HUT75368A - An enzyme with endo-1,3(4)-beta-glucanase activity - Google Patents

Description

KÖZZÉTÉTELI _K(,.?|LDÁNY

63.085/SZE

Endo-l,3(4)-p-glukanáz aktivitású enzim

NOVO NORDISK A/S, BAGSVAERD, DÁNIA

Feltalálók:

KOFOD Lene Venke,

ANDERSEN Lene Nonboe,

KAUPPINEN Márkus Sakari, CHRISTGAU Stephan,

DALB0GE Henrik,

OLSEN Hans Sejr,

BREINHOLT Jens,

BAGSVAERD, DÁNIA

A bejelentés napja: 1995. 05. 11.

Elsőbbsége: 1994. 05. 11. (546/94),

DÁNIA

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/DK95/00188

A nemzetközi közzététel száma: WO 95/31533

-2A jelen találmány tárgya endo-l,3(4)-P-glukanáz aktivitású enzim, az enzimet kódoló DNS konstrukció, az enzim és az enzimet tartalmazó enzimkészítmény előállítására szolgáló eljárás, az említett enzim vagy enzimkészítmény felhasználása a β-glukán tartalmú anyagok módosítását vagy lebontását is magában foglaló számos alkalmazási területen.

Ugyancsak szó van egy lényegében tiszta izolált NN049006 Saccharomyces cerevisiae kultúráról, amelyet az Acremonium fajból származó DNS szekvencia segítségével alakítottunk át (CBS 265.95).

Az endo-l,3(4)-p-glukanázok (E. C. sz. 3.2.1.6) a hidrolázok olyan csoportjából állnak, melyek katalizálják az 1,3-glukánok l,3-P-D-glükozid kötéseinek endo hidrolízisét, így például a kurdlan, a lichenan és a gomba sejtek (ideértve az élesztő gombákat is) falainak fő komponensét képező laminarin, valamint a kevert β-1,3-1,4glukánokban, mint például a gabona β-glukánokban, található β-1,4 kötések endo hidrolízisét. A hivatalos szisztematikus nevük 1,3-(1,3;l,4)-p-D-glukán-3(4)glukanohidroláz, a hétköznapi gyakorlatban pedig általánosan a laminarináz nevet használjuk, de a jelen leírásban a rövidített endo-l,3(4)-p-glukanáz elnevezés ugyancsak előfordul.

A gombafélékhez tartozó olyan mikroorganizmusok, mint az élesztőgombák és egyéb gombák sejtfalai komplex szerkezetűek és a β-glukán mellett számos egyéb összetevőt tartalmaznak. Például az élesztőgombák sejtfalai a glukán réteg mellett protein-mannan komplex rétegből állnak (Andrews és Asenjo, 1987), a fonalas gombák pedig ezen túlmenően különböző mennyiségű kitint és kitozánt tartalmaznak (vő. Hudson, H. J„ 1986).

A technika állásából jól ismert, hogy a mikroorganizmusok számos olyan értékes anyagok termelnek, mint a színezékek, az íz- és aromaanyagok, a vitaminok,

-3 amelyek kinyerése kívánatos. A sejten belül szintetizált termékek kinyeréséhez szükség van a mikrobiális termelősejtek sejtfalainak felrepesztésére vagy felbontására.

A mikróbasejtek falainak komplex összetétele miatt, a sejtfalak felszakítása vagy felbontása hagyományosan igen erőteljes kezelési eljárásokkal hajtható csak végre, amelyek során erős vegyszerek és/vagy mechanikai észközök alkalmazására is sor kerül.

Az élesztő extraktumok vagy egyéb sejten belül képződött termékek előállítása során a kémiai vagy mechanikai feltárás kívánatos alternatívájaként a mikróbasejtek enzimatikus felbontását és feltörését ajánlották (ld.: Andrew and Asenjo (1987); Phaff (1977)). Ezen túlmenően enzimatikus bontás alkalmazását javasolták az gombából vagy élesztőkből származó protoplasztok előállítása során is. (Hamlyn és mtársai, 1981). Számos kereskedelmi forgalomban hozzáférhető enzim készítmény felhasználható az élesztő- és gombasejtek enzimatikus bontására. Ezek a termékek rendszerint többféle enzimatikus aktivitással rendelkeznek, így például β-1,3- és/vagy β-Ι,ό-glukanáz, proteáz, kitináz, mannanáz aktivitású vagy más egyéb sejtfal komponensek lehasítására alkalmasak enzimek.

Pitson és munkatársai (1993) szerint az endo-l,3(4)-P-glukanáz aktivitással rendelkező enzimeket termelő szálas gombák közé például a Rhizopus arrhizus, Trichoderma longibranchiatum és a Penicillum funiculosium tartoznak.

A jelen találmány célkitűzése, hogy olyan új endo^-glukanáz enzimet, valamint olyan endo^-glukanáz előállítására szolgáló eljárást nyújtson, amely nagyobb tisztaságú termék előállítását teszi lehetővé jobb kitermeléssel, mint az ez idáig lehetséges volt, emellett az új endo-1,3(4)-P-glukanáz enzimnek önmagában vagy egyéb enzimekkel kombinációban növényi- vagy mikróbasejt fal szövet lebontásra történő felhasználását bemutassa. A találmány célkitűzése továbbá az is, hogy olyan új • · ·

-4termékeket szolgáltasson, amelyekben az endo-l,3(4)-P-glukanáz enzim aránya magas az eredeti termékbeli részarányhoz viszonyítva.

Kívánatos lenne az enzim készítmények sejtfal lebontó vagy módosító képességének növelése és ezen túlmenően előrelépést jelentene, ha specifikusabban tudnánk kontrollálni a speciális növény- vagy mikróbasejt falak komponenseinek lebomlását vagy módosítását.

A jelen találmány feltalálóinak meglepő módon sikerült izolálni és pontosan meghatározni azt a DNS szekvenciát, amely az endo-l,3(4)-P-glukanáz aktivitást mutató enzimet kódolja és ezáltal lehetővé vált az egyes endo-l,3(4)-P-glukanázok előállítása.

Ennek megfelelően a találmány egyik aspektusból az endo-p-glukanáz enzim aktivitással rendelkező enzimet kódoló DNS szekvenciát tartalmazó DNS konstrukcióra vonatkozik, amely DNS szekvencia

a) a SEC ID No. 3 szám alatt bemutatott DNS szekvencia vagy

b) a SEC ID No. 3 szám alatt bemutatott DNS szekvencia olyan analógja, amely

i) homológ a SEC ID No. 3 szám alatt bemutatott DNS szekvenciával; és/vagy ii) hibridizál ugyanazzal az oligonukleotid próbával, amit a SEC ID No. 3 szám alatti DNS szekvencia mutat be; és/vagy iii) olyan polipeptidet kódol, amely homológ a SEC ID No. 3 szám alatt bemutatott DNS szekvencia által kódolt polipeptiddel; és/vagy iv) olyan polipeptidet kódol, amely immunológiailag reaktív a CBS 243.71. számú Trichoderma harzianum-ból származó SEC ID No. 4 szám alatt bemutatott • · · ·

-5szekvencia által kódolt, tisztított endo-l,3(4)^-glukanázzal szemben termelt ellenanyaggal.

A találmány egy speciális megvalósítási módja szerint a fentiekben említett DNS szekvencia endo-l,3(4)-p-glukanáz aktivitással rendelkező enzimet kódol.

A jelen szöveg összefüggésben a SEC ID No. 3 szám alatt bemutatott analóg DNS szekvencia olyan endo-3-glukanáz (így például endo-l,3-3-glukanáz és endol,3(4)-P-glukanáz aktivitású enzimet kódoló DNS szekvenciát jelöl, amely a fentiekben i) - iv) pontok alatt ismertetett tulajdonságokkal rendelkezik. Jellegzetesen az analóg DNS szekvencia

- egy másikból vagy azok származékaiból (pl. ugyanabból az) ismert organizmusból kerül elválasztásra vagy az endo-p-glukanáz aktivitású enzimet az itt ismertetésre kerülő eljárások alkalmazásával a SEC ID No. 3 szám alatt bemutatott DNS szekvencia alapján vagy valamely SEC ID No. 1 vagy 2 szám alatt bemutatott DNS szekveciák alapján állítjuk elő, vagy

- a SEQ ID No. 3 szám alatt bemutatott DNS szekvencia alapján vagy bármely a SEQ ID No. 1 vagy 2 szám alatt szereplő DNS szekvenciák alapján kerül felépítésre, például olyan nukleotid helyettesítések bevitelével, amelyek nem eredményezik a DNS szekvencia által kódolt endo-p-glukanázban más aminosav szekvencia létrejöttét, de amely megfelel az enzim termelésére szánt gazda szervezet kód hasznosításának; vagy olyan nukleotid helyettesítések bevitelével, amelyek eltérő aminosav szekvenciát eredményeznek és ezáltal lehetővé válik a natív enzimtől eltérő tulajdonságokkal rendelkező endo-3-glukanáz mutáns előállítására képes eltérő fehérje szerkezet létrehozása. A lehetséges módosításokra további példaként említjük egy vagy több nukleotidnak a szekvenciába történő inszertcióját, egy vagy több nukleotidnak a hozzáadását vagy a szekvencia végéhez, ilyen lehet például valamely cellulóz kötő dómén, illetve egy vagy több nukleotidnak a kiejtése vagy a szekvencia végéről vagy a « · ···· * · «· * · · · « • · · · ·

-6szekvenciából. Például az analóg DNS szekvencia lehet a SEQ ID No. 3 szám alatt vagy a SEQ ID No. 1 vagy 2 szám alatt bemutatott DNS szekvenciák bármelyike.

Magától értetődő, hogy a SEQ ID Nos. 1 szám és SEQ ID No. 2 szám alatt bemutatott DNS szekvenciák vagy a DNS szekvencia részek olyan szekvenciák, melyek felhasználhatók az endo-P-glukanáz aktivitású enzim kódolására szolgáló DNS teljes szekvencia izolálására. Az analóg elnevezés a SEQ ID No. 3 szám alatt bemutatott teljes DNS szekvenciát magába foglalja, amely tartalmazza a SEQ ID Nos. 1 vagy 2 szám alatt bemutatott szekvenciáknak legalább egy részét, illetve részeit.

A fentiekben az i) pontban hivatkozott hidridizáció azt jelzi, hogy az analóg DNS szekvencia hibridizál ugyanahhoz a próbához, mint az endo-l,3(4)-P-glukanáz enzimet kódoló DNS szekvencia bizonyos speciális körülmények között, amelyeket részletesen az alábbiakban következő Anyagokat és eljárásokat ismertető részben írunk le. Rendszerint az analóg DNS szekvencia nagymértékben homológ, legalább 40 -50 %-ban, de még inkább 60 - 70 %-ban a fentiekben bemutatott, a találmány szerinti endo-p-glukanáz enzimet kódoló szekvenciák bármelyikéhez, ily módon legalább 75 %-ban, legalább 80 %-ban, legalább 85 %-ban, legalább 90 %-ban vagy éppen 95 %bán homológ a fentiekben bemutatott szekvenciák közül bármelyikhez.

A fentiekben az i) pontban szereplő homológia fok a két szekvencia közötti azonosság fokaként kerül meghatározásra jelezve az első szekvencia másodikból történő származtatását. A homológia megfelelően meghatározható a technika állásából ismert számítógépes programok segítségével. Jellegzetes módon a DNS szekvencia legalább 40 és 50 % közötti, de inkább legalább 60 és 70 % közötti, így legalább 80 %os vagy 90 %-os azonossági szintet mutat a SEQ ID No. 3 szám alatt bemutatott DNS szekvenciával vagy a SEQ ID No. 1 és/vagy 2 szám alatt bemutatott DNS szekvencia(k) legalább egy részével rendelkező DNS konstrukcióval.

A fentiekben az iii) pontban szereplő homológia fok a két szekvencia közötti azonosság fokaként kerül meghatározásra jelezve az első szekvencia másodikból • · · ·

-7történő származtatását. A homológia megfelelően meghatározható a technika állásából ismert számítógépes programok segítségével. Jellegzetes módon az analóg DNS szekvencia legalább 40 és 50 % közötti, de inkább legalább 60 és 70 % közötti, így legalább 80 %-os vagy 90 %-os homológia fokot mutat a SEQ ID No. 3 szám alatt bemutatott DNS konstrukcióval vagy a SEQ ID No. 1 és/vagy 2 szám alatt bemutatott rész DNS konstrukciókkal kódolt enzimmel.

Az iii) tulajdonsággal összefüggésben a fentiekben ismertetett származik valamiből terminológia nem csupán a CBS 243.71 törzs által előállított endo-l,3(4)-pglukanázra vonatkozik, hanem a CBS 243.71 törzsből kinyert DNS szekvencia által kódolt és az említett DNS szekvencia révén a gazda szervezetben előállított endol,3(4)-P-glukanázra is. Az immunológiai reaktivitás az alábbiakban következő, az Anyagokat és eljárásokat részletesen ismertető részben leírt eljárással határozható meg.

