HUT72986A

HUT72986A - Microporous macrocapsules

Info

Publication number: HUT72986A
Application number: HU9501426A
Authority: HU
Inventors: Frank T Gentile; Patrick A Tresco; Tyrone Hazlett; Thomas Flanagan; Edward J Doherty; David Rein; Laura Holland
Original assignee: Univ Brown Res Found
Priority date: 1992-11-16
Filing date: 1993-11-16
Publication date: 1996-06-28
Also published as: DK0674497T3; BR9307455A; CZ122795A3; EP0674497A1; NZ258720A; ES2179839T3; SK62495A3; EP0674497A4; PL309012A1; KR950703910A; EP0674497B1; FI952322A; DE69332149T2; LV10906B; JPH08503472A; CA2149420A1; DE69332149D1; AU5671394A; AU687371B2; CA2149420C

Description

Ez a bejelentés az USSN 07/975,354 számú bejelentés rész» beni folytatása, amely utóbbi az 1992. április 22-én benyújtott

US92/03327 számú egyidejű vizsgálat alatt álló PCT bejelentés részbeni folytatása; ez utóbbi az 1991. április 25-én benyújtott, USSN 07/692,403 számú bejelentés folytatólagos bejelentése. E rokon bejelentések tartalmát kifejezetten hivatkozásként foglaljuk alábbi leírásunkba.

A találmány tárgya makrokapszulák és azok alkalmazása sejtek beültetésére (implantációjára) és eltávolítására használható eszközökként.

Jelenleg számos kutatási törekvés középpontjában állnak azok a módszerek, amelyek útján élő sejtek és/vagy szövetek az élő szervezetbe ültethetők (implantálhatók) terápiásán hasznos anyagok biztosítására (sejtterápia). A sejtterápia terápiás alkalmazását javasolták - többek között - a cukorbetegség, valamint idegsorvadásos megbetegedések, például Alzheimer-betegség, Parkinson-kór és epilepszia területén. Ezen túlmenően kimutatták, hogy a sejtterápiának nagy gyógyászati lehetősége van káros anyagok eltávolításában a szervezetből. így például Wang és munkatársai [Transplantation Proceedings 23, 894-895 (1991)] magas koleszterinszintek kezelésére hepatocitákat (májsejteket) ültettek be.

A sejtterápia egyik megvalósítási módja szerint a betegbe ültetett sejteket előzőleg genetikailag in vitro exogén genetikai anyaggal módosítják, hogy a sejteket képessé tegyék azon kívánt, biológiai anyag termelésére, amely terápiás szerként alkalmazható. Sejtek átalakítására több mechanizmus ismert. Lényegesnek találták retrovírusok vektorait, amelyek közül egye« · · «

-3- ·..··..··:· :

sek a célsejtek nagyon nagy hányadát képesek átalakítani. Ilyen ► vektorok alkalmazása során a provirális integrálódás bekövetkezéséhez a célsejtek replikációja szükséges. Elméletileg a retrovírusokkal átalakított sejtek nem képesek a vírusok szétszórására más sejtekbe. Az ilyen rendszerek alkalmazása számos biztonsági problémát vet fel. Ilyen veszély például annak a lehetősége, hogy a retrovirális vektorkészítmény előállítása során fertőző vírusokkal vagy patogénekkel szennyeződik [Cornetta: Humán Gene Therapy 2, 5-14 (1991)].

Génátvivő (transzfer) vektorokként adenovírusokat is alkalmaznak. Ezek kettősszálú DNS vírusok, amelyek képesek sejtoszlás utáni (mitózis utáni) állapotban lévő sejtek fertőzésére, és a fertőzés sikeres átvitele a gazdasejtekbe (sikeres transzfekciója) nagy mennyiségű géntermék kifejezését eredményezheti. Az adenovírusok az ember szempontjából kevéssé patogének (minor patogének) és normális körülmények között rosszindulatú megbetegedés kifejlődésével nem járnak. Jóllehet az adenovírus vektor általában episzomális marad, és replikációja nem következik be, a vizsgálatok szerint a gén kifejezése jelentős időn át megmaradhat; ez azt a lehetőséget tárja fel, hogy a vektorok legalábbis kompetitivek a replikáció szempontjából.

Bár a jelenleg ismert, sejtterápiás módszerek lényeges gyógyászati lehetőséget nyújtanak, számos súlyos korlátozással terheltek. Sejtek befecskendezése egy betegben súlyos immunreakciót válthat ki. A sejtek első befecskendezésére bekövetkező immunreakció egy második befecskendezést nagy valószínűséggel kizár, s ez korlátozza azt a javulást, amely az első ilyen kezeléssel elérhető. Egyes kiszemelt sejttípusok olyan vírusré-4szecskéket szórhatnak szét, melyek a gazdaszervezetre károsak lehetnek, s így átültetésre alkalmasnak nem tekinthetők. Olyan esetekben, ahol a sejteket vírusmódszerek alkalmazásával genetikailag módosítják a kívánt biológiai anyag termelése céljából, a sejtek vírusrészecskéket köthetnek meg, és ez a beteg sejtjei szempontjából fertőzés lehetőségét jelenti. A jelenleg ismert sejtterápiás módszerek egy másik hátránya, hogy számos sejt amely a terápia szempontjából hasznos lehetne - ismert módon helyben (in situ) elmozdul (például a gliasejtek). Ha a beültetett sejtek nem tarthatók rögzített helyzetben, akkor ez a tény terápiás szerekként való felhasználásra azokat alkalmatlanná teheti. Ugyanígy, a gazdaszervezet szempontjából autológ, sőt allogén sejtek folyamatosan nem ellenőrzött módon osztódhatnak, és így daganatokat idézhetnek elő.

A sejtterápia jelenlegi módszerei nem teszik lehetővé egykönnyen a sejtterápiás kezelési rend leállítását vagy szabályozását a sejtek beültetése után. Ennek az az oka, hogy a beteg saját szövetétől a szervezetébe ültetett sejtek nem különülnek el megfelelően, s így könnyűszerrel nem távolíthatók el, nem alakíthatók. Ez reális veszélyt jelent, ha a sejteket előzőleg retrovírus-töredékek alkalmazásával genetikailag módosítják, mivel a beültetett sejtek in situ elmozdulhatnak; ez esetleg azt eredményezi, hogy a fertőző sejtvonal provirálisan beépül a fertőző gazdatörzs sejtjeibe, s így a provírust az ivadékra átviszi.

Többféle különleges körülmény kritikus jellegűvé teheti a beültetett, terápiás sejtek megölését vagy eltávolítását. Ilyen okok például:

1. Egy vagy több, beültetett sejt onkogénné (rákképzövé) vagy daganatképzővé válik, vagy káros immunreakciót vált ki.

2. A dózis beállítása megkívánhatja a beültetett sejtek számának csökkentését meghatározott időpontokban.

3. Genetikailag módosított sejtpopulációk kis számban olyan sejteket tartalmazhatnak, amelyek útján genetikai anyag nem megfelelő módon épül be, és ez káros hatásokat idéz elő.

4. A terápiának adott esetben meghatározott végpontja lehet (például növekedési hormonnal végzett kezelés esetén); ezen az időponton túl a terápiás sejtek jelenléte nemkívánt vagy káros.

5. A genetikailag módosított sejtek egyidejűleg adagolt, farmakológiailag hatásos anyagokkal szemben káros választ válthatnak ki.

6. Kedvezőbb terápiás megoldás kifejlesztése a terápia megváltoztatását indokolhatja, s ez az átültetett sejtek eltávolítását igényli.

A sejtterápia befejezésére - például a beültetett sejtek megölése útján - lehetséges eszközként javasolták indukálható öngyilkos gének beépítését a beültetésre szánt sejtekbe. E megközelítési mód egyik hátránya azonban, hogy - mivel a sejtoszlás sztochasztikus folyamat - mindig fennáll annak a lehetősége, hogy a szuicid (öngyilkossági) mechanizmus egy vagy néhány sejtben inaktiválódik. Nemkívánt hatások még akkor is felléphetnek, ha egyetlenegy sejt folytatja az osztódást. Ennek a megközelítési módnak olyan nem kívánatos eredményei is lehetnek, amelyeket az elválasztási termékek - így például növekedési faktorok vagy proteázok - kiürülése vagy vírusok • · · ·

-6• · · · « « · « « • · · ····· · • · · · · · felszabadulása okoz, a beültetett sejtek nagymérvű lebomlásának következtében.

A sejtkapszulázási módszereket felhasználták sejtek olyan elkülönítéséra, mely lehetővé teszi a kívánt biológiai anyagok felszabadulását. Kétféle eljárást alkalmaztak: a mikrokapszulázást és a makrokapszulázást. A mikrokapszulázás során a sejteket általában kisméretű, gömbalakú, szelektív permeabilitású tokba foglalják; míg a makrokapszulázás esetében a sejteket egy nagyobb, nem gömbalakú membránba zárják.

A 4 409 331 és 4 352 883 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásokban (szerzője Lim) ismertetik mikrokapszulázó módszerek alkalmazását sejtek által in vitro termelt biológiai anyagok előállítására; ennek során a kapszulák permeabilitása az előállítani kívánt biológiai anyagoktól függ. Wu és munkatársai [Int. J. Pancreatology 3, 91-100 (1988)] ismertetik inzulintermelő, mikrokapszulázott hasnyálmirigy-szigetek átültetését diabeteses patkányokba. Aebischer és munkatársai [Biomaterials 12, 50-55 (1991)] dopamint elválasztó sejtek makrokapszulázását írják le.

