DE69332149T2

DE69332149T2 - MIKROPORöSE MAKROKAPSELN

Info

Publication number: DE69332149T2
Application number: DE69332149T
Authority: DE
Inventors: J. Doherty; Thomas Flanagan; T. Gentile; Tyrone Hazlett; Laura Holland; David Rein; A. Tresco
Original assignee: Brown University Research Foundation Inc
Current assignee: Brown University Research Foundation Inc
Priority date: 1992-11-16
Filing date: 1993-11-16
Publication date: 2003-02-27
Anticipated expiration: 2013-11-17
Also published as: DE69332149D1; EP0674497A1; NZ258720A; CA2149420C; FI952322A7; LV10906B; ATE220883T1; CA2149420A1; WO1994010950A1; AU5671394A; HU9501426D0; FI952322L; AU687371B2; KR950703910A; PT674497E; LV10906A; ES2179839T3; PL309012A1; BR9307455A; SK62495A3

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist auf Makrokapseln und deren Verwendung als Implantations- und Wiederauffindungs-Vorrichtungen für Zellen gerichtet.
Die Verfahren zur Implantation lebender Zellen und oder Gewebe in den Körper, um therapeutisch nützliche Substanzen (Zelltherapie) bereitzustellen, stellen gegenwärtig das Hauptinteresse vieler Forschungsbemühungen dar. U.a. wurden therapeutische Anwendungen für die Zelltherapie in den Bereichen von Diabetes und neuralen degenerativen Krankheiten, wie die Alzheimer- Krankheit, Parkinsonsche Krankheit und Epilepsie vorgeschlagen. Außerdem wurde gezeigt, dass Zellen ein großes therapeutisches Potential zur Entfernung schädlicher Substanzen aus dem Körper haben. Zum Beispiel wurden Hepatozyten zur Behandlung hoher Cholesterinspiegel implantiert, wie von Wang et al., Transplantation Proceedings, 23: 894-895 (1991) gezeigt.
In einer Form von Zelltherapie wurden die Zellen, die in den Patienten implantiert werden, in vitro mit exogenem genetischem Material genetisch modifiziert (transduziert), um zu ermöglichen, dass die Zellen eine gewünschte biologische Substanz erzeugen, welche als ein therapeutisches Mittel nützlich ist. Es gibt verschiedene Mechanismen für die Transduktion von Zeilen. Retrovirale Vektoren waren auf Grund der Fähigkeit mancher Vektoren, eine sehr hohe Prozentzahl an Targetzellen zu transduzieren, von Interesse. Eine Replikation von Targetzellen ist notwendig, damit eine provirale Integration unter Verwendung dieser Vektoren auftritt. In der Theorie sind mit Retroviren transduzierte Zellen nicht in der Lage, einen Virus auf andere Zellen auszubreiten. Jedoch sind mit der Verwendung dieser Systeme einige Sicherheitsprobleme verbunden. Risiken schließen die mögliche Kontamination während der Herstellung der retroviralen Vektor-Präparationen mit infektiösen Viren oder Pathogenen ein (Cornetta, Human Gene Therapy Vol. 2: 5-14, 1991).
Adenoviren werden auch als Gentransfervektoren verwendet. Dies sind doppelsträngige DNA-Viren, welche postmitotische Zellen infizieren können, und ihre erfolgreiche Transfektion von Wirtszellen kann zur Expression großer Mengen an Genprodukt führen. Adenoviren sind unbedeutende Krankheitserreger in Menschen und werden normalerweise nicht mit Malignität in Verbindung gebracht. Während der Adenovirus-Vektor im Allgemeinen episomal bleibt und keiner Replikation unterliegt, haben Studien gezeigt, dass eine Genexpression für eine beträchtliche Zeitdauer andauern kann, was die Möglichkeit eröffnet, dass die Vektoren zumindest replikationsfähig sind.
Während gegenwärtige Zelltherapie-Verfahren ein großes therapeutisches Potential zeigen, weisen sie einige Einschränkungen auf. Die Injektion von Zellen in einen Patienten kann zu einer starken Immunreaktion führen. Eine Immunreaktion auf eine erste Injektion von Zellen wird höchstwahrscheinlich eine zweite Injektion ausschließen, womit der Nutzen, der durch eine solche Behandlung erhalten werden kann, eingeschränkt wird. Manche möglichen Zelltypen können Viruspartikel abgeben, welche schädlich für den Wirt sein können, und daher nicht als für die Implantation geeignet angesehen werden können. Im Fall von Zellen, die unter Verwendung viraler Techniken genetisch modifiziert wurden, um eine gewünschte biologische Substanz zu erzeugen, können die Zellen virale Partikel tragen, wodurch die Zellen eines Patienten infiziert werden können. Ein weiterer Nachteil der gegenwärtigen Zelltherapie- Verfahren ist, dass bekannt ist, dass viele Zellen, welche für solche Therapien geeignet sein könnten, in situ migrieren (z. B. Gliazellen). Das Unvermögen, implantierte Zellen an einer fixierten Stelle zu halten, kann diese ungeeignet als therapeutische Mittel machen. Ebenso können sich Zellen, welche autolog oder sogar allogenisch zu dem Wirt sind, weiter unkontrolliert teilen und Tumoren erzeugen.
Gegenwärtige Verfahren für eine Zelltherapie erlauben keine leichte Beendigung des Zelltherapie-Protokolls, oder keine leichte Einstellung auf das Zelltherapie-Protokoll, wenn die Zellen einmal implantiert sind. Dies liegt daran, dass Zellen, die in den Körper eines Patienten implantiert sind, von dem eigenen Gewebe des Patienten nicht gut isoliert sind, und daher nicht leicht wiederaufgefunden oder manipuliert werden können. Dies verursacht wirkliche Bedenken, wenn die Zellen unter Verwendung retroviraler Partikel genetisch modifiziert wurden, da implantierte Zellen in situ migrieren könnten, und möglicherweise zu einer proviralen Integration in Keimlinienzellen des Wirtes führen, wodurch der Provirus auf Nachkommen übertragen wird.
Es gibt zahlreiche spezifische Umstände, unter denen es kritisch sein kann, aufzuhören oder implantierte therapeutische Zellen zu entfernen. Diese schließen ein:
1. Eine oder mehrere der implantierten Zellen ist onkogen oder tumorbildend geworden, oder hat eine ungünstige Immunreaktion induziert.
2. Eine Dosis-Einstellung kann eine Reduzierung der Anzahl implantierter Zellen zu spezifischen Zeiten erfordern.
3. Genetisch modifizierte Zellpopulationen können eine kleine Anzahl an Zellen mit nicht korrekter Inkorporation von genetischem Material aufweisen, was zu nachteiligen Effekten führt.
4. Die Therapie kann einen definierten Endpunkt haben (z. B. Wachstumshormon-Behandlung), bei welchem ein anhaltendes Vorhandensein der therapeutischen Zellen unerwünscht oder schädlich ist.
5. Genetisch modifizierte Zellen können eine nachteilige Reaktion auf gleichzeitig verabreichte pharmakologische Mittel entwickeln.
6. Die Entwicklung einer verbesserten therapeutischen Möglichkeit kann eine Therapie-Änderung rechtfertigen, welche die Entfernung transplantierter Zellen erfordert.
Die Inkorporation von induzierbaren Suizidgenen in Zeilen für die Implantation wurde als ein potentielles Mittel zur Beendigung einer Zelltherapie vorgeschlagen, d. h. durch Töten der implantierten Zellen. Ein Nachteil dieses Ansatzes ist jedoch, dass immer die Möglichkeit besteht, dass der Suizid- Mechanismus in einer oder mehreren Zellen inaktiviert werden könnte, da die Zellteilung ein stochastischer Prozess ist. Unerwünschte Auswirkungen könnten selbst dann erzeugt werden, wenn nur eine der Zellen sich weiter teilt. Dieser Ansatz kann auch zu unerwünschten Ergebnissen führen, verursacht durch Abgabe sekretorischer Produkte, wie Wachstumsfaktoren oder Proteasen oder die Freisetzung von Viren, etc., auf Grund der Zerstörung implantierter Zellen in großem Maßstab.
Zelleinkapselungs-Verfahren wurden verwendet, um Zellen zu isolieren, während die Freisetzung erwünschter biologischer Materialien ermöglicht wird. Zwei Techniken wurden verwendet, die Mikroeinkapselung und die Makroeinkapselung. Typischerweise werden bei der Mikroeinkapselung die Zellen in einem kleinen permselektiven sphärischen Behälter sequestriert, wohingegen die Zellen bei der Makroeinkapselung in einer größeren nicht sphärischen Membran eingeschlossen sind.
Lim, US-Patente Nr. 4,409,331 und 4,352,883, offenbart die Verwendung von Mikroeinkapselungs-Verfahren, um durch Zellen in vitro gebildete biologische Materialien herzustellen, wobei die Kapseln abhängig von den hergestellten biologischen Materialien von Interesse variierende Permeabilitäten haben. Wu et al., Int.J. Pancreatology, 3: 91-100 (1988), offenbaren die Transplantation Insulin-produzierender, mikroeingekapselter pankreatischer Inseln in diabetische Ratten. Aebischer et al., Biomaterials, 12: 50-55 (1991), offenbaren die Makroeinkapselung von Dopamin-sekretierenden Zellen.
Verschiedene polymere Materialien wurden im Fachgebiet verwendet, um Viren von Flüssigkeiten abzufiltern. Anazawa et al., (US-Patent Nr. 5,236,588) beschreiben eine Ultrafiltrations-Membran, hergestellt durch Bestrahlen eines Monomers, um eine Membran mit in Verbindung stehenden Poren herzustellen. Allegrezza (US-Patent Nr. 5,096,637) berichtet über eine asymmetrische Komposit-Ultrafiltrations-Membran zur Isolierung von Viren von Proteinenthaltenden Lösungen. DiLeo (US-Patent Nr. 5,017,292) lehrt asymmetrische Membranen mit Hülle umfassend ein poröses Substrat, eine Ultrafiltrations- Oberflächenhaut und eine Zwischenzone, die frei ist von Hohlräumen, welche einen Riss in der Haut bilden, und welche dazu führen, dass Flüssigkeit direkt mit dem porösen Substrat in Verbindung steht. Die Membranen werden zur Isolierung von Viren aus Protein-haltigen Lösungen verwendet. US-Patente Nr. 4,808,315 und 4,857,196 lehren eine hydrophile Hohlfaser-Membran zur Entfernung von Viren aus einer Protein-haltigen Lösung.
Keines der oben zitierten Dokumente beschreibt Virus-rückhaltefähige, permselektive, biokompatible Membranen, welche in einen Patienten zu Zelltherapie-Zwecken implantiert werden können. Es gibt viele Situationen, in denen es nützlich wäre, eine Zelltherapie für den in vivo-Transport biologischen Materials bereitzustellen, während die Freisetzung schädlicher Viren, welche von den eingekapselten Zellen abgegeben werden können, im Wesentlichen verhindert wird. Es gibt auch viele Situationen, wo eine leichte Beendigung der Zelltherapie-Behandlung erwünscht wäre. Jedoch fehlen im Fachgebiet für Zelltherapie wirksame Mittel für solche Behandlungen.
WO-A-92195 offenbart eine implantierbare permselektive Vorrichtung gemäß der Präambel von Anspruch 1.
Demgemäß ist es ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Makrokapseln zur Einkapselung von Zellen bereitzustellen, wobei die Kapseln abhängig von ihrer bestimmten Verwendung ausgewählte Permeabilitäts-Eigenschaften und gewünschte Virus-Rückhalte-Charakteristiken aufweisen.
Diese und weitere Gegenstände und Merkmale der Erfindung werden für den Fachmann aus der folgenden detaillierten Beschreibung und den anhängenden Ansprüchen offensichtlich werden.
Es wird angenommen, dass keines der vorangehenden zitierten Dokumente die vorliegende Erfindung, wie sie beansprucht wird, offenbart, und sie wird nicht als Stand der Technik angenommen. Die zitierten Dokumente werden als Hintergrund-Information geliefert.

ZUSAMMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wird eine implantierbare permselektive Makrokapsel zur Verwendung in der Zelltherapie beschrieben. Die Makrokapsel umfasst einen Kern umfassend lebende Zellen, die fähig sind, ein ausgewähltes biologisch aktives Produkt zu sekretieren oder eine ausgewählte biologische Funktion bereitzustellen und eine äußere Hülle, die den Kern umgibt. Die Hülle umfasst ein biokompatibles Material, das im Wesentlichen frei von den eingekapselten Zellen ist, und weist eine nominale Molekulargewichts-Grenze auf, die ausreicht, um die Zellen innerhalb der Makrokapsel zu halten. In manchen Ausführungsformen ist die nominale Molekulargewichts-Grenze der Makrokapsel unterhalb des Molekulargewichts schädlicher Viren, die von den lebenden Zellen abgegeben werden können.
Ein Verfahren zur Bestimmung der Virus-Rückhaltung einer äußeren Hülle der implantierbaren selektiven Makrokapsel wird auch beschrieben, wobei die äußere Hülle eine Hohlfaser umfasst und Virus in die Hohlfaser eingebracht wird. Die Enden der Hohlfaser werden dann verschlossen und die Faser wird in einer Badlösung platziert. Nach einem Zeitintervall wird die Badlösung auf einem Rasen von Bakterien, die für den Virus empfänglich sind, inokuliert und die Virus-Rückhaltung wird basiered auf der Anzahl gebildeter Plaques berechnet.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die Verringerung im Log-Maßstab der Phagen-Freisetzung von den mikroporösen Makrokapseln.
Fig. 2 zeigt den Testbehälter, der zur Messung der Virus-Rückhaltung der mikroporösen Makrokapseln verwendet wurde.
Fig. 3 und 4 zeigen die prozentuale Abweisung von Dextranen verschiedener Größe von den mikroporösen Makrokapseln.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt permselektive biokompatible Makroeinkapselungs-Vorrichtungen und Verfahren zur Verwendung derselben zur Zurückhaltung von Zellen, zum Abhalten bestimmter schädlicher Viren, die von zurückgehaltenen Zeilen abgegeben werden, oder zur Verhinderung des Eindringens schädlicher Viren von Wirtsgewebe durch die Einkapselungs- Vorrichtung bereit. Die Makrokapseln erlauben auch eine wirksame Beendigung von Zelltherapie-Behandlungen. Die erfindungsgemäßen Verfahren beruhen alle auf permselektiven Makroeinkapselungs-Vorrichtungen, die abhängig von der Natur der zu implantierenden Zellen und der Stelle der Implantation, immunoisolatorische Eigenschaften haben oder nicht haben können. Somit sind die Zellen in manchen Fällen fähig, eine gewünschte Funktion zu erzeugen, ohne dass eine physische Barriere zwischen ihnen selbst und dem Immunsystem des Empfängers erforderlich ist. Viele solche Zellen sind die gleichen Zellen, von denen geglaubt wird, dass sie für eine klassische, nicht eingekapselte Zelltherapie nützlich sind.
Die Makrokapseln der vorliegenden Erfindung sind biokompatibel. Der Ausdruck "biokompatibel", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich sowohl auf die intakte Makrokapsel als auch auf ihren Inhalt. Insbesondere bezieht er sich auf die Fähigkeit der implantierten intakten Makrokapsel und ihres Inhalts, schädliche Auswirkungen auf verschiedene Schutzsysteme des Körpers, wie das Immunsystem, oder eine Fremdkörper-fibrotische Reaktion zu vermeiden und für eine beträchtliche Zeitspanne funktional zu bleiben. Außerdem impliziert "biokompatibel" auch, dass keine spezifischen unerwünschten zytotoxischen oder systemischen Auswirkungen durch das Vehikel und ihres Inhalts verursacht werden, welche die erwünschte Funktion des Vehikels oder seines Inhalts stören würde.
Die Makrokapseln sind auch "permselektiv" und ihre Permeabilitäts- Eigenschaften können auf ihre spezielle Verwendung abgestimmt werden. Zum Beispiel können Makrokapseln, welche zur Einkapselung xenogener Zellen, die schädliche Viren tragen können, verwendet werden, so gestaltet werden, dass die Freisetzung der Viren minimiert wird. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung erlauben es, die Virus-Rückhalte/Retardations-Eigenschaften einer bestimmten Makrokapsel vor der Implantation zu kennen. Virus-Rückhaltung (in welchem Ausmaß die Membran einen Virus-Transport verzögert) kann durch die Berechnung von DMembran/DWasser bestimmt werden, wobei D der Diffusionskoeffizient der Substanz durch die Membran ist. Dadurch wird der Transportwiderstand durch die Membran mit dem einer entsprechenden Wasser-Distanz verglichen. Für Viren mit Größen von 18 bis 120 nm ist DWasser 2,4 · 10&supmin;&sup7; cm²/sek bis 3,8 · 10&supmin;&sup8; cm²/sek. Die Diffusionskoeffizienten verschiedener Viren durch Membranen wurden basierend auf den Anfangsdaten und den Daten nach 6 Wochen gemessen. Der Diffusionskoeffizient ist ein Maß des Transportwiderstands durch die Membran und wird durch die Gleichung:
J = D( C)/( X)
gegeben, wobei J der Fluss durch die Membran ist, C ist die Konzentrationsdifferenz zwischen dem Inneren und dem Äußeren der Membran und X ist die Membran-Wanddicke. D ist eine Konstante und ist unabhängig von der Konzentration. Es ist eine Proportionalitätskonstante zwischen C und dem resultierenden Fluss, J. Die Virus-Rückhaltung der Membran ist vorzugsweise weniger als ungefähr 0,5, mehr bevorzugt weniger als 0,1 und am meisten bevorzugt weniger als ungefähr 10&supmin;². Vorzugsweise wird die Membran, wenn sie einmal dem Patienten implantiert ist, ihre Virus-Rückhalte- /Retardations-Eigenschaften mindestens 1 Woche, vorzugsweise mindestens 2 Wochen, und mehr bevorzugt mindestens 6 Wochen beibehalten. Es ist am meisten bevorzugt für die Membran, einen gegebenen Virus- Rückhalte/Retardations-Wert für die Dauer der Therapie beizubehalten.
Die permselektive Eigenschaft einer Makrokapsel kann auch mittels ihrer Molekulargewichts-Grenze definiert werden. Der Ausdruck "Molekulargewichts- Grenze" (MWCO) bezieht sich auf die Größe oder das Molekulargewicht von Partikeln, welche von einer bestimmten Membran unter konvektiven oder Druck-getriebenen Bedingungen zurückgehalten werden. Da semipermeable Membranen im Allgemeinen eine Gauss-Verteilung von Porengrößen aufweisen, bezieht sich der Ausdruck MWCO, wie er hierin verwendet wird, auf die Größe eines Marker-Moleküls, wenn mit einer spezifischen Membran getestet wurde, wovon 90% durch die Membran unter den Testbedingungen gehalten wurden. Insbesondere können, während die Mehrzahl an Poren in einer Membran so groß sein kann, um ein bestimmtes Partikel zurückzuhalten, manche Poren vorliegen, die groß genug sind, dass das Molekül hindurchgeht. Somit ist die MWCO einer gegebenen Membran nicht absolut und kann etwas differieren, wenn unter Verwendung verschiedener Tests gemessen wird. Während Partikel einer bestimmten Größe, wenn sie groß genug ist, vollständig für eine gegebene Zeitdauer zurückgehalten werden können, gibt es einen Bereich an Teilchengrößen, bei dem ein Teil der Partikel zurückgehalten werden und ein Teil freigesetzt werden wird. Wenn z. B. 60% der Partikel mit einem Molekulargewicht von ungefähr 50 kD durch eine gegebene Membran zurückgehalten werden, dann wird ein größerer prozentualer Anteil an Partikeln, die größer als 50 kD sind, durch dieselbe Membran in derselben Zeitdauer zurückgehalten werden. Der Ausdruck "nominale MWCO" (nMWCO) bezieht sich auf die Größe von Partikeln, die durch die Makrokapsel zu Levels von 90% zurückgehalten werden. Somit ist z. B., wenn 100 kD-Partikel durch eine Membran zu Levels von 90% zurückgehalten werden, die nMWCO der Makrokapsel 100 kD.
