HUT67362A - Methods of use of bovine respiratory syncytial virus recombinant dna, proteins, vaccines, antibodies and transformed cells - Google Patents
Methods of use of bovine respiratory syncytial virus recombinant dna, proteins, vaccines, antibodies and transformed cells Download PDFInfo
- Publication number
- HUT67362A HUT67362A HU9300187A HU18793A HUT67362A HU T67362 A HUT67362 A HU T67362A HU 9300187 A HU9300187 A HU 9300187A HU 18793 A HU18793 A HU 18793A HU T67362 A HUT67362 A HU T67362A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- virus
- protein
- recombinant
- bovine respiratory
- respiratory syncytial
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 243
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 184
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 40
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 37
- 241000711895 Bovine orthopneumovirus Species 0.000 title claims description 482
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 87
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 294
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 claims abstract description 78
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 67
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 55
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 28
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims abstract description 12
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 148
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 claims description 128
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 claims description 128
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 claims description 121
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 66
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 66
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 62
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 61
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 58
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 44
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 40
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 35
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 35
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 32
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 29
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 27
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 24
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 claims description 22
- 101710181008 P protein Proteins 0.000 claims description 22
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 claims description 22
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 21
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 19
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 17
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 16
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 11
- 101900141306 Bovine respiratory syncytial virus Major surface glycoprotein G Proteins 0.000 claims description 10
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 9
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims description 5
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims description 5
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 claims description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims 12
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 claims 4
- 208000030925 respiratory syncytial virus infectious disease Diseases 0.000 claims 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims 4
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 111
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 abstract description 92
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 90
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 35
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 abstract description 33
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 16
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 abstract description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 abstract description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 152
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 111
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 74
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 61
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 60
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 56
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 37
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 26
- YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N Tunicamycin II Natural products O1C(CC(O)C2C(C(O)C(O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)C(O)C(O)C(NC(=O)C=CCCCCCCCCC(C)C)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1NC(C)=O YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N tunicamycin Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@@H](O)[C@@H](CC(O)[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)O1)O)NC(=O)/C=C/CC(C)C)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N 0.000 description 19
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 17
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 17
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 16
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 16
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 14
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 13
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 13
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 13
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 13
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 12
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 12
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 11
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 description 10
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 10
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 10
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 10
- 101150082239 G gene Proteins 0.000 description 9
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 9
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 244000309466 calf Species 0.000 description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 9
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 9
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 8
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 8
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 8
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 8
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 8
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 8
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 8
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 7
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 7
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 7
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 7
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 7
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 6
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 6
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 6
- 101710160621 Fusion glycoprotein F0 Proteins 0.000 description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 5
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 5
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 4
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 3
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 3
- 108010059722 Viral Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 3
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 244000144980 herd Species 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 3
- 238000007900 DNA-DNA hybridization Methods 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- GJAARPKBDFKHFS-UHFFFAOYSA-N Gerin Natural products COC(=O)C(=C)C1CC2C(=C)C(=O)C=CC2(C)CC1OC(=O)C GJAARPKBDFKHFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 description 2
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 2
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 2
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 2
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 2
- 241000282806 Rhinoceros Species 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 2
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 1
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 1
- 101000688206 Bos taurus Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 1
- 108010068473 C-terminal binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000252095 Congridae Species 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102100020743 Dipeptidase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710172804 K protein Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010024971 Lower respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710169105 Minor spike protein Proteins 0.000 description 1
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 description 1
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241001307210 Pene Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000711902 Pneumovirus Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 101900202921 Sendai virus Phosphoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101900209501 Vaccinia virus Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010051511 Viral diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 210000004695 acinic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003097 anti-respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000027645 antigenic variation Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 1
- 150000001576 beta-amino acids Chemical group 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 241000902900 cellular organisms Species 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000019788 craving Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001456 gonadotroph Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000001466 metabolic labeling Methods 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010065781 myosin light chain 2 Proteins 0.000 description 1
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079892 phosphoglycerol kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000011451 sequencing strategy Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 108700001624 vesicular stomatitis virus G Proteins 0.000 description 1
- 230000009447 viral pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Virology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
A találmány olyan rekombináns DNS molekulákkal kapcsolatos, melyek szarvasmarha respirációs szincitia vírus /bovine respiratory syncytial = BRS vírus/ proteineket, valamint BRS vírus, proteinekhez hasonló proteineket és ezekből származó peptideket kódolnak. Ez részben szarvasmarha respirációs szincitia vírus proteinek - ide értve az F-et, G-t és N-et kódoló teljes hosszúságú cDNS-akat - klónozásán alapul. A G és F proteineket kódoló DNS-akat vaccinia vírus vektorokba inzertáltuk és ezeket a vektorokat használtuk a G és F proteinek tenyészetben való expresszálására. A G proteineket kódoló vektorokat anti szarvasmarha respirációs szincitia vírus immunválasz indukálására használtuk. A találmány molekulái biztonságos és hatásos szarvasmarha respirációs szincitia vírus vakcinák előállítására használhatók.
A továbbiakban megadjuk a találmány hátterét
A következőkben megadjuk a szarvasmarha respirációs szincitia vírus jellemzését
A szarvasmarha respirációs szincitia /BRS/ vírus 391-2 törzsét egy szarvasmarha respirációs szincitia vírus járvány során izolálták Észak-Karolinában 1984-1985 telén. A járvány öt tejelő csordát, egy borjú neveidét, egy tehenészeti telepet, valamint egy ökör hizlaldát érintett /Fetrow et al., North Carolina State University Agric. Extension Service Vet.
r
• · · ·
News./. A respirációs szincitia vírust, mely egy burokkal rendelkező, egyszálu, negatív sense RNS vírus /Huag and Wertz, 1982, J.Virol.43:150-157; Kingabury et al., 1978, Intervirology, 10:137-153/ eredetileg csimpánzból izolálták /Morris et al., 1956, Proc.Soc.Exp.Bioi.Med.92:544-549/· Ezt követően respirációs szincitia vírust izoláltak emberekből, szarvasmarhákból, juhokból és kecskékből /Chanock et al., 1957, Am.J.Hyg.őb:281-29o; Evermann et al., 1985, Am.J.Vet.Rés. 46:947-951; lehmkuhl- et al., 198o, Arch.Virol.6_5:269-276; Lewis,F.A. et al., 1961, Med.J.Aust.48:932-933; Paccaud and Jacquier, 197o, Arch.Gesamte Virusfőrseh.3o:327-342/· A humán respirációs szincitia /HRS/ virus a fő okozója a súlyos, alsó légúti szervek fertőzéseinek az egy év alatti gyermekeknél. A járvány évente előfordul /Stott and Taylor 1985, Arch. Virol.84:1-52/. Hasonlóképpen a BRS virus bronchiolitist és pneumoniát okoz szarvasmarhánál, és telente a szarvasmarha ágazatban gazdaságilag jelentős járványok fordulnak elő /Bohlender et al., 1982,Mód.Vet.Pract.63:613-618; Stott and Taylor, 1985.Arch.Virul.84:1-52; Stott et al., 198o.J.Hyg. 85:257-27o/. A súlyos BRS virus okozta betegség leggyakrabban a 2-4,5 hónapos borjaknál fordul elő. A BRS virus 391-2 törzse okozta járvány atipikus volt abból a szempontból, hogy a betegség a felnőtt szarvasmarha egyedek többségére hatással volt, ami egy tejelő csorda esetén 5o%-os tejtermelés csökkenést eredményezett, valamint néhány állat elhullását, mig a csorda fiatalabb egyedeire csupán gyenge hatás- 4 -
sál volt /Fetrow et al., 1985» North Carolina State University Agric. Extension Service Vet.Newsl·/.
A BRS vírust először 197o-ben izolálták /Paccaud and Jaquier, 197o, Arch.Gesamte Virusforsch.3o :327-342/ és a kutatás a virális fertőzés gazdára kifejtett klinikai /van Nieuwstadt, A.P. et al., 1982, Proc.l2th World Congr.Dis.Cattle l:124-13o; Verhoeff et al., 1984, Vet.Rés.114:288-293/, patológiai /Baker et al., 1986, J.Am.Vet.Med.Assoc.l89:66-7o; Castleman et al., 1985, Am.J.Vet.Rés.46:554-56o; Castleman et al., 1985, Am.J.Vet.Rés.46:547-553/ és szerológiai vizsgálataira /Baker et al., 1985, Am.J.Vet.Rés.46:891-892; Kimman et al., 1987, J.Clin.Miorobiol.2^:lo97-llo6j Stott et al., 198o, J.Hyg.85:257-27o/ koncentrált. A vírust molekuláris részletességgel nem írták le. Csupán egy tanulmányban hasonlították össze a BRS vírus által fertőzött sejtben talált fehérjéket a HRS vírus által fertőzött fehérjékkel /Cash et al., 1977, Virology 82:369-379/· Ezzel szemben a HRS vírust részletes molekuláris analízisnek vetették alá. A HRS vírus mRNS-ak cDNS kiónjait készítettük el és használtuk lo olyan vírus specifikus mRlíS azonosítására, melyek lo különböző polipeptidet kódolnak, és a lo génből 9-nek a teljes nukleotid szekvenciája ismert /Collins, P.L. et al.,1986, in Concepts in Viral Pathogenesis II” Springer Verlag, New York; Stott and Taylor, 1985, Arch.Virol.84:1-52/.
Két bizonyíték sugallja, hogy a HRS vírus és a BRS vírus különböző respirációs szincitia vírus alcsoportba tartoznak
• · · ·
Először is a BRS vírus és a HRS vírus eltér a különböző fajok szövettenyészet sejtjeinek fertőzési képességében /Paccaud and Jaquier, 197o, Arch.Gesamte Virusvorsch._3o: 327-342/. Egy kivételével a vizsgálatok azt mutatták, hogy a BRS vírus szükebb gazdaspeeifitást mutat, mint a HRS vírus. Matumoto et al. /1974, Arch. Gesamte Virusforsch. 44:28o-29o/ arról számoltak be, hogy a BRS vírus NMK7-es törzse szélesebb gazdaspeeifitást mutat, mint a HRS vírus Long törzse. Másoknak nem sikerült ezt megismételniük más törzsekkel /Paccaud and Jaquier, 197o, Arch. Gesamte Virusforsch. 3o:327-342; Pringle and Crass, 1978, Natúré /London/276:5ol-5o2/. A második bizonyitéksor azt mutatja, hogy a BRS vírus HRS vírustól való eltérései a BRS vírus és a HRS vírus fő, G glükoproteinjei antigenikus különbözőségeinek kimutatásából adódik /Orvell et al., 1987, J.Gen.Vírol. 68:3125-3135/. A monoklonális antitesteket alkalmazó vizsgálatok a HRS vírus törzseket két alcsoportba sorolják a G glükoproteinnel való kapcsolat alapján /Anderson 1985, J.Infect. Dis. 151:626-633; Mufson et al., 1985, J.Gen,.Virol. 66:21112124/. Az ezen vizsgálatokban szereplő BRS vírus törzsek G proteinjei nem reagáltak a HRS vírus alcsoportok bármelyikéből származó vírusok ellen létrehozott monoklonális antitestekkel /Orvell et al.,1987, J.Gen.Virol. 68:3125-3135/.
A BRS vírus lehetővé teszi a fő glükoprotein /G/ szerepének tanulmányozását, ehhez kapcsolódva a BRS vírus lehetséges gazdákra való korlátozódását a HRS víruséhoz viszonyítva, valamint a természetes gazdákban a védő immunválasz kiváltá- 6 sához szükséges egyedi virális antigének szerepének tanulmányozását, mely jelenleg nem tanulmányozható könnyen a HRS vírus esetében,
A következőkben megadjuk a G protein ismertetését
Korábbi munkák ezt mutatták, hogy nincs keresztreakció a BRS vírus és a HRS vírus G rögzítő felületi glükoproteinjei között, raig a többi transzmembrán glükoprotein. .között, a fúziós fehérje /P/ és a fő struktur fehérjék /az N,P és az M/ között van antigenikus keresztreakció /Lerch et al,, 1989, J.Virol. 63:833~84o; Orville et al., 1987» J.Gen.Virol. 68: 3125-3135/. A rendelkezésre álló bizonyítékok azt mutatják, hogy a BRS vírus sokkal kevesebb gazdára korlátozódik, tenyészetben csak szarvasmarhák és szarvasmarha-félék sejtjeit fertőzi, míg a HRS vírus számos sejttípust és kísérleti állatot fertőzhet /Jacobs and Edington, 1975» Res.Vet.Scio 18: 299-3o6; Mohanty et al., 1976, J.InfDis. 134:4o9—4-13; Paccaud and Jaquier, 197o, Arch.Gesamte Virusforsch. 3o:327-342/» Mivel a HRS vírus G fehérjéje a virális rögzítő fehérje /Levine et al., 1987, J.Gen.; ifiről. 63:2521-2524/ ez a megfigyelés azt sugallja, hogy a BRS és a HRS vírusok G fehérjéi közötti különbségek lehetnek felelősek a BRS és a HRS vírusoknál megfigyelt kötődésbeni és gazda spektrumbeli eltérésekért.
A HRS vírus G mRNS szekvencia analízisére alapozva feltételezik, hogy a G protein három doménnel rendelkezik: egy • ·
- 7 belső citoplazmás doménnel, egy transzmembrán doménnel és egy külső doménnel, mely a polipeptid háromnegyed részét tartalmazza /Satake jst al., 1985, Iíucl.Acids Rés. 13:7795-7812; Wertz et al., 1985, Proc.Natl.Acad Sci. USA 82:4o75-4o79/. A bizonyítékok azt sugallják, hogy a respirációs szincitia vírus G proteinje úgy helyezkedik el, hogy amino vége a virionon belül és karboxil vége azon kívül helyezkedik el /Olmsted et al., 1989, J.Virol. 13:7795-7812; Viyaja et al., 1988, Mól.Cell.Bioi. 8:17o9-1714; Wertz et al., 1985 Proc. Natl.Acad.Sci, USA 82:4o75-4o79/. Más Paramyxovirus rögzítő fehérjéktől eltérően a respirációs szincitia vírus G proteinje nem rendelkezik sem neuraminidáz, sem hemagglutináló aktivitással /Gruber and Levine, 1983, J.Gen.Virol. 64:825832; Richman et al., 1971, Appl. Microbiol. 21:lo99/. A virionokban és fertőzött sejtekben talált érett G protein becsült molekulasúlya 8o-9o kDa poliakrilamid géleken való vándorlásukra alapozva /Dubovi, 1982, J.Virol. 42:372-378; Gruber and Levine, 1983, J.Gen.Virol. 64:825-832; Lambert and Pons, 1983, Virology 13o:2o4~214; Peeples and Levine, 1979, Virol. 95:137-145/. Ezzel szemben a G mRIYS szekvencia egy 32 kDa molekulasulyu fehérjét határoz meg /Sétáké et al., 1985, Nucl.Acids Rés. 13.:7795-7812; Wertz et al., 1985, Proc.Natl. Acad Sci. USA 82:4ο75τ4ο79/ és amikor a G mRNS~t in vitro transzlációnak vetik alá, egy olyan 36 kDa molekulasulyu fehérje szintézisét irányítja, melyet az anti G szérum specifikusan immunoprecipitál. Kimutatták, hogy N kötésű és exten-8··<·· ziv 0 kötésű glikozilációt mutattak ki a polipeptid vázon /Lambert, 1988, Virology, 164:458-466; Wertz et al., 1989, J.Virol. 63:X/. Glikozidázokat /a cukor addició inhibitorait/ és az 0 kötésű glikozilációban hibás sejtvonalakat használó kísérletek azt sugallják, hogy az érett G protein molekulasúlyának 55%-a az O“kötésü glikozilációnak és 3 %-a az N kötésű ^likozilációnak köszönhető. Azonban ezek a becslések az SDS poliakrilamid gélekben való vándorlásra alapulnak és csupán megközelítő értékek. Az extenziv O-kötésü glikoziláció bizonyítékaival összhangban áll a magas /3o%-os/ treonin és szerin maradékok mennyisége a G protein feltételezett aminosav szekvenciájában /Satake et al., 1985, Nucl.Acids Rés. 13:77957812; Wertz et al., 1985, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82:4o754o79/. A treonin és a szerin olyan aminosav maradékok, melyek az O-kötésü oligoszacharid rögzítési helyeiként szolgálnak /Kornfield and Kornfield, 198o, in: The Biocheraistry of Glycoproteins and Proteoglycans Lenarz ed., Plenura Press, NY. PP. 1-32/ és a HRS vírus G fehérjéjében a treonin és a szerin maradékok 85%-a az extracelluláris doménben található /Wertz et al., 1985, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82:4o75-4o79/. A magas prolin /lo%-os/ szerin és treonin tartalom /3o%-os/ és a G protein extenziv O-kötésü glikozilációja olyan tulajdonságok, melyek a mucinozus fehérjékként /ibid/ ismert celluláris glükoproteinek csoportjára jellemző tulajdonságokhoz hasonlóak, de melyek szokatlanok a virális glükoproteinek kö zött ·· ·· • · ··· ·
A HRS vírusok ízóláturnáit két alcsoportba osztották, az A-ra és a B-re, a G proteineknél megfigyelt antigenikus variációkra alapozva monoklonális antitestek paneljeit használva /Anderson et al., 1985, J.Inf.Dis. 151:626-633; Mufson et al., 1985, J.Gen.Virol. 66:2111-2124/. Azonban létezik néhány olyan monoklonális antitest, mely- mindkét alcsoport G proteinjét felismeri /Mufson et al., 1985, J.Gen.Virol. 66:2111-2124; Orvell et al., 1987, J.Gen.Virol. 68:3125-3135/. A két alcsoportból származó HRS vírusok G mRHS-ainak szekvencia analízise 54%-os általános aminosav azonosságot mutatott a feltételezett G proteinek között, valamint 44%-os aminosav azonosságot a fehérjék extracelluláris dóménjeiben /Johnson et al., 1987, Proc.Natl.Acad,Sci. USA 84:5625-5629/.
Az alábbiakban bemutatjuk az F proteint
Az érett BRS vírus F proteinje két diszulfiddal kapcsolt polipeptidből, az F^-ből és az F£-ből áll /Lerch et al., 1989, J.Virol. 62:833-84o/. A BRS vírus és a HRS vírus F proteinjeit különböző elektroforetikus mobilitás jellemzi SDS-poliakrilamid géleken /Lerch et al., 1989, supra/. A poliklonális és a legtöbb monoklonális antitest reagál a HRS vírus és a BRS vírus F proteinjeivel /Stott et al., 1984; Orvell et al., 1987; Kennedy et al., 1988, J.Gen.Virol. 69:3o23-3o32; Lerch et aló, 1989, supra/.
A Paramyxovirusok P fúziós proteinje okozza a vírus sej··«· · • * · ·« ···· « « · • «·
- Ιο tekhez való fúzióját és a fertőzött sejtek környező' sejtekkel való fúzióját. Szerkezetileg a különböző Paramyxovírusok F proteinjei hasonlóak egymáshoz. Az F protein prekurzorkónt /Fo/ szintetizálódik, mely proteolitikusan hasitódik egy belső hidrofób régiónál az F^ és Fg polipeptidek létrehozása céljából, melyek diszulfid kötésüek és az aktív fúziós fehérjét hozzák létre. Az F^ polipeptid egy karboxil terminális hidrofób régiójáról úgy vélik, hogy az F proteint a membránhoz rögzíti oly módon, hogy a karboxilvége a sejtben, az amino vége a sejten kívül helyezkedik el. Az F protein N glikozilált /lásd Morisson, 1988, Vírus Research lo:113-136 áttekintő tanulmányát/. A HRS vírus F proteinje egy tipikus paramyxovirus fúziós protein. Az F proteinre specifikus antitestek blokkolják a fertőzött sejtek fúzióját /Walsh and Hruska, 1983, J.Virol. 47:171-177; Wertz et al., 1987, J.Virol. 61: 293-3ol/, valamint semlegesítik a vírus fertőzőképességét /Fernie and Gerin, 1982, Inf.Immun. 37:243-249; Walsh and Hruska, 1983, J.Virol. 47:171-177; Wertz et al., 1987, J.Virol. 61:293-3ol/, de nem gátolják a rögzülést /Levine et. al., 1987, J.Gen.Virol. 68:2521-2524/. Az F protein egy FQ po· lipeptid prekurzorként szintetizálódik, mely két polipeptidre hasad, az F^-re és az Fg-re. Ez .a két polipeptid diszulfid kötésű és N-glikozilált /Fernie and Gerin, 1982, Inf.Immun. 37:243-249; Gruber and Levine, 1983, J.Gen.Virol. 64:825-832; Lambert and Pons, 1983, Virol. 13o:2o4-224/.
- 11 • · ·«··
A következőkben szarvasmarha szincitia virus vakcinák kerülnek leírásra
A szarvasmarha respirációs szincitia virus /BRS/ vakcinák-xat úgy fejlesztették ki, hogy élő vagy inaktivált vírust, vagy virális proteineket tartalmaznak. Frennet et al., /1984, Ann.Med.Vet. 128:375-383/ arról számoltak be, hogy a kombinált élő BRS és szarvasmarha vírusos diarrhoea vakcinával kezelt borjak 81%-a védetté vált a súlyos respirációs szimptómákkal szemben, melyet a legelőkön való kitettség vált ki. Stott et al., /1984, J.Hyg. 93:251-262/ összehasonlítottak egy inaktivált BRS virus vakcinát /BRS vírussal tartósan fertőzött glutáraldehiddel rögzített szarvasmarha orr nyálkahártya sejteket tartalmazott, melyet olajos hatásjavítóval emulgeáltak/ két élő vírust tartalmazó vakcinával, melyek közül az egyik BRS vírusra, a másik HRS vírusra irányul. A Stott tanulmányban /supra/ az inaktivált vírussal kezelt 12 borjú közül 11 teljes védettséget szerzett a BRS vírussal szemben, míg az összes kontroll és az élő vírusokat tartalmazó vakcinával oltott állat megkapta a fertőzést.
Lehetséges, hogy az élő oltóanyag fokozza a BRS virus fertőzést. A BRS vírussal kapcsolatos respirációs szervek súlyos megbetegedése röviddel azután következett be, hogy a borjakat a módosított élő BRS vírussal oltották /Kimman et al., 1989, Vet.Q. 11:250-253/. Park et al.,/1989, Rés.Rep.Rural Dev.Adm. 31:24-29/ beszámoltak egy bináris etiléniminnel /BEI/ ···· ♦
·· inaktivált BRS vírus oltóanyag kifejlesztéséről, melynek immunogenitását tengerimalacokon és kecskéken tesztelték.Szérum neutralizáló antitesteket az inokulálást követő második héten detektálták és az antitestek száma a négy héttel később adott . emlékeztető oltás után emelkedett meg. Kecskék esetében a BRS vírus elleni védő hatást akkor figyelték meg, amikor az állatokat az inokulálást követő 12-dik héten tették ki a vírusnak.
Trudel et al., /1989, Vaccine, 7:12-16/ humán /Dong/ és szarvasmarha /A 519o8/ RS törzsek felületi proteinjeiből készített ’Quil A hatásjavítóhoz adszorbeált immunostimulációs komplexeket vizsgáltak azon képességükre, hogy indukálják-e a neutralizáló antitesteket. A neutralizáló antitestek indukálásában a szarvasmarha RS vírus fehérjékből készített immunostimuláló komplexek szignifikánsan hatékonyabbnak bizonyultak humán megfelelőiknél.
A következőkben megadjuk a találmány összefoglalását
A találmány olyan rekombináns DNS molekulákra vonatkozik, melyek szarvasmarha respirációs szincitia /BRS/ vírus fehérjéket kódolnak, BRS vírus fehérjékre és peptidekre és ezekből készített rekombináns BRS vírus vakcinákra. Ez részben olyan, alapjában véve teljes hosszúságú cDNS-ak klónozására épül, melyek a teljes BRS vírus G, F és N proteineket kódolják. A G, F és N cDNS-ak nukleotid szekvenciáit meghatároztuk és a 2. ábrán /G protein/, a 9. ábrán /F protein/ és a 17· ábrán /11 pro···· « »
- 13 tein/ mutatjuk be.
A találmány egy speciális megvalósulása szerint egy BRS vírus fehérjét vagy peptidet kódoló DNS a BRS vírus fertőzés diagnosztizálására használható vagy másik lehetőségként expressziós vektorokba inzertálható, mely vektorok közé, ezekre való korlátozás nélkül, a következők tartoznak: a vaccinia vírus, baktérium, élesztőgomba, rovar, vagy más, gerinces vektorok. Ezek az expressziós vektorok a BRS vírus fehérje vagy peptid nagyarányú termelésére használhatók; a nyert alapjában véve tiszta virális peptid vagy fehérje alegység vakcina készítményekbe építhető vagy monoklonális vagy poliklonális antitestek előállítására használható, mely a BRS vírus fertőzés diagnosztizálására vagy passzív immunizálásra használható. További megvalósulásokban a találmány által biztosított BRS vírus fehérje szekvenciák szintetikus peptidek vagy proteinek termelésére használhatók, melyek alegység vakcinákban használhatók vagy a poliklonális vagy a monoklonális antitest termelésben. Másik megoldásként egy nem patogén expressziós vektor használható rekombináns vírus vakcinaként.
