SK166996A3 - Antibodies which bind to insect gut proteins and their use - Google Patents

Antibodies which bind to insect gut proteins and their use Download PDF

Info

Publication number
SK166996A3
SK166996A3 SK1669-96A SK166996A SK166996A3 SK 166996 A3 SK166996 A3 SK 166996A3 SK 166996 A SK166996 A SK 166996A SK 166996 A3 SK166996 A3 SK 166996A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
antibody
dna sequence
plant
toxin
monoclonal antibody
Prior art date
Application number
SK1669-96A
Other languages
English (en)
Inventor
Nadine B Carozzi
Michael G Koziel
Original Assignee
Ciba Geigy Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ciba Geigy Ag filed Critical Ciba Geigy Ag
Publication of SK166996A3 publication Critical patent/SK166996A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

Vynález opisuje protilátky, ktoré sa viažu na proteíny prítomné na črevách hmyzu a ich využitie, zvlášť ich využitie pri tvorení nových hybridných molekúl toxínov., Vynález sa ďalej týka mikroorganizmov, rastlinných buniek a rastlín, ktoré produkujú uvedené protilátky a hybridné molekuly toxínov. Vynález sa ďalej týka insekticídnych kompozícií a ich využitia pri ochrane rastlín proti hmyzím škodcom.
Doterajší stav techniky
Využívať biologické molekuly na reguláciu populácií najrôznejších škodcov je pri doterajšom stave techniky možné len v obmedzenom množstve prípadov. Najznámejšími príkladmi použitia pesticídnych biologických molekúl je využitie J-endotoxínov produkovaných baktériami rodu Bacillus thuringiensis (Bt). Sú známe rôzne kmene Bt produkujúce počas sporulácie insekticídne proteíny - J-endotoxíny. Niektoré z týchto (^-endotoxínov sa pre svoje insekticídne vlastnosti používajú proti rôznym hmyzím škodcom. Použitie ó-endotoxínov je však obmedzené, pretože tieto látky sú účinné len proti malej časti populácie z celkového počtu hmyzích škodcov.
Obmedzená špecifita endotoxínov produkovaných Bt je spôsobená, aspoň z časti, ako mechanizmom aktivácie príslušného toxínu v črevách hmyzu (Haider, M. Z. a kol., 1986, Eur. J. Biochem. 156, str. 531 až 540) tak schopnosťou tohto toxínu viazať sa na špecifické receptory prítomné na povrchu epiteliálnych buniek stredného čreva hmyzu (Hofmann, C. P. a kol., 1988, PNAS 85, strana 7844 až 7848). Medzi faktormi, ktoré obmedzujú insekticídnu aktivitu jednotlivých <7-endotoxínov produkovaných Bt patrí nedostatok vhodných receptorov prítomných na črevách hmyzu a nedostatočná afinita 6-endotoxínov voči receptorom, ktoré môžu byt prítomné na povrchu čriev. Z toho vyplýva neschopnosť δ-endotoxínov viazať sa na membrány kefkového lemu. V súčasnosti závisí schopnosť regulovať populáciu určitých hmyzích škodcov pomocou 6-endotoxínov produkovaných baktériami Bt na schopnosti nájsť vhodné 6-endotoxíny s požadovaným rozsahom insekticídnych aktivít. Taký 6-endotoxín nie je v mnohých prípadoch známy a nie je isté, či vôbec existuje. S cieľom nájsť toxín účinný proti Diabrotica virgifera (WCRW-western corn rootworm), hlavnému škodcovi u kukurice, sa napríklad uskutočnil screening tisícov kmeňov baktérií Bt. V súčasnosti však neexistuje žiadna zmienka o kmeňoch baktérie Bt, ktoré produkujú δ-endotoxín vysoko účinný proti WCRW.
Jednotlivé 5-endotoxíny majú obvykle veľmi úzke spektrum aktivít a každý je účinný len proti jednému alebo niekolko málo druhom hmyzích škodcov. Okrem toho sa zistilo, že 5-endotoxíny sú účinné len proti niekoľkým zástupcom, ktoré patria k malému počtu rádov v triede Insecta (hmyz). Možnosť produkovať proteíny s unikátnym pesticídnym účinkom vytvára viac alternatív na reguláciu populácií škodcov v poľnohospodárstve, zvlášť hmyzích škodcov, s použitím biologických molekúl, ktoré sú netoxické pre organizmy, proti ktorým nie sú tieto molekuly namierené. Vzniká teda potreba produkcie väzbových proteínov, ktoré môžu byť namierené proti jednotlivým hmyzím škodcom.
Podstata vynálezu
Vynález opisuje protilátky, predovšetkým monoklonálne protilátky a ich fragmenty, ktoré sa viažu na vezikuly membrán kefkového lemu čriev hmyzu (BBMV-brush border membráne vesicles) a tiež opisuje gén alebo gény, ktoré kódujú tieto proteíny. Protilátky podľa vynálezu sa viažu na proteíny prítomné na črevách jedincov hmyzu, proti ktorým sú tieto protilátky namierené. Zástupcovia hmyzu, proti ktorým sú protilátky podľa vynálezu namierené, patria predovšetkým k rádom Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, He3 miptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera a Trichoptera; protilátky podlá vynálezu sa však neviažu na membrány kefkového lemu cicavcov ani na rastlinné mikrozómy. Vynález sa predovšetkým týka monoklonálnych protilátok alebo ich fragmentov, ktoré sa viažu na črevo WCRW. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú monoklonálnymi protilátkami protilátky 2B5, 3B1, 10B6, 17F6, 14G1 a 16E4.
Vynález opisuje bunkové línie hybridómov, ktoré produkujú monoklonálne protilátky podlá vynálezu, zvlášť bunkové línie hybridómov, ktoré sú umiestnené v ATCC pod číslami HB 11616, HB 11617, HB 11618, HB 11619 a HB 11620.
Vynález ďalej opisuje sekvenciu DNA, ktorá kóduje monoklonálnu protilátku alebo väzbové miesto uvedenej protilátky podľa vynálezu. Vynález predovšetkým opisuje sekvenciu DNA, ktorá kóduje monoklonálnu protilátku alebo väzbové miesto uvedenej protilátky, kde uvedená DNA sekvencia je zvolená zo Sekvencie id. č. 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 44 alebo 46. V tomto vynáleze je tiež opísaná sekvencia DNA, kde je uvedená sekvencia DNA operatívne pripojená k sekvencii DNA, ktorá kóduje molekulu toxínu, kde uvedená molekula toxínu patrí do skupiny molekúl, ktorá zahŕňa toxíny produkované zástupcami rodu Bacillus, exotoxín produkovaný zástupcami rodu Pseudomonas, phytolaccin, gelonin, ribonukleázy alebo proteíny inaktivujúce ribozómy.
Protilátky a gény, ktoré kódujú tieto protilátky sa môžu využit na konštrukciu hybridných molekúl toxínov, ktoré slúžia na reguláciu počtu jedincov hmyzích škodcov. Vynález sa ďalej týka hybridnej toxínovej molekuly, ktorá sa skladá z monoklonálne j protilátky alebo fragmentu monoklonálnej protilátky, ktorý obsahuje väzbové miesto podľa vynálezu operatívne spojené s molekulou toxínu. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu patrí uvedená molekula toxínu do skupiny molekúl, ktorá zahŕňa toxíny produkované zástupcami rodu Bacillus, napríklad endotoxíny produkované zástupcami rodu Bacillus, predovšetkým však patrí do skupiny molekúl, ktorá zahŕňa endotoxíny produkované zás4 tupcami rodu Bacillus, vegetatívne insekticídne proteíny, exotoxín produkovaný zástupcami rodu Pseudomonas, phytolaccin, gelonin, ribonukleázy alebo proteíny inaktivujúce ribozómy.
Vynález sa ďalej týka hybridnej molekuly toxínu, ktorá sa skladá z monoklonálnej protilátky alebo fragmentu monoklonálnej protilátky, ktorý obsahuje väzbové miesto umožňujúce väzbu na črevo hmyzu, ale predovšetkým na membrány kefkového lemu čreva hmyzu, proti ktorému je táto protilátka namierená (táto monoklonálna protilátka alebo jej fragment sa však neviažu na membrány kefkového lemu cicavcov alebo na rastlinné mikrozómy), operatívne spojené s molekulou toxínu. Uvedená molekula toxínu patrí do skupiny molekúl, ktorá zahŕňa toxíny produkované zástupcami rodu Bacillus, napríklad endotoxíny produkované zástupcami rodu Bacillus, predovšetkým však patrí však patrí do skupiny molekúl, ktorá zahŕňa endotoxíny produkované zástupcami rodu Bacillus, vegetatívne insekticídne proteíny, exotoxín produkovaný zástupcami rodu Pseudomonas, phytolaccin, gelonin, ribonukleázy alebo proteíny inaktivujúce ribozómy.
Vynález ďalej opisuje sekvencie DNA, ktoré kódujú hybridnú molekulu toxínu podlá vynálezu, ktorá sa skladá z monoklolálnej protilátky alebo fragmentu monoklonálnej protilátky operatívne spojenej s molekulou toxínu, ktorá obsahuje väzbové miesto na črevo hmyzu, proti ktorému je táto protilátka namierená, ale neviažu sa na membrány kefkového lemu cicavcov alebo na rastlinné mikrozómy.
Vynález ďalej opisuje mikrobiálnych hostiteľov transformovaných vhodným vektorom s vloženou sekvenciou DNA, ktorá kóduje hybridnú molekulu toxínu podľa vynálezu. Zvlášť vhodnými mikroorganizmami sú zástupcovia baktérií, rias a húb.
Vynález sa ďalej týka rekombinantných organizmov, zvlášť mikroorganizmov, ktoré patria do skupiny tvorenej baktériami, ako sú baktérie rodov Bacillus, Caulobacter, Agmenellum, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methilius, Agrobacterium,
Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azobacter, Leuconostoc a Alcaligenes, hubami a zvlášť kvasinkami ako sú Sacharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula a Aureobasidium a vírusmi ako napríklad jadrový polyhedrálny vírus Autographica californica, transformované aspoň jednou zo sekvencií DNA podlá vynálezu.
Vynález ďalej opisuje rekombinantný mikroorganizmus, ktorý nesie aspoň jednu molekulu DNA, ktorá kóduje hybridnú molekulu toxínu zloženú z protilátky alebo fragmentu tejto protilátky operatívne spojenej s molekulou toxínu, ktorá sa viaže na črevo hmyzu, proti ktorému je namierená, ale pritom sa neviaže na membrány kefkového lemu cicavcov alebo na rastlinné mikrozómy. Uvedená DNA sekvencia, ktorá kóduje monoklonálnu protilátku, obsahuje sekvenciu, ktorá je zvolená zo skupiny tvorenej Sekvenciami id. č. 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 44 a 46.
Vynález sa ďalej týka insekticídnej kompozície, ktorá obsahuje akýkoľvek z vyššie uvedených rekombinantných mikroorganizmov podľa vynálezu, ktoré sú spolu s vhodným nosičom prítomné v tejto kompozícii v množstve dostatočnom na uskutočnenie ich insekticídnych vlastností.
Vynález ďalej opisuje insekticídnu kompozíciu, ktorá obsahuje izolovanú hybridnú molekulu toxínu podľa vynálezu, ktorá je spolu s vhodným nosičom prítomná v tejto kompozícii v množstve dostatočnom na uskutočnenie jej insekticídnych vlastností.
Vynález sa ďalej týka sekveneie DNA, ktorá sa skladá z prvej expresívnej kazety s obsahom sekveneie DNA, ktorá kóduje promótor, ktorý je schopný riadiť expresiu proteínu v rastline, operatívne spojenú s prvou sekvenciou DNA, ktorá kóduje ľahký reťazec monoklonálnej protilátky alebo väzbovú doménu lahkého reťazca tejto protilátky, kde uvedená protilátka je schopná väzby na črevo hmyzu, proti ktorému je namierená. V ďalšom uskutočnení vynálezu uvedená kazeta ďalej obsahu6 je druhú sekvenciu DNA, ktorá kóduje molekulu toxínu operatívne spojenú s uvedenou prvou sekvenciou DNA, ktorá kóduje ľahký reťazec monoklonálnej protilátky alebo väzbovú doménu ľahkého reťazca tejto protilátky. Zvlášť výhodná je expresívna kazeta, kde druhá DNA sekvencia kóduje toxínovú molekulu, ktorá patrí do skupiny molekúl, ktorá zahŕňa toxíny produkované zástupcami rodu Bacillus, exotoxín produkovaný zástupcami rodu Pseudomonas, phytolaccin, gelonin, ribonukleázy alebo proteíny inaktivujúce ribozómy.
Vynález ďalej opisuje sekvenciu DNA, ktorá obsahuje druhú expresívnu kazetu s obsahom sekvencie DNA, ktorá kóduje promótor, ktorý je schopný riadiť expresiu proteínu v rastline, operatívne spojenú s prvou sekvenciou DNA, ktorá kóduje ťažký reťazec monoklonálnej protilátky alebo väzbovú doménu ťažkého reťazca tejto protilátky, pričom uvedená protilátka je schopná väzby na črevo hmyzu, proti ktorému je namierená. V ďalšom uskutočnení vynálezu uvedená kazeta ďalej obsahuje druhú sekvenciu DNA, ktorá kóduje molekulu toxínu operatívne spojenú s uvedenou prvou sekvenciou DNA, ktorá kóduje ťažký reťazec monoklonálnej protilátky alebo väzbovú doménu ťažkého reťazca tejto protilátky. Zvlášť výhodná je expresívna kazeta, kde druhá DNA sekvencia kóduje toxínovú molekulu, ktorá patrí do skupiny molekúl, ktorá zahŕňa toxíny produkované zástupcami rodu Bacillus, exotoxín produkovaný zástupcami rodu Pseudomonas, phytolaccin, gelonin, ribonukleázy alebo proteíny inaktivujúce ribozómy.
Sekvencia DNA podľa vynálezu môže byť prítomná v izolovanej a purifikovanéj forme alebo ako súčasť genómu rastliny.
Vynález ďalej opisuje rastlinné bunky alebo celé rastliny vrátane ich potomstva, zvlášť rastliny kukurice, kde sú uvedené rastlinné bunky alebo celé rastliny transformované sekvenciou DNA podľa vynálezu, ale predovšetkým rastlinnou expresívnou kazetou podľa vynálezu. Vynález sa ďalej týka transgénnych rastlinných buniek alebo celých rastlín vrátane ich potomstva, zvlášť rastlín kukurice, ktoré exprimujú hybridné molekuly to7 xínu podľa vynálezu a ktoré s výhodou exprimujú hybridné molekuly toxínu v množstve dostatočnom na to, aby sa u rastlinných buniek alebo celých rastlín vytvorila tolerancia alebo rezistencia voči hmyzím škodcom. Rastliny podľa vynálezu sú s výhodou hybridné rastliny.
Vynález tiež opisuje rastlinný propagačný materiál, predovšetkým semená rastlín, ktoré sú ošetrené zmesou, ktorá vytvára na ich povrchu ochranný obal.
Vynález ďalej opisuje spôsoby, ktoré slúžia na prípravu bunkových línií hybridómov, ktoré produkujú protilátky alebo monoklonálne protilátky podľa vynálezu. Uvedené spôsoby zahŕňajú:
a) využitie čriev hmyzu, výhodnejšie membrán kefkového lemu hmyzu, ako antigénu,
b) imunizáciu živočícha, ktorý bude následne zdrojom B-buniek, uvedeným antigénom,
c) izoláciu imunokompetentných B-buniek z organizmu tohto živočícha,
d) fúziu uvedených imunokompetentných B-buniek s bunkovou líniou nádorových buniek schopných nekonečného počtu bunkových delení,
e) izoláciu výsledného fúzneho produktu, jeho kultiváciu vo vhodnom kultivačnom médiu a následné klonovanie pozitívnych hybridných buniek,
f) screening klonovaných hybridných buniek, či tieto produkujú monoklonálne protilátky a následnú selekciu tých klonov, ktoré vykazujú požadované vlastnosti.
Vynález ďalej opisuje spôsob, ktorý slúži na produkciu protilátky, predovšetkým monoklonálnej protilátky alebo jej fragmentu, ktorá sa viaže na membránové vezikuly kefkového lemu čreva hmyzu. Tento spôsob zahŕňa kultiváciu bunkovej línie hybridómov, ktoré produkujú uvedené protilátky, vo vhodnom kultivačnom médiu in vivo a in vitro a izoláciu vzniknutých protilátok.
Vynález sa ďalej týka spôsobu produkcie hybridných molekúl toxínov, ktoré sa skladajú z monoklonálnej protilátky alebo väzbového fragmentu tejto monoklonálnej protilátky podía vynálezu, ktorá sa viaže na membránové vezikuly kefkového lemu čreva hmyzu, operatívne spojené s molekulou toxínu. Tento spôsob, ktorý slúži na produkciu hybridných molekúl toxínov, zahŕňa klonovanie variabilnej oblasti uvedenej protilátky a pripojenie uvedenej variabilnej oblasti k molekule toxínu.
Vynález ďalej opisuje spôsob prípravy sekvencie DNA, ktorá kóduje monoklonálnu protilátku podía vynálezu. Tento spôsob, ktorý slúži na tvorenie sekvencie DNA, zahŕňa klonovanie príslušných génov hybridómov, ktoré kódujú protilátky, s použitím primérov ku konzervovaným DNA sekvenciám, ktoré kódujú konštantné oblasti a úseky základnej štruktúry variabilných oblastí príslušnej protilátky.
Vynález sa ďalej týka spôsobu prípravy transgénnych rastlinných buniek a rastlín. Tento spôsob zahŕňa transformáciu uvedenej rastlinnej bunky alebo rastliny prostredníctvom jednej alebo viac vyššie uvedených sekvencií DNA, ktoré kódujú hybridnú molekulu toxínu podía vynálezu. Táto hybridná molekula toxínu sa skladá z monoklonálnej protilátky alebo väzbového fragmentu tejto monoklonálnej protilátky operatívne spojenej s molekulou toxínu, ktorá sa viaže na membránové vezikuly kefkového lemu čreva hmyzu, ale neviaže sa na membrány kefkového lemu cicavcov alebo na rastlinné mikrozómy.
Vynález opisuje protilátky a monoklonálne protilátky vrátane ich fragmentov, ktoré sú schopné viazat sa špecificky na proteíny prítomné na črevách hmyzu. Také protilátky sa viažu na bunky čreva hmyzu, ale neviažu sa ani na membránové veziku9 ly kefkového lemu cicavcov (BBMV - brush border membráne vesicles) ani na rastlinné mikrozómy. Protilátky podlá vynálezu zahŕňajú polyklonálne a monoklonálne protilátky vrátane ich fragmentov, ktoré si udržali schopnosť viazať sa na proteíny prítomné na črevách hmyzu. Ak hovoríme u protilátky, monoklonálnej protilátky alebo jej fragmentu o schopnosti viazať určitú molekulu, myslíme tým schopnosť uvedenej protilátky, monoklonálnej protilátky alebo jej fragmentu špecificky reagovať s uvedenou molekulou a tým sa na túto molekulu vlastne viazať. Termínom protilátka (Ah) a monoklonálna protilátka (Mab) sa myslia intaktné molekuly, ako aj ich fragmenty alebo väzbové oblasti alebo domény (ako napríklad Fab a F(ab)2 fragmenty) schopné viazať haptén. Také fragmenty sú obvykle pripravené proteolytickým štiepením intaktných molekúl s použitím napríklad papaínu alebo pepsínu. Alternatívnou cestou prípravy fragmentov schopných viazať haptén je použitie postupov, ktoré využívajú techniky rekombinácie DNA alebo chemická syntéza.
Spôsoby, ktoré slúžia na prípravu protilátok podľa vynálezu sú v súčasnosti dobre známe; viď napríklad Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow and Dávid Lane (editori) Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988) a tiež aj tu citované práce. Medzi štandardné práce, ktoré sa týkajú všeobecných princípov imunológie patria: Klein, J. Immunology: The Science of Cell-Noncell Discrimination, John Wiley & Sons, NY (1982); Dennett, R. a kol., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plénum Press, NY (1980); a Campbell, A. Monoclonal Antibody Technology, In Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Burdon a kol. (editori), Elsevier, Amsterdam (1984); viď tiež americké patenty číslo 4 609 893, 4 713 325, 4 714 681, 4 716 111, 4 716 117 a 4 720 459.
Pri príprave protilátok a monoklonálnych protilátok podľa vynálezu môžeme ako antigén používať črevá hmyzu a zvlášť membrány kefkového lemu čreva hmyzu. Metodika prípravy takých membrán z čreva hmyzu je v súčasnosti dobre známa. Membrány kefového lemu sa môžu z lariev hmyzu izolovať postupom, ktorý zahŕňa najprv disekciu čriev, následnú homogenizáciu a precipitáciu membrán chloridom vápenatým; viď napríklad Wolfersberger (1986) Comp. Biochem. Physiol. 86A, str. 301 až 308.
Je zrejmé, že prostredníctvom spôsobov opísaných v tomto vynáleze sa môžu pripraviť protilátky špecificky namierené proti príslušnému druhu hmyzu. Hmyzom, proti ktorému je protilátka namierená rozumipme hmyz, v ktorého organizme dochádza k väzbe protilátky podía vynálezu na proteín alebo proteíny prítomné na črevách tohto hmyzu. Z toho vyplýva, že sa môžu pripraviť protilátky schopné selektívne sa viazať na proteíny prítomné na črevách hmyzu, proti ktorým sú namierené.
Zástupcovia hmyzu, proti ktorým sú uvedené protilátky namierené patria k rádom Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera a Trichoptera atď. Z uvedených rádov sa teda môže vybrať akýkoľvek zástupca a môžu sa vytvoriť protilátky špecifické proti tomuto jedincovi. Zvlášť zaujímaví z tohto hľadiska sú hmyzí škodcovia, pre ktorých neexistuje žiadny proteín produkovaný baktériami Bt schopný väzby v organizme daného škodcu a následného zahubenia tohto organizmu. Jedným z takých škodcov je napríklad WCRW.
Bunkové línie podľa vynálezu, ktoré produkujú protilátky a monoklonálne protilátky tvoria len časť zo všetkých bunkových línií, ktoré produkujú protilátky, ak sú membránové vezikuly kefkového lemu (BBMV) hmyzu použité ako antigén na stimuláciu produkcie protilátok. Väzbové charakteristiky požadovaných protilátok produkovaných bunkovými líniami sa stanovujú metódou diferenčného screeningu všetkých možných monoklonálnych protilátok proti BBMV hmyzu, proti ktorému sú namierené.
Metódou diferenčného screeningu podľa vynálezu identifikujeme tiež protilátky produkované bunkovými líniami, ktoré sa viažu tiež na bunky BBMV cicavcov a/alebo na rastlinné mikrozómy. Protilátky (a príslušné bunkové línie, ktoré produku11 jú tieto protilátky), ktoré sa viažu na BBMV cicavcov alebo na rastlinné mikrozómy sa už ďalej nepoužívajú. Metódou diferenčného screeningu môžeme tiež identifikovať bunkové línie, ktoré produkujú monoklonálne BBMV jedincov hmyzu odlišných protilátky, ktoré sa viažu na od jedincov hmyzu, proti ktorým sú tieto protilátky namierené. Protilátkami podľa vynálezu teda rozumieme protilátky, ktoré sa vysoko selektívne viažu na hmyz, proti ktorému sú namierené a zvlášť na črevo tohto hmyzu.
