HUT59165A - Process for producing somatostatine analogues - Google Patents

Description

A találmány tárgyát olyan új peptidek képezik, amelyek befolyásolják a humán rosszindulatú daganatok növekedését. Pontosabban a jelen találmány a szomatosztatin rövid ciklikus analógjait és ezek sóit öleli fel, amelyekhez citotoxikus csoportok kapcsolódnak, gátolják a hipofízis növekedési hormon szekrécióját és tumorellenes hatásúak, továbbá vonatkozik ezen analógokat tartalmazó gyógyászati készítményekre és ezek felhasználási módjára.

Jelen találmány új ciklikus szomatosztatin analógokra vonatkozik, amelyek citotoxikus csoportokat tartalmaznak, befolyást gyakorolnak a hipofízis növekedési hormon felszabadulására emlősökben és tumoréilenes hatásúak.

Az

I-----------------------------------------------------—1

Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 szerkezetű tetradekapeptid-szomatosztatin a növekedési hormon felszabadulását gátolja, később széles körű gátló tulajdonságúnak bizonyult, nevezetesen a hasnyálmirigy inzulinjára és glukanonjára vonatkozóan. A szomatosztatin analógok konformáció és szerkezet-funkció analízis vizsgálata azt mutatta, hogy a biológiai aktivitásért felelős szekvencia tartalmazza a B-turn fragment fenilalanin-tripszin-lizintreonin részét, ami a szomatosztatin 7-10 részének felel meg [D. Veber és mtsai, Natúré (London) 280, 512 (1979) és D. Veber és mtsai, Natúré (London) 292 55 (1981)] A szelektív, fokozott és elhúzódó hatású vegyületek keresése során a szomatosztatinnak sok rövid ciklikus analógját fejlesztették ·· ···· ·« »··· ···· • · · · · · · • ······· * .:.. ·..·.:.....·«...

, » - 3 y r .

Á ki.

Veber és mtsai ciklikus hexapeptid-analógok szintézisét és jelentős gátló aktivitását ismertették, amit a szomatosztatin 14 aminosavából 9-nek prolinnal vagy N-metil-alaninnal helzettesitésével kaptak(ciklo[Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe] és ciklo[N-MeAla-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe])-val való helyettesítésével nyertek. Továbbá ugyanezen csoport előállított egy új hexapeptidet a ciklo(N-MeAla-Tyr-D-Phe-Lys-Val-Phe), ami magas aktivitású (D. Veber és mtsai Life Sci. 34, 1371 (1984)). Bauer és mtsai (Life Sci., 1, 1133 (1982) a szomatosztatin más nagy hatású oktapeptid sorozatát állították elő. Legaktívabb analógjuk a D-Phe-Cys-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OL volt. Mi közel 300 oktapeptid-amid analógját fejlesztetük ki fenti vegyületüknek (R.-Z. Cai és mtsai Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1896 (1986) és R.-Z. Cai és mtsai Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84., 2502 (1982)). Ezek közül kettő [D-Phe-Cys-Tyr-D-TrpLys-Val-Cys-Thr-NH2 és D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2 több mint százszor hatékonyabbnak bizonyult a szomatosztatinnál a növekedési hormon felszabadulás gátlása terén és elhúzódó aktivitást fejtett ki.

Különféle vizsgálatok igazolták a szomatosztatin gátló hatását agromegáliában, endokrin pankreász tumorban, mint például inzulinomában, glukagonomában, továbbá ektopiás tumorokban, mint például gasztrinomában és VIP termelő tumorban szenvedő betegeknél. Mindamellett a szomatosztatinnak csekély szerepe van a daganatterápiában, többirányú hatása és antiszekretoros hatásának rövid időtartama miatt; a keringésben a felezési ideje kb. 3 perc (A.V. Schally és mtsai, Annu. Rév.

Biochem. 47, 89 (1978). Veber és mtársainak munkája (1979-1984) nyilvánvalóan az I. típusú diabétesz terápiában alkalmazott analógok előállítását célozta és analógjaik nem eredményeztek tumorellenes hatást különböző állati tumormodelleken 984) (A.V.