A jelen találmány szerinti megoldás további aspektusból a találmány szerinti DNS szerkezetet magában foglaló expressziós vektorra, az expressziós vektort vagy a DNS konstrukciót tartalmazó sejtre és az endo-l,3(4)-P-glukanáz aktivitással rendelkező enzim előállítási eljárásra vonatkozik, amely eljárás az enzim termelést lehetővé tévő körülmények között az említett sejtek tenyésztését jelenti, valamint a tenyészetből történő enzim kinyerési eljárásra vonatkozik.

A találmány még további aspektusból az endo-P-glukanáz aktivitást mutató enzimre vonatkozik, amely enzimet

a) a találmány szerinti DNS konstrukció kódolja; és/vagy

b) a jelen találmány szerinti eljárással állítjuk elő; és/vagy amely enzim

c) immunológiailag reaktív a CBS 243.71. számú Trichoderma harzianum-bói származó SEC ID No. 4 szám alatt bemutatott szekvencia által kódolt tisztított endol,3(4)-3-glukanázzal szemben termelt ellenanyaggal.

• · ·

- 8Az említett találmány szerint elválasztott enzimet az alábbiakban ismertetett kiviteli példákban jellemezzük. Például azt találtuk, hogy az SDS-PAGE-el meghatározott látszólagos molekulatömege (Mw) körülbelül 31 kDa. Továbbá a látszólagos izolelektromos pontját (pl) körülbelül 5.1-nek találtuk.

Az enzim kinetikai paramétereit és specifikus aktivitását ugyancsak meghatároztuk. Az endo-l,3(4)-p-glukanáz specifikus aktivitása 30 °C-os hőmérsékleten, pH = 5.0 érték mellett körülbelül 100 - 200 U/mg enzim, valamint a Km érték 0.02 és 0.06 % p-l,3-l,4-glukán körüli.

Továbbá azt tapasztaltuk, hogy a találmány szerinti endo-l,3(4)-P-glukanáz 4.0 és 6.5 közötti pH tartományban több, mint 60 %-os aktivitással rendelkezik, az optimális aktivitást jelentő pH érték tartomány pedig 4.5 és 5.5 közötti (lásd 1. ábra). Az enzim aktivitást 50 °C-os hőmérsékleten találtuk optimálisnak (lásd 2. ábra).

Továbbá a β-glukánok depolimerizációjával és ¹³C NMR méréssel igazoltuk, hogy a kinyert enzim l,3(4)endo^-l,3(4)-glukanáz aktivitást mutat, az eljárásokat a 9. és 10. kiviteli példákban ismertetjük.

A jelen találmány egy még további aspektusból számos célra, így β-glukán tartalmú anyagok, különösen mikróbasejtek fal anyagainak módosítására vagy lebontására és/vagy növényi sejtfal összetevők módosítására vagy lebontására alkalmas enzim készítményekre vonatkozik, az említett készítmények a fentiekben ismertetett endo-l,3(4)^-glukanáz aktivitást mutató enzimekben gazdagok.

Sorrendben az utolsó aspektusát tekintve a találmány szerinti megoldás a találmány szerinti enzim vagy a találmány szerinti enzimkészítmény számos olyan területen történő felhasználására vonatkozik, ahol növényi vagy mikrobiális sejt falak anyagainak módosítására vagy lebontására van szükség.

-9A mellékelt ábrák rövid ismertetése

Az 1. ábra a találmány szerinti endo-P-l,3(4)-glukanáz enzim aktivitását mutatja be a pH függvényében 30 °C-os állandó hőmérsékleten.

A 2. ábra a találmány szerinti endo-P-l,3(4)-glukanáz enzim aktivitását mutatja be a hőmérséklet függvényében 5.0 állandó pH érték biztosítása mellett.

A 3. ábra a Laminarinnak a találmány szerinti endo-l,3(4)-P-glukanáz enzimes depolimerizációját mutatja be.

A 4. ábra a p-l,3-l,4-glukánnak a találmány szerinti endo-l,3(4)-p-glukanáz enzimes depolimerizációját mutatja be.

Az 5. ábra a kurdlannak a találmány szerinti endo-l,3(4)-P-glukanáz enzimes depolimeriációját mutatja be.

A 6. ábra a β-glukán ¹³C NMR spektrumát mutatja be a találmány szerinti endo-1,3(4)β-glukanáz enzimmel történő kezelés előtt, alatt és után.

A találmány szerinti endo^-glukanáz aktivitással rendelkező enzimet kódoló DNS szekvencia általánosan alkalmazott eljárással választható el, amely magában foglalja a a DNS klóntárnak a Trichoderma harzianum-ból megfelelő vektorok formájában történő klónozását;

a megfelelő élesztő gazdasejteknek az említett vektorokkal történő transzformálását;

a gazdasejtek megfelelő körülmények közötti tenyésztését annak érdekében, hogy expresszáltassa a számunkra érdekes enzimet, amelyet a DNS klóntárban található egyik klón kódol;

- 10a kiónok által előállított enzim endo-P-glukanáz aktivitásának meghatározásával a pozitív kiónok kiszűrését;

az enzim kódoló DNS izolálását ezekből a kiónokból.

Az általánosan alkalmazható eljárás további részletes ismertetése a WO 93/11249 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben megtalálható, amely szakirodalom a jelen bejelentés esetében a technika állásának részét képezi. A szűrési vagy osztályozási eljárás az alábbiakban ismertetett 1. kiviteli példában részletesen ismertetésre kerül.

Az enzim kódolására szolgáló DNS szekvencia például a Trichoderma harzianum, például annak CBS 243.71 számú törzse, cDNS klóntárának átvizsgálásával izolálható, amely törzs nyilvánosan hozzáférhető Hollandiában, Delftben a Centraalbureau voor Schimmelcultures-ban, majd kiválaszhatók a megfelelő aktivitású enzimet expresszáló kiónok (az endo-l,3(4)-3-glukanáz aktivitású enzim valamely megfelelő szubsztrátum, így például az AZCL-kurdlan és az AZCLglukán p-l,3(4)-glukán kötéseinek hidrolizáló képességével definiálható; vö. az alábbiakban következő Anyagokra és eljárásokra vonatkozó leírás résszel.) A megfelelő DNS szekvencia ezután a klónból standard eljárásokkal, például az 1. kiviteli példában is ismertetett módon választható el.

Ezek után elvárható, hogy a homológ enzim kódolására szolgáló DNS szekvenciához, azaz valamely analóg DNS szekvenciához, egyéb mikroorganizmusokból is hozzájussunk. Például a DNS szekvencia más mikroorganizmusok, különösen gombák, így az Aspergillus sp. törzs, főként az A. aculeatus vagy A. niger törzsek; egy másik Trichoderma sp. törzs, ideértve különösen a T. reesie. a T. viride, a T. longíbrachiatum vagy a T. koningii törzseket; vagy a Fusarium sp. törzs, különösen az F. oxyspórum törzs; vagy ά Humicola sp. törzs; vagy a Rhizopus sp. törzs, főként a Rhizopus arrhizus', vagy zzAcremonium sp. törzs; vagy a Botrytis sp. törzs; vagy a Penicillium sp. törzs vagy a Scleotium sp. törzs cDNS könyvtárának hasonló módon történő szűrésével is származtatható.

• · · · · ·

- 11 Ezekre a homológ enzimeket kódoló DNS szekvenciákra specifikus példák származtathatók az Acremonium sp.-ből (CBS 265.95). Ezeket az enzimeket kódoló teljes DNS szekvenciának két részleges szekvenciáját a mellékelt SEC ID No. 5 és a SEC ID No. 6 tartalmazza.

A szaccharomyces cerevisiae pYes 2.0 expressziós plazmiddal (Invitrogen) transzformált, amely a SEC ID No. 5 és SEC ID No. 6 számok alatt bemutatott cDNS szekvenciákkal rendelkezik, a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH-nál (rövidítve; DSM) Németországban (Mascheroder Weg lb, D3300 Braunschweig) került letétbe helyezésre az alábbiakban feltüntetett napon (ld. pontos dátum) szabadalmaztatási eljárás céljából. Mivel a DSM a Budapesti Szerződés értelmében nemzetközi letétbe-helyezési intézet a szerződés 9. cikkelye értelmében folyamatosan lehetőséget nyújt a letétbe helyezésre.

A letétbe helyezés napja: 1995. 05. 1E

Depozíciós hivatkozási szám: NN049006

DSM ügyiratszám: DSM 9970

Alternatív módon a találmány szerinti endo-l,3(4)-P-glukanáz kódolására szolgáló DNS - a technika állásából jól ismert eljárásokkal - a fentiekben említett mikroorganizmusokból származó DNS-ből könnyedén izolálható a jelen leírásban ismertetett DNS szekvenciából kiindulva előállított szintetikus oligonukleotid próbák használatával. Például a megfelelő oligonukleotid próba a SEC ID No. 3 szám alatt bemutatott nukleotid szekvenciára épül, illetve a nukleotid szekvenciáknak legalább egyes részeit a SEC ID No. 1 és 2 számok alatt mutatjuk be.

A DNS szekvencia ezt követően beilleszthető a rekombináns expressziós vektorba. Ez lehet bármely olyan vektor, amelyen a rekombináns DNS eljárások egyszerűen végrehajhatók, a vektor kiválasztása gyakran attól a gazda sejttől függ, amelybe azt bevisszük. Ennek megfelelően a vektor lehet egy függetlenül replikálódó ll

- 12vektor, azaz olyan vektor, amely extrakromoszómálisan létezik, amelynek a replikációja független a kromoszómális replikációtól, például egy plazmid. Alternatív módon a vektor olyan is lehet, hogy amikor a gazdasejtbe bevisszük, integrálódik a gazda sejt genomjába és azzal a kromoszómával (illetve azokkal a kromoszómákkal) együtt replikálódik, amelybe integrálódott.

A vektorban az endo-P-glukanáz kódolására szolgáló DNS szekvencia a megfelelő promóter és terminátor szekvenciához működőképesen kell, hogy kapcsolódjék. A promóter bármely DNS szekvencia lehet, amely transzkripcionális aktivitást mutat a kiválasztott gazdasejtben és származhat olyan génekből is, amelyek gazdasejttel homológ vagy heterológ fehérjéket kódolnak. Az endo-p-glukanáz kódolására szolgáló DNS szekvencia, a promóter és a terminátor lekötésére, valamint azoknak a megfelelő vektorokba történő illesztésére használt eljárások szakember számára a technika állásából jól ismert módszerek (vö., például Sambrook és mtsai, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

A találmány tárgyát képező enzimet kódoló DNS szekvenciával átalakított gazdasejt előnyösen valamely eukariota sejt, különösen gomba, mint például élesztőgomba vagy fonalas gomba sejt. A sejt különösen Aspergillus, még előnyösebben az Aspergillus oryzae vagy Aspergillus niger fajok közé tartozik. A gombasejtek átalakíthatok protoplaszt képzéssel és a protoplasztok transzformálásával, melyet a sejtfal önmagában ismert módon végzett regenerációja követ. Gazda mikroorganizmusként Aspergillus alkalmazását írja le az EP 238 023 lajstromszámú európai szabadalmi leírás (Novo/Nordisk A/S), amely a jelen bejelentéshez tartozó technika állásának részét képezi. A gazdasejt lehet valamely élesztőgomba sejt, például valamely Saccharomyces sp. törzs, főként Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri vagy Saccharomyces uvarum, Schizosaccharomyces sp. törzs, például Schizosaccharomyces pombe, Hansenula sp. törzs vagy a Pichia sp. törzs vagy Yarrowia sp. törzs, például a Yarrowia lipolytica vagy a Kluyveromyces sp. törzs, így például a Kluyveromyces lactis.

• · · · · · ·

- 13 A találmány egy még további aspektusát tekintve a találmány szerinti enzim előállítására szolgáló eljárásra is vonatkozik, amelynek során a megfelelő enzimet kódoló DNS szekvenciával transzformált gazdasejtet az enzim termelődését biztosító körülmények között tenyésztjük és a kapott enzimet a tenyészetből kinyerjük.

A transzformált gazdasejteket tartalmazó kultúrához bármely hagyományosan alkalmazott, a kérdéses gazdasejtek szaporodásának biztosításához megfelelő közeg felhasználható. Az expresszált endo-β-glükanáz könnyen hozzáférhető módon a kultúra közegbe választódik ki és onnan jól ismert eljárásokkal nyerhető ki, így például a sejteknek a közegből történő kicentrifugálásával vagy kiszűrésével, a közeg proteinszerű összetevőinek sózásos - így például ammónium-szulfát hozzáadásával történő - kicsapásával és a mindezeket követő kromatográfiás eljárásokkal, így például ioncserés kromatográfia, affinitás kromatográfia segítségével, és ehhez hasonló eljárásokkal.

A jelen találmány tárgyát képezi egy még további aspektusból a β-glukánt tartalmazó anyagok módosítására vagy lebontására alkalmas enzimkészítmény, ahogyan azt már az előzőekben is kifejtettük, a találmány szerinti enzimkészítmény koncentráltan tartalmazza endo-l,3(4)^-glukanáz aktivitást mutató enzimet.