Bunkové línie, ktoré produkujú monoklonálne protilátky s požadovanou väzbovou špecifitou sa môžu použiť ako zdroj messenger RNA určenej na klonovanie cDNA pre príslušnú monoklonálnu protilátku. Gény, ktoré kódujú protilátky sa môžu z línií hybridómov klonovať s použitím primérov ku konzervatívnym sekvenciám DNA, ktoré kódujú konštantné oblasti a úseky základnej štruktúry variabilných domén príslušnej protilátky. Po tomto postupe môže nasledovať amplifikácia DNA metódou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). Databáza sekvencii ľahkých a ťažkých reťazcov myší vytvorená Kabatom a ďalšími sa úspešne použila na vytvorenie primérov (ako špecifických pre jednotlivé izotypy tak degenerovaných vzhľadom na jednotlivé izotypy) na klonovanie génov, ktoré kódujú protilátky (Kabat, E. A. a kol., 1987, ministerstvo zdravotníctva USA, Vládny tlačový úrad USA a Jones, S. T. a Bendig, M., 1991, Bio/technology 9, str. 88 až 89). V súčasnosti je okrem toho známych veľa spôsobov, ktoré slúžia na klonovanie menších fragmentov protilátok, ktoré majú väzbovú špecifitu pôvodnej protilátky.
Klonovaná DNA sa môže sekvenovať spôsobmi dobre známymi v stave techniky; viď napríklad Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989) zväzky 1 až 3 a články tu citované. Proteínová sekvencia väzbovej domény príslušnej protilátky sa môže odhadnúť zo zodpovedajúcej sekvencie nukleovej kyseliny.
Protilátky a monoklonálne protilátky podía vynálezu sú použité pri tvorení hybridných molekúl toxínov. Termíny hybridná molekula toxínu alebo hybridný toxín označujú fúzne proteíny alebo imunotoxíny, ktoré sa skladajú z monoklonálnej protilátky alebo fragmentu monoklonálnej protilátky operatívne spojenej s molekulou toxínu a ktoré sú schopné väzby na črevo hmyzu. To znamená, že aj po spojení s molekulou toxínu si monoklonálna protilátka alebo fragment monoklonálnej protilátky zachovávajú svoje väzbové vlastnosti a naopak, že molekula toxínu si zachováva svoje cytotoxické vlastnosti.
Ako molekula toxínu sa môže použiť veľké množstvo cytotoxických proteínov. Patria sem (nielen) toxíny (vrátane endotoxínov) produkované baktériami Bacillus a vegetatívnymi insekticídnymi proteínmi; viď napríklad americká patentová prihláška 08/037 057, 25. marec 1993 a WO 93/072278, ktorá je tu citovaná. Ako ďalšie toxíny sa môžu použiť katalytické inaktivátory ribozómov, ako napríklad gelonin; phytolaccin alebo exotoxín A produkovaný baktériami Pseudomonas (štruktúra toxínu produkovaného baktériami Pseudomonas je dobre opísaná v článku Chaudhary a kol., (1990) J. Biol. Chem. 265, str. 16303 až 16310); látky, ktoré narúšajú bunkový metabolizmus ako napríklad ribonukleázy (viď napríklad Mariani a kol., (1990) Náture 347, str. 737 až 741); PE-Bar, čo je vlastne chimerický toxín odvodený od ribonukleázy produkovanej baktériami Bacillus amyloliquefaciens (barnáza-Bar) a endotoxínu A produkovaného baktériami Pseudomonas (viď Prior a kol., (1991) Celí 64, str. 1017 až 1023); hydrofilné peptidy, ktoré vytvárajú póry v membránach (Frohlich a Wells (1991) Int. J. Peptide Protein Res. 37, str. 2 až 6) atď.
Hybridné molekuly toxínov podľa vynálezu sa teda skladajú z oblasti, ktorá umožňuje väzbu na molekuly prítomné na črevách hmyzu (časť, ktorá zodpovedá molekule protilátky) a z časti, ktorá zodpovedá molekule toxínu, ktorej úlohou je deštrukcia cieľovej bunky a nakoniec celého organizmu hmyzu, proti ktorému sú namierené. Použitie monoklonálnych protilátok alebo fragmentov monoklonálnych protilátok v hybridných mole13 kulách toxínov spôsobí, že hybridná molekula toxínu sa viaže len na črevo hmyzu, proti ktorému je namierená a že je toxická len pre tento hmyz. Väzbové charakteristiky takých hybridných molekúl toxínov sú odvodené od väzbovej oblasti Mab, zatiat čo toxický účinok týchto hybridných molekúl toxínov závisí na druhu použitej molekuly toxínu.
V stave techniky je známy rad spôsobov, ktoré slúžia na pripojenie protilátky alebo fragmentov protilátok k molekule toxínov. V uvedených spôsoboch sú použité na vytvorenie jednoreťazcového imunotoxinu linkery (Chaudhary a kol., (1989) Náture 339, str. 394 až 397; Chaudhary a kol., (1990) PNAS
87, str. 9491 až 9494; Batra a kol., (1991), Mol. and Cellular Biol. 11, str. 2200 až 2205; Brinkmann a kol., (1991), PNAS
88, str. 8618 až 8620; Brinkmann a kol., (1992), PNAS 89, str. 3075 až 3079; Whitlow a kol., (1993) Proteín Engineering 6, str. 989 až 995). Jeden zo zvlášť vhodných linkerov je založený na sekvencií pantovej oblasti ludského IgAl ako je opísané v Hallewell a kol., (1989), J. Biol. Chem. 264, str. 5260 až 5268 a v Sekvencií id. č.: 43.
Aktivita hybridnej molekuly toxínu môže závisieť na niekoľkých faktoroch, ktoré sa môžu optimalizovať. Táto aktivita sa môže merať, ak použijeme proteín produkovaný protoplastami kukurice. Protoplasty kukurice, ktoré exprimujú hybridné molekuly toxínov, sa môžu pridávať do diéty hmyzu s cieľom stanoviť ich aktivity. Vo všeobecnosti sú dané spôsoby opísané v Marrone (1985) J. Econ. Entomolo. 78, str. 260 až 293, Macintosh a kol., (1990) J. of Invertebrate Pathology 56, str. 258 až 266 a v článkoch tu citovaných.
Je teda možné merať insekticídne aktivity hybridných molekúl toxínov namierených proti jednotlivým hmyzím škodcom. Hybridné molekuly toxínov, ktoré vykazujú príslušnú insekticídnu aktivitu sa môžu ďalej upraviť a použiť v poľnohospodárstve.
Je zrejmé, že je možné vytvoriť najrôznejšie hybridné molekuly toxínu. Hybridná molekula toxínu môže byť napríklad kódovaná dvoma expresívnymi kazetami, z ktorých jedna kóduje ľahký reťazec a druhá ťažký reťazec molekuly protilátky. Táto binárna hybridná molekula toxínu môže byť potom in vivo zostavená bežným mechanizmom používaným bunkami na tvorenie väzbového miesta protilátky. Časť hybridnej molekuly toxínu zodpovedajúca molekule toxínu môže byť operatívne pripojená na N alebo C konce ťažkého alebo ľahkého reťazca, alebo môže nahradiť časť alebo dokonca celú konštantnú oblasť ktoréhokoľvek reťazca. Molekula toxínu môže byť tiež vložená do konštantnej oblasti alebo medzi konštantné oblasti reťazcov protilátky; viď napríklad Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989) zväzky 1 až 3 a články tu citované.
Hybridné molekuly toxínov (vrátane binárnych toxínov) podľa vynálezu sa môžu produkovať v rastlinách. Gény, ktoré kódujú protilátky sa môžu teda klonovať a exprimovať v rastlinách takým spôsobom, aby sa vytvorili funkčné molekuly protilátok; viď napríklad Hiatt a kol., (1989) Náture 342, str. 76 až 78; During a kol., (1990) J. Plánt Molecular Biology 15, str. 281 až 293 a PCT Application WO 91/06320. Hladina expresie bivalentných protilátok dosahovala napríklad u tabaku 1 % množstva všetkých rozpustných proteínov. Je zrejmé, že tak ako intaktné molekuly protilátok sa môžu použiť aj fragmenty týchto protilátok ako napríklad Fab alebo Fv fragmenty. Dokázalo sa, že menšie Fab a Fv fragmenty (12 kDa až 50 kDa) zachovávajú väzbovú afinitu akú mali príslušné intaktné protilátky. Jednoreťazcové Fv fragmenty (scFv), u ktorých sú domény Vh a VI spojené prostredníctvom hydrofilných a ohybných peptidov sa s úspechom použili pri namierení enzýmov a toxínov proti špecifickým bunkám (Bird (1988) Science 423, str. 423 až 426 a Huston (1988) PNAS 85, str. 5879 až 5883). Samostatné Vh domény (Dabs) a samostatné, komplementaritu určujúce oblasti (complementarity determining regions-CDR) s veľkosťou 20 aminokyselín nazývané minimálne rozpoznávacie jednotky (minimal recognition units-mru) sa tiež použili na väzbu antigénov (Ward (1989) Náture 341, str. 544 až 546 a Taub (1989) J. Biol. Chem. 264:259-265 a Williams (1989) PNAS 86, str. 5537 až 5541). Použitie týchto fragmentov protilátok poskytuje možnosť minimalizovať velkosť domény odvodenej od Mab zodpovednej za špecifitu väzby na hmyz.
Vynález tiež opisuje fragmenty DNA, ktoré kódujú protilátky alebo oblasti protilátok, ktoré sa viažu na črevo hmyzu. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu kódujú tieto fragmenty DNA väzbové oblasti, ktoré sú odvodené z monoklonálnych protilátok namierených proti BBMV cieľového organizmu hmyzu a u ktorej sa testovali, či sa neviažu na BBMV cicavcov alebo na rastlinné mikrozómy. Také fragmenty DNA sa môžu použiť pri konštrukcii nových génov, ktoré kódujú hybridné toxínové molekuly uvedené v predchádzajúcom texte.
Sekvencie DNA, ktoré kódujú v hybridnej molekule toxínu časť zodpovedajúcu molekule toxínu sú v súčasnosti dobre známe; viď Lamb a kol., (1985) Eur. J. Biochem. 148, str. 275 až 170 (Ricin); Gray a kol., (1984) PNAS 81, str. 2645 až 2649 (sekvencia DNA, ktoré kódujú toxín produkovaný baktériami Pseudomonas); Hindley a Berry (1988) Nucleic Acids Res. 16, str. 4168 (gén, ktorý kóduje toxín produkovaný baktériami B. sphaericus); Bauman a kol., (1988) J. Bacteriol. 170, str. 2045 až 2050; Bauman a kol., (1987) J. Bacteriol. 169, str. 4061 až 4067; Berry a Hindley (1987) Nucleic Acids Res. 15, str. 5891; Berry a kol., (1989) Nucl. Acids Res. 17, str. 7516 (B. sphaericus); WO 9309130-A (gelonin); EP 466222-A americký patent 5 128 460 (proteín, ktorý inaktivuje ribozómy); EP 412911-A (barnáza); Heernstadt a kol., (1987) Gene 57, str. 34 až 46 (crylIIA); Brizzard a Whiteley (1988) Nucleic Acids Res. 16, str. 2723 až 2724 (crylB); Geiser a kol., (1986) Gene 48, str. 109 až 118 (crylA(B)). Ďalej potom Porter a kol., (1993) Microbiological Reviews 57, str. 838 až 861; Hofte a Whiteley (1989) Microbiological Reviews 53, str. 242 až 255 a WO 93/07278.
Gény, ktoré kódujú hybridné molekuly toxínov podía vynálezu, sa môžu upraviť s cieľom dosiahnuť zvýšenú expresiu v rastlinách; viď napríklad WO 93/07278; EPA 0385962; WO 91/16432; Pelak a kol., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, str. 3324 až 3328 a Murray (1989) Nucleic Acids Res. 17, str. 477 až 798. Môžu sa syntetizovať gény s kodónmi uprednostňovanými pri translácii v rastlinách. Slovným spojením uprednostňovaný kodón rozumieme kodón v hostiteloví, ktorý sa v organizme tohto hostiteľa najčastejšie používa na kódovanie danej aminokyseliny. Napríklad u kukurice sa môže uprednostňovať kodón pre danú aminokyselinu odvodený zo známych génových sekvencií kukurice. Použitie kodónu v 28 génoch kukurice môžeme nájsť v Murray, (1989), Nucleic Acids Research 17, str. 477 až 498. Syntetické gény sa môžu tiež vytvoriť na základe znalosti distribúcie kodónov využívaných jednotlivými hostiteľmi na kódovanie príslušných aminokyselín.
Týmto spôsobom sa môžu optimalizovať nukleotidové sekvencie na expresiu proteínov v akejkoľvek rastline. Je zrejmé, že akákoľvek génová sekvencia alebo jej časť sa môže optimalizovať a syntetizovať. To znamená, že je možné použiť ako syntetické (čiastočne optimalizované), tak aj natívne sekvencie.
Spôsoby, ktoré slúžia na transformáciu rastlinných buniek a na regeneráciu transformovaných buniek sú v stave techniky veľmi dobre známe. Vo všeobecnosti sa môžu na zavedenie cudzorodej DNA do rastlinných buniek použiť buď plazmidové vektory Ti alebo priamy príjem DNA, lipozómy, elektroporácia, mikroinjekcie alebo mikroprojektily. Všetky tieto metódy sú publikované; viď napríklad Guerche a kol., (1987) Plánt Science 52, str. 111 až 116; Neuhause a kol., (1987) Theor. Appl. Genet. 75, str. 30 až 36; Klein a kol., (1987) Náture 327. str. 70 až 73; Howell a kol., (1980) Science 208, str. 1265; Horsch a kol., (1985) Scienca 227, str. 1229 až 1231;, DeBlock a kol., (1989) Plánt Physiology 91, str. 694 až 701; Methods f or Plánt Molecular Biology (Weissbach a Weissbach, editori) Academic Press, Inc. (1988); Methods in Plánt Molecular Biology (Schuler a Zielinski, editori) Academic Press, Inc.
(1989); ďalej tiež EPA 0193259 a ΕΡΑ 0451878A1. Je samozrejmé, že použité metódy transformácie budú závisieť na druhu transformovaných rastlinných buniek.
Je tiež zrejmé, že jednotlivé časti expresívnej kazety, ktoré obsahujú požadované sekvencie, sa môžu pripraviť s cieľom zvýšenia hladiny génovej expresie v rastlinách alebo rastlinných bunkách. Môžu sa napríklad použiť skrátené sekvencie, môže sa uskutočniť zámena niektorých nukleotidov alebo môžu sa uskutočniť ešte iné modifikácie? viď napríklad Perlak a kol., (1991) Proc. Natl. Acad. USA 88, str. 3324 až 3328; Murray i
a kol., (1989) Nucleic Acids Research 17, str. 477 až 498 a WO 91/16432.
Vytvárané sekvencie môžu tiež obsahovať ďalšie nevyhnutné regulačné prvky, ako napríklad terminátory (Guerineau a kol.,
141 až 144; Proufoot 674; Sanfacon a kol., Mogen a kol., (1990) (1991), Mol. Gen. Genet. 226, str. a kol., (1991) Celí 64, str. 671 až (1991) Genes Dev. 5, str. 141 až 149;
Plánt Celí 2, str. 1261 až 1272; Munroe a kol., (1990) Gene 91, str. 151 až 158; Ballas a kol., (1989) Nucleic Acids Research 17, str. 7891 až 7903; Joshi a kol., (1987) Nucleic Acids Research 17, str. 7891 až 7903; Joshi a kol., (1987) Nucleic Acids Research 15, str. 9627 až 9639); rastlinné translačné konvenčné sekvencie (Joshi, C. P., (1987) Nucleic Acids Research 15, str. 6643 až 6653), intróny (Luehrsen a Walbot (1991), Mol. Gen. Genet. 225, str. 81 až 93) a podobné operatívne pripojené nukleotidové sekvencie. Môže byť vhodné zaviesť do expresívnej kazety 5' vedúce sekvencie. Tieto vedúce sekvencie môžu zvýšiť účinnosť translácie. Medzi v súčasnosti známe vedúce sekvencie patria:
- vedúca sekvencia Picornavírusov, napríklad vedúca sekvencia EMCV (Encephalomyocarditis 5' nekódujúca oblasť) (Elroy-Stein, O., Fuerst, T.R. a Moss, B. (1989) PNAS USA 86, str. 6126 až 6130),
- vedúca sekveneia Pityvírusov, napríklad vedúca sekveneia vírusu leptanej mozaiky tabaku (TEV, Tobacco etch virus), (Allison a kol., (1986); vedúca sekveneia vírusu zakrpatenej mozaiky kukurice (MDMV, Maize of dwarf mosaic virus); Virology 154, str. 9 až 20 a
- ľudský proteín, ktorý sa viaže na ťažké reťazce imunoglobulínov (BiP) (Macejak, D. G. a Sarnow, P., (1991) Náture 353, str. 90 až 94),
- neprekladaná vedúca sekveneia z mRNA, ktorá kóduje obalový proteín vírusu mozaiky lucerny (AMV RNA 4, Alfa-alfa mosaic virus), (Jobling, S.A. a Gehrke, L., (1987) Náture 325, str. 622 až 625),
- vedúca sekveneia vírusu tabakovej mozaiky (TMV, Tobacco mosaic virus), (Gallie, D. R. a kol., (1989) Molecular Biology of RNA, str. 237 až 256) a
- vedúca sekveneia vírusu chlorotickej mozaiky kukurice (MCMV, Maize chlorotic mosaic virus), (Lommel, S. A. a kol., (1991) Virology 81, str. 382 až 385 a tiež Della-Cioppa a kol., (1987) Plánt Physiology 84, str. 965 až 968).
V expresívnej kazete sa môžu použiť aj rastlinné terminátory transkripcie; viď Rosenberg a kol., (1987) Gene 56, str. 125; Guerineau a kol., (1991), Mol. Gen. Genet. 226, str. 141 až 144; Proufoot a kol., (1991) Celí 64, str. 671 až 674; Sanfacon a kol., (1991) Genes Dev. 5, str. 141 až 149; Mogen a kol., (1990) Plánt Celí 2, str. 1261 až 1272; Munroe a kol., (1990) Gene 91, str. 151 až 158; Ballas a kol., (1989) Nucleic Acids Research 17, str. 7891 až 7903; Joshi a kol., (1987) Nucleic Acids Research 15, str. 9627 až 9639.
Na zaistenie tkanivovej špecifickej expresie sa môžu nukleotidové sekvencie podľa vynálezu operatívne spojiť s tkaní19 vovými špecifickými promótormi? viď napríklad US WO 93/07278 a tu citované práce.
Vynález sa ďalej týka transgénnych rastlín, zvlášť transgénnych fertilných rastlín transformovaných vyššie uvedenými postupmi a ich potomstva vzniknutého sexuálnou a/alebo asexuálnou cestou, ktoré trvalo obsahujú molekulu DNA, ktorá kóduje monoklonálnu protilátku alebo hybridnú molekulu toxínu podía vynálezu. Dospelé rastliny vypestované z transformovaného rastlinného materiálu podľa vynálezu sú buď príbuzensky alebo nepríbuzensky krížené s cielom produkcie semien.
Transgénnymi rastlinami podľa vynálezu môžu byť buď dvojklíčne alebo jednoklíčne rastliny. Výhodnejšie sú jednoklíčne rastliny čeľade Graminaceae, ktoré zahŕňajú rastliny Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale a Setaria.
Zvlášť výhodné sú transgénna kukurica, pšenica, jačmeň, cirok, žito, ovos a ryža.
Z dvojklíčnych rastlín sú najvýhodnejšie sója, bavlník, tabak, cukrová repa, repka olejná a slnečnica.
Termín ''potomstvo” zahŕňa potomstvo transgénnych rastlín vzniknuté z materskej rastliny buď sexuálnou alebo asexuálnou cestou. Táto definícia tiež zahŕňa všetky mutanty a najrôznejšie varianty rastlín, ktoré môžu vzniknúť použitím známych spôsobov ako napríklad bunkovou fúziou alebo selekciou mutantov a ktoré stále vykazujú charakteristické vlastnosti pôvodnej transformovanej rastliny. Táto definícia tiež zahŕňa všetky produkty vzniknuté krížením a fúziou transformovaného rastlinného materiálu.
Vynález sa ďalej týka materiálu, ktorý slúži na rozmnožovanie transgénnych rastlín.
Materiál, ktorý slúži na rozmnožovanie transgénnych rastlín je podía vynálezu definovaný ako akýkoľvek rastlinný materiál, ktorý sa môže množiť sexuálne alebo asexuálne in vitro alebo in vivo. Zvlášť výhodné sú podľa vynálezu protoplasty, bunky, kalusy, tkanivá, orgány, semená, embryá, peľ, vaječné bunky, zygoty, hľuzy, suché plody a dužinaté plody spolu s ďalším materiálom, ktorý slúži na rozmnožovanie, získaným z transgénnych rastlín.
Vynález sa ďalej týka časti rastlín ako napríklad kvetov, stoniek, plodov a koreňov, ktoré pochádzajú z transgénnych rastlín alebo ich potomstva transformovaných pomocou spôsobov podľa vynálezu a zložených teda (aspoň čiastočne) z transgénnych buniek.
Ešte predtým ako sa materiál, ktorý slúži na rozmnožovanie rastlín (dužinaté plody, hľuzy, suché plody, semená), predá ako komerčný produkt, ošetrí sa obvykle herbicídmi, pesticídmi, fungicídmi, baktericídmi, nematocídmi, prostriedkami na hubenie mäkkýšov alebo zmesou pripravenou z niektorých z týchto preparátov, ktoré vytvoria na jeho povrchu ochrannú vrstvu. Spolu s vyššie uvedenými látkami sa v súčasnosti obvykle na materiál, ktorý slúži na rozmnožovanie rastlín, aplikujú ešte rôzne nosiče, povrchovo aktívne látky alebo adjuvans, ktoré uľahčujú aplikáciu vyššie uvedených látok. Cieľom opísaného ošetrenia materiálu, ktorý slúži na rozmnožovanie rastlín, je ochrana tohto materiálu pred možným poškodením spôsobeným baktériami, hubami alebo živočíšnymi škodcami.
Ochranná vrstva sa môže kvôli ošetreniu semien aplikovať na tieto semená buď impregnáciou hľúz a suchých plodov kvapalnými zmesami alebo nanesením suchých alebo mokrých zmesí na povrch týchto hľúz alebo suchých plodov. Vo zvláštnych prípadoch sa môžu na aplikáciu uvedených zmesí na. rastliny použiť ešte iné spôsoby, napríklad aplikácia namierená na lupene alebo na dužinaté plody.
Rastlinné semeno podlá vynálezu, ktoré nesie sekvenciu DNA, ktorá kóduje monoklonálnu protilátku alebo hybridnú molekulu toxínu podľa vynálezu, sa môže ošetriť ochranným prostriedkom, ktorý vytvára na semene ochrannú vrstvu. Medzi uvedené ochranné prostriedky patria napríklad kaptan, karboxin, thiram (TMTDR), methalaxyl (ApronR) a pirimiphos-methyl (Actellic3*) a iné látky, ktoré sa bežne používajú na ošetrovanie semien.
Hybridné molekuly toxínov podľa vynálezu sa môžu použiť na ochranu poľnohospodárskej produkcie pred najrôznejšími škodcami. Inou možnosťou je zavedenie génu, ktorý kóduje hybridnú molekulu toxínu, prostredníctvom vhodného vektora do mikrobiálneho hostiteľa a uvedený hostiteľ sa môže následne vysadiť do okolitého prostredia, na rastliny alebo živočíchy. Môžu sa vybrať mikrobiálni hostitelia, ktorí žijú v určitej fytosfére” (fyloplane, fylosfére, rizoplane a/alebo rizosfére) jednej alebo viac rastlinných odrôd. Tieto mikroorganizmy sa vyberú tak, aby boli schopné v danom prostredí úspešne súťažiť s mikroorganizmami, ktoré sa prirodzene vyskytujú v tomto prostredí. Týmto by mala byť zaručená stabilná expresia génu, ktorý kóduje polypeptidový pesticíd, a účinnejšia ochrana pesticídu pred degradáciou alebo inaktiváciou v okolitom prostredí .
Medzi také organizmy patria baktérie, riasy a huby. Zvlášť výhodné sú mikroorganizmy ako napríklad baktérie, napríklad Bacillus, Caulobacter, Agmenellum, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc a Alcaligenes, huby a zvlášť kvasinky ako napríklad Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula a Aureobasidium. Zvlášť výhodné sú bakteriálne druhy, ktoré žijú vo fylosfére ako napríklad Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinium, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xannthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, clavibacter xyli a Azotobacter vinlandii a druhy kvasiniek, ktoré žijú vo fytosfére ako napríklad Rhodotorula rabra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. Odorus, Kluyveromyces veronae a Aureobasidium pollulans. Zvlášť výhodné sú fotosyntetizujúce mikroorgani zmy.
