HUT63062A

HUT63062A - Process for producing pharmaceutical compositions increasing the immune response and comprising il-4

Info

Publication number: HUT63062A
Application number: HU8829D
Authority: HU
Inventors: Jerome Schwartz; Claude H Nash
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1990-03-21
Filing date: 1991-03-19
Publication date: 1993-07-28
Also published as: OA09672A; CA2078676A1; PT97082A; IE72204B1; IL97600A0; EP0521916B1; EP0521916A1; ATE133074T1; ZA912037B; DE69116552T2; PT97082B; MY108672A; DE69116552D1; JPH05505799A; IE910921A1; GR3019018T3; WO1991014450A1; ES2082201T3; FI924215A; DK0521916T3

Description

A találmány tárgya eljárás olyan, aktív hatóanyagként IL-4et (interleukin-4) tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek hatékony immunválaszt képesek kiváltani endémiás krónikus fertőzéseket okozó kórokozókkal szemben, ilyen kórokozók hatásának kitett emlősök esetében. A találmány tárgya továbbá az • · ·

- 2 is, hogy az IL-4 olyan gyógyszerkészítmények előállítása során is felhasználható, melyek hatékony immunválaszt képesek kiváltani endémiás krónikus fertőzéseket okozó kórokozókkal szemben, emellett azonban a találmány tárgyához tartozik olyan módszerek biztosítása is, amelyek alkalmasak hatékony immunválasz kiválasztására endémiás krónikus fertőzéseket okozó kórokozókkal szemben, ilyenfajta kórokozók hatásának kitett emlősök esetében oly módon, hogy ezen emlősöknek hatékony mennyiségű interleukin-4-et adagolunk.

Az interleukin-4-et [a továbbiakban IL-4, melyet más néven B-sejt stimuláló faktor 1-nek (BSF-1 - B Cell Stimulatory Factor 1) is neveznek] elsőként M. Howard és munkatársai írták le a J. Exp. Med. folyóiratban [155, 914-923 (1982). Az IL-4 olyan — az IL-2-től különböző — T-sejt eredetű növekedési faktor, melynek segítségével a normál egér B-limfociták hosszú időn keresztül tartós szövettenyészete hozható létre, és amely — az aktivált B-limfocitákkal kölcsönhatásban — legalább 4 hónapon keresztül fenntartja az említett sejtek szaporodását. Bár kevert B-limfocita explantátumokat használtak a tenyészetek szaporodásának beindítására, úgy tűnik, hogy az éretlen fenotípusú B-limfociták osztódása különösen jelentős mértékben fokozható a szövettenyészetben IL-4 alkalmazásával. [Lásd például C. Perchel és munkatársainak közleményét - J. Immunoi. 142, 1558-1568 (1989)]. Emellett meg kell említeni G. Trenn és munkatársainak közleményét is [J. Immunoi. 140, 1101-1106 (1988)], amelyben a szerzők arról számolnak be, hogy az IL-4 stimulálja citotoxikus T-sejtek kifejlődését nyugvó, egér-eredetű T-Limfociták Lyt-2+ szubpopu• · ·

- 3 lációjából. H. Spits és munkatársai [J. Immunoi. 139, 1142-1147 (1987) arról számolnak be, hogy az IL-4 stimulálja citotoxikus T-sejtek kifejlődését nyugvó, egér-eredetű T-limfociták Lyt-2+ szubpopulációjából. H. Spits és munkatársai [J. Immunoi. 139, 1142-1147 (1987)] arról számolnak be, hogy az IL-4 — az IL-2-től eltérően — T-sejt növekedési faktorként fejtheti ki hatását emberi sejtekre in vitro körülmények között.

Az egér IL-4 gént klónozták, és COS-7 sejtekben kifejezték. [Lásd T. Otsuka és munkatársai, Nuc. Acids Rés. 15, 333-334 (1987)]. A klónozott faktor szövettenyészetben mindazon aktivitásokat mutatta, melyek a T-sejttenyészetek felülúszóiból nyert, tisztított faktorokra jellemzőeknek tekinthetők. A humán IL-4 gén klónozását és kifejezését N. Arai és munkatársai [J. Immunoi. 142, 274-282 (1989), valamint T. Yokota és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. 8.3, 5844-5848 (1986) írták le az eredeti molekulához hasonló aktivitású, COS-7 sejtekben termelt faktorral kapcsolatban, szövettenyészetben végzett vizsgálat során. Mivel az IL-4-et mind emberi, mind pedig egér eredetű sejtrendszerekben tanulmányozták, a molekulához további in vitro aktivitási jellemzők társíthatok, mégpedig a következők: i) az IL-4 fontos szerepet játszik az IgE szintézis indukciójában és szabályozásában, egy olyan folyamatéban, mely akkor jön létre, amikor a Blimfocita szubpopulációk proliferációja megkezdődik [L.S.