Es gibt mehrere verschiedene Verfahren zur Messung von nMWCO, welche verschiedene Ergebnisse liefern können. Tests können diffusiv oder konvektiv sein. Konvektive Verfahren bestimmen die transmembranöse Diffusion unter Druck. Die konvektive nMWCO ist ein guter Indikator dafür, wie schnell Moleküle von der Membran passiv diffundieren. Wenn die nMWCO getestet wird, ist es wichtig, dass berücksichtigt wird, dass die Gestalt und Natur des beim Testen verwendeten Moleküls die gemessenen Werte beeinflussen kann. Somit ist es wichtig, wenn Daten verschiedener Quellen verglichen werden, die Testmethode zu berücksichtigen, die verwendet wurde, um die Werte zu erhalten.
Die Makrokapseln können so gestaltet sein, dass Zellen, die mit Viren genetisch modifiziert wurden, um eine gewünschte biologische Substanz, welche als ein therapeutisches Mittel nützlich ist, zu sekretieren, zurückgehalten werden. Die nMWCO wird so gewählt, dass die biologische Substanz im Wesentlichen von der Kapsel freigegeben wird, aber verbleibende virale Partikel, welche von den modifizierten Zellen getragen werden können, im Wesentlichen zurückgehalten werden. Der Ausdruck "mit Virus genetisch modifiziert" schließt jedes Standardverfahren ein, das im Fachgebiet verwendet wird, um exogene DNA durch virale Vektoren (Retrovirus, modifizierter Herpesvirus, Herpesvirus, Adenovirus, Adeno-artiger Virus und dgl.) in die einzukapselnden Zellen einzuführen.
In manchen Ausführungsformen werden die erfindungsgemäßen Makrokapseln permeabel gegenüber Substanzen mit größerem Molekulargewicht als die C1q- Komponente des Komplements, welches ein Molekulargewicht von ungefähr 440 kD aufweist, sein. Somit werden diese Ausführungsformen im Wesentlichen nicht-immunoisolatorisch sein. Solche Kapseln werden gewöhnlich an immuno-privilegierten Orten, wie dem Gehirn, implantiert werden. Die Kapseln haben den primären Zweck, als Zell-Wiederauffindungs- Vorrichtungen zu dienen. Die relativ hohen MWCO solcher Vorrichtungen werden es ermöglichen, dass relativ große therapeutisch nützliche Mittel von den Zeilen freigegeben und zu dem Implantationsort transportiert werden. Makrokapseln, die primär als Zell-Wiederauffindungs-Vorrichtungen dienen, können MWCO im Bereich von 1000 bis 3000 kD haben. Die relativ hohen Molekulargewichts-Grenzen (MWCO) der Makrokapseln können durch Standardverfahren des Fachgebiets erreicht werden, einschließlich solcher, die von Strathmann in "Production of Microporous Media by Phase Inversion Processes", Materials Science of Synthetic Membranes, ACS Symposium Series 269, American Chemical Society, Washington D. C. (1985) beschrieben sind. Außerdem sind verschiedene Verfahren zur Veränderung der MWCO der Makrokapseln unten beschrieben.
Die permselektiven Makrokapseln können durch die gleichen Verfahren und unter Verwendung der gleichen Materialien hergestellt werden, die in der anhängenden PCT-Anmeldung US92/03327 offenbart sind. Kurz gesagt, umfasst die Kap sel (a) einen Kern, der isolierte Zellen enthält, entweder in einem flüssigen Medium suspendiert oder innerhalb einer Hydrogel-Matrix immobilisiert, und (b) eine biokompatible Umgebung oder periphere Region ("Hülle") einer permselektiven Matrix oder Membran, die im Wesentlichen frei von isolierten Zellen ist.
Der Kern der Makrokapsel wird aufgebaut, um eine geeignete lokale Umgebung für die speziellen darin isolierten Zellen bereitzustellen. In manchen Ausführungsformen umfasst der Kern ein flüssiges Medium, das ausreicht, um die Zellen zu halten. Flüssige Kerne sind insbesondere geeignet, um transformierte Zeilen, wie PC12-Zellen, zu halten. In anderen Ausführungsformen umfasst der Kern eine Hydrogel-Matrix, welche die Zellen immobilisiert und verteilt, wobei die Bildung von dichten zellulären Agglomerationen verringert wird.
Aus einer Hydrogel-Matrix hergestellte Kerne sind insbesondere geeignet, um primäre Zellen zu halten, welche zur Bildung von Agglomeraten tendieren, wie Zellen in Langerhans-Inseln oder adrenale chromaffine Zellen. Ggf. kann der Kern des vorliegenden Vehikels Substanzen enthalten, die die Funktion der isolierten Zellen unterstützen oder fördern. Diese Substanzen schließen natürliche oder synthetische Nährstoffquellen, extrazelluläre Matrix(ECM)- Komponenten, Wachstumsfaktoren oder Wachstums-regulierende Substanzen oder eine Population von Feeder-Zellen oder akzessorischen Zellen ein.
Die Hülle der Makrokapsel ist aus einem Material gebildet, welches das gleiche sein kann, wie das des Kerns, oder es kann davon verschieden sein. In jedem Fall führt das verwendete Material zu einer Umgebungs- oder peripheren Region, welche permselektiv und biokompatibel ist. Die Biokompatibilität der Hülle bedeutet, dass sie keine nachteilige Immunreaktion auslöst, die ausreicht, zu einer Abweisung der implantierten Makrokapsel zu führen, oder sie nicht anwendbar zu machen. Dies bedeutet auch, dass die Hülle keine unerwünschten Gewebe-Reaktionen auslöst. Außerdem kann die äußere Oberfläche so ausgewählt oder gestaltet werden, dass sie insbesondere für eine Implantation an der ausgewählten Stelle geeignet ist. Zum Beispiel kann die äußere Oberfläche weich, getupft oder rauh sein, abhängig davon, ob eine Anlagerung von Zellen des umgebenden Gewebes erwünscht ist. Die Gestalt oder Anordnung kann auch so ausgewählt oder gestaltet sein, dass sie insbesondere für den gewählten Implantationsort geeignet ist. Typischerweise wird die Hülle permselektive Membranen umfassen, welche in Hohlfasern oder flache Blätter geformt wurden. Eine Hohlfaser-Membran ist ein Ring, bestehend aus einer inneren zylindrischen Fläche, einer Wandstruktur als Träger und einer äußeren Zylinderfläche. Eine oder beide der Flächen kann für Moleküle unterschiedlichen Molekulargewichts selektiv sein. Ein Flachblatt ist eine planare Zusammensetzung einer Hohlfaser.
Die umgebende oder periphere Region der Hülle kann aus einer Hydrogel- Matrix oder aus einem anderen Material, wie einer thermoplastischen Membran oder Hohlfaser, gebildet sein. Sie kann auch aus einem Matrix-Membran- Komposit hergestellt sein, so dass eine permselektive thermoplastische Membran mit Matrix-gefüllten Poren, wie Hydrogel-gefüllten Poren, gebildet wird.
Geeigneterweise kann die äußere Hülle aus einem thermoplastischen Material gebildet sein, von dem bekannt ist, dass es biokompatibel ist, wie die Materialien, die hierin beschrieben sind. Außerdem können auch andere Hüllen, welche im Bereich der Mikrokapseln verwendet wurden, wie Alginat, geeigneterweise mit einem mehrwertigen Ion, wie Calcium, vernetzt, hierin verwendet werden.
Die Hülle kann direkt mit der Kernmatrix vernetzt werden, wodurch keine verbindende Zwischenschicht, wie Poly-L-Lysin (PLL), mehr benötigt wird. Die Eliminierung einer PLL-Zwischenschicht ist von daher vorteilhaft, da angenommen wird, dass PLL fibrogen ist. Auch kann die Hülle in dieser Vorrichtung hinsichtlich der Permselektivität besser kontrolliert werden als solche, die mit PLL hergestellt sind.