Vírusoknak folyadékokból való szűrésére eddig különféle polimer anyagokat használtak.Anazawa és munkatársai az 5 236 588 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban ultraszűrő membránt ismertetnek, amelyet egy monomer besugárzásával állítanak elő, s így érintkező pórusokat tartalmazó membránhoz jutnak. Allegrezza az 5 096 637 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban aszimmetrikus, összetett ultraszűrő membránt közöl vírusok izolálására fehérjét tartalmazó oldatokból. Az 5 017 292 számú Egyesült Államok-beli • · · · szabadalmi bejelentésben DiLeo aszimmetrikus, lefejtett, porózus hordozókból álló membránokat ismertet, amelyek porózus hordozóból, ultraszűrő felületi rétegből és hézagmentes közbülső zónából épülnek fel, mely utóbbiak a rétegben hézagot alakítanak ki, s így biztosítják a folyadék közvetlen érintkezését a porózus hordozóval. A membránokat vírusok izolálására alkalmazzák fehérjetartalmú oldatokból. A 4 808 315 és 4 857 196 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentésekben hidrofil, üreges rostos membránokat ismertetnek, amelyek segítségével fehérjetartalmú oldatból vírus eltávolítható.

Egyetlen fenti idézetben sem közölnek vírusokat visszatartó, szelektív permeabilitású (permeabilitás-szelektív, röviden permszelektív), biológiailag összeegyeztethető (biokompatibilis) olyan membránokat, amelyek egy betegbe sejtterápiás céllal beültethetők (implantálhatók). Sokféle helyzet adódik, ahol kedvező lehet a sejtterápia kifejlesztése biológiai anyagok in vivő szállítására úgy, hogy alapvetően megelőzzük olyan káros vírusok felszabadulását, amelyek a kapszulázott sejtből szóródhatnak. Továbbá, számos esetben kívánatos lehet a sejtterápiás kezelés könnyű befejezése. A sejtterápia területén azonban ilyen kezelésekre alkalmazható hatásos eszközök jelenleg hiányoznak.

Mindezek alapján a találmány egyik célja olyan módszerek biztosítása a sejtterápia számára, amelyek kívánt időpontban könnyen leállíthatók a beültetett sejtek eltávolítása révén.

A találmánynak egy további célja olyan makrokapszulák kidolgozása a sejtek kapszulázására, amelyek a konkrét alkalmazáson és a kívánt vírusvisszatartási jellemzőkön alapuló, megválasztott perineabi 1 itási karakterisztikákkal rendelkeznek.

·

-8« · · « · • ·· ··«·· · • · · · · «

A találmánynak egy még további célja módszerek kidolgozása makrokapszulák vírusvisszatartó képességének a tesztelésére.

A területen jártas szakember számára a találmánynak ezen és további céljai és sajátságai az alább következő részletes leírásból és igénypontokból világossá válnak.

Nézetünk szerint a fenti idézetek egyike sem ismerteti a jelen találmányt az igényelt formájában, és feltételezzük, hogy az a technika jelenlegi állása szerint ismeretlen. Az idézeteket háttérinformáció céljából hoztuk fel.

Az alábbiakban összegezzük találmányunkat.

Sejtterápiában való alkalmazásra beültethető, szelektív permeabilitású (permszelektív) makrokapszulát ismertetünk. E makrokapszula olyan élő sejteket tartalmazó magot foglal magában, amelyek megválasztott, biológiailag aktív termék elválasztására, vagy megválasztott biológiai funkció kifejtésére képesek; valamint magában foglal egy külső burkolatot, amely a magot körülveszi. A burkolat biológiailag elviselhető (biokompatibilis) anyagból áll, amely a kapszulázott sejtektől lényegében mentes, és molekulatömeg-mérethatára a sejteknek makrokapszulán belül tartására megfelelő. Egyes megvalósítási formákban a makrokapszulák névleges molekulatömeg-mérethatára azoknak a káros vírusoknak a molekulatömege alatt van, amelyek az említett, élő sejtekből szétszóródhatnak.

Az alábbiakban továbbá módszert írunk le beültethető, permszelektív makrokapszula külső burkolata vírusvisszatartó képességének a meghatározására, ahol a külső burkolat üreges rostból áll, és az üreges rostba vírust töltünk. Ezután az üreges

-9rost végeit lezárjuk, és a rostot fürdőoldatba helyezzük. Bizonyos idő eltelte után az oldatot a vírusra érzékeny baktériumrétegre oltjuk. A vírusvisszatartó képességet a kialakult plakkok száma alapján számítjuk ki.

Az alábbiakban röviden leírjuk a csatolt rajzokat.

Az 1. ábra mutatja a fágok mikroporózus makrokapszulákból végbemenő felszabadulása csökkenésének logaritmusát a mikroporózus molekulatömeg függvényében.

A 2. ábra a mikroporózus makrokapszulák vírusvisszatartó képességének mérésére alkalmazott tesztelő töltetet mutatja.

A 3. és 4. ábra mutatja különböző méretű dextránok százalékban kifejezett visszatartását a mikroporózus makrokapszulákban.

Az alábbiakban a találmányt részletesen ismertetjük.

A találmány pemszelektív, biológiailag elviselhető makrokapszulázó eszközöket biztosít, valamint módszereket ad meg azok alkalmazására sejtek visszatartására. Ezek a makrokapszulázó eszközök magukban tartják a bennük jelenlévő sejtekből szóródó, káros vírusokat, vagy gátolják káros vírusok belépését a gazdaszervezet szövetéből a kapszulázó eszközön át. A makrokapszulák révén lehetővé válik továbbá a sejtterápiás kezelési rend hatásos befejezése. Valamennyi, találmány szerinti módszer a permszelektív makrokapszulázó eszközökön alapul, amelyek a beültetésre kiszemelt sejtek természetétől és a beültetés helyétől függően immunizoláló sajátságokkal rendelkeznek, vagy ilyen sajátságaik nincsenek. így tehát egyes esetekben a sejtek képesek egy kívánt funkció kifejtésére egy, közöttük és a befogadó (gazda-) szervezet immunrendszere közötti, fizikai gát szűk» • 10 · • * * · t ]f\ ♦ · « * ««·· · ο - ......

ségessége nélkül. Számos olyan sejt rendelkezik ilyen sajátságokkal, amelyeket a kapszulázást nem alkalmazó, klasszikus sejtterápiára alkalmasnak ítélnek.

A találmány szerinti makrokapszulák biológiailag elviselhetők (összeegyeztethetők), biokompatibilisek. A „biokompatibilis” fogalma e leírásunkban mind az ép makrokapszulákra, mind azok tartalmára vonatkozik. Közelebbről, a biokompatibilitás a beültetett, ép makrokapszulának és tartalmának arra a tulajdonságára vonatkozik, hogy semmiféle káros hatást sem fejt ki a szervezet különböző védőrendszereire, például az immunrendszerre vagy az idegen testre adott fibrotikus válaszra. Ezen túlmenően a „biokompatibilitás” alatt azt is értjük, hogy a vivőeszköz és tartalma semmiféle specifikus, nemkívánt, citotoxikus vagy szisztémás hatást nem fejt ki, ami például a vivőeszköznek vagy a tartalmának kívánt működését megzavarná.

A makrokapszulák továbbá „permszelektivek” (szelektív permeabilitással rendelkeznek), és specifikus alkalmazásukra szabott permeabilitási jellemzőkkel rendelkezhetnek. így például olyan makrokapszulák, amelyeket xenogén sejtek kapszulázására használnak - s amely sejtek káros vírusokat foglalhatnak magukban - arra a célra tervezhetők, hogy vírusok felszabadulását minimálissá tegyék. A jelen találmány szerinti módszerek lehetővé teszik hogy egy adott makrokapszula beültetése előtt annak vírusvisszatartó, illetve vírusfelszabadulást késleltető jellemzőit megismerjük. A vírusvisszatartó képesség (azaz, hogy a membrán milyen mértékben késlelteti a vírus transzportját) meghatározható a D_membr.-_n/D_viz hányados kiszámításával, ahol D az anyag membránon áthaladásának diffúziós koefficiense. Ez a há- 11 nyados összehasonlítja a membránon át végbemenő transzporttal szemben megnyilvánuló ellenállást vízben megtett ekvivalens távolságéval. 18-120 nm méretű vírusok esetében D_víz értéke

2,4 x 10’⁷ cm²/sec-tól 3,8 x 10’^s cm²/sec-ig terjed. Különböző vírusok membránon át végbemenő diffúziójának koefficiensét meghatároztuk az induláskor, majd hat hét után megfigyelt adatok alapján. A diffúziós koefficiens a membránon át végbemenő transzporttal szemben mutatott ellenállás mértéke, amely a következő egyenlettel fejezhető ki:

J = D(AC)/(AX) ahol a J a membránon át végbemenő fluxus, AC a koncentrációs különbség a membránon belül és a membránon kívül (a membrán belső, illetve külső oldala között) és ΔΧ a membrán falvastagsága. A D értéke állandó, és a koncentrációtól független. A D a AC és a kapott J fluxus közötti arányossági tényező. Egy membrán vírusvisszatartó képessége előnyösen körülbelül 0,5-nél kisebb, még előnyösebben 0,1-nél kisebb, legelőnyösebben körülbelül 10’ -nél is kisebb. A membrán - a betegbe ültetése után - vírusvisszatartó, illetve vírusfelszabadulást késleltető sajátságait előnyösen legalább 1 héten át, igen előnyösen legalább 2 hétig, még előnyösebben legalább 6 héten át megtartja. Legelőnyösebb, ha a membrán egy adott vírusvisszatartó, illetve vírusfelszabadulást késleltető értéket a terápia teljes időtartamán át megtart.