A találmány szerinti enzimet bőségesen tartalmazó enzimkészítmény lehet például többszörös enzimatikus aktivitású enzimkészítmény, különösen egy a mikrobiális sejtfalak lebontásához vagy módosításához szükséges különböző enzimeket tartalmazó enzimkészítmények. Az ebbe a fajtába tartozó enzimkészítmények közül példaként a lítikus, főként a mikrobiális (gomba vagy baktérium) eredetű enzimrendszereket említjük. Az enzimek származhatnak például olyan Trichoderma törzsből, mint a Trichoderma harzianum, a Trichoderma viride vagy a Trichoderma reesie, az Oerskovia sp. törzsből, például Oerskovia xanthineolytica-bói, Arthrobacter sp. törzsből, például Arthrobacter luteus-bó\, Rhizoctonia sp. vagy Cytophaga sp. törzsekből, a Staphylococcus sp. törzsből vagy a Streptomyces sp. törzsből. Azok közül a kereskedelmi forgalomban kapható

- 14enzimkészítmények közül, melyek hatásfoka egyszerűen és kényelmesen fokozható a jelen találmány tárgyát képező enzimmel, a következőket említjük: Novozyme® 234, Cereflo® 200L, valamint Glucanex® (a Novo Nordisk A/S, Dánia termékei), Cellulase (Merck termék), Cellulase Cp és Cellulase CT (Sturge termékek) és/vagy Chitinase (Sigma termék).

A jelen találmány szerinti megoldás ismertetésekor az enzimkészítménnyel összefüggésben használt gazdagított kifejezéssel azt kívánjuk jelezni, hogy az enzimkészímény endo-l,3(4)-P-glukanáz aktivitását fokoztuk, például a gazdagítási faktor könnyűszerrel legalább 1.1-el növelhető a fentiekben ismertetett eljárással előállított találmány szerinti enzim hozzáadásával.

Alternatív módon az endo-l,3(4)-P-glukanáz aktivitású enzimmel gazdagított enzimkészítmény lehet olyan, amely a találmány szerinti enzimet fő enzimatikus komponensként tartalmazza, például egyetlen enzim komponenst tartalmazó készítményről van szó.

A találmány szerinti enzimkészítmény, amely folyékony halmazállapotú vagy szilárd termék egyaránt lehet, a technika állásából ismert eljárásokkal állítható elő. Az enzimkészítmény elkészíthető granulátumként vagy mikrogranulátumként egyaránt. A készítmény enzimkomponense a technika állásából ismert eljárásokkal stabilizálható.

A találmány szerinti enzimkészítmény a találmány szerinti endo-l,3(4)-pglukanáz enzim mellett tartalmazhat egy vagy több egyéb sejtfal bontó enzimet is, például a cellulotikus, mannolitikus, kitinilitikus vagy proteolitikus aktivitással rendelkező celluláz, endo-glukanáz, β-glukozidázok, β-Ι,ό-glukanáz, a mannáz, az endo- vagy exo-kitináz, a proteáz, a- vagy β-mannozidáz vagy mutanáz. További enzim(ek) állítható(k) elő olyan mikroorganizmusok segítségével, amelyek az Aspergillus nemzetséghez, genus-hoz tartoznak, előnyösen az Aspergillus niger, az Aspergillus acilatus, az Aspergillus awamori és az Aspergillus oryzae vagy a

- 15Trichoderma felhasználásával, illetve valamely egyéb a fentiekben a kereskedelemben beszerezhető készítményekkel kapcsolatban említett mikroorganizmus felhasználásával.

A találmány tárgyát képező enzimkészítmények előnyös alkalmazási területeire az alábbiakban mutatunk be példákat. A találmány szerinti enzimkészítmények felhasználási dózisai és alkalmazásának egyéb körülményei a technika állásához tartozó ismert eljárásokkal meghatározhatók.

A találmány szerinti enzimkészítmény előnyösen β-glukán tartalmú anyagokat, így mikróbasejt falakat módosító vagy lebontó szerként alkalmazható. A találmány szerinti enzimkészítmény különösen a mikroorganizmusok sejtfalainak felrepesztésére vagy felbontására használható fel, ami lehetővé teszi a mikroorganizmus által kiválasztott (termelt) kívánt termékek kinyerését.

Magától értetődő, hogy az enzimkészítményt minden egyes felrepeszteni vagy elbontani kívánt sejtfal esetében specifikusan kell alkalmazni. Például az élesztő sejtek fala két fő rétegből tevődik össze, egy külső protein-mannan komplexből, valamint egy belső glukán rétegből. Az élesztő sejtfalának hatékony felrepesztése céljából kívánatos, hogy a felhasználásra kerülő enzimkészítmény legalább proteáz, mannáz és β-glukanáz aktivitással rendelkezzen.

A mikroba sejtfalak felrepesztését követően kinyert extraktum rendszerint számos különböző olyan összetevőket tartalmaz, mint a vitaminok, színezékek, íz- és aromaanyagok, emulgeálószerek és stabilizáló szerek. Az élesztősejtek felrepesztésével kapott extraktumokat, azaz élesztő extraktumokat, mint olyanokat például élelmiszeripari vagy takarmányozási célokra használják - vagy annak összetevőit elválaszthatják, majd tetszőlegesen tovább feldolgozhatják.

A kinyerhető termékek közül példaként említjük az emulgeálószereket, a stabilizáló szereket, a vitaminokat, a színezékeket (például a karoténoidokat, a Q-10-et • · · ·

- 16és az astaxanthint), az enzimeket, a proteineket és az aromaanyagokat vagy ízfokozó szereket (pl.: MSG, 5'-GMP és 5'-IMP). A termékek lehetnek a kérdéses mikroorganizmushoz alapvetően hozzátartozó, benne rejlő anyagok, illetve lehetnek olyan termékek, amelyek előállítására a mikroorganizmust megszerkesztettük, ezek például a rekombináns termékek.

Továbbá a találmány szerinti endo-1,3(4)-P-glukánáz enzim felhasználható az élesztő sejtek falának, például a Saccharomyces cerevisiae sejtfalának külső mannan proteinje kinyerésében is. A manno-protein hatásos bioemulzifíkáló szer.

Ezen túlmenően a találmány szerinti enzimkészítmény felhasználható élesztőkből (pl.: Saccharomyces sp. vagy Schizosaccharomyces sp.) vagy gombákból (pl.: Aspergillus sp. vagy Penicillium sp.) történő protoplaszt előállításra. Ezekből a mikroorganizmusokból származó protoplasztok előállítása és regenerálása fontos fúziós, transzformációs és klónozási vizsgálatokban. A protoplaszt előállítás a technika állásából általánosan ismert eljárásokkal hajtható végre.

Emellett a találmány szerinti enzimkészítmény az olyan β-glukánok, mint a kurdlan, a laminarin és a lichenan módosítására is felhasználható.

A jelen találmány egy még további aspektusból növényi sejtfal tartalmú anyagok módosítására vagy lebontására szolgáló enzimkészítményre vonatkozik, amely készítmény a találmány szerinti endo-l,3(4)-3-glukanáz aktivitású enzimet dúsítva tartalmazza.

A találmány szerinti enzimet dúsítva tartalmazó, növényi sejtfal tartalmú anyagok módosítására vagy lebontására szolgáló enzimkészítmény rendelkezhet továbbá például többszörös enzimatikus aktivitással, főként többszörös növényi sejtfal bontó enzimként Pectinex®, Pectinex Ultra SP®, Celluclaste® vagy Celluzyme® készítményeket (ezek mindegyike Novo Nordisk A/S termék) tartalmazó enzimkészítményekről van szó.

• · · ·

- 17A találmány szerinti enzimkészítmény a találmány tárgyát képező endo-1,3(4)β-glukanáz aktivitású enzim mellett tartalmazhat egy vagy több egyéb növényi sejtfal bontó enzimet is, például cellulolitikus, xilanolitikus vagy pektinolitikus aktivitásúakat, így például xilanázt, arabinanázt, galaktanázt, rhamnogalakturonázt, acetilészterázt, galactanázt, poligalakturonázt, pektin-liázt, pektát-liázt, endoglukanázt (például a jelen leírásban ismertetett endo-l,3(4)^-glukanáztól eltérő specifikummal rendelkezőt) vagy pektin-metilészterázt. Ez(ek) a járulékos enzim(ek) az Aspergillus nemzetséghez tartozó, előnyösen az Aspergillus niger, az Aspergillus aculeatus, az Aspergillus awamori vagy az Aspergillus oryzae mikroorganizmusok segítségével állítható(k) elő.

A találmány szerinti endo-l,3(4)^-glukanáz előállítható lényegében egyéb más sejtfal bontó enzim nélkül is. Ez lehetővé teszi az enzim egyedüli vagy egyéb egykomponensű enzimmel való együttes alkalmazását, ily módon hozva létre az adott speciális területen alkalmazható optimális enzim kombinációt. Ezáltal lehetőség nyílik olyan enzimkombinációk kialakítására, amelyek csupán a sejt speciális részeit bontják le. Ez a specifikus bontás korábban nem volt kivitelezhető a kereskedelmi forgalomban kapható celluláz, glukán, kitináz, mutanáz, hemicelluláz és/vagy pektináz készítményekkel.

Az találtuk, hogy a találmány szerinti endo-l,3(4)^-glukanáz nagy specificitást mutat a β-l,3-glukánok iránt éppúgy, mint a kevert kötésű β-1,3-1,4^Εύ«ΰκ& iránt.

A kevert kötésű P-l,3-l,4-glukánok iránti aktivitása az endo-l,3(4)^-glukanázt és annak homológjait alkalmassá teszi a sörfőzésben, a szőlőborászatban és a sajtolt gyümölcslevek készítésben történő felhasználásra.

A sörfőzés esetében az enzimek lebontják a sörárpa β-glukánját és ezáltal csökkentik a sörcefre viszkozitását és növelik annak szűrhetőségét. A söriparban a βglukánok iránti nagy fajlagosság előnyös összehasonlítva egyéb endoglukanázokkal, • · · w ·

- 18mivel a β-glukán által okozott viszkozitás csökkenthető a cellulóz struktúrák egyidejű bomlása nélkül, amelyek elemi fontosságúak a sörcefre szűrhetősége szempontjából ott, ahol a sörfőző mester gabonát használ szűrési segédanyagként.

A szőlőborászatban és a sajtolt gyümölcslevek készítésénél az endo-l,3(4)-3glukanázok alkalmazása elősegítheti a szűrhetőség javítását meggátolva az olyan mikroorganizmusok növekedését, mint a Botrytis cinerea, amely a szőlőszemeket megfertőzheti.

Ezen túlmenően a kevert kötésű P-l,3-l,4-glukánok iránti aktivitás a találmány szerinti enzimet alkalmassá teszi élelmiszerek vagy állati takarmányok előállítására vagy ezekbe történő adagolásra ezáltal javítva a tápanyag felvétel hatásfokát vagy az emészthetőséget. Emellett az endo-l,3(4)-P-glukanáz felhasználható a sötőipari termékek vagy egyéb gabonából készülő termékek minőségének javítására.

A találmány szerinti endo-l,3(4)-P-glukanáz enzim felhasználható továbbá például a kevert kötésű P-l,3-l,4-glukanánnal rendelkező növényi anyagokból származó oligoszacharidok előállítására. Az így kapott oligoszacharidok például az élelmiszeriparban sűrűsítő anyagként alkalmazhatók.

Továbbá az endo-l,3(4)-P-glukanáz a növényi anyagokban található aroma komponensek kinyerésére is felhasználhatók.

A fentiekben felsorolt alkalmazási területek esetében, a találmány szerinti enzimkészítmény felhasznált dózisa vagy egyéb a készítmény felhasználásakor felmerült körülmény a technika állásából ismert eljárásokat alapul véve szakember által meghatározható.

A találmány szerinti megoldás magában foglalja az endo-l,3(4)-P-glukanáznak vagy az abból készült enzimkészítménynek aktív hatóanyagként történő alkalmazását a 4 ··»· *· ·· ·· ' · · • « 4 ·· • « · · « •4« ··· 4

- 19műfogsortisztító készítményekben. A készítmény alkalmas mikroorganizmusok eltávolítására a műfogsor felületéről.

A találmány magában foglalja továbbá azok plakkok eltávolítására szolgáló készítményekben, például a szájvizekben történő felhasználását is. A fogak felületén kialakuló plakkok főként poliszacharidokból állnak. Azok a fogak felületéhez tapadnak és a mikroorganizmusok jelen vannak a szájban. A találmány szerinti εηόο-1,3(4)-βglukanázok ebben az összefüggésben egyéb glukanázokkal, így például mutanázzal és dextranázzal kombinálva ugyancsak alkalmazhatók.

Például a kontaktlencsék esetében a felületen képződő biofílmek is eltávolíthatók a glukanázokat, ideértve a találmány szerinti endo-l,3(4)-P-glukanázt is, tartalmazó készítmények segítségével.

Továbbá a burkolatokon megjelenő penészek eltávolítására is felhasználhatók a találmány szerinti endo-l,3(4)-P-glukanázt tartalmazó készítmények.

A találmány kiterjed a találmány szerinti endo-l,3(4)-P-glukanáz gombaellenes szerként történő alkalmazására is.

A textíliákból a felesleges színezőanyag eltávolításával összefüggésben a találmány szerinti endo-l,3(4)-p-glukanáz ugyancsak előnyösen alkalmazható.

A találmány további részletességgel az alábbi kiviteli példák segítségével kerül ismertetésre, ezek a példák semmilyen esetben sem jelentik a szabadalmi igénypontokban megfogalmazott oltalmi kör korlátozását.