Die Makrokapseln können durch Coextrusion oder auf schrittweise Art gebildet werden. Techniken für die Coextrusion, die zur Bildung der Makrokapseln der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind im US-Patent Nr. 5,158,881 gelehrt. Mit dem Coextrusions-Verfahren werden die Makrokapseln von einer Extrusionsdüse mit verschachtelter Bohrung (nestedbore) durch Coextrusion aus Materialien gebildet, die den Kern und umgebende oder periphere Regionen bilden, unter Bedingungen, die ausreichen, die Matrix oder Membran-Vorläufer der umgebenden oder peripheren Region (und der Kernregion) zu gelieren, zu festigen oder zu gießen. Ein besonderer Vorteil dieser Coextrusions-Ausführungsform ist, dass die Zellen in dem Kern vom Moment der Bildung des Vehikels an isoliert sind, wodurch gewährleistet ist, dass die Kernmaterialien während der Handhabung des Vehikels vor der Implantation nicht kontaminiert oder beeinträchtigt werden. Ein weiterer Vorteil des Coextrusions-Verfahrens ist, dass gewährleistet ist, dass die umgebende oder periphere Region frei von Zellen und anderen Kern-Materialien ist.
Die Makrokapsel kann auch schrittweise gebildet werden. Zum Beispiel kann der Kern, wenn die herzustellende Kapsel einen Hydrogel-Kern, enthaltend die isolierten Zellen, einschließt, anfänglich gebildet werden, und die umgebende oder periphere Matrix oder Membran kann anschließend assembliert oder aufgebracht werden. Umgekehrt kann die umgebende oder periphere Matrix oder Membran vorgeformt werden und dann mit dem vorgebildeten isolierte Zellen enthaltenden Kernmaterial oder mit Materialien, die den Kern bilden werden (d. h. Kern-Vorläufer-Materialien) gefüllt werden. Die Kapsel wird so verschlossen, dass die Kern-Materialien vollständig eingeschlossen sind. Wenn ein Vorläufer-Material verwendet wird, wird das Vehikel Bedingungen ausgesetzt, die zur Bildung des Kerns führen.
Die umgebende oder periphere Region wird so hergestellt, dass sie Poren oder Hohlräume in einem vorbestimmten Größenbereich aufweist; daraus folgt, dass das Vehikel permselektiv ist. Die Permeabilitäts- und Biokompatibilitäts- Eigenschaften der umgebenden oder peripheren Region werden durch die Matrix- oder Membran-Vorläufer-Materialien, die verwendet werden, und die Bedingungen bestimmt, unter welchen die Matrix oder Membran gebildet wird.
Die Molekulargewichts-Grenze (MWCO), die für ein bestimmtes Vehikel ausgewählt ist, wird durch die Molekulargröße der größten Substanz, die in das und/oder aus dem Vehikel passieren kann, bestimmt werden. In manchen Fällen, wenn die Virus-Freisetzung nicht von Belang ist, werden die Poren der Makrokapsel so groß wie möglich sein, während immer noch Zellen zurückgehalten werden, ungefähr von 0,1 bis 10 um, abhängig von der Art der eingekapselten Zelle.
Hohlfaser-Membranen können in einem weiten Bereich der MWCO zu Zwecken des Auschlusses oder Transports verschiedener biologischer Mittel hergestellt werden, während ein wesentliches Durchlassen entweder in die Kapsel oder aus der Kapsel heraus von schädlichen Viren verhindert wird. Verändern der MWCO der Makrokapsel kann durch eine Vielzahl von Verfahren erreicht werden. Die grundlegende Methode der Veränderung der Membran-Grenze ist, die Phasenseparations-Eigenschaften eines gegebenen Sets an Membran- Gießlösungen und Koagulations-Bädern zu verändern. Die Thermodynamik der Phasenseparation für jede Material/Lösungsmittel-Kombination ist verschieden. Im Allgemeinen gilt, dass je länger es für den Phaseninversionsprozess braucht, abzulaufen, desto größer ist die Porengröße der resultierenden Membran. Das spezielle ausgewählte Membran-Material wird die MWCO beeinflussen. Material/Lösungsmittel-Systeme, wie Poly(sulfon)/N- Methylpyrrolidon (NMP) und Poly(vinylidendifluorid) (PVDF)/Tetrahydrofuran (THF), werden leichter zu Membranen mit höherer MWCO verarbeitet, auf Grund der Stärke der Polymer/Lösungsmittel/Nicht-Lösungsmittel- Wechselwirkungen, als Materialien, wie Poly(acrylnitril) (PAN)/Dimethylsulfoxid (DMSO). Permeabilitäts-Eigenschaften von Membranen können durch Auswahl geeigneter Material-Systeme ausgewählt werden. Zum Beispiel wird die Verwendung eines Systems, bei dem das Polymer in der Präzipitations- Flüssigkeit etwas löslich ist, den Phaseninversionsprozess stark verlangsamen.
Die Zugabe eines Additivs mit niedrigem Molekulargewicht zu der Membran- Gießlösung, in welcher das Hauptmembranpolymer nicht löslich ist, wird auch die MWCO der Membran beeinflussen (Cabasso, 1976). Niedermolekulare, nicht lösliche Additive machen die Gießlösung weniger stabil. Solche Lösungen können viel schneller phaseninvertieren, was zu möglichen Membranen mit niedrigerer MWCO führt. Umgekehrt können höhermolekulare Additive zu langsamerer Phasenseparation führen, was die Bildung relativ großer Poren verursachen wird. Ein Beispiel dafür ist, wenn Poly(Acrylnitril-co-Vinylchlorid) (PAN/PVC) mit Polyethylenoxid mit hohem Molekulargewicht (PEO) (MW > 100 kD) gemischt wird. Auch werden höhermolekulare oder makroskopische Additive vielleicht von der Membranmatrix wegdiffundieren und große Poren zurücklassen.
Das resultierende Molekulargewicht einer Membran kann auch durch die Zugabe eines Membranpolymer-Lösungsmittels zu sowohl der inneren Bohrung (bore) als auch den äußeren Koagulations-Lösungen verändert werden. Die Zugabe von Lösungsmittel verlangsamt die Präzipitation stark, was zu Membranen mit weit höherer Grenze führen kann.
Die Veränderung der Temperatur während des Membran-Bildungsverfahrens kann auch die MWCO beeinflussen. Diese Methode zur Veränderung der MWCO wird im Allgemeinen in Kombination mit Zugaben von Lösungsmittel oder Nicht-Lösungsmittel verwendet, da eine Temperaturänderung nicht immer die MWCO verändert. Zum Beispiel können Lösungen von Polysulfon, PEG-200 und (NMP) in Fasern mit sich unterscheidender MWCO verarbeitet werden, indem die Temperatur des Koagulations-Bades eingestellt wird. Die System- Kombination wird als ein "weniger kritisches Lösungs-Temperatur-System" (LCST) bezeichnet, in welchem die Stabilität der Lösung mit erhöhter Temperatur abnimmt. So führen höhere Temperaturen zu höheren MWCO. Die Veränderung der Temperatur des Gießens und der Koagulations-Lösungen während der Membran-Bildung wird auch die MWCO verändern. Kombinationen irgendwelcher der obigen Techniken können auch zur Änderung der MWCO verwendet werden. Zum Beispiel kann die Temperaturänderung in Kombination mit der Zugabe eines hoch- oder niedrigmolekularen Additivs verwendet werden, um die MWCO zu beeinflussen.
Auf Grund der mittleren bis hohen MWCO-Eigenschaften mancher Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden die Makrokapseln hohe Permeabilitäten und daraus folgende verbesserte Diffusions-Eigenschaften über die äußere Vorrichtungswand aufweisen. Die verbesserten Transport- Eigenschaften bedeuten, dass die Kapseln höhere Dichten lebensfähiger Zellen stützen als immunoisolatorische Kapseln, welche niedrigere MWCO aufweisen, um eine immunologische Abweisung von dem Transplantations-Empfänger zu verhindern. Höhere Zelldichten können die Verwendung von kleineren Vorrichtungen verglichen mit immunoisolatorischen Kapseln erlauben, da sie mehr therapeutische Substanz pro Volumeneinheit liefern. Mit dem Ausdruck "immunoisolatorische Kapsel" ist gemeint, dass die Permselektivität der Kapsel so ist, dass sie in ihrem Kern Zellen vor dem Immunsystem des Individuums schützt, in welchem das Vehikel implantiert ist. Dies funktioniert, indem gefährliche Substanzen des Körpers des Individuums daran gehindert werden, in den Kern des Vehikels einzudringen, indem der Kontakt zwischen dem Individuum und entzündlichen, antigenen oder auf andere Weise schädlichen Materialien, die in dem Kern vorhanden sind, zu minimieren, und indem eine räumliche Barriere bereitgestellt wird, die ausreicht, um einen immunologischen Kontakt zwischen den isolierten Zellen und dem Immunsystem des Individuums zu verhindern.