Egy makrokapszula permszelektív jellemzőjét szintén molekulatömeg-mérethatárával definiálhatjuk. A „molekulatömeg

- 12 -mérethatár” (MWCO) kifejezés a részecskék azon méretére vagy molekulatömegére vonatkozik, amelyeket egy adott membrán konvekció vagy nyomás körülményei között visszatart. Mivel a féligáteresztő (szemipermeábilis) membránok pórusméretének eloszlása általában a Gauss-görbe szerinti, az MWCO kifejezés e leírásunkban egy jelzőmolekula méretére vonatkozik, amelynek 90%-át egy specifikus membrán a tesztkörülmények között visszatartja. Közelebbről, ha egy membránban a pórusok túlnyomó részének a mérete megfelelő egy adott szemcse (részecske) visszatartására, mégis lehetnek olyan pórusok, amelyek eléggé nagyok ahhoz, hogy a molekulát átbocsássák. így egy adott membrán MWCO értéke nem abszolút érték, és különböző tesztekkel mérve némileg különböző lehet. Jóllehet egy membrán egy adott időtartamon át konkrét méretű, eléggé nagy szemcséket teljesen visszatarthat, létezik a részecskeméreteknek egy olyan tartománya, ahol a részecskék egy részét a membrán visszatartja és egy másik részét átereszti. Ha például egy adott membrán körülbelül 50 kD molekulatömegű részecskék 60%-át visszatartja, akkor ugyanaz a membrán ugyanazon időtartamon át az 50 kD-nál nagyobb molekulatömegű szemcsék nagyobb százalékát fogja visszatartani. A névleges MWCO (nMWCO) kifejezés olyan részecskék méretére vonatkozik, amelyeket a makrokapszula 90%-ban visszatart. így például, ha egy membrán

100 kD molekulatömegű részecskék 90%-át tartja vissza, akkor a megfelelő makrokapszula nMWCO értéke 100 kD.

Az nMWCO mérésére több, különböző módszer áll rendelkezésre, amelyek különböző eredményeket adhatnak. A tesztek diffúzión vagy konvekción alapulhatnak. A konvekciós mód

- 13 szerekkel a membránon át nyomás hatására végbemenő diffúziót mérjük. A konvekciós nMWCO érték jól jelzi a molekulák membránon át végbemenő, passzív diffúziójának a sebességét. Ha az nMWCO értéket teszteljük, akkor fontos figyelembe vennünk, hogy a tesztelésben alkalmazott molekula alakja és minősége a mérési értékeket befolyásolhatja. Ezért, ha különböző módszerekből származó adatokat hasonlítunk össze, akkor figyelembe kell vennünk az értékek megállapítására alkalmazott tesztmódszert.

A makrokapszulák úgy tervezhetők, hogy visszatartsák azokat a genetikailag vírusokkal módosított sejteket, amelyek a terápiás hatóanyagként alkalmazható, kívánt biológiai anyagot elválasztják. Az nMWCO értéket úgy választjuk meg, hogy lényegében a biológiai anyag szabadul fel a kapszulából, a megmaradó vírustöredékeket azonban - amelyeket a módosított sejtek tartalmazhatnak - lényegében a kapszula visszatartja. A „genetikailag vírussal módosított” kifejezés bármely standard módszerre vonatkozik, amely e szakterületen alkalmazható exogén DNS bevezetésére virális vektorokkal azon sejtekbe, amelyeket kapszulázni kívánunk. (Ilyenek például a retrovírus, valamint a módosított herpes vírusból, herpes vírusból, adenovírusból, az adenovírussal társult vírusból és hasonló vírusokból származó virális vektorok).

Egyes megvalósítási formákban a találmány szerinti makrokapszulák nagyobb molekulatömegű anyagokkal szemben is permeábilisak, mint a Clq komplement komponens, amelynek molekulatömege körülbelül 440 kD. Az ilyen kiviteli formák tehát lényegében nem immunizoláló jellegűek. Az ilyen kapszulákat

- 14 általában az immunitás szempontjából privilegizált (immun-privilegizált) helyekre, például az agyvelőbe ültetjük. A kapszulák elsődleges célja sejtek eltávolítását célzó alkalmazásuk. Az ilyen eszközök viszonylag magas MWCO értékei révén lehetővé válik viszonylag nagy méretű, terápiásán alkalmazható szerek felszabadulása a sejtekből és azok eljuttatása a beültetés helyére. Az elsősorban a sejtek eltávolítását szolgáló makrokapszulák MWCO értékei 1000-3000 kD tartományban lehetnek. A makrokapszulák viszonylag nagy molekulatömeg-mérethatárai (MWCO értékei) a szakterületen ismert, standard módszerekkel érhetők el, ezeket ismerteti például Strathmann a következő helyen: „Production of Microporous Media by Phase Inversion Processes” [„Mikroporózus közegek létesítése fázismegfordító (fázisinverziós) eljárásokkal”], Materials Science of Synthetic membranes ÁCS Symposium Series 269, American Chemical Society, Washington D.C. (1985). Makrokapszulák MWCO értékeinek változtatására alkalmas, különféle módszereket az alábbiakban ismertetünk.

A permszelektív makrokapszulák ugyanazon módszerekkel és ugyanazon anyagok felhasználásával állíthatók elő, mint amelyeket az egyidejűleg vizsgálat alatt álló, US92/03327 számon közzétett nemzetközi PCT bejelentésben közöltek. Rövid összefoglalásban: A kapszula a következő alkotórészekből áll:

(a) egy magrészből, amely folyékony közegben szuszpendált, vagy hidrogén mátrixban immobilizált, izolált sejteket tartalmaz, valamint (b) egy biokompatibilis, az előbbit körülvevő vagy perifériás részből („burkolat”), amely permszelektív mátrix vagy membrán, és az izolált sejtektől lényegében mentes.

A makrokapszula magvát úgy szerkesztjük meg, hogy megfelelő helyi környezetet biztosítson a benne lévő, izolált sejtek számára. Ezt egyes esetekben úgy valósítjuk meg, hogy a magrész a sejtek visszatartására megfelelő, folyékony közegből áll. A folyékony halmazállapotú magvak különösen alkalmasak transzformált sejtek, például PC12 sejtek visszatartására. Más megvalósítási mód szerint a mag hidrogél mátrixból áll, amely a sejteket helyhez kötötté teszi (immobilizálja), és eloszlatja, és ezáltal a sűrű sejtcsomók képződését (sejthalmozódást) csökkenti.

Hidrogél mátrixból előállított magrészek különösen alkalmasak olyan primer sejtek megtartására, amelyek agglomerátumok képzésére hajlamosak, amilyenek például a Langerhans-szigetek sejtjei vagy a mellékvese kromaffin sejtjei. Adott esetben a makrokapszula magva olyan anyagokat tartalmazhat, amelyek az izolált sejtek működését alátámasztják vagy előmozdítják. Ezek az anyagok természetes vagy mesterséges eredetűek, extracelluláris (sejten kívüli) mátrix (ECM) komponensek, növekedési faktorok vagy a növekedést szabályzó anyagok, valamint tápláló vagy járulékos sejtek populációi lehetnek.

A makrokapszula burkolatát a magrész anyagával azonos, vagy attól különböző anyagból állítjuk elő. Bármely esetben az alkalmazott anyag körülvevő vagy perifériás övezetet alkot, amely permszelektív, és biológiailag elviselhető. A burkolat biokompatibilitása azt jelenti, hogy a beültetett makrokapszula ki • · · ·

-16- .....

lökését előidéző vagy azt nem-operálhatóvá tévő káros immunválaszt nem vált ki; jelenti továbbá azt is, hogy a burkolat kedvezőtlen szöveti válaszokat nem idéz elő. Ehhez járul, hogy a külső felület úgy tervezhető és választható, hogy a meghatározott helyen történő beültetésre különösen megfelelő legyen. A külső felület például síma, szemcsés vagy érdes lehet attól függően, hogy kívánatos-e a környező szövet sejtjeivel végbemenő érintkezés. A makrokapszula alakja vagy térbeli kivitele szintén úgy választható vagy tervezhető, hogy a beültetés kiválasztott helyére különösen megfelelő legyen. A burkolat általában permszelektív membránokból áll, amelyeket üreges rostokká vagy síma lapokká alakítunk. Az üreges rostból álló membrán gyűrűforma, amely egy belső hengeres felületből, hordozásra alkalmas falszerkezetből és külső, hengeres felületből áll. Egyik vagy mindkét felület szelektív lehet különböző molekulatömegű molekulákkal szemben. A síma lap üreges rostból készült, sík termék.

A burkolat - mint körülvevő vagy perifériás övezet - hidrogél mátrixból vagy más anyagból, például hőre lágyuló membránból vagy üreges rostból állítható elő; készíthető továbbá mátrix-membrán kompozitum formájában, s így permszelektív, hőre lágyuló, mátrixszal, például hidrogéllel töltött pórusokat tartalmazó membránt alakíthatunk ki.

A külső burkolatot célszerűen egy közismerten biokompatibilis, hőre lágyuló anyagból, például a leírásunkban ismertetett anyagokból alakíthatjuk ki. Továbbá más, a mikrokapszulák területén már előzőleg alkalmazott burkolatokat például alginátot • ·

-17- ’

- célszerűen többértékű ionnal, például kalciumionnal térhálósított alginátot - is felhasználhatunk.

A burkolat közvetlenül térhálósítható a magrészt képező mátrixszá, s így egy közbenső összekötő réteg - például poli-L-lizin (PLL) - alkalmazása feleslegessé válik. A közbenső PLL réteg kiküszöbölése előnyös, mert az általános vélemény szerint a PLL fibrogén (rostképző) hatású. Továbbá, a találmány szerinti eszközben a burkolat permeabilitási szelektivitása jobban szabályozható, mint a PLL alkalmazásával készült eszközökben.