A következőkben megadjuk a találmány rajzainak leírását
1. ábra. A BRS vírus G cDNS-ainak szekvenálási elve. Az alsó skála a BRS vírus G mRNS nukleotidjainak számát jelöli az 5’ vég felöl. A cDNS-at az M13 mpl9 replikativ forma /RF/ DNS-ba inzertáltuk és a nukleotid szekvenciát didezoxinukle-
- 14 otid szekvenálással határoztuk meg, egy M13 specifikus szekvenáló prímért használva. A nyíl a G mRIíS szekvencia egy a BRS vírus mRNS-án levő szintetikus oligonukleotid primer kiterjedése által meghatározott részét jelöli. A primer szekvenciája komplementer a BRS vírus G mRNS szekvenciájának 154166 bázisaival. A G4, Glo és a G33 kiónokban a cDNS-akat PstI és KpnI-gyel hasítottuk és az Ml 3 mplö RP DNS-ba inzertáltuk a cDNS ellenkező végének szekvenálása céljából. Az egyes klónokhoz tartozó vonalak az adott kiónokból meghatározott mRNS szekvenciái jelölik. Csak a Glo és a G33 klón került teljes egészében szekvenálásra. A Gl, G7, G12, G5 és G3-as kiónok mindegyike rövidebb 5oo nukleotidnál és ezért csak részleges szekvenálásra kerültek.
2. ábra. A BRS vírus komplett G mRNS valamint az A2 és 185379 HRS vírusok G mRNS szekvenciáinak összehasonlítása. Az összehasonlítást Needleman és Wunsch /197o, J.Mól.Bioi. 48: 443-453/ módszerével végeztük a BRS vírus G szekvenciájának és a HRS vírus A2 G szekvenciájának összevetésével. Az AZ. és 18537 HRS vírusok G mRNS szekvenciáinak csupán a /BRS-sel/ nem azonos bázisait tüntettük fel. A pontozott vonalakkal jelölt hézagokat a HRS vírus AZ G szekvencia azonosságának a maximalizálására használtuk, ahogy azt Johnson et al., /1987, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5625-5629/ meghatározták. A HRS vírus konszenzus gén start és gén stop szignálokat felülhuzás jelöli. A különböző vírusok G mRNS stop kódonja és a konszen- 15 -
zus iniciációs kódon be van keretezve. A szekvenciák feletti pontok minden tizedik nukleotidot jelölik és a vonalon levő utolsó nukleotid számát a szekvencia jobb oldalán jelöltük.
3. ábra. A BRS vírus G proteinjei valamint az AZ és 18537-es HRS vírusok G proteinjei feltételezett aminosav szekvenciáinak összehasonlítása. Az összehasonlítás Needleman és Wunsch /197o, J.Mól.Bioi. 48:443-453/ módszerével történt. A HRS vírus AZ.
és 18537 G proteinjeinek azonos aminosavait csillagok jelölik. A feltételezett domének a szekvenciák felett vannak jelölve. A potenciális N-hez kötött szénhidrát addiciós helyek a BRS vírus G proteinjénél fekete háromszögekkel, a HRS A2.virus G proteinjénél fekete rombusszal vannak jelölve a szekvencia felett, és a HRS 18537 vírusnál fekete háromszöggel a szekvencia alatt. A négy konzervált cisztein maradékot sötét körök jelzik. A HRS vírus Al és 18537 G proteinjeinek konzervált tizenhárom aminosav régiója be van keretezve. Egy a HRS vírus AZ. G protein szekvenciájában levő, a HRS vírus 18537 G protein szekvenciájához viszonyított, Johnson et al. /1987, Proc. Natl.Acad. Sci.USA. 84:5625-5629/ által leirt hézagot gondolatjellel jelöltük. A szekvenciák feletti pontok minden tizedik aminosav maradék felett találhatók és az egyes sorokban levő utolsó aminosav maradék sorszámát a szekvencia jobb oldalán található szám jelöli.
4. ábra. Aminosav azonosság az RS vírus G proteinek között. Az általános azonosság és a különböző G proteinek közötti el
térő feltételezett doménekben levő azonosság a 3. ábrán látható összehasonlítás alapján kerül bemutatásra.
5. ábra. A BRS vírus és a HRS vírus AL és 18537 G proteinjének hidrofil pontjai. A hidrofil és hidrofób régiók elhelyezkedését a G proteinek feltételezett aminosav szekvenciája mentén Kyte és Doolittle /1982, J.Mól.Bioi. 157:105-132/ algoritmusának felhasználásával határoztuk meg. Az egyes aminosavakra eső értéket egy kilenc aminosavat magába foglaló ablakon keresztül határoztuk meg. Az alsó skála az aminosav maradékot jelöli az amino terminális metionintól kiindulva, az aminosav szekvencia hidrofil régióit a tengely felett, hidrofób régióit pedig a tengely alatt jelöltük.
6. ábra. A BRS vírus és a rekombináns vaccinia vírus által expresszált G proteinek Western biot analízise. BT sejteket rekombináns vaccinia vírusukkal /moi=lo/, vad tipusu vaccinia vírussal /moi=lo/ vagy BRS vírussal /moi=l/ fertőztünk.
A BRS vírussal /B sáv/, a vad tipusu vaccinia vírussal /W sáv/, a BRS vírus G gént normál /G642+ sáv/ és reverz /G4567- sáv/ orientációban tartalmazó rekombináns vaccinia vírussal és az álfertőzött /M sáv/ sejtekből, a proteineket a sejtek lizálásával gyűjtöttük össze; a vaccinia vírussal fertőzött sejtek esetében hat, a BRS vírussal fertőzött sejtek esetében pedig 36 órával a fertőzés után. A proteineket lo%-os poliakrilamid-SDS gélen szeparáltuk nem redukáló körülmények között és Western biot analízisnek vetettük alá, első antitestként
anti-391-2 szérumot alk.áLmazva. A kötött első antitest azonosítására torma peroxidázhoz kötött anti-szarvasmarha IgG-t használtunk. A BRS vírus fehérjéket jelöléssel láttuk el. Az előfestett fehérje molekulasúly markereket feltüntettük és kilodaltonban kifejezett molekulasúlyuknak megfelelően jelöltük.
7. ábra. A rekombináns vaccinia vírussal fertőzött sejtek felületi immunofluoreszcenciája. Az üveg fedőlemezen szaporított HBp-2 sejtek vagy álfertő.zöttek /Μ/ , vad tipusu vaccinia vírus /W, moi=lo/ fertőzöttek, vagy rekombináns G642 /rW, moi=lo/ fertőzöttek voltak. 24 órával a fertőzés után az élő sejteket anti-391-2 szérummal, majd fluoreszcein konjugált anti-szarvasmarha IgG-vel /H+L/ festettük. Fáziskontraszt /bal oldal/ és fluoreszcensz /jobb oldal/ fényképek ' kerülnek bemutatásra.
8. ábra. A BRS vírus F massenger RNS-e cDNS-ének szekvenálási stratégiája. A lap alján látható skála jelöli a nukleotidok számát a BRS vírus F mRNS-ének 5’ végétől. cDNS-eket inzertáltunk M13 mpl9 replikativ formájú /RF/ DNS-ba és a nukleotid szekvenciát didezoxinukleotid szekvenálási módszert használva, egy M13 specifikus szekvenáló prímért alkalmazva határoztuk meg. Az egyes kiónok vonalai a kiónokból meghatározott mRNS szekvencia részeket jelölik. A nyíl az F mRNS szekvencia azon részét jelöli, melyet a BRS vírus mRNS-en való oligonukleotid kiterjesztésével határoztunk meg. Az oligonukleotid komplementer volt a BRS vírus F mRNS 267-től 284-ig ·· • · · · tartó bázisaival. Az F2o, FB3 és FE5 kiónokon levő cDNS-akat is kimetszettük Pstl-et és KpnI-et használva és M13 mpl8 RF DNS-ba inzertáltuk a cDlJS ellenkező végének szekvenálása céljából. Az F2o, FB5 és FB3 kiónokban levő cDNS-ak fragmentjeit hoztuk létre az EcoRI /FB3, FB5/> vagy Alwltfl /F2o/, Ff ILII /F2o/ és Hpal /F2o/ és EcoRV /F2o/ restrikciós enzimek használatával, majd K13 mpl9-be vagy mpl8 RF DNS-ba klónoztuk vissza abból a célból, hogy meghatározzuk az F mRNS belső területeinek szekvenciáját.
9. ábra. A BRS vírus F mRNS-ának nukleotid szekvenciája. A BRS vírus F mRNS nukleotid szekvenciáját mutatjuk be, ahogy azt cDNS klónokból és a BRS vírus mRNS primer extenziójából meghatároztuk. A szekvenciák fölötti pontot minden tizedik nukleotid fölé helyeztük és a vonalon levő utolsó bázis számát a szekvencia jobb oldalán jelöltük. Bemutatjuk a fő nyílt leolvasási keret feltételezett aminosav szekvenciáját is. A vonalon levő utolsó kódon számát az aminosav szekvencia jobb oldalán jelöltük. A potenciális N kötésű glikozilációs helyeket bekereteztük. Az amino és karboxilterminális hidrofób doméneket feketével aláhúztuk, akárcsak a hidrofób régiót az F^ polipeptid feltételezett amino terminusánál. A feltételezett hasítási szekvenciát szürkével huztuk alá.
10. ábra. A BRS vírus F proteinjének hidrofilitási helye. Az F protein feltételezett aminosav szekvenciája hidrofil és hidrofób régióinak eloszlását Kyte és Doolittle /1982, J.Mol.
• · « ·
«. *
- 19 Bioi. 157:lo5-132/ algoritmusát használva határoztuk meg. Az egyes aminosavak értékét 9 aminosav ablakán keresztül határoztuk meg. A lap alján látható skála az amino terminális metioninnál kezdődő aminosavmaradékot jelöli. Az aminosav szekvencia hidrofil régiói a tengely felett, a hidrofób régiók a tengely alatt láthatók.
11. ábra. A BRS virus P proteinje és az A2, Bong, RSS-2 és 18537 HRS vírusok P proteinjei becsült aminosav szekvenciáinak összehasonlítása. Az összehasonlítást ITeedleman és Wunsch módszerét /197o, J.Mól.Bioi. 48:443-453/ használva végeztük, összehasonlítva a BRS virus P; proteint a különböző HRS vírusok F proteinjeivel. Csupán az eltérő aminosavakat jelöltük a HRS vírusok F proteinjei esetében. A szekvenciák alatti pontokat minden tizedik aminosav alá helyeztük és a vonalon levő utolsó maradék számát a szekvenciától jobbra jelöltük. A proteinek potenciális N-kötésü glikocilációs helyeit bekereteztük. A minden ötödik fehérje között konzervált cisztein maradékot egy világos háromszög jelöli. Az aminoterminális és a karboxil terminális hidrofób doméneket fekete vonallal aláhúztuk, akárcsak az P^ polipeptid feltételezett aminoterminusnál a hidrofób régiót. A feltételezett hasítási szekvenciát szürke vonallal huztuk alá.
12.. ábra. A BRS vírussal és a HRS vírussal fertőzött sejtek által tunikamicin jelenlétében és hiányában szintetizált fehérjék összehasonlítása. A BRS vírussal /B/, a HRS vírussal
- 2ο /Η/, vagy álfertőzott /M/ sejtekből származó proteiné35 két >JS-aetionin beépítésével jelöltük tunikamicin jelenlétében /BT, Hp és sorok/ vagy hiányában /B, H és M/. Vírus specifikus proteineket immunoprecipitáltattunk egy anti respirációs szincitia vírus szérumot használva, majd elektroforézissel 15%-os SDS-poliakrilamid gélen szeparáltuk. A gél autoradiogramját bemutatjuk. Az összes sáv ugyanabból a gélből származik, a H és a Hy sávok a többieknél hosszabb expozíciós idejűek, jelölésű fehérje molekulasúly markereket mutatunk be, melyeket molekulasúlyuknak megfelelően kilodaltonnal jelöltünk.
13. ábra. BRS vírus F protein expressziója rekombináns vaccinia vírussal fertőzött sejtekből. BT sejteket fertőztünk rekombináns vaccinia vírusokkal /moi=lo/, vad tipusu vaccinia vírussal /moi=lo/ vagy BRS vírussal /moi=l/. A BRS vírus F génjét első /F 464+/ és reverz /F 1597-/ orientációban tar·? talmazó rekombináns vírusokból származó proteineket és vad tipusu vaccinia vírusokat /W/ radioaktivan jelöltünk Smetionin beépítésével 3-tól 6 óráig a fertőzést követően. A BRS vírussal fertőzött /B sáv/ és at álfertőzött /M sáv/ sejtekből származó proteineket szintén radioaktív jelölésnek vetettük alá ^S-metionin beépítésével 3 óráig 24 órával a fertőzés után. A proteineket immunoprecipitáltattuk Wellcome anti-RS szérumot használva, majd elektroforézissel összehasonlítottuk 15%-os poliakrilaraid SDS gélen. A gélen fluoro·· ·
gráfiát végeztünk és egy autoradiográramot bemutattunk. A BRS vírus F, Ν, M és P proteineket jelöltük. A jelölésű hérje molekulasúly markereket bemutatjuk és molekulasúlyuknak megfelelően kilodaltonnal jelöljük.
14. ábra. A BRS virus és a rekombináns vaccinia vírus által expresszált tunikamicin jelenlétében szintetizált F proteinek összehasonlítása. BT sejteket rekombináns vaccinia vírusokkal /moi=lo/, vad tipusu vaccinia vírussal /moi=lo/, vagy BRS vírussal /moi=l/ fertőztük. Az ellentétes orientációjú BRS vírus F gént /F464=F/ tartalmazó rekombináns vaccinia vírusokból származó fehérjéket, vad tipusu vaccinia vírust /V/, BRS vírussal /B/ és álfertőzött /M/ sejteket radioaktív jelöléssel láttuk el, úgy, hogy S-inétionint építettünk be 3 órán át a vaccinia vírussal fertőzött sejtek esetében a fertőzés után 3 órával és a BRS vírussal fertőzött sejtek esetében a fertőzés után 24 órával tunikamicin hiányában /F, V, B és M sorok/ vagy jelenlétében /F^ V^, B^, sorok/. A protei neket immunoprecipitáltattuk vaicome anti-RS szérumot használva és 15%-os poliakrilamid SDS gélen elektroforézissel összehásonlittuk. Fluorográfiát végeztünk a gélen és egy autoradiográfot bemutatunk. A BRS vírus F, Ν, M és P proteineket jelöltük. A jelölésű fehérje molekulasúly markereket bemutatjuk és molekulasúlyuknak megfelelően kilodaltónban jelöl tük
• · *
• · · «
15. ábra. A rekombináns vaccinia vírussal fertőzött HBp-2 sejtek felszíni immunofluoreszcenciája. Az üvegből készült fedőlemezen szaporított HEp-2 sejteket í|{er4<Vtüí/M/ vagy vad tipusu vaccinia vírussal /W; moi=lo/ vagy rekombináns virus F464-gyel /rWf; moi=lo/ fertőztük. A fertőzés után 24 órával az élő sejteket anti 391-2 szérummal festettük, melyet a fluoreszceinnel konjugált anti-szarvasmarha IgG-vel /H+L/ való festés követett. A fáziskontraszt /bal panel/ és fluoreszcens /jobb panel/ fényképeket bemutatjuk.
16. ábra. A 3H-glükózamin jelölésű proteinek al-fer-tozöit /M/, szarvasmarha RS vírussal /'5Z.M/, vagy humán RS vírussal /Hu/ fertőzött sejtekből való immunoprecipitációja. A Panel. Humán RS virus G fehérje specifikus antiszérumot állítottunk elő úgy, hogy a HRS virus AZ G fehérjét expresszáló rekombináns W vektorral /vG3ol/ immunizáltunk nyulakat /Stott et al., 1986, J.Virol. 6o:6o7-613/ és a^er£6zöt| BRS vírussal /SZtf/ vagy HRS vírussal /Hu/[sejtekből a radioaktív jelölésű proteinek immunoprecipitációjára használtuk. B. Panel. A szarvasmarha RS virus G fehérjére specifikus antiszérumot oly módon állítottuk elő, hogy a BRS virus G-t expresszáló rekombináns W vektorral /vvG642/ immunizáltunk .egereket és az al-f-er•fcozo^ BRS vírussal /5ZH./ vagy a HRS vírussal /Hu/ fertőzött sejtekből a proteinek immunoprecipitációjára használtuk. G Panel. AzátyertözB^, BRS vírussal /SZN/ vagy HRS vírussal /Hu/ fertőzött sejtek citoplazmás kivonatában jelen levő összes *··· ♦ ·· ’ · · Λ · · · ·«· • ···· · · • ·· ··*·
- 23 3 H-glükózamin jelölésű protein.
17. ábra. A BRS virus N mRIiS nukleotid szekvenciája.
18. ábra. A BRS vírus 1Ί fehérjéjének aminosav szekven ciája
• · »·
- 24 A következőkben megadjuk a találmány részletes leírását
A találmány szarvasmarha respirációs szincitia vírus nukleinsavakkal és fehérjékkel kapcsolatos. A leírás egyértelműsége kedvéért és nem korlátozás céljából a találmány leírását a következő alegységekre osztottuk:
/i/ a szarvasmarha respirációs szincitia vírus gének klónozása /ii/ a szarvasmarha respirációs szincitia virus proteinek expressziója /iii/ a találmány génjei és fehérjéi /iv/ a találmány alkalmazása
A következőkben megadjuk a szarvasmarha respirációs szincitia virus gének klónozási eljárását.
A BRS virus fehérjéket kódoló nukleinsav szekvenciákként definiált szarvasmarha respirációs szincitia /BRS/ virus gének a találmány szerint azonosíthatók a BRS virus raRNS cDNS transzkriptjelnek klónozásával és a teljes hosszúságú BRS virus fehérje kódoló szekvenciákat tartalmazó kiónok azonosításával, vagy másik megoldásként BRS vírust kódoló nukleinsav szekvenciák azonosításával a pRLG414-76-191, pRLF 2ol2-76-192
- 25 *·': : .·· ♦ · «44 ·♦·« · vagy pRLNB3-76 plazmidokból származó próbákat használva vagy a
2., 9., vagy a 17. ábrákon bemutatott szekvenciákból tervezett oligonukleotid próbákat használva.
Például, és nem korlátozás céljából- a BRS vírus mRNS egy teljes nyílt leolvasási keretét tartalmazó cDNS szintetizálható, mely megfelel egy bizonyos fehérjének- BRS vírus mRNS templátot és egy specifikus szintetikus oligonukleotidot használva második szál szintéziséhez. Az oligonukleotid nukleotid szekvenciája meghatározható a BRS vírus mRNS szekvencia analíziséből. Az első szál szintézis D’Alessio et al. leírása alapján végezhető el /1987, Focus 9:1-4/. A szintézist követően az RNS templát RN-áz A-val emészthető /legalább 1 jug/pl/ kb. 3o percig 37 °C hőmérsékleten. A nyert egyszálu cDNS-ak ezután fenolos extrahálással és etanolos kicsapatással izolálhatok. A második szál szintéziséhez használt oligonukleotid előnyösen a kérdéses virális mRNS 5’-végére specifikus szekvenciával rendelkezik és előnyösen tartalmazhat egy hasznos replikációs endonukleáz hasitó helyet, mely a klónozást segíti elő. Az egyszálu cDNS-ak ezután vegyithetők az oligonukleotiddal /kb. 5o ^g/ml/, loo °C hőmérsékletre hevithetők 1 percig és jégre tehetők. Ezután reverz transzkriptáz használható a cDNS-ek második száljának szintetizálására a re akcióiké ver ékben, mely tartalmazhat 5o mM Tris-HCl-ot /pH=8.o/, 5o mM KC1ot, 5 mii MgClg-ot, lo mM ditiotreitolt, 1.6 mM dNTP-ket és loo U reverz transzkriptázt és egy órán át inkubáljuk 5o °C hőmérsékleten. A cDNS-akat ezután fenolos extrakcióval szepar ráljuk a fehérjétől, etanolos precipitációval nyerjük ki és T4DNS polimerázzal tompa-végűvé tesszük, A tompa-végű cDNS-ak ezután egy megfelelő restrikciós endonukleázzal emészthetők /pl., mely felismer egy hasítási helyet az oligonukleotid primerben;de a protein kódoló szekvencián belül nem/, fenolos extrakcióval szeparálhatók a fehérjéből, majd egy alkalmas vektorba klónozhatok.
Másik megoldásként, a virális mRNS-ból létrehozott cDNSak vektorokba klónozhatok, majd a kérdéses nukleinsav szekvenciákat hordozó kiónok hozhatók létre, próbákként olyan oligonukleotidokat használva, melyek a 2. és a 9. ábrán bemutatott, sorrendben a BRS vírus G és F fehérjéit képviselő nukleotid szekvenciák fehérjéit tartalmazzák. A virális cDNS könyvtárak például a Grunstein és Hogness /1975, Proc.Natl.Acad.Sci. USA/ által leirt módszerekkel szkrinelhetők. A visszanyert kiónok ezután restrikciós fragment térképezéssel és szekvenáló technikákkal /pl. Sanger et al., 1979, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 72:3918-3921/ analizálhatók, melyek jól ismertek a tudomány számára. Másik lehetőségként a teljes kívánt gén vagy részei is szintetizálhatok kémiailag a 2. vagy a 9· ábrán bemutatott szekvenciára alapozva.
További megvalósulásokban a találmány nukleinsav molekuláiból származó primerek és/vagy a 2. vagy a 9· ábrán bemutatott nukleinsav szekvenciák vagy az alapjában véve a 3· vagy a 11. ábrán bemutatott aminosav szekvenciákat kódoló nukleinsavak polimeráz láncreakciókban /PGR/ alkalmazhatók /Saiki et ·· „·· • >· · · ·«· — : ··!*«..
<·«4 al.,1985, Science 23ο:135ο-1354/ olyan nukleinsav molekulák létrehozása céljából, melyek BRS vírus proteineket vagy ezekkel összefüggő peptideket kódolnak.
A PCR-hez az átiródó szál, valamint a nem átiródó szál primerjeire is szükség van. Ennek megfelelően egy a BRS vírus nukleinsav egy szegmentjének vagy aminosav szekvenciájának megfelelő degenerált oligonukleotid primer használható az egyik DNS szál /pl. az átiródó szál/ primerjeként és a BRS vírus egy második nukleinsav szegmentjével vagy aminosav szekvenciájával homológ másik degenerált oligonukleotid primer használható a második DNS szál /pl. a nem átiródó szál/ primerjeként. Előnyösen ezek a primerek ismert aminosav szekvenciák szomszédos szakaszaira alapozva választhatók, úgy, hogy ezen primerek PCR-ben való alkalmazása során nyert fontos DNS reakció termékek becsülhető méretűek legyenek /pl. a termék hossza, a bázispárok száma egyezzen meg a két primer hosszának összea gével, valamint a fehérje szegmentben /melyet két primernek megfelelő szegmentek kötnek/levő aminosav maradékok számának háromszorosával. Ezek a primerek ezután a PCR-ben olyan nukleinsav terápiátokkal használhatók, melyek BRS vírus nukleinsav szekvenciákat tartalmaznak előnyösen a BRS vírus mRNS-ból preparált cDNS-at.
A DNS reakció—termékek a tudományban ismert bármely módszerrel klónozhatóko A tudomány területén ismert számos vektor gazda rendszer alkalmazható. A lehetséges vektorok jflözé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül a kozmidok, plazmidok, ♦ ··« *: · ·». · **?· %*·
- 28 vagy a módosított vírusok, de a vektor rendszer kompatibilis kell legyen a használt gazdasejttel. Az ilyen vektorok közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül a bakteriofágok, mint pl. a lambda származékok, vagy a plazmidok, mint pl. a pBR322, pUC, vagy Bluescript /Stratagene/ plazmid származékok. A rekombináns molekulák a gazdasejtekbe transzformációval, transzfekcióval, infekcióval, elektroporációval stb. juttathatók be.
A BRS vírus gén irzertálható egy olyan klónozó vektorba, mely a megfelelő gazda sejtek transzformálására, transzfektálására vagy infektálására használható abból a célból, hogy a gén szekvenciából számos kópia készüljön. Ez elvégezhető olyan módon, hogy a DNS fragmentet ligáijuk egy olyan klónozó vektorba, mely rendelkezik komplementer kohéziós végekkel. Azonban, ha a DNS fragmantálásához használt komplementer restrikciós helyek nincsenek jelen a klónozó vektorban, a DNS molekulák végei enzimatikusan módosulhatnak. Másik lehetőségként bármely óhajtott hely létrehozható nukleotid szekvenciák /kötők/ DNS végekhez való ligálásával, ezek a ligáit kötők tartalmazhatnak restrikciós endonukleáz felismerő szekvenciákat kódoló specifikus kémiailag szintetizált oligonukleotidokat. Továbbá, a PCR-ben használt primerek génsebészettel átalak£.t<=· hatók úgy, hogy megfelelő restrikciós endonukleáz hasitó helyekkel rendelkezzenek. Egy másik módszerben a hasított vektor és a BRS virális gén homopolimer farkazással módosítható. Specifikus megvalósulásokban a gazdasejtek izolált BRS vírus gént
cDNS-at vagy szintetizált DNS szekvenciát magába foglaló rekombináns DNS molekulával való transzformációja lehetővé teszi a gén számos kópiájának létrehozását. Ily ivódon a gén nagy mennyiségben nyerhető a transzformánsok szaporításával, a rekombináns DNS molekulák transzformánsokból való izolálásával és ha szükséges az inzertált gén izolált rekombináns DNS-ból való kinyerésével.