Schally és mtrsai, Proc.Soc. Exp, Bioi. Med. 175 259 (1984)). Bauer analógját (szandosztatin) óvatos klinikai vizsgálatoknak vetették alá (P. Marbach és mtsai, (1985) Proc. Symp. Somatostatin, Montreal, Canada, 1984, kiadó: Y.C. Patel & g.s. Tannenbaum, Elsevier, Amsterdam, 339. oldal). Bíztatónak tűnik terápiás szerként való alkalmazása akromegália, metasztatikus endokrin pankreász és gasztrointesztinális tumor, úgy mint inzolinoma, glukagonoma, gasztrinoma, VIPoma és karcionid tumorok esetében (A. V. Schally és mtsai, Neutral and Endocrine Peptides and Receptors, kiadó: T.W. Moody, Plenum Publishing Corp., New York, 1986, 73. oldal).

A modern szomatosztatin analógok javaltak bizonyos tumorok kezelésében, illetve kiegészítő terápiaként LH-RH analógokkal emlőrák esetén (A. V. Schally, Cancer Rés., 48. 6977 (1988)).

Az ideális rákellenes szerek elvileg azok lennének, amelyek a ráksejteket a normális sejtek károsítása nélkül pusztítják el. A tumorellenes szert hordozó hormonok a receptort tartalmazó tumorok hatékonyabb célzott kemoterápiájának megvalósítása révén szolgálnák ezt a kérdést. Hormon analógok, amelyekben a hormon szekvenciában foglaltatik, vagy ahhoz kapcsolódik citotoxikus csoport, célzottak lehetnek, ezáltal szelektívebbek a hormonreceptort hordozó tumoros szövet elpusztításában.

A hormon-gyógyszer konjugátum ideális hatásmechanizmusa az • ·

- 5 lenne, ha a hibrid molekula a sejtmembrán receptorhoz kötődne, majd a sejtbe bekerülne a gyógyszer vagy biológiailag aktív származéka a vivő hormonról endoszómákban vagy szekunder izoszómákban szabadulna fel. Azután a felszabadult hatóanyag a vezikumulok membránján át jutna a sejtplazmába és elérné a végső célpontját. Az igy ható konjugátumok esetén a szer és a hormon közötti kapcsolódás stabil kell legyen a konjugátumnak a céltumor sejtbe való bejutása előtt, de sejtbejutás után hatrozottan szét kell váljanak.

Nagy és kis affinitású szomatosztatin receptorokat találtak különböző normál, humán szövetekben, humán, agy és hipofízis tumorokban, hormontermelő gasztrointesztinális tumorokban, emlő-, hasnyálmirigy-, prosztata- és petefészekdaganatokban (D. Reichlin, N. Engl. J. Mec. , 309. 1495 (1983), A. V. Schally, CancerRes., 48, 6977 (1988)). Kimutatták, hogy a receptorhoz kötődő szomatosztatin a pankreász acinusok révén jut a sejtbe és kerül lebontásra Viguerie, N. és mtsai, Am. J. Physiol. 252; G 535-542, 1987)).

E feltevésnek megfelelően a citotoxikus gyököt tartalmazó szomatosztatin analógok képesek kifejteni a szomatosztatin analógok direkt és indirekt tumorellenes hatásait és egyidejűleg a kemoterápiás szer vivőanyagául is szolgálnak. Mivel ilyen peptidek képesek kötődni a specifikus receptorokhoz, ez célszelektivitást biztosít a kemoterápiás vegyületnek, és így azt sejtspecifikussá teszi, ezzel csökkentve nemspecifikus toxicitását. A sejtbe való bejutás után ezek a hibrid vegyületek gátolják a sejtfolyamatokat és ezzel a sejt halálát okozzák.

• · · · • · ·· • · · · • · · · • · · · ··· ··

- 6 Van néhány a klinikai használatban lévő tumorellenes szerek között, amelyek képesek kapcsolódni egy hordozó peptidmolekulával. A kapcsolódás a citotoxikus csoport megfelelően alakított funkcionális csoportja és a peptid szabad amino- vagy karboxilcsoportja között jöhet létre.