A makrokapszula egyidejű extruzióval vagy lépésenként alakítható ki. Az egyidejű extruzió olyan technológiai eljárásai, amelyek a találmány szerinti makrokapszulák képzésére alkalmazhatók, az 5 158 881 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásból ismertek. Az egyidejű (együttes) extruzió során a makrokapszulákat úgy alakítjuk ki, hogy egy beágyazott furatú extruziós hüvelyből együttesen extrudáljuk a magrészt és a körülvevő vagy perifériás övezetet alkotó anyagokat olyan körülmények között, amelyek a mátrix és a körülvevő vagy perifériás övezet (és a magrész) membrán-prekurzorának (prekurzorainak) géllé alakítására, keményítésére vagy öntésére megfelelők. Az együttes extruzió különös előnye abban áll, hogy a magrészben lévő sejteket a kapszula kialakításának pillanatától a magban izolálva tartja, s így biztosítja, hogy a maganyagok a kapszula beültetése előtti kezelése során nem szennyeződnek és nem károsodnak. Az együttes extruzió (koextruzió) eljárás további előnye annak biztosítása, hogy a körülvevő vagy perifériás övezet sejteket és más maganyagokat nem tartalmaz.

- 18 • · « • · · · • · · ···».

• · · · ·

A makrokapszulát több lépésben is kialakíthatjuk. így például, ha a kapszula előállításához az izolált sejteket tartalmazó, hidrogél magrészt használunk, akkor ez a magrész kialakítható elsőként, és a körülvevő vagy perifériás mátrixot vagy membránt ezt követően a magrésszel egyesíthetjük, vagy arra felvihetjük. Megfordítva, eljárhatunk úgy is, hogy a körülvevő vagy perifériás mátrixot vagy membránt képezzük előbb, majd ebbe töltjük az izolált sejteket tartalmazó, előre elkészített maganyagot vagy maganyagokat, (azaz a mag-előanyagokat, mag-prekurzorokat) amelyekből azután a magot formáljuk. A kapszulát olyan módon zárjuk le, hogy a maganyagok tökéletesen zárt állapotban legyenek. Ha prekurzor maganyagot alkalmazunk, akkor a makrokapszulát olyan körülmények hatásának tesszük ki, amelyek a magrész kialakulását eredményezik.

A körülvevő vagy perifériás övezetet úgy állítjuk elő, hogy előre meghatározott mérettartományú pórusai vagy üregei (hézagai) legyenek; ennek eredményeként a kapszula permszelektív. A körülvevő vagy perifériás övezet permeabilitását és biokompatibilitási jellemzőit (sajátságait) egyrészt a mátrix vagy membrán alkalmazott prekurzor-anyagai, másrészt azok a körülmények határozzák meg, amelyek között a mátrixot vagy membránt kialakítjuk.

Egy adott makrokapszula megválasztott molekulatömeg-mérethatárát annak a legnagyobb molekulájú anyagnak a molekulamérete határozza meg, amelynek a makrokapszulába vagy makrokapszulából végbemenő áthaladása megengedett. Egyes esetekben - amikor vírus felszabadulása nem jelent problémát - a makrokapszula pórusai olyan nagyok, amilyenek a sejteket még ···»

-19- .....

visszatartani képesek, azaz - a kapszulázott sejt típusától függően - körülbelül 0,1-10 pm méretűek lehetnek.

Üreges rostból álló membránok az MWCO értékek széles tartományával állíthatók elő különböző biológiai anyagok (hatóanyagok) kizárásának vagy felszabadításának a céljára, káros vírusok kapszulába való jelentősebb behatolásának vagy a kapszulából való jelentősebb kiszabadulásának gátlása mellett. Az MWCO érték változtatása többféle módszerrel valósítható meg. A membrán molekulatömeg-mérethatára változtatásának alapvető módszere abban áll, hogy membrán képzésére alkalmas oldatok és koaguláló fürdők adott készletének fáziselkülönülési sajátságait módosítják. A fáziselkülönülés termodinamikája minden

Λ egyes anyag/oldószer/ kombináció esetére különböző. Általában, minél hosszabb ideig tart a fázisinverzió folyamata (a fázisok megfordulása), annál nagyobb az így kapott membrán pórusmérete. Az adott, kiválasztott membránanyag befolyásolja az MWCO értékét. A polimer, oldószer és nem-szolvens közötti kölcsönhatások erőssége következtében az olyan, anyagból és oldószerből álló rendszerek, mint például: poli(szulfon)/N-metil-pirrolidon (NMP) vagy a poli(vinilidén-difluorid) (PVDF)/tetrahidrofurán (THF) könnyebben alakíthatók nagy MWCO értékű membránokká, mint például a poli(akrilnitril) (P AN)/dimetil-szulfoxid (DMSO) rendszer. Membránok permeabilitási sajátságait előre úgy választhatjuk meg, hogy megfelelő anyagrendszereket alkalmazunk. Ha például olyan rendszert alkalmazunk, ahol a polimer valamennyire oldódik a kicsapó folyadékban, akkor a fázisinverzió folyamata lényegesen lassúbbá válik.

- 20A membrán MWCO értékét befolyásolja továbbá kis molekulatömegű olyan segédanyag hozzáadása a membrán kialakítására (öntésére) alkalmazott oldathoz, amelyben a membrán fő polimerje nem oldódik (Cabasso, 1976). Kis molekulatömegű, nem oldódó segédanyagok a membránt kialakító oldat stabilitását csökkentik. Az ilyen oldatok fázisinverziója gyorsabb, és potenciálisan kisebb MWCO értékű membránokat eredményez. Megfordítva, magasabb molekulatömegű segédanyagok lassúbb fáziselkülönülést eredményezhetnek, és ennek következtében viszonylag nagy pórusok képződnek. Erre példa az az eset, amikor poli(akrilnitril-ko-vinil-klorid)-ot (PAN/PCV-t) elegyítünk nagy molekulatömegű (100 kD-nál nagyobb molekulatömegű) poli(etilén-oxid)-dal (PEO). Továbbá a membrán-mátrixból esetleg magasabb molekulatömegű vagy makroszkópos méretű segédanyagok diffundálhatnak kifelé, amelyek nagy pórusokat hagynak hátra.

A membrán így kapott molekulatömege is módosítható úgy, hogy mind a belső üregbe, mind a külső koaguláló oldatba a membrán-polimert oldó szert adunk. Oldószer hozzáadása lényegesen lassítja a kicsapódást, és ez sokkal nagyobb molekulatömeg-mérethatárú membránok kialakulásához vezethet.

Az MWCO értékét az is befolyásolhatja, ha a membránképzés folyamata alatt a hőmérsékletet változtatjuk. Az MWCO módosításának ezt a módszerét általában oldószer vagy nem-oldó szolvens hozzáadásával kombináljuk, mivel a hőmérséklet változtatása önmagában nem mindig módosítja az MWCO értékét, így például poliszulfont, PEG-200-at és NMP-t tartalmazó oldatok különböző MWCO értékű rostokká alakíthatók a koaguláló • · fürdő hőmérsékletének a szabályzása útján. Az ilyen kombinációt „alacsonyabb kritikus oldási hőmérsékletű rendszernek” (LCST) nevezik, amelyben az oldat stabilitása a hőmérséklet növekedésével csökken. így tehát magasabb hőmérséklet nagyobb MWCO értékekhez vezet. Az MWCO értékét úgy is módosíthatjuk, hogy a membránöntő és a koaguláló oldat hőmérsékletét a membránképzés során változtatjuk. A fentebb említett technológiai eljárások bármilyen kombinációja szintén felhasználható az MWCO megváltoztatására. így például az MWCO-t úgy is befolyásolhatjuk, hogy a hőmérséklet változtatását nagy vagy kis molekulatömegű segédanyag hozzáadásával kombináljuk.

A találmány egyes megvalósítási formáiban kialakított, mérsékelttől magas értékekig terjedő MWCO jellemzők következtében a kapott makrokapszulák permeabilitása nagy, és a kapszula külső falán át fokozott diffúzió megy végbe. A javított transzportsajátságok következtében a kapszulák az élő sejteket nagyobb sűrűségben hordozzák, mint az immunszigetelő (immunizoláló) kapszulák, amelyek MWCO értékei alacsonyabbak, hogy az iinplantátum (transzplantátum) befogadójának részéről az immunológiai kilökődést megelőzzék. A nagyobb sejtsűrűség az immunizoláló kapszulákhoz képest kisebb méretű eszközök (makrokapszulák) alkalmazását teszi lehetővé, mivel a találmány szerinti makrokapszulák térfogategységenként több terápiás anyagot biztosítanak. Az „immunizoláló (immunszigetelő) kapszula” fogalmán azt értjük, hogy a kapszula, permszelektivitása következtében a magvában lévő sejteket a beültetett makrokapszulát hordozó egyén immunrendszerétől megvédi. Ez azért válik lehetségessé, mert a tnakrokapszula meggátolja káros anyagok

-22behatolását az egyén szervezetéből a makrokapszulába, mert minimálissá teszi az érintkezést az egyén, valamint a magrészben esetleg jelenlévő gyulladást előidéző, antigén vagy egyéb káros anyagok között; valamint megfelelő térbeli barriert (gátat) alkot, amely az izolált sejtek és az egyén immunrendszere közötti immunológiai érintkezést meggátolja.

Az eltávolítás könnyítése céljából a makrokapszulák általában egy vagy több rögzítővel rendelkeznek, ami lehetővé teszi a makrokapszula elhelyezését és szilárd helybentartását annak megkárosítása nélkül. Ezen túlmenően a rögzítő felhasználható a beültetett makrokapszula felfedésére, ha a terápiát befejezni kívánjuk. A rögzítőket Aebischer és munkatársai módszere szerint állítjuk elő (lásd az egyidejű vizsgálat alatt álló US92/05369 számon közzétett, nemzetközi PCT bejelentést). A makrokapszulákat úgy is készíthetjük, hogy olyan anyagokat tartalmazzanak, amelyek elősegítik a képalkotást a makrokapszula célzott helyre való beültetésekor.