A következőkben megadjuk a szarvasmarha respirációs szincitia vírus fehérjék expresszióját
Egy a BRS vírus fehérjét vagy annak egy részletét kódoló nukleotid szekvencia egy megfelelő expressziós vektorba inzertálható pl. egy vektorba, mely tartalmazza az inzertált fehérjét kódoló szekvencia transzkripciójához és transzlációjához szükséges elemeket. A szükséges transzkripciós és transzlációs jelek biztosíthatók az eredeti BRS vírus génekkel is. Számos gazda-vektor rendszer alkalmazható a fehérjét kódoló szekvencia expressziójára. Ezek közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül a vírussal fertőzött emlős sejtrendszerek /pl. vaccinia vírus, adenovirus, stb/; vírussal fertőzött rovar sejtrendszerek /pl. baculovirus/; mikroorganizmusok, mint az élesztő vektorokat tartalmazó élesztők, vagy bakteriofágplazid- vagy kozmid-DNS-akkal transzformált baktériumok. Ezen vektorok expressziós elemei változó erősségüek és specifikációjuak. Az alkalmazott gazda-vektor rendszertől függően a
számos megfelelő transzkripciós és transzlációs elem közül bármelyik használható.
A DNS fragment egy vektorba való inzertálására vonatkozó bármelyik korábban leirt módszer használható olyan expreszsziós vektorok létrehozására, melyek tartalmaznak egy megfelelő transzkripciós/transzlációs kontroll jelekből és fehérje kódoló szekvenciákból álló kiméra gént, izek a módszerek magukba foglalhatnak in vitro rekombináns DNS és szintetikus technikákat, valamint in vivő rekombinációkat /genetikai rekombináció/. A BRS vírus fehérjét vagy peptid fragmentet kódoló nukleinsav szekvencia expressziója szabályozható egy második nukleinsav szekvenciával oly módon, hogy egy BRS vírus fehérjét vagy peptidet expresszálunk a rekombináns DNS molekulával transzformált gazdában. Például a BRS vírus fehérje expressziója kontrollálható bármelyik a tudomány e területén ismert promóter/erősitó elemmel. A BRS vírus fehérje vagy peptid expressziójának szabályozására használható promóterek közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül a GMV promóter /Stephens and Cockett, 1989, Nucl.Acids Rés. 17:711o/ az SV4o korai promóter régió /Bernoist and Chambon, 1981, Natúré 29o: 3o4-31o/ a Rous sarcoma vírus 3’ terminális ismétlődésében található promóter /Yamamoto et al., 198o, Cell 22:787-797/, a herpes tiraidin kinéz promóter /Wagner et al 1981, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 78,:144-145/ a metallotionin gén szabályozó szekvenciái /Brinster et al., 1982 Natúré 296:39-42/. prokarióta expressziós vektorok, mint pl. a béta laktamáz promóter /Villa
- 31 Kamaroff et al., 1978» Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 75:3727-3731/ vagy a tac promoter /DeBoer et al., 1983, Proc.Natl.Acad· Sci.USA, 8o:21-25/, lásd még Useful proteins fór recombinant bacteria in Scientific American, 198o, 242:74-94; nopalin szintetáz promoter régiót magukba foglaló növényi expressziós vektorok /Herrera-Estrella et al., Natúré 3o3:2o9-213/ vagy karfiol mozaik virus 35S RNS promoter /Gardner, et al., 1981, Nucl.Acids Rés. 9:2871/, és a fotoszintetikus ribulóz bifoszfát karboxiláz enzim promotere /Herrera-Estrella et al., 1984, Natúré 31o:115-12o/; élesztőkből vagy más gombákból származó promoter elemek, mint pl. a Gál 4 promoter, az ADC /alkohol dehidrogenáz/ promoter, PGK /foszfoglicerol kináz/ promoter, alkalikus foszfatáz promoter, és a következő állati transzkripciós szabályozó régiók, melyek szövet specifitást mutatnak, és melyek transzgenikus állatoknál kerültek alkalmazásra: elasztáz I gén szabályozó régió, mely pankreasz acinusos sejtekben aktiv /Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant.Biol.5o: 399-4o9; MacDonald, 1987, Hepatology 2/425-515/; inzulin gén szabályozó régió, mely pankreatikus béta sejtekben aktiv /Hanahar., 1985, Natúré 315:115-122/ iramunoglobulin gén szabályozó régió, mely limfoid sejtekben aktiv /Grosschedl et al., 1984 Cell, 38_:647-658; Adams et al., 1985, Natúré 318:533538; Alexander et al., 1987, Mól.Cell.Bioi.7:1436-1444/, egér emlő tumor virus szabályozó régió', mely here , emlő, limfoid és hizó sejtekben aktiv /Leder et al.,1986, Cell 45:485-495/ albumin gén szabályozó régió, mely a májban aktív /Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276/, alfa-fetoprotein gén szabályozó régió, mely a májban aktív /Krumlauf et al.,1985, Mól.Cell.Bioi. ,5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science, 235: 53-58/, alfa-l-antitripszin gén szabályozó régió, mely a májban aktív /Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171/, béta-globin gén szabályozó régió, mely mieloid sejtekben aktív /Mogram et al., 1985, Natúré 315:338-34o; Kollias et al.,1986 Cell 46:89-94/ mielin alap protein gén szabályozó régió, mely az agy oligodendrocita sejtjeiben aktív /Readhead et al.,1987 Cell, 48:7o3-712/, miozin könnyü-lánc 2 gén szabályozó régió, mely a vázizomban aktív /Sani, 1985, Natúré 314:283-286/, és gonadotrop felszabadító gén szabályozó régió, mely a hipotalamuszban aktív /Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378/.
BRS vírus gén inzerteket tartalmazó expressziós vektorok három általános megközelítéssel azonosíthatók:/a/ DNS-DNS hibridizációval, /b/ marker gén funkciók meglétével, vagy hiányával és /c/ az inzertált szekvenciák expressziójával. Az első megközelítésben egy expressziós vaktorba inzertált idegen gén jelenléte detektálható DNS-DNS hibridizációval egy inzertált BRS vírus génjével homológ szekvenciákat tartalmazó próbák használatával. A második megközelítésben a rekombináns vektor/gazda rendszer azonosítható és szelektálható bizonyos marker gén funkciók jelenlétének ill. hiányának alapján /pl. timidin kináz aktivitás, antibiotikumokkal szembeni rezisztencia, transzformációs fenotipus, okkluziós test képződés • · · ♦
bakulovirusokban, stb/, melyeket az idegen gén vektorba való inzertálása vált ki. Például, ha a BRS gén a vektor marker gén szekvenciáján belül inzertálódott, a BRS inzertet tartalmazó rekombinánsok azonosíthatók a marker gén funkció hiánya alapján. A harmadik megközelítésben a rekombináns expressziós vektorok azonosíthatók a rekombináns által expresszált idegen gén termék vizsgálatával.
Ha egy adott rekombináns DNS molekula azonosítása és izolálása megtörtént, a tudomány e területén ismert számos módszer használható annak sokszorosítására. Amennyiben megállapítottuk a megfelelő gazda rendszert és a szaporítási körülményeket a rekombináns expressziós vektorok nagy menniségben is szaporíthatok és előállithatók. Mint azt korábban említettük, az alkalrazható expressziós vektorok közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül, a következő vektorok, vagy azok szár— raazékai: emberi vagy állati vírusok, mint pl. a vaccinia vírus vagy adenovirus, előnyösen a szarvasmarha adenovirus, akárcsak a szarvasmarha herpes vírus, rovar vírusok, mint a baculovirus, élesztő vektorok, bakteriofág vektorok /pl. lambda/ valamint plazmid és kozmid DNS vektorok, hogy csak néhányat nevezzünk meg.
Továbbá választható olyan gazdasejt törzs, mely modulálja az inzertált szekvenciák expresszióját vagy módosítja és felhasználja a génterméket a kívánt speciális módon. Bizonyos promóterekből való expresszió bizonyos indukánsok jelenlétéiben fokozható, igy a genetikailag manipulált BRS vírus fehérje expressziéja szabályozható. Továbbá különböző gazda sejtek jellegzetes és specifikus mechanizmusokkal rendelkeznek a fehérjék transzlációs és transzláció utáni feldolgozására és modifikációjára /pl. glikoziláció, hasítás/. Megfelelő' sejtvonalak vagy gazda rendszerek választhatók az expresszált idegen fehérje kívánt modifikációjának és feldolgozásának biztosítására. Például egy bakteriális rendszerben levő expresszió felhasználható egy nem glikozilált mag protein termék előállítására. Az emlős sejtekben való expresszió felhasználható a heterológ BRS virus fehérje nativ” glikozilációjának biztosítására. Továbbá különböző vektor/gazda expressziós rendszerek befolyásolhatnak olyan feldolgozó reakciókat, mint a különböző mértékig történő proteolitikus hasítás.
Ha a BRS virus gént expresszáló rekombináns azonosítása megtörtént, analizálni kell a génterméket. Ez a termék fizikai vagy funkcionális tulajdonságain alapuló vizsgálatokkal végezhető el.
Ha a BRS virus fehérje vagy peptid azonosítása megtörtént az már izolálható és tisztítható olyan standard módszerekkel, mint pl. a kromatográfia /ioncserés, affinitási és méret szerinti oszlop kromatográfia/ centrifugálás, differenciált oldhatóság, vagy bármely más a fehérjék tisztítására vonatkozó standard technikákkal.
További megvalósulásokban a BRS virus proteinek vagy peptidek előállíthatok kémiai szintézissel a tudomány e területén jól ismert módszerek alkalmazásával. Ilyan módszereket • · · · «
- 35 ismertet pl. Bárány és Merrifield /198o, in The Peptides Vol.II,Gross and Kíeienhofer, eds., J.Academic Press, N.Y. pp. 1-284/.
Ezen felül az olyan rekombináns vírusok, melyek szarvasmarhákat megfertőznek, de azokkal szemben nem patogének, és melyek közé az ezekre való korlátozás nélkül a következők tartoznak: vaccinia virus, szarvasmarha herpes virus és a szarvasmarha adenovirus - átalakíthatok a BRS virus proteinek expresszálására megfelelő promoter elemek alkalmazásával0 Az ilyen rekombináns vírusok használhatók szarvasmarhák megfertőzésére igy fejlesztve ki a BRS virus elleni immunitást. Továbbá a BRS virus proteinek expressziójára képes, azonban potenciálisan patogén rekombináns vírusok a beadást megelőzően a vakcina komponenseként inaktiválhatók.
A következőkben megadjuk a találmány génjeinek és proteinjeinek leírását
A részletesen /supra/ és a 6. és 7· példák szekciójában /infra/ megadott módszereket használva a következő nukleinsav szekvenciákat határoztuk meg és az ezeknek megfelelő aminosav szekvenciákat levezettük. A BRS virus G fehérje cDNS szekvenciáját meghatároztuk és a megfelelő mRNS szekvenciát a 2. ábra rán mutatjuk be. A BRS virus P fehérje cDNS szekvenciáját meghatároztuk és a megfelelő mRNS szekvenciát a 9· ábrán mutatjuk be. A BRS virus N fehérje cDNS szekvenciáját meghatároz9 9 99 tűk és a megfelelő mRNS szekvenciát a 17. ábrán mutatjuk be.
Ezen szekvenciák mindegyike vagy funkcionális ekvivalenseik a találmánnyal Összhangban használhatók. A találmány továbbá a BRS virus G, F vagy N fehérjék szekvenciáira és alszekvenciáira irányul, melyeket olyan nukleinsavak kódolnak, melyek legalább tiz nukleotidot tartalmaznak, olyan szekvenciákra, melyek a BRS virus G, F vagy N fehérjéinek hibridizálható részeit tartalmazzák,melyeket olyan nukleinsav szekvenciák kódolnak, melyek pl. nukleinsav hibridizációs kísérletekben, Southern és Northern biot analízisben alkalmazhatók. A találmány biztosítja a BRS virus G, F vagy N proteinjeit, ezek fragmentjeit és származékait a 3·, 11·, vagy a 18. ábrákon bemutatott aminosav szekvenciáknak vagy ezek funkcionális ekvivalenseinek megfelelően, vagy az ATGC-nél deponált következő cDITS kiónok /pRLG414-76-191, pRLF2012-76-192 , pRLNB3-76/ által kódoltaknak megfelelően. A találmány biztosit olyan BRS virus G vagy F protein fragmenteket vagy származékokat is, melyek tartalmaznak antigenikus determ—-inánsokat.
Például a 2., 9., vagy a 17. ábrán leirt nukleinsav szekvenciák szubsztitúciókkal, addiciókkal vagy deléciókkal megváltoztathatók funkcionálisan ekvivalens molekulák létrehozása céljából. A nukleotidokat kódoló szekvenciák degenerációja következtében más DNS szekvenciák, melyek lényegében ugyanI azt az aminosav szekvenciát kódolják /ahogy azt a 3», 11·, vagy a 18. ábrák mutatják/ használhatók a találmány gyakorlata· bán. Ezek közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül a 2.
··( • · ··
9., vagy a 18. ábrákon bemutatott BRS virus G, F vagy N proteineket kódoló nukleotid szekvenciákat vagy azok részeit tartalmazó nukleotid szekvenciák, melyeket a szekvencián belül funkcionálisan ekvivalens aminosav származékokat kódoló és igy · csendes változást okozó különböző kódonok helyettesítésével változtattunk meg. Hasonlóképpen'a találmány BRS G, F vagy N proteinjei vagy fragmentjei vagy ezek származékai az ezekre való korlátozás nélkül magukba foglalják azokat, melyek primer aminosav szekvenciaként részben vagy egészben tartalmazzák azt az aminosav szekvenciát, melyei lényegében a 3· 11. vagy a 18. ábrán mutatunk be, vagy melyeket a pRLG414-76-191, pRLF2ol2-76-192 vagy pRLITB3-76 kódol és melyek tartalmaznak olyan megváltoztatott szekvenciákat, melyekben a funkcionálisan ekvivalens aminosav maradékokat csendes változást okozó szekvencián belüli maradékokkal helyettesítünk. Például egy vagy több szekvencián belüli aminosav maradék helyettesithatő egy másik hasonló polaritásu aminosavval, mely funkcionális ekvivalensként működik, csendes változást eredményezve. A szekvencián belüli aminosav helyettesítések azon osztály elemei közül választhatók ki, melybe az aminosav tartozik. Például a nem poláros /hidrofób/ aminosavak közé tartoznak az alanin a leucin, az izoleucin, a valin a prolin, a fenilalanin, a triptofán és a metionin. A poláris neutrális aminosavak közé tartoznak a glicin, a szerin, a treonin, a cisztein, a tirozin, az aszparagin és a glutamin. A pozitív töltésű /bázikus/ aminosavak közé tartoznak az arginin, a lizin, és a hisztidin.
- 38 A negatív töltésű /savas/ aminosavak közé tartoznak az aszparaginsav és a glutaminsav. A találmány hatáskörébe tartoznak azok a BRS vírus proteinek vagy ezek fragmentjei vagy származékai, melyek különbözőképpen változnak meg a transzláció alatt vagy után, pl. glikoziláció ,:proteolitikus hasítás, antitest molekulára vagy más celluláris ligandumra való kötés stb által.
Továbbá a találmány rekombináns BRS vírus G,F vagy N pro teint kódoló nukleinsav szekvenciái úgy manipulálhatók, hogy azok módosítsák a BRS vírus protein feldolgozását vagy expresszióját. Például az erre való korlátozás nélkül egy jel szekvencia inzertálható a BRS vírus G,F vagy N proteint kódoló szekvenciától upstream irányba, lehetővé téve a BRS vírus G,F, vagy N proteinjeinek szekrécióját, ezáltal elősegtive összegyűjtését vagy bioelérhetőségét.
Továbbá egy adott BRS vírus proteint kódoló nukleinsav szekvencia manipulálható in vitro vagy in vivő transzláció iniciáció és/vagy terminációs szekvenciák létrehozása és/vagy megsemmisítése céljából, vagy kódoló régiókban való variációk kialakítása céljából és/vagy uj restrikciós endonukleáz helyek kialakítása vagy korábban létezők megszüntetése céljából, további in vitro modifikációk elősegítése végett. A tudomány e területén ismert mutagenezisre vonatkozó bármely technika alkalmazható ideértve az ezekre való korlátozás nélkül az in vitro irányított mutagenezist /Hutchinson et al., 1978, J.Biol.Chem., 2^52:6551/ TAB+ literek /Pharmacia/ hasz.: ···: ;
• .* · · ··· • · ···«· * * · · · ·«
- 39 nálatát, stb.
A továbbiakban megadjuk a találmány hasznosítását
A továbbiakban megadjuk a szarvasmarha respirációs szincitia vírus vakcinák leírását
A találmány felhasználható biztonságos és hatékony BRS vírus vakcinák előállítására. A találmány szerint a vakcina fogalmát úgy értelmezzük, hogy egy olyan preparátumra vonatkozik, mely immunválaszt vált ki a preparátum egy komponensével szemben. A találmány előnyei közé tartozik a BRS vírus proteinek mennyiségi előállításának lehetősége vakcinákban való felhasználáshoz, vagy passzív immunizációs eljárásokban használható antitestek előállítására, valamint olyan rekombináns vírus vakcinák biztosításának lehetősége, melyek olyan immunogén BRS vírus proteineket termelnek, melyek nem patogének. Ezek az alternatívák kikerülik a módosított élő BRS vírus vakcinák alkalmazását, melyek súlyos szimptómákat okozhatnak olyan szarvasmarhában mely előzőleg BRS vírusnak volt kitéve.
A találmány szerint a BRS vírus nukleinsav szekvenciái inzertálhatók egy megfelelő expressziós rendszerbe, a kívánt BRS vírus protein nagy mennyiségben való előállítása céljából. A találmány speciális megvalósulásában a BRS vírus G,F vagy 1Ϊ proteinjei előállíthatok nagy mennyiségben, ily módon alegységek vakcinákban való alkalmazása céljából. A találmány előny-
- 4ο ben részesített speciális megvalósulásában a BRS vírus G,F vagy N proteinek rekombináns vaccinia vírusokkal· expresszálhatók ezek közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül az rWF464, /B fehérjét termelő vírus/ vagy az rWG642 /G proteint termelő vírus/, ezek összegyüjthetők majd protein alegységként egy megfelelő gyógyszerészeti hordozóban alkalmazhatók.
Másik lehetőségként rekombináns vírus - melyek közé az ezekre való korlátozás nélkül a vaccinia virus, a szarvasmarha herpes virus és a szarvasmarha adenovirus és a retrovirusok tartoznak, melyek szarvasmarhában nem patogének, de melyek BRS virus proteint expresszálnak - használható szarvasmarha megfertőzésére, ily módon immunitást okozva a BRS vírussal szemben járulékos betegség nélkül. A BRS virus G fehérjéje vagy egy részletének vagy származékának termelése rekombináns vírussal oltott állatokban meggátolhatja a virus sejtekhez való kapcsolódását ily módon limitálva a fertőzést.
A találmány további megvalósulásaiban a BRS virus protein vagy peptid kémiailag szintetizálható vakcinákban való alkalmazás céljából.
A BRS virus proteinekből származó peptid fragmenteket tartalmazó vakcináknál kívánatos lehet olyan peptidek szelektálása, melyek nagyobb valószínűséggel váltanak ki immunreakciót. Például a BRS virus fehérje aminosav szekvenciája számitógépes analízisnek vethető alá felületi epitópok azonosítására, olyan módszert alkalmazásával az erre való korlátozás nélkül, melyet pl. Hopp és Woods írtak le /1981, Proc.Natl.
.: ··*: * ·♦ ···.
• · · · : φ· * · ··· · • · · ·· ..
- 41 Acad.Sci. USA 78:3824-3828/, melyet sikeresen alkalmaztak Hepatitis B felületi antigén antigenikus peptidjelnek azonosítására. Kívánatos lehet a BRS vírus peptidek módosítása is az immunogenitásuk fokozása érdekében, például a peptidek kémiai módosításával vagy a peptidek hordozó molekulára való kötésével.
A találmány vakcinái megfelelő gyógyszerészeti hordozókban többféle utón adhatók be, pl. az ezekre való korlátozás nélkül nazálisán, orálisan, intramuszkulárisan, szubkután vagy intravénásán és előnyösen intratracheálisan vagy szkarifikáció utján. A találmány előnyben részesített megvalósulásaiban Ιοθlo rekombináns vírus adható be egy oltás során. Kívánatos lehet a találmány alegység vakcináinak hatás javítóval együtt való beadása, mint pl. az ezekre való korlátozás nélkül Freundféle /teljes vagy nem teljes/ ásványi gélek, mint pl. az alumínium hidroxid, felületaktív anyagok mint pl. a lizolecitin pluronikus poliolok polianionok, peptidek., olaj emulziók 'keyhole limpet hemocianidok, dinitrofenol, vagy Bacillus calmette-Guérin /BOG/ vagy Corinebacterium parvum. Szükség lehet többszöri oltásra protektiv és/vagy hosszú távú immunitás elérése céljából.
A következőkben meg-adjuk a szarvasmarha respirációs szincitia vírus proteineket
További megvalósulásokban a találmány nukleinsav, prote··
- 42 in vagy pepiid molekulái felhasználhatók a BRS virus proteinre irányuló monoklonális vagy poliklonális antitestek kifejlesztésében. A BRS virus fehérjével szemben irányuló raonoklonális antitestek előállítására bármely technika alkalmazható, mely biztosítja az antitest molekulák folymatos sejtvonalakkal tenyészetben történő termelését. Használható pl. a hibridóma technika, melyet eredetileg Kohler és Llilstein /1975» Natúré 256:495-497/ fejlesztettek ki.
A BRS virus protein antitestjének egy molekuláris kiónja ismert technikákkal állítható elő. Rekorabináns DNS eljárás /lásd Maniatis et al., 1982, lüolecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York/ használható olyan nukleinsav szekvenciák létrehozására, melyek monoklonális antitest molekulákat vagy ezek antigén kötő régióit kódolják.
Az antitest molekulák ismert technikákkal tisztíthatok, pl. immunabszorpcióval vagy immunoaffinitás krómatográfiával kromatográfiás módszerekkel mint a HPLC vagy ezek kombinációival, stb.
Olyan antitest fragmentek, melyek tartalmazzák a molekula idiotópját, ismert technikákkal állíthatók elő. Például ezen fragmentek közé tartoznak az ezekre való korlátozásnnéllcül az B/ab’/g fragment, mely az antitest molekulák pepszines emésztésével állítható elő, az Bab’ fragmentek, melyek az P/ab*/^ frágmént diszulfid hídjainak redukálásával állíthatók elő és a 2 Bab vagy Bab fragmentek, melyek az antitest molekulák re- 43 dukáló anyaggal és papainnal való kezelése utján nyerhetők.
A továbbiakban megadjuk a találmány diagnosztikai alkalmazását
A találmány, mely BRS vírus proteineket kódoló nukleinsavakra, proteinekre peptid fragmentekre v<.gy az azokból előállított származékokra valamint BRS vírus proteinek és peptidek elleni antitestekre vonatkozik a BRS vírus fertőzések diagnosztizálására használható.
Például a találmány nukleinsav molekulái BRS vírus nukleinsav jelenlétének detektálására használható BRS vírussal fertőzött állatokban hibridizációs technikákkal ideértve a
Northern-féle lenyomat technikát, melyben egy állatból származó nukleinsav készítményt kiteszünk a találmány egy potenciálisan komplementer nukleinsavának olyan körülmények között, melyek lehetővé teszik a hibridizáció bekövetkezését és a hibridizáció kimutatását.
Például az erre való korlátozás nélkül teljes RNS állítható elő potenciálisan BRS vírussal fertőzött szarvasmarhából nyert nazális szövetcsomókból, tracheális csomókból vagy a felsőbb légutak nyálkahártyájának bármely felületéből. Ezután az RNS alávethető Northern biot analízisnek,melyben a BRS vírus nukleinsavból nyert detektálhatóan jelzett /pl. rádió jelölésű/ oligonukleotid próba kitehető egy olyan Northern biot szűrőnek, mely a szarvasmarha RNS-at a hibridizációt lehetővé tevő körülmények között hordozza; a hibridizáció után a szűrő mosható és a próba szűrőhöz való • *··
-·♦« ♦ .· ί · ·’·· .· ί ·♦·· · · · , • * ·· ♦·
- 44 kötődése autoradiográfiával tehető láthatóvá.
Másik lehető· ségként ha a diagnosztikai mintában a BRS vírusnak alacsony szintjei vannak jelen kívánatos lehet a BRS vírus nukleinsav jelenlétének detektálása a találmány oligonukleotidjainak használatával PCR reakcióban a jelenlevő BRS vírus nukleinsav mennyiségének amplifikálása céljából.
A találmány egy előnyben részesített megvalósulásában tenyésztett sejtekből amplifikált vírus RNS analizálható RS vírus szekvenciákra dot-blot hibridizációval. Az ilyen PCR reakciók termékében a primer által nem biztosított BRS vírus szekvenciák jelenléte a BRS vírus fertőzésre utalna.