Felhasznált anyagok és eljárások

-20Donor szervezet: Kukorica darát tartalmazó fermentációs közegben a megfelelő levegőztetést keveréssel biztosítva szaporított Trichoderma harzianum-bó\ (CBS 243.71) mRNS-t izoláltunk. 3-5 napi növekedés után a micéliumot (a gomba tenyésztésiét) összegyűjtöttük, folyékony nitrogénben azonnal lefagyasztottuk és -80 °C-os hőmérsékleten tároltuk.

Élesztő törzsek: yNG231 (ΜΑΤ a, leu2, ura 3-52, his 4-539, pep4-delta 1, cir+) vagy JG169 (ΜΑΤ a, ura 3-52; leu 2-3, 112; his 3-D200; pép 4-1137; prcl::HIS3; prbl:: LEU2; cir+) számú Saccharomyces cerevisiae törzseket használtunk.

Letétbe helyezett szervezet: A SEQ ID No 6 szám és a SEC ID No 5 szám alatt bemutatott két rész DNS szekvenciát tartalmazó DNS szekvenciával transzformált NN049006 számú Saccharomyces cerevisiae, amelyeket pYES 2.0 expressziós plazmid tartalmaz. A transzformált DNS szekvencia a SEC ID No 3 szám alatt bemutatott szekvenciával homológ.

A SEQ ID Nos. 5 és 6 szám alatt bemutatott DNS szekvencia elválasztása A SEQ

ID No 5 és 6 szám alatt bemutatott Acremonium sp. -bői származó cDNS szekvenciát tartalmazó pYES 2.0 élesztő expressziós vektor a letétbe helyezett NN049006 számú Saccharomyces cerevisiae-böi a technika állásából ismert eljárásokkal a cDNS plazmid extrakciójával izolálható.

A letétbe helyezett mikroorganizmus SC + 2% galaktózt tartalmazó agar lemezeken tenyészthető az alábbiakban ismertetésre kerülő módon 30 °C-os inkubációs hőmérsékleten 3-5 napig.

Plazmidok: A kereskedelemben beszerezhető pYES 2.0 plazmidból (Invitrogen) állítottuk elő az élesztő promotort tartalmazó pYHD17 expressziós plazmidot. A plazmidot és annak szerkezetét a WO 93/11249 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés ismerteti részletesen, amely bejelentés a jelen találmányhoz tartozó technika állásának részét képezi. A pEID414 Aspergillus expressziós vektor a • · · · • ·

-21 p775 plazmidból (lásd. EP 238 023 lajstromszámú európai szabadalom) származik. A pHD414 felépítése a WO 94/14952 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben található meg részletesen.

pYES 2.0 (Invitrogen)

A teljes RNS extrakciója: A teljes RNS-t a guanidium-tiocianáttal történő extrakcióval és az azt követő 5.7 mól CsCl párnán keresztüli ultracentrifugálással állítottuk elő, lényegében úgy, ahogyan azt Chirgwin és mtársai által 1979-ben leírásra került és a WO 94/14952 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben megtalálható.

A poli(A)⁺RNS elválasztása: A poli(A)⁺RNS-eket a WO 93/11249 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírtak szerint oligo(dT)-cellulóz affínitású kromatográfia alkalmazásával választottuk el.

A cDNS szintézise és módosítása: A kettős szálú cDNS-t 5 pg poli(A)⁺ RNS-ból kiindulva RN-áz H eljárással (lásd. Gubler & Hoffman 1983, Sambrook és mtársai, 1989.) hajtű módosítás alkalmazásával szintetizáltuk. A kettős szálú cDNS szintézisét oly módon hajtottuk végre, ahogyan azt korábban a WO 95/12044 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben közzétették, azzal az eltéréssel, hogy az első szál szintézis reakcióelegyéhez 25 ng random hexanukleotid primereket (Gibco BRL, USA) adtunk. Miután az elegyet Mung bean (bab) nukleázzal (Bethesda Research Laboratories) kezeltük, a ds cDNS-(végé)t T4 DNS polimerázzal (Invitrogen) tompa véggé alakítottuk és a cDNS-t nem palindróm BstX I adapterekhez (Invitrogen) kötöttük az előállítási utasításoknak megfelelően.

A c-DNS klóntárak szerkesztése: Az előkészített ds cDNS-t centrifugálással nyertük vissza, 70 %-os etil alkohollal mostuk és 25 ml desztillált vízben visszaoldottuk. Mielőtt a nagyléptékű klóntár ligáláshoz fogtunk négy teszt ligálást hajtottunk végre (úgy ahogyan a fentiekben), minden esetben 1 μΐ ds cDNS-t (1-3. kémcsövek), 2

-22egység Τ4 ligázt (Invitrogen) és 50 ng (1. kémcső), 100 ng (2. kémcső) valamint 200 ng (3 - 4. kémcsövek) Bst XI hasított élesztő expressziós vektort tartalmazó 10 pl ligációs pufferben. A ligáló reakciókat 16 °C-os inkubáció mellett 12 óra alatt, majd a hőmérsékletet 5 percre 70 °C-ra emelve végeztük, valamint minden ligálás 1 pl-ét elektroporáltunk (200 Ω, 2.5 kV, 25 pF) 40 pl kompetens E. coli MCI061 sejtekkel (OD600 = 0.9 1 liter LB-táptalajban, kétszer hideg desztillált vízzel, egyszer 10 ml 10 %-os glicerol oldattal mostuk, 2 ml 10 %-os glicerol oldatban ismételten szuszpendáltatva). Minden egyes transzformációs elegyhez 1 ml SOC -ot adtunk, majd a sejteket 37 °C-on 1 órán keresztül szaporítottuk, abból 50 pl-t LB + ampicillin lemezekre helyeztünk (100 pl/ml) és 37 °C-on 12 órán keresztül szaporítottunk.

Az optimális körülmények alkalmazásával a nagyléptékű ligálást 40 pl 9 egység T4 ligázt tartalmazó ligációs oldat alkalmazásával végeztük el, a reakciőelegyet pedig 16 °C-os hőmérsékleten 12 órán keresztül inkubáltuk. A ligációs reakciót az elegyet 5 percig 70 °C-on tartva állítottuk le, etanollal -20°C-os hőmérsékleten 12 órán keresztül kicsapattuk, eentrifugálással kinyertük és 10 pl desztillált vízben újra szuszpendáltuk. Egy pl-es aliquot-okat transzformáltunk elektrokompetens E. coli 1061 sejtekbe a fentiekkel azonos elektroporációs körülmények között, majd a transzformált sejteket megtitráltuk és a klóntárat LB+ ampicillin lemezekre szélesztettük 5000-7000 c. f. u./lemez [(colony forming unit)/plate] mennyiségben. Valamennyi lemezhez 3 ml táptalajt adtunk. A baktériumokat lekapartuk, 1 ml glicerol oldatot adtunk hozzá és készletként (pool) -80 °C-on tároltuk. A maradék 2 ml-t DNS izolálásra használtuk fel. Amennyiben a DNS mennyisége nem elegendő, hogy a kívánt számú élesztő transzformánsokhoz jussunk nagy mennyiségű DNS-t preparáltunk 500 ml 50 pl -80 °C-on tárolt baktériummal beoltott és egy éjszakán keresztül szaporított kultúrából (TB).

Az élesztő klóntár készítése: Annak biztosítása érdekében, hogy valamennyi baktérium kiónt megvizsgáljunk az élesztőben, az élesztő transzformátumok számát • ·

-23 határértékként 5-szőr nagyobbra kell választanunk, mint az eredeti készletben található bakteriális kiónok száma volt.

Az egyedi készletekből származó tisztított plazmid DNS egy μΙ-es aliquots mennyiségeit (100 ng/μΐ konc.) elektropolártuk (200 Ω, 2.5 kV, 25 pF) 40 μΐ kompetens S. cerevisiae JG 169 sejtekkel (OD600 = 1.5 500 ml YDP-ben, kétszer hideg desztillált vízzel, egyszer hideg 1 mólos szorbitol oldattal mostuk, 0.5 ml 1 mólos szorbitol oldatban ismételten szuszpendálva, lásd. Becker & Guarante, 1991). 1 ml 1 mólos szorbitol oldat hozzáadása után 80 μΐ aliquot mennyiségeket SC + glukóz uracil mentes agar lemezekre szélesztettünk 250-500 c.f.u./lemez számban, majd azokat 30 °C-os hőmérsékleten 3-5 napon keresztül inkubáltuk.

A pozitív kolóniák azonosítása: A szaporítás 3-5. napja elteltével az agar lemezeket átmásoltuk néhány SC + galaktóz uracil mentes agar lemez készletekre. Az egyik 0.1 AZCL-kurdlant vagy AZCL-3-glukánt tartalmazó lemez sorozatot ezt követően 3-5 napon keresztül 30 °C-on inkubáltunk az endo-l,3(4)-3-glukanáz aktivitás kimutatása céljából. A pozitív telepeket a kolóniákat körülvevő kék gyűrűk révén azonosítottuk.

Az enzim-pozitív kolóniákból származó sejteket az egytelep izolálása céljából agar lemezre szélesztettük, és egyetlen enzim-termelő kolóniát választottunk ki minden egyes endo-l,3(4)-P-glukanáz-termelö kolónia azonosításához.

A poztitív kiónok jellemzése: A pozitív kiónokat egytelepekként kaptuk meg, a cDNS inszerteket közvetlenül az élesztő kolóniákból szaporítottuk fel biotinilált polilinkerprimerek alkalmazásával, mágnesen ágyon tisztítottuk (Dynabead M-280, Dynal). A kiónokat egyenként jellemeztük minden cDNS klón 5'-végét szekvenálva lánc-terminációs módszer alkalmazásával (lásd Sanger és munkatársai) és a Szekvenáz rendszer felhasználásával (United States Biochemical).

A cDNS gén izolálása az Aspergillusban történő expresszió céljára: Egy vagy több endo-l,3(4)-p-glukanáz-termelő kolóniákat 50 ml-es üveg kémcsőben 20 ml YPD • · « « • *

-24táptalajban beoltottunk. A kémcsövet 2 napon keresztül 30 °C-on rázattuk. A sejteket 10 perces 300 fordulat/perc sebességgel centrifugálva összegyűjtöttük.

A sejteket 1 ml 0.9 mólos szorbitolból és 0.1 mól EDTA-ból álló 7.5 pH-jú elegyben ismételten szuszpendáltuk. A pelletet Eppendorf csőbe töltöttük és 30 másodpercig teljes sebességgel centrifugáltuk. A sejteket 0.4 ml 0.9 mól szorbitolból és 0.1 mól EDTA-ból, 14 mmól β-merkapto-etanolból álló elegyben ismételten szuszpendáltuk. 100 pl 2 mg/ml koncentrációjú Zymolase-t adtunk hozzá, majd a szuszpenziót 37 “’Con 30 percig inkubáltuk és 30 másodpercig centrifugáltuk. A pelletet (spheroplasztokat) 0.4 ml TE oldatban ismételten szuszpendáltuk. 90 pl (1.5 ml 0.5 mólos 8.0-as pH-jú EDTA-oldatból, 0.6 ml 2 mólos 8.0-as pH-jú Tris-Cl-ból, valamint

0.6 ml 10 tömeg %-os SDS oldatból összeállított) oldószer elegyet adtunk hozzá és a kapott szuszpenziót 65 °C-on 30 percig inkubáltuk. 80 pl 5 mólos KOAc oldatot adtunk hozzá, majd a szuszpenziót jeges fürdőben legalább 60 percig inkubáltuk és 15 percig teljes sebességgel centrifugáltuk. A felülúszó részt elválasztottuk és egy tiszta kémcsőbe tettük át és alapos, de gyengéd keverés közben etilalkoholt töltöttünk hozzá (szobahőmérsékleten) és 30 másodpercig centrifugáltuk. A kapott pelletet 70 tömeg %os hideg etanol oldattal mostuk, 30 másodpercig centrifugáltuk és szobahőmérsékleten megszárítottuk. A csapadékot 50 pl TE oldatban ismételten szuszpendáltuk és 15 percig centrifugáltuk. A felülúszó részeket elválasztottuk és egy tiszta kémcsőbe helyeztük át. 2.5 pl 10 mg/ml koncentrációjú RNáz oldatot adtunk hozzá, majd a kapott elegyet 37 °C-on 30 percig inkubáltuk és lassú keverés közben 500 pl izopropanolt adtunk hozzá. A reakcióelegyet 30 másodpercig centrifugáltuk, és a felülúszó részeket eltávolítottuk. A pelletet 96 tömeg %-os hideg etilalkohollal leöblítettük, majd szobahőmérsékleten megszárítottuk. A DNS-t 50 pl vízben oldottuk a körülbelüli 100 pg/ ml végső koncentráció elérése céljából.

A DNS-t standard eljárásokkal az E. coli-ba transzformáltuk. Az E. coli-ból ugyancsak standard eljárások alkalmazásával plazmid DNS-t választottunk el és restrikciós enzim analízissel elemeztük. A cDNS inszertet a megfelelő restrikciós

-25 enzimek alkalmazásával vágtuk ki és valamely Aspergillus expessziós vektorba ligáltuk.