Ha a makrokapszulák olyan permszelektivitással rendelkeznek, hogy lényegében nem immunizoláló jellegűek, akkor a kapszulázásra szánt sejteknek a kívánt terápiával vagy funkcióval összeegyeztethetőknek kell lenniük. Ezek olyan sejtek, amelyek immunizolálással vagy anélkül eléggé hosszú ideig túlélők, s így a befogadó szervezet számára terápiás értékkel rendelkeznek. Általában a sejtek kiválasztása specifikus funkciók végzésére, valamint azok a módszerek, amelyek az implantátum túlélését biztosítják, és a sejtek életképességére vonatkozó más megfontolások - a sejtterápia körülményei között - azonosak a Gage és • · · munkatársai által az 5 082 670 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban kifejtett elvekkel.

Egyes esetekben lehetséges olyan sejtterápia kivitelezése, ahol a transzplantátum a befogadó szervezet saját sejtjeit tartalmazza (például daganat, endoteliális vagy epiteliális biopsziák). Alkalmazhatók a befogadó szervezettel szemben szingén sejtek is. Ilyen helyzetekben a makrokapszula által biztosított immunizolálás kevésbé lényeges. Ha azonban xenogén és/vagy allogén sejteket alkalmazunk, akkor ez immunszuppresszív módszereket igényel. Lokális immunszuppressziós módszereket ismertet Gruber [Transplantation 54, 1-1 1 (1992)], valamint Rossini (5 026 365 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás). Gruber idézett közleményében kifejti továbbá azokat a rekombináns módszereket, amelyek alkalmazásával dónorsejtek antigén jellege csökkenthető (összefoglalásokra és idézetekre vonatkozóan lásd Gruber fentebb idézett közleményét). Faustman a WO 92/04033 (1992) számon közzétett, nemzetközi PCT bejelentésben példákat ad meg transzplantátumok immunogén jellegének csökkentésére irányuló módszerekről a sejtfelület módosítása útján. Weiss a WO 93/14767 számon közzétett, nemzetközi PCT bejelentésben módszereket ismertet antigéntől mentesített sejtek előállítására célsejtekből. Sims a WO 93/02188 számon közzétett, nemzetközi PCT szabadalmi bejelentésben genetikailag módosított, univerzális dónorsejteket közöl.

Ha a kapszulázandó sejtek a befogadó szervezettel szemben xenogének, akkor az immunszuppresszió a legfontosabb követelmény. Általában olyan módszer alkalmazása szükséges, amellyel a kapszulázott sejtekre adott immunválasz csökkenthe

-24tő vagy kiküszöbölhető. Ezért a befogadó szervezetet gyakran iminunszuppresszív állapotba kell hozni immunszuppresszív hatóanyagok, például ciklosporin alkalmazásával vagy helyi immunszuppresszió útján lokálisan alkalmazott immunszuppresszív hatóanyagokkal. Egy más módon a sejtek immunogén jellege úgy is csökkenthető, hogy a sejteket redukált antigenitással bíró donorból - például módosított vagy delécióval módosított MHC antigénekkel rendelkező, transzgén állatokból - állítjuk elő.

Ha olyan sejteket használunk fel, amelyek a befogadó sejtjeivel szemben allogének, akkor a leggyakrabban szövettípus-meghatározást kell végeznünk, hogy a befogadó szöveti tűrőképességéhez legközelebb álló sejteket alkalmazzuk.

A beültetett sejtek életképességének biztosítására egyik lehetőség - az immunmodulációs módszerek - a sejtfelület módosítása, valamint általános és helyi immunszuppresszió - alternatívájaként a sejtek elhelyezése egy immunizoláló eszközön belül a permszelektív makrokapszula elhelyezése előtt. Megfelelő immunizoláló eszközök lehetnek például a mikrogömbök vagy az alginátból álló fonalak. Kimutatták, hogy az alginát hasznos immunizoláló szer (eszköz), ha kerülete mentén sejtmentes övezetet tartalmaz.

Sejtterápiás célokra a jelen találmány szerinti makrokapszulák terápiás szerekké tesznek egyes olyan sejteket is, amelyek jelenleg kapszula nélküli sejtterápiában nem alkalmazhatók, mivel e sejtek különlegesen hátrányos tulajdonsága, hogy káros vírusokat szórnak szét vagy nemkívánt helyváltoztató sajátságaik vannak.

• · a · • · · · ·*·♦ ·« ·· · · -25 Sejtterápiás módszerek esetében kívánatos a gazdaszervezet védelme olyan vírusoktól, amelyeket a dónorsejtek hordozhatnak. Gyakran alkalmazunk xenogén sejteket. Bár a xenogén szövetet előnyösen olyan állatcsoportokból vesszük, amelyek öröklési állományát és étrendjét gondosan ellenőriztük, a vírusszenynyezés mégis lehetséges. Jóllehet a legtöbb állati vírus emberekre nem jut át, számos olyan állatbetegség ismert, amely állatokról emberekre vírus útján átvihető. Szarvasmarháról emberre átvihető vírusok például: a szarvasmarha diaré-vírusa, a szarvasmarha orr-légcsőgyulladását előidéző fertőző vírus; a parainfluenza 3 vírus; a szarvasmarha adenovírus; a szarvasmarha-parvovírus; a szarvasmarha reovírus. A kapszulázó eszközök permeabilitását úgy szabhatjuk meg, hogy a gazdaszervezetet ezektől és más, a xenogén sejtekből esetleg felszabaduló hatóanyagoktól megvédjük.

A szövet még idegen szervezetből végzett átültetés esetén is kórokozókat tartalmazhat. Lehetséges ugyan számos káros anyag szűrővizsgálata, mindegyik azonban nem vizsgálható. HlV-mentes szövet például nem garantálható, mivel a vírus elleni antitestek általában csak a fertőzés után sok héttel jelennek meg. Az ilyen anyagok átvihetők és olyan makrokapszulák használata, amelyek a vírusok transzportját késleltetik, további biztonsági intézkedést jelentenek.

Kívánatos lehet továbbá védelem biztosítása a kapszulázott szövet számára fertőzött gazdaszervezettől származó vírushatással szemben. Jóllehet számos betegség nyilvánvalóan víruseredetű, más betegségek, így a multiplex szklerózis, izomsorvadásos laterális szklerózis és a szkizofrénia vírusos kóroktanát is e»««

-26feltételezték. A fertőzött gazdaszervezet sejtterápiásan úgy kezelhető, hogy az egészséges sejteket egy, a vírus átvitelét késleltető membránban kapszulázva tartjuk.

Az alábbi 1. táblázatban különböző betegségeket és kóros állapotokat sorolunk fel, ahol a találmány szerinti, permszelektív, makrokapszulás sejtterápiás módszerek alkalmazhatók, továbbá megadjuk azokat a megfelelő, terápiás hatású anyagokat is, amelyek a kapszulázott sejtekből felszabadulnak.

1. táblázat

A genetikailag módosított sejBetegség vagy kóros állapot tekből felszabaduló terápiás anyag

Leukémia

Kaposi-szarkóma

Hepatitisz B

Hepatitisz C

M.S.

Vesekarcinóma

Krónikus granulomatózis

Öröklött leukokémia

Vérzékenység (hemofilia)

B-sejtes limfóma

Autoimmun betegség

Izületi gyulladás a-interferon β-interferon γ-interferon a granulocita-kolóniát stimuláló faktor faktor VIII, faktor IX idiotipikus antitestek antitestet elválasztó sejtek

IIl-RA

-TI az 1. táblázat folytatása

Gaucher-betegség glükocerebrozidáz övekedett (magas) kolesz- makrofág kolóniát stimuláló

terinszint	faktor
Daganatok	daganatelhalási (tumor nekrózis) faktor
Koszorúérplasztika	tPA
Növekedési hormon hiánya	növekedési hormon
Idegsorvadás	idegsejt-szaporodási faktorok
Csont helyreállítása	morfogén csontpeptid

Mivel a vírusok igen változatos alakokban és méretekben léteznek, különböző vizsgálati módszerek alkalmazhatók annak meghatározására, hogy egy adott membrán egy adott vírussal szemben rendelkezik-e a kívánt tulajdonságokkal. A találmány olyan módszert nyújt rostok sajátságainak tesztelésére vírusokkal szemben, amelyekkel megközelítőleg megállapítható a vírus felszabadulásának sebessége beültetés után. Ez a módszer, mint ismert, vírusokra különösen érzékeny lemezre-oltási eljárás. Számos esetben az adott vírus közvetlenül tesztelhető úgy, hogy a rostnak az üregébe megadott koncentrációban vírust viszünk be, a rost végeit szorosan zárjuk, majd a rostot fürdőoldatba helyezzük. A fürdőoldat kívánt időközökben vizsgálható, és a vírustartalom standard lemezeljárással mérhető [B. Davis: Micro-28biology: Including Immunology and Molecular Genetics (Mikrobiológiai immunológia és molekuláris genetika), 3. kiadás, Harper & Row (1980)]. Olyan esetekben (például kórokozó vírusok eseteiben), ahol a vírus közvetlen tesztelése nemkívánt, a kérdéses vírus modelljét alkalmazhatjuk. Vírusjellegük következtében a vírus méreteihez hasonló bakteriofágok hasznos modellek lehetnek. Számos fágféleség kapható az ATCC gyűjteményből, ezek felsorolása megtalálható a következő helyen: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (A molekuláris klónozás laboratóriumi kézikönyve; J. Sambrook és munkatársai, Colg Spring Harbor Laboratory Press, 1989). A célbaktérium fertőzésére egyetlen vírus is elegendő. A vírus replikációja megindul, és a vírus a környező baktériumok irányában felszabadul. Ennek következtében egy baktériumrétegen kialakuló plakk segítségével nagyon csekély mennyiségű vírus azonosítható.

A 2. táblázatban néhány jellegzetes, állati vírus méretét tüntetjük fel. Ezek mérettartománya 18-26 nm a parvovírusok, és 150-300 nm a paramyxo (parainfluenza) vírusok körében.