További megvalósulásokban a találmány BRS vírus proteinjei és peptidjei BRS vírus fertőzés diagnosztizálására használhatók. Például az ezekre való korlátozás nélkül a BRS vírus fehérjék és peptidek enzim kötött immunoszorbens vizsgálatokban /ELISA/, immonoprecipitációkban, rozettáló vagy Western biot technikákban, anti-BRS vírus antitest jelenlétének detektálására használhatók. Előnyben részesített megvalósulásokban az anti-BRS vírus antitestek titerbeni megnövekedése aktív BRS fertőzést jelezhet. Ezen megvalósulások szerint egy szérum minta kitehető a BRS vírus proteirvvágy peptid hatásának olyan körülmények között, melyek lehetővé teszik az antitest fehérjéhez vagy pepiidhez való kötődését és a kötődés detektálását. Például és az ezekre való korlátozás nélül a BRS vírus protein vagy peptid immobilizálható egy szilárd felületen, kitehető olyan szérum hatásának, mely potenciálisan ·*·♦
- - ··· *··· 9 • ·· tartalmaz anti-BRS vírus antitestet /teszt szérumot/, olyan körülmények között, melyek lehetővé teszik az antitest fehérjéhez vagy peptidheii való kötődését és ezután olyan anyag har fásának tahető ki, mely lehetővé teszi az antitest BRS vírus proteinhez vagy pepiidhez való kötődésének detektálását, például egy detektálhatóan jelölt anti-immunoglobulin antitest detektálást. Másik lehetőségként a BRS vírus protein vagy peptid alávethető Western biot analízisnek és ezután a Western biot tehető ki a teszt szérum hatásának és az antitestek BRS vírus proteinhez vagy pepiidhez való kötődése detektálható a fent leirt módon. A találmány további, nem korlátozott megvalósulásában a BRS vírus protein vagy peptid abszorbeálható vörösvérsejt felületére és az ilyen antigénnel burkolt vörösvérsej~ tek tehetők ki olyan szérum hatásának, mely potenciálisan tartalmazza az anti-BRS vírus antitestet. Az antigénnel burkolt vörösvérsejtek széruma általi rozetta képződés jelezheti a BRS vírus expozíciót vagy az aktív fertőzést.
A találmány további megvalósulásában BRS vírus proteineket felismerő antitestek alkalmazhatók SLISA vagy Western biot technikában BRS vírus proteinek jelenlétének kimutatására, ami aktív BRS vírus fertőzésre utalna.
·*·« ; .·· * · ·· «·· ··
- 46 6-Példa: A szarvasmarha respirációs szincitia vírus G kötődési proteinjének nukleotid szekvenciája és a vaccinia vírus vektorhói való expressziója
A következőkben megadjuk a találmányban alkalmazott anyagokat és módszereket.
A következőkben megadjuk az alkalmazott vírust és sejteket
A BRS vírus 391-2 izolátum, a vad tipusu /Koppenhága törzs/ és a rekombináns vaccinia vírus /W/ a szarvasmarha orrkagyló /BT/ sejtek, HEp-2 sejtek és a timidin kináz negatív /tk~/ 143B sejtek tenyésztése és szaporítása a Hruby és Ball /1981, J.Virol. 40:456-464/ , Lerch et al., /1909» J· Virol. 63:833-84o/ és Stott et al. /1986, J.Virol 6o:6o7-613/ munkáiban leírtak szerint történt.
A következőkben megadjuk a cDNS szintézist a molekuláris klónozást a BRS vírus G specifikus cDNS kiónok azonosításait cDNS-akat szintetizáltunk Gubler és Hoffman /1983, Gene 25;
263-269/ szál helyettesítéses módszerét alke.lmazva, amint azt D’Allesio et al.,/1987, Focus 9.:1-4/ leírták. T4 DNS polimerázt /BRL/.használtunk a cDNS-ak végeinek tompává tételére /Maniatis et al., 1932, in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y./.
·: *’’? · ,.....:
··· : ···· ·*'· ·.’· t
- 47 A cDNS-akat M13mpl9 replikációs /RF/ DNS-ba ligáitűk, melyet megelőzően Smal-gyel emésztettünk és qjelyet borjú bél alkalikus foszfatázzal kezeltünk és alkalmas E.coli DH5 alfa F’ sejtekbe transzfektáltunk /Bethesda Research Laboratories, Hanahan, 1983, J.Mól.Bioi, 166:557-58o/. A BRS virus G specifikus inzerteket tartalmazó M13mpl'9 fágokat a fág DNS dót biot hibridizációjával azonosítottuk /Davis et al., 1986 in: Basic Methods in Molecular Biology Elsevier Science Publishing Co., Inc,, NY,NY/, olyan BRS virus G kiónnal próbáltattuk /Lerch et al.,1989, J.Virol.'63:833-84o/, melyet előzőleg nick transz· lációval megjelöltünk /Rigby et al., 1977, J.Mól.Bioi. 113: 237-251/. Az M13upl9 és a rekombináns fág szaporítását és manipulálását Messing irta le /1983, Methods Enzymol.lol:2o78/.
A következőkben megadjuk az mRNS-on végzett nukleotid szekvenálást és a primer extenziót
E.coli DNS polimeráz 1 /Pharmacia/ Klenow fragmentjét vagy egy módosított T7 DNS polimerázt /Sequenase, US.Biochemicals/ felhasználva aidezoxinukleotid szekvenálást végeztünk lényegében a Lim és Pene /1988,Gene Anal.Tech.5.:32-39/ és Tábor és Richardson /1987, Proc. Natl.Acad Sci. USA 84:47464771/ munkáiban leírtak szerint, egy M13 szekvenálási prímért használva /New England Biolabs/. A BRS virus G mRNS-ának 154166 bázisaival komplementer szintetikus DNS primer extenziója a BRS vírus mRNS templáton Avian mieloblasztosis vírus /AMV/ reverz transzkriptáz /Molecular Genetic Resources/ felhaszná lásával a BRS vírus G mRNS /Air, 1979 Virol. 97:468-472/ 5’ szekvenciájának meghatározása céljából történt.
Az RNS-on való primer extenzióban templátként használt BRS vírus raRNS-at öszszegyüjtöttük a cDNS szintézishez használt mRNS esetében leírtak /Lerch et al., 1989· J.Virol. 63:833-84o/ szerint. A nuk35 leotid szekvenálást és a primer extenziót /ex- 2/ dATP /Amersham/ és poliakrilamid-urea gradiens gélelektroforézis felhasználásával végeztük Biggin et al., /1983, Proc.Natl.Acad. Sci.USA 80:3963-3965/ leírása szerint. A nukleotid szekvenciát a Wisconsin Egyetem Genetikai Computer csoport software csomagjával analizáltuk /Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Rés. 12:387-395/.
A következőkben megadjuk a teljes cDNS-ak szintézisét és a
BRS vírus G mRNS-hoz való klónozását.
Egy a BRS vírus G rnRNS-nak teljes nyílt leolvasási keretét tartalmazó cDNS-at szintetizáltunk a második szál szintéziséhez egy specifikus szintetikus oligonukleotidot használva. Az oligonukleotid nukleotid szekvenciáját a.BRS vírus mRIÍSinak szekvencia analíziséből határoztuk meg. Az első szál szintézisét a D’Alessio et al-nál leírtak szerint végeztük /1987 Focus 9:1-4/. A szintézist követően az RNS templátot RN-áz A-val /1 ^ig/jul/ emésztettük 3o percig 37 °g hőmérsékleten. A
kapott egyszálu cDNS-akat fenolos extrakcióval és etanolos precipitációval izoláltuk. A második szál szintézishez használt oligonukleotid szekvenciája 5’-CACGGATCCACAAGTATGTCCAACC-3* volt az oligonukleotid 5’ végi első kilenc bázisánál tartalmazott egy BamHI restrikciós enzim helyet a génben. Az egyszálu cDNS-akat összekevertük az oligonukleotiíokkal körülbelül 5o jug/jul koncentrációban, loo °C hőmérsékletre hevitettük egy percig, majd jégre helyeztük. AMV reverz transzkriptázt használtunk a aÖNS-ak második száljának szintéziséhez egy 5o mM Tris-HCl-t /pH=8.o/', 5o mid KGl-t, 5 mM MgClg-őt, lo mM ditiotreitolt, 1,6 mM dNTP-ket és loo U AMV reverz transzkriptázt tartalmazó reakció keverékben, amit egy óráirát 5o °C hőmérsékleten inkubáltunk. A cDNS-akat fenolos extrakcióval választottuk el a proteinektől, etanolos prescipitációval nyertük ki és a végeket T4 DNS polimerázzal tompává tettük. A tompa végűvé tett cDNS-akat ezután BamHI restrikciós enzimmel emésztettük /Bethesda Research Laboratoriss/ és fenolos extrakcióval választottuk el a proteinektől. A BamHI-gyel és Smal-gyel emésztett, majd borjú intesztinális foszfatázzal kezelt M13mpl8 RF DNS-at oldat formájában összekevertük a cDNS-akkal és etanolos precipitációval kinyertük. A cDNS-akat és a vektort ligáltuk és megfelelő DH5<xF’ sejtekbe transzfektáltuk /Bethesda Research Laboratories/ a Hanahan által leírtak tak szerint /1983» J.Mól.Bioi. 166:557-5θο/.
A következőkben megadjuk a rekombináns vaccinia vírus vektorok előállítását és izolálását
Egy teljes a BRS vírus G mRNS-ának megfelelő cDNS kiónt /G4/ szubklónoztunk egy rekombináns plazmidba, a pIB176-192~ ba, BamHI-gyel és KpnI-gyel való emésztéssel, 14 DNS polimerázzal való kezeléssel /ez a cDNS végeinek tompa végűvé tételére szolgált/ és a ΌΙΒ176-192 egy egyedi Smal helyére való kötésével, A ρΙΒ17θ-192 plazmid hasonló a Ball et al., /1986 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:246-25o/ által leirt rekombináns plazmidokhoz. A ΌΙΒ176-192 a pIB176 HindlII és Smal helyei közé inzertált vaccinia vírus HindlII J fragmentjének l-171o bázispárjait /bp/ tartalmazza /International Biotechnology inc. /. A vaccinia vírus timidin kináz /tk/ gén / a
Hindii J fragment 5o2-lo7o bp; Weir and Moss, 1983, J.Virol. 46:53o-537/ BcoRI helyére / a HindlII J fragment 670 bp/ egy 28o bp hosszúságú DNS fragment lett inzertálva, mely a vaccinia vírus 7.5 K promóterét tartalmazza. E fragment orientációja olyan volt, hogy a transzkripciót jobbról balra irányította a hagyományos vaccinia vírus térképen, ellentétesen a vaccinia vírus tk gén transzkripciójának irányával. A pIB176-192-ben levő egyedi Smal hely a 7.5 K promoter fő transzkripciós kezdő helyétől downstreara irányban helyezkedik el.
A BRS vírus G mRNS szekvenciát tartalmazó rekombináns vaccinia vírusok izolálása a Stott etal. által leírtak /1986 J.Virol. 6ο:6ο7-θ13/ szerint történt azzal az eltéréssel, hogy
- 51 a rekombináns vírusokat Levi és Btkin /1981, Carcinogenesis 2_:417-423/ biot eljárását használva azonosítottuk.
A következőkben megadjuk a rekombináns vaccinia virus vektorok jellemezését
Vad tipusu és rekombináns vírusokból származó vaccinia virus mag DNS-at készítettünk elő Southern biot analízishez Esposito et al. /1981, J.Virol.Líefchods 2:175-179/ leírásának megfelelően. A restrikciós enzimes emésztést, a Souhtern biot analízist, a DNS nick transzlációval való radioaktív jelölést standard technikák felhasználásával /Líaniatis et al.,
1982, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Sring Harbor, IIY.; Rigby et al., 1977
J.Mol..<Biol. 113:237-251/ végeztük. A BRS vírusból származó proteinek vad tipusu valamint rekombináns vaccinia vírussal fertőzött sejtek metabolikus jelölését Lerch et al. /1989,
J.Virol. 63:833-84o/ leírása szerint végeztük, azzal az ellevő téréssel, hogy a vaccinia vírussal fertőzött sejtekben proteinek jelölését három órán át végeztük a fertőzést harmadik órától kezdődően. A fehérjék SDS-polakrilamid követő gél elektroforézisét standard eljárásokat használva végeztük el.
A Western biot analízishez fertőzött és nem fertőzött sejtekből származó proteineket gyűjtöttünk össze Lerch et al. /1989 J.Virol. 63:833-84o/ leírásának megfelelően, harminc órával a fertőzés után a BRS vírussal fertőzött BT sejtek esetében
és hat órával a fertőzés után a vaccinia vírussal fertőzött BT sejtek esetében. A Western biot analízisben Anti-BRS vírus 391-2 szérumot /ibid/ használtunk.Üveg lemezeken tenyésztett ΗΕρ-2-őn immunofluoreszcenciát végeztünk. A Hep-2 sejteket vad tipusu vagy rekombináns vaccinia vírusokkal fertőztük meg /a fertőzés multiplicitása /moi/=lo/. 48 órával a fertőzés után a sejteket megfestettük felszíni imraunofluorszcencia céljaira anti BRS vírus 391-2 szérumot használva első antitestként, majd ezt követően fluoreszcein kcnjugált anti-szarvasmarha I IgG /H+L/-et alkalmazva. A fluoreszcenciát Nikon fluoreszcensz mikroszkópon keresztül figyeltük meg.
A következőkben megadjuk a találmány eredményeinek leírását.
A következőkben leírjuk a nukleinsav szekvenciát és összehasonlításukat .
A BRS vírus G mRNS-á.· szekvenciájának meghatározása és az aminosav szekvencia levezetése érdekében a BRS vírus G mRNSához cDNS-akat generáltunk és a nukleotid szekvenciát kilenc cDNS klónból határoztuk meg. A kilenc kiónt négy különálló cDNS szintézises reakcióban, egymástól függetlenül nyertük. A G mRNS 5’ végének direkt szekvenálása szintén megtörtént BRS vírus mRNS-on levő szintetikus DNS primer primer extenziójával. A BRS vírus G mRNS szekvencia különböző kiónokból és a primer extenzióból meghatározott részleteit az 1. ábra
• · · ·
mutatja. A G4 klón egy teljes hosszúságú BRS vírus G klón, melyet egy második szál szintézishez specifikus oligonukleotid primer felhasználásával szintetizáltunk. Három független kiónt, a G4-et /8-838 bázisok/, a Glo-et /19-828 bázisok/ és a G33-at /23-8o3 bázisok/ Pstl-gyel és KpnI-gyel metszettük ki és az LiljmplS RR DNS-ba szübklónoztuk ezeket, hogy lehetővé tegyük a cDNS másik végéről való szekvenálást· A Glo és a G33 kiónokat teljességükben szekvenáltuk. A Gl, G7, G12, G5 és a G3 kiónok mind 5oo nukleotidnál rövidebbek voltak és ebből kifolyólag csupán részben kerültek szekvencáláara.
A BRS vírus G protein raRNS-á.t úgy találtuk, hogy körülbelül 838 nukleotid hosszúságú, nem számítva a poliadenilát ' farkat /2. ábra/. A BRS vírus G mRNS szekvenciáját összehasonlítottuk az A2 és a 18537 HRS vírusok /egy sorrendben A alcsoportu és egy B alcsoportu vírus/ G protein mRNS-ainak leközölt nukleotid szekvenciáival /2.ábra//Johnson et al·, 1987, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84:5625-5629; Wertz et al. 1985 Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 82:4o75-4o79/· A BRS vírus G mRNS-a rövidebb volt az A2 és a 18537 HRS vírusok G mRNS-ainál, sorrendben 81 illetve 84 bázissal. Általában volt néhány konzervált jellemvonás a BRS vírus G mRNS-a és a HRS vírus G mRNS-ai között. Az első nukleotid kivételével a BRS vírus G rnRNS-a rendelkezett a konzervált 5’GGGGCAAAU...3’ gén start szignállal, amit az összes HRS vírus mRlIS 5’ végén megtaláltak /Collins et al., 1986, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 83:4594-4598/A BRS vírus G mRIIS-ának 3’ vége szintén megegyezett az összes
HRS virus gén 3’ végén talált két konszenzus gén végi szekvenciák egyikével /5’...AGU^AU^Upoli A3’/ /Gollins et al., 1986, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 83:4594-4598/. A BRS virus
G mRNS-a fő nyílt leolvasási kerete kezdő kodonjának pozíciója /16-18 nukleotidok/ megegyezett a HRS vírusok G mRNS-ai kezdő kódonjainak pozíciójával /'Johnson et al,, 1987, Proc.
Natl.Acad.Sci. USA, 84:5625-5629; Satake et al., 1985, Nucleic Acids Rés. 13:7795-7812; Wertz et al., 1985, Proc.Natl.Acad.
Sci. USA 82:4o75-4o79/. Azonban a BRS virus mRNS-ának 3’ végén levő nem kódoló régió 42 bázis hosszúságú volt szemben a HRS virus A2 G mRNS-ának 6 bázisával és A HRS virus 18537
G mRNS-ának 27 bázisával /Johnson et al., 1987, Proc.Natl.
Acad,Sci. USA, 84:5625-5629; Satake et al., 1985, Nucleic Acids
Rés. 13:7795-7812; Wertz et al., 1985 Proc.Natl.Acad,Sci.
USA, 82:4o75-4o79/. Bz okozta azt, hogy a BRS virus G proteinjének tei-minációs kódonja 119 bázissal előbb van, mint az
A2 HRS virus G proteinnek a terminációs kódonja és 98 bázissal előbb, mint a 18537 G mRNS terminációs kódonja. Úgy klórból, a G4-ből hiányoztak a 312, 819 és 824-es bázisok, melyek mindegyike a 3* nem kódoló rá-*gióban levő terminációs kódonok után következtek. A BRS virus G mRNS-ából hiányzott egy upstreara elhelyezkedő ATG, melyet megtaláltak a HRS virus G mRNS-aiban /Johnson et al., 1987, Proc.Natl.Acad.Sci. USA,
84:5625-5629; Satake et al., 1985,Nucleic Acids Rés. 13:
7735-7812; Wertz et al., 1985, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 82:
4o75-4o79/.
I
- 55 A BRS virus G mRIíS-a 51,7% szekvencia azonosságot mutatott az A2 HRS virus G mRlíS-ával és 5o,8% szekvencia azonosságot a 18537 HRS virus G mRNS-ával, amikor a BRS virus G mRnS
párhuzamba állították az
A2 HRS virus G mRITS-ával.
Az A2 és 18537 HRS vírusok G mRNS-ai 67,4% szekvencia azonosságot mutattak /Johnson et al., 1387, Proc .ITatl.Acad.Sci. USA, 84: 5625-5629/. Egy kis eltérés figyelhető meg akkor, amikor a BRS virus G mRNS-át állítjuk párhuzamba a 18537 HRS virus
G mRNS ával, de ez kevesebb mint 1%-os eltérést okoz a BRS vi rus G mRHS-a vagy az A2 vagy a 18537 HRS virus G mRHSa közötti szekvencia azonosságban. Számitógépes analízist használtunk a annak megállapítására, hogy egy belső deléció jobb párhuzamot eredményez-e, de egy ilyet sem találtunk.
A következőkben bemutatjuk az aminosav szekvenciát és az öszszehasonlitást
A BRS virus G mRHS-ának van egy olyan fő nyílt leolvasási kerete, mely egy 257 aminosavból álló polipeptidet feltété lez. E polipeptid feltételezett molekulasúlya 28,6 kD volt. A BRS virus G proteinjének levezetett aminosav szekvenciáját bemutattuk /3. ábra/ és összehasonlítottuk az A2 és a 18537 HRS virus G proteinjeinek leközölt aminosav szekvenciáival /Johnson et al., 1987, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5625-5629; Wertz et al., 1985, Proc.líatl.Acad.Sci. USA, 82:4o75.4o79/. A BRS virus G proteinje az általános aminosav összetétel te·♦·» * ·· ···· • · · • · · · · « ···· · · · .
• ·· ·· kintetében hasonló volt a HRS virus G proteinjeihez, magas treonin és szerin maradék tartalmommal /25,7%/ összehasonlít va az 18537 /28,4h és az A2 /3o,6%/ HRS vírusok G proteinjeire kapott adatokkal. A szerin és a treonin maradékok potenci-
addiciós helyek az
O-kötésü szénhidrát oldalláncok számára.
A BRS virus proteinben 66 treonin és szerin maradékból /79%/ a feltételezett extracelluláris doménben van. Csupán kilenc treonin maradék /12, 52, 72, 92, 129,
139,
199, 21o,
211, 235 aminosavak/ és nyolc azerin maradék /2, 28, 37, 44, dig vizsgált összes u prötéin pozíciója volt konzervált az edfeltételezett aminosav szekvenciái
A potenciális O-kötésü szénhidrát addiciós helyek mellett 4 hely is volt a BRS virus G proteinjében A potenciális N-kö tésü a BRS virus és a B HlíS szubtipusu vírusok között; a négy po tenciális helyből kettő azonos volt az A2 HRS virus és a BRS virus G proteinjeiben.
A BRS virus G proteinnek magas volt a prolin tartalma /7,8%/, hasonlóan az A2 /lo,o%6 és a 18537 /8,6%/ HRS vírusok proteinjeiben megfigyeltekhez /Johnson et al., 1987, Proc.
Natl.Acad,Sci.USA, 84:5625-5629; Satake et al., 1985, Nucleic Acids Rés. 13:7795-7312; Wertz et al., 1985, Proc.Natl.Acad. Sci.USA, 82: 4o75-4o79/. Hat prolin maradék volt konzervált a máig szekvenált összes RS virus G fehérjéinek körében. Ezek a prolin maradékok a 146, 155, 156, 172, 194 és 2o6-os amino ··-♦
- 57 savak voltak /3. ábra/.
A BRS vírus G proteinje tervezett extracelluláris dóra énjében négy cisztein maradék volt. Ezen négy maradék pozíciója teljesen konzervált volt a fehérje amino terminusához viszonyítva az A2, Long és 18537 HRS vírusok körében konzervált cisztein maradékkal együtt /3. ábra//Johnson et al., Proc. Kati.Acad.Sci. USA 84: 5625-5629; Satake, et al., 1285, iíucleic Acids Rés. 13:7795-7812; Wertz et al., 1985, Proc. Háti. Acad.Sci.USA, 82:4o75-4o79/. Továbbá a BRS vírus az A2 HRS virus és a 18537 HRS vírus G proteinjei mind rendelkeztek egy cisztein maradékkal a tervezett citoplazmás doménben /3· ábra/. Azonban ez a cisztein maradék nincs jelen a Long HRS virus G proteinj ében.
Iáig a cisztein maradékok konzerváltak voltak a BRS virus G proteinjében, addig egy 13 aminosavból álló régió, melyet korábban szigorúan konzerváltnak jelentettek a HRS vírusok A és B szubssoportjának G proteinjeiben, nem volt konzervált a BRS virus G proteinjében. A BRS virus G proteinje ezen régiójában a 13 aminosavból csupán hat volt konzervált és e hatból kettő cisztein maradék volt /3» ábra/'.
A BRS virus G proteinje és a HRS virus proteinek közötti aminosav azonosság szignifikánsan kisebb volt mint a HRS virus A és B alcsoport G proteinjei között megfigyelt aminosav azonosság /4. ábra/. A teljes amonosav azonosság az A2 és az 18537 HRS virus G proteinjei között 53 %. A BRS virus G proteinje csupán 29 %-os aminosav azonosságot mutatott az A2 ····
HRS vírus G proteinjével és 3o;S-os aminosav azonosságot a 18537
HRS vírus G proteinjével. Az aminosav azonosság összehasonli tása a G proteinek mindhárom posztulált dóménjében világos különbségeket mutatott az azonosság szintjei tekintetében a három doménben. A BRS vírus és a HRS vírus G proteinjeinek fel tételezett extracelluláris doménjei közötti azonosság szignifikánsan kisebb volt mint a teljes aminosav azonosság és ki sebb volt a két HRS vírus G protein extracelluláris doménje közötti azonosságnál /4. ábra/ A BRS vírus G protein feltételezett cifcoplazmás és transzmembrán doménjei jobban konzerválódtak mint az extracelluláris domének, sorrendben 43 4 és 55 % aminosav azonosságot mutattak bármely HRS vírus G protein megfelelő doménjei körében /4.ábra/. Bár a teljes azonosság a BRS vírus G protein és bármely HRS vírus G protein között kisebb fokú volt mint az a HRS vírusok G proteinjei között, mégis voltak hasonlóságok a különböző fehérjék hidropatikus profiljaiban /5. ábra/ /Johnson et al., 1987, Proc.Natl.Acad. Sci. USA, 84:5625-5629; Satake et al., 1985 Nucleic Acids Rés. 13:7795-7812; Wertz et al., 1985» Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 82: 4o75“4o79/. Volt egy kezdeti hidrofil régió, melyet egy hídrofób csúcs követett az A2 HRS vírus, az 18537 HRS vírus G proteinjeiben és a BRS vírus G proteinjében. Hz a két terület együtt megfelel a feltételezett citoplazmás doménnek /1-37 aminosavak/. Ezt egy erősen hidrofób régió követte, mely a feltételezett transzmembrán doménnek /38-66 aminosavak/ felelt meg. A protein maradéka főként hidrofil volt és a feltétele59 zett extracelluláris doménnek /67-257, 292 vagy 298 aminosavak/ felelt meg. Ezt a hidrofil extracelluláris domént mind a három G proteinben megszakította egy rövid hidrofób régió /166-188 aminosavak/, ami megfelelt annak a régiónak, mely a négy konzervált cisztein maradékot tartalmazza.