A tumorok kezelésében használt alkiláló szerek alapvetően nem szelektív hatásmechanizmusúak. Fitotoxikus hatásuk kifejtése az alkilcsoportjuk különböző sejtalkotókba való bejuttatása révén valósul meg. A DNA alkilálása a sejtmagban feltehetően reprezentálja a fő interakciót, ami a sejt elpusztulásához vezet. Fiziológiás körülmények között alkilálhatunk minden sejtmaghoz kötődő anyagot, mint például ionizált karboxil- és foszforsav-csoportokat, hidroxilcsoportot, tiolokat és töltéssel nem rendelkező nitrogéncsoportokat. A mustár-nitrogének (klórambucil, ciklofoszfamid, melfalán és mustár-nitrogén) a legrégibb daganatellenes szerek a klinikai gyakorlatban. Ezek spontán képeznek ciklikus aziridinium (etilénimónium) kationszármazékokat intramolekuláris ciklizáció révén, amelyek direkt vagy karbóniumionon keresztül transzferálnak egy alkilcsoportot egy sejtmaghoz kötődő vegyületre. Az aziridincsoport tartalmú szerek, mint a tio-TEPA ezen mechanizmus alapján hatnak.

Az angiotenzin II-be épített alkiláló melfalan (4-[bisz {2-klór-etil}-amino]-fenilalanin) előállítása hatékony kompatitív antagonistához vezetett, ami világosan mutatja, hogy az analóg nem alkilálta a receptort. (K.-H. Hsieh és G. R. Marshall, J. Mec. Chem. 24 1304-1310, 1981).

A T-47D humán emlő karcinoma sejtvonal és az MT-4 és MT-5

patkány emlőtumor sejtvonal kultúrákon szignifikáns citotoxikus aktivitás ([³H]timidin beépítés gátlása) mutatkozott Dmelfalant tartalmazó LHRH analógok esetén.

Majdnem minden klinikailag alkalmazott alkiláló szer kétféleképpen működhet. Képes keresztkötést kialakítani két különálló molekula között, vagy egy molekulának két különböző nukleofil csoportját alkilálhatja. Keresztkötések a DNS-sel létre jöhetnek egyszálú formában, két komplementer szálú között, vagy DNS és más molekulák, úgy mint proteinek között. Feltételezett, hogy az alkiláló szerek citotoxicitása összefüggésben van a keresztkötéseket kialakító képességüekkel (J. J. Roberts és tsai, Adv. Radiat. Bioi. 7 211-435, 1978)

Ciszplatint (cisz-diamin-diklór-platinum) régóta alkalmazzák a daganat-terápiában. Ciszplatinhoz hasonló struktúrájú oldalláncot tartalmazó LHRH analógok nagy affinitást mutatnak a patkány hipofízis membrán receptoraihoz és humán emlőrák sejtjeihez. (S. Bajusz és tsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 63136317, 1989). Citotoxikus réz és nikkel komplexek beépítése megfelelően módosított LHRH analógokban a vegyületekben nagy hormonális aktivitást és affinitást eredményezett az LHRH receptorokhoz humán emlő karcinoma sejtmembránon. Néhány ezen metallopeptidek közül citotoxikus aktivitást fejtett ki humán emlő és prosztata sejtvonalakra in vitro. Például pGlu-His-TrpSer-Tyr-D-Lys[Ahx-A2bu(SAL)2(Cu)]-Leu-Arg-Pro-Gly-NH gátolja a [³H]-timidin beépülését az MDA-MB-231 humán emlő sejtvonal DNS-ébe 87 %-os koncentrációnál 10 /g koncentrációban.

Néhány antimetabolit kemoterápiás szerként számíthat érdeklődésre, minthogy fontosak a sejt folát metabolizmusában (I.