2. táblázat

Víruscsalád	Vírus	Átmérő (nm)
Parvoviridae	Parvo	18-26
(DNS)
Adenoviridae	Adeno	70-90
(DNS)
Picornaviridae	Rhino	24-30
(RNS)
Reoviridae	Reo	75
(RNS)
Orthomyxoviridae	Influenza	80-120
(RNS)
Paramyxoviridae	Paramyxo	150-300
(RNS)	(parainfluenza)
Retroviridae	oncovirus C, B, D típus	-100

A 3. táblázatban különböző jelzőanyagok és vírusok molekulatömegét, Stokes-sugarát és diffuzivitását szemléltetjük.

3. táblázat

Jelzőanyag	Molekulatömeg (g/mol)	Stokes-sugár (angström)	Diffuzivitás vízben, 37 °C-on
(cm i	^zsec)
Glükóz	186	-3,5	9,24 x	10^-6
B₁₂ vitamin	1300	-7,7	5,00 x	10'⁶
Citokróm C	13400	16,5	1,78 x	10'⁶
Mioglobin	16900	15,2	1,57 x	10’⁶
a-Kimotripszinogén	24500	22,5	1,44 x	10'⁶
Ovalbumin	43500	27,6	1,02 x	10’⁶
BSA (szarvasmarha-szé-	67000	36,1	9,64 x	10’⁷
rumalbumin)
IgG	155000	51,3	6,29 x	10’⁷
Apoferritin	440000	59,3	6,11 x	10’⁷
Parvovirus		-180	-2,4 x	10’⁷
Orthomyxoviridae		- 1200	-3,8 x	10‘⁸

Mivel egy membrán nMWCO értéke az ultraszűrő mérettől a mikroporózus tartományig növekedik, fokozódik a vírus áthaladásának valószínűsége a membránon, a koncentrációnak mint hajtóerőnek az eredményeként. A membránon át végbemenő behatolásnak a képessége a vírusrészecske jellemző méretének és a vírus alakjának a függvénye. Az 1. ábra egy fágnak két, különböző nMWCO értékkel rendelkező membránon végbemenő áthaladása diffúziójának logaritmikus csökkenését mutatja. Egy

- 31 100 kD nMWCO értékű (0,002 pm pórusméretű) ultraszűrő PAN/PVC 440 kD molekulatömegig terjedő részecskék számára teljesen átjárható (permeábilis), ha 2 héten át állni hagyjuk. Ugyanez a membrán viszont a phiX174 fág (23 nm) áthaladását logaritmus 9-es értékkel csökkenti 2 hét állás után. Ez a csökkenés még 6 héten túl is lóg 12-re növekszik a lambda GF-10 fág esetében (amelynek fejmérete 95 nm x 65 nm, farokmérete 115 nm x 17 nm). Ha a membrán nMWCO értékét a mikroporózus tartományra növeljük - ilyen például egy 0,1 pm molekulatömeg-mérethatárú, poliszulfon membrán - akkor a phiX174 logaritmikus csökkenése 3 nap eltelte után megszűnik, és a lambda GT10 fág áthaladása 6 hét múlva lóg 6 rendűre csökken.

A membránon át végbemenő behatolás meghatározásában a teljes méreten kívül a vírus alakja is lényeges. Az Ml3 fág (mérete 5 nm x 200 nm) áthaladását egy ultraszűrő membrán teljesen meggátolja (2 hét után 14 a logaritmikus csökkenés). Feltételezhető, hogy a vírus térbeli kialakulása következtében például hosszú, hajlékony vírusrészecskék beilleszkedhetnek a membrán pórusaiba, és ennek következtében a logaritmikus csökkenés nagyobb mint ami csupán a vírus mérete alapján várható. A membrán sajátságainak az adott vírus tulajdonságaival való összeegyeztetése - különösen a méret, alak és flexibilitás szempontából - lehetővé teszi vírusméretű részecskék szelektív visszatartását.

A rostok pórusméretének jellemzésére fehérjék és dextránok részecske-mérettartományának konvektiv MWCO adatait használuk. Valamennyi rosttétel MWCO értéke egy hüvelyben elhelyezett rostkötegen mérhető. A hüvely szerkezete üreges, cső- 32 szerű, végei zártak. A rostokat a hüvely végein át fektetjük, majd a hüvely végeit zárjuk. A fehérje MWCO teszt során egy fehérjeoldatot (szarvasmarha-szérumalbumin, immunglobulin G, mioglobin) 34 kPa membránon túli (transzmembrán) nyomás alatt ultraszűrésnek vetünk alá. A tartóedényben, illetve a szűrletben lévő fehérje koncentrációját spektrofotométerrel mérjük, és a visszatartási (megtartási) koefficienst (R) az R = 1 · Cf/Cr hányadosból számítjuk ki, ahol Cf a fehérje konentrációja a szűrletben, és Cr a fehérje koncentrációja a tartóedényben.

A konvektív dextrán MWCO próba (teszt) a diffúziós fehérje MWCO próbától abban különbözik, hogy a szűrlet térfogatos áramlási sebességét és a visszatartott rész térfogatos áramlási sebességét ellenőrizzük. A dextránpróba reagense polidiszperz oldat, amelyben a molekulatömeg 2000 g/mol-tól 4000000 g/mol értékig változik (beszerezhető a Pharmacia cégtől). A dextránkoncentrációt egy molekulatömeg-tartományban mérjük mind a tartóedényben, mind a szűrletben géláteresztő kromatográfia útján. A visszatartási koefficienseket - mint a dextrán sugarának függvényét - a szűrlet koncentrációjának a tartóedény koncentrációjához viszonyított arányából számítjuk ki. így elkészíthetjük a teljes visszatartási profilt, vagy megadhatjuk a dextránrészecske azon sugarát, amelynek visszatartása 20%, 50%, illetve 90%.

A sejtterápiás alkalmazásokon kívül a permszelektív makrókapszulák felhasználhatók polimer implantátumok - például biológiai körülmények között erodálható (leépülő), terápiásán hasznos anyagokat tartalmazó polimerek - megtartására. Az ilyen implantátumok hordozó nélkül rideggé és törékennyé válhatnak;

továbbá kapszulás hordozó nélkül a beültetés után esetleg nehézkesen távolíthatók el. Mivel az erodálható polimerek leépülnek, és céltermékeiket felszabadítják, ezek elmozdulhatnak, és nem célzott helyekre kerülhetnek. A mikroporózus makrokapszulák a polimer szállító rendszerek számára a biztonság, eltávolithatóság és szöveti biokompatibilitás további előnyeit biztosítják.

A következő példákat részletesen leírjuk a találmány teljesebb megértése érdekében. Nyilvánvaló, hogy ezek a példák csupán a szemléltetést szolgálják, és a találmány oltalmi körét semmiképpen sem korlátozzák.

1. példa

Allogén, magzati agyszövet beültetése

Mikroporózus rostokat állítunk elő úgy, hogy 10% poli(etilén-oxid)-ot [molekulatömege (röviden: MW) 100 K], 10%

PAN/PVC-t (MW = 100 K) és 80 tömeg% dimetil-formamidot tartalmazó oldatot extrudálunk egy koaxiális extruziós hüvely (fúvóka) külső lumenén keresztül. Koagulálás céljára vizet alkalmazunk, amelyet a hüvely centrális furatán át a polimerrel együtt extrudálunk. Az így kapott rostok nMWCO értéke 2000 kD. A rost belső átmérője 0,8 mm, külső átmérője 1 mm.

A magzati agyszövetet Tresco és munkatársai módszerével állítjuk elő [Society fór Neuroscience Abstracts 18, 393.2 (1992)]. A szövetet, mint szaporodó szubsztrátumot Matrigel (Collaborative Research) jelenlétében a rostokba helyezzük, és a szövet elkülönítésétől számított három órán belül érett, egészséges, hím Sprague Dawley patkányok striatumába (corpus striatum, csikóit test) ültetjük. A patkányokat két hét (állatszám 3), illetve négy hét (állatszám 4) múlva megöljük, és az implan-34 tátumokat szövettanilag elemezzük. Két, illetve négy hét után olyan élő sejtek vannak jelen, amelyek alaktani fenotípusai az in vitro körülmények között tartott, és azonos időben izolált tenyészetekhez hasonlók.

Egyes sejtek festödése tirozin-hidroxilázra pozitívnak mutatkozott, ami arra utal, hogy in vivő körülmények között az idegsejtek túlélése legalább négy hétig kitart.

2. példa

Makrokapszulák előállítása kis molekulatömegű adalékok alkalmazásával

Az alábbi kialakító (öntő) oldatokat készítjük az üreges rostok céljára:

Az 1. oldat összetétele: 12,5% PAN/PVC, 50,5% polietilénglikol (MW 200) (PEG 200) és 37,5% N-metil-pirrolidon (NMP). A PEG 200 kis molekulatömegű adalék, amelyben a PAN/PVC nem oldódik. Szobahőmérsékleten az oldat homogén gélt képez. Az öntőoldatot 50 °C-ra melegítjük, és fázisinverziót végzünk egy környezeti hőmérsékleten tartott fürdőoldatban. így olyan polimert kapunk, amelynek nMWCO értéke megközelítőleg 120 kD. Ha az üreges rostot PEG 200 adalék nélküli oldatból készítjük, akkor nMWCO értéke körülbelül 80 kD.

A 2. oldat 13% PAN/PVC-t, 15% glicerint és NMP-t tartalmaz. Szobahőmérsékleten szilárd, készítését a fentebb leírt módon végezzük. így olyan membránokat kapunk, amelyek nMWCO értéke körülbelül 200 kD-tól a mikroporózus tartományig, sőt a sejtek számára átjárható tartományig terjed.