Zur Erleichterung der Wiederauffindung werden die Makrokapseln im Allgemeinen eine oder mehrere Halte-Vorrichtungen (tether) aufweisen, um die Lokalisierung und das Ergreifen der Vorrichtung zu erlauben, ohne Schaden anzurichten. Außerdem kann die Halte-Vorrichtung dazu verwendet werden, die implantierte Makrokapsel zu finden, wenn erwünscht ist, die Therapie zu beenden. Solche Halte-Vorrichtungen werden gemäß den Verfahren von Aebischer et al. in der anhängigen PCT-Anmeldung US92/05369 hergestellt. Die Makrokapseln können auch so hergestellt werden, dass sie Substanzen enthalten, die die Sichtbarmachung verbessern, um die Implantation der Vorrichtung an die Zielstelle zu erleichtern.
Wenn die Permselektivität der Makrokapseln so ist, dass sie im Wesentlichen nicht immunoisolatorisch sind, sollten die einzukapselnden Zellen kompatibel mit der gewünschten Therapie oder Funktion sein. Dies werden Zellen sein, die mit oder ohne Immunoisolation lang genug überleben, dass sie für den Empfänger einen therapeutischen Wert haben. Im Allgemeinen sind die Auswahl der Zellen für spezifische Funktionen, Verfahren, um das Implantat- Überleben zu gewährleisten und verschiedene andere Betrachtungen, die die Zell-Lebensfähigkeit bei Zelltherapien betreffen, die gleichen, wie die von Gage et al., US-Patent Nr. 5,082,670 dargestellten.
In manchen Fällen kann es möglich sein, eine Zelltherapie bereitzustellen, indem die eigenen Zellen des Transplantat-Empfängers verwendet werden (z. B. im Fall eines Tumors, endothelialer oder epithelialer Biopsien etc.). Zellen, die syngen zu denen des Empfängers sind, können auch verwendet werden. In diesen Fällen ist eine mangelnde Immunoisolation, die von der Makrokapsel bereitgestellt wird, von geringer Bedeutung. Jedoch können, wenn xenogene und/oder allogene Zellen verwendet werden, immunosuppressive Techniken erforderlich sein. Lokale immunosuppressions-Verfahren werden von Gruber, Transplantation 54: 1-11 (1992), und von Rossini, US-Patent Nr. 5,026,365 offenbart. Allgemeine Übersichten und Zitate für die Verwendung von rekombinanten Methoden zur Verringerung der Antigenizität von Donorzellen werden von Gruber (supra) offenbart. Beispielhafte Wege zur Verringerung der Immunogenität von Transplantaten durch Zelloberflächen-Modifikation werden von Faustman, WO 92/04033 (1992) offenbart.
Weiss, WO 93/14767, offenbart Verfahren zur Herstellung von Antigendepletierten Zellen aus Targetzellen. Sims, WO 93/02188, offenbart genetisch modifizierte universelle Donorzellen.
Wenn die einzukapselnden Zellen xenogen gegenüber dem Empfänger sind, ist der Bedarf für eine Immunosuppression am größten. Im Allgemeinen wird ein Verfahren zur Verringerung oder Eliminierung der Immunreaktion auf die eingekapselten Zellen verwendet werden müssen. Somit werden die Empfänger häufig immunosupprimiert werden, entweder durch die Verwendung von immunosuppressiven Wirkstoffen, wie Cyclosporin, oder durch lokale Immunosuppressions-Strategien, bei denen lokal angewendete Immunosuppressiva verwendet werden. Alternativ kann die Immunogenität der Zeilen verringert werden, indem Zellen von einem Donor mit verringerter Antigenität, wie transgene Tiere, welche veränderte oder deletierte MHC- Antigene haben, hergestellt werden.
Wenn Zellen verwendet werden, die allogen zu denen des Empfängers sind, wird am häufigsten Gewebe-Typisierung in einem Ausmaß verwendet werden, um am besten mit dem Histokompatibilitätstyp des Empfängers zusammenzupassen.
Ein alternativer Weg zu solchen Verfahren, wie Immunomodulation, Zelloberflächen-Modifikation und allgemeine und lokale Immunosuppression, um die Lebensfähigkeit implantierter Zellen zu gewährleisten, ist das Platzieren von Zellen innerhalb einer immunoisolatorischen Vorrichtung vor dem Platzieren in die permselektive Makrokapsel. Geeignete immunoisolatorische Vorrichtungen würden Mikrosphären oder Alginatstränge (-nudeln) einschließen. Es wurde gezeigt, dass Alginat ein nützlicher Immunoisolator ist, solange eine zellfreie Region um den Umfang herum enthalten ist.
Zu Zwecken der Zelltherapie werden durch die Makrokapseln der vorliegenden Erfindung außerdem manche Zellen als therapeutische Mittel nützlich gemacht, welche gegenwärtig nicht nützlich sind für eine uneingekapselte Zelltherapie, da solche Zellen spezifische nachteilige Eigenschaften haben, wie die Abgabe schädlicher Viren oder unerwünschte migratorische Eigenschaften.
Bei Zelltherapie-Verfahren ist es erwünscht, den Empfänger vor Viren zu schützen, welche von Donorzellen getragen werden können. Häufig werden xenogene Zellen verwendet. Während xenogenes Gewebe vorzugsweise von Tierherden stammt, welche ein sorgfältig kontrolliertes Erbgut und eine sorgfältig kontrollierte Ernährung haben, ist eine Virus-Kontamination trotzdem möglich. Während die meisten Tierviren nicht auf Menschen übertragen werden, gibt es manche zoonotische Krankheiten, welche durch einen Virus von Tieren auf Menschen übertragen werden können. Zum Beispiel schließen Viren, welche von Rindern auf Menschen übertragen werden können, den Rinderdiarrhöevirus, den infektiösen Rinder-Rhinotrachitis-Virus, den Parainfluenza-3-Virus, den Rinder-Adenovirus, den Rinder-Parvovirus, den Rinder-Rheovirus ein. Die Permeabilität der Einkapselungs-Vorrichtungen kann so zugeschneidert werden, dass der Empfänger vor diesen und anderen hinzukommenden Mitteln, welche von xenogenen Zellen freigegeben werden könnten, geschützt wird.
Selbst im Fall von Allotransplantaten kann das Gewebe Pathogene enthalten. Während es möglich ist, auf viele schädliche Mittel zu screenen, ist es nicht möglich, dies für alle durchzuführen. Zum Beispiel kann die Diagnose von HIV- freiem Gewebe nicht garantiert werden, da Antikörper für diesen Virus im, Allgemeinen bis mehrere Wochen nach der Infektion nicht vorhanden sind. Solche Mittel sind übertragbar und die Verwendung von Makrokapseln, welche den Transport von Viren verzögern, führen zu einem größeren zusätzlichen Maß an Sicherheit.
Es kann auch erwünscht sein, einen Schutz für das eingekapselte Gewebe vor Virusangriffen von einem infizierten Empfänger bereitzustellen. Während es viele Krankheiten gibt, welche eindeutig viralen Ursprungs sind, gibt es andere, wie Multiple Sklerose, amyotrophische Lateralsklerose und Schizophrenie, wo virale Ätiologien angenommen wurden. Indem gesunde Zellen innerhalb einer Membran eingekapselt werden, welche die Virus-Übertragung verzögert, kann ein infizierter Empfänger durch Zelltherapie behandelt werden.
In Tabelle 1 sind verschiedene Krankheiten und Bedingungen aufgelistet, für welche die permselektive Makroeinkapselungs-Zelltherapie-Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sein können und die entsprechenden therapeutischen Substanzen, die von den eingekapselten Zellen freigegeben werden, sind dort auch aufgeführt.