···· ·· ·♦·· ···· * · · · · · · · · ·· ·« · ···· ·· ·♦·· ··· ··

- 8 D. Goldman és tsai., Eds. Folyl and Antifolyl Polyglutamates, Plenum Kiadó, New York, 1983). A metotrexát /N-[p[[(2,4-diamino6-pteridinil)-metil]-metil-amino]-benzoil]-glutaminsav/ egy folsav antagonista, amelyik gátolja a dihidrofolát reduktáz funkcióját és ezáltal megakadályozza a timidilát és purin nukleotidok szintézisét, valamint a szerin és metionin aminosavakét, ezáltal gátolja a DNS, az RNS és a proteinek képződését.

A találmány tárgya tehát rövid ciklusos szomatosztatin analógok, melyek erős agonista aktivitással rendelkeznek és vagy a peptid szekvenciába beépített vagy a peptidlánchoz kapcsolt citotoxikus csoporttal rendelkeznek. Citotoxikus csoportokra példa a nitrogénmustár, antimetabolitok, háromtagú gyűrűs csoportok, kinonok, tumorellenes antibiotikumok, platinafém komplexek, vagy nem platina csoportbeli fémek komplexei, daganatellenes szerek, melyek lehetnek olyan szervetlen vagy fémorganikus vegyületek, amelyek átmeneti fémeket tartalmaznak, mint például titán, vanádium, vas, réz, kobalt és arany, illetve nikkel, kadmium és cink vagy egy citotoxikus vegyület, amely a fenti fémek komplexeként kerül beépítésre.

A találmány szerinti vegyületeknek egy részét azt alábbi (I) általános képlet öleli fel

I-------------------------------------------------------------------------------r

Q-R¹-R²-R³-D-Trp-Lys-R⁶-R⁷-R⁸-NH₂

- ahol

R¹ jelentése egy a Phe, Mel, Trp, Thr, Val, Gly, Alá, Ser aminosavak közül választott L-, D- vagy DL-aminosav,

R² és R⁷ jelentése L-, D- vagy DL-cisztein,

- 9 R³ jelentése a Tyr, Phe, Mel aminosavak közül választott

L-, D- vagy DL-aminosav,

R⁶ jelentése Thr vagy Val,

R⁸ jelentése egy a Thr, Trp, Mel, Val, Pro, Tyr, Alá, Gly, MeAla aminosavak közül választott L-, D- vagy DL-aminosav,

Q jelentése hidrogénatom, L- és D-Mel, Mel-Mel dipeptid, ciklopropán-alkanoil, aziridin-2-karbonil-, metotrexoil-, 1,4-naftokinon-5-oxi-karbonil-etil-, epoxi-alkil-csoport valamint ezeknek Ω-karbonil-alkil-amino-származékai, továbbá az Ω-karbonil-alkanoil-származékai a 2-hidroximetil-antrakinonnak, doxorubicinnek, eszperamicinnek vagy a mitomicin C-nek, ahol az Ω-karbonil-alkil-aminocsoport a -CO-(CH₂)n-NHképlettel jellemezhető, ahol n jelentése 2-6, és az Ω-karbonil-alkanoil-csoport a

-CO-(CH₂)_n-C0képlettel jellemezhető, ahol n jelentése 2-6 és gyógyászatilag elfogadható savakkal és bázisokkal képezett sóik.

A találmány további tárgyát képező vegyületeket az alábbi (II) általános képlettel jellemezhetjük

I--------------------------------------------------------_r

Q¹-A-R¹-R²-R³-D-Trp-Lys-R⁶-R⁷-R⁸-NH₂

- ahol

R¹ jelentése egy a Phe, Trp, Thr, Val, Gly, Alá, Ser aminosavak közül választott L-, D- vagy DL-aminosav,

R² és R⁷ jelentése L-, D- vagy DL-cisztein,

R³ jelentése a Tyr, Phe aminosavak közül választott ··«·

- 10 L-, D- vagy DL-aminosav,

R⁶ jelentése Thr vagy Val,

R⁸ jelentése egy a Thr, Trp, Val, Pro, Tyr, Alá, Gly,

MeAla aminosavak közül választott L-, D- vagy DL-aminosav, A jelentése egy alábbi (III) általános képletű diamino-acil-, előnyösen diamin-alkanoil-csoport