Užitočnosť génov, ktoré kódujú hybridné molekuly toxínov prítomných v rekombinantných kmeňoch mikroorganizmov je ilustrovaná v príklade 7. Malo by byť tiež zrejmé, že izolovaný gén, ktorý kóduje hybridnú molekulu toxínu podľa vynálezu, sa môže preniesť do organizmu akéhokoľvek mikrobiálneho hostiteľa a že prepožičiava týmto hostiteľom svoje insekticídne vlastnosti . Alternatívne hostiteľ, do ktorého sa prenesie gén, ktorý kóduje hybridnú molekulu toxínu podľa vynálezu, sa môže vybrať, ak je s cielom zvýšenia jeho efektivity prístupný na klonovanie, na charakterizáciu formy a funkcie génu alebo proteínu kódovaného týmto génom, na použitie ako produkčný hostiteľ na zvýšenie výťažku hybridnej molekuly toxínu, na efektívnejší prenos aspoň jednej hybridnej molekuly toxínu do organizmu hmyzieho škodcu, proti ktorému je táto molekula namierená alebo na zavedenie génu, ktorý kóduje hybridnú molekulu toxínu, do patogénov hmyzu, akými sú napríklad bakulovírusy (jadrové polyhedrálne vírusy, napríklad (Autographica californica) ).
Gény alebo ich rekombinantné formy, ktoré kódujú hybridnú molekulu toxínu, sa môžu do takého alternatívneho hostiteľa preniesť pomocou v súčasnosti dobre známych spôsobov. Jedným z výhodných postupov je elektroporácia mikrobiálnych buniek opísaná napríklad v Dower (U. S. Patent No. 5 186 800). Iným výhodným spôsobom je spôsob opísaný v Schurter a kol., (Mol. Gen. Genet. 218, str. 177 až 181 (1989)). Tento spôsob je tiež opísaný v EP-A 0 342 633.
Je zrejmé, že uvedený alternatívny hostiteľ by sa mal následne vysadiť do okolitého prostredia, na rastliny alebo živočíchy, s cielom regulácie populácie hmyzu. Môžu sa vybrať mikrobiálni hostitelia, ktorí žijú v určitej fytosfére (fyloplane, fylosfére, rizoplane a/alebo rizosfére) jednej alebo viac rastlinných odrôd. Tieto mikroorganizmy sa vyberú tak, aby boli schopné v danom prostredí úspešne súťažiť s mikroorganizmami, ktoré sa prirodzene vyskytujú v tomto prostredí. Týmto by mala byť zaručená stabilná expresia génu, ktorý kóduje polypeptidový pesticíd a účinnejšia ochrana pesticídu pred degradáciou alebo inaktiváciou v okolitom prostredí.
Vynález ďalej opisuje insekticídne kompozície, ktorých aktívnou zložkou je aspoň jedna hybridná molekula toxínu podľa vynálezu alebo rekombinantný organizmus, ktorý nesie aspoň jeden z génov, ktoré kódujú rekombinantnú molekulu toxínu. Spolu s týmito aktívnymi zložkami sú v uvedenej insekticídnej kompozícii prítomné adjuvans ako napríklad nosič, rozpúšťadlo, povrchovo aktívna látka alebo adjuvans, ktorý uľahčuje aplikáciu vyššie uvedených látok. Kompozícia môže tiež obsahovať aj iné biologicky aktívne zlúčeniny. Uvedené zlúčeniny môžu byť buď fertilizéry, zdroje živín alebo iné látky, ktoré ovplyvňujú rast rastlín. Môžu to byť tiež herbicídy, pesticídy, fungicídy, baktericídy, nematocídy, prostriedky na hubenie mäkkýšov alebo zmesi pripravené z niektorej z týchto zlúčenín. Spolu s týmito zlúčeninami môžeme ďalej aplikovať nosiče prijateľné v poľnohospodárstve, povrchovo aktívne látky alebo adjuvans, ktoré uľahčujú aplikáciu vyššie uvedených látok, ktoré sa využívajú pri tvorení zmesí. Vhodné nosiče a adjuvans môžu byť buď v tuhej alebo kvapalnej forme a sú totožné s látkami bežne používanými v postupoch na prípravu zmesí ako napríklad prírodné alebo regenerované minerálne látky, rozpúšťadlá, dispergátory, zvlhčovadlá, látky, ktoré spôsobujú lepivosť, spojivá alebo fertilizéry.
Kompozície môžu obsahovať aktívnu zložku v množstve 0,1 až 99 % z celkovej hmotnosti, kvapalné alebo tuhé adjuvans v množstve 1 až 99 % z celkovej hmotnosti a povrchovo aktívnu látku v množstve 0 až 25 % z celkovej hmotnosti. Aktívna zložka, ktorá sa skladá z aspoň jednej hybridnej molekuly toxínu podľa vynálezu alebo rekombinantného mikroorganizmu, ktorý nesie jeden z génov, ktoré kódujú rekombinantnú molekulu toxínu alebo kompozície s obsahom uvedenej aktívnej zložky, sa môže aplikovát na rastliny alebo na plodiny, ktoré sa majú chrániť, spolu s inými insekticídmi alebo chemickými látkami (1993 Crop Protection Chemicals Reference, Chemical and Pharmaceutical Press, Canada), bez toho, že dôjde k strate aktivity uvedenej aktívnej zložky. Táto aktívna zložka sa môže aplikovať vo forme prášku, suspenzie, zmáčateľného prášku alebo v akejkoľvek inej forme použiteľnej v poľnohospodárstve.
Vynález ďalej opisuje spôsoby, ktoré slúžia na reguláciu počtu hmyzích škodcov alebo na ich hubenie prostredníctvom aplikácie aktívnej zložky, ktorá sa skladá z aspoň jednej hybridnej molekuly toxínu podľa vynálezu alebo rekombinantného mikroorganizmu, ktorý nesie jeden z génov, ktoré kódujú rekombinantnú molekulu toxínu alebo kompozície s obsahom uvedenej aktívnej zložky. Táto aktívna zložka sa aplikuje (a) do prostredia, v ktorom by mohlo dôjsť k výskytu hmyzieho škodcu, (b) na rastlinu alebo na časť rastliny s cieľom ochrany uvedenej rastliny alebo jej časti pred poškodením spôsobeným hmyzím škodcom alebo (c) na semená rastlín s cieľom ochrany rastliny, ktorá vyrastie z uvedeného semena, pred poškodením spôsobeným hmyzím škodcom.
Výhodnými spôsobmi pri aplikácii látky v oblasti, kde požadujeme ochranu rastlín, je aplikácia látky na listy rastlín. Počet a frekvencia aplikácií závisí na druhu rastliny, ktorú ochraňujeme a na rozsahu zamorenia danej oblasti príslušným škodcom. Aktívna zložka môže však prenikať do organizmu rastlín aj cez korene (systematický účinok) a to, ak je miesto kde rastlina rastie presýtené kvapalnou zmesou alebo ak sa na toto miesto (napríklad do pôdy) aktívna zložka inkorporuje v tuhej forme, napríklad vo forme granúl (pôdna aplikácia). V prípade ryže, ktorá rastie na zavodnených ryžových poliach, sa môžu tieto granule aplikovať v odmeranom množstve.
Kompozície podľa vynálezu sú tiež vhodné na ochranu materiálu, ktorý slúži na rozmnožovanie rastlín, napríklad semien ako napríklad dužinatých plodov, hľúz alebo suchých plodov alebo odrezkov rastlín pred hmyzími škodcami. Materiál, ktorý slúži na rozmnožovanie rastlín, sa môže pred výsadbou ošetriť pomocou uvedených kompozícií: semená sa môžu napríklad ošetriť pred vlastnou sadbou. Aktívna zložka podľa vynálezu sa môže tiež aplikovať na suché plody a to buď impregnáciou týchto suchých plodov kvapalnou zmesou alebo sa tiež môžu tieto plody obaliť zmesou v tuhej forme. Zmes sa môže tiež aplikovať na miesto, kde je materiál, ktorý slúži na rozmnožovanie semien vysievaný, napríklad do brázd počas sadby. Vynález tiež opisuje spôsoby ošetrenia materiálu, ktorý slúži na rozmnožovanie rastlín a tiež uvedeného materiálu, ktorý slúži na rozmnožovanie rastlín.
Kompozície podľa vynálezu, ktoré obsahujú ako aktívnu zložku rekombinantný mikroorganizmus, ktorý nesie aspoň jeden z génov kódujúcich rekombinantnú molekulu toxínu, sa môžu aplikovať pomocou spôsobov, ktoré slúžia na ošetrenie semien alebo pôdy prostredníctvom bakteriálnych kmeňov; viď napríklad americký patent 4 863 866. Použitie týchto bakteriálnych kmeňov je efektívne, aj keď tieto mikroorganizmy nie sú živé. Výhodnejšia je však aplikácia živých organizmov.
Medzi plodiny, pre ktoré je vhodný systém ochrany opísaný v tomto vynáleze, patria napríklad nasledovné rastlinné druhy:
obilniny (pšenica, jačmeň, žito, ovos, ryža, cirok a príbuzné plodiny), repa (cukrová repa a kŕmna repa), krmoviny (Dactylis, kostrava a podobné plodiny), kôstkovice, malvice a dužinaté ovocie (jablká, hrušky, slivky, broskyne, mandle, čerešne, jahody, maliny a černice), strukoviny (fazuľa, šošovica, hrach, sója), olejniny (repka olejná, horčica, mak, olivy, slnečnice, kokosové orechy, rastliny, ktoré produkujú ricínový olej, kakaové bôby, podzemnica), plodoviny (uhorka, tekvice, melóny), textilné rastliny (bavlna, ľan, konope, juta), citrusy (pomaranče, citróny, grapefruity, mandarínky), zelenina (špenát, hlávkový šalát, špargľa, kapusta a ďalšie rastliny, ktoré patria do čeľade Brassicae, cibuľa, paradajky, zemiaky, paprika), rastliny, ktoré patria do čeľade Lauraceae (avokádo, mrkva, škorica, gáfor), ihličnaté a listnaté stromy (napríklad lipy, tisy, duby, jelše, topole, brezy, jedle, smrekovce, borovice), alebo rastliny ako napríklad kukurica, tabak, orechy, kávovník, cukrová trstina, čajovník, vínna réva, chmeľ, banánovník a kaučukovník a tiež aj okrasné rastliny (vrátane astrovitých).
Rekombinantné mikroorganizmy, ktoré nesú aspoň jeden z génov, ktoré kódujú rekombinantnú molekulu toxínu sa obvykle aplikujú vo forme insekticídnych kompozícií a môžu sa na rastlinnú produkciu alebo na rastliny aplikovať spolu s alebo pred alebo po aplikácii ďalších biologicky aktívnych zlúčenín. Uvedené zlúčeniny môžu byť buď fertilizéry, zdroje živín alebo iné látky, ktoré ovplyvňujú rast rastlín. Môžu to byť tiež herbicídy, pesticídy, fungicídy, baktericídy, nematocídy, prostriedky na hubenie mäkkýšov alebo zmesi pripravené z niektorej z týchto zlúčenín. Spolu s týmito preparátmi môžeme ďalej aplikovať nosiče, povrchovo aktívne látky alebo adjuvans, ktoré uľahčujú aplikáciu vyššie uvedených látok, ktoré sa využívajú pri tvorení zmesí.
Aktívna zložka podľa vynálezu sa môže použiť samostatne (žiadnym spôsobom modifikovaná) alebo spolu s vhodným nosičom prijateľným na použitie v poľnohospodárstve. Také nosiče sú adjuvans používané bežne v poľnohospodárstve pri príprave rôznych zmesí a sú teda známym spôsobom miešané do formy emulzií ikovaných koncentrátov, pasty, ktorá sa môže vybaviť povlakom, striekateľných roztokov alebo roztokov prístupných ďalšiemu riedeniu, zriedených emulzií, zmáčateľných práškov, rozpustných práškov, popraškov, zrnitých materiálov a tiež látok zapuzdrených v puzdre z polymérnych zlúčenín. Ako povaha kompozícií, tak aj spôsoby ich aplikácie ako napríklad rozstrekovanie, rozprašovanie, práškovanie, rozptyľovanie alebo polievanie sa vyberajú v súlade v cieľom aplikácie a prevažujúcimi podmienkami. Vhodné množstvo aplikovanej aktívnej látky (a.i.) sa obvykle nachádza v rozsahu od 50 g do približne 5 kg na hektár, výhodnejšie v rozsahu od 100 g do 2 kg aktívnej látky/ha. Významné sú aplikácie, pri ktorých sa množstvo aplikovanej aktívnej látky pohybuje medzi 200 g a 1 kg a.i./ha a 200 g a 500 g a.i./ha.
Na ošetrenie semien sa vhodné množstvo aktívnej látky pohybuje v rozsahu od 0,5 g do 1000 g a.i./100 kg semien, výhodnejšie v rozsahu od 3 g do 100 g a.i./100 kg semien alebo v rozsahu od 10 g do 50 g a.i./100 kg semien.
Vhodné nosiče a adjuvans môžu byť tuhé alebo kvapalné a sú totožné s látkami bežne používanými v postupoch na prípravu zmesí ako napríklad prírodné alebo regenerované minerálne látky, rozpúšťadlá, dispergátory, zvlhčovadlá, látky, ktoré spôsobujú lepivosť, spojivá alebo fertilizéry. Kompozície, to znamená insekticídne kompozície, prípravky alebo zmesi, ktoré obsahujú ako aktívnu zložku rekombinantný mikroorganizmus, ktorý nesie rekombinantný gén alebo tento mikroorganizmus v kombinácii s inými aktívnymi zložkami a ktoré, ak je to vhodné, obsahujú tiež tuhé alebo kvapalné adjuvans. Tieto kompozície sa pripravujú pomocou známych spôsobov, napríklad miešaním a/alebo mletím aktívnych zložiek s prísadami, napríklad rozpúšťadlami, tuhými nosičmi a v niektorých prípadoch aj povrchovo aktívnymi látkami.
Vhodnými rozpúšťadlami sú: aromatické uhlovodíky, zvlášť frakcie s obsahom 8 až 12 atómov uhlíka, napríklad zmesi xylénu alebo substituované naftalény, ftaláty ako napríklad dibutylester kyseliny ftalovej alebo dioktylester kyseliny ftalovej, alifatické uhlovodíky ako napríklad cyklohexán alebo parafíny, alkoholy a glykoly a ich estery a étery ako napríklad etanol, monometyl alebo monoetyl estery etylénglykolu, ketóny ako napríklad cyklohexanón, silno polárne rozpúšťadlá ako napríklad N-metyl-2-pyrolidón, dimetylsulfoxid alebo dimetylformamid a tiež aj rastlinné oleje alebo epoxidované rastlinné oleje ako napríklad epoxidovaný kokosový olej alebo sójový olej; alebo voda.
Ako tuhé nosiče používané napríklad na prípravu zmesi vo forme prášku alebo dispergovatelného prášku, sa obvykle využívajú prírodné anorganické plnivá ako napríklad kalcit, sľuda, kaolín, montmorilonit alebo attapulgit. Na zlepšenie fyzikálnych vlastností sa tiež môže pridať dispergovaná ortokremičitá kyselina alebo dispergované absorbujúce polyméry. Vhodnými adsorbujúcimi nosičmi v tvare granúl sú pórovité materiály ako napríklad pemza, rozbité tehly, sépiolit alebo bentonit a vhodné neadsorbujúce nosiče sú materiály ako napríklad kalcit alebo piesok. Ďalej sa môže použiť veľké množstvo najrôznejšieho materiálu organického alebo anorganického pôvodu, napríklad dolomit alebo rozdrtené rastlinné zvyšky, vopred upraveného do formy granúl.
V závislosti na povahe aktívnej zložky pridávanej do kompozície patria medzi vhodné povrchovo aktívne látky neiónové, katiónové a/alebo aniónové povrchovo aktívne látky, ktoré majú dobré emulzifikačné, dispergačné a zvlhčujúce vlastnosti. Termín povrchovo aktívna látka tiež označuje aj zmes povrchovo aktívnych látok. Vhodnými aniónovými povrchovo aktívnymi látkami môžu byť vo vode rozpustné mydlá a vo vode rozpustné povrchovo aktívne látky. Vhodnými mydlami sú soli vyšších mastných kyselín (s obsahom 10 až 22 atómov uhlíka) s alkalickými kovmi, kovmi alkalických zemín alebo substituované či nesubstituované amónne soli vyšších mastných kyselín, napríklad sodná alebo draselná sol kyseliny olejovej alebo stearovej, alebo prírodné zmesi mastných kyselín získaných napríklad z kokosového oleja alebo z loja. Ďalšími vhodnými povrchovo aktívnymi látkami sú tiež soli mastných kyselín s metyltaurínom a tiež aj modifikované alebo nemodifikované fosfolipidy.
Oveľa častejšie sa však používajú tzv. syntetické povrchovo aktívne látky, zvlášť sulfonáty mastných kyselín, sulfáty mastných kyselín, sulfónované benzimidazolové deriváty alebo alkylarylsulfonáty. Alifatické sulfonáty alebo sulfáty sa obvykle pripravujú vo forme solí s alkalickými kovmi, kovmi alkalických zemín alebo vo forme substituovaných či nesubsti29 tuovaných amónnych solí a obvykle obsahujú alkylové zvyšky s obsahom 8 až 22 atómov uhlíka, medzi ktoré tiež patria alkylové reťazce acylových zvyškov, napríklad sodná alebo draselná sol kyseliny lignosulfónovej, sodná alebo draselná soľ dodecylsulfátu alebo sodná alebo draselná soľ zmesi esterov kyseliny sírovej s alifatickými alkoholmi získanými z prírodných mastných kyselín. Medzi tieto zlúčeniny patria tiež soli esterov kyseliny sírovej s alifatickými alkoholmi alebo s aduktami etylénoxidu alebo soli esterov kyseliny sulfónovej s alifatickými alkoholmi alebo s aduktami etylénoxidu. Sulfónované deriváty benzamidazolu s výhodou obsahujú 2 skupiny kyseliny sulfónovej a jeden zvyšok mastnej kyseliny s obsahom 8 až 22 atómov uhlíka. Ako príklad alkylaurylsulfonátov môžu slúžiť sodné, vápenaté alebo trietanolamínové soli kyseliny dodecylbenzénsulfónovej, kyseliny dibutylnaftalénsulfónovej alebo soli kondenzačného produktu kyseliny naftalénsulfónovej a formaldehydu. Vhodné sú tiež zodpovedajúce fosfáty, napríklad soli esterov kyseliny fosforečnej s aduktom p-nonylfenolu so 4 až 14 molmi etylén oxidu.
Medzi neiónové povrchovo aktívne látky patria predovšetkým deriváty polyglykoléteru s alifatickými alebo cykloalifatickými alkoholmi, alebo nasýtenými či nenasýtenými mastnými kyselinami a alkylfenolmi; uvedené deriváty obsahujú 3 až 30 éterových skupín polyglykolu a 8 až 20 atómov uhlíka v (alifatickom) uhľovodíkovom reťazci a 6 až 18 atómov uhlíka v alkylovom zvyšku u alkylfenolov.
Ďalšími vhodnými neiónovými povrchovo aktívnymi látkami sú vo vode rozpustné adukty polyetylénoxidu s polypropylénglykolom, etyléndiaminopolypropylénglykolom a alkylpropylénglykolom s obsahom 1 až 10 atómov uhlíka v alkylovom reťazci, pričom adukt obsahuje 20 až 250 éterových skupín etylénglykolu a 10 až 100 éterových skupín propylénglykolu. Tieto zlúčeniny obvykle obsahujú 1 až 5 jednotiek etylénglykolu na jednu jednotku propylénglykolu. Reprezentatívnymi príkladmi neiónových povrchovo aktívnych látok sú nonylfenolpolyetoxyetanoly, polyglykolétery ricínového oleja, adukty polypropylénu a poly30 etylénoxidu, tributylfenoxypolyetoxyetanol, polyetylénglykol a oktylfenoxypolyetoxyetanol. Estery mastných kyselín a sorbitanu polyoxyetylénu ako napríklad trioleát sorbitanu polyoxyetylénu, sú tiež vhodnými povrchovo aktívnymi látkami.
Výhodnými katiónovými povrchovo aktívnymi látkami sú kvartérne amóniové soli, ktoré ako substituent na dusíku obsahujú aspoň jeden alkylový zvyšok, ktorý sa skladá z 8 až 22 atómov uhlíka a ako ďalšie substituenty nižšie nesubstituované alebo halogénované alkylové zvyšky, benzylové zvyšky alebo nižšie hydroxylované alkylové zvyšky. Uvedené soli sú najvýhodnejšie vo forme halogenidov, metylsulfátov alebo etylsulfátov, napríklad stearyltrimetylamónium chlorid alebo benzyl-(2-chloroety1)etylamónium bromid.
Povrchovo aktívne látky obvykle používané pri príprave kompozícií sú opísané napríklad v McCutcheon1 s Detergents and Emulsifiers Annual, MC Publishing Corp. Ridgewood, N. J., 1979; Helmut Stache, Tensid Taschenbuch (Handbook of Surfactants), Carl Hanser Verlag, Munich/Vienna.
Ďalšou výhodnou črtou insekticídnej kompozície podía vynálezu je perzistencia aktívnej zložky po aplikácii na rastliny a do pôdy. Možnými príčinami znižovania aktivity sú ultrafialové žiarenie, tepelná inaktivácia, inaktivácia rastlinnými ochrannými látkami uvoľňovanými na povrch listu a inaktivácia zmenou pH. V insekticídnej kompozícii podľa vynálezu sa inaktivácii zabráni buď vhodnými aditívami, ktoré môžu predĺžiť životnosť aktívnej zložky, alebo zapuzdrením kompozície takým spôsobom, ktorý ju ochráni pred inaktiváciou. Takéto zapuzdrenie sa môže uskutočniť chemickou cestou (viď McGuire a Sasha, J. Econ. Entomol. 85: 1425 až 1433, 1992) alebo biologickým spôsobom (viď Barnes a Cummings, 1986, EP-A, 0 192 319). Chemickým zapuzdrením sa rozumie proces, pri ktorom sa aktívna zložka potiahne polymérnym materiálom, zatiaľ čo biologickým zapuzdrením sa rozumie expresia hybridných toxínových génov v mikroorganizmoch. V biologicky zapuzdrenom prípravku sa ako aktívna zložka používa intaktný mikroorganizmus, ktorý obsahu31 je hybridný gén toxínového proteínu. Prídavok látok, ktoré chránia pred UV žiarením môže výrazne redukovať radiačné poškodenie aktívnej zložky. Rovnako aj tepelná inaktivácia sa môže zmierniť prídavkom vhodných aditív.
Výhodné formulácie podía vynálezu obsahujú ako aktívnu zložku živé mikroorganizmy a to buď vo forme vegetatívnych buniek, alebo s výhodou vo forme spór, ak je to možné. Vhodné formulácie môžu pozostávať napríklad z polymérneho gélu, ktorý je zosieťovaný pomocou polyvalentných katiónov a ktorý obsahuje tieto mikroorganizmy (viď napríklad D. R. Fravel a kol., Phytopathology, zväzok 75, č. 7, str. 774 až 777, 1985, v tejto práci je ako polymérny materiál použitý alginát). Táto publikácia tiež opisuje použitie nosných materiálov (carriers). Vo všeobecnosti sa môžu kompozície podía vynálezu pripraviť zmiešaním roztoku prirodzeného alebo syntetického polyméru (napríklad alginátov) s vodným roztokom soli polyvalentného kovového iónu a vznikajú malé individuálne kvapôčky. Mikroorganizmy sa môžu suspendovať v jednom alebo v obidvoch reakčných roztokoch. Formovanie gélu začína miešaním vo forme kvapôčiek. Je možné tiež následné sušenie gélových partikúl. Tento proces sa nazýva ionotropné zgélovatenie. V závislosti na stupni vysušenia sa formujú kompaktné a tuhé častice polyméru, ktoré sú štruktúrne zosieťované polyvalentnými katiónmi a obsahujú rovnomerne distribuované mikroorganizmy a nosný materiál. Veľkosť týchto častíc môže byť až 5 mm.