• ·

- 35 - - · ·

3. példa

Makrokapszulák előállítása a furatban és a fürdőben oldószer hozzáadásával

12,5% PAN/PVC-t és 87,5% NMP-t tartalmazó oldatot állítun elő. Ha ezt az oldatot vízben koaguláltatjuk, akkor standard ultraszűrő membránt kapunk. Ha ugyanezt az oldatot oldószer és víz keverékével csapjuk ki, akkor az MWCO érték nagy mértékben az ultraszűrő tartomány felső határáig (200 kD) növekedik.

4. példa

Immunizolált sejtek eltávolítása alginát-fonalak segítségével

Emberi hasnyálmirigyekből Scharp és munkatársai módszerével (lásd a 4 868 121 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást) a hasnyálmirigy-szigetekből (szigetrészekből) steril szuszpenziót állítunk elő. Továbbá, steril körülmények között nátrium-alginátból fiziológiás konyhasóoldattal (rövidítve PS, koncentrációja 150 mM NaCl) 2%-os oldatot állítunk elő, amelyet a preparált sejtekkel 1:1 arányban hígítunk úgy, hogy a szigetsejtek szuszpenziójában az alginát végkoncentrációja 1%.

Sejtmentes kerületi tartománnyal körülvett, emberi hasnyálmirigy-szigeteket tartalmazó, 1,0 mm méretű hengeralakú alginát-” fonalakat” (1,0 tömeg% alginát, Pronova^R) az alábbi módon állítunk elő. A szigeteket tartalmazó szuszpenziót olyan kettős furatú koextrudáló berendezés belső kamrájába töltjük (ennek kialakítását az egyidejű vizsgálat alatt álló, 07/461 999 számú Egyesült Allamok-beli szabadalmi bejelentés közli), amelynek belső furata 500 mikron átmérőjű, perifériás furata 600 mikron • ·

- 36- ’* ' * átmérőjű. A berendezés külső kamrájába steril, fiziológiás konyhasóoldattal készített 1%-os nátrium-alginát-oldatot töltünk.

A hüvely (fúvóka) végét steril, fiziológiás konyhasóoldattal készült 1%-os kalcium-klorid-oldatot tartalmazó fürdőbe mártjuk, ez az alginát-poliionok térhálósodása következtében az alginátot keményíti vagy gélesíti. A kamrába töltött anyagokat ebbe a fürdőbe egyidejűleg extrudáljuk (koextrudáljuk), s így olyan folytonos alginát-hengert alakítunk ki, amely egy alginát-matrixon immobilizált szigetrészeket tartalmazó magrészből és egy szigetrészektől mentes alginát-matrixot tartalmazó, körülvevő tartományból áll. A burkolat külső átmérője 1,2 mm. A mag belső átmérője 1,0-1,05 mm. A magrész szigetektől elfoglalt össztérfogata 0,8 mm (200 sziget). A magrész össztérfogata 25,98 mm³. A szigetek térfogata a mag össztérfogatának 3%-a. A magrész alginátja a burkolat alginátjával térhálósított.

A körülvevő tartomány relatív vastagságát úgy módosítjuk, hogy szabályozzuk azokat a sebességeket, amelyekkel az anyagokat a hüvely központi és perifériás furataiból extrudáljuk. Általában a központi furatban az áramlási sebesség növekedésével a falvastagság csökken. A perifériás furatban az áramlási sebesség növekedése a falvastagság növekedésével jár. Mind a központi furatban, mind a perifériás furatban azonos tartományú áramlási sebességeket (0,3-1,5 ml/perc) alkalmazunk. A henger végeit úgy zárjuk le, hogy a hengert előbb steril, 2%-os nátrium-alginát-fürdöbe, majd utána steril, 1%-os kalcium-klorid-fürdőbe mártjuk. Az így kialakított makrokapszulákat a beültetés előtt steril szövettenyészetet tartalmazó közegben tartjuk.

- 37 • « · · • · · · · *· ····· · • · · · ·

A szigeteket tartalmazó „fonalakat” 2 cm hosszúságú darabokra vágjuk steril szikével, 1,5 mm belső átmérőjű PEO/PAN/PVC kapszulákba töltjük, és cukorbeteg befogadó (recipiens) szervezetekbe szubkután úton beültetjük.

Négy hét eltelte után a kapszulákat eltávolítju k, és a szigetek életképességét meghatározzuk.

5. példa

Immunizolált sejtek eltávolítása mikroszférák (mikrogömbök) útján

Élő sejteket tartalmazó mikroszférákat (mikrogömböket) kétféle módszerrel állítunk elő. PC12 sejteket tartalmazó, hőképlékeny mikroszférákat Sefton módszerével készítünk (lásd a 4 353 888 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást). Alginát/polilizin mikroszférákat Lim módszerével készítünk (lásd a 4 352 883 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást). A mikroszférák átmérője egyik esetben sem nagyobb 500 pm-nél. A mikroszférákat az 1. példában leírt, hőképlékeny visszatartó eszközökbe töltjük. Valamennyi eszközt megvizsgáljuk, hogy névleges MWCO értéke a 200 kD-t meghaladja-e.

A PC12 sejteket tartalmazó makrokapszulákat patkányok striatumába ültetjük, és két hétig ott tartjuk. Ekkor a makrokapszulákat eltávolítjuk, a fibrómás túlburjánzást megvizsgáljuk, és kiértékeljük a sejtek életképességét.

6. példa

Mellékvese kromaffin sejtjeinek a beültetése

Az emberi mellékveséből származó kromaffin sejteket emberi tetemekből állítjuk elő Ságén módszerével (lásd a 4 753 635 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást), és azokat az 1.

·♦ · ·

- 38 - ......

példában leírt eljárással előállított, permszelektív makrokapszulákba helyezzük. A kapszulákat a gerincvelő burkába krónikus fájdalmaktól szenvedő egyének ágyéki területeire ültetjük. Három hét múlva a kapszulákat eltávolítottuk, épségben találtuk; élő sejteket tartalmaztak.

7, példa

A bakteriofág-visszatartó képesség vizsgálata

Tesztet dolgoztunk ki lambda gtlO fág transzportja késleltetésének a meghatározására PAN/PVC membrán segítségével. Ezt a fágot modellrendszer céljára választottuk, hogy hasonló méretű vagy nagyobb, állati vírusok kapszulázásának az esetére a fluxus késleltetését jósolhassuk. Három különböző rostot vizsgáltunk, amint ezt a 4. táblázat mutatja.

4. táblázat

A membrán típusa	A membrán anyaga	Pórusméret (mm)	Hártya	Belső átmérő (mm)	Falvastagság (mm)
Ultraszűrő	PAN/PVC	-0,01^a	kettős	0,779	0,097
Ultraszűrő	PAN/PVC	-0,01^a	egyszeres	0,682	0,086
Mikroporózus	Poliszulfon	0,2	nincsen	0,948	0,029
^a megfelel 100	kD nominális	MWCO	értéknek.

A lambda gtlO fág törzseket NM514 (az ATCC gyűjteményből származó E. coli) rétegeken növesztettük. A kiválasztott lemezeket 5 ml SM pufferoldattal rekonstruáltuk (ezek előállítását J. Sambrook és munkatársai fentebb idézett közleménye sze ·♦ · ·

-39- ......

rint állítottuk elő). A lemezeket 4 órán át enyhén rázattuk, a folyadékot centrifugacsőbe pipettáztuk, és 100 μΐ kloroformot adtunk hozzá. Egy órás inkubálás után a törzset 3700 rpm (percenkénti fordulatszám) sebességgel centrifugáltuk, és a felülúszót kinyertük. A rostba töltés előtt a fág titerét meghatároztuk.

Az NM514-et 0,2% maltózzal kiegészítettük NZCYM közegben 2 optikai sűrűség (OD) értékig szaporítottuk. Az OD érték elérése után a baktériumokat 3700 rpm sebességgel centrifugáltuk, és steril vízzel készült, 10 mM koncentrációjú magnézium-szulfát-oldattal 37 °C hőmérsékletű fürdőben a pellet teljes szuszpendálásáig rázattuk.

A vizsgáló (tesztelő) eszközünk 12 cm hosszúságú hüvely, belső térfogata 9 ml, amelyet SM közeggel töltünk meg (2. ábra). A vizsgáló töltet kúpos, apa-típusú fedeleibe két vagy három rostot ágyazunk 5 percen epoxi alkalmazásával. A rostokat az eszközbe ágyazzuk, utána glicerinmentesítjük úgy, hogy a rostoknak százszoros térfogatában vett Milli-Q vízzel ultraszűrjük. A PAN/PVC rostokat úgy kondicionáljuk, hogy a rostokra számítva kétszeres térfogatban vett HL1 közeget a rostokon ultraszűrjük. Ez a kezelés szimulálja a sejtek kapszulázására alkalmazott töltési körülményeket. A membránok pórusméretét a membrán felületén végbemenő fehérjeadszorpció csökkenti. Ezzel ellentétben nem-kondicionált poliszulfonból álló, mikroporózus rostokat alkalmazunk a fág diffúziója növekedésének kiértékelésére a membrán pórusméretének növelésétől függően. A rost bakteriofággal való töltését úgy valósítjuk meg, hogy a rost lumenébe a fedélen keresztül 1 ml űrméretű, egyszeri használatú fecskendővel 0,1 ml bakteriofágtörzset fecskendezünk.

-40• · « Λ • · · · * • ·· ····« · * · · · · ·

A rostok beágyazása és kondicionálása után a hüvelyt tartalmazó fürdőt friss SM pufferoldattal cseréljük. Ezután a rostokat töltjük, és a rost végeit fedjük, majd az eszközöket 37 °C hőmérsékletű inkubátorba helyezzük. A fürdőkből 1, 3, illetve 6 hét múlva mintákat veszünk, és standard plakk-képző eljárással meghatározzuk a bakteriofág koncentrációját.

Eredmények

Az 5. táblázatban mutatjuk be a fág koncentrációját és a ^membrán értékeit zérus időpontban és 6 hét eltelte után.