Az Aspergillus oryazae vagy Aspergillus niger transzformációja (általános eljárás): 100 ml YPD-t (Sherman és mtársai, Methods in Yeast Genetics, Cold Sping Harbor Laboratory, 1981) az A. oryazae vagy az A. niger spóráival oltottunk be és rázással 37 °C-on körülbelül 2 napig inkubáltuk. A micéliumot (a gomba tenyészteste) ruhán keresztüli szűréssel kinyertük, majd 200 ml 0.6 mólos magnézium-szulfát oldattal mostuk. A micéliumot 15 ml 1.2 mólos magnézium-szulfát oldatból és 10 mmólos NaH₂PO₄ oldatból összeállított 5.8-es pH-jú elegyben szuszpendáltuk. A szuszpenziót jégen lehütöttük, majd 1 ml 120 mg Novozym 234-et, batch 1687-et tartalmazó puffért adtunk hozzá. 5 perc elteltével 1 ml 12 mg/ml koncentrációjú BSA oldatot adtunk hozzá (Sigma H25 típus), majd 1.5 - 2.5 órán keresztül 37 °C-os hőmérsékleten gyenge mozgatás közepette inkubáltuk mindaddig, amíg a mikroszkóp alatt megvizsgált mintában a protoplasztok nagy számban nem váltak láthatóvá.

A szuszpenziót ruhán keresztül leszűrtük, a szűrletet egy steril kémcsőbe helyeztük, majd 5 ml 0.6 mólos szorbitol, 100 mmól Tris-HCl, pH=7.0 oldatot felülrétegeztük. 15 percig 100 g-vel centrifugáltuk, majd a protoplasztokat a MgSO₄ párna tetejéről összegyűjtöttük. 2 térfogatrész STC-t (1.2 mól szorbitol, 10 mmol Tris-HCl, pH= 7.5. 10 mmol CaCl₂) adtunk a protoplaszt szuszpenzióhoz és az elegyet 1000 g-vel 5 percig centrifugáltuk. A protoplaszt pelletet 3 ml STC-ben ismételten szuszpendáltuk, majd újra pelletizáltuk. Végül a protoplasztokat 0.2 - 1 ml STC-ben szuszpendáltuk.

100 pl protoplaszt szuszpenziót 5 - 25 pg megfelelő 10 pl STC-ben oldott DNS-el elegyítettünk. A protoplasztokat p3SR2-vel (A. nidulans amdS gén hordozó plazmid) elegyítettük. Az elegyet szobahőmérsékleten 25 percig állni hagytuk. 0.2 ml 60 %-os PEG 4000 (BDH 29576). 10 mmol CaCl₂ és 10 mmol Tris-HCl, pH= 7.5 adtunk hozzá és (kétszer) óvatosan megkevertük, majd végül 0.85 ml ugyanolyan oldatot adtunk hozzá és óvatosan összekevertük. Az elegyet szobahőmérsékleten 25 pereg állni hagytuk, 2500 g-vel 15 percig centrifugáltuk és a pelletet 2 ml 1.2 mólos szorbitolban

-26ismételten szuszpendáltuk. Még egy ülepítést követően a protoplasztokat a megfelelő lemezekre szélesztettük. A protoplasztokat (Cove Biochem. Biophys. Acta 113 (1966) 51-56) a háttér növekedés megakadályozása céljából, 1.0 mmol szukrózt, pH=7.0, nitrogén forrásként 10 mmol acetamidot és 20 mmol CsCl-t tartalmazó minimál lemezekre szélesztettük. 4-7 napon keresztül 37 °C-on végzett inkubációt követően a spórákat felszedtük és egytelepre szélesztettük. Ezt az eljárást megismételtük és az egytelepek spóráit a második újra izolálás transzformánsként tároltuk.

Az A. oryzae transzformánsok vizsgálata

Valamennyi transzformánst 10 ml YPM-ben beoltottunk és szaporítottunk. 2 -5 napon keresztül 37 °C-on történt inkubációt követően a 10 ml felülúszó részt eltávolitottuk. Az endo-l,3(4)-3~glukanáz aktivitást AZCL-kurdlánnal vagy AZCL-3-glukánnal határoztuk meg.

Hibridizációs körülmények (a találmány szerinti DNS szerkezet i) tulajdonságának értékelésére szolgál):

Az oligonukleotid próba és valamely analóg DNS szekvencia közötti hibridizáció meghatározására alkalmas körülmény magában foglalja a DNS szekvenciákat tartalmazó filter előzetes 5xSSC-vel való nedvesítését a hibridizációhoz, és 1 órán keresztül körülbelül 50 °C-on az 5xSSC oldatban való előhibridizációt, 5xDenhardt's oldat, 50 mmol nátrium-foszfát, pH 6.8, valamint 50 pg denaturált szonikált borjú csecsemőmirigy DNS, amelyet ugyanabban az oldatban hibridizáció követ kiegészítve 50 pCi 32-P-dCTP-vel jelölt próbával. 18 órán keresztül körülbelül 50 °C-os hőmérsékleten végzett hibridizálást háromszor 2xSSC, 0.2 % SDS oldatban való mosás követ 50 °C-on 30 percig.

A hibridizációban alkalmazott megfelelő oligonukleotid próba bármely a SEQ ID No 3 szám alatti DNS szekvencia alapján, illetve legalább a SEQ ID No. 1 vagy 2 szám alatti vagy a SEQ ID No. 5 vagy 6 alatti DNS szekvencia részek egyike alapján előállítható.

-27Immunológiai kereszt-reaktivitás: Az immunológiai kereszt-reaktivitás meghatározására használt antitesteket tisztított endo-l,3(4)-p-glukanáz alkalmazásával állíthatjuk elő. Még közelebbről, a találmány szerinti endo-l,3(4)-3-glukanázzal szembeni antiszérum nyulak (vagy egyéb rágcsálók) immunizálásával állítható elő oly módon, ahogyan az N. Axelsen és mtársai a Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publikations, 1973, Chapter 23. irodalmi helyen, vagy N. Johnstone és R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (még közelebbről 27-31. oldal) irodalmi helyen ismertetésre kerül. A tisztított immunoglobulinok például só kicsapással (NH₄)₂SO₄), kaphatók az antiszérumból, amelyet dialízis és ioncserés kromatográfia, például DEAE-Sephadex, követ. A proteinek immunokémiai jellemzése Outcherliny-féle kettős diffúziós analízissel (lásd.: O. Ouchterlony Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, pp. 655-706), kereszt immunoelektroforézissel (N. Axelsen és mtársai, supra (ld.fenntebb) Chapters 3 and 4), illetve gyors (rockét) immunoelektroforézissel (N. Axelsen és mtársai, supra Chapter 2) történhet.

Coomassie festés: Az üveglemezekről a gélt óvatosan eltávolítottuk és lassan forgórázó asztalon inkubáltuk körülbelül 100 ml alábbiakban felsorolt oldatokban:

1. ) 30 perc 40 v/v % etanol; 5 v/v % ecetsav

2. ) 30 perc 40 v/v % etanol; 5 v/v % ecetsav + 0.1 % Coomassie brillantkék R250

3. ) Festés eltávolítás 30 perc alatt 40 v/v % etanolban; 5 v/v % ecetsavban addig amíg a háttér színtelenné válik

4. ) Végül a gél inkubációja a következő tartósító oldatban: 10 v/v % etanol; 5 v/v % ecetsav; 5% v/v glicerin és levegőn szárítjuk a két celofán membrán lap között.

Ezüst festés: Az üveglemezekről a gélt óvatosan eltávolítottuk és lassan forgó-rázó asztalon inkubáltuk körülbelül 100 ml alábbiakban felsorolt oldatokban:

1. ) 30 perc 40 v/v % etanol; 5 v/v % ecetsav

2. ) 20 perc 10 v/v % etanol; 5 v/v % ecetsav

3. ) 20 perc 0.0057 w/v % APS (0.25 mmol)

-284. ) 60 perc 0.1 w/v % AgNO₃

5. ) Az előhíváshoz a gélt 30 - 60 másodperc közötti időtartamra az előhívóba merítjük: 0.015 % formaldehid; 2 % w/v Na₂CO3. A gélt ezután inkubáljuk egy második menetben az előhívóban mindaddig amíg kielégítő proteinfestést nem érünk el (rendszerint 5-15 perc). Végül a gélt inkubáljuk a következő tartósító oldatban: 10 v/v % etanol; 5 v/v % ecetsav; 5% v/v glicerin és levegőn szárítjuk két celofán membrán lap között.

Táptalajok:

YDP: 10 gramm élesztő extraktum, 20 gramm peptone, 900 ml víz, Autoklávban kezelve, 100 ml 20 %-os (steril szűrt) glukózt adva hozzá.

YPM: 10 gramm élesztő extraktum, 20 gramm peptone, 900 ml víz, Autoklávban kezelve, 100 ml 20 %-os (steril szűrt) maltodextrint adva hozzá.

x Bazal só: 75 gramm élesztő nitrogén bázis, 113 gramm borostyánkősav, 68 gramm NaOH, 1000 ml víz, sterilen szűrve.

SC-URA: 100 ml 10 x Basal só, 28 ml 20 %-os kazamidosavak, vitaminoktól mentes, 10 ml 1 %-os tryptophan, 900 ml víz, autoklávban kezelve, 3.6 ml 5 %-os threonin és 100 ml 20 %-os glukóz vagy 20 %-os galaktózt adva hozzá.

SC-URA agar: SC-URA, 20 g/1 agar hozzáadásával

AZCL-kurdlan (Megazyme, Ausztrália)

AZCL-3-glukán (Megazyme, Ausztrália)

Qiagen tisztított plazmid DNS (Qiagen, USA) • · · ·

-29Sequenase®kit (U.S. Biochemical corp., USA)

Random hexanokleotid primérek (Gibco BRL, USA)

Kiviteli példák

1. PÉLDA

A T. harzianum-bó\ származó körülbelül 106 egyedi kiónból álló, 150 készletbe gyűjtött E. coli klóntárat állítottunk össze.

A DNS-t 20 klóntárból származó egyedi kiónból választottuk el, majd cDNS inszert analízisnek vetettük alá. Az inszerciós frekvenciát körülbelül 90 %-osnak találtuk. Néhány készletből származó DNS-t az élesztőbe transzformáltunk, majd egyenként 200 - 500 élesztő kolóniát tartalmazó 50 - 100 lemezeket kaptunk minden készletből.

A pozitív kolóniákat azonosítottuk és agaron elválasztottuk. A cDNS inszerteket közvetlenül az élesztő kolóniából szaporítottuk fel, majd a fenti 'Anyagok és eljárások' részben ismertetett módon határoztuk meg jellemzőiket. Az endo-l,3(4)-3-glukanázt kódoló cDNS szekvenciát a SEC ID No. 3 szám alatt mutatjuk be.

2. PÉLDA

Élesztőkolóniából teljes DNS-t választottunk el és a fentiekben ismertetett eljárással plazmid DNS-t szabadítottunk fel E. coli transzformációval. Abból a célból, hogy endo-1.3(4)-P-glukanázt expresszáltassunk Aspergillusban, a DNS szekvenciát HindlII/Xbal-el tártuk fel, majd gélen méret szerint frakcionáltuk és az endo-l,3(4)-pglukanáz génnek megfelelő fragmentumot tisztítottuk. A gént ezt követően HindlII/Xbal-el feltárt pH414-el ligáltuk.

-30A DNS Ε. coli-ban történő kiegészítését követően a pA2CU3 plazmidot a fentiekben ismertetett módon Aspergillus oryazae-ba transzformáltuk.

Az A. oryazae transzformánsok vizsgálata

Minden egyes transzformánst a fentiekben ismertetett módon endo-1,3 (4)-βglukanáz aktivitás szempontjából elemeztünk. A transzformátumok közül néhány a háttérnél lényegesen nagyobb endo-l,3(4)^-glukanáz aktivitással rendelkezett. Ez bizonyítja az Aspergillus oryzae-ban végrehajtott hatékony endo-l,3(4)-3-glukanáz expressziót. A legmagasabb endo-l,3(4)^-glukanáz aktivitással rendelkező transzformánst kiválasztottuk és 500 ml-es rázóedényben YPM táptalajjal inkubáltuk. A jó levegőztetés biztosítása érdekében elegendő mechanikai mozgatással végzett 3-5 napos fermentációt követően a kultúrát tartalmazó tenyészetet 10 percig 2000 g-vel centrifugáltuk és a felülúszó részeket kinyertük.

3. PÉLDA (Az endo-l,3(4)-B-glukanáz tisztítása)

Az endo-l,3(4)-(l-glukanázt expresszáló Aspergillus oryazae vagy A. niger fermentációjából kapott kultúra felülúszó részét centrifugáltuk és 0.2 μιτι-es szűrőn keresztül szűrtük a micélium eltávolítása céljából.

A leszűrt felülúszó rész 35 -50 ml-ét (5-50 mg rekombináns enzim) 10 kDa membránnal ellátott Amicon ultracentrifuga alkalmazásával 10-szeres koncentráció eléréséig ultracentrifugáltuk.