TABELLE 1

Krankheit/Bedingung Therapeutische Substanz transportierbar durch genetisch modifizierte Zellen
Leukämie Kaposi'sches Sarkom Hepatitis B α-Interferon
Hepatitis C M. S. β-Interferon
Nierenkarzinom Chronische Granulomatose γ-Interferon
kongenitale Leukopenie Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor
Hämophilie Faktor VIII, Faktor IX
B-Zell-Lymphom idiotypische Antikörper
Autoimmunkrankheit Antikörper-sekretierende Zellen
Arthritis II1-RA
Gaucher'sche Krankheit Glukozerebrosidase
Erhöhtes Cholesterin Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor
Tumoren Tumornekrosefaktor
Angioplastie tPA
Wachstumshormon-Mangel Wachstumshormon
Nervendegeneration Nervenwachstumsfaktoren
Knochenreparatur Knochen-morphogenetisches Peptid
Da Viren in einer großen Vielfalt von Gestalten und Größen existieren, können verschiedene Assays verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine gegebene Membran die gewünschten Eigenschaften in Bezug auf einen gegebenen Virus haben wird. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um Fasern auf ihre Eigenschaften in Bezug auf Viren zu testen, so dass ihre Virus- Freisetzungsrate auf eine Implantation angenähert werden kann. Dieses Verfahren schließt Plaque-Techniken ein, welche dafür bekannt sind, dass sie insbesondere empfindlich gegenüber Viren sind. In manchen Fällen kann der spezielle Virus von Interesse direkt getestet werden, indem eine gegebene Virus-Konzentration in das Lumen der Faser eingebracht, die Enden sicher verschlossen und die Faser in eine Badlösung eingebracht wird. Die Badlösung kann dann bei gewünschten Zeitintervallen getestet und auf Viren analysiert werden, indem Standard-Plaque-Prozeduren verwendet werden [Davis, B., Microbiology: including Immunology and Molecular Genetics, 3.Ausgabe, Harper & Row (1980)]. In Fällen, in denen es unerwünscht sein kann, den interessierenden Virus direkt zu testen (z. B. pathogene Viren), kann ein Modell des interessierenden Virus verwendet werden. Bakteriophagen ähnlicher Dimensionen des interessierenden Virus dienen auf Grund ihrer viralen Natur als nützliche Modelle. Eine Vielfalt an Phagen sind von ATCC erhältlich und sind in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) aufgelistet. Ein einzelner Virus kann ein Targetbakterium infizieren. Der Virus wird replizieren und an umgebende Bakterien freigegeben werden. Somit können sehr geringe Mengen an Virus durch Plaque-Bildung auf einem Bakterienrasen nachgewiesen werden.
Tabelle 2 gibt die Größen einiger repräsentativer Tierviren wieder. Sie reichen von 18-26 nm für die Parvoviren bis 150-300 nm für die Paramyxo(Parainfluenza)-Viren. Tabelle 2 Größen repräsentativer Tierviren
Tabelle 3 gibt das Molekulargewicht, den Stoke'schen Radius und die Diffusität von verschiedenen Markern und Viren wieder. Tabelle 3 Molekulargewicht, Stoke'scher Radius und Diffusionsvermögen verschiedener Marker
Da die nMWCO einer Membran von dem Ultrafiltrations- zum mikroporösen Bereich erhöht wird, erhöht sich die Wahrscheinlichkeit des Virus, auf Grund einer Konzentrations-Triebkraft durch die Membran zu passieren. Diese Fähigkeit, durch eine Membran durchzugehen, ist eine Funktion der charakteristischen Größe des Viruspartikels und der Virusgestalt. Fig. 1 zeigt die Verringerung im Log-Maßstab der Phagen-Diffusion über zwei Membranen verschiedener nMWCO. Die PAN/PVC-Membran mit Ultrafiltrations-Klasse mit einer nMWCO von 100 kD (0,002 um) ist vollständig permeabel für Partikel bis zu 440 kD, wenn sie über eine Zeitdauer von 2 Wochen belassen wird. Nichtsdestotrotz stellt diese Membran eine Verringerung im 9-Log-Maßstab des Durchlasses für phiX174-Phagen (~23 nm) über 2 Wochen bereit. Dies erhöht sich auf eine Verringerung im 12-Log-Maßstab für Lambda GF 10 (Kopf 95 nm · 65 nm; Schwanz 115 nm · 17 nm) selbst nach 6 Wochen. Wenn die nMWCO der Membran in den mikroporösen Bereich erhöht wird -eine Polysulfonmembran mit einer 0,1 um-Grenze- wird die Verringerung im Log- Maßstab von phiX174 über eine Zeitdauer von 3 Tagen eliminiert und Lambda GT 10 wird bei 6 Wochen auf eine Verringerung im 6-Log-Maßstab reduziert.
Zusätzlich zur Gesamtgröße ist die Gestalt des Virus bei der Bestimmung des Durchlasses durch die Membran wichtig. Phage M13 (5 nm · 200 nm) wurde vollständig durch die Ultrafiltrations-Membran (Verringerung 14 im Log-Maßstab nach 2 Wochen) blockiert. Es wird angenommen, dass manche Virus- Konfigurationen, wie lange flexible Viruspartikel, innerhalb der Membranporen verstrickt werden können, was zu einer höheren Verringerung im Log-Maßstab führt, als die Größe alleine verursachen würde. Eine sorgfältige Übereinstimmung von Membran-Eigenschaften mit speziellen Virus- Eigenschaften, insbesondere Größe, Gestalt und Flexibilität, werden eine selektive Rückhaltung von Partikeln mit Virusgröße erlauben.
Konvektive MWCO-Daten für einen Bereich von Partikel-Größen (Proteine und Dextrane) werden zur Charakterisierung der Faser-Porengröße verwendet. Die MWCO jeder Fasermasse kann an einem Faserbündel, eingebracht in einen Behälter, gemessen werden. Der Behälter ist eine hohle röhrenartige Struktur mit gecappten (capped) Enden. Die Fasern werden durch die Kappen gewunden und an den Enden verschlossen. Der Protein-MWCO-Test involviert die Ultrafiltration einer Proteinlösung (Rinderserumalbumin, Immunoglobulin G, Myoglobin) bei 5 Pounds pro Quadratinch Gauge (psig) transmembranem Druck. Die Reservoir- und Filtrat-Protein-Konzentrationen werden auf einem Spektrometer gemessen und der Abweisungskoeffizient (R) wird aus ihrem Verhältnis berechnet, da R = 1 - Cf/Cr, wobei Cf die Filtrat-Konzentration und Cr die Reservoir-Konzentration darstellen:
Der konvektive Dextran-MWCO-Test unterscheidet sich von dem diffusiven Protein-MWCO-Test durch die Kontrolle der volumetrischen Filtrat-Flussrate zusätzlich zur Kontrolle der volumetrischen Retentat-Flussrate. Das Dextran- Testreagens ist eine polydisperse Lösung, die im Molekulargewicht von 2000 g/mol bis zu 4 000 000 g/mol (von Pharmacia) variiert. Die Dextran- Konzentration über einen Bereich von Molekulargewichten wird sowohl in dem Reservoir als auch in dem Filtrat mit Gelpermeationschromatographie gemessen. Dann werden Abweisungs-Koeffizienten als eine Funktion des Dextran-Radius von den Verhältnissen von Filtrat- zu Reservoir-Konzentration berechnet. Entweder kann das gesamte Abweisungsprofil oder es können die Dextran-Radien bei 20%, 50% und 90% Abweisung angegeben werden.
Zusätzlich zu Zelltherapie-Anwendungen können permselektive Makrokapseln auch verwendet werden, um polymere Implantate, wie bioerodierbare Polymere, enthaltend therapeutisch nützliche Substanzen, zu halten. Solche Implantate können ohne einen Träger brüchig oder zerbrechlich werden. Ohne einen Kapselträger kann es schwierig sein, sie nach der Implantation wiederzufinden. Da erodierbare Polymere brechen und ihre Zielprodukte freigeben können, können sie auch verdrängt werden und können an unbeabsichtigte Stellen gelangen. Mikroporöse Makrokapseln stellen die zusätzlichen Vorteile der Sicherheit, Wiederauffindbarkeit und Gewebe- Biokompatibilität für polymere Transportsysteme bereit.
Damit die hierin beschriebene Erfindung vollständiger verstanden werden kann, werden die folgenden Beispiele gegeben. Dies sollte so aufgefasst werden, dass diese Beispiele nur zur Veranschaulichung sind, und dass sie nicht so ausgelegt werden sollen, dass sie den Umfang der Erfindung auf irgendeine Weise beschränken.

Beispiel 1

Implantation von allogenem fötalem Gehirngewebe

Es wurden mikroporöse Fasern hergestellt, indem eine 10% Polyethylenoxid (MW = 100 K), 10% PAN/PVC (MW = 100 K), 80% Dimethylformamid (Gewicht/Gewicht)-Lösung durch das äußere Lumen einer koaxialen Extrusionsdüse extrudiert wurde. Wasser wurde als Koagulierungsmittel verwendet und mit dem Polymer durch die Mittelbohrung der Düse koextrudiert. Die nominale MWCO dieser Fasern war 2000 kD. Die Faser hatte einen Innendurchmesser von 0,8 mm und einen Außendurchmesser von 1 mm.
Fötales Gehirngewebe wurde gemäß dem Verfahren von Tresco et al., Society for Neuroscience Abstracts, 18: 393.2 (1992) hergestellt. Das Gewebe wurde in diese Fasern in Gegenwart von Matrigel (Gollaborative Research) als ein Wachstumssubstrat eingebracht und in das Striatum von gesunden erwachsenen männlichen Sprague Dawley-Ratten innerhalb von 3 h der Gewebe-Isolierung implantiert. Die Ratten wurden nach 2 (n = 3) und 4 (n = 4) Wochen getötet und die Implantate wurden histologisch analysiert. Nach 2 und 4 Wochen waren lebensfähige Zellen vorhanden, weiche morphologische Phänotypen anzeigten, die ähnlich waren zu Kulturen, welche in vivo gehalten und zur gleichen Zeit isoliert wurden. Manche der Zellen färbten sich mit Tyrosinhydroxylase, was ein neuronales Überleben in vivo für mindestens 4 Wochen anzeigt.