Romagnani és munkatársai, Clin. Immunoi. Immunopathol. .50., 513523 (1989)]; ii) az IL-4 alacsony affinitású Fce receptorok (CD23) indukcióját váltja ki szövettenyészetben, normális emberi B-limfociták esetében [T. DeFrance és munkatársai, J. Exp. Med.

165, 1459-1467 (1987); iii) az IL-4 rendkívül precízen meghatározható módon kölcsönhatásba lép egyéb limfokinekkel, nevezetesen az interferon-a-val [R.L. Coffman és munkatársai, Immunoi. Rés.

102, 5-27 (1988) és S. Romagnani és munkatársai, 1. fent] és a

T-sejtekkel [R.L. Coffman és munkatársai, 1. fent: S. Romagnani és munkatársai, 1 fent; és M.D. Widmer és munkatársai, Natúré 326, 795-798 (1987), és ily módon B-sejt proliierációt és alterációt idéz elő.

Továbbra is szükség van azonban annak kimutatására, hogy a humán IL-4 említett in vitro jellegű aktivitási jellemzői fokozott és megnövekedett immunválasz formájában nyilvánulhatnak meg, azaz abban, hogy endémiás krónikus fertőzést okozó kórokozók hatásának kitett emlősöknél megemelkedett antitestszintek lennének megfigyelhetők.

Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy az endémiás, krónikus fertőzést kiváltó kórokozókra adott hatékony immunválasz oly módon váltható ki az ilyen szerek hatásának kitett — illetve ismételten kitett — emlősök esetében, ha az említett szerek hatásának kitett emlősnek — például embernek — az IL-4 hatékony menynyiségét adagoljuk.

A fentiek értelmében a találmány egy olyan gyógyszerkészítményt bocsát rendelkezésünkre, amelynek segítségével hatékony immunválasz indukálható endémiás krónikus fertőzést kiváltó kórokozók hatásának kitett emlősök esetében, és amely gyógyszerkészítmény hatóanyagként IL-4-et tartalmaz.

A találmány tárgyát képezi továbbá az IL-4 felhasználása olyan gyógyszerkészítmények előállítása során, melyek segítsé gével hatékony immunválasz indukálható endémiás, krónikus fertőzést kiváltó kórokozók hatásának kitett emlősök esetében.

A találmány a fentieken kívül eljárást ismertet hatékony immunválasz kiváltására (indukálására) endémiás, krónikus fertőzést okozó kórokozók hatásának kitett emlősök esetében, amely eljárás során az adott emlősnek az IL-4 olyan mennyiségét adagolják, mely hatékonyan képes kiváltani a fent említett indukciós hatást.

A találmány továbbá eljárást biztosít az antitestek hatékony szintjének indukálására olyan emlősök esetében, melyek először, illetve ismételten vannak kitéve endémiás, krónikus fertőzést kiváltó kórokozó szerek hatásának, és amely eljárás során az IL-4 olyan mennyiségét adagolják az emlősnek, mely alkalmas az említett indukció kiváltására.

A találmány eljárást biztosít továbbá az immunválasz fokozására olyan emlősök esetében is, melyek ismételten ki vannak téve endémiás, krónikus fertőzést okozó kórokozók hatásának, ezen emlősök immunreakciója — IL-4 hiányában — nem eléggé erős és nem eléggé gyors ahhoz, hogy megakadályozza a betegség ismételt fellépését. A találmány szerinti eljárás során az adott emlősnek az IL-4-nek az említett cél elérése szempontjából hatékony menynyiségét adagoljuk.

A találmány eljárást biztosít továbbá az immunválasz fokozására olyan emlősök esetében is, melyek első ízben vannak kitéve az endémiás, krónikus fertőzést kiváltó kórokozók hatásának, és amely emlősök immunreakciója — IL-4 hiányában — nem eléggé erős és nem eléggé gyors ahhoz, hogy megakadályozza a betegség kifejlődését. A találmány szerinti eljárás során az illető emlősnek az IL-4-nek az említett cél elérése szempontjából hatékony mennyiségét adagoljuk.