Ezt a koncentrátumot 25 mmólos Tris pH 8.0-ás oldatban 100-szorosára hígítottuk ugyanabban a készülékben két egymást követő ultracentrifugálási menetben. Ezt az ultracentrifugált mintát 1.5 ml/perc sebességgel 25 mmólos Tris pH 8.0-val

-31 egyensúlyba hozott Pharmacia XK16/10 Fást Flow Q Sepharose anioncserélőbe töltöttük. Miután a mintát felvittük a kolonnát két kolonna térfogatnyi mennyiségű 25 mmólos Tris pH 8.0-al mostuk, majd a megkötött proteineket 0 és 5 mól közötti NaCI a 25 mmólos Tris pH 8.0-ban oldva lineárisan növekvő NaCI gradienssel eluáltuk.

ml-es frakciókat különítettünk el és a fentiekben ismertetett módon vizsgáltuk azok endo-l,3(4)-3-glukanáz aktivitását. Az endo-l,3(4)-p-glukanáz körülbelül 0.1 mólos NaCI oldat alkalmazásánál eluálódott. A kolonnáról eluált εηόο-1,3(4)-βglukanáz nem volt tiszta.

Ily módon az endo-l,3(4)-3-glukanázt tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, majd 10 kDa membránnal ellátott Amicon ultracentrifugában ultracentrifugálva 10szeres koncentráció eléréséig betöményítettük. Ezt a koncentrátumot 10 mmólos nátrium-foszfát pH 6.8-as oldatban 100-szorosára hígítottuk ugyanabban a készülékben két egymást követő ultracentrifügálási menetben. Ezt az ultracentrifugáit mintát 1 ml/perc sebességgel 10 mmólos nátrium-foszfát pH 6.8-al egyensúlyba hozott Pharmacia XK10/20 BioGel HTP-vel (BioRad, USA) tötött kolonnába töltöttük. Miután a mintát felvittük, a kolonnát két kolonna térfogatnyi mennyiségű 10 mmólos nátrium-foszfát pH 6.8-al mostuk, majd a megkötött proteineket 0.01 és 0.5 mól között lineárisan növekvő nátrium-foszfát koncentráció gradienssel eluáltuk. 5 ml-es frakciókat különítettünk el és a fentiekben ismertetett módon vizsgáltuk azok endol,3(4)-P-glukanáz aktivitását. Ezek között a körülmények között a kolonna endol,3(4)-3-glukanázt nem kötött meg, az endo-l,3(4)-3-glukanázt tartalmazó frakciók ugyanis a Filtron Macrosep 10 kDa készülék utolsó 3 ml-es térfogatában koncentrálódtak. Ezt a mintát 0.25 mólos ammónium-acetát pH 5.5-el egyensúlyba hozott Pharmacia Superdex G75 kolonnára töltöttük 1 ml/perc áramlási sebességgel. 5 ml-es frakciókat különítettünk el és vizsgáltuk azok endo-l,3(4)-3-glukanáz aktivitását. A kolonnáról eluált endo-l,3(4)-3-glukanáz több mint 50 %-os tisztaságú volt, ahogyan azt SDS PAGE - val megállapítottuk, ezt használtuk a soron következő jellemzéshez.

-324. PÉLDA

Mw meghatározás SDS-PAGE elektroforézissel

Az SDS-PAGE elektroforézist Mini Leak 4 elektroforézis egységben (Kem-EnTec, Koppenhága) a Laemmli-féle eljárás (Laemmli 1970; Christgau, Schierbeck és mtársai. 1991) módosított verziójaként hajtottuk végre. Röviden, az elválasztáshoz használt gélt 12 %-os akrilamiddal; 0.2 %-os BIS akrilamiddal; 0.1 % SDS-el; 0.375 mól Tris pH 8.8-al; 0.04 % APS-el (ammónium-perszulfát) & 0.04 % TEMED-el alakítottuk ki. 6 - 15 órás polimerizációs reakciót követően kialakult gélt 4.5 w/w % akrilamiddal; 0.075 % BIS-akrilamiddal; 0.1 % SDS-el; 66.5 mmol Tris pH 6.8-al; 0.4 w/w % APS -el (ammónium-perszulfát) & 0.4 % TEMED-el kezeltük. Az elektród kamrákat a következő puffer oldattal töltöttük fel: 25 mmol Tris-bázis; 0.192 mól glicerin & 0.05 % SDS, minek utána a mintákat, a mintát tartalmazó puffért betöltöttük és a gélt 2-4 mA/géllel egy éjszakán át futtattuk és 10 -30 mA/géllel gyorsfuttatást végeztünk. Ezután a gélt eltávolítottuk és coomassie vagy ezüst festőanyaggal itattuk át, ahogyan azt a fenti Anyagok és eljárások részben már ismertettük.

Az így mért látszólagos molekulatömeg (Mw) körülbelül 31 kDa.

5. PÉLDA pl meghatározás izoelektromos fókuszálással

Az izoelektromos fókuszálást Ampholine PAG lemezeken pH 3.5 - 9.5 között (Pharmacia, Upsala) Multiphor elektroforézis egységgel hajtottuk végre a gyártó használati utasításának megfelelően. Az elektroforézist követően vagy coomassie vagy ezüst festőanyaggal itattuk át, ahogyan azt a fentiekben már ismertettük, azzal az eltéréssel, hogy a festést megelőzően a gélt 20 percig 20 %-os TCA-ban (Triklórecetsav) inkubáltuk.

Az így mért látszólagos pl körülbelül 5.1.

-33 6. PÉLDA pH optimum

A 2.5 és 8.0 közötti pH értékű puffereket 0.1 mólos trinátrium-foszfát és 0.1 mólos citromsav oldatok elegyítésével állítjuk elő. Az endo-l,3(4)-P-glukanázt hígítottuk annak biztosítása érdekében, hogy a minta a lineáris elemzési tartományba essen. Szubsztrátumként 0.4 %-os AZCL-P-glukán (MegaZyme) szuszpenziót és a citrát/foszfát puffer 1 : 1 térfogatarányú elegyét alkalmaztuk, melynek végső szubsztrátum koncentrációja 0.2 % AZCL-P-glukán. Eppendorf® 1.5 ml polipropilén csőben 1 ml szubsztrátumhoz 10 μΐ enzim oldatot adtunk, majd az elegyet Eppendorf®ban Thermomixer-ek által szabályozott hőmérsékleten 15 percig inkubáltuk mielőtt az enzimeket egy külön Thermomixer-ben 20 perces 95 °C-os hőkezeléssel inaktiváltuk volna. A kémcsöveket centrifugáltuk és mindegyik felülúszó réteg 200 μΐ-ét egy 96 üreges mikrotitráló lemez egy-egy üregébe vittük át, majd az OD értéket 620 nm-nél ELISA elemzőben (Labsystems Multiskan® MCC/340) határoztuk meg. Az optimális pH érték meghatározásához 30 °C-on inkubációt végeztünk. Minden egyes pH érték esetében három kémcsőhöz adtunk enzimet és inkubáltuk mielőtt a hőfok emelésével inaktiváltuk azokat, ellenben egy kémcsőbe (háttér) enzimet töltöttünk és hőfokemeléssel azonnal inaktiváltuk. A három inkubált mintából középértéket számítottunk, a háttér értéket pedig kivontuk. Az optimális pH-nál számított értéket 100 %-ként definiáltuk.

Az endo-l,3(4)-3-glukanáz aktivitást 30 °C-os hőmérsékleten a pH függvényében az 1. sz. ábra mutatja be. Ezen látható, hogy az endo-l,3(4)-P-glukanáz nem mutat 60 %-osnál nagyobb aktivitást 4.0 és 6.5 közötti pH érték mellett, az aktivitás pH 4.5 és 5.5 értékek között optimális.

7. PÉLDA

-34Hőmérsékleti optimum

Az előzőeknek megfelelően a pH 5.0-ás citrát/foszfát puffer esetében végrehajtott inkubáció optimális hőmérsékletét kerestük. Ez a hőmérséklet 30 °C és 80 °C közötti hőfoktartományba kell, hogy essen. Minden hőmérsékleten három minta inkubációját hajtottuk végre és átlagot számítottunk. Három háttér mintát készítettünk az enzimek azonnali hőkezeléses inaktiválásával, és az átlagukat kivontuk az inkubált minta értékekből. Az optimális hőmérsékleten mért aktivitást 100 %-ként definiáltuk.

Az endo-l,3(4)-P-glukanáz aktivitást 5.0-ás pH érték mellett a hőmérséklet függvényében a 2. sz. ábra mutatja be. Ezen látható, hogy az endo-l,3(4)-p-glukanáz 50 °C-os hőmérsékleten mutat optimális aktivitást.

8. PÉLDA

Kinetikai paraméterek

Km értékeket és specifikus aktivitást határoztunk meg 30 °C-os 15 perces inkubáció esetében 0.025 és 1.5 % közötti P-l,3-l,4-glukán (MegaZyme) koncentráció (S) tartományban pH 5.0-ás citrát/foszfát pufferben. A reakciósebességet (v) cukor képződés vagy csökkenés/perc-ben mértük. Az enzim inaktiválását követően mért csökkenő cukor koncentrációt oly módon határoztuk meg, hogy a mintákhoz mikrotitráló lemezeken 0.15 gramm para-hidroxi-benzoesav-hidrazidból (Sigma H9882), 0.50 gramm kálium-nátrium tartarátból (Merck 8087) és 2 tömeg %-os nátriumhidroxid oldatból álló PHBAH reagenst adtunk legfeljebb 10.0 ml mennyiségben. Standardként glukózt alkalmaztunk és a háttér eredményeket itt is kivontuk. Ezután az S/v hányadosokat vettük fel az S függvényében és lineáris regressziós analízist végeztünk. A meredekséget (=1/Vmax) és az ordináta tengely metszetet (Km/Vmax) használtuk fel a Km és a specifikus aktivitás (=Vmax/E) kiszámításához, ahol az E a

-35hozzáadott enzim mennyisége. A specifikus aktivitás U/mg enzimben mértük, ahol 1U = 1 μιηοΐ cukor csökkenés/perc.

Az endo-l,3(4)-p-glukanáz specifikus aktivitása 30 °C-os hőmérsékleten pH 5.0 mellett körülbelül 100 - 200 U/mg enzim volt és Km-re körülbelül 0.02-0.06 % β-1,31,4-glukán értéket kaptunk.

9. PÉLDA

A β-glukánok depolimerizációja

Gélszűréses kromatográfia céljára 1 %-os pustulan (Roth), laminarin (Sigma), kurdlan (MegaZyme), vagy β-1,3-1,4^Η&έη (MegaZyme) oldatok 1 ml -es aliqout mennyiségeit 10 μΐ 0.2 mg/ml koncentrációjú enzim oldattal együtt 30 °C-on 0, 1, 2, 4 és 24 órán keresztül inkubáltuk a hőkezeléses inaktiválást megelőzőn. A minta 25 μΙ-ét három TSK-kolonnára (TosoHaas) injektáltuk sorozatban (PW G4000, PW G3000, PW G2500), majd a szacharidokat 0.4 mólos acetát pufferrel pH 3.0 0.8 ml/perc sebességgel eluáltuk. Az elulálódó szacharidokat Shimdzu Rí detectorral mértük és az adatgyűjtést 15 percig folytattuk. Az adatokat Dionex softverrel dolgoztuk fel. Molekulatömeg standardokként (Serva-tól származó) dextránokat használtunk.

Az endo-l,3(4)^-glukanáz aktivitásának megfelelően az enzim gyorsan bontotta a laminarint (lásd 3. ábra), a β-1,3^Εύ<ύηΐ (kurdlant) (4. ábra) és a zabból származó β-glukánt (p-l,3-l,4-glukán) (5. ábra), mindamellett a pustulánt nem bontotta.

10. PÉLDA

A H-glukán bontása endo-l,3(4)-Q-glukanázzal ·· · ·

-36^LlC NMR spektrumot vettünk fel 75.47 MHz frekvenciával működő Brucker AC300 spektrofotométerrel. A spektrumokat 330 K-en vettük fel, az adatokat pedig egy éjszakán keresztül rögzítettük.

mg P-l,3-l,4-glukánt oldottunk 1000 μΐ D₂O-ban (99.95 %-os D, Merck), majd felvettük az oldat ¹³C NMR spektrumát (lásd 6. ábra, alsó vonal). Εηόο-1,3(4)-βglukanáz oldatot (10 μΐ, 0-070 mg protein/ml koncentrációjú) adtunk hozzá, majd miután az elegyet 5 órán keresztül szobahőmérsékleten állni hagytuk és felvettük annak 13

C NMR spektrumát (lásd 6. ábra, középső vonal). A második rész enzim oldatot (10 μΐ) is hozzáadtuk és hagytuk a reakciót 3 napig szobahőmérsékleten zajlani. Ezt követően felvettük a reakcióelegy ¹³C NMR spektrumát (lásd 6. ábra, felső vonal).

A β-glukán esetében felvett spektrum lényegében azonos egy már korábban publikálttal (Bock és mtársai, (1991), Carbohidráte Research, 211, 219-233). Az endol,3(4)^-glukanázzal együtt végzett 5 órás inkubációt követően felvett spektrumból világosan kiderül, hogy a szubsztrátumnak csak igen kis mértékű bomlása zajlott le. Mindamellett a 3 nap elteltével a 96.7 ppm (C-β 1) és 93.0 ppm (C-ctl) paraméterekkel rezonáló anomer szénatomoknak megfelelő jeleket rögzíthettünk. Továbbá a 3glukoszilált egységekben a C-3-nak tulajdonítható jel változatlan maradt, amely azt jelzi, hogy az enzim az 1,3-kötéseket nem hidrolizálta. Ezek az eredmények is alátámasztják, hogy a kapott enzim endo-l,3(4)^-glukanáz (E.C. 3.2.1.6.), amely 3βI, 3-glukán β-1,3-kötései mellett a kevert kötésű β-1,3-1,4^Ηΰύύκ± β-ΙΑ-^έβεΐί is hidrolizálja.