Beispiel 2

Herstellung von Makrokapseln unter Verwendung von niedermolekularen Additiven

Die folgenden Gießlösungen wurden für Hohlfasern hergestellt:
Lösung 1 enthielt 12,5% PAN/PVC, 50,0% Polyethylenglykol (MW 200) (PEG- 200) und 37,5% N-Methylpyrrolidon (NMP). PEG-200 ist ein niedermolekulares Additiv, in welchem PAN/PVC nicht löslich ist. Bei Raumtemperatur ist die Lösung ein homogenes Gel. Die Gießlösung wird auf 50ºC erwärmt und bei Umgebungstemperatur in einem Bad phaseninvertiert. Dies führt zu einem Polymer, in welchem die nMWCO ungefähr 120 kD ist. Die Hohlfaser, die aus einer Lösung ohne PEG-200-Additiv resultiert, weist einen nMWCO von ungefähr 80 kD auf.
Lösung 2 enthält 13% PAN/PVC, 15% Glycerin und NMP. Es ist bei Raumtemperatur ein Feststoff und wird auf die oben beschriebene Weise spinnverarbeitet. Es können Membranen mit nMWCO im Bereich von ungefähr 200 kD bis zu mikroporösem Bereich und sogar bis zum zellpermeablen Bereich hergestellt werden.

Beispiel 3

Herstellung von Makrokapseln unter Verwendung von Lösungsmittel-Zugabe in der Bohrung (bore) und dem Bad

Eine 12,5% PAN/PVC, 87,5% NMP-Lösung wird hergestellt. Wenn diese Lösung in Wasser koaguliert wird, führt dies zu einer Standard-Ultrafiltrations- Membran. Wenn die gleiche Lösung in einer Lösungsmittel/Wasser-Mischung präzipitiert wird, erhöht sich die MWCO stark bis zu dem sehr hohen Endpunkt des Ultrafiltrations-Bereiches (200 kD).

Beispiel 4

Wiederauffindung immunoisolatorischer Zellen: Alginatstränge

Eine sterile Suspension pankreatischer Inseln wurde von menschlichen Pankreas durch das Verfahren von Scharp et al., US-Patent Nr. 4,868,121 hergestellt. Eine 2%-Lösung von Natriumalginat in physiologischer Sahne (PS; 150 mM NaCl) wurde unter sterilen Bedingungen hergestellt, welche dann 1 : 1 mit den präparierten Zellen zu einer Endkonzentration von 1% Alginat in der Insel-Suspension verdünnt wurde.
1,0 mm zylindrische "Nudeln" von Alginat (1,0% Gewicht/Alginat, Pronova ®) - enthaltenden menschlichen pankreatischen Inseln, umgeben von einer zellfreien Umfang-Region wurden wie folgt hergestellt. Die Insel-Suspension wurde in die Innenkammer einer geschachtelten Dualbohrungs-Koextrusions- Vorrichtung der Konfiguration, wie sie in der anhängenden US- Patentanmeldung Nr. 07/461,999 beschrieben ist, wovon die innere Bohrung einen inneren Durchmesser von 500 Mikron und die periphere Bohrung davon einen Durchmesser von 600 Mikron aufweist, eingebracht. Die äußere Kammer dieser Vorrichtung wurde mit einer Lösung steriler 1% Natriumalginat in PS beladen.
Die Spitze der Düse wurde in ein Bad getaucht, das eine sterile Lösung von 1% CaCl&sub2; in PS enthält, was die Härtung oder das Gelieren von Alginat durch Vernetzen von Alginat-Polyionen induziert. Die in die Kammern eingebrachten Materialien wurden in dieses Bad koextrudiert, wobei ein sich kontinuierlich bildender Alginat-Zylinder erzeugt wird, enthaltend einen Kernbereich von Alginatmatrix-immobilisierten Inseln und eine umgebende Region von Alginatmatrix, der frei von Inseln ist. Der äußere Durchmesser der Hülle war 1,2 mm. Der innere Durchmesser des Kerns war 1,0 bis 1,05 mm. Das gesamte Inselvolumen des Kerns war 0,8 mm³ (200 Inseln). Das gesamte Kernvolumen war 25,98 mm³. Das Volumen der Inseln war 3% des gesamten Kernvolumens. Das Alginat des Kerns wurde mit dem Alginat der Hülle vernetzt.
Die relative Dicke der umgebenden Region wurde modifiziert, indem die Geschwindigkeiten, bei welchen die Materialien von den Kern- und peripheren Bohrungen der Düse extrudiert wurden, eingestellt wurden. Im Allgemeinen nimmt die Wanddicke mit Zunahme des Flusses in dem Kern ab. Wenn der Fluss in der peripheren Bohrung erhöht wurde, nahm die Wanddicke zu. Die Regionen der verwendeten Flussraten waren die gleichen für sowohl den Kern als auch die Peripherie (0,3 bis 1,5 ml/min). Die Enden des Zylinders wurden verschlossen, indem der Zylinder zuerst in ein steriles 2%-Natriumalginat-Bad, dann in ein steriles 1%-CaCl&sub2;-Bad getaucht wurde. Die so gebildeten Makrokapseln wurden vor der Implantation in sterilem Gewebe-Kulturmedium gehalten.
Diese Insel-enthaltenden "Nudeln" wurden auf 2 cm Länge geschnitten, indem ein steriles Skalpell verwendet wurde, und dann in PEO/PAN/PVC-Kapseln mit einem Innendurchmesser von 1,5 mm eingebracht und subkutan in diabetische Empfänger implantiert.
Nach 4 Wochen wurden die Kapseln wieder aufgefunden und die Inseln auf Lebensfähigkeit untersucht.

Beispiel 5

Wiederauffindung immunoisolierter Zellen: Mikrosphären

Mikrosphären, die lebende Zellen enthalten, werden durch zwei separate Verfahren hergestellt. Thermoplastische Mikrosphären, enthaltend PC12-Zellen, werden gemäß dem Verfahren von Sefton, US-Patent Nr. 4,353,888 hergestellt. Alginat : Polylysin-Mikrosphären werden gemäß dem Verfahren von Lim, US- Patent Nr. 4,352,883 hergestellt. In beiden Fällen haben die Mikrosphären einen Durchmesser von nicht größer als 500 um. Mikrosphären werden in die thermoplastischen Rückhalte-Vorrichtungen, die in Beispiel 1 beschrieben sind, eingebracht. Bei allen Vorrichtungen wurde gefunden, dass sie nominale MWCO von größer als 200 kD aufweisen.
Die PC12-enthaltenden Makrokapseln werden in Ratten-Striata implantiert und für 2 Wochen belassen. Die Makrokapseln werden zurückgewonnen, auf Anhaltspunkte für ein fibromartiges Überwachstum inspiziert und auf Zell- Lebensfähigkeit geprüft.

Beispiel 6

Implantation von adrenalen chromaffinen Zellen

Menschliche adrenale chromaffine Zellen wurden aus menschlichen Kadavern durch das Verfahren von Sagen, US-Patent Nr. 4,753,635, hergestellt und in permselektive Makrokapseln, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurden, platziert. Die Kapseln werden intrathekal in Lumbar-Bereiche menschlicher Patienten, die unter chronischen Schmerzen leiden, implantiert. Nach 3 Wochen werden die Kapseln entfernt, und es wurde gefunden, dass sie intakt waren und lebensfähige Zellen enthielten.