A találmányt a továbbiakban ábráink segítségével ismertetjük részletesebben, amelyek közül:

az 1. ábra az immunválasz fokozódását szemlélteti — a találmány értelmében — egy emberi vírusbetegség (majom varicella-vírus által okozott betegség) májommodelljében (afrikai zöldmajom), humán IL-4 adagolásának hatására;

a 2. ábra az antitestek megjelenését szemlélteti az emberi vírusbetegség májommodelljében, azt követően, hogy a találmánynak megfelelően rekombináns humán IL-4-et adtunk az állatoknak.

A találmány célja annak biztosítása volt, hogy a humán IL-4 szövettenyészetben megfigyelt és ismertetett számos aktivitási jellemzőjét egy in vivő jellegű emlős, azaz májommodellre alkalmazzuk. Az IL-4 in vivő aktivitásának vizsgálata céljából a humán varicella-zoster vírusfertőzés májommodelljét választottuk. E modell alkalmazásakor afrikai zöldmajmokat (Cercopithecus aerthiops) majom varicella vírus (SVV - simian vericella vírus) közel halálos mennyiségével fertőztünk meg. A fertőzést túlélő állatokban határozott, erős immunitás fejlődött ki a betegséggel szemben egy esetleges ismételt SVV fertőzés esetére. Ezt az immunitást ismertetik E.D.Roberts és munkatársai [Am.J.Vet.Rés.

45, 523-530 (1984)] megállapítva, hogy ezen immunitás az állandó helyzetű és/vagy keringő B-limfocitákból származó keringő anti-SW antitestek jelenlétének a következménye. Ezen in vivő emlős modellt a szakterületen jártas egyének már régóta használ ják a potenciális humán anti-varicella-zoster vírusellenes szerek vizsgálatára, és számos szerző közölt részleteket ezen emlős modellel kapcsolatban, valamint példákat annak felhasználhatóságára [lásd K.F. Sóiké és munkatársai, Antimicrob.Ag.Chemother.

29, 20-25 (1986); Antivira Rés. 1, 325-337 (1981). D.W. Horohow és munkatársai [J. Immunoi. 141, 4217-4273 (1988)] arról számoltak be, hogy az immunsejtek IL-4 által kiváltott alterációja szövettenyészetben befolyásolja az influenza-vírus osztódását. Az

1-es típusú humán T-sejtes leukémia-vírus osztódásával kapcsolatos problémákat tárgyal S. Miyatake és munkatársainak közleménye [Nuc.Acids Rés. .16, 6541-6566 (1988)]. Ily módon tehát helyesnek tekinthető az IL-4 vizsgálata az SVV majommodellben, az IL-4-nek az antitest-termelésre és az immunsejtek proliierációjára kifejtett hatásainak vizsgálata céljából.

Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a hatékony mennyiségű rekombináns humán IL-4-gyel kezelt afrikai zöldmajmok statisztikailag igazolható módon erősebb és gyorsabb immunválaszt adtak az SVV-vel történt, ismétlődő fertőzésre, illetve az azzal való, ismételt találkozásra, azon majmokhoz viszonyítva, melyeket nem kezeltek rekombináns humán IL-4-gyel.

Az a kifejezés, mely szerint hatékony immunválaszt indukálunk endémiás, krónikus fertőzést okozó kórokozók hatásának kitett emlősökben, az alábbiakat jelenti: (1) antitestek hatékony szintjének kiváltása olyan emlősök esetében, melyek első ízben vannak kitéve ilyen, endémiás krónikus fertőzést kiváltó kórokozók hatásának; (2) antitestek hatékony szintjének kiváltása olyan emlősök esetében, melyek ismételten vannak kitéve ilyen, « * · · · · a · ·· ··· • · · · · · ··« ·· · · · · · endémiás krónikus fertőzést kiváltó kórokozók hatásának; (3) az immunválasz fokozása olyan emlősök esetében, melyek ismételten vannak kitéve ilyen, endémiás krónikus fertőzést kiváltó kórokozók hatásának, amely emlősök immunreakciója — IL-4 hiányában — nem eléggé erős és nem eléggé gyors ahhoz, hogy megakadályozhassa a betegség ismételt fellépését; és (4) az immunválasz fokozása olyan emlősök esetében, melyek első ízben vanak kitéve ilyen, endémiás krónikus fertőzést kiváltó kórokozók hatásának, amely emlősök immunreakciója — IL-4 hiányában — nem eléggé erős és nem eléggé gyors ahhoz, hogy megakadályozza a betegség fellépését. Bár az említett emlősök immunreakciója — IL-4 hiányában — nem eléggé erős és nem eléggé gyors ahhoz, hogy megakadályozza a betegség fellépését a fent említett emlősök esetében, sikerült olyan, hatékony módszereket találnunk, melyek során az IL-4 — előnyösen rekombináns humán IL-4 — olyan mennyiségét adjuk az emlősnek, amely az adott cél szempontjából hatékonynak tekinthető.