V dokumente EP-A1-0 0957 571 sú opísané kompozície založené na čiastočne zosietených polysacharidoch, ktoré okrem mikroorganizmov obsahujú napríklad jemne mletú kyselinu kremičitú ako nosný materiál a vápenaté ióny ako sieťovacie činidlo. V týchto kompozíciách nie je aktivita vody vyššia ako 0,3. W. J. Cormick a kol. opisujú v súhrnnom článku (New Directions in Biological Control: Alternatives for Supressing Agricultural Pests and Diseases, Nové smery biologickej kontroly: Alternatívy boja so škodcami a chorobami v poľnohospodárstve, str. 345 až 372, vyd. Alan R. Liss, 1990) rôzne systémy, granules vermikulitem ako nosiče a kompaktné alginátové guličky pripravené vyššie opísaným spôsobom ionotropného zgélovatenia. Také kompozície opisuje aj D. R. Fravel vo Formulations and application systems, Vzorce a aplikačné systémy, zväzok 11, ASTM STP 1112, Americká spoločnosť na testovanie a materiály, Philadelphia, 1992, str. 173 a 179). Tieto kompozície sa môžu tiež použiť s rekombinantným mikroorganizmom podía vynálezu.
Insekticídne kompozície podía vynálezu obvykle obsahujú 0,1 až 99 % aktívnej zložky, s výhodou 0,1 až približne 95 % a najvýhodnejšie 3 až 90 % aktívnej zložky, ďalej potom 1 až
99,9 % tuhého alebo kvapalného adjuvans, s výhodou 1 až približne 99 % a najvýhodnejšie 5 až približne 95 % adjuvans a nakoniec 0 až 25 % povrchovo aktívnej látky (surfaktantu), s výhodou 0,1 až 25 % a najvýhodnejšie 0,1 až približne 20 % povrchovo aktívnej látky.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu obsahujú insekticídne kompozície 0,1 až 99,9 % rekombinantného mikroorganizmu, s výhodou 0,1 až 95 % tohoto mikroorganizmu, ktorý obsahuje aspoň jeden nový rekombinantný gén, alebo obsahujú kombináciu týchto mikroorganizmov s ďalšími aktívnymi zložkami, 1 až 99,9 % tuhého alebo kvapalného adjuvans a 0 až 25 %, s výhodou 0,1 až 20 % povrchovo aktívnej látky.
Zatial čo komerčné produkty sú väčšinou vo forme koncentrátov, koncový užívateľ bude väčšinou používať prostriedky v podstatne nižšom riedení. Insekticídne kompozície môžu tiež obsahovať ďalšie zložky, ako sú napríklad stabilizátory, činidlá na potláčanie penenia, regulátory viskozity, spojivá, prostriedky na zlepšenie konfekčnej lepivosti, hnojivá alebo ďalšie aktívne zložky, ktoré slúžia na dosiahnutie požadovaných vlastností.
Existuje veľa spôsobov introdukcie génu, ktorý exprimuje hybridný toxín do cieľového mikroorganizmu v podmienkach, ktoré umožnia stabilitu a expresiu génu. Napríklad sa môžu vytvoriť expresné kazety, ktoré obsahujú požadované DNA konštrukty operatívne naviazané na transkripčné a tŕanslačné regulačné signály na expresiu týchto konštruktov. Ďalej potom tieto kazety obsahujú sekvenciu DNA, ktorá je homológna so sekvenciou hostiteľského organizmu a zaistí tak integráciu celého konštruktu. Prípadne môžu takéto konštrukty obsahovať replikačné systémy funkčné pre hostiteľský organizmus, ktoré zaistia stabilitu a udržanie konštruktu v hostiteľovi.
Transkripčné a tŕanslačné regulačné signály zahŕňajú napríklad promótory, miesto iniciácie transkripcie, operátory, aktivátory, enhancéry, iné regulačné elementy, miesta pre väzbu ribozómov, iniciačný kodón, terminačné signály a podobne, pričom vyššie uvedený výpočet nie je žiadnym spôsobom obmedzujúci. viď napríklad: americké patenty č. 5 039 523, č. 4 853 331; EPO 0480762A2, Sambrook a kol. (viď vyššie), Molecular Cloning-Laboratory Manual, Maniatis a kol., Cold Spring Harbor Lab., New York, 1980.
Vynález bude ďalej opísaný v nasledujúcich príkladoch, ktoré nie sú však žiadnym spôsobom obmedzujúce.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Príprava monoklonálnych protilátok
Imunizácia
Vhodné množstvá antigénu (približne 50 pq membránových vezikúl kefkového lemu WCRW) sa suspendujú v neolejovom adjuvans a použijú sa na imunizáciu skupiny myší BALB/c. Obnovovacia injekcia (booster) sa myšiam podáva každý druhý týždeň. Sedem dní po tretej obnovovacej dávke sa myšiam odoberú vzorky séra a pomocou ELISA testu sa stanoví relatívny titer protilátok v sére, viď nižšie. Vybraným štyrom myšiam s najvyšším titrom sa počas troch dní podajú záverečné obnovovacie injek34 cie s nízkym obsahom antigénu (približne s jednou desatinou dávky použitej na imunizáciu). Slezinné bunky týchto myší sa potom použijú na fúziu, viď nižšie.
Fúzia
Pre dve fúzie sa vybrali štyri myši s titrom špecifických protilátok vyšším ako 1 : 5000. V aseptických podmienkach sa vyňali sleziny. Sleziny sa potom mechanicky homogenizovali a izolovali sa z nich nasledovným spôsobom lymfocyty. Červené krvinky sa odstránili inkubáciou v 0,155M roztoku chloridu amónneho v 0,017M zásady TRIZMA, pH 7,2 (Sigma Chemicals Company, St. Louis, Mo). Bunky sa dvakrát premyli PBS pufrom a lymfocyty sa ďalej prečistili centrifugáciou v hustotnom gradiente, viď ďalej. Bunky sa opatrne navrstvili na roztok Ficollu (Sigma Chemicals Company, St. Louis, Mo) so špecifickou hustotou 1,065 (Van Mourik a kol., Meth. in Enzymologý, 121, str. 174 až 182, (1996)). Centrifugácia prebiehala 20 minút pri 450 x g. Peleta s obsahom buniek s vyššou špecifickou hustotou ako 1,065 je veľmi bohatá na lymfocyty. Táto peleta sa použila na fúziu s myeloidnými bunkami.
Pri fúzii pomocou polyetylénglykolu sa použili izolované lymfocyty a HPGRT (hypoxantin-guaninfosforibosyl transferáza) deficientnej plazmacytómovej bunkovej linie SP2/0, odvodenej od myšej línie BALB/c. Lymfocyty sa zmiešali s myeloidnými bunkami v pomere 4:1. Zmes buniek sa dôkladne premiešala, zcentrifugovala a potom sa nasledovným spôsobom uskutočnila bunková fúzia (viď Oi a kol., Selected Meth. in Cellular Immunology, editory Michell, B. B. a Shiigi, S. M., Freemen San Francisco, str. 351 až 371, (1980), Fazekas a kol., J. Immunol. Meth., 35, str. 1 až 21, (1980)). Bunková peleta sa opatrne suspendovala v 1 ml 50 % polyetylénglykolu (PEG) za stáleho miešania počas jednej minúty. Koncentrácia PEG sa pozvoľne znižovala prídavkom bezsérového RPMI média (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Po fúzii sa sfúzované bunky peletovali centrifugáciou pri 80 x g počas 5 minút, resuspendovali a umiestnili sa na 96 jamkové mikrotitračné dosky tak, aby na jednu jamku pripadlo celkom asi 10s až 10® buniek. Slezinné bunky určené ako podporné (feeder) sa pripravili tak, že slezinné bunky neimunizovaných myší sa ošetrili 20 gg/ml mitomycínu C. Tieto bunky sa potom pridali do kultivačných jamôk, aby produkovali pomocné rastové faktory. V niekoľkých nasledujúcich dňoch prebiehala selekcia na médiu HAT (hypoxantin-aminopterintymidin) s obsahom 17,6 gg/ml aminopterinu. Rastúce kolónie boli v inverznom mikroskope viditeľné už 3. až 4. deň po fúzii. V tejto fáze sa supernatanty jednotlivých jamôk testovali na produkciu špecifických protilátok.
Výber hybridómov
Najprv sa detegujú kolónie, ktoré prežili selekciu pomocou HAT média. Supernatanty z týchto kolónií sa testujú pomocou ELISA (imunosorpčná enzymatická detekčná technika, viď Engvall, Meth. Enzymology 70, str. 419, (1980), Engvall a kol., Immunochemistry 8, str. 871, (1971)). Supernatanty hybridómov sa kultivovali na mikrotitračných doskách s 96 jamkami. Jamky sa vopred potiahli približne 500 ng antigénu na jednu jamku. Po príslušnom premytí (viď Engvall a kol.) sa naviazané látky detegovali sekundárnou kozou-anti-myšou protilátkou konjugovanou s chrenovou peroxidázou (HRP - horseradish peroxidase). Po ďalšom dôkladnom premytí sa pomocou chromogénneho substrátu vyhodnotila enzymatická aktivita v jednotlivých jamkách. Pozitívne kolónie sa určili z výslednej absorbancie pri vlnovej dĺžke 492 nm. Absorbancie sa stanovili pomocou automatického ELISA-readeru. Hybridómne línie s vysokou väzbovou afinitou k membránovým vezikulám kefkového lemu WCRW sa ďalej testovali v ďalších troch testoch ELISA, aby sa eliminovali také klony, ktoré sú schopné väzby aj na ľudské proteíny alebo proteíny cicavcov. Konkrétne sa uskutočnili testy s doskami potiahnutými membránovými vezikulami králičieho kef kového lemu a prípravkami z mikrozomálnych membrán z listu a koreňa kukurice. Tiež sa uskutočnila ELISA zameraná na identifikáciu hybridómov, ktoré vykazujú krížovú reaktivitu s membránovými vezikulami obaľovača kukuričného (Ostrinia nubilalis, European corn borer, ECB).
Hybridómne kolónie so sekréciou protilátok špecifických k antigénu (membránovým vezikulám kefkového lemu WCRW) a pritom neschopné väzby na proteíny cicavcov a rastlín, sa klonovali nižšie opísaným spôsobom.
KÍonovanie
V tejto fáze sa klonovali hybridómy, ktoré sekrétujú protilátky so zjavnou špecifitou na antigén. Hybridómy sa expandovali a klonovali pri koncentráciách 0,5, 1 a 5 buniek na jamku. Hybridómom sa kvôli urýchleniu rastu do kultivačného média pridávali rastové faktory (Sugasawara a kol., J. Immunol. Meth. 79, str. 275 až 275 (1985)). Po dvoch až troch týždňoch, keď kolónie dorástli do dostatočnej veZCkosti, sa pozitívne klony opäť testovali ELISA testom (viď vyššie). Reprezentatívne klony sa potom expandovali a určili na produkciu protilátok.
Produkcia ascitických tekutín
Veľkoobjemová produkcia monoklonáIných protilátok sa dosiahla použitím hybridómov rastúcich ako ascitické tumory v myšiach BALB/c (Brodeur a kol., J. Immunol. Meth. 71, str. 265 až 272, (1984)), ktorým sa tumor indukoval pristánom. Ascitické tekutiny sa zhromaždili a protilátky sa čiastočne purifikovali z dialyzovaných ascitov pomocou chromatografie na kolóne s proteínom A. Výsledné protilátky sa rozdelili na alikvóty a potom zmrazili.
Bunkové línie, ktoré produkujú protilátky podľa vynálezu, sú opísané v tabuľke 1. Hybridómne bunkové línie, u ktorých je v tabulke 1 uvedené ich prístupové číslo ATCC boli uložené 19. apríla 1994 v Americkej zbierke typových kultúr, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA.
Tabuľka 1
Hybridómne bunkové línie proti BBMV WCRW
Bunková línia Krížová reakcia s obaľovačom Western blot Izotyp číslo u ATCC
1A4 áno 2 WCRW pruhy IgM-k
1A11 nie 2 WCRW pruhy IgM-k
1F51 áno 2 WCRW pruhy IgM-k
2B5 áno 2 WCRW pruhy IgM-k HB 11691
3B1 nie 1 WCRW pruh IgGl-k HB 11671
17G6 nie > 5 pruhov IgM-k
10A1 nie žiadny signál IgM-k
10B6 nie > 5 pruhov C IgG3-k HB 11618
10F9 nie > 5 pruhov B IgM-k
12G4 nie neuskutočnené IgM-k
14G1 nie > 5 pruhov IgG2B-k
17F6 nie > 5 pruhov A IgGl-k. HB 11620
17H6 nie > 5 pruhov A IgG2A
18A7 nie > 5 pruhov B IgGl-k.
16E4 áno > 5 pruhov IgM HB 11616
Príklad 2
Izolácia membránových vezikúl kefkového lemu (BBMV)
Izolácia BBMV Diabrotica virgifera (WCRW)
Vezikuly sa pripravili metódou podía Wolfesbergera a kol., Comp. Biochem. Physiol. 86A, str. 301 až 308 (1987) modifikovanou Englishom a Readdym (Insect Biechem. 19, str. 145 až 152, (1989)). Črevá larvy WCRW v treťom instarštádiu sa homogenizovali v ľadovom pufri s obsahom 50mM sacharózy, 2mM Tris-HCl (pH 7,4) a 0,lmM fenylmetylsulfonylfluoridu (PMSF) pomocou homogenizátora firmy Potter-Elvenhem. Potom sa k homogenátu pridal chlorid vápenatý do koncentrácie 50mM a zmes sa 15 minút miešala na ľade. Potom sa homogenát centrifugoval pri 4300 x g počas 10 minút a pri teplote 4 ’C. Peleta sa odstránila. Potom sa supernatant centrif ugoval pri 27000 x g počas 10 minút. Peleta sa resuspendovala v 0,32M sacharóze. Suspenzia sa pretlačila cez ihlu s priemerom 27 a uchovala pri teplote 70 ’C.
Izolácia BBMV obaľovača kukuričného (Ostrinia nubilalis)
Črevá sa vybrali z piateho instarštádia obaľovača kukuričného a pozdĺžne rozrezali, aby sa mohli odstrániť zvyšky potravy a peritrofné membrány. Izolácia BBMV sa uskutočnila podľa vyššie opísaných metód.
Izolácia rastlinných mikrozómov
Listové alebo koreňové tkanivá z kukuríc pestovaných 72 hodín v tme a pri teplote 28 ’C sa rozmelnili v trecej miske s tlčikom v rovnakom objeme 0,3M draselnofosfátového pufra s prídavkom 5mM DTT a 1 % (w/v) PVPP. Zmes sa potom prefiltrovala cez štyri vrstvy jemného plátna. Prefiltrovaná zmes sa centrifugovala 15 minút pri 10000 x g. Supernatant sa potom centrifugoval 60 minút pri 100000 x g a peleta sa resuspendovala v 0, IM draselnofosfátovom pufri pH 7,4.
Izolácia membránových vezikúl kefkového lemu cicavcov
- Membrány kefkového lemu cicavcov sa pripravili zo sliznice králičieho dvanástnika a stromatu (Kessler a kol., BBA 506, str. 136 až 154, (1978)) pomocou podobného postupu aký sa použil na izoláciu membránových vezikúl kefkového lemu z čriev hmyzu. Vnútorný povrch čerstvého králičieho dvanástnika a dolného žalúdka sa premyl a slizničná vrstva sa oddelila od nižšie položenej stromy. Materiál sa suspendoval v desaťnásobku ladového pufra s obsahom 50mM sacharózy, 0,lmM PMSF a 2mM Tris-HCl pH 7,4. Potom sa materiál homogenizoval 15 údermi. Nakoniec sa pridal chlorid vápenatý do výslednej koncentrácie lOmM a zmes sa 15 minút miešala na Tade. Potom sa homogenát centrifugoval pri 4300 x g počas 10 minút a pri teplote 4 ’C. Potom sa supernatant centrifugoval pri 27000 x g počas 10 minút. Peleta sa resuspendovala v 0,32M sacharóze a uchovávala pri teplote 70 ’C.
Príklad 3
Charakterizácia monoklonálnych bunkových línií so špecifitou na WCRW BBMV.
Monoklonálne bunkové línie, u ktorých sa pomocou testu ELISA zistila vysoká afinita k membránovým vezikulám kefkového lemu, sa ďalej selektovali, aby sa vylúčili klony krížovo reagujúce s kukuričnými mikrozómami alebo mikrozómami cicavcov. Ďalšie ELISA testy sa uskutočnili s mikrozómami z listov a z koreňov kukurice a s vezikulami z králičích črevných membrán. Simultánne sa uskutočnili tiež testy všetkých línií proti proteínom obalovača kukuričného (ECB). Zo 78 testovaných línii sa vybralo 11 línií špecifických na Diabrotica virgifera. Ďalej sa izolovali štyri línie, ktoré vykazovali krížovú reaktivitu s obaľovačom kukurice. Týchto pätnásť klonov je tvorených bunkovými líniami, ktoré sekrétujú protilátky tried IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3 a IgM. Monoklonálne bunkové línie sa analyzovali pomocou Western blotu, čím sa potvrdila ich špecifita k WCRW a nereaktivita s králičími alebo mikrozómami kukuričného zrna. Špecifická väzba týchto protilátok k rôznym proteínov WCRW BBMV je dobre zrejmá na obr.l. Z obrázku je zrejmé, že môžeme rozlíšiť päť rôznych väzbových skupín. Dve skupiny sú špecifické pre jeden až dva proteíny a zvyšné tri reprezentujú väzbu na 7 až 15 proteínov. Skupina so 7 až 15 proteínmi sa ďalej rozdelila na podtriedy A, B a C podľa väzbového obrazca.
Analýza monoklonálnych bunkových línií pomocou Western blotu
Membránové vezikuly kefkového lemu sa pripravili podľa príkladu 2. Potom sa elektroforeticky rozdelili na 8 až 16 % akrylamidovom géli v prítomnosti SDS (Novex, San Diego, CA). Proteíny sa potom preniesli na nitrocelulózovú membránu (Burnette, W. N., Western blotting, 112, 195, (1981)). Na túto membránu sa potom nechali pôsobiť roztoky supernatantov z hybridómnych línií. Väzba protilátok na blotované proteíny sa vizualizovala pomocou štandardných postupov (viď napríklad Antibodies: A laboratory Manual - Protilátky: Laboratórna príručka, E. Harlow a D. Lane, Cold Spring Harbor, 1988 a v ňom citované odkazy).
Príklad 4
Klonovanie väzbových domén protilátok proti WCRW
Sú známe rôzne spôsoby, ktoré umožňujú získať gény špecifických protilátok proti WCRW. Jedným zo spôsobov je klonovanie náhodnej knižnice protilátkových génov v bakteriofágovi a vyhľadávanie takých klonov z tejto knižnice, ktoré sa viažu na proteíny čriev WCRW. Iným možným spôsobom je príprava monoklonálnych protilátok proti črevným proteínoin WCRW klasickým spôsobom a v ďalšom kroku sa potom klonujú pre protilátky z hybridómov. V tomto príklade sa postupovalo druhým uvedeným spôsobom. Gény protilátok sa vyňali z hybridómnych bunkových línií pomocou primérov, ktoré boli komplementárne ku konzervovaným sekvenciám DNA v konštantných oblastiach a k úsekom základnej štruktúry (framework regions) variabilných oblastí. Gény sa potom amplifikovali pomocou PCR, viď Mullis a kol., Meth. Enzymol., 155, str. 335 až 350, (1987), Ehrlich (editori), PCR Technology, Stockton Press (New York 1989). Na prípravu izotypovo špecifických a degenerovaných primérov určených na klonovanie protilátkových génov (viď Jones a kol., Bio/technology 9, str. 88 až 89, (1991)) sa úspešne použila databáza myších sekvencii ťažkých a ľahkých reťazcov zostavená Kabatom a kol., Ministerstvo zdravotníctva USA, (1987). Je známych veľa techník určených na klonovanie menších fragmentov protilátok (napríklad Fab), ktoré vykazujú väzbové vlastnosti pôvodných protilátok. Celá molekula protilátky je pomerne veľká (150 kDa), avšak sa dokázalo, že oveľa menšie Fab a Fv fragmenty (12 až 50 kDa) si zachovávajú plnú väzbovú afinitu. Jednoreťazcové Fv fragmenty (scFv), v ktorých sú domény Vh a VI spojené hydrofilným a flexibilným peptidom, sa úspešne použili na nasmerovanie enzýmov a toxínov na špecifické bunky (Bird, Science 423, str. 423 až 426, (1988), Houston, PNAS 85, str. 5879 až 5883, (1988)). Pre väzbu antigénov sa tiež použili samotné Vh domény (Dabs) a samotné komplementaritu určujúce oblasti s dĺžkou púhych 20 aminokyselín (tzv. minimálne rozpoznávacie jednotky - m.r.u., minimal recognition units) viď Ward, Náture 341, str. 544 až 546, (1989), Taub, J. Biol. Chem 264, Str. 259 až 265 (1989), Wiliams, PNAS 86, str. 5537 až 5541, (1989). Vyplýva z toho teda, že je možné redukovať doménu špecificky rozpoznávajúcu proteíny WCRW na veľmi malú molekulu.
Klonovanie génov protilátok pomocou PCR
Na klonovanie génov pre imunoglobulíny alebo pre časti imunoglobulínov sa použili špecifické priméry a polymerázová reťazová reakcia. Pomocou vyššie opísanej databázy sa vybrali PCR priméry špecifické ako pre ťažký tak aj pre ľahký reťazec IgM a troch izotypov IgG. Priméry pre úsek, ktorý kóduje N-koniec variabilnej oblasti sa navrhli tak, aby boli komple42 mentárne k prvému úseku základnej štruktúry a naviac, aby boli istou dávkou degenerované a dali sa tak použit ako univerzálne priméry. 3' priméry použité na špecifickú PCR amplifikáciu variabilných oblastí sa navrhli z konzervatívnych sekvencii prvej konštantnej domény (CH1) ľahkého a ťažkého reťazca. Rôzne 31 priméry sa použili na amplifikáciu imunoglobulínov izotypov IgGl (3B1 a 17F6), IgG3 (10B6) a IgM (2B5). Protilátky izotypov IgG2A a IgG2B sa môžu amplifikovať pomocou rovnakého priméru, ktorý sa použil na amplifikáciu IgGl. Gény variabilného úseku protilátok sa klonovali do expresívnych vektorov pCIB4612 (ľahký) a pCIB4611 (ťažký reťazec). Tieto expresívne vektory obsahovali signálny peptid pre transport do endoplazmatického retikula a konštantnej oblasti ľahkého resp. ťažkého reťazca IgGl.
Tabulka 2 ukazuje štruktúru primérov použitých na PCR klonovanie ťažkého a ľahkého variabilného reťazca myších imunoglobulínov. Prípadne sa môžu použiť iné priméry opísané v literatúre (Coloma a kol., Bio/Techniques 11, str. 152 až 156, (1991), Jones a kol., Bio/Technology 9, str. 88 až 89, (1991)). Oligonukleotidy sa pripravili na DNA syntetizátore 380B firmy Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA) v štandardných podmienkach. V PCR primároch boli zabudované cieľové miesta pre reštrikčné enzýmy, ktoré uľahčili po amplifikácii a naštiepení príslušným enzýmom klonovanie do rastlinného expresívneho vektora pod kontrolou promótora CaMV 35S. Vybrali sa také cieľové miesta, ktoré sa nevyskytujú v sekvenovaných génoch pre protilátky.