A BRS vírus G mRNS-a két másik nyílt leolvasási keretet tartalmazott a fő nyílt leolvasási keret mellett. Az egyik nyílt leolvasási keret a 212-es nukleotidnál kezdődött és a 352-es nukleotidnál végződött és egy feltételezett 46 aminosavból álló polipeptidet kódolt. A másik ég a kettő közül a hosszabb nyílt leolvasási keret ugyanabban a kódoló keretben volt mint az első, de á 33o-as nukleotidnál kezdődött és a 814es nukleotidnál ért véget. Ez a.nyílt leolvasási keret egy feltételezett 144 aminosavból álló polipeptidet kódolt.
A következőkben megadjuk a BRS vírus G gént tartalmazó rekombináns vaccinia vírus vektorok megszerkesztését és jellemzését
Egy a nRS vírus
G mRNS-ának teljes fő leolvasási keretét cDRS-at inzertáltuk egy plazmidba, a pCB176-192-be, melyet vaccinia vírus rekcmbinánsok megszerkesztéséhez tervez tünk. A ΌΙΒΙ76-Ι92 plazmid hasonló a korábban leirt /Ball et al., 1986, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 83_:246-25o/ rekombináns plazmidokhoz,melyek tartalmazzák a vaccinia vírus Hindii! J fragmentjének egy részletété a timiain ki.náz /tk/ génbe inzertált 7,5 k promóterrel. Azonban a pIB176-192 esetében a Hindii!
- 6ο J fragment és a PvuII helyei közötti 171o-es bázispár hosszúságú fragment a pIB176 Hindin és Smal helyei közé volt inzertéivé és a 7,5 K promoter a transzkripciót a tk prcmóterrel ellentétes irányban vezeti. A BRS virus G mRNS cDNS-a a 755 K próraóter fő transzkripciós
volt inzertálva. Az inzertált BRS virus G gént tartalmazó
HlndlII J fragmentet a vaccinia virus /Koppenhága törzs/ genomjába inzertáltuk homológ rekombinációval /Stott et al., 1986 J.Virol. 6o:6o7-613/. Rekombináns virus DNS hibridizációval timidin kinéz negatív rekombináns vaccinia vírusokat /rW/ azonositottunk egy BRS virus G génre specifikus próbával és három plakk-tisztitási lépéssel szelektáltuk ezeket. A G642 és a G4567 rekombináns vaccinia vírusok a BRS virus G gént sorrendben előre muratő vagy reverz orientációban tartalmazták a
7,5 K promóterre «aló tekintettel. A rekombináns vaccinia vírusok genom strukturált vaccinia virus mag DNS emésztett részein végzett Southern biot analízissel igazoltuk annak bizo nyítására, hogy a BRS virus
G gén a rekombináns vírusok tk génjein belül inzertálódott.
A következőkben megadjuk a BRS virus gént tartalmazó rekombináns vaccinia vírussal fertőzött sejtekből származó proteinek analízisét
A BRS virus G gént tartalmazó rekombináns vaccinia virus azon képességét, hogy BRS virus G proteint expresszáljon BT
- 61 • ·* sejteken vizsgáltuk. A BRS vírussal, vad tipusu vaccinia vírussal vagy a BRS virus G gént tartalmazó rekombináns vaccinia vírusokkal fertőzött BT sejtekből származó fehérjéket Western biot analízissel vizsgáltuk 391-2 BRS virus specifikus antiszérummal, mert a BRS virus protein nem könnyen jelölhető / S/-raetioninnal ezen aminosav hiánya miatt a BRS virus
G aminosav szekvenciájában valamint azon tény miatt, hogy a 391-2 antiszérum nem használható immunoprecipitációra. A 391-2 antiszérusról korábban bemutattuk, hogy felismerte a BRS virus G proteint BRS vírussal fertőzött sejtekből származó proteinek Western biot analízisében.,/Lerch et al., 1989» J. Virol. 63:833-84o/. A szérum felismert két az rW G642-vel / /előremutató orientáció/ fertőzött sejtben jelen levő /6. ábra G642 sor/, de melyek nincsenek jelen az rWG4567-tel /fordított orientáció/ vagy a vad tipusu vacciniával fertőzött sejtekben /6. ábra, G4567 és W sornk, értelemszerűen/. Az rWG642-vel fertőzött sejtekben termelt két fehérje komigrált azokkal a fehérjékkel, melyeket az antiszérum a BRS vírussal fertőzött sejtekben ismert fel. Az rWG642-vel fertőzött sejtekben levő fehérjék egyike komigrált az érett BRS virus G proteinnel, széles sávként vándorolva a 68 kD és 97 kD markerek között.
A másik fehérje körülbelül 43 kD-nál vándorolt.
A következőkben leírjuk a rekombináns vaccinia vírusokból expresszált BRS vírus G protein felületi expresszióját.
A G protein egy glükoprotein, mely fertőzött sejtek felületén expresszálódik és virionok membránjaiba épül be. /Huang 1985, Vírus Rés. 2:157-173/· Annak megállapítása céljából, hogy a rekombináns vaccinia vírussal fertőzött sejtekben expresszált BRb vírus G protein transzprotálódott-e és expresszálódott-e fertőzött sejtek felületére indirekt immunofluorszcens festést alkalmaztunk a rekombináns fertőzött sejteken. Úgy találtuk, hogy a BT sejtek rendkívül érzékenyek voltak a vaccinia vírus fertőzéssel szemben. Magas volt a háttér fluoreszcencia és nagyon kevés sejt élte túl a festési eljárást. Emiatt az immunofluorszcens festést rekombináns vírussal fertőzött H6p-2 sejteken hajtottuk végre. A rekombináns G642 vírussal fertőzött Hep-2 sejtek /7. ábra, rWG panel/ specifikus felületi fluoreszcenciát mutattak, mely sem fertőzetlen /7. ábra, M panel/ sem vad tipusu vaccinia vírussal fertőzött sejtek /7. ábra VV panel/ esetében nem volt jelen.
A következőkben megadjuk a találmány megvitatását
A respirációs szincitia vírus G protein sok szempontból szokatlan vírus glükoprotein. Annak ellenére, hogy a HRS vírus kötő fehérjéjeként Írták le /Levine et al., 1987, J.Virol. 68:2521-2524/, hiányzik belőle mind a neuraminidáz, mind a .: *··: :
ί .· * · ♦ ·· a *··♦ · ··· « 4 «· • *·· hemagglutináló aktivitás, amit a paramyxovirus család többi vírusainak kötő fehérjéiben megfigyeltek /Gruber and Levine 1983, J.Gen.Virol. 64:825-832; Richman et al., 1971, Appl. NMicrobiol.£l:lo99/. Bizonyítékok feltételezik, hogy a HRS vírus G proteinje erősen glikozilált az érett fehérje tömeg körülbelül 55%-ában, ami feltételezhetően az O-kötésü oligoszacharid oldalláncok addiciójának köszönhető /Lambert, 1988, Virology 164:458-466/. A BRS vírus G proteinjéről kimutattuk, hogy antigenikusan különbözik a HRS vírus G proteinjétől /Lerch et al., 1989, J.Virol. 63:833-84o; Orvell et al., 1987 J.Gen.Virol. 68:3125-3135/. Továbbá, egyetlen eí-ééréstől eltekintve /Matumoto et al., Arch. Gesamte Virusforsch. 44:28o29o/, a BRS vírus képtelen hatékonyan megfertőzni emberi eredetű sejteket, mig a HRS vírus mind emberi mind szarvasmarha sejteket megfertőz. Lehetséges, hogy a BRS és HRS vírusok gazda körében meglevő különbség tükröződik a kötő fehérjék aminosav szekvenciájának különbözőségeiben,
A BRS és HRS vírusok G proteinjei közötti különbségek további vizsgálata érdekében meghatároztuk a cDNS-ból származó BRS vírus G protein mRNS-ának nukleotid szekvenciáját. A BRS virus G mRNS-a kisebb volt a HRS vírusok G mRNS-ainál és a máig szekvenált HRS vírusok G mRNS-ával 51%-os szekvencia azonosságot mutatott. A HRS virus génekben megfigyelt konszenzus gén kezdő és vég szekvenciái a BRS virus G mRNS-ában konzerváltak voltak, akárcsak a kezdő kódon pozíciója a HRS virus G mRNS-ának kezdő kódonjára vonazkozólag. A BRS virus tf «· «·* >··· • · ··
- 64 G mRKS-a nagyobb 3’ nem kódoló régióval rendelkezett, ami a kisebb méretű BRS virus G mRNS-ával együtt olyan fő nyilt leolvasási keretet eredményezett, mely egy 28 kDa-ra becsült molekulasulyu, 257 aminosavból álló polipeptidet kódolt. Ez hasonlít azon 298 és 292 aminosavból álló polipeptidekre, melyeket a HRS virus A és B szubcsoportjainak G mRNS-a kódol sorrendben, és melyek becsült molekulasúlya körülbelül 32 kDa mindkettő esetében. A feltételezett BRS virus G polipeptid méretét összehasonlítva a fertőzött sejtekben talált érett BRS virus G protein feltételezett méretével azt sugallja, hogy a BRS virus G polipeptidben nagyfokú modifikáció van.
Endoglikozidázokat, szénhidrát addiciós inhibitorokat és O-kötésü glikozilációban szegény sejtvonalakat alkalmazó vizs gálatok kimutatták, hogy a HRS virus G protein erősen glikozilált mind a N- mind az O-kötésü szénhidrát oldalláncokban /Lambert, 1988, Virology 164:458-466/. A fertőzött sejtekből származó érett BRS virus G fehérjéről kimutattuk, hogy glikozilált volt , valamint, hogy a 9o kDa-u HRS virus G proteinhez hasonló elektroforetikus mozgékonysággal rendelkezett, holott a polipeptid feltételezett aminosav szekvenciája egy 28 KDa-u proteint jelzett /Lerch et al., 1989, J.Virol. 63: 833-84o; Westenbrink et al., 1989, J.Gen.Virol. 7o:591-6ol/. Ez azt sugallta, hogy a BRS virus G proteinje szintén erősen glikozilált, akárcsak a HRS virus G protein. A BRS virus G protein feltételezett aminosav szekvenciájában a szerin és a treonin szintje magas volt /'ZHf/o/ a HRS virus G proteinjében
- 65 levő szintekhez hasonlóan /3o% és 28% az A és a B szubcsoportban, sorrendben/, annak ellenére, hogy a BRS vírus esetében a potenciális O-glikozilációs helyek valódi száma /66/ kisebb mint az a szubcsoportu HRS vírusokban talált 91 potenciális hely /Johnson et al., 1987, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84:56255629; Satake et al., 1?85, Nucleic Acids Res° 13:7795-7812; Wertz et al., 1985, Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 82:4o75-4o79/· A levezetett BRS \jirus G aminosav szekvencia magas szerin és treonin tartalma azt sugallja, hogy a BRS vírus G proteinje magában hordozza a nagyarányú O-kötésü glikoziláció lehetőségét is.
Bár a BRS vírus G protein általános aminosav összetétele hasonló volt a HRS vírus G protein aminosav összetételéhez, a BRS vírus G aminosav szekvenciájának alacsonyabb szintű volt az általános aminosav azonossága a HRS vírus G proteinjével, akár az A, akár a B szubcsoport vírusai esetében /Johnson et al., 1987, Proc.Kati.Acad.Sci. USA 84:5625-5629/□ Csupán 29-3o%-os azonosság volt a BRS vírus G protein és az A vagy a B szubcsoportu HRS vírusok G proteinje között, mig az aminosav azonosság 53%, ha a HRS vírus A és B szubcsoportjának G proteinjeit hasinlitjuk Össze /Johnson et al., 1987, Proc. Natl.Acad.Sci. USA.84:5625-5629/. A feltételezett citoplazmás és transzmembrán doménekben magasabb szintű volt az aminosav azonosság a BRS vírus G protein és a HRS vírus G proteinjei között, de ez megint csak alacsonyabb szintű volt, mint ami az A és B szubcsoportu HRS vírusok G proteinjeinek ezen ré-
- 66 giókban történő összehasonlításánál adódott. /4. ábra/ Az a tény, hogy a BRS vírus G protein aminosav szekvenciája nincs közelebbi kapcsolatban sem az A sem a B szubcsoportu HRS vírus aminosav szekvenciájával azt sugallja, hogy a humán és szarvasmarha respirációs szincitia vírusok a HRS vírus A és B szócsoportjainak megjelenése előtt divergáltak, valamint azt, hogy különálló Pneumovirus szubcsoportba kellene őket osztályozni.
A BRS vírus G protein feltételezett szekvenciája azt mutatta, hogy a BRS vírus és a HRS vírus G proteinjei csupán 29-3o%-os aminosav azonosságot mutatnak. Ezen különbségek ellenére a két protein hidropatikus profilja erős hasonlóságot mutatott hasonló általános strukturális jellemvonások, .lehetőségét sugallva.
Johnson et al /1987, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84:56255629/ feltételezték, hogy a HRS vírusok G proteinjei extracelluláris doménjében talált 13 konzervált aminosavból álló régió egy receptor kötő hely lehet. Az a tény, hogy a konzervált régió a BRS vírus G proteinben nem konzervált, összefügghet a BRS vírus gazda specifitásával. A BRS vírus és a HRS vírusok G proteinjeiben talált négy konzervált cisztein maradék hasonló másodlagos struktúrát eredményezhetne a G proteinek körében konzervált régió gazda specifitását megváltoz. tató specifikus különbségeiben. Aretonvaleszcensz borjú szérum sugallta annak a lehetőségét, hogy a BRS vírusoknak is lehetnek antigenikus szubcsoportjai, mint a HRS vírusoknak /Lerch
- 67 et al., 1989, J.Virol. 63:833-84o/.
A BRS vírus G génbe inzertált cDNS-at tartalmazó rekombináns vaccinia vírusok expressélták a BRS vírus G proteint. Ez a BRS vírus G protein olyan elektroforetikus mozgékonysággal rendéLkezik SDS-poliakrilamid gélekben, ami a BRS vírussal fertőzött sejtekből származó G proteinekhez volt hasonló. 391-2 BRS vírusra specifikus antiszérum felismerte fertőzött sejtekben a rekombináns vaccinia vírus által termelt BRS vírus G proteint, amint azt a Western biot analízis kimutatta. A rekombináns vaccinia vírusból expresszált BRS vírus G protein a fertőzött sejt felületére transzportálódott és ott expresszálódott, amint azt az immunofluoreszcencia kimutatta.
7. Példa: A szarvasmarha respirációs szincitia vírus fúziós fehérje mRNS-ának nukleotid szekvencia analízise és egy rekombináns vaccinia vírus
A következőkben megadjuk a találmány 7· példájában felhasznált anyagok és eszközök leírását
A következőkben megadjuk a felhasznált vírus éa a sejtek leírását.
A 391-2 BRS vírus, a vad tipusu /Koppenhága törzs/ és rekombináns vaccinia vírusok, szarvasmarha orrkagyló /BT/ sejtek, HEp-2 sejtek és timidin kináz negatív /tk-/ 143B sej-- 68 — tek tenyésztése és szaporítása a Hruby és Ball /1981, J. Virol. 4p:456-464; Stott et al., 1986 J.Virol. 6o:6o7-613; Lerch et al., 1989 J.BVirol. 63:833-84o/ által leírtak szerint történt.
A következőkben megadjuk a fehérje jelölést és a BRS vírussal fertőzött sejtek összegyűjtését
Szarvasmarha orrkagyló /BT/ sejtek sejt monorétegeit , BRS vagy HRS vírussal fertőztük. Tunikamicint /1,5 ug/ml, Boehringer Mannheim/ adtunk a sejteket beborító tápközeghez 25 órával a fertőzés után a jelölt esetekben. Egy óra elteltével a tápközeget eltávolitottuk a monorétegekről és metionin hiányos DMEM-mel /Gibco/ helyettesítettük. A jelölt esetekben ismét tunfckamicint adtunk hozzá. Egy harminc perces inkubációt követően /S/-metionint /loo μθί/ml, New England Nuclear/ adtunk a tápközeghezo A sejteket két óráig inkubáltuk és a fehérjéket Lerch et al. /1989, J.Virol. 63: 833-84o/ leírásának megfelelően gyűjtöttük össze. A vírus-specifikus fehérjéket immunoprecipitáltattuk Wellcome anti-RS szérum /Wellcome Reagents Ltd./ felhasználásával a Wertz et al. /1985, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82^:4075-4079/ munkájában leírtak szerint. A fehérjéket SDS-poliakrilamid gél elektroforézissel /SDS-PAGE/ /Laemmli, 197o, Natúré, /London/ 227.: 680-685/ analizáltuk és fluorográfiával detektáltuk /Davis and Wertz, 1982, J.Virol. 41:821-832/.
- 69 A következőkben megadjuk a cDNS szintézis, a molekuláris klónozás és az F specifikus kiónok azonosításának leírását.
cDNS-akat szintetizáltunk Gubler és Hoffman szálhelyettesitéses módszerét használva /1,983, Gene, 25:263-269/ D’Alessio et al., /1987, Focus, 9:1-4/ leírás szerint. A cDNSak végeinek tompává tételéhez T4 DNS polimerázt /BRL/ használtunk /Maniatis et al., 1982, in: Molecular Cloning, A La boratory Manual Cold Sring Harbor Laboratoryijt Cold Spring Harbor, N.Y./. A cDNS-akat M13mpl9 replikációs forma /RF/ DNSba ligáltuk, melyet előzőleg Smal-gyel emésztettünk, majd borjú bél alkalikus foszfatázzal kezeltünk /Maniatis et al·, supra/ és alkalmas E.coli DElSc^-F’ sejtekbe /Bethesda Reasearch Laboratories/ transzferáltunk /Hanahan, 1983, J.Mól.Bioi. 166:557-58o/. A BRS vírus F specifikus inzerteket tartalmazó M13mpl9 fágokat azonosítottuk fág DNS dót biot hibridizációval /Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York, N.Y./ melyet egy korábban azonosított BRS virus F gén specifikus klánnal próbáltattunk /Lerch et al., 1989, J.Virol. 63:833-84o/, melyet előzőleg nick transzlációval megjelöltünk /Rigby et al,, 1977 J.Mól.Bioi, 113:237-251/. Az M13mpl9 és a rekombináns fágok azonosítását és manipulációját a Messing /1983, Metho Enzymol· lol:2o-78/ által leírtak alapján végeztük.
- 7ο A következőkben megadjuk a nukleotid szekvenálást és az RNSon végzett primer extenziót
E.coli DNS polimeráz I /Pharmacia/ Klenow fragmentjé± vagy módosított T7 DNS polimerázt/Sequenase, US. Biochemicals/ felhasználó didezoxinukleotid szekvenálást végeztünk Tábor és Richardson /1987, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84:4746-4771/ és Lim és Pens /1988, Gene Anal.Tech. 5.:32-39/ leírásának megfelelően egy M13 szekvenáló prímért alkalmazva /New England Biolabs/. A BRS virus P mRNS-ának 267-284 bázisaival komplementer szintetikus DNS primer extenzióját végeztük el BRS virus mRNS-án Avian mielolasztozis /AMV/ reverz transzkriptáz /Molecular Genetic Resources/ felhasználásával /Air, 1979, Virology 97:468-472/. Az RNS-an való primer extenzióban templátként használt BRS virus mRi'Jo-at úgy gyűjtöttük össze, ahogy azt a cDNS szintézisre használt mRNS esetében leírták /Lerch et al., 1989, J.Virol. 63:833-84o/. A nukleotid szekvenálást és a primer extenziót /^- ^S/dATP /Amersham/ es poliakrilamid urea grádiens gél elektroforézis felhasználásával végeztük Biggin et al., /1983, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 80:3963-3965/ leírása szerint. A nukleotid szekvenciát a Wisconsin Egyetem Genetika Computer Csoport software csomagjával azonosítottuk /Deveraux et al., 1984, Nucl.Acids Rés. 12:387-395/.
A következőkben megadjuk egy teljes cDNS szintézisét és a BRS virus F mRNS-ához való klónozását
A BRS virus F mRNS-ának teljes fő nyílt leolvasási keretét tartalmazó cDNS-at szintetizáltunk egy specifikus szintetikus oligonukleotidot használva a második szál szintézisre. Ezen oligonukleotid nukleotid szekvenciáját a BRS virus mRNS-ának szekvencia analízise alapján határoztuk meg. Az első szál szintézisét a D’Alessio et al., /1987, Focus, 9:14/ által leírtak alapján végeztük. A szintézist követően az RNS templátot RN-áz A-val /lpg//il/ emésztettük 3o percig 37 °C hőmérsékleten. A kapott egyszálu cDNS-akat fenolos extrakcióval és etanolos precipitációval izoláltuk. A második szál szintézisre használt oligonukleotid szekvenciája 5’*^CAGGGATCGAGAAGTATGTCCAACC 3’ volt, az oligonukleotid 5’ első kilenc bázisa egy BamHI restrikciós enzim helyet tartalmazott. Az egyszálu cDNS-akat összekevertük az oligonukleotiddal /5o pg/ml/ 1 percre loo °C hőmérsékletre hevitettük majd jégre helyeztük. AMV reverz transzkriptázt használtunk a cDNS-ak második száljának szintéziséhez egy olyan keverékben /5o mM Tris-HCl /pH=8,o/, 5o mM KG1, 5m MgCl2, lo mM ditiotreitol, 1,6 mM dNTPk, loo U AMV reverz transzkriptáz/ melyet 1 órán át inkubáltunk 5o °C hőmérsékleten. A cDNS-akat a fehérjéktől fenolos extrakcióval szaparáltuk, etanolos precipitációval nyertük ki és a végeket T4 DNS polimerázzal tettük tompává. A tompa végű ' cDNS-akat ezután BamHI restrikciós
- 72 enzimmel emésztettük /Bethesda Reasearch Laboratories/ és fenolos extrakcióval szeparáltuk a fehérjétől. A BamHI-gyel és Smal-gyel emésztett és borjú bél foszfatázzal kezelt M13mpl8 RF DNS-at hozzá adtuk a cDNS-hoz, majd etanolos precipitációval kinyertük. A cDNS-akat és a vektort ligáltuk, majd megfelelő DH5CX F* sejtekbe transzfektáltuk /Bethesda Research Laboratories/ Hanahan /1983, J.Mól.Bioi. 166:557-58o/ leírásának megfelelően.
A következőkben megadjuk a rekombináns vaccinia virus vektorok felépítését és izolálását.
Egy a BRS virus P mRNS-ának megfelelő teljes cDNS klóntz q.z P2o-atyszubklónoztuk egy rekombináns plazmidba, a pIBI76192-be, BamHI-gyel és KpnI-gyel való emésztéssel a cDNS végeinek tompává tételére szolgáló T4 DNS polimerázzal való kezeléssel és a pIBI76-192 egyedi Smal helyére való ligálássalo A pIBl76-192 plazmid hasonló a Ball et al. /1986, Proc0Natl. Acad.Sci. USA. 83:246-250/ által leirt rekombináns plazmidokhoz. A pIBI76-192 esetében a vaccinia virus HíndlI-J fragmentjének 1-1710 bázispárjait /bp/ inzertáltuk a pIBI 76 Hindin és Smal helyei közé. A vaccinia virus 7,5 K promóterét tartalmazó DNS 28o bp hosszúságú fragmentjét a vaccinia virus timidin kinéz /tk/ gén-/ Hindin J fragment 5o2-lo7o bázispárja/ Ecol helyére /a HxndlII J fragment 67o-es bázispárja/ inzer táltuk /Weir and Moss, 1983, J.Virol. 46,:53o-537/. Ezen promóter orientációja olyan volt, hogy a transzkripciót jobbról balra irányította a hagyományos vaccinia vírus térképen, a vaccinia vírus tk gén transzkripciójának irányításával ellenkezően. A pIBI76-192-ben levő egyedi Smal hely a 7,5 K promóter fő transzkripciós kezdő helyétől downstream irányban helyezkedett el.
A BRS vírus F mRNS szekvenciát tartalmazó rekombináns vaccinia vírusok izolálása a Stott et al. /1986, J.Virolo 6o: 6o7-613/ által leírtak szerint történt kivéve azt, hogy a rekombináns vírusokat Lavi és Ektin /1981, Carcinogenesisi 2^:417-423/ biot eljárásával azonosítottuk.
A következőkben megadjuk a rekombináns vaccinia vírus vektorok jellemzését.
Vad tipusu és rekombináns vírusokból izolált vaccinia vírus mag DNS-at készítettünk elő Southern biot analízisre az Esposito et al. /1981, J.Virol. Méth. 2.:175.179/ által leírtak szerint. A restrikciós enzim emésztés, a Southern biot analízis és a DNS nick transzlációval végzett radioaktív jelölése a 6. fejezetben leírtak Zsúpra/ szerint történt. Vad tipusu és rekombináns vaccinia vírussal fertőzött sejtekből származó fehérjék metabolikus jelölése a fentiek szerint történt, azzal az eltéréssel, hogy a fertőzött sejteket három órán át tettük ki a jelölésnek három órával a fertőzést köve• ·· tőén. A fehérjéket SDS-poliakrilamid gél elektroforézissel analizáltuk standard eljárásokat használva. Virus specifikus fehérjék immunoprecipitációja Wellcome anti-RS szérum /Wellcome Reagents Ltd./ felhasználásával a Wertz et al. /1985, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 82:4o75-4o79/ által leírtak szerint történt. Immunofluoreszcencia céljaira H£p-2 sejteket szaporítottunk üveg fedőleraezeken. A sejteket vad tipusu vagy rekombináns vaccinia vírusokkal fertőztük /moi=lo/ és 24 órával a fertőzés után a sejteket indirekt immunofluoreszcenciával festettük, anti-391 BRS virus szérumot használva /Lerch et al., 1989, J.Virol. 63:833-84o/ első antitestként, majd fluoreszcens konjugált anti-szarvasmarha IgG /H+L/-et alkalmazva. A fluoreszcenciát egy Nikon fluoreszcencia mikroszkópon át figyeltük meg.