-HN-CH₂(CH₂)m(HN)CH-(CH₂)_n-COahol m jelentése 0 vagy 1 és n jelentése 0 vagy 1,

Q¹ jelentése Q² vagy (B2)Q³ vagy (Q⁴)2 csoportok - ahol

Q² jelentése Pt(Y)₂ ahol Y jelentése egy győgyászatilag elfogadható savból származó anion,

Q³ jelentése egy nem platinafém-csoportbeli fém, előnyösen titán, vanádium, vas, réz, kobalt, arany, nikkel, kadniium vagy cink,

Q⁴ jelentése L- vagy D-Mel, Mel-Mel dipeptid, ciklopropán-alkanoil-, aziridin-2-karbonil-, epoxi-alkil-, 1,4-naftokinon-5-oxi-karbonil-etil-csoport vagy azok Ω-karbonil-alkil-amino-származékai, vagy az Ωkarbonil-alkanoil-származékai a 2-hidroxil-metil-antrakinonnak, doxorubicinnek, eszperamicinnek és mitomicin C-nek, ahol az Ω-karbanoil-alkil-amino-csoport a

-CO-(CH₂)-NHáltalános képlettel jellemezhető, ahol n jelentése 2-6, és az Ω-karbonil-alkanoil-csoport a

-CO-(CH₂)-COáltalános képlettel jellemezhető, ahol n jelentése 2-6, • · · · · 4· • · 44··« • · · 4 · ·· ···· ·· «4«· ·····

- 11 B jelentése egy szubsztituált aralkilidén- vagy heteroaralkilidén-csoport, amely lehet halogénatommal vagy nitrofenil-csoporttal szubsztituált kis szénatomszámú alkilidén; kis szénatomszámú alkil-hidroxi-metil- vagy foszforoxi-metil-piridil-csoporttal szubsztituált kis szénatomszámú alkilidén, ahol a kis szénatomszámú alkil megnevezés 1-6-szénatomos részt jelöl és gyógyászatilag elfogadható savakkal és bázisokkal képzett sóik.

Különösen előnyösek azok a ciklusos vegyületek, amelyekben a beépített oxigéntartalmú funkciós csoport a 2-es pozícióban helyezkedik el, és amelyek egy 2-hidroxi-l-oxo-vegyületből származnak, mint például szubsztituált vagy nem szubsztituált szalicilaldehidből, piridoxálból, piridoxál-foszfátból, mely egy Schiff bázist alakít ki az A csoport aminocsoportjával, és kapcsolódhat egy fémionhoz a negatívan töltött oxigénatomon keresztül.

Az (I) általános képletű vegyületeket előállíthatjuk szilárd fázisú eljárással, vagy szilárd fázisú technikák és a klasszikus (oldószeres) szintézisek kombinálásával.

Az (I) általános képletű vegyületeket előnyösen az alábbi (Vlla) általános képletű intermedier peptidekből állíthatjuk elő:

XÍ-RÍ-R²(X²)-R³(X³)-D-Trp-Lys(X⁵)-R⁶-R⁷(X⁷)-R⁸(X⁸)-NH-X⁹ ahol

R³, R², R³, R⁶, R⁷ és R⁸ jelentése a fentiekben megadott

X¹ jelentése hidrogénatom vagy egy 2-5 szénatomos acilcsoport, feltételezve, hogy az (I) általános képletű • · · · ···· ·♦ ··«· ···· * · · 5 · • · · · · · • · · · · · • · ···· · · · ·«

- 12 vegyület egy oktapeptid, vagy Mel, Azy vagy Mel-Mel feltéve, hogy az (I) általános képletü vegyület nonapeptid, illetve dekapeptid,

X² és X⁷ jelentése hidrogénatom vagy egy Cys szulfhidril-csoport védőcsoportja,

X³ jelentése hidrogénatom vagy a Tyr fenolos hidroxilcsoportjának védőcsoportja,

X⁵ jelentése hidrogénatom vagy a Lys ε-aminocsoportjának védőcsoportja,

X⁸ jelentése hidrogénatom vagy a Tyr fenolos hidroxilcsoportjának védőcsoportja,

X⁹ jelentése hidrogénatom vagy egy gyantával beépített benzhidrilcsoport.