II. PÉLDA

Az Acremonium sp. cDNS klóntárának összeállítása és annak szűrése

Teljes RNS-t állítottunk elő fagyasztott, porított Acremonium sp. CBS 265.95 törzsből guanidinium-tiocianátos extrakcióval és az azt követő ultracentrifugálással, ez • · · · * · · • · · · · • · · · · ··· ··· · ·

-37utóbbi műveletet 5.7 mól CsCl párnán keresztül végeztük (Chirgwin és mtársai., (1979), Biochemistry, 18, 5294-5299). Poli(A)+RNS-t választottunk el oligo(dT)cellulóz kromatográfiás úton (Lásd Aviv és Leder, (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69, 1408-1412). Kettős szálú cDNS-t szintetizáltunk 5 pg poli(A)+RNSből, ahogyan Gubler és Hoffman, (1983), Gene, 25, 263-269; Sambrook és mtársai, (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbot Laboratory irodalmi helyeken az ismertetésre kerül azzal az eltéréssel, hogy 25 ng random hexanukleotid primereket (Gibco BRL, USA) használtunk fel az első szál szintézisben. Az 1.5 χ 10⁶ kiónt tartalmazó cDNS klóntárat állítottunk össze pYES 2.0 élesztő expressziós vektorban, ahogyan azt már az előzőkben is leírtuk (Lásd Kofod és mtársai. (1994), J. Bioi. Chem., 261, 8407-8413). A cDNS klóntár készletből származó plazmid DNS-t Y. cerevisiae W3124-ba transzformáltuk (lásd van den Hazel és mtársai., (1992), Eur. J. Biochem., 207, 277283) elektroporézissel (Becker és Guarente, (1991), Methods Enzimol., 194, 182-187), majd a transzformánsokat 2 % glukózt tartalmazó SC agarra helyeztük (Sherman, (1991), Methods Enzymol. 194, 3-21). 30 °C-os hőmérsékleten 3-4 napon keresztül inkubáltuk, a kolóniákat 2 %-os glukózt SC agar lemezekre másoltuk, majd 30 °C-on további 3 napon keresztül inkubáltuk. A transzformált S. cerevisiae enzim aktivitását AZCL-P-glukánon és AZCL-kurdlánon ellenőriztük. Az endo-l,3(4)-3-glukanáz pozitív kiónokat azonosítottuk.

A pozitív élesztő kolóniákból teljes DNS-t izoláltunk és ampicillin rezisztancia elérése céljából pYES 2.0 kiónokat tartalmazó inszertet szabadítottunk fel E. coli MC 1061 (Meissner és m.társai, (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 4174-4176) transzformációval.

Nukleotid szekvencia analízis

A cDNS inszert mindkét szálának nukleotid szekvenciáját Qiagen tisztított plazmid DNS, Sequenase®kit vagy szintetikus oligonukleotid primerek felhasználásával dideoxi láncvégződési eljárással (Sanger és m.társai, (1977), Proc.

-38Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463-5467) határoztuk meg. A szekvencia analízis adatokat a Devereux és mtársai, (1984), Nucleic Acids Rés., 12, 387-395. irodalmi hivatkozásban szereplő eljárással kaptuk. A két rész cDNS szekvenciát a SEC ID Nos. 5 és 6 számok alatt mutatjuk be.

12. PÉLDA

Élesztő sejt fal izolátum hidrolízisének vizsgálata

450 gramm Saccharomyces cerevisiae, sütőélesztőt 1350 gramm vízben szuszpendáltunk. A plazmolízist állandó keverés közben 50 °C-os hőmérsékleten 18 órán keresztül végeztük. 10 ml-es mintákat vettünk 0 óra, 0.5 óra, 1 óra, 17 óra, 17.5 óra, és 18 óra elteltével. A mintákat Heraeus-féle Labofuge centrifugával 3400 g-vel forgatva centrifugáltuk (ez 4500 fordulat/perc centrifuga fordulatszámnak felel meg) 5 percig. A reakció lefolyását a felülúszó rész ozmolalitásának méréseivel követtük 3W2 számú Advanced Wide-Range Osmometer (Advanced Instruments) felhasználásával. A centrifügátumok szárazanyag tartalmának mérésére DUR REFRACTOMETERElectronic (Schmidt Haensch) berendezést alkalmaztunk. A mérési eredményeket az 1. számú táblázatban foglaltuk össze

1. Táblázat

Sütőélesztő plazmolízisénél mért adatok

Idő (óra)	Ozmolalitás, mOSM/kg	°BRIX
0	115	0.6
0.5	165	0.8
1	196	0.9
17	350	4.5
17.5	354	4.6

···· +· • « · • ·» • · ·

-3918 356 4.6 óra elteltével az egész elegyet 30 percen keresztül 4500 fordulat/perc fordulatszámmal Sorvall RC-3G típusú hűtőcentrifuga készülékben centrifugáltuk.

1475.8 gramm felülúszó részt és 227.3 gramm szilárd fázist választottunk el. A szilárd anyagot 1475.8 gramm vízben szuszpendáltuk, majd 4500 fordulat/perc fordulatszámmal Sorvall RC-3G típusú hűtőcentrifuga készülékben ismételten 30 percen keresztül centrifugáltuk. Végül 266.1 gramm mosott sejtfal anyagot választottunk el.

A szárazanyag tartalom meghatározást 105 °C-os hőmérsékleten egy éjszakán keresztül végeztük. A termék szárazanyag tartalmát 22.8 w/w %-nak mértük. Ezt a terméket élesztő sejt izolátumnak nevezzük.

Háttér hidrolízist hajtottunk végre 21.9 gramm nedves sejt fal izolátum felhasználásával, amikor is az anyagot egy 250 ml-es Erlenmeyer lombikban 70 ml vízben szuszpendáltuk. Az elegy pH-ját 6 N-os HC1 oldattal 5.0 értékre állítottuk be. Az Erlenmeyer lombik tartalmát 100 ml-re egészítettük ki. Az elegyből t=l, 5, 10, 20, 30, 60, 90, 120, 180, 240 perc elteltével vettünk mintákat. A mintákat azonnal Heraeus-féle Labofuge centrifugával a 3400 g-vel forgatva centrifugáltuk (ez 4500 fordulat/perc centrifuga fordulatszámnak felel meg) 5 percig. A reakció lefolyását a felülúszó rész ozmolalitásának méréseivel követtük 3W2 számú Advanced WideRange Osmometer (Advanced Instruments) felhasználásával. A centrifugátumok szárazanyag tartalmának mérésére DUR REFRACTOMETER-Electronic (Schmidt Haensch) berendezést alkalmaztunk.

A hidrolízis vizsgálatokat a fentiekben ismertetett módon hajtottuk végre azzal az eltéréssel, hogy a pH beállítást követően az Erlenmeyer lombik teljes tartalmát 95 ml-re egészítettük ki. A termosztálás után körülbelül 2.5 mg endo-l,3(4)-p-glukanáz enzimet adtunk hozzá. A hidrolízis reakciót állandó keverés közben 50 °C-os • · · ·

-40hőmérsékleten hajtottuk végre a mágneses keverővei felszerelt Erlenmeyer lombikot vízfürdőbe helyezve. A minták feldolgozására és mérésére a fentiekben ismertetett módon került sor.

A háttér hidrolízis során kapott és az endo-l,3(4)-p-glukanázzal kezelt élesztő sejtfal anyag hidrolízise során kapott mérési adatokat az alábbi 2. táblázatban mutatjuk be.

2. Táblázat

Az endo-l,3(4)-3-glukanáz oldhatóságot fokozó hatása és lebontó képessége

Háttér Endo-l,3(4)-P-glukanáz kezelés

idő, perc	mOSM/-kg	AmOsm/- kg	°BRIX	mOSM/kg	AmOsm/- kg	°BRIX
1	20	0	0	37	0	0
5	20	0	0	37	0	0
10	21	1	0	38	1	0
20	21	1	0	41	4	0.10
30	22	2	0	43	6	0.14
60	23	3	0	50	13	0.30
90	24	4	0	58	21	0.46
120	26	6	0	64	27	0.56
180	28	8	0	76	39	0.74
240	30	10	0	85	48	0.84

IRODALOMJEGYZÉK

-41 Aviv, Η. & Leder, Ρ. 1972. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69: 1408-1412

Becker, D. M. & Guarante, L. 1991. Methods Enzymol. 194: 182-187

Chirgwin, J. M., Pryzbyla, A. E., MacDonald, R. J. & Rutter, W. J. 1979. Biochemistry 18: 5294-5299.

Gubler, U. & Hoffman, B. J. 1983. Gene 25: 263-269

Smabrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Láb., Cold Spring Harbor, NY.

Sanger, E., Nicklen, S. & Coulson, A. R. 1977 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 54635467

Pitson et al., Noncellolytic fungal β-glucanases: Their physiology and regulation. In Enzyme Microb. Technoi., 1993, vol. 15, March.

Reed and Nagodawithana, in Yeast Technology, Second Edition, pp. 372-380

Phaff, H.J., Enzymatic Yeast Cell Wall Degradation. In Food Proteins, Improvement through Chemical and Enzymatic Modification, edited by Feeney and Whitaker, Washington, 1977

Hamlyn et al., Efficient protoplast isolation from fungi using commercial enzymes. In Enzyme Microb. Technoi., 1981, Vol. 3, October

Andrews and Asenjo, Enzymatic lysis and disruption of microbial cells. In Tibtech, October 1987, Vol. 5

-42Hudson, H.J. in Fungal Biology, eds Willis, A.J. and Sleigh, M.A., 1986, Edward Arnold (Publishers), Ltd.

Kofod et al., (1994), J. Bioi. Chem., 261, 8407-8413 van den Hazel et al., (1992), Eur. J. Biochem., 207, 277-283

Becker and Guarante, (1991), Methods Enzymol., 194, 182-187

Sherman, (1991), Methods Enzymol. 194, 3-21

Meissner et al., (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 4171-4176

Devereux et al., (1984), Nucleic Acids Rés., 12, 387-395

Laemmli et al. (1970, Natúré, vol 227, p. 680-685

Christgau, Schierbeck et al., (1991), J. Bioi. Chem, Vol 266, p. 21157-21164

SZEKVENCIA LISTÁK

SEC ID No. 1

Trichoderma harzianum-ból CBS 243.71 származó endo-l,3(4)-P-glukanáz enzimet kódoló rész cDNS szekvencia

GTATATACAACATCAGTACATACTATATACCCTCCTTTTAACCCCTTTTT

GAAACATATACAAAATGTGGTCTCCCAAGGTTGCTGCTGCCGTCCTCGCC

TTTGTTGGTGCTACCAACGCCTGGCAGCCCCCGACCTACAGCGGCTTCAA

CTTGGTCTGGACTGACACCTTCGCTGGCAACGGTGGCACTTCTCCTAACC

-43AGAACAACTGGAACATCATCACCGGAAACTTGAACGTCAACGCCGAGCA

GGAGACCTACTCCTCCAGCACCGCCAATGTTCAGCTCAGTGGTGGCAGCA

CCCTTCAGCTGGTCCCCTGGAGAGCAGCAGCAAGGGAACAGCACCTTTG

GTGGCTGGACCTCGGCTGCT

SEC ID No. 2

Trichoderma harzianum-bói CBS 243.71 származó endo-l,3(4)-P-endoglukanáz enzimet kódoló rész cDNS szekvencia

CCCTCACCTGGTCCTCGACGGCACCAACTACTTCCAGTCACTGGTTCTCGCA

TT

GGCAACCAGGGCGTCTGGAACAACATTGCTCACAGCCCCTCTTCTTCATT

CTTAACGTTGCTGTCGGTGGCAACTGGCCTGGCAACCCCAACAGCGCTACC

CTCGATGGCTACGGAAGCATGATGGAGGTTGGCTACGTCGCTCAGTACTCT

A

CCTAAGAACCTTGCGCTCTTGAGGTAGCTGTTTGTGACATGCGATACCACA

GTACATAAGCCTGAGCTCGTCTCAGGCTCAGTGGCAAATTAGAGGATGAGC

ATTTTCACT

TCCTCTTGTCACT

SEC ID No. 3

Trichoderma harzianum-bói CBS 243.71 származó endo-l,3(4)-3-glukanáz enzimet kódoló cDNS szekvencia teljes hossza