A következőkben leírjuk a találmány eredményeit.
A következőkben megadjuk a nukleinsav szekvenciát és összehasonlítását
A BRS virus F mRNS teljes nukleotid szekvenciájának meghatározása céljából M13 fágvektorokban levő cDNS klánokat izoláltunk és nukleotid szekvenciájukat analizáltuk. A BRS vi rus F mfíNS szekvenciáját nyolc, négy különböző cDNS szintézises reakcióból függetlenül nyert klón alapján határoztuk meg. A BRS virus F mRNS szekvenciájának a különböző klónokból meg határozott részeit a 8. ábra mutatja. A szekvencia nagy részét három kiónból, az BB3-ból, az BB5-ből és az B2o-ból határoztuk meg. Az B2o egy teljes hosszúságú BRS virus B cDNS, melyet a BRS virus B mRNS-ának 5’ végére specifikus oligonukleotid felhasználásával szintetizáltunk. Az BB3, Az BB5 és az B2o kiónokból származó inzerteket PstI és KpnI restrikciós enzimek felhasználásával metszettük ki, melyek nem hasítanak az inzerteken belül és az M13mpl8 RP DBS-ba szubklónoztuk ezeket a cDNS ellentétes végéről való szekvenálás céljából. Továbbá az inzertek restrikciós fragmentjeit M13mpl8 és mpl9 RB DNSakba szubklónoztuk, hogy lehetővé tegyük a cDNS-ak középső részén levő szekvencia meghatározását. Az B2o kiónt AlwNI, PflMI, EcoV vagy Hpal restrikciós enzimekkel emésztettük és az PB3 és BB5 kiónokat EcoRI restrikciós enzimmel. A BRS virus B mRNS 5’ végének szekvenciáját egy DNS oligonukleotid BRS vírussal fertőzött sejtből származó mRNS-on történő extenziójával határoztuk meg. A BRS virus B mRNS-ának 267-284 bázisaival komplementer oligonukleotid szekvenciáját a cDNS kiónok szolgáltatta saekvenciából határoztuk meg. Az B29, BB2, B138 és BB1 kiónok mind 75o vagy annál rövidebb nukleotidokból álltak és nem szekvenáltuk ezeket alaposan.
A BRS virus B mRNS 1899 nukleotidot tartalmazott nem számítva a polianenilát farkat /9. ábra/ Az mRNS 5’ végén levő 7 bázist nem lehetett meghatározni az erős stop szignálok következtében.-az egyes bázisok mRNS-on való primer extenziójában a négy nukleotid reakcióban. A BRS virus B mRNS 3’ végén
- 76 levő szekvencia megegyezett a két konszenzus gén vég szekvencia egyikével az 5’.....AGUyAU^UpoliA3’, mely megtalálható minden HRS virus gén végén /Collins et al., 1986, Proc.Natl. Acad.Sci. USA, 83:4594-4598/ és a BRS virus G mRNS-ának 3’ végén. A BRS virus P mRNS-ának egy olyan egyedüli fő nyilt leolvasási kerete van, mely egy a 14-es nukleotidnál kezdődő iniciációs kódonnal indul és a 1736-os nukleotidnál levő terminációs kódonig tart. Volt egy 161 nukleotidból álló nem kódoló régió a 3’ végen a 3’ poliadenilát területet megelőzően /9. ábra/.
A BRS virus P mRNS nukelotid szekvenciáját összehasmnli<tottuk az A2 HRS virus /Collins et al., 1989» Proc. Natl.Acado Sci. USA 83:4594-4598/, a Long /Lopez et al., 1988, Virus Rés. 10:249-262/, az RSS-2 /Baybutt and Pringle, 1987, J.Gen.Virol. 68:2789-2796/ és a 18537 /Johnson and Collins, 1988, J.Gen. Virol. 69:2623-2628/ P mRHS-ainak közölt szekvenciáival, hogy meghatározzuk a nukleinsav azonosság mértékét a különböző P mRNS szekvenciák között /1. Táblázat/.
·· ···· ··*· · • · · · ···«·« · • ····· · · * · ·« ··
-77 1. Táblázat
A RESPIRÁCIÓS SZINCITIA VÍRUSOK FÚZIÓS FEHÉRJE GÉNJEI KÖZÖTTI NUKLEINSAV
AZONOSSÁG
A
A
A
EH
EH A N
A A P
A A
Ό A O A
Ό W
EH
tís] <4 cn CTi ι co en cσ>
co>
I bcn c— <·
OJ co bbι <o cn in ccn cn bCJ A b- bI
| EH | Eh | EH | EH | EH | |||||
| 04 | A | A | A | A | |||||
| O | O | O | O | O | |||||
| A | A | A | A | A | |||||
| O | O | O | O | O | |||||
| A | A | A | A | A | |||||
| O | O | O | O | O | |||||
| A | A | A | A | A | |||||
| A | A | A | A | A | |||||
| tA | tA | A | tA | IA | |||||
| A | A | A | A | A | |||||
| <4 | A A | A | A p | A | «4 | ||||
| A | A | ||||||||
| ·* A | A A | A | ·» A | A A | ·· A | A | •t A | A | |
| A | S | A | A | J-H | A | A | A | A | |
| A | A | A | A | A | fa | A | A | ||
| H | H | H | H | H | vj 1—\ | H | H | ||
| > | > | > | I—3 ω | > | > | ||||
| A | A | A | A | A | tó ΓτΊ | A | A | ||
| pH | pH | frf | A | P-4 | A | A | |||
| A | S | A | A | P* | A | A |
BRS VÍRUS, B SZUBCS0P0RT • ♦ · · · » · · · • · • » · ·· · • ·· · · ·· * • ·· · *
Az A2, a Long és az RSS-2 HRS vírusok az A szubcsoportu vírusok és a 18537 B szubcsoportu vírus /Anderson et al., 1985, J.Infect.Dis. 151:626-633; Mufson et al., 1985, J.Gen.Virol» 66:2111-2124/,, A nukleinsav azonosság szintje a BRS és a HRS vírusok F mRNS-ai között /71,5%/ hasonló volt a két HRS vírus alcsoport összehasonlításakor adódó értékhez /79%/· A BRS vírus és a HRS vírusok F mRNS-ai közötti mind a két HRS vírus szubcsoport F mRNS-ai közötti azonossági szint alacsonyabb volt, mint az ugyanazon szubcsoporton belüli /97-98%/ HRS vírusok F mRNS-ai közötti azonossági szint» A nukleotid szekvencia azonossági szintje a BRS és a HRS vírusok között az F szekvencia 3’ nem kódoló régiójában 37,5% volt szemben az F szekvencia kódoló régiójában adódó 74,5%-kal. Ez hasonló volt a 3’ nem kódoló és a kódoló régiók azonossági szintjéhez, sorrendben 47% és 82%, amikor a HRS 'vírusok A és B szubcsoportjának szekvenciáit hasonlítottuk össze. Az F mRNS azekvenciában két helyen eltérés volt a nukleotidokban. Egy kiónban az F2o-ban a 455-ös és a 473-as nukleotid sorrendben G és C volt a más klónoknál megfigyelt és a szekvenciában látható /9. ábra/ A és C helyett.
A következőkben megadjuk a BRS vírus F protein feltételezett a aminosav szekvenciáját és a HRS vírus F protein szekvenciájával való összehasonlítását.
A BRS vírus F mRNS-ának nyílt leolvasási kerete egy 574 • · ** ·
aminosavból álló polipeptidet feltételezett, Ezen polipeptid aminosav szekvenciája a 9· ábrán látható az mRNS szekvencia alatt. A feltételezett BRS vírus F polipeptid becsült molekula súlya 63,8 kDa volt. A. feltételezett polipeptid hidropatikus profilja erősen hidrofób régiókat jelzett az amino végen /az 1-26 maradékoknak felel meg/ és á karboxil vég közelében /az 522-549 maradékoknak felel meg /lo. ábra//. A hidropatikus profil és az aminosav szekvencia olyan doméneket sugallt a BRS vírus F proteinjében, melyek hasonlóak a HRS vírus F pro^teinjére leírtakhoz, beleértve egy amino terminális jel peptid régiót /1-26 maradékok/, karboxil terminális rögzítő régiót /522-549 maradékok/ és feltételezett hasítási szekvenciát /131-136 maradékok/, mely F^ és F2 polipeptideket hoz létre /lásd lo. 11. ábra/ Három potenciális hely volt N-kötésü szénhidrát oldalláncok addiciójára, kettő a feltételezett Fg polipeptidben és egy a feltételezett Fg polipeptidben /9. ábra/.
A feltételezett BRS vírus F aminosav szekvenciáját összehasonlítottuk az A2 HRS vírus /Collins et aló, 1984, Proc. Natl.Acad.Sci.USA, 81:71683-71687/, a Long /Lopez et al., 1988, Vírus Rés. lo:249-262/, az RSS-2 /Baybutt and Pringle, 1987, J.Gen.Virol. 68:2789-2796/ és a 18537 /Johnson and Collins 1988, J.Gen.Virol. 69:2623-2628/ F polipeptidjeinak fetételezett aminosav szekvenciájával /11. ábra/. A BRS vírus F polipeptid 574 aminosavból állt,mint mind a négy HRS vírus F polipeptid· A BRS vírus F proteinben jelen levő feltételezett karboxil terminál hidrofób kötő /522-549 maradékok/ és az a minő terminális jel.régiók /l-2b maradékok/ hasonlóak voltak a HRS virus P proteinekben levőkhöz. Továbbá a Lys-lys-ArgLys-Arg-Arg szekvencia a BRS virus P proxeinjében levő 131136 maradékoknál egy feltételezett hasítási jelet képviselt. Ez a szekvencia azonos volt az összes HRS virus P proteinben levő feltételezett hasítási jellel · A BRS virus P proteinjében a hasítási szekvenciát egy hidrofób maradékból /137-158 maradékok/ álló terület követte, mely a hasítás után az P·^ polipeptid amino terminusát képviselné. Az P2o kiónban levő nukleotidbeli eltérések azt eredményezhetnék, hogy a 148 és 154 aminosav maradékoknál /mely része a feltételezett amino terminusnak/ a Val Ile-re és a Leu Val-ra cserélődne. Ezek a különbségek azt eredményezhetnék, hogy a BRS virus P proteinjében e két pozícióban levő aminosavak azonosak lennének a HRS virus P proteinjében levő megfelelő aminosav pozíciókkal0
A feltételezett amino terminális jel peptidben levő egy cisztein maradék kivételével /25-ös maradék/ minden cisztein maradék konzervált pozíciójú volt a BRS virus és a HRS virus P proteinjeinek körében. Ezek között van az 55o-es pozíciójú cisztein maradék is, melyről kimutatták, hogy a palmilát humán RS virus P proteinhez való kovalens kötési helye /Arumugham et al., 1989, J.Bioi.Chem. 26á:lo339-lo342/· Volt egy egyedüli potenciális N-kötésü glikozilációs hely /5oo-as maradék/ a BRS virus P protein P^ polipeptidjében, mely konzervált volt minden HRS virus P proteinben /11. ábra/. A BRS virus P2 polipeptid j ében két potenciális hely volt N-kötésü glikoziláció··*♦ * · · • · *<
··· · _ 81 _ ra /27 és 12o maradékok/ /9. és 11. ábra/. A 27-es maradéknál levő potenciális hely konzervált volt a BRS vírus és a HRS virus F proteinjei körében /11. ábra/ Azonban a HRS vírus F2 polipeptidjei összesen négy vagy öt potenciális helyet tartalmaztak az izolátumtól függően és a BRS virus Έ?, polipeptidjében levő maradék potenciális N-kötésü glikolizációs helyek nem voltak konzerváltak az Összes HRS virus F2 polipeptidben /11. ábra/. Csupán két a BRS virus F2 polipeptidjében levő potenciális N-kötésü glikozilációs hely léte fért össze azzal a korábbi megfigyeléssel, hogy a BRS virus és a HRS virus F2 polipeptidjeinek elektroforetikus mozgékonysága eltérő volt. /Lerch et al., 1989, J.Virol. 63:833-84o/.
A különböző vírusok F proteinjei közötti aminosav azonosság az F fehérje különböző régiói esetében a 2. Táblázatban látható.
_ 82 _
AMINOSAV AZONOSSÁG A RESPIRÁCIÓS SZINCITIA VÍRUSOK FÚZIÓS PROTEINJEI KÖZÖTT
A H
A H EH
Ph
A A hu
EH w o
EH EH o Eh
co co !O
KJ <4 co co l ι-1 00 o> ι ο6
I
CO ι
t06
| EH | EH | |
| A | A | |
| O | O | |
| A | A | |
| O | O | |
| CO | CO | CO |
| o | u | |
| o | A | |
| A | A | A |
| KJ | co | N |
| co | CO | |
| <! | A | <4 |
| •k | A | ·* |
| co | co | |
| A | A | |
| A | tó | |
| H | H | |
| > | > |
kO cn f*6 oo
| EH | EH | |
| PÚ | A | |
| O | O | |
| Pú | A | |
| o | O | |
| co | a | A |
| o | O | |
| A g | A | A A KJ |
| CO | A | A |
| A | A | A |
| •6 | A | |
| CO | A | |
| A | > | A |
| A | A | |
| H | H | |
| > | > |
-U oo kO
I c~<0 co CO o co
cu ι—1 co kű oo co
A co
| A | A | A | A | ||
| § | A | g | g | A | g |
| H | H | J—i | H | ||
| t* | co A | > | > | A A | > |
| A A | A > | A g | A A | A | A |
| A | A | g |
*« : .·· • * · ··* ···· 4 · * ·»
-83 Α2, Long és RSS-2 HRS vírusok A saubcsoportuak és az 18537
B szubcsoportu virus /Anderson et at., 1985, J.Infect.Dis.
151:626-633; Mufson et al., 1985, J.Gen.Virol. 66:2111-2124/. Bár a legnagyobb méitékü változatosság a feltételezett szignál peptid régióbai volt /1-26 maradékok/ ezen terület általános hidrofóbitása a BRS virus F proteinben konzervált volt /10. ábra/. A BRS virus F protein feltételezett F2 polipeptidje alacsonyabb szintű azonosságot mutatott az F2 polipeptidekkel, mint amilyen megfigyelhető a HRS virus A és B szócsoportjainak F2 polipeptidjei között /Johnson and Collíné, 1988, J.Gen. Virol. 2623-2628/. Ezzel szemben az Fp polipeptidek közötti azonossági szint hasonló volt akár BRS vírusokat és HRS vírusokat, akár a két HRS virus szócsoportba tartozó vírusokat hasonlítottuk össze.
A következőkben megadjuk a tunikamicin hatásának leírását a BRS virus F proteinjének elektroforetikus mozgékonyságára
Annak meghatározása céljából, hogy a BRS virus F protein korábban megfigyelt glikozilációja /Lerch et al., 1989, J.Virol. 63:833-840/ vajon az N-kötésü glikoziláció következménye-e megvizsgáltuk a tunikamicin /mely a N-kötésü glikoziláció egy inhibitora/ jelenlétében és hiányában radioaktivan jelölt BRS virus protein elektroforetikus mozgékonyságát. BRS vírussal és HRS vírussal valamint álfertőzött sejtekben levő proteineket tunikamicin jelenlétében és hiányában radioaktivan je···
-84 35 löltünk meg / ^SZ-metioninnat való kitevéssel, immunoprecipitáltattuk és SDS-poliakrilamid gél elektroforésrissel szeparáltuk. A tunikamicin jelenlétében jelölt BRS vírus F protein megváltozott elektroforetikus mozgékonyságot mutatott azon BRS vírus F proteinekhez képest, melyeket tunikamicin hiányában jelöltünk meg /12. ábra, B^ és B sorok/. Ezen kivül a BRS vírus tunikamicin jelenlétében szintetizált FQ, F^ és Fg polipeptidjei hasonló elektroforetikus mozgékonysággal rendelkeztek mint a megfelelő tunikamicin jelenlétében szintetizált HRS vírus FQ, F^ és Fg polipeptidek /12. ábra, Ηφ és sorok/. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a BRS vírus F protein az N-kötésü szénhidrát addiciókon keresztül glikozilálódott és hogy a BRS vírus és a HRS vírus Fg polipeptidjei elektroforetikus mozgékonyságában megfigyelt különbségek a különböző mértékű glikoziláció következményei amint azt a levezetett aminosav szekvenciából megjósoltuk /11. ábra/.
A következőkben megadjuk a BRS vírus gént tartalmazó rekombináns vaccinia vírus felépítését és izolálását.
A BRS vírus egyéni proteinjeinek a gazdában való védekező immunválaszok kiváltásában játszott szerepre vonatkozó kutatás előmozdítása érdekében BRS vírus F gént építettünk be egy vaccinia vírus expressziós vektorba. Egy a BRS vírus F mRNS-ának teljes fő nyílt leolvasási-keretét tartalmazó cDNSat inzertáltuk egy plazmádba, a pIBI76-192-be, vaccinia virus rekombinánsok felépítése céljából. A pIBI76-192 plazmid hasonló azokhoz a rekombináns plazmidokhoz, melyeket Ball et al. /1986, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 83:246-25o/ Írtak le és melyek a vaccinia virus Hindin J fragmentjének egy részét tartalmazzák a timidin kináz /tk/ génbe inzertált 7,5 K promóterrel. Azonban a pIBI7ö-192 esetében a 7,5 K promoter a transzkripciót a tk gén transzkripciójával ellentétes irányban irányítja. A BRS virus P mRNS cDNS-át a 7,5 K promoter fő transzkripciós kezdő helyétől downstream irányban inzertáltuk. Az inzertált BRS virus F gént tartalmazó HindlII J frag.mentet a vaccinia virus /Koppenhága törzs/ genomjába inzertálták homológ rekombinációval /Stott et al., 198θ, J.Virol. 6o: 607-613/. Timidin kináz negatív rekombináns vaccinia vírusokat /rW/ azonosítottunk rekombináns vaccinia vírusok hibridizáésy ciójával BRS virus F génre specifikus próbával(három egymást követő plaque tisztítási eljárással szelektáltuk ezeket. Az F464 és F1597 rekombináns vaccinia vírusok tartalmazták a BRS virus F gént sorrendben előremutató illetve fordított orientációban a 7,5 K promóterre vonatkozóan. A rekombináns vaccinia vírusok genom struktúráját vaccinia mag DNS restrikciós enzimmel emésztett részeinek Southern biot analízisével vizsgáltuk. Ezek a vizsgálatok megerősítették, hogy a BRS virus F gén a rekombináns vírusok tk génjén belül inzertálódotto • ·· • ν
9 9
A következőkben leírjuk a BRS virus F gént tartalmazó rekombináns vaccinia vírussal fertőzött sejtekből származó proteinek analízisét.
A BRS virus F gént tartalmazó rekombináns vaccinia vírusok BRS virus F proteineket expresszáló képességét szövettenyésztési sejtekben vizsgáltuk. A BT sejteket BRS vírussal vad tipusu vaccinia vírussal vagy a promóterre vonatkozóan a BRS virus F gént pozitív vagy negatív orientációban tartalmazó rekombináns vaccinia vírusokkal fertőztük meg. A sejtekben a fehérjéket /^S/-metionin beépítésével jelöltük meg, összegyűjtöttük, majd Wellcome anti-RS szérummal immunoprecipitáltattuk és SDS-poliakrilamid gél elektroforézissel szeparáltuko Az F464 rekombináns vaccinia virus /előremutató orientáció/ legalább két olyan proteint termelt a fertőzött sejtekben, melyeket a Wellcome anti-RS szérum precipitált /13. ábra, F464+ sor/ és melyek, nem voltak jelen a vad tipusu vaccinia vírussal fertőzött sejtekben /13. ábra W sor/ sem az rW F1597 /fordított orientáció/ által fertőzött sejtekben /13· ábra F1597sor/. A két rW F464 által fertőzött sejtre specifikus fehérjének ugyanolyan elektroforetikus mozgékonysága volt, mint a BRS virus Fq és F-^ polipeptidjeinek. Egy a szérum által precipitált celluláris protein /12. ábra M sor/ olyan elektrofo retikus mozgékonysággal rendelkezett, mely hasonlított a BRS virus Fg polipeptidjéhez és meggátolta az rW F464 által fertőzött sejtekben a± Fg polipeptid detektálását. Feltételeztük, hogy ha az Fq protein termelődött és Fj. polipeptidet létrehozva hasitódott, akkor az F2 polipeptid is jelen volt, ha nem is lehetett láthatóvá tenni.
Egy további proteint, melyet korábban BRS vírussal fertőzött sejtekben figyeltek meg /Lerch et al., 1989, J.Virol. §3:833-84o/ és mely kicsit nagyobb volt a BRS vírus . 22 K proteinjénél, figyeltünk meg rW F464-gyel fertőzött sejtekben /13· ábra, F464+ sor/. Eza.további fehérje csupán BRS vírussal vagy rW F464-gyel fertőzött sejtekben termelődött és a Wellcome anitszérummal immunoprecipitáltattuk. Ez az eredmény azt mutatja, hogy ez a további fehérje vagy a BRS vírus F protein speciális hasítási fragmentje vagy kölcsönhatásban van a BRS vírus F proteinjével.
A következőkben megadjuk a rekombináns vaccinia vírusból expresszált BRS vírus F protein glikozilációját.
Annak meghatározása céljából, hogy vajon a rekombináns vaccinia vírussal fertőzött sejtekben szintetizálódott F polipeptidek hasonló módon glikozilálódtak-e mint az autentikus . BRS vírus F polipeptidek az rW F464-gyel fertőzött BT sejtekben levő fehérjéket / yS/-metioninnal jelöltük meg tunikamicin jelenlétében és hiányában. Ezeket a proteineket hasonlóan jelölt BRS vírussal fertőzött BT sejtekből származó pro teinekkek hasonlítottuk össze immunoprecipitációval és SDSpoliakrilamid gél elektroforézissel /14. ábra/. Tunikamicin • · · · _ 88 _ jelenlétében az rVV F464 vírussal fertőzött sejtekben termelődött FQ és ϊχ polipeptidek gyorsabb elektroforetikus mozgékonysággal rendelkeztek mint a tunikamicin hiányában szintetizálódott párjaik /14· ábra, hasonlítsa össze az F^ és F sorokat/ és a BRS vírussal fertőzött sejtekből származó nem glifcozilált Fq és F-^ polipeptidekkei megegyező elektroforetikus mozgékonyságuk volt /13. ábra, az F^ és B^ sorok összevetése/. Tunikamicin jelenlétében a rekombináns vírussal fertőzött sejtekből származó protein sáv, mely feltehetően tartalmazta a BRS virus Fg polipeptidjét egy celluláris proteinnel együtt eltűnt és a gél alján egy sáv intenzitása megnőtt, ahová a nem glikozilált BRS virus F2 migrált /12. ábra/.
A következőkben megadjuk a rekombináns vaccinia vírusból expresszált BRS virus F proteinje sejt felszíni expresszióját
A HRS virus ? glikoprotein a fertőzött sejtek felületén expresszálódik és a virionok membránjába épül be /Huang, 1983, The genome and gene products of humán respiratory syncytial virus Univ.Of North Carolina at Ghapel Hill, Huang et al·, 1985 2:157-171/. Annak meghatározása, .céljából, hogy vajon a rekombináns vaccinia vírussal fertőzött sejtekben expresszált BRS virus F protein transzprotálódott-e a felületére és expresszálódott-e a fertőzött sejtek felületén, rekombináns vaccinia vírussal fertőzött sejteket vizsgáltunk indirekt immunofluo^reszcens festéssel. A BT sejtek rendkívül érzékenyek voltak
a vaccinia vírus fertőzésre és nem voltak használhatók immunofluoreszcenciára magas háttér fluoreszcencia nélkül. Ezért az immunofluoreszcenciát rekombináns vírussal fertőzött HEp-2 sejteken hajtottuk végre. Az immunofluoreszcenciában használt antiszérum a 391-2 BRS vírus specifikus antiszérum volt, melyről korábban kimutatták, hogy felismeri a BRS vírus F proteint BRS vírussal fertőzött sejtekből származó proteinek Western biot analízisében /Lerch et al., 1989, J.Virol. 63: 833-84o/. Ez az antiszérum az immunofluoreszcenci.ás vizsgálatokban specifikus volt a BRS vírussal fertőzött sejtekre, de a nem fertőzött sejkekre nem. A resombináns F464 által fertőzött HBp-2 sejtek /15» ábra, rW F panel/ specifikus felületi fluoreszcenciát mutattad, ami nem volt jelen sem a nem fertőzött sejtekben /15. ábra M panel/ sem a vad tipusu vaccinia vírussal fertőzött sejtekben /15· ábra, W panel/.