Tabuľka 2
PCR priméry použité pri amplifikácii génov pre protilátky
Variabilné úsekv ľahkého reťazca 3B1. 2B5, 10B6, 14G1 a 17F6 vo vektoroch PCIB4614, PCIB4616, PCIB4625, PCIB4636 a PCIB4617:
NC92: CT-3 ' 5' Primér 5'-GTC TCG AGG AYA TYS WGM TSA CCC ART
(Sekvencia id. č.:37)
NC130: 3' Primér 5'-GCA GAT CTA GTT GGT GCA GCA TCA GCC
CG-3 ' (Sekvencia id. č.:38)
Variabilná oblasť_ťažkého reťazca protilátok 3B1_and 17F6 vo vektoroch PCIB4613 and PCIB4609
NC91: 5’ Primér 5'-GTC TCG AGC AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG-31 (Sekvencia id. č.:39)
NC114: 3' Primér 5'-GCA GAT CTA GAT CCA GGG GCC AGT GGA TA-3' (Sekvencia id. č.:40)
Variabilná oblasť ťažkého reťazca protilátky 2B5 vo vektore
PCIB4615:
NC91: 5' Primér 5'-GTC TCG AGC AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG-3' (Sekvencia id. č.:39)
NC111: 3' Primér 5'-GCA GAT CTG CAG GAG ACG AGG GGG AAG ACA TT-3' (Sekvencia id. č.:41)
Variabilná oblasť ťažkého reťazca protilátky 10B6 vo vektore
PCIB4637:
DB91: 5' Primér 5'-ACG TCT CGA GGA RGT GAA GCT KRW KGA RWC TG-3' (sekvencia id. č.:48)
NC117: 3’ Primér 5'-GCA GAT CTG CAG CCA GGG ACC AAG GGA
TA-3 ' (Sekvencia id. č.:42)
Variabilná oblasť ťažkého reťazca protilátky 14G1 vo vektore
PCIB4635:
DB91: 5' Primér 5'-ACG TCT CGA GGA RGT GAA GCT KRW KGA
RWC TG-3' (Sekvencia id. č.:48)
DB114: 3' Primér 5'-CAA TTC GCA TAT GAG ATC CAG GGG CCA
GTG GAT A-3' (Sekvencia id. č.: 49)
Y = CorT; S = CorG; W = AorT; M = CorA; R = AorG
Na prípravu prvého vlákna cDNA, použitého pre následné PCR reakcie, sa použila poly-A+ RNA, izolovaná z hybridómnych bunkových línií. Poly-A+ RNA sa extrahovala z 10® hybridómnych buniek pomocou guanidium tiokyanátovej lýzy a oligo (dT) celulózovej purifikácie. Na purifikáciu sa použil kit Fast Track mRNA na izoláciu mRNA (Invitrogen, San Diego, CA). Na tvorbu prvého vlákna cDNA sa použila približne jedna desatina izolovanej RNA (približne 500 ng). RNA sa inkubovala 30 minút pri teplote 42 ’C, potom sa zahriala na 5 minút na teplotu 95 ’C spolu so zmesou deoxynukleotidov (0,2mM každého dNTP), 5μg náhodných hexamérov pd (N6, Pharmacia LKB Biotechnology Inc, Piscataway) použitých vo funkcii primérov, 50 jednotkami MUMLV (Murine Moloney Leukémia Virus, vírus myšej leukémie) reverznej transkriptázy a 1 x PCR pufrom v celkovom objeme 100 μΐ reakčnej zmesi. Prvé vlákno cDNA sa izolovalo pomocou chloroform-fenolovej extrakcie a centrifugácie cez centrifugačnú chromátografickú kolónu deliacu podía velkosti molekúl (Chromá Spin 30, Clontech Laboratories, Inc. , Palo Alto, CA), čím sa odstránili náhodné hexaméry. Jedna desatina (10 μΐ) reakčnej zmesi s prvým vláknom cDNA sa pridala k 50 μΐ PCR reakčnej zmesi so špecifickými primérmi pre imunoglobulíny podía inštrukcií uvedených v amplifikačnom kite firmy Perkin-Elmer Cetus. Zmes sa amplifikovala 20 cyklami v termocykléri firmy Perkin-Elmer Cetus. Pri amplifikácii sa použili nasledovné teploty: denaturácia 94 ’C počas 1 hodiny, hybridizácia s primármi 52 ’C počas 1 minúty a 30 sekúnd a extenzia pri teplote 72 ’C na 1 minútu. PCR produkty sa elektroforeticky rozdelili na 6 % akrylamidovom géli (Novex, Encinitas, CA) a DNA sa purifikovala z výrezov gélu. Výrezy gélu sa najskôr zhomogenizovali v 200 μΐ TE pufra a potom purifikovali centrifugáciou cez kolónu Ultrafree-MC Milipore (Milipore, Bedford, MA). Eluát sa štiepil 30 minút 50 /ig/ml proteinázy K pri teplote 37 ’C a potom sa extrahoval zmesou f enol-chlorof orm-izoamyl (50 : 48 : 2). Po extrakcii nasledovala ďalšia extrakcia chloroformom a precipitácia etanolom. DNA sa resuspendovala v 40 μΐ pufra TE a potom štiepila príslušnými reštrikčnými enzýmami. PCR produkty variabilných oblastí protilátok sa štiepili enzýmami Xhol a Bgl II a opätovne purifikovali na 6 % akrylamidovom géli (viď vyššie). V poslednom kroku sa Xho Ι/Bgl II fragmenty ligovali do expresívneho vektora pre lahký (pCIB4612) alebo ťažký (pCIB4611) reťazec. Vektory sa vopred tiež štiepili reštrikčnými enzýmami Xho Ι/Bgl II. Expresívny vektor pCIB4612 obsahuje promótor CaMV 35S a terminačnú sekvenciu s 19 aminokyselín dlhým signálnym peptidom, ako aj konštantnú oblasť ľahkého reťazca CH1. Variabilné úseky ľahkého reťazca sa klonovali do Xho Ι/Bgl II miesta tak, aby sa exprimoval úplný ľahký reťazec.
Všetky protilátkové gény sa klonovali vyššie uvedeným spôsobom okrem ťažkého reťazca 10B6 a ťažkého a ľahkého reťazca 14G1. Tieto gény protilátok sa tiež klonovali z PCR produktov, ale produkty sa delili elektroforézou na 6 % akrylamidovom/TBE géli. Fragmenty sa vyrezali z gélu a eluovali pomocou 0,7M LiCl s prídavkom 2mM EDTA. Potom sa fragmenty precipitovali a resuspendovali v pufri lOmM Tris-HCl, 2mM EDTA, pH 7,5. Izolované PCR produkty sa priamo ligovali do klonovacieho vektora pT&Blue (Novagen) odvodeného od vektora pUC. Vzhľadom na to, že Taq DNA polymeráza ponecháva na 3' konci reakčného produktu jeden presahujúci adenínový nukleotid (Clark, Nucl. Acids Res. 16, str. 9677 (1988)) môže sa klonovať priamo tento produkt do vektora, ktorý obsahuje komplemen46 tárny voľný presahujúci T-nukleotid (Marchuk a kol., Nucl. Acids Res. 19, str. 1154, (1990)).
Vektor pCIB4612 sa pripravil štvornásobnou ligáciou 155 bp dlhého Ddel/Styl fragmentu konštantnej oblasti ľahkého reťazca z myšieho Ig Kappa reťazca (Schulze-Gahmen a kol., J’. Biol. Chem. 263, str. 17100 až 17106, (1988), Kabat a kol., Ministerstvo zdravotníctva USA (1987)) a 71 bp dlhého fragmentu Xhol/Ddel, 101 bp dlhého fragmentu Styl/BglII a 3,8 kb dlhého zvyšku vektora pCIB4610 po štiepení enzýmami Xhol/BglII. Hybridizáciou oligonukleotidov KE109A28 a KE110A28 sa pripravil 101 bp dlhý fragment s presahujúcimi miestami Styl a BamHI.
KE109A28: 5' -CAA GGA CGA GTA TGA ACG ACA TAA CAG CTA TAC
CTG TGA GGC CAC TCA CAA GAC ATC AAC TTC ACC CAT TGT CAA
GAG CTT CAA CAG GAA TGA GTG TTA GG- 3' (Sekvencia id. č.:19)
KE110A28: 5’ -GAT CCC TAA CAC TCA TTC CTG TTG AAG CTC TTG
ACA ATG GGT GAA GTT GAT-GTC TTG TGA GTG GCC TCA CAG GTA
TAG CTG TTA TGT CGT TCA TAC TCG TC- 3’ (Sekvencia id. č. :20)
Hybridizáciou oligonukleotidov KE111A28 a KE112A28 sa pripravil 71 bp dlhý fragment s presahujúcimi miestami Xhol a Ddel.
KE111A28: 5' -TCG AGG GTA CCG AGC TCT AGA TCT GTA TCC ATC TTC CCA CCA TCC AGT GAG CAG TTA ACA TCT GGA GGT GCC- 3’ (Sekvencia id. č.:21)
KE112A28: 5' -TGA GGC ACC TCC AGA TGT TAA CTG CTC ACT GGA TGG TGG GAA GAT GGA TAC AGA TCT AGA GCT CGG TAC CC- 3' (Sekvencia id. č.:22)
Expresívny vektor pCIB4611 obsahuje konštantné oblasti ťažkého reťazca CH1 až CH3 a podobne sa môže klonovať do mies4Ί ta Xhol/BglII aj variabilná oblasť ťažkého reťazca tak, aby sa exprimoval kompletný ťažký reťazec. Vektor pCIB4611 sa pripravil ligáciou Ncol/BstXI fragmentu génu konštantnej oblasti ťažkého reťazca z myšieho IgGl Gama (viď Honjo a kol., Náture 277, str. 627 až 633, (1979), Kabat a kol., US Dept of Health and Human Services (1987)) s dvomi hybridizovanými 40 bp dlhými oligonukleotidovými fragmentárni a následnou ligáciou výsledného 982 bp dlhého fragmentu do vektora pCIB4610, ktorý bol predtým štiepený reštriktázami BglII a Xhol. Jeden 40 bp dlhý fragment sa pripravil hybridizáciou oligonukleotidov KE106A28 a KE107A28 a má presahujúce konce Xhol/Ncol, zatiaľ čo druhý 40 bp dlhý fragment sa pripravil hybridizáciou oligonukleotidov KE108A28 a KE105A28 a má presahujúce konce BstXI a BamHl.
KE106A28: 5' -TCG AGG GTA CCG AGC TCT AGA TCT GCT GCC CAA
ACT AAC TC- 3' (Sekvencia id. č.:23)
KE107A28: 5' -CAT GGA GTT AGT TTG GGC AGC AGA TCT AGA GCT
CGG TAC CC- 3' (Sekvencia id. č.:24)
KE108A28: 5' -CTG GTA AAG GCG GCC GCA TCG ATT AAG TCG ACC
CGC GGG- 3' (Sekvencia id. č.:25)
KE105A28: 5' -GAT CCC CGC GGG TCG ACT TAA TCG ATG CGG CCG
CCT TTA CCA GGA GA- 3’ (Sekvencia id. č.:26)
Vektor pCIB4610 obsahuje sekvenciu, ktorá kóduje 19 aminokyselín dlhý signálny peptid pre myšie endoplazmatické retikulum umiestnené medzi CaMV 35S terminačnú sekvenciu. Vektor pCIB4610 sa pripravil ligáciou 83 bp dlhého produktu PCR naštiepeného enzýmami BamHl a Hpaľ do vektora pCIB4600 naštiepeného rovnakými enzýmami. Produkt PCR reakcie sa pripravil s použitím vektora pCIB4600 ako templátu pre PCR a primérov KE102A28 a KE101A28. Vektor pCIB4610 sa líši od pôvodného vektora pCIB4600 len neprekladanou vedúcou sekvenciou za promótorom CaMV 35S. Vektor pCIB4610 obsahuje konsenzuálnu rastlinnú sekvenciu na iniciáciu translácie AACA ATG (sekvencia id. č.
27), kde ATG je počiatkom translácie, zatial čo vektor pCIB4600 obsahuje sekvenciu TCCG ATG (sekvencia id. č. 28).
KE102A28: 5’ -CGA AGT TAA CAG ATC TAG AGC TCG G- 3' (Sekvencia id. č.: 29)
KE101A28: 5' -CGG GAT CCA ACA ATG GGA TGG AGC TGG ATC
TT-3’ (Sekvencia id. č.: 30)
Vektor pCIB4610 sa pripravil ligáciou derivátu expresívneho vektora pCIB710 s promótorom CaMV 35S (Rohstein a kol., Gene 53, str. 153 až 161, (1987)) naštiepeného enzýmami BamHI a Sací s 86 bp dlhým BamHI/SacI fragmentom, ktorý kóduje signálny peptid pre endoplazmatické retikulum (Kabat a kol., Ministerstvo zdravotníctva USA, (1987)). Sekvencia tohto 86 bp dlhého fragmentu je nasledovná.
5' -GAT CCA ACA ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG
TCA GTT GTT ACC CTA CCT CGA CCT AGA AAG AGA AGG AGG ACA GTG
GAG CTG CAG GTG TCC ATT GCC TAC TCG AGG GTA CCG AGC TCC TCG
ACG TCC ACA GGT AAC GGA TGA GCT CCG ATG GC- 3' (Sekvencia id.
Č.: 31)
Jednotlivé variabilné oblasti ľahkých a ťažkých reťazcov piatich rôznych monoklonálnych línií proti WCRW sa klonovali do expresívnych vektorov za vzniku nasledovných konštruktov:
pCIB4613: variabilná oblasť ťažkého reťazca 3B1 pCIB4614: variabilná oblasť ľahkého reťazca 3B1 pCIB4615: variabilná oblasť ťažkého reťazca 2B5 (NRRL B-21216) pCIB4616: variabilná oblasť lahkého reťazca 2B5 (NRRL B-21217)
PCIB4609: variabilná B-21215) oblasť ťažkého reťazca 17F6 (NRRL
pCIB4617: variabilná B-21218) oblasť ľahkého reťazca 17F6 (NRRL
PCIB4637: variabilná B-21279) oblasť ťažkého reťazca 10B6 (NRRL
PCIB4625: variabilná oblasť ľahkého reťazca 10B6 (NRRL
B—21219)
PCIB4635: variabilná B—21277) oblasť ťažkého reťazca 14G1 (NRRL
pCIB4636: variabilná B-21278) oblasť ľahkého reťazca 14G1 (NRRL
PCIB4631: variabilná oblasť ľahkého aj ťažkého reťazca
3B1 (NRRL B-21278)
Vyššie uvedené expresívne vektory s prístupovým číslom NRRL boli 7.marca 1994 uložené u Agricultural Research Service, Patent Culture Colection (NRRL), Northern Regional Research Centre, 1815, North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA. výnimku tvoria vektory pCIB4637, pCIB4635 a pCIB4636, ktoré boli uložené 3.júna 1994.
Tabuľka 3 obsahuje prehľad identifikačných čísiel sekvencií variabilných oblastí. V prípade vektorov pCIB4613, pCIB4617, PCIB4625, pCIB4637, pCIB4635 a pCIB4636 ide o kompletné sekvencie variabilných oblastí, ktoré začínajú prvým kodónom prvého úseku variabilnej oblasti a končia posledným kodónom štvrtého úseku štruktúry variabilnej oblasti. Variabilná oblast vo vektore pCIB4609 nie je úplná, 5' koniec kódujúcej sekvencie je skrátený a sekvencia tak začína druhou CDR oblasťou variabilnej oblasti.
Tabuľka 3
Prehľad DNA sekvencii
Sekvencia id. č.l:
Sekvencia id. č.2:
Sekvencia id. č. 3 :
Sekvencia id. č.4:
Sekvencia id. č.5:
Sekvencia id. č.6:
Sekvencia id. č.7:
Sekvencia id. č.8:
Sekvencia id. č.9:
Sekvencia id. č.10:
Sekvencia id. č.11:
reťazcov protilátok
DNA variabilnej oblasti ťažkého reťazca 3B1 sekvencia proteínu variabilnej oblasti ťažkého reťazca 3B1
DNA variabilnej oblasti ľahkého reťazca 3B1 sekvencia proteínu variabilnej oblasti ľahkého reťazca 3B1
DNA variabilnej oblasti ťažkého reťazca 2B5 sekvencia proteínu variabilnej oblasti ťažkého reťazca 2B5
DNA variabilnej oblasti ľahkého reťazca 2B5 sekvencia proteínu variabilnej oblasti ľahkého reťazca 2B5
DNA variabilnej oblasti ťažkého reťazca 17F6 sekvencia proteínu variabilnej oblasti ťažkého reťazca 17F6
DNA variabilnej oblasti ľahkého reťazca 17F6
Sekvencia id. č.12: sekvencia proteínu variabilnej oblasti ľahkého reťazca 17F6
Sekvencia id. č.13: DNA variabilnej oblasti ťažkého reťazca 10B6
Sekvencia id. č.14: sekvencia proteínu variabilnej oblasti ťažkého reťazca 10B6
Sekvencia id. č.15: DNA variabilnej oblasti ľahkého reťazca 10B6
Sekvencia id. č.16: sekvencia proteínu variabilnej oblasti ľahkého reťazca 10B6
Sekvencia id. č.17: DNA jednoreťazcovej protilátky 3B1
Sekvencia id. č.18: sekvencia proteínu jednoreťazcovej protilátky 3B1
Sekvencia id. č.44: DNA variabilnej oblasti ťažkého reťazca 14G1
Sekvencia id. č.45: sekvencia proteínu variabilnej oblasti ťažkého reťazca 14G1
Sekvencia id. č.46: DNA variabilnej oblasti ľahkého reťazca 14G1
Sekvencia id. č.47: sekvencia proteínu variabilnej oblasti ľahkého reťazca 14G1
Syntéza DNA oligonukleotidov
DNA oligonukleotidy sa syntetizovali pomocou syntetizátoru 380B firmy Applied Biosystems a štandardného postupu. 01igoméry sa pripravili modernizovaným SSCAF3 cyklom na 0,2 Mmol malej kolóne ABI s veľkými pórmi. Na konci procedúry sa z ko52
Ióny vymyl trityl a oligomér sa odštiepil z tuhej fázy štandardným automatickým štiepacím cyklom syntetizátora 380B. 01igonukleotidy sa potom odblokovali v prebytku hydroxidu amónneho pri teplote 55 ’C. Odblokovanie trvalo 8 až 12 hodín. Potom sa oligonukleotidy vysušili v evaporátore v dusíkovej atmosfére. Nakoniec sa oligonukleotidy resuspendovali v 0,25 až 0,5 ml deionizovanéj vody.
Purifikácia syntetických DNA oligonukleotidov
Alikvót každého oligonukleotidu sa zmiešal s ekvivalentným množstvom zmesi modrého farbiva a formamidu tak, aby výsledný roztok obsahoval 0,05 % brómfenolovej modrej, 0,05 % xylén kyanolu FF a 25 % formamidu. Táto zmes sa 10 minút zahrievala pri teplote 95 ’C tak, aby došlo k denaturácii oligonukleotidov. Vzorky sa potom naniesli na 12 % polyakrylamidový gél s obsahom 7M močoviny (Sambrook a kol.). Po 3 až 4 hodiny trvajúcej elektroforéze pri napätí 300 a 400 V vo vertikálnej elektroforéznej jednotke firmy Hoefer (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA) sa pomocou UV transiluminátora v géli vyhľadali fragmenty so správnou veľkosťou, ktoré sa potom skalpelom vyrezali. Tieto fragmenty gélu sa homogenizovali a inkubovali cez noc v pufri s obsahom 0,4M LiCl, lmM EDTA (pH 8) pri teplote 37 ’C.
Na separáciu oligonukleotidov z gélu sa použila jedna z dvoch nasledujúcich metód: použitie mikrónovej pórovitej polyetylénovej filtračnej jednotky Gel/X (Genex Corp., Gaithersburg) alebo 0,45 mikrónové filtračné jednotky Millipore (Millipore ultrafree-MC 0,45μ). Purifikované oligonukleotidy sa precipitovali etanolom, peletovali centrifugáciou v mikrocentrifúge (20 minút pri teplote 4 ’C) a nakoniec rozpustili v TE pufri (lOmM Tris-HCl, lmM EDTA, pH 8,0). Na základe absorbancie pri vlnovej dĺžke 260 nm sa upravila koncentrácia oligonukleotidov na 50 ng/μΐ.
Fosforylácia oligonukleotidov
V každej 20 μΐ kinázovej reakcii sa použil 1 pikomól purif ikovaného oligoméru v pufri s obsahom 7,0mM Tris-HCl, pH
7,5, lOmM KC1, lmM MgCl2, 0,5mM DTT, 50 Mg/ml BSA, 3000 gCi (3 pikomóly) 32P-r-ATP a 8 jednotiek T4 polynukleotid kinázy. Kinázová reakcia sa inkubovala 1 hodinu pri teplote 37 ’C, potom nasledovala fenol/chloroformová extrakcia a trojnásobná precipitácia v etanole s glykogénom ako nosičom (Tracy, Prep. Biochem. 11, str. 251 až 268, (1981)).
Hybridizácia oligonukleotidov na priame klonovanie
Oligoméry určené na hybridizáciu sa zhromaždili (od 1 Mg do 20 M9 celkovej DNA) a fosforylovali sa jednu hodinu v 1 x ligačnom pufri Promega s obsahom 30mM Tris-HCl, pH 7,8, lOmM MgCla, lOmM DTT a lmM aATP pri inkubačnej teplote 37 ’C. V reakcii sa použila jedna až dvadsať jednotiek T4 polynukleotidkinázy podía toho, aké bolo množstvo celkovej DNA. Fosforylácia sa ukončila ponorením reakčnej zmesi do vriaceho vodného kúpeľa na 5 minút. Zhromaždené oligonukleotidy sa doplnili hybridizačným pufrom na objem 50 až 100 μΐ tak, aby konečná koncentrácia solí bola lOOmM NaCl, 120mM Tris-HCl pH 7,5 a lOmM MgCl2. Fosforylované aj nefosforylované oligonukleotidy sa spojili dohromady a opäť sa inkubovali 5 minút vo vriacom vodnom kúpeli a potom sa postupne počas približne štyroch hodín ochladzovali na izbovú teplotu. Hybridizovaná oligonukleotidy sa potom extrahovali fenol/chloroformovou zmesou, precipitovali etanolom a resuspendovali v 17 μ1 TE pufra (lOmM Tris-HCl, lmM EDTA, pH 8,0). K týmto 17 μΐ sa pridal ligačný pufor tak, aby vo výsledných 20 μΐ roztoku boli tieto koncentrácie reaktantov 30mM Tris-HCl, pH 7,8, lOmM MgCl2, lOmM DTT, lmM dATP a 3 jednotky T4 DNA ligázy (Promega, Madison, WI). Ligačná reakcia prebiehala približne 2 hodiny pri izbovej teplote. Hybridizované/ligované fragmenty sa elektroforeticky prečistili na 2 % agaróze Nusieve (FMC BioProducts, Rockland, ME) a to pred a/alebo po enzymatickej reštrikcii a pred vlastným klonovaním do vektorov. V 20 μΐ ligačnej zmesi sa použilo
100 ng až 500 ng každého fragmentu s približne ekvimolárnym množstvom DNA vektora v pufri s obsahom 30mM Tris-HCl, pH
7,8, lOmM MgCl2, lOmM DTT, lmM dATP a 3 jednotky T4 DNA ligázy (Promega, Madison, WI). Ligačná reakcia prebiehala približne dve hodiny pri izbovej teplote. Po ligačnej reakcii sa DNA transformovali zmrazené kompetentné baktérie E. coli s použitím štandardných postupov (Sambrook a kol.)., Transformanti sa selektovali na LB-agare (Sambrook a kol.) s obsahom 100 gg/ml ampicilínu (viď ďalej).