Az endémiás krónikus fertőzést okozó kórokozó kifejezés azt jelenti, hogy az ide tartozó kórokozók immunválaszt indukálnak emlősök esetében, és az alábbiak sorolhatók közéjük: vírusfertőzést okozó kórokozó [például a humán immunhiányos tünetegyüttest okozó vírus (HÍV), azaz az AIDS vírusa], bakteriális fertőzések kórokozói, (például a Staphylococcus nevű baktérium), gombás fertőzéseket okozó kórokozók (például a Candida-fajhoz tartozó gombák és a protozoon fertőzéseket kiváltó kórokozók (például a Trichomonas-fajhoz tartozó protozoonok).

A találmány értelmében bármilyen megfelelő IL-4 alkalmazható. Az IL-4 komplementer DNS-einek (cDNS-ek) klónozása és megfe• · ·

- 9 lelő bázisszekvenciájuk kialakítása számos laboratóriumban megtörtént [lásd például Yokota és munkatársai, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, .83., 5894-5898 (1986); Lee és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83., 2061-2065 (1986) (egér); Noma és munkatársai, Natúré 319, 640-646 (1986) (egér); és Genzyme Corporaton, Boston, Massachusetts (ember és egér)]. Nem-rekombináns IL-4 különböző tenyészetek felülúszóiból történő kinyerése és tisztítása is megemlítendő továbbá [például Grabstein és munkatársai, J.Exp. Med. 163, 1405-1413 (1985) (egér); Ohara és munkatársai, J. Immunoi. 135, 2518-2523 (1985) (egér BSF-1)]. Találmányi leírásunkhoz a fent említett közleményeket referenciaként csatoltuk a DNS-bázisszekvenciával, aminosavszekvenciákkal és azon módszerekkel kapcsolatos információik miatt, melyek — a találmány tárgyának megfelelően — előnyös IL-4 anyagok nyerésére vonatkoznak.

A találmány szerinti eljárás során felhasznált IL-4 előnyösen humán IL-4, még előnyösebben pedig az a humán IL-4, amelynek szekvenciáját Yokota és munkatársai ismertették az alábbi közleményeikben: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 5894-5898 (1986) és a 87/02990 számú, 1987. május 21-én közzétett PCT szabadalmi bejelentés; ezen IL-4 expresszióját E. coliban figyelték meg és abból is izolálták [lásd a 079,666 számú, 1987. július 29-i amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentést, valamint a 194,799 számú, 1988. július 12-i amerikai szabadalmi bejelentést.] Az IL-4 CHO-sejtekből történő előállítását az SN 386,937 számú,

1989. július 28-án benyújtott amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés ismerteti. Az IL-4 E.coliból történő előállí- • · · · • · · · · · • · · · • * · · ♦«

- 10 tását pedig az SN 429,588 számú, 1989. október 31-én benyújtott amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés tárgyalja.

A fenti közlemények, PCT és amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentések, referenciaként tekintendők.

A találmány értelmében az emlősöknek valamilyen IL-4 hatékony mennyiségét adagoljuk annak érdekében, hogy megakadályozzuk a betegség első ízben vagy ismételten történő fellépését, az endémiás, krónikus fertőzést kiváltó kórokozóknak kitett emlős szervezetben, továbbá azért, hogy növeljük az antitestszinteket és/vagy fokozzuk a hatékony immunválaszt az endémiás, krónikus fertőzést okozó ágensekkel való első és/vagy ismételt találkozás esetén. Az ilyen, hatékony mennyiség az IL-4 bármely olyan menynyisége lehet, amely szignifikánsan — tehát legalább 25 %-kal, de előnyösen 50 %-kal — fokozza/emeli az antitestszinteket. Az előnyösen humán, E. coliból vagy CHO sejtekből rekombináns eljárással előállított, IL-4-ből, a találmány szerint előnyösen körülbelül 0,25 és körülbelül 15 mikrogramm közötti mennyiség adagolandó naponta testtömeg-kilogrammonként. Még előnyösebben az emlősöknek körülbelül 5 és 15,0 mikrogramm hIL-4-et adagolunk naponta, testsúlykilogrammonként 5 és 10,0 mikrogramm közötti mennyiséget.

Az adagolási mennyiség, gyakoriság és tartam olyan tényezők függvényeként alakul, mint például a neutrofil és a monocita sejtek száma (tehát például a monocitopénia vagy a granulocitopénia súlyossága), a beteg kora, tápláltsági foka, stb. Általában az IL-4 adagolását kezdetben naponta végezzük, majd a beteg egész élete folyamán, periodikusan folytathatjuk. Az alkalmazott « · · · · ··· · · · ··· • · * · · · ··· ·· ·« ··· dózis nagyságát és az adagolás gyakoriságát a neutrofil sejtszám kezdeti szintje, valamint az IL-4-nek az antitestszinteket növelő hatásának nagyságrendje alapján határozhatjuk meg.

Az adagolás történhet intravénás, nazális (orron keresztül), parenterális, perorális, szubkután, intramuszkuláris, helyi, transzdermális (bőrön keresztüli) vagy bármilyen más, elfogadható módon. Az IL-4 adagolása bármely számú hagyományos adagolási formában történhet. A parenterális készítmények közé tartoznak a steril oldatok, illetve szuszpenziók. Az inhalációs adagolás történhet nazális vagy orális permet formájában vagy pedig befúvás útján. A helyi adaglási formák közé sorolhatók a krémek, kenőcsök, oldatok, transzdermális eszközök (például a hagyományos rezervoár vagy mátrix típusú tapasz) és hasonlók.

A fentiekben ismertetett gyógyszerkészítmény adagolási formák előállítása során bármilyen hagyományos, gyógyszerészetileg elfogadható kötőanyag és adalékanyag felhasználható a hagyományos eljárások alkalmazása folyamán.

Jelenleg az IL-4-et előnyösen intravénásán adagolják. A beadásra kerülő oldatok lehetnek rekonstruált liofilizált porok, amelyek a hatóanyagon kívül még tartósító szereket, puffereket, diszpergáló szert, stb. is tartalmazhatnak.

Előnyösen az IL-4-et 10 millimólos citrátpufferrel és tartósítószertől mentes, steril vízzel rekonstruáljuk oly módon, hogy a maximális koncentráció ne lépje túl a milliliterenkénti 100 mikrogrammot, az adagolás pedig folyamatos intravénás infúzió vagy intravénás injekció formájában történik. Folyamatos infúzió esetében a napi dózist 5 ml normál sóoldathoz adhatjuk hoz•·· · ·· ··· • · · · · · ··· ·· · · ··«

- 12 zá, az oldatot pedig infundálhatjuk mechanikus pumpa segítségével vagy a szokásosan alkalmazott, sírna lefolyatással (gravitációs módszer).

Az IL-4-nek valamely vírusfertőzést kiváltó ágens (vírus kórokozó) jelenlétére adott immunválaszt fokozó hatása — például az emlős antitestszintjének növelése — az alábbi kísérleti terv szerint végezhető el.

Anyagok és módszerek:

Az alábbi két kísérlet során felhasznált humán rekombináns IL-4 CHO-sejt-eredetű volt, és előállításának módszerét az 1989. július 29-én benyújtott amerikai egyesült államokbeli SN 386,937 számú szabadalmi bejelentés ismerteti.

Két kísérletet végeztünk annak érdekében, hogy megállapítsuk a CHO-sejtekben termelt humán rekombináns IL-4 (rHuIL-4) hatását az SVV-vel történő ismételt találkozásra adott humorális antitest-válaszreakciókra és a vérsejt-paraméterekre.

Kísérleti terv:

Azon afrikai zöldmajmokat, melyek túlélték az SVV-vel végzett kísérleti fertőzés okozta kezdeti, súlyos megbetegedést, ismételt kísérletekben használtuk fel az IL-4 hatásának mérése céljából. Az állatoknak 15 napon keresztül adagoltuk az IL-4-et, és meghatároztuk a szérum SVV-neutralizáló antitesteket és a vérsejtek koncentrációit, először az 0. napon, majd bizonyos időközönként az adagolás folyamán és azt követően. Az alábbiakban ismertetendő 1. kísérletben 1, 30 és 5,0 μg/kg/nap B.I.D.

(napi két alkalomra elosztva adott) által termelt IL-4 hatását tanulmányoztuk intravénás adagolás esetében; a szintén alább • · · · · · • · * ·· · · ··« ismertetendő 2. kísérletben 2, 5,0 és 1,0 valamint 0,25 gg/kg/nap — CHO-sejtek által termelt — IL-4 hatását vizsgáltuk, melyet ugyanolyan módon adagoltunk, mint az 1. kísérlet esetében. Minden vizsgálatban 4-4 állatból álló csoporttal dolgoztunk, ily módon arányosan elosztottuk az egyes csoportok között a 0. napon látott változatokat a neutralizáló SVV antitest-értékek tekintetében.

Majmok:

Afrikai zöldmajmokat (Arcopithecus aethiops) szereztünk be Szomáliából (kereskedelemben kapható, vadon élő állatokat). A felhasználás előtt valamennyi állat legalább 90 napig karanténban volt. Ezek a majmok különböző nemű és korú állatok, amelyek fogságba ejtésük előtt vadon éltek; testsúlyuk 2 és 6 kg között volt. Erőfeszítéseket tettünk arra, hogy az állatok kezelési csoportba sorolása úgy történjék, hogy minden csoportba hasonló nemek szerinti megoszlású és átlagosan azonos testsúlyú majmok kerüljenek.

A vírus és az állatok beoltása/fertőzése a vírussal:

Vírus: — Ezen vizsgálatokban a majom varicella vírust (SW-simian varicella vírus) használtuk, melyet egy természetes úton fertőzött majomfajtából izoláltunk (Erythocebus patas). Az izolált vírust ezután átoltottuk afrikai zöldmajmokba, majd előállítottuk a vírustörzset. Az SVV izolálása fertőzött majomból származó perifériás vérből nyert limfocitákat tartalmazó Verő sejttenyészetből történt. A fertőzött tenyészetek tovább tenyésztő se oly módon történt, hogy a lekapart fertőzött sejteket frissen leoltott Verő tenyészetekre oltottuk át 1:3 ♦ · « *··· · · · ··· • · · · · · ··· ·« ·· ««· arányban. Az ötödik átoltáskor a fertőzött Verő sejteket lekapartuk a felületről, szövettenyésztő lombikokba oltottuk át, majd Eagle-féle minimál esszenciális táptalajban szuszpendáltuk, amely 5 tömeg%-nyi fötális szarvasmarha-szérumot és 35 tömeg%-nyi szorbitot tartalmazott. Az SVV törzset ampullákba töltöttük, és -70°C hőmérsékleten tároltuk.

Az állatok beoltása/fertőzése a vírussal: — A majmokat az SVV törzs egy előre meghatározott hígításával fertőztük oly módon, hogy 1,5 ml-t a légcsövön keresztül (transztracheálisan), a gyuruporcon át, 1,5 ml-t pedig a hasi területre vittünk be szubkután módon. A bevitelre kerülő fertőző anyagot Verő sejtekben titráltuk minden egyes kísérlet alkalmával, a vírus plakk-képző egységei szempontjából.

Antitest-analízis:

Az SW neutralizáló antitestek szintjét minden egyes vizsgálat 0. napján, valamint a feltüntetett időpontokban határoztuk meg. A titereket oly módon fejeztük ki, mint a vírus 80 %-ának neutralizálásához szükséges legnagyobb higítás reciprok értékét, Verő sejteken végzett SVV-plakk-képző vizsgálat segítségével. Röviden vázolva, a majomszérum-mintákat 60 percig inkubáltuk 37°C hőmérsékleten, 100-200 plakkot létrehozó vírus (SVV) egység jelenlétében. Az inkubációt követően a keveréket ráhelyeztük a sejtekre, 60 percen keresztül, 37°C hőmérsékleten végzett inkubációt követően megfestettük a sejteket, és meghatároztuk a megmaradó SW plakkok számát.

A vér paramétereinek meghatározása:

Minden egyes szérumminta esetében meghatároztuk a millili•

- 15 terenként! vörösvérsejtszámot, teljes fehérvérsejtszámot és az egyes fehérvérsejt-típusok megoszlását, valamint a (szintén milliliterenként!) vérlemezkeszámot a korábban ismertetett eljárások segítségével [E.D. Roberts és munkatársai, Am.J.Vet.Rés.

45, 523-530 (1984) és K.F. Solvie és munkatársai, Antimicro.Ag. Chemother. 29, 20-25 (1986) és Antiviral Rés. 1, 325-337 (1981)]. A fentiek mellett — a szakterületen használt módszerek segítségével — meghatároztuk a hemoglobin és a hematokrit értékét is.

Eredmények:

Az alábbi két kísérletet annak érdekében végeztük, hogy meghatározzuk a CHO-sejtekben termelt IL-4 hatását az immunválaszra ismételt SVV-fertőzés esetén afrikai zöldmajmoknál.

1. kísérlet:

Olyan afrikai zöldmajmokat használtunk, melyek túlélték a kezdeti, súlyos SW-fertőzést. Az SVV-vel történő ismételt találkozáskor gyorsan emelkedett az antitestek szintje. Az ismételt fertőzést két dózisban [5,0 és 30,0 ^g/kg/nap B.I.D. (=napi két alkalomra elosztva)] intravénásán adott rHuIL-4 jelenlétében, illetve hiányában, valamint placebo jelenlétében vizsgáltuk. Valamennyi csoport 4 állatból állt, és a humán IL-4 adagolását a 0. napon kezdtük és 15 napon keresztül folytattuk. Az állatok az rHuIL-4, illetve a placebo adagolásának 8. napján találkoztak ismét az SVV-vel. Különböző időközönként vérmintákat vettünk annak ellenőrzésére, mikor jelennek meg az SW-neutralizáló antitestek, továbbá a fehérvérsejtszám és egyéb vérparaméterek meghatározására. Az 1. ábra az SW neutralizáló antitestek megjelenésének meghatározásával kapcsolatos eredményeket mutatja be.

···«*· ·· · · * · ·· • « · · · · λ «·*«······

- 16 Mind az 5,0, mind pedig a 30,0 ^g/kg/nap dózisú rJrHuIL-4 statisztikailag magasabb antitestszint-válaszreakciót hozott létre az SW-vel való ismételt találkozáskor. 5,0 ^g/kg/nap dózis esetében szignifikánsan magasabb volt a válaszreakció, mint a 30-asnál. A dózis-válaszreakció összefüggés hiánya talán annak tudható be, hogy a szövettenyészetben élesen, határozottan megfigyelhető az IL-4 optimális dózisa.

Emellett, az antitestszintek fellépésének számított meredeksége különböző volt az rHuIL-4-gyel kezelt állatok esetében, ami azt mutatja, hogy az antitestek gyorsabban jöttek létre ezen csoportokban, mint a placeboval kezelt csoportban.

2. kísérlet:

Az 1. kísérlethez hasonló kísérletet végeztünk. A CHO-sejtekből származó rHuIL-4-et három dózisszinten alkalmaztuk. 5,0, 1,0 és 0,25 )ng/kg/nap B.I.D. (=napi két alkalomra elosztva) intravénás adagolása történt egy 15 napos periódus folyamán, az 1. kísérletben leírtakhoz hasonló módon. Csoportonként 4 állatot alkalmaztunk.

A 2. ábra az SVV-antitestek megjelenésével kapcsolatos eredményeket szemlélteti. Bár az alacsonyabb dózisszinteken (1,0 és 0,25 μg/kg/nap) nem voltak statisztikailag szignifikáns különbségek, 5,0 μς esetében a 22. napon az a tendencia mutatkozozott, hogy magasabbak voltak az antitestszintek. Az alacsonyabb dózisszintek nem voltak hatékonyak az antitest-válaszreakció fokozása tekintetében. Mind az 1., mind pedig a 2. kísérlet során fokozott antitesttermelés volt megfigyelhető az 5,0 μg/kg/nap és annál magasabb dózisok esetében olyan majmoknál, melyek ismétel• «« ten találkoztak egy endémiás krónikus fertőzés kórokozójával, például az SVV-vel.

A fenti kísérletek eredményeinek tükrében várható, hogy az IL-4 — és előnyösen az rHuIL-4 — fokozza az immunválaszt az emlősben az endémiás krónikus fertőzéssel való első vagy primer találkozást követően, amikor az adott emlős immunreakciója még nem eléggé erős és nem eléggé gyors ahhoz, hogy megakadályozza a betegség fellépését.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Az IL-4 felhasználása olyan gyógyszerkészítmény előállítására, amely alkalmas hatékony immunválasz indukálására endémiás krónikus fertőzést kiváltó kórokozók hatásának kitett emlősökben .
2. Az igénypont szerinti felhasználás, azzal jellemezve, hogy indukálás alatt az alábbiakat értjük: (1) hatékony antitestszint indukálása olyan emlősökben, melyek első ízben vagy ismételten vannak kitéve endémiás krónikus fertőzést kiváltó ágensek hatásának, illetve (b) az immunválasz fokozása olyan emlősökben, melyek ismételten ki vannak téve endémiás krónikus fertőzést kiváltó kórokozók hatásának, és az említett emlős válaszreakciója IL-4 hiányában nem eléggé erős és nem eléggé gyors ahhoz, hogy megakadályozhassa a betegség ismételt fellépését; illetve (c) az immunválasz fokozása olyan emlősöknél, melyek első ízben vannak kitéve az endémiás krónikus fertőzést kiváltó kórokozók hatásának, és az említett emlősök immunreakciója — IL-4 hiányában — nem eléggé erős és nem eléggé gyors ahhoz, hogy megakadályozhassa a betegség fellépését.
3. Az 1. illetve a 2. igénypont szerinti felhasználás, a zzal jellemezve, hogy az IL-4 adagolása intravénásán vagy szubkután módon történik.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az IL-4 humán IL-4, illetve E. coli eredetű rekombináns humán IL-4.

• ·· 9··* «· ♦ ··<

• » · · * ··· · ·· ··· • ♦ · · · * ··· ·· ·· ···
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, a zzal jellemezve, hogy az adagolt IL-4 mennyisége testtömeg-kilogrammonként és naponta a körülbelül 0,25 és 15 mikrogramm közötti tartományba esik.
6. Gyógyszerkészítmény hatékony immunválasz kiváltására endémiás krónikus infekciót okozó ágensek hatásának kitett emlősökben, azzal jellemezve, hogy a készítmény hatóanyagként az IL-4 hatékony mennyiségét tartalmazza.
7. A 8. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal j ellemezve, hogy a hatóanyag egy humán IL-4, előnyösen az E. coli eredetű rekombináns humán IL-4.
8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény azzal jellemezve, hogy az IL-4-et körülbelül 0,25 és 15 mikrogramm/testtömeg-kilogramm mennyiségben adagolják naponta .
9. Eljárás hatékony immunválasz kiváltására endémiás krónikus fertőzést kiváltó kórokozó hatásának kitett emlősökben, a zzal jellemezve, hogy az ilyen emlősöknek az IL-4-nek az indukció előidézése szempontjából hatékony mennyiségét adjuk be.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jelleme z ve, hogy indukálás alatt az alábbiakat értjük: (1) hatékony antitestszint indukálása olyan emlősökben, melyek első ízben vagy ismételten vannak kitéve endémiás krónikus fertőzést kiváltó ágensek hatásának, illetve (b) az immunválasz fokozása olyan emlősökben, melyek ismételten ki vannak téve endémiás krónikus fertőzést kiváltó kórokozók hatásának, és az említett emlős • t · · · · ··· ·· ·· ··· válaszreakciója IL-4 hiányában nem eléggé erős és nem eléggé gyors ahhoz, hogy megakadályozhassa a betegség ismételt fellépését; illetve (c) eljárás az immunválasz fokozására olyan emlősöknél, melyek első ízben vannak kitéve az endémiás krónikus fertőzést kiváltó kórokozók hatásának, és az említett emlősök immunreakciója — IL-4 hiányában — nem eléggé erős és nem eléggé gyors ahhoz, hogy megakadályozhassa a betegség fellépését.
11. A 9. vagy 10. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy az IL-4 humán IL-4, előnyösen E. coli eredetű rekombináns humán IL-4.
12. A 9. vagy 10. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy az IL-4 adagolása körülbelül 0,25 és 15 mikrogramm/testtömeg-kilogramm dózisban történik naponta.
13. Az előző igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény, illetve eljárás alkalmazására, azzal jellemezve, hogy az endémiás krónikus fertőzést kiváltó kórokozó valamely vírus, baktérium, gomba vagy protozoon.