A következőkben megadjuk a találmány megvitatását
Meghatároztuk a BRS vírus F mRNS-ának megfelelő cDNS kiónok nukleotid szekvenciáját. A nukleotid szekvenciát és a levezetett aminosav szekvenciát összehasonlítottuk a megfelelő HRS vírus szekvenciákkal. Az F mRNS azonos hosszúságú volt /1899 nukleotid/ az A2, Long és RSS-2 HRS vírusok j? mRNS-aival /Collins et a., 1984, Proc.Natl.AcadoSci. USA 81: 7683-7687; Baybutt and Pringle, 1987 J.Gén.Virol. 68:27892796; Lopez et al., 1988, Vírus Rés. 10:249-262/. A 18537 ··· • · · ·
- 9ο HRS vírus F mRNS 3 nukleotiddal rövidebb a 3’ nem kódoló régióban /Johnson and Collins 1988, J.Gen.Virol. 65:2623-2628/. A nukleinsav azonosság szintje a BRS vírus és a HRS vírus F mRNS-ai között hasonló volt, mint az A és B szubcsoportu HRS vírusok F mRNS-ai közötti szint /Johnson and Collins, 1988, J.Gen.Virol. 69:2623-2628/. A BRS vírus F mRNS fő nyílt leolvasási kerete egy olyan feltételezett 574 aminosavból álló proteint kódolt, mely méretében megegyezett a HRS vírus F proteinjeinek méretével /Collins et al., 1984, Proc.Nazl.Acad. Sci.USA, 81:7683-7687; Baybutt and Pringle, 1987, J.Gen.Virol. 68:2789-2796; Johnson and Collins, 1988, J.Gen.Virol. 69:26232628; Lopez et al., 1988, Vírus Rés. lo:249-262/. A BRS vírus F protein feltételezett strukturális jellemvonásai, mint az Nterminális jel, a C terminális kötő szekvencia, a hasítási szekvencia, ami az F^ és Fg polipeptideket eredményezi, konzerválódtak a HRS vírus F protein ezen jellemvonásaival. A BRS vírus F protein levezetett aminosav szekvenciája 80%-os általános aminosav azonosságot mutatott a HRS vírus F proteinjeivel. A BRS vírus és a HRS vírus F^ polipeptidjei jobban konzerválódtak, 88% aminosav azonossággal, mint az Fg polipeptidek, melyek között 68$-os volt az aminosav azonosság. Ha a BRS vírus és a HRS vírus egy közös őstől származott , az amir nosav azonosság alacsonyabb szintje az Fg-ben az F-^-hez képest azt sugallja, hogy más vagy kevesebb kényszer van az Fg polipeptiden, hogy fenntartsa a specifikus aminosav szekvenciát, mint az F^ polipeptiden. Ugyanúgy a humán és szarvasmarha Fg
- 91 polipeptidek közötti azonossági szintek különbsége összehasonlítva az P2 polipepitidekével azt sugallja, hogy acpontos aminosav szekvencia konzerválása az B2 polipeptid esetében nem olyan fontos mint az B^ polipeptid aminosav szekvenciája esetén, az B protein funkciójának és struktúrájának fenntartásában. A BRS virus B-^ polipeptid feltételezett kötő régiójának és aminos terminusának aminosav szekvenciája erősen konzerválódott összehasonlítva a HRS virus B proteinek ezen szekvenciáival. A feltételezett amino terminális jel peptidek a BRS virus és a HRS virus B proteinjei esetében nem voltak konzerváltak az aminosav szekvenciában, de a feltételezett hidrofobitásban igen.
A BRS virus B polipeptidek tunikamicin /az N-kötésü glikoziláció egy inhibitora/ jelenlétében történő szintézise megmutatta, hogy a BRS virus B polipeptidek N-kötésü szénhidrát felek addiciójával glikozilálódik. Ezen kívül a tunikamicin jelenlétében szintetizált BRS virus és HRS virus B2 polipeptidjei azonos elektroforetikus mozgékonysággal rendelkeztek SDS-poliakrilamid géleken. Ez a BRS virus és a HRS virus Bg polipeptidjeinek különböző mértékű glikozilációját jelezte. A BRS virus B mRNS cDNS kiónjainak nukleotid szekvencia analízise megerősítette, hogy különbség van a potenciális glikozilációs helyek számában. A levezetett BRS virus B2 aminosav szekvencia csupán két helyet tartalmazott potenciális N-kötésü oligoszacharid addicióhoz, mig az A2 HRS virus B2 polipeptidjében négy potenciális hely van.
• ·♦ ♦ • ·
AaN-kötésü glikoziláció gátlására szolgáló tunikamicin alkalmazása megmutatta, hogy a HRS virus és a BRS virus P^ polipeptidek elektroforetikus mozgékonyságában fennálló különbség nem a glikozilációs különbségek következménye volt, mivel a BRS virus és a HRS virus nem glikozilált P^ polipeptid jeinek elektroforetikus mozgékonyságában csupán kis különbségek voltak. A nukleotid szekvencia analizis kimutatta, hogy a feltételezett BRS virus P^ aminosav szekvencia és a HRS virus polipeptididjei azonos méretűek és mindegyik tartalmazott egy potenciális N-kÖtésü oligoszacharid addiciós helyet. Jelenleg azt a következtetést vontuk le, hogy a BRS vírus és a HRS virus P^ polipeptidek aminosav összetételében meglevő kicsiny eltérések okozták az elektroforetikus migrációban tapasztalható különbségeket. Ezen következtetést támasztja a.lá az a munka, mely'kimutatja, hogy egyetlen aminosav megváltoztatása- a vezikuláris stomatitis virus G proteinben, úgy hogy közben a protein glikozilációja változatlan maradt, megváltoztatja az elektroforetikus mozgékonyságot/Pitta et aló, 1989, J.Virol. 63:381o-38o9/.
A BRS virus P proteinje és a HRS virus P proteinjei konzervált epitópokkal rendelkeznek. A reconvalescens borjú szérum és a monoklonális antitestek is felismerik az P proteint bármelyik vírusból /Orvell et al., 1987, J.Gen.Virolo 68:31253135; Stott et al., 1984, Dev.Biol. Stand. 57:237-244; Kennedy et al., 1988, J.Gen.Virol. 69:3o23-3o32; Lerch et al. 1989, J.Virol. 63:833-84o/. Orvell et al /1987, JoGen.Virolo ·· · · · * • ···♦»♦ · β· · ·««·· ·· ·
- 93 68:3125-3135/ azt találták, hogy a 35 HRS vírus F proteinhez előállított monoklonális antitestből csupán 3 nem ismerte fel az F proteint három BRS vírus törzsből. Ezen kívül mind a 11 F protein elleni monoklonális antitest, melyek a HRS vírust neutralizálták egyben neutralizálták a BRS vírus törzsek fertőzőképességét is /Orvell et al., 1987, J.Gen.Virol. 68:3125-3135/. A szintetikus peptideket és monoklonális antitesteket felhasználó vizsgálatok azt sugallták, hogy a HRS vírus F proteinen legalább két olyan epitóp van, mely részt vesz a vírus neutralizációjában. Az epitópok a 212-232 aminosavaknál /Trudel et al., 1987a, J.Gen.Virol. 68:22-73-228o; Trudel et al», 1987b Canad J.Microbiol. 33:933-938/ és a 283-299 aminosavaknál helyezkednek el. Az első epitóp ezek közül pontosan konzerválódott a BRS vírus F proteinjében. A második epitópban három változás van a BRS vírus F proteinjében, melyek mindegyike konzervatív változás. Bár e két epitóp mindegyike az F^ polipeptidben helyezkedik el a neutrálizációt befolyásoló amínosavakat az Fg polipeptidben lokalizálták a Newcastle járvány vírus fúziós proteinjében /Totoda et al., 1988, J.Virol. 62;4427-4430;
Neyt et al., 1989, J.Virol. 63:952-954/.
A HRS vírus és a BRS vírus F proteinjeinek hasonlóságéival szemben ezen vírusok G proteinjei antigenikusan különbözőek. Egyik monoklonális antitest, mely bármelyik HRS vírus szubcsoport G proteinje ellen termelődött, sem ismerte fel a BRS vírus G proteinjét /Orvell et al., 1987, J.Gen.Virol, 68: 3125-3135/. Kimutatták, hogy a BRS vírussal fertőzött borjúból ··♦ _94 származó poliklonális rekonvalecens szérum, mig a BRS virus G proteinjét felismerte, a HRS virus G proteinjét nem ismerte fel /Lerch et al., 1989, J.Virol. 63:833-84o/. A BRS virus és a HRS virus F proteinek közötti antigenikus hasonlóság és a BRS virus és a HRS virus G proteinek között antigenikus kereszt reaktivitás a HRS virus és.a BRS virus homológ fehérjéi közötti aminosav azonossági szintben is tükröződött. A HRS vi. rus és a BRS virus G proteinjei csupán 3o%-os aminosav azonosságot mutattak, mig a két virus F proteinjei 8o%-os aminosav azonossággal rendelkeztek. Az F és G glikoproteinek közötti különbségek az epitópokban való megjelenésükben is nyilvánvaló. Garcia-Barreno et al., /1989, J.Virol. 63.:925-932/ monoklonális antitest paneleket használva azt találták, hogy az F protein epitópjai öt át nem fedő csoportra oszlottak, mig a G protein számos epitopjának kompetíciós profilja erős átfedéseket jutatott.
A BRS virus F génhez tartozó cDNS inzertet tartalmazó rekombináns vaccinia vírusok a BRS virus F proteint expresszálták. Ez a BRS virus F protein az F^ és az F2 polipeptidekre hasadt és hasonló elektroforetikus mozgékonysággal rendelkeztek SDS-poliakrilamid gélekben, mint a BRS vírussal fertőzött sejtekből származó F proteineko Tunikamicinnel, az N-kötésü glikoziláció egy inhibitorával végzett kísérletek kimutatták, hogy a rekombinánssal fertőzött sejtekből expreszszált BRS virus F protein hasonló mértékig glikozilálódott, mint a BRS vírussal fertőzött sejtekből származó F proteinek.
♦ · · · • · · · ·* · • ···«· · · * • · .· ··
A rekombináns vaccinia vírusból expresszált BRS virus F protein transzportálódott és a fertőzött sejtek felületén expresszálódott, amint azt a felületi immunofluoreszcencia kimutatta.
8, Példa: Monospecifikus, poliklonális antitest termelése a BRS virus G proteinjéhez és az antigenikus specifitás kimutatása.
A rekombináns W vírusokból expresszált szarvasmarha RS virus kötődési proteinjének biológiai aktivitásának tesztelésére, valamint a poliklonális antiszérum felhasználásával a _ BRS és HRS vírusok G proteinjei közötti antigenikus kereszt reaktivitás megállapítására BRS virus vagy HRS virus proteint expresszáló rekombináns W vírust használtunk állatok immunizálására Stott et al /1986, J.Virol. 6o:6o7-613/ leírásának megfelel^ően. A BRS virus G proteinnel immunizált állatokból származó szérum specifikusan immunoprecipitálta a BRS virus kötődési proteint^ de nem ismerte fel a humán RS G proteint /16. ábra/. Hasonlóan a HRS virus G protein ellen termelt antiszérum specifikus volt a HRS virus G proteinjére és nem ismerte fel a szarvasmarha RS virus G proteinjét, megerősítve a két kötődési protein antigenikus különbözőségét.
···
-96···::
• · « • · * · • ·· ··
A következőkben leírjuk a deponált mikroorganizmusokat
A következő miknprganizmusokat deponáltuk az American Type Culture Collection-ben /Rockville, Maryland/:
pRLG414-76-191 plazmid pRLF2ol2-76-19o2 plazmid pRLNB3-76 plazrrtid rVG-642 virus rVF-464 virus
A találmány körét nem korlátozzák a deponált mikroorganizmusok vagy a példákban leirt megvalósulások, melyeket a találmány néhány aspektusának illusztrálására szántunk és bármilyen funkcionálisan ekvivalens megvalósulás a találmány körébe tartozik. Valójában az itt bemutatott és leirt megvalósulás mellett számos módosítás nyilvánvaló lesz a tudomány e területén képzett szakember számára és szándékunk szerint ezek is beletartoznak a csatolt igénypontok körébe. Számos publikációra hivatkoztunk a találmány leírásában, ezeket a hivatkozások révén te Íj ességükben beépítettük a találmányba.
Claims (57)
1. Egy rekombináns DNS molekula aszal jellemezve, hogy szarvasmarha respirációs szincitia virus G proteint kódoló nukleinsav szekvenciát tartalmaz.
2. Az 1. igénypont szerinti rekombináns DNS molekula azzal jellemezve, hogy a szarvasmarha respirációs szincitia virus G proteint kódoló nukleinsav szekvencia vagy szubszekvencia alapjában véve a 2. ábrán leírtaknak megfelelő' és legalább kb. lo nukleotidot tartalmaz.
3. Az 1. igénypont szerinti rekombináns DNS molekula azzal jellemezve, hngy a szarvasmarha respirációs szincitia virus G proteint kódoló nukleinsav szekvencia vagy szubszekvencia alapjában véve a 2. ábrán látható 16-912 nukleotidokkal egyezik és legalább kb. lo nukleotidot tartalmaz.
4. A 2. igénypont szerinti rekombináns DNS molekula azzal jellemezve, hogy a 4o841 katalógusszámon az ATCO-ben deponált pRLG414-76-191 plazmidban található.
5. Egy rekombináns DNS molekula azzal jellemezve, hogy a 3. ábrán leirt aminosav szekvenciával vagy annak részeivel alapjában véve homológ proteint kódoló legalább kb. lo nukleotidot magába foglaló szekvenciát tartalmazó
6. Az 1., 2., vagy 5. igénypontok szerinti rekombináns • ··♦*·· · • · ····· · · · ···· · ·« ·· ··:
DNS molekula azzal jellemezve, hogy a szarvasmarha respirációs szincitia virus G proteinjét vagy peptid fragmentjét kódoló nukleinsav szekvencia expresszióját egy második nukleinsav szekvencia szabályozza olyan módon, hogy a szarvasmarha respirációs szir ;itia virus G protein a rekombináns DNS molekulával transzformált gazdában expresszálódik.
7. A 6. igénypont szerinti rekombináns DNS molekula azzal jellemezve, hogy a VR2276 katalógusszámon az ATCC-ben deponált rVG642-ben található.
8. L’gy rekombináns mikroorganizmus azzal jellemezve, hogy az 1., 2., vagy 5. igénypontok szerinti rekombináns DNS molekulát tartalmazza.
9. A 8. igénypont szerinti rekombináns mikroorganizmus azzal jellemezve, hogy egy baktériumot jelent.
10. A 8. igénypont szerinti rekombináns mikroorganizmus azzal jellemezve, hogy egy élesztőgombát jelent.
11. Egy rekombináns mikroorganizmus azzal jellemezve, hogy a 6. igénypont szerinti rekombináns DNS molekulát tartalmazza.
12. Egy eukarióta sejt azzal jellemezve, hogy az 1.,2., vagy 5· igénypontok szerinti rekombináns DNS molekulát tartal mazza ····
13. Egy eukarióta sejt azzal jellemezve, hogy a 6. igénypont szerinti rekombináns DNS molekulát tartalmazza.
14. Egy eukarióta sejt azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerinti rekombináns DNS molekulát tartalmazza.
15. Eljárás a szarvasmarha-respirációs szincitia vírus
G fehérje vagy annak egy fragmentje előállítására azzal jellemezve, hogy az 1., 3«, vagy 5· igénypontok szerinti DNS molekulát tartalmazó rekombináns mikroorganizmust szaporítjuk oly módon, hogy a DNS molekulát a mikroorganizmus expresszálja, majd az expresszált szarvasmarha respirációs szincitis vírus G proteint vagy fragmentet izoláljuk.
16. Eljárás a szarvasmarha respirációs szincitia vírus G proteinje vagy annak egy fragmentje előállítására azzal jellemezve, hogy a 6. igénypont szerinti DNS molekulát tartalmazó rekombináns mikroorganizmust szaporítjuk olyan módon, hogy a DNS molekulát a mikroorganizmus expresszálja, majd az expreszszált szarvasmarha respirációs szincitia vírus G proteint vagy fragmentet izoláljuk.
17. Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia vírus
G protein vagy annak egy fragmentje előállítására azzal jellemezve, hogy az 1., 3. vagy 5. igénypontok szerinti DNS molekulát tartalmazó rekombináns mikroorganizmust szaporítjuk oly módon, hogy a DNS molekulát az eukarióta sejt expresszálja, majd az expresszált szarvasmarha respirációs szincitia •*‘t s vírus G proteint vagy fragmentet izoláljuk.
18. Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia vírus
G protein vagy annak egy fragmentje előállítására azzal jellemezve, hogy a 6. igénypont szerinti DNS molekulát tartalmazó rekombináns mikroorganizmust szaporítjuk oly módon, hogy a DNS molekulát az eukarióta sejt expresszálja, majd az expreszszált szarvasmarha respirációs szincitia vírus G proteint vagy fragmentet izoláljuk.
19. Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia vírus G protein vagy annak egy fragmentje előállítására azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerinti DNS molekulát tartalmazó rekombináns mikroorganizmust szaporítjuk oly módon, hogy a DNS molekulát az eukarióta. sejt expresszálja, majd az expresszált szarvasmarha respirációs szincitia vírus G proteint vagy fragmentet izoláljuk.
20. A 15. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmus egy baktériumot jelent.
21. A 16. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmus egy baktériumot jelent.
22. A termék azzal jellemezve, hogy a 15. igénypont szerinti eljárással készült.
23. A termék azzal jellemezve, hogy a 16. igénypont szerinti eljárással készült.
.: ···:; ......:
• « · · «··· • * ···· «« a · ··· · · ·♦·· lol
24. A termék azzal jellemezve, hogy a 17. igénypont szerinti eljárással készült.
25. A termék azzal jellemezve, hogy a 18. igénypont szerinti eljárással készült.
26. A termék azzal jellemezve, hogy a 19. igénypont szerinti eljárássá! készült.
27. Egy alegység vakcina igénypont szerinti terméket egy hordozóban tartalmazza.
28. Egy alegység vakcina igénypont szerinti terméket egy hordozóban tartalmazza.
29. Egy alegység vakcina igénypont szerinti terméket egy hordozóban tartalmazza.
30. Egy alegység vakcina igénypont szerinti terméket egy hordozóban tartalmazza.
31. Egy alegység vakcina igénypont szerinti terméket egy hordozóban tartalmazza.
32. Egy alegység vakcina azzal jellemezve, hogy a 15· megfelelő gyógyszerészeti azzal jellemezve, hogy a 16. megfelelő gyógyszerészeti azzal jellemezve, hogy a 17« megfelelő gyógyszerészeti azzal jellemezve, hogy a 18. megfelelő gyógyszerészeti azzal jellemezve, hogy a 19. megfelelő gyógyszerészeti azzal jellemezve, hogy a 2o0 ···«
- 1ο2 igénypont szerinti terméket egy megfelelő gyógyszerészeti hordozóban tartalmazza.
33. Egy rekombináns vírus azzal jellemezve, hogy a vírus fertőző de nem patogén és mely az 1., 2., vagy 5· igénypontok szerinti DNS molekulát tartalmazza.
34« Egy rekombináns vírus azzal jellemezve, hogy a vírus fertőző de nem patogén és mely a 6. igénypont szerinti DNS molekulát tartalmazza.
35. Egy vakcina azzal jellemezve, hogy a 33« igénypont szerinti rekombináns vírust tartalmazza.
36. Egy vakcina azzal jellemezve, hogy a 34. igénypont szerinti rekombináns vírust tartalmazza.
37. Egy rekombináns DNS molekula azzal jellemezve, hogy szarvasmarha respirációs szincitia vírus F fehérjét kódoló nukleinsav szekvenciát tartalmaz.
38. A 37. igénypont szerinti rekombináns DNS molekula azzal jellemezve, hogy a szarvasmarha srespirációs szincitia vírus F proteint kódoló nukleinsav szekvencia vagy szubszekvencia alapjában véve a 9. ábrán leírtaknak megfelelő és legalább kb. lo nukleotidot tartalmaz.
39. A 37. igénypont szerinti rekombináns DNS molekula azzal jellemezve, hogy a szarvasmarha respirációs szincitia ·· ···· • ·ν«4 « ·* · · · · • · »·«· · » « · ··♦ · · to· ««
- 1ο3 virus F proteint kódoló nukleinsav szekvencia vagy szubszekvencia alapjában véve a 9. ábrán látható 14-1735 nukleotidokkal egyezik és legalább kb lo nukleotidot tartalmazó
40. A 38. igénypont szerinti rekombináns DNS molekula a 4o842 katalógusszámon az ATCC-ben deponált pRLF2012-76-192 plazmidban található.
41. Egy rekombináns DNS molekula azzal jellemezve,hogy egy a 11. ábrán leirt aminosav szekvenciával vagy annak részéivé! alapjában véve homológ proteint kódoló legalább kb lo nukleotidot magába foglaló szekvenciát tartalmaz.
42. A 37., 38., vagy 41 igénypontok szerinti rekombináns DNS molekula azzal jellemezve, hogy a szarvasmarha respirációs szincitia virus F proteinjét vagy peptid fragmentjét kódoló nukleinsav szekvencia expresszióját egy második nukleinsav szekvencia szabályozza oly módon, hogy a szarvasmarha respirációs szincitia virus F proteinje a rekombináns DNS molekulával transzformált gazdában expresszálódik.
43. A 42. igénypont szerinti rekombináns DNS molekula azzal jellemezve, hogy a VR2277 katalógusszámon az ATCC-ben deponált rVF464-ben található.
,
44. . Egy rekombináns mikroorganizmus azzal jellemezve, hogy a 37., 38., vagy 41. igénypontok szerinti rekombináns DNS molekulát tartalmaz.
• ·
- 104
45.
A 44. igénypont szerinti rekombináns mikroorganiz mus azzal jellemezve, hogy egy baktériumot jelent.
46. a 44. igénypont szerinti rekombináns mikroorganizmus azzal jellemezve, hogy egy élesztőgombát jelent.
47. Egy rekombináns mikroorganizmus azzal jellemezve, hogy a 42. igénypont szerinti rekombináns molekulát tártál mázzá.
48. Egy eukarióta sejt azzal jellemezve, hogy a 37·,
38., vagy 41 igénypontok szerinti rekombináns DNS molekulát tartalmaz.
49. Egy eukarióta sejt azzal jellemezve, hogy a 42. igénypont szerinti rekombináns DNS molekulát tartalmaz.
50. Egy eukarióta sejt azzal jellemezbe, hogy a 43· igénypont szerinti rekombináns DNS molekulát tartalmaz.
51. Eljárás a szarvasmarha respirációs színeitia virus F proteinje vagy annak egy fragmentje előállítására azzal jellemezve, hogy a 37., 38., vagy 41 igénypontok szerinti DNS molekulát tartalmazó rekombináns mikroorganizmust szaporítjuk oly módon, hogy a DNS molekulái a mikroorganizmus expresszálja, majd az expresszált szarvasmarha respirációs szincitia virus F fehérjét vagy fragmentet izoláljuk.
52. Eljárás a szarvasmarha respirációs szincitia virus •·»··· · • ···«« , · .
• · «· · ·
- 1ο5 Ρ protein vagy annak egy fragmentje előállítására aszal jellemezve, hogy a 42. igénypont szerinti DNS molekulát tartalmazó rekombináns mikroorganizmust szaporítjuk oly módon, hogy a DNS molekulát a mikroorganizmus expresszálja, majd az expresszált szarvasmarha respirációs szincitia virus P proteint vagy fragmente-t izoláljuk.
53. Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia virus P protein vagy annak egy fragmentje előállítására, azzal jellemezve, hogy a 37., 38., vagy 41 igénypontok szerinti DNS molekulát tartalmazó rekombináns mikroorganizmust szaporítjuk oly módon, hogy a DNS molekulát az\ eukarióta sejt expresszálja, majd az expresszált szarvasmarha respirációs szincitia virus P proteint vagy fragmentet izoláljuk.
54. Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia virus
P protein vagy annak egy fragmentje előállítására azzal jellemezve, hogy a 42. igénypont szerinti DNS molekulát tartalmazó rekombináns mikroorganizmust szaporítjuk oly módon, hogy a DNS molekulát az eukarióta sejt expresszálja, majd azexpresszált szarvasmarha respirációs szincitia virus P proteint vagy fragmentet izoláljuk.
55» Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia virus P protein vagy annak egy fragmentje előállítására azzal jellemezve, hogy a 43. igénypont szerinti DNS molekulát tartalmazó rekombináns mikroorganizmust szaporítjuk oly módon, hogy a DNS molekulát az eukarióta sejt expresszálja, majd az ex- — 1ο6 presszált szarvasmarha respirációs szincitia virus F proteint vagy fragraentet izoláljuk.
56. Az 51. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmus egy baktériumot jenet.
57. Az 52. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmus egy baktériumot jelent.
63. Egy alegység vakcina azzal jellemezve, hogy az 51.
igénypont szerinti terméket egy megfelelő gyógyszerészeti hordozóban tartalmazza.
64. Egy alegység vakcina azzal jellemezve, hogy az 52 igénypont szerinti terméket egy megfelelő’gyógyszerészedri ♦ · ♦ · • · · ·
- 1ο7 hordozóban tartalmazza.
65. Egy alegység vakcina azzal jellemezve, hogy az 53» igénypont szerinti terméket egy megfelelő gyógyszerészeti hordozóban tartalmazza.
66. Egy alegység vakcina'azzal jellemezve, hogy az 54· igénypont szerinti terméket egy megfelelő gyógyszerészeti hordozóban tartalmazza.
67. Egy alegység vakcina azzal jellemezve, hogy az 55. igénypont szerinti terméket egy megfelelő gyógyszerészeti hordozóban tartalmazza.