Príklad 5
Konštrukcia molekuly jednoretazcovej protilátky (SCA)
Vektor pCIB4631 obsahuje DNA, ktorá kóduje jednoretazcovú protilátku (SCA-single Chain antibody) špecifickú k BBMV WCRW fúzovanú s génom pre konštantné oblasti ťažkého reťazca protilátky. Gén SCA obsahuje fúzne variabilné fragmenty protilátky 3B1 (monoklonálne línie 3B1 so špecifitou proti membránovým vezikulám kefkového lemu WCRW) z ľahkého aj ťažkého reťazca spolu s 19 aminokyselín dlhou signálnou sekvenciou pre endoplazmatické retikulum. Medzi fragmenty Fv ťažkého a ľahkého reťazca je vložený 10 aminokyselín dlhý doménový linker (GGGGSGGGGS, sekveneia id. č. 32), viď Huston a kol., PNAS 85, str. 5879 až 5883, (1988). Vektor pCIB4631 sa pripravil fragmentu (Fv: konštatntná terminačný úsek: fragment Xbal/BglII fragmentu (CaMV ligáciou 4,1 kb dlhého Xbal/Xhol oblasť ťažkého reťazca: CaMV 35S vektora pCIB4613) a 1,4 kb dlhého
35S promótor: ľahký fragment Fv z vektora pCIB4614) a ďalej ešte 36 bp dlhého linkeru s presahujúcimi koncami BglII/Xhol.
Tento 36 bp dlhý linker vznikol hybridizáciou oligonukleotidov KE147A28 a KE182A28:
KE147A28: 5' -GAT CTG GTG GCG GTG GCT CGG GCG GTG GTG GGT CGC- 3’ (Sekveneia id. č.:33)
ΚΕ182Α28: 5' -TCG AGC GAC CCA CCA CCG CCC GAG CCA CCG CCA CCA -3' (Sekvencia id. č.:34)
Oligonukleotidy sa purifikovali vyššie uvedeným spôsobom na 12 % akrylamidovom géli so 7M močovinou. Po UV transiluminácii sa z gélu vyrezali prúžky, ktoré obsahovali fragment so správnou dĺžkou. Oligonukleotidy sa ďalej f'osforylovali, viď vyššie.
Expresívny vektor pCIB4631 bol 7. u Agricultural Research Service, Patent (NRRL), Northern Regional Research Centre, sity Street, Peoria, Illinois 61604, USA prístupové číslo NRRL B-21220.
marca 1994 uložený Culture Colection
1815, North Univera bolo mu pridelené
Príklad 6
Charakterizácia väzbových vlastností SCA
Jednoretazcové protilátky sa exprimovali v kukuričných protoplastoch a izolovali sa. Dokázalo sa, že sa viažu na proteíny membránových vezikúl kefkového lemu WCRW vo Western blote aj na izolované rezy stredného čreva WCRW v imunoteste (Bravo a kol., J. of Invert. Path. 60, str. 237 až 246, (1992), Bravo a kol., J. of Invert. Path. 60, str. 247 až 253, (1992)).
Izolácia suspenzných kukuričných protoplastov
Embryogénne suspenzné kultúry odvodené od nedospelých embryonálnych kultúr kukurice odrody Ciba Seeds inbred B73 alebo prípadne od Čiernej Mexickej Sladkej sa udržiavali v bazálnom médiu B6 (Chu a kol., 1975) doplnenom 3 % sacharózou a 2 mg/ml 2,4-D. Kultivácia prebiehala pri teplote 27 ’C na otočnnej trepačke pri 130 otáčkach za minútu a kultúry sa raz za týždeň pasážovali. Suspenzné bunky sa odobrali 1 až 2 dni po pasážovaní a resuspendovali sa v enzymatickom roztoku (3 % celulóza RS, 1 % macerozým RIO v pufri KMC: 8,7 g/1 KC1, 12,5 g/1 CaCl2, 16,4 g/1 MgSO^, 5 g/1 MES, pH 7,5) v pomere 2 ml kompaktného bunkového objemu k 20 ml enzymatického roztoku. Bunky sa rozdelili do Petriho misiek 100 x 25 mm a inkubovali štyri hodiny pri izbovej teplote na otočnej trepačke pri 50 otáčkach za minútu.
Transformácia protoplastov
Ihneď po izolácii sa protoplasty resuspendovali v pufri RS (0,45M manitol, 15mM CaCl2, 0,1 % MES, pH 7,5) tak, aby výsledná hustota bola 6 miliónov buniek na 1 ml. 0,5 ml veľké alikvóty sa umiestnili do polystyrénových skúmaviek 17 x 100 mm. Potom sa pridalo 50 μ% DNA vektora pCIB4631 a 50 gg CaMV 35S GUS (napríklad pB1221, Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) ako pozitívna kontrola. Potom sa do skúmaviek pridalo 0,5 ml roztoku polyetylénglykolu (40 % PEG 6000, 0,4M manitol, 0,IM Ca(NO)3) a celá zmes sa jemne premiešala ľahkým trepaním skúmavky. Po 30 minútach inkubácie pri izbovej teplote sa protoplasty po krokoch rozpustili v 1 ml, 2 ml, 5 ml a 10 ml roztoku W5 (9,0 g/1 NaCl, 18,5 g/1 CaCl2, 0,37 g/1
KCl, 0,9 g/1 glukózy, pH 5,6), sedimentovali a resuspendovali sa v kultivačnom médiu (MS soli, vitamíny B5, 3 % sacharóza, mg/ml 2,4-D, 0,3M manitol) tak, aby bunková hustota bola 2x10® protoplastov na ml. Protoplasty sa inkubovali v tme pri teplote 26 ’C. Po 18 až 22 hodinách sa protoplasty preniesli do mikroskúmaviek, sedimentovali a resuspendovali sa v 0,4 ml extrakčného pufra (lOOmM KHPO^, lmM DTT, pH 7,8). Vzorky sa potom sonikovali a debris sa peletovala centrifugáciou.
Väzba jednoreťazcových protilátok na membránové vezikuly kefkového lemu WCRW:
Vyššie uvedeným spôsobom sa pripravili membránové vezikuly kefkového lemu. Vezikuly sa potom elektroforeticky rozdelili na 8 až 16 % akrylamidovom géli v prítomnosti SDS (Novex, San Diego, CA). Proteíny sa potom preniesli na nitrocelulózovú membránu (Burnette, Western Blotting 112, str. 195, (1991)). Potom sa membrány inkubovali s extraktom z kukuričných proto57 plastov, ktorý obsahoval proteíny jednoreťazcových protilátok. Jednoreťazcový protilátkový proteín 3B exprimovaný vektorom pCIB4631 bol vo Western blote schopný väzby na proteín BBMV s rovnakou molekulovou hmotnosťou, na ktorý sa viazala pôvodná monoklonálna protilátka 3B1. Jednoreťazcová protilátka exprimovaná v kukurici bola tiež schopná väzby na rezy zo stredného čreva WCRW v imunosekčných experimentoch (Bravo a kol., J. of Invert. Path. 60, str. 237 až 246, (1992), Bravo a kol., J. of Invert. Path. 60, str. 247 až 253, (1992)).
Príklad 7
Konštrukcia imunotoxínov špecifických na WCRW
Jednoreťazcová protilátka so špecifitou proti membránovým vezikulám kefkového lemu WCRW sa spojila s toxickou oblasťou exotoxínu A baktérií Pseudomonas. Pseudomonas exotoxín A sa použil pri syntéze rekombinantných hybridných proteínov zložených z toxínu a protilátky, ktoré sa použili pri liečbe rakoviny a imunologických ochorení (Pastan I., Fitzgerald D., J. Biol. Chem. 264, str. 15157 až 15160, (1989) a Patan a kol., Annu. Rev. Biochem. 61, str. 331 až 354, (1992)). Štruktúra pseudomonálneho exotoxínu je dobre známa a tiež je známa aj jeho funkcia. Myšlienka použitia hybridných proteínov toxín/protilátka v úlohe insekticídov je nová a bezprecedentná.
Pseudomonálny exotoxín (PE) je jednoreťazcový toxín produkovaný baktériami Pseudomonas aeruginosa. Zabíja bunky ireverzibilnou ADP-ribozyláciou a inaktiváciou translačného elongačného faktora 2 (EF-2). Štruktúra PE je dobre známa (Chaudhary V. K. a kol., J. Biol. Chem. 265, str. 16303 až 16310, (1990)). PE pozostáva z troch domén. Doména la je zodpovedná za rozpoznávanie buniek a väzbu PE na cieľovú bunku, doména II je potrebná na translokáciu ADP-ribozylačnej aktivity do cytozolu a nakoniec doména III je nositeľom ADP-ribozylačnej aktivity. Pri vstupe do bunky sa toxín najprv internalizuje endo58 cytickými vezikulami. Vnútri vezikúl dôjde k proteolytickému štiepeniu za vzniku 37 kDa domény III - aktivovavého toxínu. Delécia domény la vedie k odstráneniu domény, ktorá sprostredkováva väzbu na cieľovú bunku. Vzniká tak 40 kDa proteín (PE40) s extrémne nízkou cytotoxicitou. Väzba protilátky na PE40 sa využila pri tvorbe mnohých rekombinantných imunotoxínov na liečbu rakoviny. Uznáva sa, že väzba fúzneho proteínu PE40-protilátka musí byt nasledovaná receptormi sprostredkovanou endocytózou, inak nedôjde k náležitej aktivácii PE40 a následnému prechodu do cytozolu.
Toxická doména PE sa naviazala na C-koniec fragmentu ťažkého reťazca jednoreťazcovej protilátky WCRW 3B1 pretože sa dokázalo, že fúzia na N-koniec PE40 nevedie k strate cytotoxicity. Môžu sa tiež vytvoriť fúzne proteíny, v ktorých je jednoreťazcová protilátka viazaná na C-koniec toxínu PE40 (Prior a kol., Celí zväzok 64, str. 1017 až 1023). Tieto fúzne proteíny jednoreťazcovej protilátky sa vytvorili a testovali v expresívnych vektoroch v baktériách E. coli. Použil sa pritom expresívny vektor p-FLAG, ktorý obsahuje tac promótor indukovateľný IPTG, po ktorom nasledujú sekvencia, ktorá kóduje signálny peptid ompA pre sekréciu do periplazmy a osem aminokyselín dlhý epitop FLAG, ktorý umožňuje izoláciu fúzneho proteínu pomocou afinitnej chromatografie. Z tohto expresívneho vektora FLAG sa purifikovali fúzne jednoreťazcové protilátky. Tieto jednoreťazcové protilátky sa potom stali súčasťou diéty skúmaného hmyzu pri testoch aktivity.
Tento fúzny proteín PE40-jednoreťazcová protilátka sa pripravil ligáciou približne 1,2 kb dlhého SpHI/EcoRI fragmentu s obsahom PE40 a 700 bp dlhého HindlII/Sphl fragmentu s obsahom jednoreťazcovej protilátky 3B1 do 5,37 kb dlhého vektora pFLAG (IBI, New Haven, CT) naštiepeného reštriktázami HindlIl/EcoRI. Fragment s obsahom PE40 sa získal z vektora pWW20, ktorý obsahuje toxickú doménu pseudomonálneho exotoxínu pod kontrolou indicibilného promótora Lac (Wels a kol., Cancer Research 52, str. 6310 až 6317, (1992)). 700 bp dlhý fragment s obsahom jednoreťazcovej protilátky 3B1 sa vytvoril pomocou PCR, pričom ako templát sa použil vektor pCIB4631 ako a priméry sa použili oligonukleotidy NC200 a NC202.
NC200: CGAAGCTTGA CATTGTGCTG ACCCAG (Sekvencia id. č.:35)
NC202: GCCCTCTAGA AGCATGCCTG AGGAGACGGT GACTGA (Sekvencia id. č.:36)
Príklad 8
Transformácie a expresie v rastlinách
Hybridné toxíny zložené z protilátkovej domény a z toxínovej domény sa transformujú do rastlín obvyklým spôsobom, viď WO 93/07278, 08/008 006 a 08/037 057. Binárne toxíny zložené z dvoch nezávislých protilátkových reťazcov alebo protilátkových domén sfúzovaných s toxínom sú exprimované a zostavené v rastlinách bežným bunkovým mechanizmom. Proteíny zložené z jednoreťazcovej protilátky a toxínu sú exprimované buď v cytoplazme raslinnej bunky a smerované do rastlinnej apoplazmy, alebo v prípade hybridných toxínov s bunkovou cytotoxicitou sú smerované do vnútra organel v rastlinnej bunke (Taviadoraki a kol., Náture 366, str. 469 až 472, (1993), Owen a kol., Bio/Technology 10, str. 790 až 794, (1992), Firek a kol., Plánt Molecular Biology 23, str. 861 až 870, (1993)). Známe, v literatúre opísané spôsoby sú použité na nasmerovanie proteínov do chloroplastov alebo do vakuoly pre endoplazmatické retikulum. V literatúre sú opísané smerovacie signály vo forme peptidov na karboxy konci (Bednarek S. a kol., Plánt Celí 3, str. 1195 až 1206, (1991), Neuhaus J. M. a kol., PNAS 88, str. 10362 až 10366, (1991), Bednarek S. a kol., Plánt Mol. Biol. 20, str. 133 až 150 (1992), Chrispeels M. J. a kol., Celí 68, str. 613 až 616, (1992), Nakamura K., Plánt Physiol. 101, str. 1 až 5, (1993), Dobrowski J. E., Plánt Celí 5, str. 587 až 596 (1993), Schroeder M. R., Plánt Physiol 101, str. 451 až 458, (1993)). Tiež aj signály na smerovanie do chloroplastov sú opísané v literatúre a majú podobu N-koncových peptidov (Van Den Broeck G. a kol., Náture 313, str. 358 až 363, (1985), Smeekens S. a kol., Plánt Mol. Biol. 9, str. 377 až 388, (1987), Szabo L. J. a kol., v knihe Plánt DNA Infectious Agents (Rastlinné infekčné DNA), editory Hohn T. a Schell J., vyd. Springer, Viedeň, str. 321 až 339, (1987), Keegstra K. a kol., Annu Rev. Plánt Physiol. Plánt Mol. Biol. 40, str. 471 až 501, (1989)).
Vynález opisuje spôsoby konštrukcie toxínových molekúl, ktoré sú špecificky namierené na určitý druh hmyzu. Tieto konštrukty sú špecificky namierené na hmyz, ktorý odolal väzbe toxínu a cytotoxickým účinkom BI endotoxínu. Ďalej sú toxínové molekuly konštruované tak, aby boli špecifické pre konkrétnych hmyzích škodcov.
Pretože boli pomerne podrobne opísané aj vynálezy, ktoré patria do stavu techniky je zrejmé, že sa tak stalo len v záujme väčšej jasnosti a ľahkého pochopenia a že boli urobené zmeny v zmysle nárokov.
Príklad 9
Príklady aplikačných foriem vynálezu
Aktívnou zložkou použitou v nasledujúcich aplikačných formách sú purifikované fúzne proteíny jednoreťazcových protilátok podľa príkladu 7.
Al Zmáčateľné prášky aktívna zložka lignosulfát sodný laurylsulfát sodný diizobutylnaftalénsulfonát sodný
a) b) c) % 50 % 75 % % 5 % — % — 5 % % 10 % oktylfenol-polyetylénglykoléter — 2 % — (7 až 8 mólov etylén oxidu) jemne dispergovaná kyselina kremičitá 5 % 10 % 10 % kaolín 65 % 27 % —
Spóry sa dôkladne premiešajú s adjuvans a celá zmes sa potom dôkladne rozomelie vo vhodnom mlecom zariadení za vzniku zmáčatelného prášku. Zmáčatelný prášok sa môže rozpustiť vo vode, čím vznikne suspenzia s požadovanou koncentráciou aktívnej zložky.
A2 Emulgovatelny koncentrát aktívna zložka 10 % oktylfenol-polyetylénglykoléter 3 % (7 až 8 mólov etylén oxidu) dodecylbenzénsulfonát vápenatý 3 % ricínový olej polyglykoléter 4 % (36 mol etylén oxidu) cyklohexanón 30 % zmes xylénov 50 %
Rozpustením vo vode sa môže získať emulzia s lubovolnou koncentráciou.
A3 Prášky
a) b)
aktívna zložka 5 % 8 %
mastenec 95 % —
kaolín —— 92 %
Prášky pripravené na okamžité použitie sa získajú zmiešaním aktívnej zložky s nosičom a dôkladným rozomletím zmesi vo vhodnom mlecom zariadení.
Α4 Lisovaný granulát aktívna zložka 10 % lignosulfát sodný 2 % karboxymetyl celulóza 1 % kaolín 87 %
Aktívna zložka alebo zmes sa zmieša s adjuvans a rozomelie sa. Zmes sa potom lisuje pretláčaním, granuluje a suší sa v prúde vzduchu.
A5 Poťahované granule aktívna zložka 3 % polyetylénglykol (mol.hm.200) 3 % kaolín 94 %
Aktívna zložka alebo zmes sa pomaly a rovnomerne pridáva do mixéra ku kaolínu, ktorý je zvláčnený polyetylénglykolom. Týmto spôsobom sa získajú neprášivé poťahované granule.
A6 Koncentrovaná suspenzia aktívna zložka 40 % etylénglykol 10 % nonylfenol-polyetylénglykoléter 6 % (15 mol etylén oxidu) lignosulfát sodný 10 % karboxymetyl celulóza 1 % % vodný roztok formaldehydu 0,2 % silikónový olej vo forme 75 % 0,8 % vodného roztoku voda 32 %
Aktívna zložka sa bezodkladne zmieša s adjuvans za vzniku koncentrovanej suspenzie, z ktorej sa môže pripraviť ľubovoľná suspenzia požadovanej koncentrácie nariedením vodou.
Stručný opis obrázku
Obrázok 1
Na obrázku je viditeľný výsledok analýzy pomocou western-blotu. BBMV Diabrotica virgifera sa elektroforeticky rozdelili na polyakrylamidovom géli a potom sa preniesli na membránu a detegovali pomocou monoklonálnych protilátok. Pri tomto pokuse sa použili protilátky produkované bunkovými líniami 3B1, 2B5, 17F6 a 10B6. MW znamená štandardy molekulovej hmotnosti.
INFORMÁCIA 0 SEKVENCII ID. Č. 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DÍŽKA: 357 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTNENIE: 1 až 357 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: variabilná oblasť ťažkého reťazca protilátky 3B1 z vektora pCIB4613 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 1
CAG GTC AAA CTG CAG GAG TCT GGT GGA GGA TTG GTG CAG CCT AAA GGG Gin Val Lys Leu Gin Glu Sér Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Lys Gly
TCA TTG AAA CTC TCA. TGI GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AAT AAC TTC Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Phe
GCC ATG AAC TGG GIC CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTG GAA TGG GTT 144
Ala Met Asn. Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
GCT CGC ATA AGA AGT AAA AGT AAT AAT TAT GCA ACA TCT TAT GGC GAT 192
Ala Arg íle Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Gly Asp
50 55 60
TCA GTG AAA GAC AGvj TTC ACC GTC TCC AGA GAT GAT TCA CAA AGC ATG 240
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gin Ser Met
65 70 75 80.
TTC TAT CTG CAA ATG AAC AAC TTG AAA ACT GAG GAC ACA GCC ATG TAT 288
Phe Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
TAC TGT GTG AGG GTA . GľA . TAC : GGT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA 336
Tyr Cys Val Arg Val Val . Tyr : Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
ACC TCA GTC ACC GTC TCC : tca 357
Thr Ser Val Thr Val Ser : Se:
115
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCÍE (A) DĹŽKA: 119 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCÍE ID. Č. 2:
Gin Val Lys Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Lys Gly 15 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Phe 20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Arg íle Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Gly Asp 50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gin Ser Met 65 70 75 80
Phe Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95
Tyr Cys Val Arg Val Val Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĎŽKA: 333 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTNENIE: 1 až 339 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: variabilná oblasť ľahkého reťazca protilátky 3B1 z vektora pCIB4614 (#21FvAb)
(xi) OP IS í SEKVENCIE ID. Č. 3:
GAC ATT GTG CTG ACC CAG TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG 48
Asp He Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 1.5
CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AGA GCC AGC GAA AGT GIT GAT CAT TAT 96
Gin Arg Ala Thr íle Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp His Tyr
20 25 30
GAC ATT AGT TTT ATG AAC TGG TTC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC L44
Asp íle Ser Phe Met Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro
35 40 45
AAA CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAC CAA GGA TCC GGG GTC CCT GCC 192
Lys Leu Leu íle Tyr Ala Ala Ser Asn Gin Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
AGG TTT AGT GGC AGľ GGG TCT GGG ACA GAC TTC AGC CTC AAC ATC CAT 240
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn íle His
65 70 75 80
CCT ATG GAG GAG GAT GAT ACT GCA ATA TAT TTC TGT CAG CAA AGĽ AGG 288
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala íle Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Arg
85 90 95
GAA CTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC ACG CTG GAA ATA AAA 333
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Ľeu Glu He Lys
100 105 . 110
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 111 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 4:
Asp Íle Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gin Arg Ala Thr íle Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp His Tyr
20 25 30
Asp íle Ser Phe Met Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu LLe Tyr Ala Ala Ser Asn Gin Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn íle His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala íle Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu íle Lys
100 105 110
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 372 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTNENIE: 1 až 372 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: variabilná oblasť ťažkého re ťazca protilátky 2B5 z vektora pCIB4615 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 5:
CAG GTG Gin Val 1 CAA CTG CAG GAG TCT GGA GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGT 48
Gin Leu Gin 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly 15 Gly
TCT CTG AGA CTC TCC TGT GCA ACT TCT GGG TTC ACC TTC ACT GAT TAC 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
TAT ATG ACC TGG GTC CGC CAG CCT CCA GGA AAG GCA CTT GAG TGG TTG 144
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
GGT TTT ATT AGA CAC AAA GCT AAT GGT TAC ACA ACA GAA TAC AGT GCA 192
Gly Phe íle Arg His Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
TCT GTG AAG GGT CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAT AAT TCC CAA AAC ATC 240
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Gin Asn íle
65 70 75 80
CTC TAT CTT CAA ATG AAC ACC CTG AGA GCT GAG GAC AGT GCC ACT TAT 288
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
TAC TGT GCA AGA GAT ATA TGC TAT GGT TAC GAC GTT GGG GCT CTG GAC 336
Tyr Cys Ala Arg Asp íle cys Tyr Gly Tyr Asp Val Gly Ala Leu Asp
100 105 110
TAC TGG GGT CAA GGA. ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 372
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 124 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 6:
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr .Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe íle Arg His Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lvs Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Gin Asn íle
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp íle Cys Tyr Gly Tyr Asp Val Gly Ala Leu Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser. Ser 115 120
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DÍiŽKA: 330 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTNENIE: 1 až 330 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: variabilná oblasť ľahkého reťazca protilátky 2B5 z vektora pCIB4616 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 7:
GAT ATC GTG ATG ACC CAG TCT CCT GCT TCC TTA GCT ATA TCT CTG GGG 48
Asp íle Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala íle Ser Leu 15 Gly
1 5 10
CAG AGG GCC ACC ATC TCA TAC AGG GCC AGC ÄAA AGT GTC AGT ACA TCT 96
Gin Arg Ala Thr íle Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
GGC TAT AGT TAT ATG CAC TGG AAC CAA CAG ÄAA CCA GGA CAG CCA CCC 144
Glv Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro
35 40 45
AGA CTC CTC ATC TAT CTT GTA TCC AAC CTA GAA TCT GGG GTC CCT GCC 192
Arg Leu Leu íle Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Ί1
AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CAT 240
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn íle His
65 70 75 80
CCT GTG GAG GA.G GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAC ATT AGG 288
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His íle Arg
85 90 95
GAG CTT ACA CGT TCG GAG GGG GGA CCA AAG CTG GAA ATA AAA 330
Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Lys Leu Glu íle Lys
100 105 110
INFORMÁCIA Ο SEKVENCII ID. Č. 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 110 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 8:
Asp íle Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala íle Ser Leu Gly 1 5 10 15
Gin Arg Ala Thr íle Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45
Arg Leu Leu íle Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn íle His 65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His íle Arg 85 90 95
Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Lys Leu Glu íle Lys 100 105 110
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. C. 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 165 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTNENIE: 1 až 165 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: variabilná oblasť ťažkého re ťazca protilátky 17F6 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. C.
9:
TCT GTG AAA GGC AGA TTC ACT ATT TCA AGA
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg
1 5 10
GTC TAC CTG GAG ATG AAC ACG CTA AGA GAG
Val Tyr Leu Glu Met Asn Thr Leu Arg Glu
20 25
TAT TGT TGT AGA GGG GGG GAG GAG GGG TTT
Tyr Cys cys Arg Gly Gly Glu Glu Gly Phe
35 40
ACT CTG GTC ACT CTC TCT GCA
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
GAT GAT TCA CAA ACT ACT 48
Asp Asp Ser Gin Ser Thr
GAA GAC ACT GCC ňď TAT 96
Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
CCT TAC TGG GGG CAA. GGG 144
Pro Tyr Trp Gly Gin. Gly 45
165
SO 55
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 55 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 10:
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asp Ser Gin Ser Thr 1 5 10 15
Val Tyr Leu Glu Mec Asn Thr Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 20 25 30
Tyr Cys Cys Arg Gly Gly Glu Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly 35 40 45
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 50 55
INFORMÁCIA o SEKVENCII ID. č. 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 339 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTNENIE: 1 až 339 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: variabilná oblasť ľahkého re ťazca protilátky 17F6 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 11:
GAC ATC GTG CTG ACC CAA TCT CCA TCC TCC CTG AGT GTG TCA GTA GGA 48
Asp íle Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
GAG AAG GTC ACC ATG AGC TGC AAG TCC AGT CAG AGT CTT TTC GAC AGT 96
Glu Lys Val Thr Met Ser. Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Phe Asp Ser
20 25 30
GGA AAT CAA AAG AAC TCC TTG GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG CAG 144
Gly Asn Gin Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin
35 40 45
CCT CCT AAA CTA TTG ATC TAC GGG ACA TCC ACT AGG GAT TCT GGG GTC 192
Pro Pro Lys Leu Leu íle Tyr Gly Thr Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val
50 55 60
CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GGG ACC GAT TTC ACT CTT ACC 240
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
ATC AGT GGT ATA CAG GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TAC TGT CAG AAT 288
íle Ser Gly íle Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Asn
85 90 95
GAT CAT TAT TAT CCG TTC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG gag; ATA 336
Asp His Tyr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu. íle 100 105 110
AAA 339
Lys
INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ ID. Č. 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 113 aminokyselín (B) TYP: aminokyse1ina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 12:
Asp íle Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr ypr Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Phe Asp Ser
20 25 30
Gly Asn Gin Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin
*3 q jj 40 45
Pro Pro Lvs Leu Leu íle Tyr Gly Thr Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
íle Ser Gly íle Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Asn
85 90 95
Asp His Tyr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu. íle
100 105 110
INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ ID. Č. 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DÍŽKA: 357 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTNENIE: 1 až 357 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: variabilná oblasť ťažkého re ťazca protilátky 10B6 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 13:
GAG GTG AAG GTG GAT GAG AGT GGG GGA GGC TTG GTG AGG CCT GGA AAT 48
Glu Val Lys Val Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Asn
10 15
TCT CTG AAA CTC TCC TGT GAA ACC TCG GGA TTC ACT TTC AGT TAT TAT 96
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
25 30
TGG ATG CAC TGG CTT CGC CAG CCT CCA GGG AAG AGG CTG GAG TGG ATT 144
Trp Met His Trp Leu Arg Gin Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp íle
40 45
GCT GTG ATT AAA GTC AAA TCT GCT AAT TAT GGA TCA AAT TAT GCA GAG .192
Ala Val íle Lys Val Lys Ser Ala Asn Tyr Gly Ser Asn Tyr Ala Glu
55 60
TCT Ser 65 GTG Val AAA GGC AGA TTC ACT ATT TCA AGA GAT GAT TCA AAT AGC GGT 240
Lys Gly Arg Phe Thr 70 íle Ser Arg Asp 75 Asp Ser Asn Ser Gly 80
GTC TAC CTG CAG ATG AAC AGA TTA AGA GAA GAA GAC ACT GCC ACT TAT 238
Val Tyr Leu Gin Met Asn Arg Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
TAT TGT AGT AGA GGG GGG GCC CCC GGG ITT CCT TAT TGG GGC CAA GGG 336
Tyr Cys Ser Arg Gly Gly Ala Pro Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 357
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 14 • •
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 119 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (Xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 14:
Glu Val Lys Val Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val. Arg Pro Gly Asn 15 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Thr. Ser Gly Phe Thr Phe Ser T^rr Tyr 20 25 30
Trp Met His Trp Leu Arg Gin Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp íle 35 40 as
Ala Val íle Lys Val Lys Ser Ala Asn. Tyr Gly Ser Asn Tyr Ala Glu 50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asp Ser Asn Ser Gly 65 70 75 80
Val Tyr Leu Gin Met Asn Arg Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95
Tyr Cvs Ser Arg Gly Gly Ala ?ro Gly Phe ?ro Tyr Trp Gly Gin Gly 100 . 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala '115
INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ ID. Č. 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DÍŽKA: 339 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTNENIE: 1 až 339 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: variabilná oblasť ľahkého re ťazca protilátky 10B6 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 15:
GAT ATC CTG ATC ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTA ACT GTG TCT TTA GGA 48
Asp 1 íle Val íle Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Val Ser Leu 15 Gly
GAG AAG CTC ACT TTG AGC TGC AAG TCC AGT CAG AGT CTG TTT ACC GCT 96
Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Phe Thr Gly
20 25 30
GGA GAT CAA AAG AAC TCC TTG GCC TGG TAC CAG CAG AAA GCA GGG CAG 144
Gly Asp Gin Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Ala Gly Gin
35 40 45
CCT CCT AGA CTG TTG ATC TAC GGG ACT TCC ACT AGG GAA TCT GGG GTC 192
Pro Pro Arg Leu Leu íle Tyr Gly Thr Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
CCT GAT CGC TTC ACA /-r·**' ACT GGA TCT GGA ACC GAT TTC ACT CIT GCC 240
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala
65 70 75 80
ATC AGC ACT CTG CAG GCT GAA GAC CTG GCA GCT TAT TAC TGT CAG AAT 288
íle Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Gly Tyr Tyr Cys Gin Asn
85 90 95
GAT CAT ACT TAT CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA ATG TTG GAA CTA 336
Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Met Leu Glu Val
100 105 110
AAA 339
Lys
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 113 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (Xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 16:
Asp íle Val íle Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Phe Thr Gly 20 25 30
Gly Asp Gin Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Ala Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Arg Leu Leu íle Tyr Gly Thr Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala 65 70 75 80 íle Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Gly Tyr Tyr Cys Gin Asn 85 90 95
Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Met Leu Glu Val 100 105 110
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 1797 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTNENIE: 1 až 1797 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: jednoreťazcová protilátka z vektora pCIB4631 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 17:
ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCA GGA' GCT GCA GGT 48
Met Gly Tr? Ser Tr? íle Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala Glv
1 5 10 15
GTC CAT TGC CTA L. X'-. GAG GAC ATT GTG CTG ACC CAG TCT CCA GCT TCT 96
Val His Cys Leu Leu Glu Asp íle Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser
20 25 30
TTG GCT GTG TCT CTA. GGG CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AGA GCC AGC 144
Leu Ala Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr He Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
GAA AGT GTT GAT GAT TAT GAC ATT AGT TTT ATG AAC TGG TTC CAA CAG 192
Glu Ser Val Asp His Tyr Asp íle Ser Phe Met Asn Trp Phe Gin Gin
50 55 60
AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CIC ATC TAT GCT GCA TCC AAC CAA 240
Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu He Tyr Ala Ala Ser Asn Gin
65 70 75 80
GGA TCC GGG GTC CCT GCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC 288
Gly Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
90 95
TTC AGC CTC AAC ATC CAT CCT ATG GAG GAG GAT GAT ACT GCA ATA TAT 336
Phe Ser Leu Asn 100 íle His Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala íle Tyr
105 110
TTC TGT CAG CAA AGT AGG GAA CTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC 384
Phe Cys Gin 115 Gin Ser Arg Glu Leu Pro 120 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 125
ACG CTG GAA ATA AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT AGA TCT GGT GGC 432
Thr Leu 130 Glu íle Lys Arg Ala 135 Asp Ala Ala Pro Thr Arg Ser 140 Gly Gly
GGT GGC TCG GGC GGT GGT GGG TCG CTC GAG CAG GTC AAA CTG CAG GAG 480
Gly Gly 145 Ser Gly Gly Gly Gly 150 Ser Leu Glu Gin Val Lys Leu 155 Gin Glu 160
TCT GGT GGA GGA TTG GTG CAG CCT AAA GGG TCA TTG AAA CTC TCA TGT 528
Ser Gly Gly Gly Leu Val 165 Gin Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu 170 Ser Cys 175
GCA. GCC TCT GGA TTC ACC TTC AAT AAC TTC GCC ATG AAC TGG GTC CGC 576
Ala Ala Ser Gly 180 Phe Thr Phe Asn Asn 185 Phe Ala Met Asn Trp 190 Val Arg
CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTG GAA TGG GTT GCT CGC ATA AGA AGT AAA 624
Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg íle Arg Ser Lys
195 200 205
AGT AA.T AAT TAT GCA ACA TCT TAT GGC GAT TCA GTG AÄA GAC AGG TTC 672
Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe
210 215 220
ACC GTC TCC AGA GAT GAT TCA CAA AGC ATG TTC TAT CTG CAA ATG AAC 720
Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gin Ser Met Phe Tyr Leu Gin Met Asn
225 230 235 240
AAC TTG AAA ACT GAG GAC ACA GCC ATG TAT TAC TGT GTG AGG GTA CTA 768
Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Val Val
245 250 255
TAC GGT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC 816
Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
260 265 270
TCA GCC AAA ACG ACA CCC CCA TCT GTC TAT CCA CTG GCC CCT GGA TCT 864
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser
275 280 285
AGA TCT GCT GCC CAA ACT AAC TCC ATG GTG ACC CTG GGA TGC CTG GTC 912
Arg Ser Ala Ala Gin Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
290 295 300
AAG GGC TAT TTC CCT GAG CCA GTG ACA GTG ACC TGG AAC TCT GGA TCC 960
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
305 310 315 320
CTG TCC AGC GGT GTG CAC ACC TTC CCA GCT GTC CTG CAG TCT GAC CTC 1008
Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Asp Leu
325 330 335
TAC ACT CTG AGC AGC TCA GTG ACT GTC CCC TCC AGC ACC TGG CCC AGC 1056
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser 340 345 350
GAG ACC GTC ACC TGC AAC CTT GCC CAC CCG GCC AGC AGC ACC AAG CTG Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val
355 360 365
GAC AAG ÄAA ATT GTG CCC AGG GAT TCT GCT TCT AAG CCT. TGC ATA TGT Asp Lys Lys íle Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys íle Cys
370 375 380
1104
1152
ACA GTC CCA GAA GTA TCA TCT GTC TTC ATC TTC CCC CCA AAG CCC AAG
1200
Thr Val Pro 385 Glu Val Ser 390 Ser Val Phe íle Phe Pro Pro Lys Pro Lys
395 400
GAT GTG CTC ACC ATT ACT CTG ACT CCT AAG GTC ACG TGT GTT GTG GTA 1248
Asp Val Leu Thr íle Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
405 410 415
GAC ATC AGC AAG GAT GAT CCC GAG GTC CAG TTC AGC TGG TTT GTA GAT 1296
Asp íle Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gin Phe Ser Trp Phe Val Asp
420 425 430
GAT GTG GAG GTG CAC ACA GCT CAG ACG CAA CCC CGG GAG GAG CAG TTC 1344
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gin Thr Gin Pro Arg Glu Glu Gin Phe
'435 440 445
AAC AGC ACT TTC CGC TCA GTC AGT GAA CTT CCC ATC ATG CAC CAG GAC 1392
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro íle Met His Gin Asp
450 455 460
TGG CTC AAT GGC AAG GAG TTC AAA TGC AGG GTC AAC AGT GCA GCT TTC 1440
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe
465 470 475 480
CCT GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA ACC AAA GGC AGA CCG AAG 1488
Pro Ala Pro íle Glu Lys Thr íle Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
485 490 495
GCT CCA CAG GTG TAC ACC ATT CCA CCT CCC AAG. GAG CAG ATG (GCC AAG 1536
Ala Pro Gin Val Tyr Thr íle Pro Pro Pro Lys Glu Gin Met Ma Lys
500 505 510
GAT AAA GTC AGT CTG ACC TGC ATG ATA ACA GAC TTC TTC CCT GAA GAC 1584
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met íle Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp
515 520 525
ATT ACT GTG GAG TGG CAG TGG AAT GGG CAG CCA GCG GAG AAC TAC AAG 1632
íle Thr Val Glu Trp Gin Trp Asn Gly Gin Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
530 535 540
AAC ACT CAG CCC ATC ATG AAC ACG AAT GGC TCT TAC TTC GTC TAC AGC 1630
Asn Thr Gin Pro íle Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
54S 550 555 560
AAG CTC AAT GTG CAG AAG AGC AAC TGG GAG GCA GGA AAT ACT TTC ACC 1728
Lys Leu Asn Val Gin Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
565 570 575
TGC TCT GTC TTA CAT GAG GGC CTG CAC AAC CAC CAT ACT GAG aag AGC 1776
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
580 585 590
CľC TCC CAC TCT CCT GGT ÄAA 1757
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
595
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 599 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 18:
Met Gly Trp Ser Trp íle Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala Gly 1.5 10 15
Val His Cys Leu Leu Glu Asp íle Val. Leu Thr Gin Ser Pro .Ma Ser 20 25 30
Leu Ala Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr íle Ser Cys Arg Ala Ser
Glu Ser Val Asp Hť s Tyr Asp íle Ser Phe Msr Asn Trp Phe Gin Gin 50 55 · 50
Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu íle Tyr Ala Ala Ser Asn Gin • 65 70 75 30
Gly Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr As?
90 95
Phe Ser Leu Asn He His Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Lle Tyr 100 10S 110
Phe Cys Gin Gin Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125
Thr Leu Glu íle Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Arg Ser (31y Gly 130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Gin Val Lys Leu 'Gin Glu
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Bro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys
165 170 175
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Phe Ala Met Asn Trp Val Arg 180 185 190
Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg íle Arg Ser Lys
195 200 205
Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe 210 215 220
Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gin Ser. Met Phe Tyr Leu Gin Met Asn 225 . . 230... · 235 . 240
235 .
8Β
Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Val Val 245 250 255
Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val. Ser 260 265 270
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser 275 280 285
Arg Ser Ala Ala Gin Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val 290 295 300
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
305 310 315 320
Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Asp Leu
325 330 335
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser 340 345 350
Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Äla His Pro ňla Ser Ser Thr Lys Val 355 360 365
Asp Lys Lys íle Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys íle Cys 370 375 380
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe íle Phe Pro Pro Lys Pro Lys
385 390 395 400
Asp Val Leu Thr íle Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
405 410 415
Asp íle Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gin Phe Ser Trp Phe Val Asp 420 425 430
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gin' Thr Gin. Pro Arg- Glu Glu Gin Phe
435 440 445
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro íle Met His Gin Asp
450 455 460
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe
465 470 475 480
Pro Ala Pro íle Glu Lys Thr íle Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
485 490 495
Ala Pro Gin Val Tyr Thr íle Pro Pro Pro Lys Glu Gin Met Ala Lys
500 505 510
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met íle Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp
515 520 525
íle Thr Val Glu Trp Gin Trp Asn Gly Gin Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
530 535 540
Asn Thr Gin Pro íle Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
545 550 555 560
Lys Leu Asn Val Gin Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
565 570 575
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
580 585 590
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
595
INFORMÁCIA 0 SEKVENCII ID. Č. 19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 101 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: 1ineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: oligonukleotid KE109A28 použitý na prípravu 101 bp dlhého fragmentu Styl/BglII vo vektore pCIB4612 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 19:
CAAGGACGAG TATGAACGAC ATAACAGCTA TACCTGTGAG GCCACTCACA AGACATCAAC TTCACCCATT GTCAAGAGCT TCAACAGGAA TGAGTGTTAG G
INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ ID. Č. 20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DÍŽKA: 101 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: oligonukleotid KE110A28 použitý na prípravu 101 bp dlhého fragmentu Styl/BglII vo vektore pCIB4612 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 20:
GATCCCTAAC ACTCATTCCT GTTGAAGCTC TTGACAATGG GTGÄAGTTGA
TGTCTTGTGA GTGGCCTCAC AGGTATAGCT GTTATGTCGT TCATACTCGT C
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 21?
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA? 72 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: oligonukleotid KE111A28 použitý na prípravu 71 bp dlhého fragmentu Xhol/Ddel vo vektore pCIB4612 (Xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 21:
TCGAGGGTAC CGAGCTCTAG ATCTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA
GCAGTTAACA TCTGGAGGTG CC
INFORMÁCIA 0 SEKVENCII ID. Č. 22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 71 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: oligonukleotid KE112A28 použitý na prípravu 71 bp dlhého fragmentu Xhol/Ddel vo vektore pCIB4612 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 22:
TGAGGCACCT CCAGATGTTA ACTGCTCACT GGATGGTGGG AAGATGGATA
CAGATCTAGA GCTCGGTACC C
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 41 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: oligonukleotid KE106A28 použitý na prípravu 40 bp dlhého fragmentu Xhol/Ncol vo vektore pCIB4611 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 23:
TCGAGGGTAC CGAGCTCTAG ATCTGCTGCC CAAACTAACT C
INFORMÁCIA 0 SEKVENCII ID. Č. 24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 41 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: oligonukleotid KE107A28 použitý na prípravu 40 bp dlhého fragmentu Xhol/Ncol vo vektore pCIB4611 (Xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 24:
CATGGAGTTA GTTTGGGCAG CAGATCTAGA GCTCGGTACC C
INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ ID. Č. 25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 39 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: oligonukleotid KE108A28 použitý na prípravu 40 bp dlhého fragmentu BstXI/BamHI vo vektore pCIB4611 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 25:
CTGGTAAAGG CGGCCGCATC GATTAAGTCG ACCCGCGGG
INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ ID. Č. 26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 47 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: oligonukleotid KE108A28 použitý na prípravu 40 bp dlhého fragmentu BstXI/BamHI vo vektore pCIB4611 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 26:
GATCCCCGCG GGTCGACTTA ATCGATGCGG CCGCCTTTAC CAGGAGA
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 27:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCÍE (A) DĹŽKA: 7 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: rastlinná konvenčná sekvencia translácie pre vektor pCIB4610 (xi) OPIS SEKVENCÍE ID. Č. 27:
AACAATG
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 28:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCÍE (A) DĹŽKA: 7 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: rastlinná konvenčná sekvencia translácie pre vektor pCIB4600 (xi) OPIS SEKVENCÍE ID. Č. 28:
TCCGATG počiatku počiatku
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 29:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCÍE (A) DĹŽKA: 25 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: PCR primér KE102A28 použitý na bp dlhého fragmentu pre vektor (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 29:
CGÄAGTTAAC AGATCTAGAG CTCGG
INFORMÁCIA 0 SEKVENCII ID. Č. 30:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 32 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: PCR primér KE101A28 použitý na 83 bp dlhého fragmentu pre vektor prípravu pCIB4610 prípravu pCIB4610 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 30:
CGGGATCCAA CAATGGGATG GAGCTGGATC TT
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 31:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 164 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: oligonukleotid, ktorý kóduje signálny pep tid pre endoplazmatické retikulum, viď Ka bat a kol., 1987 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 31:
GATCCAACAA TGGGATGGAG CTGGATCTTT CTCTTCCTCC TGTCAGTTGT
TACCCTACCT CGACCTAGAA AGAGAAGGAG GACAGTGGAG CTGCÄGGTGT
CCATTGCCTA CTCGAGGGTA CCGAGCTCCT CGACGTCCAC AGGTAACGGA
TGAGCTCCGA TGGC
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 32:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 10 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) MENO/KĽÚČ: doména (B) UMIESTNENIE: 1 až 10 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: 10 aminokyselín dlhý linker ktorý spája lahký a ťažký Fv fragment (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 32:
. Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 33:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: oligonukleotid KE147A28 použitý pri príprave 36 bp dlhého linkeru pre vektor pCIB4631 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 33:
GATCTGGTGG CGGTGGCTCG GGCGGTGGTG GGTCGC
INFORMÁCIA 0 SEKVENCII ID. Č. 34:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: oligonukleotid KE182A28 použitý pri príprave 36 bp dlhého linkeru pre vektor PCIB4631 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 34:
TCGAGCGACC . CACCACCGCC CGAGCCACCG CCACCA
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 35:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 26 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: PCR primér NC200 použitý na prípravu 700 bp dlhého fragmentu s obsahom kódujúcej sekvencie jednoreťazcovej protilátky 3B1 pre fúziu s PE40 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 35:
CGAAGCTTGA CATTGTGCTG ACCCAG
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 36:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: PCR primér NC202 použitý na prípravu 700 bp dlhého fragmentu s obsahom kódujúcej sekvencie jednoretazcovej protilátky 3B1 pre fúziu s PE40 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 36:
GCCCTCTAGA AGCATGCCTG AGGAGACGGT GACTGA
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 37:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 29 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: 1ineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: PCR primér NC92 použitý na amplifikáciu génov protilátok (Xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 37:
GTCTCGAGGA YATYSWGMTS ACCCARTCT
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 38:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 29 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: PCR primér NC130 použitý na amplifikáciu génov protilátok (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 38:
GCAGATCTAG TTGGTGCAGC ATCAGCCCG
INFORMÁCIA 0 SEKVENCII ID. Č. 39:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 30 párov báz
100 (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: PCR primér NC91 použitý na amplifikáciu génov protilátok (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 39:
GTCTCGAC-CA C-GTSMARCTG CAC-SAGTCNG
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 40:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 29 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: PCR primér NC114 použitý na amplifikáciu génov protilátok (Xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 40:
GCAGATCTAG ATCCAGGGGC CAGTGGATA
INFORMÁCIA 0 SEKVENCII ID. Č. 41:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 32 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna
1Ó1 (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: PCR primér NC111 použitý na amplifikáciu génov protilátok (Xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 41:
GCAGATCGGC AGGAGACGAG GGGGAAGACA TT
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 42:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 29 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: PCR primér NC117 použitý na amplifikáciu génov protilátok (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 42:
GCAGATCTGC AGCCAGGGAC CAAGGGATA
INFORMÁCIA 0 SEKVENCII ID. Č. 43:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DÍŽKA: 22 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: 1ineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie
102 (v) TYP FRAGMENTU: interný (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) MENO/KĽÚČ: doména (B) UMIESTNENIE: 1 až 22 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: alternatívny doménový linker medzi ľahkým a ťažkým Fv fragmentom (Xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 43:
Gly Pro Gly Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro
Thr Pro Ser Gly Pro Gly 20
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 44:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 357 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genómová) (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) ANTI-SENSE: nie (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTNENIE: 1 až 357 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: variabilná oblasť ťažkého re ťazca protilátky 14G1 z vektora pCIB4635
103 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č.. 44:
GAG GTG AAG CTT GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTG AGG CCT GGA AAT 48
Glu Val Lys Leu 1 Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Arg Pro Gly 15 Asn
TCT CTG AAA CTC TCC TGT GTT ACC TCG GGA TTC ACT TTC AGT AAC TAC 96
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
CGG ATG CAC TGG CTT CGC CAG CCT CCA GGG AAG AGG CTG GAG TGG ATT 144
Arg Met His Trp Leu Arg Gin Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp íle
35 40 45
GCT GTA ATT ACA CTC AAA TCT GAT AAT TAT GGA ACA ATT TAT GCA GAA 192
Ala Val íle Thr Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Gly Thr íle Tyr Ala Glu
50 55 60
TCT GTG AAA AGA TTC ACC ATT TCA AGA GAA GAT TCA GAA AGC AGC 240
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Glu Asp Ser Glu Ser Ser
65 70 75 80
ATC TAC CTG CAG ATG AAC AGA TIA AGA GAG GAA GAC ACT GCC ACT TAT 288
íle Tyr Leu Gin Met Asn Arg Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
TAC TGT AGT AGA GGT AGT GAC TGG GGA TTT CCT TAT TGG GGG CAA GGG 336
Tyr Cys Ser Arg Gly Ser Asp Trp Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
104
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 45:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 119 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (Xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 45:
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Arg Met His Trp Leu Arg Gin Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp He
35 40 45
Ala Val íle Thr Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Gly .Thr íle Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Glu Asp Ser Glu Ser Ser
65 70 75 80
íle Tyr Leu Gin Met Asn Arg Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Arg Gly Ser Asp Trp Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu val Thr Val Ser Ala 115
105
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 46:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCÍE (A) DĽŽKA: 339 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genómová) (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) ANTI-SENSE: nie (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTNENIE: 1 až 339 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: variabilná oblasť lahkého re ťazca protilátky 14G1 z vektora pCIB4636 (xi) OPIS SEKVENCÍE ID. Č. 46:
GAT ATT GTG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG AGT GTG TCA GCA GGA Asp íle Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly
GAG AAG GTC ACT ATG AAC TGC AAG TCC AGT CAG AGT CTG TTA AAT AGT Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser
GGA AAT CAA AAG CAC TAC TTG GCC TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGC CAG Gly Asn Gin Lys His Tyr Leu Ala Trp Tyr. Gin Gin Lys Pro Gly Gin
144
106
CCT CCT Pro Pro 50 AÄA CTG TTG ATC TAC GGG Gly GCA TCC ACT AGG GAA TCT GGG GTC 192
Lys Leu Leu íle Tyr 55 Ala Ser Thr Arg 60 Glu Ser Gly Val
CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGG TCT GGA ACC GAT TTC ACT cti: ACC 240
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TTC TGT CAG AAT 288
íle Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gin Asn
85 90 95
GAT CG? AGT TAT CCG TTC ACA TTC GCC TCG GGG ACA AAG TTG GAA ATA 336
Asp Arg Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Ala Ser Gly Thr Lys Leu Glu íle
100 105 110
AÄA 339
Lys
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 47:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DÍiŽKA: 113 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 47:
107
Asp íle Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gin Lys His Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu íle Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
íle Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gin Asn
85 90 95
Asp Arg Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Ala Ser Gly Thr Lys Leu Glu íle
100 105 no
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 48:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 32 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: PCR primér DB91 použitý na génov protilátok (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) ANTI-SENSE: nie amplifikáciu
108 (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 48:
ACGTCTCGAG GAEGTGAAGC TKEWKGAEWC TG
INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 49:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE (A) DĹŽKA: 34 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jedno (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: PCR primár DB91 použitý na amplifikáciu génov protilátok (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) ANTI-SENSE: nie (Xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 49:
CAATTCGCAT ATGAGATCCA GGGGCCAGTG GATA
109

Claims (56)

1. Protilátka, alebo jej fragment, vyznačujúca sa tým, že sa viaže na črevo cieľového hmyzu, ale neviaže sa na membrány kefkového lemu cicavcov ani na rastlinné mikrozómy.