ATGTGGTCTCCCAAGGTTGCTGCTGCCGTCCTCGCCTTTGTTGGTGCTACCA

ACGCCTGGC

AGCCCCCGACCTACAGCGGCTTCAACTTGGTCTGGACTGACACCTTCGCTG

GCAACGGTGG

-44CACTTCTCCTAACCAGAACAACTGGACATCATCACCGGAAACTTGAACGTA

CACGCCAG

CAGGAGACCTACTCCTCCAGCACCGCCAATGTTCAGCTCAGTGGTGGCAGC

ACCCTTCAGC

TGGTCCCCTGGAGAGACAGCAGCAAGGGAACCAGCACCTTTGGTGGCTGG

ACCTCCGGTCG

TCTTGAGTCCAAGTACACATTCATCCCGCGGCCGGCAAGGTCACCCGTCTT

GAAGCCGCC

ATCCGCTTCGGCAGCAACGCTACGGCCAACAAGCAGGGTATCTGGCCTGCT

TTCTGGATGC

TGGGTGACTCCCTCCGTCAACCGGGCGGCAGCTGGCCCAACTGTGGTTGAG

ATCGACATCAT

GGAGACTGTCGACGGCAGGCTACCGGCCACGGTACCCTTCACTGCGACGTC

TACCCGGC

GGTATCTGCAACGAGGGTAACGGTATTGGAGGCCCTGTCAACATCGCCAAC

GTCAACGTAACGACT

GGCACGCTTGGCGTGTTGAGATCGACCGACTCCCAGCAGCTGGCAATCCGA

GACCCTCAC

CTGGTCCCTCGACGGCACCATCTACTTCCAGATCACTGGCTCTCGCATTGGC

AACCAGGGC

GTCTGGAACAACATTGCTCACAGCCCCCTCTTCTTCATTCTTAACGTTGCTG

TCGGTGGCA

ACTGGCCTGGCAACCCCAACAGCGCTACCCTCGATGGCTACGGAAGCATG

ATGGAGGTTGG

CTACGTCGCTCAGTACTCTACCTAA

SEC ID No. 4

Endo-l,3(4)-p-glukanáz aminosav szekvencia teljes hossza

-45MWSPKVAAVLAFVGATNAWQPPTYSGFNLVWTDTFAGNGGTSPNQNNWNII

TGNLNVNAE

QETYSSSTANVQLSGGSTLQLVPWRDSSKGTSTFGGWTSGRLESKYTFTPAAG

KVTRLEAA

IRFGSNAQANKQGIWPAFWMLGDSLRQPGGSWPNCGEIDIMETVDGQATGHG

TLHCDVYPG

GICNEGNGIGGPVNIANVNDWHAWRVEIDRTPSSWQSETLTWSLDGTIYFQIT

GSRIGNQG

VWNNIAHSPLFFILNVAVGGNWPGNPNSATLDGYGSMMEVGYVAQYST

SEC ID No. 5

Acremonium s/z-ből CBS 265.95 származó endo-l,3(4)-p-glukanáz enzimet kódoló rész cDNS szekvencia

ATGCGCTTCGCTTCTTATCTTTCGTTGCTACCCATTCTGGGAGCCAGCGTCT

CAGCCTGGG

ACGCACCGAGCTACGATGGGTACCGGCTTGTCTGGGCCGAGACCTTCGCAG

GCCCCAGCAA

CGGCCTTCCCAATGAGAACAACTGGAACATCATCGACGGAAACATCGGCC

GTCAACAACGA

GCTCCAGACGTACCGGCGGAACCCG

SEC ID No. 6

Acremonium sp. törzsből CBS 265.95 származó endo-1,3 (4)-P~glukanáz enzimet kódoló rész cDNS szekvencia

GGCATCAACTCAACGACCAGGGCGTCTGGGAGAGCTTGACGGCCAAGCCT

CTGTTCTT45 • ·

-46TATCCTGAATGTTGCGGTTGGCGGCAACTGGCCCGGCTATCCCAATGGCAA

CACCCTTGGC

GGCTATGGCGCCATGATGGAAGTGGGCTATGTTGCTCAGTACTCCTCTTGA.

Claims (39)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Endo-P-glukanáz enzim aktivitással rendelkező enzimet kódoló DNS szekvenciát tartalmazó DNS konstrukció azzal jellemezve, hogy a DNS szekvencia

   a) a SEC ID No. 3 szám alatt bemutatott DNS szekvencia vagy

   b) a SEC ID No. 3 szám alatt bemutatott DNS szekvencia olyan analógja, amely

   i) homológ a SEC ID No. 3 szám alatt bemutatott DNS szekvenciával; és/vagy • ·

   -47ii) hibridizál ugyanazzal az oligonukleotid próbával, amit a SEC ID No. 3 szám alatti DNS szekvencia mutat be; és/vagy iii) olyan polipeptidet kódol, amely homológ a SEC ID No. 3 szám alatt bemutatott DNS szekvencia által kódolt polipeptiddel; és/vagy iv) olyan polipeptidet kódol, amely immunológiailag reaktív a CBS 243.71. számú Trichoderma harziannm-bó\ származó SEC ID No. 4 szám alatt bemutatott szekvencia által kódolt tisztított endo-l,3(4)-p-glukanázzal szemben termelt ellenanyaggal.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti DNS konstrukció azzal jellemezve, hogy az endoglukanáz aktivitása endo-l,3(4)-P-glukanáz aktivitás.
3. 3. Az 1. és 2. igénypontok szerinti DNS konstrukció azzal jelle-mez v e, hogy olyan endo-l,3(4)-P-glukanáz aktivitású enzimet kódoló DNS szekvenciát tartalmaz, amely DNS szekvencia a SEC ID Nos. 1 vagy 2 számok alatt bemutatott DNS szekvenciáknak legalább egy részét tartalmazza.
4. 4. Az 1. és 3. igénypontok bármelyike szerinti DNS konstrukció az- z a 1 jellemezve, hogy az endo-p-glukanáz aktivitású enzimet kódoló DNS szekvencia mikroorganizmusokból nyerhető.
5. 5. A 4. igénypont szerinti DNS konstrukció azzal jellemezve, hogy a DNS szekvencia fonalas gombából vagy élesztőből nyerhető.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti DNS konstrukció azzal jellemezve, hogy a DNS szekvencia Trichoderma, Saccharomyces, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Humicola, Acremonium, Botrytis vagy Sclerotium törzsből nyerhető.
7. 7. A 6. igénypont szerinti DNS konstrukció azzal jellemezve, hogy a DNS szekvencia Trichoderma törzsből, különösen Trichoderma harzianum törzsből nyerhető.
8. 8. A 7. igénypont szerinti DNS konstrukció azzal jellemezve, hogy a DNS szekvencia a Trichoderma harzianum CBS 265.95 törzs DNS klóntára alapján izolálható vagy állítható elő.
9. 9. A 6. igénypont szerinti DNS konstrukció azzal jellemezve, hogy a homológ DNS szekvencia Acremonium sp. CBS 265.95 törzsből nyerhető.

   • ·

   -4810. A 9. igénypont szerinti DNS konstrukció azzal jellemezve, hogy a DNS szekvenciát a SEC ID Nos 5 és/vagy 6 alatti részleges szekvenciákat tartalmazó Saccharomyces cerevisiae NN049006-ból izoláljuk.
10. 11. A rekombináns expressziós vektor azzal jellemezve, hogy az 1 10. igénypontok bármelyike szerinti DNS konstrukciót tartalmazza.
11. 12. Sejt azzal jellemezve, hogy az 1 - 10. igénypontok bármelyike szerinti DNS konstrukciót vagy a 11. igénypont szerinti rekombináns expressziós vektort tartalmaz.
12. 13. A 12. igénypont szerinti sejt azzal jellemezve, hogy eukariota sejt, főként gomba sejt, így élesztőgomba sejt vagy fonalas gomba sejt.
13. 14. A 13. igénypont szerinti sejt azzal jellemezve, hogy a sejt az Aspergillus törzshöz, különösen az Aspergillus niger vagy Aspergillus oryzae törzshöz tartozik.
14. 15. Εηάο-β-glukanáz aktivitást mutató enzim előállítására szolgáló eljárás a z zal jellemezve, hogy a 12 - 14. igénypontok bármelyike szerinti sejtet az enzim termelést lehetővé tevő körülmények között szaporítjuk, majd az enzimet a tenyészetből kinyerjük.
15. 16. Az endo^-glukanáz aktivitással rendelkező enzim a z z a 1 jel le me zve, hogy az enzimet

    a) az 1 - 10. igénypontok bármelyike szerinti DNS konstrukció kódolja; és/vagy

    b) a 15. igénypont szerinti eljárással állítjuk elő; és/vagy

    c) immunológiailag reaktív a CBS 243.71. számú Trichoderma harzianum-bói származó SEC ID No. 4 szám alatt bemutatott szekvencia által kódolt tisztított endol,3(4)^-glukanázzal szemben termelt ellenanyaggal.
16. 17. A 16. igénypont szerinti enzim azzal jellemezve, hogy a Km érték körülbelül 0.02 és 0.06 % β-1,3-1,4^Κύ<ήη közötti.
17. 18. A 16. igénypont szerinti enzim azzal jellemezve, hogy a látszólagos izolelektromos pontja (pl) körülbelül 5.1.
18. 19. A 16. igénypont szerinti enzim azzal jellemezve, hogy a látszólagos molekulatömege (Mw) körülbelül 31 kDa.

    -4920. A 16. igénypont szerinti enzim azzal jellemezve, hogy hőmérsékleti optimuma 40 °C és 60 °C közé esik, még előnyösebben körülbelül 50 °C.
19. 21. A 16. igénypont szerinti enzim azzal jellemezve, hogy a pH optimuma pH 4.5 és 5.5 közötti, még előnyösebben körülbelül pH 5.
20. 22. A 16. igénypont szerinti enzim azzal jellemezve, hogy specifikus aktivitása körülbelül 100 - 200 U/mg enzim.
21. 23. A β-glukánt tartalmazó anyagok módosítására vagy lebontására alkalmas enzimkészítmény azzal jellemezve, hogy a készítmény a 16 - 22. igénypontok bármelyike szerinti endo^-glukanáz aktivitással rendelkező enzimmel gazdagított.
22. 24. A 23. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy tartalmaz továbbá legalább egyet a proteázok, kitinázok, mannanázok, kitozanázok, cellulázok, endo-glukanázok, mannozidázok, β-glukozidázok, β-Ι,ό-glukanázok, mutanázok, xilanázok, arabinanázok, galaktanázok, rhamnogalakturonázok, pektinacetilészterázok, galaktanázok, poligalakturonázok, pektin-liázok, pektát-liázok vagy pektin-metilészterázok enzimcsoportjaiból.
23. 25. A 16 - 22. igénypontok bármelyike szerinti enzim vagy a 23. vagy 24. igénypontok szerinti enzimkészítmény felhasználása β-glukánt tartalmazó anyag módosításra vagy lebontásra.
24. 26. A 25. igénypont szerinti felhasználási eljárás azzal jelle mez-ve, hogy a β-glukán tartalmú anyag mikróbasejt fal.
25. 27. A 25. igénypont szerinti felhasználási eljárás azzal jellemez-ve, hogy a β-glukán tartalmú anyag növényi sejtfal.
26. 28. A 25. vagy 26. igénypont szerinti felhasználási eljárás azzal jel-le m e z v e, hogy az enzimet vagy enzimkészítményt protoplaszt készítményként használjuk fel.
27. 29. A 25. vagy 26. igénypont szerinti felhasználási eljárás azzal jel-le m e z v e, hogy az enzimet vagy enzimkészítményt élesztő extrakt készítményként használjuk fel.
28. 30. A 25. vagy 27. igénypont szerinti felhasználási eljárás azzal jel-le m e z v e, hogy a sörfőzési eljárásban alkalmazzuk.

    -5031. A 25. vagy 26. igénypont szerinti felhasználási eljárás azzal jel-le m e z v e, hogy a szőlőborászatban és a sajtolt gyümölcslevek készítése során alkalmazzuk.
29. 32. A 25. vagy 27. igénypont szerinti felhasználási eljárás azzal jel-le m e z v e, hogy az élelmiszeriparban és a takarmánykészítés során alkalmazzuk.
30. 33. A 32. igénypont szerinti felhasználási eljárás azzal jellemez-ve, hogy a gyártott élelmiszer sütőipari vagy gabonát tartalmazó termék.
31. 34. A 25. vagy 26. igénypont szerinti felhasználási eljárás azzal jel-le m e z v e, hogy azokat gombaellenes szerekként alkalmazzuk.
32. 35. A 25. vagy 27. igénypont szerinti felhasználási eljárás azzal jel-le m e z v e, hogy a textíliák kezelésében alkalmazzuk.
33. 36. A 25. vagy 26. igénypont szerinti felhasználási eljárás azzal jel-le m ez v e, hogy a felületi penészek eltávolításakor alkalmazzuk.
34. 37. A 25. igénypont szerinti felhasználási eljárás azzal jellemez-ve, hogy emberi higiéniás termékekben alkalmazzuk.
35. 38. A 37. igénypont szerinti felhasználási eljárás azzal jellemez-ve, hogy protézistisztító készítményekben alkalmazzuk.
36. 39. A 37. igénypont szerinti felhasználási eljárás azzal jellemez-ve, hogy plakkeltávolító készítményekben alkalmazzuk.
37. 40. A 25. igénypont szerinti felhasználási eljárás azzal jellemez-ve, hogy biofilmek felületekről történő eltávolítására használjuk.
38. 41. A 35. vagy 26. igénypont szerinti felhasználási eljárás azzal jel-le m e z v e, hogy mikróbasejt falakból mannoprotein kinyerésére használjuk.
39. 42. Izolált, lényegében tiszta Saccharomyces cerevisiae NN049006 kultúra.