5. táblázat

A Lambda gtlO megoszlása

Kezelés		Fág-koncentráció (pfu/ml)
Töltet	Lumenbán a 0. héten	Lumenbán 6 hét után	Fürdőben 6 hét után	^membrán
HL-l-vel kondiéi-	1	1,0el5	2,0el 1	10	7xl0'²³
onált PAN/PVC	2	1,0el5	2,0e9	10	7x10 ²³
kettős hártya
HL-l-vel kondiéi-	1	1,0e 1 5	2el0	10	7x10 ²³
onált PAN/PVC	2	1,0e 1 5	3e9	le3	8x10 ²¹
egyszeres hártya	3	1,0e 15	2el 1	4e5	3xl0'¹⁶
Nem kondicionált	1	1,0e 15	6el0	lel	5x 1 0'¹⁶
poliszul fon	2	1,0e 1 5	5el0	5e7	3,8xl0¹⁶
	3	1,0el5	lelO	8e7	6x10’¹⁶

• ·

-41 A fág-koncentráció lumenban és a 6 hétig tartott fürdőben megfigyelt koncentrációinak a különbsége világosan mutatja, hogy a membrán a fágnak fürdő irányában végbemenő diffúzióját jelentős mértékben gátolta. A kapszulázás után 6 héttel a fág összes aktivitása csökkent. A kontrollok jelezték, hogy a 37 °C hőmérsékleten tartott fágtörzs magas koncentrációjú értéke (1 x 10 pfu/ml) és alacsony koncentrációjú értéke (1 x 10 pfu/ml) 6 hét után állandósult. Ha a fág a membránfelületeken adszorbeálódott, akkor ez indokolta az aktivitásnak a mért csökkenését 6 hét után. Ennek alapján a fág 6 hét után mutatott viszszatartását (retencióját) kétféle módon számítottuk:

(A) a kapszulákba töltött fág összmennyiségét osztottuk a fág 6 hét eltelte után a fürdőben mért összkoncentrációjával; vagy (B) a kapszula lumenében 6 hét után jelenlévő fág összes menynyiségét osztottuk a 6 héten át tartott fürdő fág-koncentrációjával.

A 6. táblázat mutatja a fág diffúziója számított, logaritmikus csökkenésének az értékeit.

• ·

6. táblázat

A fág diffúziójának logaritmikus csökkenése*¹

Kezelés	Logaritmikus csökkenés
Töltet	„A” módszer „B” módszer
HL-l-vel kondicionált	1	9	12
PAN/PVC	2	7	12
kettős hártya
HL-l-vel kondicionált	1	7	10
PAN/PVC	2	8	10
egyszeres hártya	3	6	12
Nem kondicionált	1	3	8
poliszulfon	2	3	6
	3	3	6

^a „A” módszer: a logaritmikus csökkenés = lumen-koncentráció hét után osztva a fürdő 6 hét utáni koncentrációjával „B” módszer: logaritmikus csökkenés = lumen-koncentráció a

0. héten/100 osztva a fürdő 6 hét utáni koncentrációjával

Mivel a vizsgált lambda gtlö átlagos fejmérete 95 x 65 nm és farokrészének átlagos mérete 17 x 115 nm, e kísérlet eredményei szerint a PAN/PVC membránok képesek olyan káros anyagok (hatóanyagok) visszatartására, amelyek mérete a 95 nm-nél legalább hat nagyságrenddel nagyobb.

• « · ·

8. példa

A φ-Χ fágot visszatartó képesség vizsgálata

A φ-Χ fág transzportja késleltetésének meghatározására a 7. példában leírt membrántípusokat és módszereket alkalmaztuk. Ez a fág körülbelül 24-30 nm átmérőjű, lényegében gömbalakú. A PAN/PVC ultraszűrő membránt PC1 közeggel előkondicionáljuk, a poliszulfonból álló mikroporózus rostot nem kezeljük. A mintákat a mikroporózus rost esetében 3 nap múlva, az ultraszűrő rost esetében 1, illetve 2 hét múlva vesszük ki. Az SM közeg helyett LB közeget használunk (amelyet J. Sambrook és munkatársai fentebb idézett közleménye szerint állítunk elő). A φ-Χ törzs transzportjának logaritmikus csökkenése rövidebb idő alatt kisebb, mint amelyet a nagyobb méretű lambda gtlO fág esetében mértünk (vesd össze a 6. és 5. táblázatokat).

7. táblázat

A fág diffúziójának a logaritmikus csökkenése³

Kezelés	Logaritmikus csökkenés
Töltet	Idő	„A” módszer	„B” módszer
1	2 hét	4	9
2	2 hét	7	10
3	1 hét	6	9
4	3 nap		1
5	3 nap		1
6	3 nap		1

1., 2. és 3. töltetek: PC1 közeggel kondicionált PAN/PVC

4., 5. és 6. töltetek: kezeletlen poliszulfonrostok »♦ *β

9, példa

A fehérjevisszatartó képesség vizsgálata

A 7. példában vizsgált rostokat továbbá úgy is jellemeztük, hogy megmértük több standard fehérje, valamint polidiszperz dextránok keveréke visszatartásának a százalékos értékét. A fehérjék visszatartási értékeit a 8. táblázatban, a polidiszperz dextránok visszatartási értékeit a 3. és 4. ábrában mutatjuk be.

8. táblázat

Rost	Fehérje	Visszatartás (%)
HL-l-vel kondicionált	Szarvasmarha-szérum-	96,2
PAN/PVC	albumin
kettős hártya	Ovalbumin	60
	Mioglobin	26

HL-l-vel kondicionált

Szarvasmarha-szérum90

PAN/PVC albumin egyszeres hártya

Ovalbumin

A leírásban szereplő valamennyi dokumentumot kifejezetten hivatkozásként foglaltuk leírásunkba.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Beültethető, permszelektív (permeabilitás szempontjából szelektív), sejtterápiára alkalmazható makrokapszula, amely (a) egy magrészből - amely megválasztott, biológiailag aktív termék elválasztására vagy megválasztott biológiai funkció teljesítésére képes, élő sejteket tartalmaz - és (b) a magrészt körülvevő, külső burkolatból áll, amely burkolat sejtektől lényegében mentes, biokompatibilis (biológiailag összeegyeztethető) anyagot tartalmaz, és amely burkolat névleges molekulatömeg-mérethatára a sejteknek makrokapszulán belüli visszatartására megfelelő.
2. Az 1. igénypont szerinti permszelektív makrokapszula, ahol a magrész kiegészítőleg hidrogél mátrixot is tartalmaz, és az élő sejtek a mátrix által immobilizált állapotban vannak.
3. Az 1. igénypont szerinti permszelektív makrokapszula, ahol a biokompatibilis anyag hidrogélekből áll.
4. A 2. igénypont szerinti permszelektív makrokapszula, ahol a magrész és a biokompatibilis anyagok azonos hidrogélből állnak.
5. Az 1. igénypont szerinti permszelektív makrokapszula, ahol a biokompatibilis anyag többértékű ionnal térhálósított alginátból áll.
6. Az 1. igénypont szerinti permszelektív makrokapszula, ahol a biokompatibilis anyag egy hőre lágyuló membránból áll.
7. Az 1. igénypont szerinti permszelektív makrokapszula, ahol a külső burkolat névleges molekulatömeg-mérethatára körülbelül 440 kD értéknél nagyobb.

-46• · · · _ · . ’ · · · • * · · ··«· · ·* ·· · 4
8. A 7. igénypont szerinti permszelektív makrokapszula, ahol a névleges molekulatömeg-mérethatár körülbelül 1000 kD és körülbelül 3000 kD között van.
9. Az 1. igénypont szerinti permszelektív makrokapszula, ahol a külső burkolat névleges molekulatömeg-mérethatára kisebb, mint azoknak a káros vírusoknak a molekulatömege, amelyek az élő sejtekből szétszóródhatnak.
10. Az 1. igénypont szerinti permszelektív makrokapszula, ahol az élő sejtek vírussal genetikailag módosítottak, és a névleges molekulatömeg-mérethatár a vírus molekulatömegénél kisebb.
11. A 10. igénypont szerinti permszelektív makrokapszula, ahol a külső burkolat vírusvisszatartó képességének értéke körülbelül 10’²-nél kisebb.
12. Az 1. igénypont szerinti permszelektív makrokapszula, amely továbbá (c) a makrokapszula eltávolítására alkalmas tartót is tartalmaz.
13. Az 1. igénypont szerinti permszelektív makrokapszula, ahol a magrész kiegészítőleg immunizoláló eszközöket is tartalmaz, amelyekben az élő sejtek kapszulázva vannak.
14. A 13. igénypont szerinti permszelektív makrokapszula, ahol az immunizoláló eszközök mikroszférákból vagy alginát-fonalakból állnak.
15. Beültethető makrokapszula terápiásán alkalmazható terméknek adagolására egy befogadó szervezet számára, amely makrokapszula ···· ν«·· · (a) egy magrészből - amely a megválasztott, terápiásán alkalmazható termék elválasztására képes polimer implantátumot tartalmaz - és (b) egy külső, a magrészt körülvevő burkolatból áll, amely burkolat biokompatibilis anyagból kialakított, és névleges molekulatömeg-mérethatára lehetővé teszi a megválasztott, terápiásán alkalmazható termék elválasztását.
16. Eljárás beültethető permszelektív makrokapszula külső burkolata vírusvisszatartó képességének a meghatározására, ahol a burkolat felső és alsó végződéssel rendelkező, üreges rostból áll, azzal jellemezve, hogy az üreges rostot a vírussal töltjük, a felső és alsó végződéseket lezárjuk, a burkolatot fürdőoldatba helyezzük, a fürdőoldattal egy, a vírussal szemben érzékeny baktériumréteget beoltunk, majd a vírusvisszatartó képességet a baktériumrétegen kialakult plakkok számának az alapján kiszámítjuk.