2. Protilátka podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že ide o monoklonálnu protilátku alebo jej fragment.
3. Monoklonálna protilátka alebo jej fragment podľa nároku 2, vyznačujúca sa tým, že sa viaže na membrány kefkového lemu hmyzu.
4. Monoklonálna protilátka podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúca sa tým, že cieľový hmyz patrí do jedného z rádov Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphanptera a Trichoptera.
5. Monoklonálna protilátka podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že cieľový hmyz je Diabrotica virgifera.
6. Monoklonálna protilátka podľa nároku 5, vyznačujúca sa tým, že patrí do skupiny tvorenej protilátkami 2B5, 3B1, 10B6, 17F6, 14G1 a 16E4.
7. Sekvencia DNA, vyznačujúca sa tým, že kóduje monoklonálnu protilátku podľa ľubovoľného z nárokov 2 až 6 alebo väzbové miesto tejto monoklonálnej protilátky.
8. Sekvencia DNA podľa nároku 7, vyznačujúca sa tým, že je zvolená zo skupiny tvorenej Sekvenciami id. č. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 44 a 46.
110
9. Sekvencia DNA podía nároku 7 alebo 8, vyznačujúca sa tým, že je operatívne spojená so sekvenciou DNA, ktorá kóduje molekulu toxínu.
10. Sekvencia DNA podľa nároku 9, vyznačujúca sa tým, že toxínová molekula je zvolená zo skupiny tvorenej toxínmi baktérií Bacillus, exotoxínmi baktérií Pseudomonas, phylotaccinom, geloninom, ribonukleázami a proteínmi inaktivujúcimi ribozómy.
11. Sekvencia DNA podľa ľubovoľného z nárokov 7 až 10, vy značujúca sa tým, že táto DNA je súčasťou rastlinného genómu.
12. Hybridná molekula toxínu, vyznačujúca sa tým, že obsahuje protilátku, ktorá sa viaže na črevo cieľového hmyzu, ale neviaže sa na membrány kefkového lemu cicavca ani na rastlinné mikrozómy, operatívne naviazanú na toxínovú skupinu.
13. Hybridná molekula toxínu, vyznačujúca sa tým, že pozostáva z monoklonálnej protilátky alebo z väzbového fragmentu monoklonálnej protilátky podľa nároku 2 a z toxínovéj skupiny, ktorá je na ňu operatívne naviazaná.
14. Hybridná molekula toxínu podľa nároku 12 alebo 13, vyznačujúca sa tým, že toxínová skupina je zvolená zo skupiny tvorenej toxínmi baktérií Bacillus, exotoxínmi baktérií Pseudomonas, phylotaccinom, geloninom, ribonukleázami a proteínmi inaktivujúcimi ribozómy.
15. Hybridná molekula toxínu podľa nároku 14, vyznačujúca sa tým, že toxín baktérií Bacillus je zvolený zo skupiny tvorenej endotoxínmi baktérií Bacillus a vegetatívnymi insekticídnymi proteínmi.
111
16. Hybridná molekula toxínu podľa nároku 15, vyznačujúca sa tým, že toxín baktérií Bacillus je Bt endotoxín.
17. Hybridná molekula toxínu podľa nároku 12, vyznačujúca sa tým, že monoklonálna protilátka je protilátka podľa ľubovoľného z nárokov 2 až 6.
18. Hybridná molekula toxínu podľa nároku 17, vyznačujúca sa tým, že monoklonálna protilátka, protilátka, alebo jej väzbová oblasť, sa viaže na membrány kefkového lemu hmyzu.
19. Hybridná molekula toxínu podľa nároku 18, vyznačujúca sa tým, že monoklonálna protilátka je protilátka zvolená zo skupiny tvorenej protilátkami 2B5, 3B1, 10B6, 17F6, 14G1 a 16E3.
20. Sekvencia DNA, ktorá kóduje hybridnú molekulu podľa ľubovoľného z nárokov 12 až 19.
21. Sekvencia DNA podľa nároku 20,vyznačujúca sa tým, že je súčasťou rastlinného genómu.
22. Sekvencia DNA, vyznačujúca sa tým, že pozostáva z prvej expresívnej kazety s obsahom sekveneie DNA, ktorá kóduje promótor schopný riadiť expresiu v rastlinách, operatívne naviazanú na sekvenciu DNA, ktorá kóduje ľahký reťazec monoklonálnej protilátky alebo väzbovú doménu uvedenej monoklonálnej protilátky, pričom táto protilátka je schopná sa viazať na črevo cieľového hmyzu.
23. Sekvencia DNA podľa nároku 22,vyznačujúca sa tým, že kazeta ďalej obsahuje sekvenciu DNA, ktorá kóduje toxínovú skupinu, operatívne spojenú so sekvenciou DNA, ktorá kóduje ľahký reťazec monoklonálnej protilátky alebo väzbové domény protilátky.
112
24. Sekvencia DNA, vyznačujúca sa t ý m, že obsahuje druhú expresívnu kazetu, ktorá pozostáva z DNA, ktorá kóduje promótor umožňujúci expresiu v rastlinách, operatívne spojenú s ďalšou sekvenciou DNA, ktorá kóduje ťažký reťazec monoklonálnej protilátky alebo jej väzbové domény, pričom táto monoklonálna protilátka je schopná väzby na črevo cieľového hmyzu.
25. Sekvencia DNA podľa nároku 24,vyznačujúca sa tým, že kazeta ďalej obsahuje sekvenciu DNA, ktorá kóduje toxínovú skupinu, operatívne spojenú so sekvenciou DNA, ktorá kóduje ťažký reťazec monoklonálnej protilátky alebo väzbové domény protilátky.
26. Sekvencia DNA podľa ľubovoľného z nárokov 22 až 25, v y značujúca sa tým, že ďalej obsahuje terminačnú sekvenciu funkčnú v rastlinách.
27. Sekvencia DNA podľa nároku 23 alebo 26, vyznačujúca sa tým, že toxínová skupina patrí medzi toxíny baktérií Bacillus, exotoxíny baktérií Pseudomonas, phylotaccin alebo ribonukleázy.
28. Sekvencia podľa ľubovoľného z nárokov 22 až 27, v y z n ačujúca sa tým, že je táto DNA súčasťou rastlinného genómu.
29. Rastlinná bunka transformovaná sekvenciou DNA podľa ľubovoľného z nárokov 7 až 11 a 20 až 21.
30. Rastlinná bunka transformovaná sekvenciou DNA podľa ľubovoľného z nárokov 22 až 28.
31. Rastlina a jej potomstvo, vyznačujúca sa tým, že bola transformovaná sekvenciou DNA podľa ľubovoľného z nárokov 7 až 11 a 20 až 21.
113
32. Rastlina a jej potomstvo, vyznačujúca sa tým, že bola transformovaná sekvenciou DNA podľa ľubovoľného z nárokov 20 až 28.
33. Rastlina a jej potomstvo, vyznačujúce sa tým, že exprimujú monoklonálnu protilátku podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 6.
34. Rastlina a jej potomstvo, vyznačujúce sa tým, že exprimujú hybridnú molekulu toxínu podľa ľubovoľného z nárokov 12 až 19.
35. Rastlina podľa ľubovoľného z nárokov 31 až 34, vyznačujúca sa tým, že ide o kukuricu.
36. Rastlina podľa ľubovoľného z nárokov 31 až 35, vyznačujúca sa tým, že ide o hybridnú rastlinu.
37. Propagačný materiál rastliny podľa ľubovoľného z nárokov 31 až 36, vyznačujúci sa tým, že sa ošetril ochranným povlakom.
38. Propagačný materiál podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, obsahujúci prípravok zvolený zo skupiny tvorenej herbicídmi, insekticídmi, fungicídmi, baktericídmi, nematocídmi, prostriedkami na hubenie mäkkýšov alebo ich zmesami.
39. Propagačný materiál podľa nároku 37 alebo 38, vyznačujúci sa tým, že pozostáva zo semena.
40. Rekombinantný mikroorganizmus, vyznačujúci sa t ý m, že sa transformoval aspoň jednou zo sekvencii DNA podľa ľubovoľného z nárokov 7 až 11 a 20 až 21.
41. Rekombinantný mikroorganizmus, vyznačujúci sa tým, že sa transformoval aspoň jednou z izolovaných sekvencií DNA podľa ľubovoľného z nárokov 22 až 28.
114
42. Rekombinantný mikroorganizmus, vyznačujúci sa tým, že obsahuje aspoň jednu molekulu DNA, ktorá kóduje hybridnú molekulu toxínu pozostávajúceho z protilátky alebo jej fragmentu schopného väzby na črevo cieľového hmyzu, ale pritom sa neviaže na membrány kefkového lemu cicavcov alebo na rastlinné mikrozómy a ktorá je operatívne spojená s toxínovou skupinou, pričom uvedená sekvencia DNA, ktorá kóduje protilátku, obsahuje sekvenciu zvolenú zo skupiny tvorenej Sekvenciami id. č. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,
17, 44 a 46.
43. Rekombinantný mikroorganizmus podía nárokov 40 až 42, vyznačujúci sa tým, že je zvolený zo skupiny tvorenej baktériami ako sú baktérie Bacillus, Caulobacter, Agmenellum, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc a Alcaligenes, hubami a zvlášť kvasinkami ako sú Saccharomyces, Cryptococcus , Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula a Aureobasidium a vírusmi ako napríklad jadrový polyhedrálny vírus Autographica californica.
44. Insekticídna kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje rekombinantný mikroorganizmus podía ľubovoľného z nárokov 40 až 43 v insekticídne účinnom množstve spolu s vhodným nosičom.
45. Insekticídna kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje hybridnú molekulu toxínu podľa ľubovoľného z nárokov 12 až 19 v insekticídne účinnom množstve spolu s vhodným nosičom.
46. Propagačný materiál rastliny, vyznačujúci sa tým, že je ošetrený insekticídnou kompozíciou podía ľubovoľného z nárokov 44 až 45.
115
47. Propagačný materiál pódia nároku 46, vyznačujúci sa t ý m, že ide o rastlinné semeno.
48. Spôsob trvalej transformácie hostiteľského organizmu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa - vloženie sekvencie DNA podľa ľubovoľného z nárokov 7 až 10, 21, 23 až 25 a 27 až 29 do genómu tohto hostiteľského organizmu.
49. Spôsob podľa nároku 33,vyznačujúci sa tým, že hostiteľský organizmus je mikroorganizmus.
50. Spôsob podľa nároku 33,vyznačujúci sa tým, že hostiteľský organizmus je rastlina.
51. Spôsob prípravy hybridómovej bunkovej línie, ktorá produkuje protilátku alebo monoklonálnu protilátku podía nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa
a) použitie čriev hmyzu, predovšetkým membrány kefkového lemu, ako antigénu,
b) imunizáciu zvieracieho donora týmto antigénom,
c) izoláciu imunokompetentných B-lymfocytov zo zvieracieho donora,
d) fúzovanie imunokompetentných B-lymfocytov s tumorovou bunkovou líniou, ktorá je schopná kontinuálneho bunkového delenia,
e) izoláciu vzniknutého fúzneho produktu, jeho kultiváciu vo vhodnom kultivačnom médiu a následné klonovanie pozitívnych hybridných buniek,
f) testovanie klonovaných hybridných buniek na produkciu protilátok a výber takých, ktoré vykazujú požadované vlastnosti.
116
52. Spôsob konštrukcie hybridných molekúl protilátka-toxín podía nároku 11 až 20, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa klonovanie variabilnej oblasti protilátky a spojenie tejto oblasti s toxínovou skupinou.
53. Spôsob produkcie monoklonálnej protilátky alebo jej fragmentov schopných väzby na vezikuly membrány kefkového lemu hmyzieho čreva, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu hybridómových bunkových línií, ktoré produkujú tieto protilátky, vo vhodnom kultivačnom médiu in vivo alebo in vitro a izoláciu vzniknutých protilátok.
54. Spôsob produkcie sekvencie DNA, ktorá kóduje monoklonálnu protilátku podía nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa klonovanie príslušných génov protilátky z hybridómovej bunkovej línie s pomocou primérov ku konzervovaným sekvenciám DNA v konštantných oblastiach a v úsekoch základnej štruktúry variabilných oblastí.
55. Hybridómová bunková línia, vyznačujúca sa tým, že produkuje protilátku podía ľubovoľného z nárokov 2 až 6.
56. Hybridómové bunkové línie podľa nároku 55 uložené pod pri stupovými číslami HB 11616, HB 11617, HB 11618, HB 11619 a HB 11620 u ATCC.
SK1669-96A 1994-06-28 1995-06-20 Antibodies which bind to insect gut proteins and their use SK166996A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US26764194A 1994-06-28 1994-06-28
PCT/IB1995/000497 WO1996000783A1 (en) 1994-06-28 1995-06-20 Antibodies which bind to insect gut proteins and their use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK166996A3 true SK166996A3 (en) 1997-08-06

Family

ID=23019624

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1669-96A SK166996A3 (en) 1994-06-28 1995-06-20 Antibodies which bind to insect gut proteins and their use

Country Status (16)

Country Link
US (2) US5686600A (sk)
EP (1) EP0804579A1 (sk)
JP (1) JPH11505401A (sk)
CN (1) CN1151759A (sk)
AU (1) AU696661B2 (sk)
BG (1) BG101171A (sk)
BR (1) BR9508154A (sk)
CA (1) CA2193859A1 (sk)
CZ (1) CZ382196A3 (sk)
EE (1) EE9600192A (sk)
HU (1) HUT76089A (sk)
MX (1) MX9700007A (sk)
NZ (1) NZ287124A (sk)
PL (1) PL318164A1 (sk)
SK (1) SK166996A3 (sk)
WO (1) WO1996000783A1 (sk)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2246242A1 (en) * 1996-02-08 1997-08-14 Institut Fur Pflanzengenetik Und Kulturpflanzenforschung Cassettes for the expression of storable proteins in plants
AU727218B2 (en) 1997-04-03 2000-12-07 Syngenta Participations Ag Plant pest control
US7011835B1 (en) 1997-07-10 2006-03-14 Research Development Foundation Targeted destruction of pests
US6013510A (en) * 1997-09-25 2000-01-11 Becton, Dickinson And Company Identification of a DNA region potentially useful for the detection of Mycobacterium kansasii
US7250494B2 (en) * 1998-06-15 2007-07-31 Biosynexus Incorporated Opsonic monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of Gram positive bacteria
US6187558B1 (en) 1998-06-24 2001-02-13 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Invertebrate intestinal mucin cDNA and related products and methods
WO1999067373A2 (en) * 1998-06-24 1999-12-29 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Invertebrate intestinal mucins, cdnas, antibodies and their use
ES2246093T3 (es) * 1998-10-16 2006-02-01 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Forderung Der Angewandten Forschung E.V. Patogenicida molecular que induce una resistencia a la enfermedad en las plantas.
AU2001236806A1 (en) * 2000-02-10 2001-08-20 Research Development Foundation Targeted destruction of pests
US9522217B2 (en) 2000-03-15 2016-12-20 Orbusneich Medical, Inc. Medical device with coating for capturing genetically-altered cells and methods for using same
US7465790B2 (en) * 2000-10-09 2008-12-16 Isis Innovation, Inc. Therapeutic antibodies
AU2001293995B2 (en) 2000-10-09 2005-10-13 Cytomx Therapeutics, Inc. Therapeutic antibodies
US7030156B2 (en) 2001-03-05 2006-04-18 University Of Florida Research Foundation, Inc Devices and methods for eliminating termite colonies
US6716421B2 (en) 2001-03-05 2004-04-06 University Of Florida Research Foundation, Inc. Devices and methods for eliminating termite colonies
US6969512B2 (en) 2001-03-05 2005-11-29 The University Of Florida Research Foundation, Inc. Devices and methods for eliminating termite colonies
US20050176928A1 (en) * 2001-03-23 2005-08-11 Syngenta Participations Ag Insect nuclear receptor genes and uses thereof
GB0119274D0 (en) * 2001-08-08 2001-10-03 Univ Durham Fusion proteins for insect control
US20040052779A1 (en) * 2001-12-21 2004-03-18 Stinson Jeffrey R. Opsonic monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of Gram positive bacteria
US20040063912A1 (en) * 2002-03-15 2004-04-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
US20040016004A1 (en) * 2002-04-01 2004-01-22 Raitano Arthur B. Nucleic acid and corresponding protein entitled 238P1B2 useful in treatment and detection of cancer
US7531522B2 (en) 2002-04-22 2009-05-12 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Forderung Der Angewandten Forschung E.V. Antibodies, recombinant antibodies, recombinant antibody fragments and fusions mediated plant disease resistance against fungi
US8025873B2 (en) 2002-06-20 2011-09-27 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8029803B2 (en) * 2002-06-20 2011-10-04 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8007805B2 (en) * 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
KR20070008714A (ko) 2004-04-30 2007-01-17 오르버스네이치 메디칼 인코포레이티드 유전적으로-변형된 세포 포획용 코팅을 갖는 의료 장치 및이의 사용 방법
CN101300355A (zh) * 2005-10-13 2008-11-05 威瑞克斯医药公司 包含丙型肝炎病毒多肽和用于引起免疫应答的Fc片段的嵌合抗原
US8415271B2 (en) * 2007-04-21 2013-04-09 Uxmal S.A. Biofertilizer formulation
WO2008156763A2 (en) * 2007-06-15 2008-12-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Human neutralizing monoclonal antibodies to h5n1 influenza a virus
EP2215247B1 (en) * 2007-11-13 2014-09-24 The Scripps Research Institute Production of cytotoxic antibody-toxin fusion in eukaryotic algae
CN102482347B (zh) 2009-01-12 2017-04-26 希托马克斯医疗有限责任公司 修饰抗体组合物及其制备和使用方法
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
EP3415010A1 (en) * 2017-06-13 2018-12-19 Agrosavfe Nv Insect-controlling polypeptides and methods

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5290914A (en) * 1988-04-28 1994-03-01 Mycogen Corporation Hybrid diphtheria-B.t. pesticidal toxins
US5196320A (en) * 1989-09-20 1993-03-23 Abbott Biotech, Inc. Method of producing engineered binding proteins
US5202422A (en) * 1989-10-27 1993-04-13 The Scripps Research Institute Compositions containing plant-produced glycopolypeptide multimers, multimeric proteins and method of their use
EP0438312A3 (en) * 1990-01-19 1992-07-01 Merck & Co. Inc. Recombinant human anti-cd18 antibodies
US5143905A (en) * 1990-05-03 1992-09-01 The Regents Of The University Of California Method and means for extending the host range of insecticidal proteins
US5665595A (en) * 1991-06-07 1997-09-09 Dowelanco Immunoglobulins against insect tissue
ES2082429T3 (es) * 1991-07-25 1996-03-16 Ciba Geigy Ag Metodo de deteccion inmunologico.

Also Published As

Publication number Publication date
US6069301A (en) 2000-05-30
EP0804579A1 (en) 1997-11-05
CN1151759A (zh) 1997-06-11
JPH11505401A (ja) 1999-05-21
AU696661B2 (en) 1998-09-17
NZ287124A (en) 1999-04-29
CA2193859A1 (en) 1996-01-11
US5686600A (en) 1997-11-11
EE9600192A (et) 1997-06-16
AU2573595A (en) 1996-01-25
CZ382196A3 (cs) 1998-03-18
HUT76089A (en) 1997-06-30
BG101171A (en) 1997-10-31
MX9700007A (es) 1997-04-30
WO1996000783A1 (en) 1996-01-11
BR9508154A (pt) 1998-07-14
PL318164A1 (en) 1997-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK166996A3 (en) Antibodies which bind to insect gut proteins and their use
RU2196824C2 (ru) Новые пестицидные протеины и штаммы
US6172281B1 (en) Recombinant plant expressing non-competitively binding BT insecticidal crystal proteins
JP4389075B2 (ja) 広域スペクトルのデルタ−エンドトキシン
KR101156893B1 (ko) 살충 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열들
KR20010006015A (ko) 식물 해충 방제 방법
UA75317C2 (uk) Виділений і очищений кристалічний білок bacillus thuringiensis, композиція кристалічного білка, очищений сегмент нуклеїнової кислоти, що кодує кристалічний білок, спосіб застосування сегмента нуклеїнової кислоти, що кодує кристалічний білок, спосіб виявлення послідовності нуклеїнових кислот, що кодує кристалічний білок, очищене антитіло, генероване шляхом використання кристалічного білка, штам клітин bacillus thuringiensis, що містить сегмент нуклеїнової кислоти, який кодує кристалічний білок, спосіб одержання кристалічного білка, інсектицидна композиція, яка містить кристалічний білок
MXPA99009043A (en) Plant pest control
JP2001506973A (ja) 鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ）昆虫とＣｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ ｓｐｐ．に毒性の、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＴｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのＣｒｙＥＴ２９組成物
US7019197B1 (en) Pesticidal fusions
JP2893585B2 (ja) 殺虫に有効なペプチド
JPH06502299A (ja) 殺虫性タンパク質
US5665595A (en) Immunoglobulins against insect tissue
US20040023875A1 (en) Insect inhibitory bacillus thuringiensis proteins, fusions, and methods of use therefor
US6855873B1 (en) Recombinant plant expressing non-competitively binding Bt insecticidal cryatal proteins
US6784337B1 (en) Method of improving nematode resistance in plants via transformation with a DNA encoding a proteinase inhibitor fusion protein
US10889830B2 (en) Binary insecticidal Cry toxins
JP5054267B2 (ja) 新規トキシン
HU220078B (hu) Transzgénikus növények, inszekticid szerek és növényvédelmi eljárások