68. Egy alegység vakcina azzal jellemezve, hogy az 56. igénypont szerinti terméket egy megfelelő gyógyszerészeti hordozóban tartalmazza.
69. Egy rekombináns virus azzal jellemezve, hogy a virus fertőző de nem patogén és mely a 37·, 38., vagy 41. igénypontok szerinti DNS molekulát tartalmaz.
70. Egy rekombináns virus azzal jellemezve, hogy a virus fertőző de nem patogén és mely a 42. igénypont szerinti DNS molekulát tartalmaz.
71. Egy vakcina azzal jellemezve, hogy a 69. igénypont szerinti rekombináns virust tartalmaz.
• ·
- 1ο8
72. Egy vakcina azzal jellemezve, hogy a 7o. igénypont szerinti rekombináns vírust tartalmaz.
73. Egy a 3. ábrán leirt aminosav szekvenciával vagy annak egy szubszekvenciájával alapjában véve azonos aminosav szekvenciával rendelkező rekombináns vagy szintetikus protein azzal jellemezve, hogy egy antigenikus determinánssal rendelkezik.
74. Egy a 11. ábrán leirt aminosav szekvenciával vagy annak egy szubszekvenciájával alapjában véve azonos aminosav szekvenciával rendelkező rekombináns vagy szintetikus protein azzal jellemezve, rogy egy antigenikus determinással rendelkezik.
75. Egy alegység vakcina azzal jellemezve^ hogy a 73. igénypont szerinti rekombináns vagy szintetikus proteint egy megfelelő gyógyszerészeti hordozóban tartalmazza.
76. Egy alegység vakcina azzal jellemezve, hogy a 74. igénypont szerinti rekombináns vagy szintetikus proteint egy megfelelő gyógyszerészeti hordozóban tartalmazza.
77. Egy antitest azzal jellemezve, hogy olyan módszerrel állítjuk elő, melyben egy állatot a 73. igénypont szerinti rekombináns vagy szintetikus proteinnel inokulálunk.
78. A 77. igénypont szerinti antitest azzal jellemezve, hogy egy monoklonális antitestet jelent.
• · · · • · · ♦ · · • ··*»·· · · ····· ·· ·
- 1ο9 -
79. Egy antitest fragment-vagy egy antitest származék azzal jellemezve, hogy a 77. igénypont szerinti antitestből állítjuk elő.
80. Egy antitest fragment vagy egy antitest származék azzal jellemezve, hogy a 73. igénypont szerinti antitestből állítjuk elő.
81. Egy antitest azzal jellemezve,hogy olyan módszerrel állítjuk elő, melyben egy állatot a 74. igénypont szerinti rekombináns vagy szintetikus proteinnel inokulálunk.
82. A 81. igénypont szerinti antitest azzal jellemezve, hogy egy monoklonálí_s antitestet jelent.
83. Egy antitest fragment vagy egy antitest származék azzal jellemezve, hogy a 81. igénypont szerinti antitestből állítjuk elő.
84. Egy antitest fragment vagy egy antitest származék azzal jellemezve, hogy a 82. igénypont szerinti antitestből állítjuk elő.
85. Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia vírus fertőzés diagnosztizálására azzal jellemezve, hogy a szarvasmarha respirációs szincitia vírus nukleinsav jelenlétét detektáljuk olyan mintában,melyet szarvasmarha respirációs szincitia vírussal potenciálisan fertőzött állatból nyertünk.
86.
hogy;
melyben a szincitia
87.
hogy:
···::
• · · ··· * · · · · · ·
- llo A 85. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, /1/ egy szarvasmarha respirációs szincitia vírussal potenciálisan fertőzött állatból nyert mintából készített nukleinsavat kiteszünk egy nukleinsav molekulának - mely a 2. ábrán leirt szekvenciáju vagy azzal alapjában véve azonos szubszekvenciával rendelkezik és legalább kb. lo nukleotidot tartalmaz - olyan körülmények között, melyek a hibridizációt lehetővé teszik és /2/ detektáljuk, hogy a hibridizáció bekövetkezik-e, hibridizáció detektálása a szarvasmarha respirációs vírus fertőzést indikálja.
A 85. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, /1/ egy szarvasmarha respirációs szincitia vírussal potenciálisan fertőzött állatból nyert mintából készített nukleinsavat kiteszünk egy nukleinsav molekulának - mely a 9· ábrán leirt szekvenciáju, vagy azzal alapjában véve azonos szubszekvenciával rendelkezik és legalább kb. lo nukleotidot tartalmaz - clyan körülmények között, melyek a hibridizációt lehetővé tesik és ···♦ • ·· ·
- 111 • · · • · a ···»·· · • ···»· · · · • * · · * · /2/ detektáljuk, hogy a hibridizáció bekövetkezik-e , melyben a hibridizáció detektálása a szarvasmarha respirációs szincitia virus fertőzést indikálja.
A 86. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az RlJS-at szarvasmarha respirációs szincitia vírussal potenciálisan fertőzött állatból nyerjük és az /1/ lépésben
Northern biot analízisnek vetjük alá.
39. A 87. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az RNS-at szarvasmarha respirációs szincitia vírussal potenciálisan fertőzött állatból nyerjük és az /1/ lépésben Northern biot analízisnek vetjük alá.
9o. Agy a szarvasmarha respirációs szincitia virus fertőzés detektálására szolgáló eljárás azzal jellemezve, hogy:
/1/ egy szarvasmarha respirációs szincitia vírussal potenciálisan fertőzött állatból nyert szérum mintát'kitesszük egy antigenikus determinánst tartalmazó, a 3. ábrán leirt aminosav szekvenciáju vagy azzal alapjában véve megegyező aminosav szekvenciával vagy ennek egy szübszekvenciájával rendelkező rekombináns vagy szintetikus fehérjének olyan körülmények között, mely lehetővé teszi az antitest fehérjéhez való kötődését; és • · · · • · · · • · · ·· • · · · · • · ·
- 112 /2/ detektáljuk, hogy az antitest proteinhez való kötődése bekövetkezik-e, ahol az antitest proteinhez való kötődése a szarvasmarha respirációs szincitia vírussal való fertőzöttséget vagy az ennek való kitettséget jelzi.
91. A 9o. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy egy enzimhez kötött immunoszőrbens vizsgálatot jelent.
92. A 9o. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az antitest jelenlétét Weste?n biot technikákat használva határozzuk meg.
93. Egy a szarvasmarha respirációs szincitia vírus fertőzés detektálására szolgáló eljárás azzal jellemezve, hogy: /1/ egy szarvasmarha respirációs szincitia vírussal potenciálisan fertőzött állatból nyert szérum mintát kiteszünk egy antigenikus determinánst tartalmazó, a 11. ábrán leirt aminosav szekvencíáju vagy azzal alapjában véve megegyező aminosav szekvenciával vagy ennek egy szubszekvenciával rendelkező rekombináns vagy szintetikus fehérjének olyan körülmények között, mely lehetővé teszi az antitest fehérjéhez való kötődését; és /2/ detektáljuk, hogy az antitest proteinhez való kötődése bekövetkezik-e, ··♦* • · · ·
- 113 ahol az antitest proteinhez való kötődése a szarvasmarha respirációs szincitia vírussal való fertőzöttséget vagy az ennek való kitettséget jelzi.
94. A 93« igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy egy enzimhez kötött immunoszorbens vizsgálatot jeleni.
95. A 93. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az antitest jelenlétét Western biot technikákat használva határozzuk meg.
96. Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia vírussal szembeni immunválasz kiváltására azzal jellemezve, hogy a 27. igénypont szerinti alegység vakcina hatékony mennyiségét adjuk egy olyan állatnak, melynek egy ilyen kezelésre szüksége van.
97. Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia vírussal szembeni immunválasz kiváltására azzal jellemezve, hogy a 28. igénypont szerinti alegység vakcina hatékony mennyiségét adjuk olyan állatnak, melynek egy ilyen kezelésre szüksége van.
98. Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia vírussal szembeni immunválasz kiváltására azzal jellemezve, hogy a 29. igénypont szerinti alegység vakcina hatékony mennyiségét adjuk egy olyan állatnak, melynek egy ilyen kezelésre szüksége van.
·· · 9 « • «»·«·· • · · · · e · ··· ♦ ·
- 114 99· Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia vírussal szembeni immunválasz kiváltására azzal jellemezve, hogy a 3o. igénypont szerinti alegység vakcina hatékony mennyiségét adjuk egy olyan állatnak, melynek egy ilyen kezelésre szüksége van.
100. Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia vírussal szembeni immunválsz kiváltására azzal jellemezve, hogy a 31. igénypont szerinti alegység vakcina hatékony mennyiségét adjuk egy olyan állatnak, melynek egy ilyen kezelésre szüksége van.
101. Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia vírussal szembeni immunválsz kiváltására azzal jellemezve, hogy a 32. igénypont szerinti alegység vakcina hatékony - mennyiségét adjuk egy olyan állatnak, melynek egy ilyen kezelésre szüksége van.
102. Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia vírussal szembeni immunválsz kiváltásáraaazzal jellemezve, hogy a 35. igénypont szerinti vakcina hatékony mennyiségét adjuk egy olyan állatnak, melynek egy ilyen kezelésre szüksége van.
103. Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia vírussal szembeni immunválasz kiváltására azzal jellemezve, hogy a 36. igénypont szerinti vakcina hatékony mennyiségét adjuk egy olyan állatnak, melynek egy i]jpn kezelésre *· · • ♦· ···· • ♦ · * · · · * · ····· ·· · • · · · ·
- 115 szüksége van.
1ο4· Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia vírussal szembeni immunválasz kiváltására azzal jellemezve, hogy a 63. igénypont szerinti alegység vakcina hatékony mennyiségét adjuk egy olyan állatnak, melynek egy ilyen kezelésre szüksége van.
105. Eljárás szarvasmarha respirációs szinsitia vírussal szembeni immunválasz kiváltására azzal jellemezve, hogy a 64. igénypont szerinti alegység vakcina hatékony mennyiségét adjuk egy olyan állatnak, melynek egy ilyen kezelésre szüksége van.
106. Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia vírussal szembeni immunválasz kiváltására azzal jellemezve, hogy a 65. igénypont szerinti alegység vakcina hatékony mennyiségét adjuk egy olyan állatnak, meoynek egy ilyen kezelésre szüksége van.
107. Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia vírussal Szembeni immunválasz kiváltására azzal jellemezve, hogy a 66. igénypont szerinti alegység vakcina hatékony mennyiségét adjuk egy olyan állatnak, melynek egy ilyen kezelésre szüksége van.
108. Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia vírussal szembeni immunválasz kiválátására azzal jellemezve, hogy • · · ·
- 116 a 67. igénypont szerinti alegység vakcina hatékony mennyiségét adjuk egy olyan állatnak, melynek egy ilyen kezelésre szüksége van.
109. Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia vírussal szembeni immunválasz kiváltására azzal jellemezve, hogy a 68. igénypont szerinti alegység vakcina hatékony mennyiségét adjuk egy olyan állatnak, melynek egy ilyen kezelésre szüksége van.
110. Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia vírussal szembeni immunválasz kiváltására azzal jellemezve, hogy a 71. igénypont szerinti vakcina hatékony mennyiségét adjuk egy olyan állatnak, melynek egy ilyen kezelésre szüksége van.
111. Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia vírussal szembeni immunválasz kiváltására azzal jellemezve, hogy a 72. igénypont szerinti vakcina hatékony mennyiségét adjuk egy olyan állatnak, melynek egy ilyen kezelésre szüksége van.
112. Egy rekombináns DNS molekula azzal jellemezve, hogy egy szarvasmarha respirációs szincitia vírus N proteint kódoló nukleinsav szekvenciát tartalmaz.
113. A 112. igénypont szerinti rekombináns DNS molekula azzal jellemezve, hogy a benne található szarvasmarha respirációs szincitia vírus N proteint kódoló nukleinsav szekvencia vagy szubszekvencia alapjában véve megegyezik a • 2 ♦«·« · *· ··♦· • · · · * · • · · « «·· « • · *··· · * « » ··· · « *· ·«
- 117 17. ábrán leírtakkal és legalább kb. lo nukleotidot tartalmaz.
114. A 113. igénypont szerinti rekombináns DNS molekula azzal jellemezve, hjogy a 4o843 katalógusszámon az ATCCben deponált pRLNB3-76 plazmádban található.
115. Egy rekombináns DNS molekula azzal jellemezve, hogy a 18. ábrán leirt aminosav szekvenciával vagy annak részeivel alapjában véve homológ proteint kódoló legalább kb. lo nukleotidot magába foglaló szekvenciát tartalmaz.
116. Egy rekombináns mikroorganizmus azzal jellemezve, hogy a 113. igénypont szerinti rekombináns DNS molekulát tarttalmaz.
117. A 116. igénypont szerinti rekombináns mikroorganizmus azzal jellemezve, hogy egy baktériumot jelent.
118. A 116. igénypont szerinti rekombináns mikroorganizmus azzal jellemezve, hogy egy élszetőgombát jelent.
119. Egy eukarióta sejt azzal jellemezve, hogy a 113<> igénypont szerinti rekombináns DNS molekulát tartalmazza.
120. Egy rekombináns vírus azzal jellemezve, hogy a vírus fertőző de nem patogén és mely a 113· igénypont szerinti DNS molekulát tartalmazza.
121. Egy vakcina azzal jellemezve, hogy a 12o. igénypont szerinti rekombináns vírust tartalmazza.
118
122. Egy a 18. ábrán leirt aminosav szekvenciával vagy annak egy szubszekvenciájával alapjában véve azonos aminosav szekvenciával rendelkező rekombináns vagy szintetikus protein azzal jellemezve, hogy egy antigenikus determinánssal rendelkezik.
123o Egy alegység vakcina azzal jellemezve, hogy a 122o igénypont szerinti rekombináns vagy szintetikus proteint egy megfelelőgyógyszerészeti hordozóban tartalmazza.
124. Egy antitest azzal jellemezve, hogy olyan módszerrel állítjuk elő, melyben egy állatot a 122o igénypont szerinti rekombináns vagy szintetikus proteinnel inokulálunko
125. A 124. igénypont szerinti antitest azzal jellemezve, hogy egy monoklonális antitestet jelent.
126. Egy antitest fragment vagy egy antitest származék azzal jellemezve, hogy a 125. igénypont szerinti antitestből előállítjuk ·
127. A 85. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy:
/1/ egy szarvasmarha respirációs szincitia vírussal potenciálisan fertőzött állatból nyert mintából készített nukleinsavat kiteszünk egy egy nukleinsav molekulának - mely a 17. ábrán leirt szekvenciáju vagy azzal alapjában véve .: ···:: ......;
♦ · · · ··· · • · ···* · · · · ··· 9 · ♦· ··
- 119 azonos szubszekvenciával rendelkezik és legalább kb. lo nukleotidot tartalmaz - olyan körülmények között, melyek a hibridizációt lehetővé teszik és /2/detektáljuk, hogy- a hibridizáció bekövetke—zik-e, melyben a hibridizáció ‘detektálása-a szarvasmarha respirációs szincitia virus fertőzést indikálja.
128. Egy a szarvasmarha respirációs szincitia virus fertőzésére szolgáló eljárás azzal jellemezve, hogy:
/1/ egy szarvasmarha respirációs szincitia vírussal potenciálisan fertőzött állatból nyert szérum mintát kiteszünk egy antigenikus determinánst tartalmazó, a 18, ábrán leirt aminosav szekvenciáju vagy azzal alapjában véve megegyező aminosav szekvenciával vagy ennek egy szubszekvenciájával rendelkező rekombináns vagy szintetikus fehérjének olyan körülmények között, mely lehetővé teszi az antitest fehérjéhez való kötődését; és /2/ detektáljuk, hogy az antitest proteinhez való kötődése bekövetkezik-e ahol az antitest proteinhez való kötődése a szarvasmarha respirációs szincitia vírussal való fertőzöttséget vagy az ennék
12ο való kitettséget jelzi.
129. Eljárás szarvasmarha respirációs szincitia vírussal szembeni immunválasz kiváltására azzal jellemezve, hogy a 123. igénypont szerinti alegység vakcina hatékony mennyiségét adjuk egy olyan állatnak, melynek egy ilyen kezelésre szüksége van.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US55726790A | 1990-07-24 | 1990-07-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9300187D0 HU9300187D0 (en) | 1993-04-28 |
| HUT67362A true HUT67362A (en) | 1995-03-28 |
Family
ID=24224715
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9300187A HUT67362A (en) | 1990-07-24 | 1991-07-23 | Methods of use of bovine respiratory syncytial virus recombinant dna, proteins, vaccines, antibodies and transformed cells |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6060280A (hu) |
| EP (1) | EP0540645A4 (hu) |
| JP (3) | JPH05509231A (hu) |
| AU (1) | AU650040B2 (hu) |
| CA (1) | CA2087853A1 (hu) |
| HU (1) | HUT67362A (hu) |
| IE (1) | IE912586A1 (hu) |
| NZ (1) | NZ239084A (hu) |
| WO (1) | WO1992001471A1 (hu) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2198279A1 (en) * | 1994-08-25 | 1996-02-29 | Johannes Petrus Maria Langedijk | Antigenic peptides derived from the g protein of rsv for type- and subtype-specific diagnosis of respiratory syncytial virus (rsv) infection |
| US5789229A (en) * | 1994-09-30 | 1998-08-04 | Uab Research Foundation | Stranded RNA virus particles |
| US5716821A (en) * | 1994-09-30 | 1998-02-10 | Uab Research Foundation | Prevention and treatment of respiratory tract disease |
| FR2726471B1 (fr) | 1994-11-07 | 1997-01-31 | Pf Medicament | Procede pour ameliorer l'immunogenicite d'un compose immunogene ou d'un haptene et application a la preparation de vaccins |
| AU727923B2 (en) * | 1995-09-27 | 2001-01-04 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Production of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences |
| US6180398B1 (en) * | 1996-07-12 | 2001-01-30 | Virogeneitics Corporation | Two-step immunization procedure against the pyramyxoviridae family of viruses using recombinant virus and subunit protein preparation |
| FR2751229B1 (fr) * | 1996-07-19 | 1998-11-27 | Rhone Merieux | Formule de vaccin polynucleotidique notamment contre la pathologie respiratoire des bovins |
| FR2751228B1 (fr) * | 1996-07-19 | 1998-11-20 | Rhone Merieux | Vaccin polynucleotidique bovin pour voie intradermique |
| US7632508B2 (en) | 1997-05-23 | 2009-12-15 | The United States Of America | Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus (PIV) vaccines |
| US20030082209A1 (en) | 2000-07-05 | 2003-05-01 | Skiadopoulos Mario H. | Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus (PIV) vaccines |
| US7951383B2 (en) | 1997-05-23 | 2011-05-31 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Attenuated parainfluenza virus (PIV) vaccines |
| US7201907B1 (en) | 1997-05-23 | 2007-04-10 | The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus(PIV) vaccines |
| WO1999024564A1 (en) * | 1997-11-10 | 1999-05-20 | University Of Maryland | PRODUCTION OF NOVEL BOVINE RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUSES FROM cDNAs |
| US6908618B2 (en) | 1997-11-10 | 2005-06-21 | University Of Maryland | Production of novel bovine respiratory syncytial viruses from cDNAs |
| EP1074612A1 (en) * | 1999-08-04 | 2001-02-07 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Use of vegetal peptones for DNA vaccine production |
| US6605283B1 (en) | 2002-11-01 | 2003-08-12 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Nucleotide sequence for the Avian Metapneumovirus (Colorado) attachment glycoprotein gene |
| GB2475223A (en) * | 2009-09-24 | 2011-05-18 | Pasteur Institut | A Paramyxoviridae family N protein-RNA complex in crystal form |
| CN109266622B (zh) | 2012-08-01 | 2023-05-09 | 巴法里安诺迪克有限公司 | 重组改良型安卡拉痘苗病毒(mva)呼吸道合胞病毒(rsv)疫苗 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| US4722848A (en) * | 1982-12-08 | 1988-02-02 | Health Research, Incorporated | Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus |
| US4752638A (en) * | 1983-11-10 | 1988-06-21 | Genetic Systems Corporation | Synthesis and use of polymers containing integral binding-pair members |
| US4855224A (en) * | 1984-03-09 | 1989-08-08 | Genentech, Inc. | Molecularly cloned diagnostic product and method of use |
| US4790987A (en) * | 1985-11-15 | 1988-12-13 | Research Corporation | Viral glycoprotein subunit vaccine |
| DE3689622T2 (de) * | 1986-01-14 | 1994-06-16 | Univ North Carolina | Impfstoffe gegen menschliche respiratorische viren. |
| US4879213A (en) * | 1986-12-05 | 1989-11-07 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic polypeptides and antibodies related to Epstein-Barr virus early antigen-diffuse |
| US4994368A (en) * | 1987-07-23 | 1991-02-19 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Amplification method for polynucleotide assays |
| US5223254A (en) * | 1987-09-29 | 1993-06-29 | Praxis Biologics, Inc. | Respiratory syncytial virus: vaccines |
| WO1992007940A2 (en) * | 1990-11-05 | 1992-05-14 | Siba Kumar Samal | Bovine respiratory syncytial virus genes |
| WO1993011795A1 (en) * | 1991-12-10 | 1993-06-24 | Integrated Biotechnology Corporation | Anti-idiotypic vaccine for protection against bovine respiratory syncytial virus |
-
1991
- 1991-07-23 AU AU83303/91A patent/AU650040B2/en not_active Ceased
- 1991-07-23 EP EP19910914308 patent/EP0540645A4/en not_active Withdrawn
- 1991-07-23 CA CA002087853A patent/CA2087853A1/en not_active Abandoned
- 1991-07-23 NZ NZ239084A patent/NZ239084A/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-07-23 HU HU9300187A patent/HUT67362A/hu unknown
- 1991-07-23 JP JP3514104A patent/JPH05509231A/ja active Pending
- 1991-07-23 IE IE258691A patent/IE912586A1/en not_active Application Discontinuation
- 1991-07-23 WO PCT/US1991/005194 patent/WO1992001471A1/en not_active Application Discontinuation
-
1993
- 1993-09-08 US US08/118,148 patent/US6060280A/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-01-12 JP JP2001004873A patent/JP2001258581A/ja active Pending
- 2001-01-12 JP JP2001004856A patent/JP2001258580A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU9300187D0 (en) | 1993-04-28 |
| EP0540645A4 (en) | 1993-12-29 |
| US6060280A (en) | 2000-05-09 |
| WO1992001471A1 (en) | 1992-02-06 |
| CA2087853A1 (en) | 1992-01-25 |
| IE912586A1 (en) | 1992-01-29 |
| JP2001258581A (ja) | 2001-09-25 |
| JPH05509231A (ja) | 1993-12-22 |
| NZ239084A (en) | 1994-09-27 |
| JP2001258580A (ja) | 2001-09-25 |
| AU650040B2 (en) | 1994-06-09 |
| EP0540645A1 (en) | 1993-05-12 |
| AU8330391A (en) | 1992-02-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0832253B1 (en) | Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines | |
| JP2534246B2 (ja) | ニユ−カツスル病ウイルス遺伝子クロ−ン | |
| HUT67362A (en) | Methods of use of bovine respiratory syncytial virus recombinant dna, proteins, vaccines, antibodies and transformed cells | |
| Lerch et al. | Nucleotide sequence analysis and expression from recombinant vectors demonstrate that the attachment protein G of bovine respiratory syncytial virus is distinct from that of human respiratory syncytial virus | |
| US6083925A (en) | Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines | |
| Sullender et al. | The respiratory syncytial virus subgroup B attachment glycoprotein: analysis of sequence, expression from a recombinant vector, and evaluation as an immunogen against homologous and heterologous subgroup virus challenge | |
| US8372963B2 (en) | RSV F-protein and its use | |
| JPH03502687A (ja) | レスピラトリイ・シンシチアル・ウイルス：ワクチンおよび診断法 | |
| Lerch et al. | Nucleotide sequence analysis of the bovine respiratory syncytial virus fusion protein mRNA and expression from a recombinant vaccinia virus | |
| CN117098551A (zh) | 编码截短的ns1蛋白和sars-cov受体结合域的流感病毒 | |
| WO1992007940A2 (en) | Bovine respiratory syncytial virus genes | |
| JP2001512662A (ja) | 呼吸器合胞体ウイルスのｇタンパク質をコードする核酸ワクチン | |
| JP3262787B2 (ja) | 豚コレラウイルスワクチン | |
| US6730305B1 (en) | Nucleotide sequences encoding bovine respiratory syncytial virus immunogenic proteins | |
| US6017897A (en) | Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines | |
| KR20210005090A (ko) | 키메라 벡터 | |
| KR20180085803A (ko) | 약독화 표현형의 범위를 제공하는 m2-2 orf 변이를 가지는 재조합 호흡기 세포융합 바이러스 균주 | |
| US6605283B1 (en) | Nucleotide sequence for the Avian Metapneumovirus (Colorado) attachment glycoprotein gene | |
| CA2402339C (en) | Viral antigen and vaccine against isav (infectious salmon anaemia virus) | |
| NZ250402A (en) | Bovine respiratory syncytial virus g protein, recombinant dna and vaccines | |
| US7510863B2 (en) | Avian pneumovirus genes, recombinant avian pneumoviruses and methods of making | |
| KR20230021115A (ko) | 생 약독화된 호흡기 세포융합 바이러스 (live attenuated respiratory syncytial virus) | |
| Pastey | Biochemical and antigenic characterization of the fusion protein of bovine respiratory syncytial virus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |