HUT61620A - Method for quantitative detecting biological active form of human neuro-growth factor /ngf/ - Google Patents

Description

A hím egér szubmandibuláris nyálmirigyéből származó NGF szekvenciáját is meghatározták és klónozták /J.Scott és mtsai, Natúré, 302, 538 ( 1983) ; A. Ulrich és mtsai, Natúré, 303, 821 (1983)/. A humán ^NGF gént is sikerült izolálni és >klónozni /A. Ulrich és mtsai, Natúré, 303, 821 (1983) ; 0121388 számú európai szabadalom ; 48564A89 számú olaszországi szabadalmi bejelentés/.

Egér szubmandibuláris mirigyekbó'l előállított NGF típust használnak leggyakrabban az NGF aktivitásának in vitro és in vivő tanulmányozására. Az NGF in vitro biológiai aktivitásának á területét primer idegsejteken és klónozott sejtvonalakon határozták meg. Az NGF-re in vitro választ adó primer idegsejtek a következők: gerincvelői idegdúcokból eredő fetális (8-12 fetális nap) szenzoros neuronok, szimpatikus ganglion eredetű autonóm noradrenerg fetális neuronok, septum eredetű kolinerg fetális neuronok és a fejlődés folyamán a kromaffin mellékvese sejtek. Míg a szenzoros és szimpatikus neuronok élete és fejlődése NGF függő, úgy tűnik, hogy a kolinerg neuronoknak nincs szükségük NGF-re életben maradásukhoz, csak differenciálódásukhoz, azaz a neurotranszmitterrel (idegingerület átvivő anyag) kapcsolatos fenotipusos jellemzők kifejeződéséhez. Ha kromaffin szuprarenális (mellékvese) sejtekhez (idegrendszeri eredetűek) fejlődésük első fázisa folyamán NG F et adunk, úgy ez idegi fenotípusok kifejeződését vonja maga után. A szakirodalom szerint az NGF-re in vitro vála szoló sejtvonalak közé tartoznak az idegrendszeri tumorokból származó kromaffin mellékvese sejtek, amelyeket pheochromocyta ···· ·· »·♦· <· • · · · · ··· · * ·· • · · * ···» ···♦ « ··

- 4 (mellékvese velőállomány daganat) sejteknek neveztek (PC12) és a humán neuroblastoma sejtek. Ha ezeket a sejteket N G F fel kezeljük, megváltoztatják viselkedésüket és az erősen proliferativ fázisból posztmitotikus állapotba mennek át.

Számos in vitro és in vivő kísérletet végeztek állat modelleken és a kutatás mára annyira előrehaladt, hogy az eredmények az NGF potenciális felhasználásának a hipotézisét igazolják a Parkinson betegség kezelésében /Science, 243, 11 (1989)/. Legutóbb más rendkívül fontos hipotéziseket közöltek az NGF-fel kapcsolatban, ezek szerint az NGF közvetítő szerepet játszik a központi idegrendszer és az immunrendszer között /L. Aloe és mtsai, Proc. Natl. Acad.Sci., 6184, 1986 (1983) j M.G. Spillantini és mtsai,

Proc.Natl.Acad.Sci . , 8555, 1 989 ( 1986)/. A közleményekben leírtak alapján felmerül az igény a humán NGF meghatározására biológiai folyadékokban és táptalajokban, mennyiségi analitikai módszerekkel. Megfelelő analitikai módszerek és speciális reagensek nélkülözhetetlenek a molekulák analíziséhez.

A találmány szerinti eljárás felismeri a specifikus epitópokat és igy nem ad téves negatív eredményeket.

A találmány tárgya eljárás a humán NGF 2,5S forma mennyiségi meghatározására, amely a következő lépésekből áll:

/a/ a vizsgálandó biológiai folyadék egy mintáját összehozzuk az analizálandó anyaggal .szemben termelt antitestekkel, amelyek felismerik a humán MGF-et és amelyeket szilárd hordozóhoz kötöttünk vagy erre adszorbeáltünk, hogy megkapjuk a szilárd fázist;

* ···· 4·* *»«ο·* ··· · ·· 9 Λ • ··· 4 ··* ♦ · · 9 99 ··· ··· 9999 Λ99 /f az említett szilárd fázist elválasztjuk a szóbanforgó biológiai folyadék mintájától;

/c/ a fenti szilárd fázist egy detergens és a humán NGF 2,5S formáját felismerő és kötő monoklonális antitest jelenlétében,inkubáljuk; és /d/ meghatározzuk a humán NGF 2,55 forma mennyiségét a humán NGF 2,5S formához kötött monoklonális antitest mennyiségének a kvantitatív mérésével.

A találmány további tárgyát a humán HGF 2,5S formának a meghatározására szolgáló készlet (kit) képezi, amely a következőkből áll:

/a/ szilárd hordozóhoz kötött vizsgálandó anyaggal szembeni antitestek;és /b/ az említett NGF 2,5S formára specifikus monoklonális antitestek.

Az alábbiakban az ábrák rövid leírása következik:

Az 1. ábrán a humán vagy egér NGF-nek nyálban termelt poliklonális ellenanyagokkal való reakciója után végzett Western biot analízis látható.

A 2. ábrán a humán vagy egér NGF-nek egy 2,5S egér formával szembeni monoklonális antitesttel való reakciója után végzett Western biot analízist mutattunk be.

A 3 . ábrán eukarióta sejtekből (CHO) rekombináns DNS technológiával előállított hNGF 2,5S vagy p> NGF formának különböző koncentrációival készült ELISA válasz-görbét mutatunk be.

Az egér mirigyekből származó NGF úgy viselkedik, mint egy 7 S tipusu protein komplex (molekulatömege körülbelül 140.000 dal tón), amely három különböző alegységből ··· • ··* *444 áll (oQ|fi 2Γ ) j ^s ezek koordinációs kötésben tartanak egy 2 +

Zn atomot. A 7S molekula biológiai aktivitással kapcsolatos legfontosabb részét két polipeptid lánc alkotja, mindkettő molekulatömege 13.250 és 118 aminosavból állnak. Mindegyik lánc, azaz monomer, három diszulfid hidat tartalmaz, amelyek kovalens kötéseket képeznek két cisztein csoport között, kölcsönöznek a protein háromdimenziós szerkezetének. A két NGF monomer gyenge kötésekkel kapcsolódik egymáshoz, miáltal egy 26.500 molekulatömegü dimer képződik. Kimutatták, hogy a biológiai aktivitás a dimerhez kapcsolódik, amelyet 2,5S-nek vagy szokásosan p’NGF-nek nevezünk. A géntechnológiai eljárások lehetővé tették, hogy az NGF ^-alegység (fiNGF) molekulát kódoló gént azonosítsuk /J.

Scott és mtsai, Natúré, 302, 538 (1983);

A. Ulrich és mtsai,

Natúré, 303, 821 (1983)/.

A molekulát kódoló humán gén az

I-es kromoszóma rövid karján helyezkedik el és a 26.500 molekulatömegei biológiailag aktív molekulánál egy sokkal nagyobb molekulát kódol. Tehát a gén egy nagyobb méretű NGF vagy pre-NGF prekurzor szintézisét határozza meg. Kimutatták továbbá, hogy az NGF fi-alegységét kódoló gén nagymértékben állandó a különböző fajoknál, a madártól az emberig /R.

Me i e r és mtsai, EMBO J. , 5 , 1489 (1986)/.

Az egér, ember , marha és csirke eredetű ^>NGF nukleotid szekvenciájának a meghatározásával lehetővé vált a molekula állandó és nem állandó helyeinek, valamint e helyek aminosav rokonságának az összehasonlítása. Az analitikai módszerek közül kétségtelenül a szendvics rendszer a legjobb, ami • *♦♦· ·· *·** ·« • · · · · « ν • ··· · · »« • · · · « ··· *·· <««· 4» t« az érzékenységet'és a specifitást illeti.

Biológiai folyadékokban egy analizálandó anyag meghatározását szendvics-tipusu reakció rendszerrel úgy végezzük, hogy a vizsgálandó anyagot tartalmazó vagy a vizsgálandó anyagot nem tartalmazó mintát egy olyan hordozóval inkubáljuk, amelyhez az analizálandó anyaggal szembeni antitestek hozzá vannak kötve, s amelyet szilárd fázisnak nevezünk. A hordozóhoz kötött analizálandó anyaggal szembeni antitestekkel le nem reagált analizálandó anyag eltávolítása után a szilárd fázist megfelelő pufferekkel mossuk és a szóbanforgó analizálandó anyagra specifikus antitestekkel inkubáljuk. Ezek az antitestek közvetlenül jelezhetők látható reakciót előidéző szerekkel, de más szerekkel is azonosíthatók, például anti-species antitestekkel, ezek a második inkubáció analizálandó anyagával szemben termelt antitestek, melyeket megfelelő jelző anyaggal jelzünk. Számos azonosítási módszer áll már rendelkezésre, amelyek lehetővé teszik az analizálandó anyag és a szendvics rendszerben lévő antitest közötti kölcsönhatás láthatóvá tételét. Hasonlóképpen számos hordozóanyag áll rendelkezésre, amelyhez az antitestek köthetők. Eltekintve a hordozó anyagok és a jelző rendszerek tökéletesítésétől, melyek az általános technológiai fejlesztés részét képezik, egy szendvics rendszerrel végzett kvantitatív analitikai meghatározás alapvetően a rendszer spéciticitásán alapszik, s ez azt jelenti, hogy biztonságosan képes kimutatni az analizálandó anyagot egy folyadékban. Nyilvánvaló, hogy az analizálandó anyag ·· · • *·· • · ··· ··» <·<* ·* • ·t •·« • ·· •··

- 8 csak akkor észlelhető, ha szerkezeti formája jól meghatározott, vagyis ha kapcsolatban van biológiai aktivitásával, ugyanis ez megnöveli az analitikai mennyiségi meghatározás spécificitási jellemzőit és következésképpen a szóbanforgó analizálandó anyag mennyiségi meghatározásának a biológiai szignifikanciáját. Szendvics-tipusu analitikai mennyiségi meghatározás esetében a spécificitást az analizálandó anyaggal szembeni antitestek biztosítják.

A találmányban az analizálandó anyag az NGF és a találmány célja az érett, biológiailag aktív humán NGF amely általában mint 2,5S vagy pNGF forma ismeretes mennyiségi meghatározására szolgáló vizsgálati eljárás. A rövidített név, az NGF, egyben a molekula biológiailag aktív formáját is jelenti.

A szilárd hordozóhoz adszorbeált szilárd fázisban alkalmazott anti-NGF antitesteket úgy állítjuk elő, hogy nyulakat immunizálunk egér NGF-fel és szilárd hordozón immobilizált ugyanezen proteinen affinitás-kromatográfiával tisztítjuk /K. Stoeckel és mtsai, J. Neurochem., 26, 1207 (1976)/, de ez a protein az immunizálásra használt készítménytől különbözik. Megvizsgáltuk, hogy vajon ezen p ο 1i klónál is anti-egér NGF antitestek adnak-e kereszt reakciót a humán placentából kivont humán NGF-fel (333,574 számú nyi1vánosságrahοzott európai szabadalmi leírás) és a klónozott és prokarióta sejtekben, mint például E. coliban vagy eukarióta sejtekben kifejezett humán NGF biológiailag aktív 2,5S vagy P) NGF formával (48564A89 számú olaszországi • · · szabadalmi bejelentés; 0121388 számú nyilvánosságrahozott európai szabadalmi leírás), valamint ennek denaturált, lineáris polipeptid formájával.

Az anti-NGF poliklonális antitestek reá keié képességét a jól ismert

Western biot technikával vizsgáltuk.

Az eredmények az 1 .

ábrán láthatók.

ábrán a humán vagy az eger

NGF és a poliklonális antitestek reakciója után végzett

Western biot vizsgálat egy példája látható.

A szóbanforgó antitesteket nyulakban állítottuk egér NGF 2 , 5 S formával való immunizálással és amelyeket ezután szilárd hordozón immobilizált ugyanezen proteinen affinitás kromatográfiával tisztítottunk.

poliklonális antitestek jelenlétét kereskedelemben kapható amp1ifikációs rendszerrel mutattuk ki.

A különböző sávok a következők:

sáv:

mNGF dimer formában, 2,5S vagy ^NGF (m = mouse = egér) mNGF monomer formában, 1 mmól P-merkaptoetanollal percig 100 C°-on való inkubálás után.

sáv :

mNGF az A sávnál leírt formában.

sáv:

hNGF 2,5S formában, amelyet rekombináns DNS technikával állítottunk elő eukarióta sejtekben (CHO= chinese hamster ovary kínai hörcsög petefészek) sáv:

h N G F 2,5S formában, amelyet humán piacent a szövegből tisztítottunk.

sáv :

hNGF 2,5S formában, amelyet rekombináns DNS technisáv :

kával prokarióta mNGF az A sávnál és sejtekben

C sávnál (E.coli) állítottunk leírt formában.

A standard molekulatömeg indikátorok a következők:

foszforiláz B (molekulatömeg: 94.000), albumin (molekulatömeg: 67.000), ovalbumin (molekulatömeg: 43.000), szénsavanhidráz (molekulatömeg: 30.000), tripszin inhibitor (molekulatömeg: 20.000), a 1 fa-laktalbumin (molekulatömeg: 14.400).

Hasonló módon állíthatunk elő anti-egér NGF monoklonális antitesteket úgy, hogy speciális fajtájú patkányokat immunizálunk /A. Cattaneo és mtsai, J. Neurochem.,

- 10 50, 1003 (1988)/. Ha jól választunk, olyan monoklonális antitesteket azonosíthatunk, amelyek az NGF-nek csak a biológiailag formáját, a

2,5S vagy p’NGF formát ismerik fel .

jelen találmány szerinti szendvics vizsgálat kifejlesztésekor ilyen tulajdonságokkal rendelkező mο η oklonális antitestet alkalmaztunk, amely egyértelműen felismeri a plancentából tisztított (333,574 számú nyilvánosságrahozott európai szabadalmi leírás) vagy rekombináns

DNS technológiával előálli tott (lásd például

48564Λ89 számú olaszországi szabadalmi bejelentést és

01211388 számú európai nyilvánosságrahozott szabadalmi leírást)

2,5S forma humán NGF-et. A

2. ábra a monoklonális antitest

Western biot technikával kapott vizsgálati eredményeit mutatja be. Ezenkívül az a monoklonális anti-NGF antitest, amelynek a jellemző adatait a 2. ábra mutatja be, blokkolja az egér NGF biológiai aktivitását /A. Cattaneo és mtsai, J. Neurochem., 50, 1003 (1988)/. Az antitestek vizsgálata azt mutatja, hogy ezek felismerik a humán NGF biológiailag

1 aktív formáját és következésképpen rendelkeznek a szükséges spécificitással a humán NGF szendvics tipusu mennyiségi meghatározásához .

A 2. ábrán a humán vagy az egér NGF és a

2,5 forrnával szembeni specifikus monoklonális antitest reakciója után végzett Ví estem biot vizsgálat egy monoklonális antitest jelenléte példáját mutatjuk kereskedelemben be. A kapható reagensekkel kimutatható.

A.

m N G F dimer formában, 2,5S sáv:

sáv:

mNGF monomer formában, az . ábránál hNGF 2,5S formában, humán placenta hNGF humán placentából tisztítva és (B sáv ) leírtak szövetből tiszmonomer formává alakítva az 1. ábránál (B sáv) leírtak szerint.

A standard molekulatömeg indikátorokról ábránál tettünk említést.

A jelen találmány egy olyan kitre is vonatkozik, amely a találmány módszereiben alkalmazott komponenseket tartalmazza.

Ennek magába kell foglalnia legalább a hordozóhoz kötött anti-NGF antitesteket és azokat, a melyekét az NGF jelenlétének a ki mutatására alkalmazunk, az utóbbiak az esettől függően lehetnek jelzettek vagy nem jelzettek.

A használt hordozók például a következők lehetnek:

csövek, mikrotitráló lemezek, üvegből, műanyagból vagy más megfelelő anyagból készült szemcsék vagy korongok, amelyek a szakterületen jól ismertek.

* . . V «* ··«« ·♦ ··· ·· ··· ···· · * ·· • · · · · · ······ ···· · · ·

- 12 Az alkalmazható jelzőanyagok lehetnek a szakterületen jól ismert enzimek, fluoreszkáló vegyületek, festő vegyületek, fémek vagy ezek származékai vagy a fenti szerekkel jelzett anti-species antitestek.

A találmány szerinti kit tartalmazhat még szükség szerint egyéb szereket a jelző anyagok meghatározására, a' mint amilyenek az enzim szubsztrátumai, mosó és higitó pufferek detergenssel vagy detergens nélkül.

A találmányt az alábbiakban az 1. és 2. példa szemlélteti, ezek azonban nem korlátozzák a szabadalom oltalmi körét. A találmány a rekombináns DNS technológiával előállított humán NGF biológiailag aktív formájának a mennyiségi meghatározására vonatkozik (lásd például: 48564A89 számú olaszországi szabadalmi bejelentés ; 0121388 számú nyilvánosságrahozott európai szabadalmi leírás).

1. példa

HUMÁN NGF MEGHATÁROZÁSA TÁPTALAJBAN POLIKARBONÁT MIKROTITRÁLÓ LEMEZEKEN.

A. Módszerek.

A.1. A mikrotitráló lemezek fedése.

Az anti-NGF poliklonális antitesteket bikarbónát pufferben (ρH = 9,0) hígítjuk, 24 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd a polikarbonát mikrotitráló lemez tartályainak a belső felületére abszorbeáljuk. A tartályokat ezután 0,15 M foszfát pufferrel (pH = 7,2) mossuk.

A.2. A mikrotitráló lemezek inkubálása az analizálandó mintával.

• · ·

- 13 Az analizálandó mintából különböző koncentrációkban

Λΐΐ-es mennyiségeket mérünk a mikrotitráló lemez tartályaiba és 24 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. A le nem reagált, feleslegben lévő mintát ezután leöntjük és a tartályokat 2% marha albumint és egy nem ionos detergenst - például 0,05% Tween 20-at -^'tartalmazó 0,15 foszfát pufferrel (pH = 7,2) mossuk.

A.3. Inkubálás anti-NGF monoklonális antitestekkel.

Az A.2. pontban leirt módon előkészített mikrotitráló lemez tartályaiba 2% marha albumint tartalmazó 0,15 M foszfát pufferrel (pH - 7,2) hígított anti-NGF monoklonális antitest oldatból 50 /ul-eket mérünk be és 24 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. A le nem reagált reagens felesleget leöntjük, a tartályokat 0,05% Tween 20-at és 2% marha albumint tartalmazó 0,15 M foszfát pufferrel (pH = 7,2) mossuk.

A . 4. Inkubálás jelzett, anti-species antitesttel.

Az A.3. pontban leirt módon kezelt tartályokba kereskedelemben kapható jelzőanyaggal - mely enzim, például torma peroxidáz lehet - jelzett anti-patkány IgG kecske IgG-ből 50 /ul-t mérünk be. A lemezeket 4-6 órán át szobahőmérsékleten vagy 37 C °-ο n inkubáljuk. A felesleges reagenst ezután 0,15 M foszfát pufferes (pH = 7,2) mosással távolitjuk el .

A.5. Inkubálás a szubsztrátummal.

Az A.4. pontban leírtak szerint kezelt tartályokba pH = 5,0-ös pufferrel készített 0,4 mg/ml orto-feni1én-diamin és 0,2 mg/ml hidrogén-peroxid tartalmú oldatból /il-eket mérünk be, majd 15 perces inkubálás után 2,5 M kénsavból 50 /ul-eket mérünk a mikrotitráló lemez tartályaiba .

A. 6. Abszorpció mérés.

A mikrotitráló lemez tartályaiban lévő oldatok abszorpcióját fotométerrel, 492 nm hullámhosszon (0D 492 nem) mérjük le.

B, EREDMÉNYEK

A tartályokban a humán NGF különböző koncentrációit tartalmazó táptalaj abszorpcióját a fent leírt módszerrel határoztuk meg és az eredményeket a 3. ábrában mutatjuk be.

2. példa

TESZT KIT.

A humán NGF 1. példa szerinti meghatározására egy többadagos kitet használunk, amely a következőket tartalmazza :

polikarbonát mikrotitráló lemezek, melynek tartályaira olyan poliklonális antitesteket adszorbeáltattunk, amelyek az NGF 2,5S vagy ^NGF formáit, valamint nem dimer formáit felismerik;

ampullák, ezek olyan monoklonális antitestet tartalmaznak, amely specifikusan felismeri a humán eredetű biológiailag aktiv 2,5S vagy ^NGF formát;

ampullák, amelyek arra a fajra specifikus enzimatikus jelzőket tartalmaznak, amelyben az anti-NGF mono klonális antitestet előállítottuk;

• · ·

- 15 marha albumint tartalmazó foszfát puffért (pH = 7,2) tartalmazó fiolák;

Tween 20 detergens oldatot tartalmazó fiolák·^ szubsztrátumos fiolák, amelyek pufferrel (pH = 5,0) készített orto-fenilén-diamint és hidrogén-peroxidot tartalmaznak ampullák, amelyek különböző koncentrációjú humán NGFet, valamint egy negatív kontrollt tartalmaznak: utasítások a teszt kit megfelelő használatához.

Claims (14)

1. Eljárás a humán NGF 2,55 formának mennyiségi meghatározására, azzal jellemezve, hogy a következő lépésekből áll:

/a/ a vizsgálandó biológiai folyadék mintáját összehozzuk a vizsgálandó anyaggal szemben terhelt antitestekkel, amelyek felismerik a humán NGF-et és amelyeket szilárd fázis képzése céljából szilárd hordozóhoz kötöttünk, vagy adszorbeáltunk ;

/b/ az említett szilárd fázist az említett biológiai folyadék mintától elválasztjuk^ /c/ a szilárd fázist olyan monoklonális antitestek jelenlétében inkubáljuk, amelyek felismerik és megkötik a humán NGF 2 , 5 S formátj és /d/ a humán NGF 2,5S forma mennyiségét úgy határozzuk meg, hogy meghatározzuk a humán NGF 2,55 formához kötött monoklonális antitest mennyiségét.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett vizsgálandó anyaggal szembeni antitestek olyan poliklonális antitestek, amelyek felismerik a humán NGF-et.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett monoklonális antitesteket enzimmel jelezzük.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett vizsgálandó anyaggal szembeni * *

- 17 antitesteket szilárd- hordozóhoz kötjük.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jelle- mezve, hogy a szilárd hordozó polikarbonát.

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jelle- mezve, hogy az említett monoklonális antitesteket az említett szilárd hordozóval inkubáljuk, nem-ionos detergens jelenlétében.

7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jelle-

R mezve, hogy az említett nem-ionos detergens a Tween 20 .

8. Kit előállítása a humán NGF 2,55 forma meghatározására, azzal jellemezve, hogy a következőket tartalmazza:

/a/ vizsgálandó anyaggal szembeni antitestek, szilárd hordozóhoz kötve; és /b/ az NGF 2,55 formára specifikus monoklonális antitestek.

9. A 8. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az NGF 2,5S formára specifikus jelzett monoklonális antitesteket is tartalmaz.

10. A 9. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett jelzőanyag egy enzim.

11. A 10. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az említett enzim egy szubsztrátumát is tartalmazza.

12. A 8. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy a szilárd hordozó egy polikarbonát mikrotitráló lemez.

13. A 8. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, a/ hogy a humán NGF standard görbéjét is tartalmazza.

14. A 8. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy egy detergens tartalmú protein oldatot is tartalmaz.