Beispiel 1

Bakteriophagen-Rückhalte-Test

Es wurde ein Test entwickelt, um die Transport-Retardation von Lambda gt 10 zu messen, bereitgestellt durch eine PAN/PVC-Membran. Dieser Phage wurde gewählt, um als ein Modellsystem zu dienen, um eine Fluss-Retardation für die Einkapselung von Tierviren ähnlicher Größe oder größer vorherzusagen. Drei verschiedene Fasern wurden untersucht, wie es in Tabelle 4 gezeigt ist: Tabelle 4
* entspricht einer nominalen MWCO von 100 kD.
Ein Vorrat von Lambda gt 10-Phagen wurde auf NM514 (E.coli von ATCC)- Rasen gezüchtet. Ausgewählte Platten wurden mit 5 ml SM-Puffer (hergestellt unter Verwendung der Verfahren von Sambrook J. et al., supra) rekonstituiert. Diese Platten wurden für 4 h mäßig geschüttelt, die Flüssigkeit wurde in ein Zentrifugen-Röhrchen pipettiert und 100 ul Chloroform wurden zugegeben. Nach Inkubation für 1 h wurde die Kultur bei 3700 U/min zentrifugiert und der Überstand wurde rückgewonnen. Vor der Faser-Beladung wurde der Phagen- Titer bestimmt.
NM514 wurden in NZCYM-Medium, zu dem 0,2% Maltose auf eine optische Dichte (OD) von 2 zugesetzt wurden, gezüchtet. Nachdem die OD bestimmt war, wurden die Bakterien bei 3700 U/min zentrifugiert und in 10 mM MgSO&sub4; (hergestellt in sterilem Wasser) unter Verwendung eines 37ºC-Schüttelbades resuspendiert, bis das Pellet vollständig suspendiert war.
Die Testvorrichtung bestand aus einer 12 cm langen Hülle mit einem Innenvolumen von 9 ml, gefüllt mit SM-Medium (Fig. 2). Zwei oder drei Fasern wurden in die Luer-Außenkegel des Testbehälters unter Verwendung von 5- Minuten-Epoxy eingebracht. Nach dem Einbringen der Fasern in die Vorrichtungen wurden sie durch Ultrafiltration mit Milli-Q-Wasser (100 · Faservolumen) entglyceriniert. Die PAN/PVC-Fasern wurden durch Ultrafiltration von HL1-Medium mit 2x dem Faservolumen durch die Fasern konditioniert. Diese Behandlung simuliert die Beladungs-Bedingungen, die zur Einkapselung von Zellen verwendet werden. Die Porengröße der Membranen wird durch Protein-Adsorption an die Membran-Oberfläche verringert. Im Gegensatz dazu wurden unkonditioniertes Polysulfon, mikroporöse Fasern verwendet, um die Erhöhung der Phagen-Diffusion mit erhöhter Membran- Porengröße zu evaluieren. Die Beladung der Faser mit Bakteriophagen wurde durch Injektion von 0,1 ml des Bakteriophagen-Vorrats in die Faserlumen durch den Luer unter Verwendung einer 1 ml-Einwegspritze erreicht.
Nach dem Einbringen und dem Konditionieren der Fasern wurden die Füllbäder durch frischen SM-Puffer ersetzt. Dann wurden Fasern beladen und die Faserenden wurden gecappt, und die Vorrichtungen wurden in einen 37ºC- Inkubator eingebracht. Die Bäder wurden nach 1, 3 und 6 Wochen getestet und auf die Bakteriophagen-Konzentration untersucht, indem Standard-Plaque- Prozeduren verwendet wurden.

Ergebnisse

Tabelle 5 zeigt die Phagen-Konzentration und DMembran zur Zeit 0 und 6 Wochen. Tabelle 5 Verteilung von Lambda gt10
Wie aus dem Unterschied der Phagen-Konzentrationen in dem Lumen und dem Bad bei 6 Wochen hervorgeht, lieferte die Membran eine beträchtliche Widerstandsfähigkeit gegen Phagen-Diffusion in das Bad. Es trat eine Abnahme in der Phagen-Gesamtaktivität nach 6 Wochen Einkapselung auf. Kontrollen zeigten an, dass Phagen-Vorräte, die bei 37ºC bei hohen (1 · 10¹&sup5; pfu/ml) und niedrigen (1 · 10³ pfu/ml) gehalten waren, nach 6 Wochen stabil sind. Wenn die Phagen an die Membran-Oberflächen adsorbierten, konnte dies für die gemessene Abnahme der Aktivität über die 6 Wochen verantwortlich gemacht werden. Folglich wurde die Phagen-Rückhaltung bei 6 Wochen auf 2 Wege berechnet: (A) Die Gesamtmenge an Phagen, die in die Kapseln geladen wurde, wurde durch die gesamte Phagen-Konzentration in dem Bad bei 6 Wochen dividiert oder (B) die Gesamtmenge an Phagen, die in dem Lumen der Kapsel bei 6 Wochen vorhanden ist, wurde durch die Phagen-Konzentration in dem Bad bei 6 Wochen dividiert. Diese berechneten Verringerungen im Log- Maßstab der Phagen-Diffusion sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 Verringerung der Phagen-Diffusiona im Log-Maßstab
a Verfahren A Verringerung im Log-Maßstab = Lumen-Konz. bei 6 Wochen/Bad-Konz. bei 6 Wochen
Verfahren B Verringerung im Log-Maßstab = Lumen-Konz. bei 0 Wochen/100/ Bad-Konz. bei 6 Wochen
Da die mittleren Dimensionen der untersuchten Lambda gt 10 95 · 65 nm für den Kopf und 17 · 115 nm für den Schwanz sind, zeigen diese Ergebnisse, dass PAN/PVC-Membranen hinzugekommene Mittel, die größer sind als 95 nm, durch einen Faktor von mindestens 6 Größenordnungen zurückhalten können.

Beispiel 8

Phi-X-Phagen-Rückhalte-Test

Die gleichen Membran-Typen und Verfahrens-Typen wie in Beispiel 7 wurden verwendet, um die Transport-Retardation der phi-X-Phage zu bestimmen. Dieser Phage weist einen Durchmesser von ungefähr 24 bis 30 nm auf und ist im Wesentlichen sphärisch. Die Ultrafiltrations-PAN/PVC-Membran wurde mit PC1-Medium vorkonditioniert und die mikroporöse Polysulfon-Faser war unbehandelt. Die Proben wurden nach 3 Tagen für die mikroporöse Faser und nach 1 und 2 Wochen für die Ultrafiltrations-Faser genommen. LB-Brühe (hergestellt unter Verwendung der Verfahren von Sambrook J. et al., supra) wurde anstelle des SM-Mediums verwendet. Der phi-x-Phage weist eine niedrigere Verringerung im Log-Maßstab bei einer kürzeren Zeit auf, als es für den größeren Lambda gt 10-Phagen beobachtet wurde (Tabelle 6 versus Tabelle 5). Tabelle 7 Verringerung der Phagen-Diffusiona im Log-Maßstab.
*Behälter 1,2,3: PAN/PVC, konditioniert mit PC1-Medium.
Behälter 4,5,6: Polysulfon unbehandelte Fasern

Beispiel 9

Protein-Rückhalte-Test

Die in Beispiel 7 untersuchten Fasern wurden ferner durch das Messen der prozentualen Abweisung für mehrere Standard-Proteine und eine Mischung von polydispersen Dextranen charakterisiert. Die Abweisungen für die Proteine sind in Tabelle 8 gezeigt. Die Abweisungen für die polydispersen Dextrane sind in den Fig. 3 und 4 gezeigt. Tabelle 8
Auf alle hierin zitierten Dokumente wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.

Claims

1. Implantierbare permselektive Vorrichtung zur Verwendung in der Zelltherapie mit einem Kern und einer Hülle, umfassend:

(a) einen Kern umfassend lebende Zellen, die fähig sind, ein ausgewähltes biologisch aktives Produkt zu sekretieren oder eine ausgewählte biologische Funktion bereitzustellen; und

(b) eine äußere Hülle, die den Kern umgibt, wobei die Hülle ein biokompatibles Material, das frei von den Zellen ist, umfasst und eine nominale Molekulargewichts-Grenze von 1000 kD bis 3000 kD aufweist;

dadurch gekennzeichnet, dass die Hülle eine nicht-immunoisolatorische Makrokapsel bildet und eine Porengröße von 0,1 um bis 10 um hat.

2. Permselektive Makrokapsel nach Anspruch 1, wobei der Kern ausserdem eine Hydrogel-Matrix umfasst, wobei die lebenden Zellen durch diese Matrix immobilisiert sind.

3. Permselektive Makrokapsel nach Anspruch 1, wobei das biokompatible Material aus Hydrogelen besteht.

4. Permselektive Makrokapsel nach Anspruch 2, wobei der Kern und die biokompatiblen Materialien aus dem gleichen Hydrogel bestehen.

5. Permselektive Makrokapsel nach Anspruch 1, wobei das biokompatible Material mit einem mehrwertigen Ion vernetztes Alginat umfasst.

6. Permselektive Makrokapsel nach Anspruch 1, wobei das biokompatible Material eine thermoplastische Membran umfasst.

7. Permselektive Makrokapsel nach Anspruch 1, wobei die äußere Hülle eine nominale Molekulargewichts-Grenze hat, die unterhalb des Molekulargewichts von schädlichen Viren liegt, die von den lebenden Zellen abgegeben werden können.

8. Permselektive Makrokapsel nach Anspruch 1, wobei die lebenden Zellen mit einem Virus genetisch modifiziert worden sind und die nominale Molekulargewichts-Grenze unterhalb des Molekulargewichts dieses Virus liegt.

9. Permselektive Makrokapsel nach Anspruch 8, wobei die äußere Hülle einen Virus-Rückhaltewert von weniger als ungefähr 0,5 hat.

10. Permselektive Makrokapsel nach Anspruch 1, die ferner umfasst:

(c) eine Vorrichtung zur Wiederauffindung der Makrokapsel.

11. Permselektive Makrokapsel nach Anspruch 1, wobei der Kern ausserdem immunoisolatorische Vorrichtungen umfasst, in die die lebenden Zellen eingekapselt sind.

12. Permselektive Makrokapsel nach Anspruch 11, wobei die immunoisolatorischen Vorrichtungen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Mikrosphären und Alginat-Strängen.

13. Permselektive Makrokapsel nach Anspruch 1, wobei das biologisch aktive Produkt ein therapeutisch verwendbares Produkt ist.