A (II) általános képletü peptideket szilárd fázisú eljárással ámíthatjuk elő. A vegyületeket előnyösen az alábbi (VIIIA) általános képletü intermedier peptidekből állítjuk elő, melyeket a (VIIA) általános képletü peptid-gyanta vegyületekből, (ahol X¹ jelentése hidrogénatom) állíthatjuk elő egy megfelelően védett A-val végzett acilálással:

X^-R^-R² (X²) -R³ (X³) -D-Trp-Lys (X⁵) -R⁶-R⁷ (X⁷) -R⁸ (X⁸) -NH-X⁹ ahol A, R¹, R², R³, R⁶, R⁷ és R⁸ a fentiekben megadott és X a diaminosavon elhelyezkedő védőcsoportokat jelöli.

A (VIIA) és (VIIIA) általános képletü vegyületek intermedierjei az (I) általános képletü ciklusos vegyületek előállítási eljárásának. Az R² és R⁷ csoportok közötti híd lehet egy diszulfid híd (-S-S-), egy szén/kén híd (-C-S) vagy egy

- 13 szén-szén híd (-C-C) a 2-es és 7-es pozícióban elhelyezkedő csoportok tulajdonságaitól függően. A védőcsoport eltávollítása után végrehajtott ciklizálási reakció az alábbi (VIIB) és (VIIIB) általános képletű vegyületeket eredményezi:

I I

Rl-R2__R3__D__Trp__Ly_S (X⁵) -R⁶-R⁷-R⁸-NH₂ and

I I

A-R^x-R²-R³-D-Trp-Lys(X⁵)-R⁶-R⁷-R⁸-NH₂ ahol A, R¹, R², R³, R⁶, R⁷ és R⁸ jelentése a fentiekben megadott

X⁵ jelentése hidrogénatom vagy a Lys oldallánc aminocsoportjának egy védőcsoportját jelöli.

A (II) általános képletű metallopeptidek előállítása esetén egy (VIIIB) általános képletű peptidet, (ahol X⁵ jelentése hidrogénatom) K2PtC14~dal reagáltatjuk és így citotoxikus csoportként Q¹ jelentésében Q² (azaz PtCl2) csoportot hordozó vegyületet kapunk, amelyet kívánt esetben ismert módon PtY₂ csoportot hordozó vegyületté alakíthatunk.

Olyan (II) általános képletű vegyület előállítása esetén, ahol Q² jelentése (B₂)Q³ csoport egy (VIIIB) általános képletű peptidet (ahol X⁵ jelentése hidrogénatom) in situ hidroxi-oxo Q³ vegyületből és egy nem fémcsoportbeli fémből előállított komplexszel reagáltatunk.

Olyan (I) általános képletű vegyületek előállítása esetén, ahol Q jelentése ciklopropán-alkanoil-, epoxi-alkil-, 1,4-naftokinon-5-oxi-karbonil-etil- vagy metotrexoil-csoport, ··. ··♦<

ν* <*·· ·«·· • · · « • ··· · • · · · • · · · · ·· ··

- 14 előállíthatjuk egy (VIIB) általános képletű vegyület (ahol X⁵ jelentése Boc vagy FMOC csoport) alkil- vagy alkanoilhalogeniddel, vagy metotrexáttal végzett acilezésével. Olyan (I) általános képletű peptidek előállítása során, melyeknél a citotoxikus csoport antrakinon, doxorubicin, eszperamicin vagy mitomicin C vegyületekből származó csoport, a megfelelő vegyületeket egy bifunkcionális áthidaló csoporton keresztül kapcsoljuk a (VIIB) általános képletű vegyülethez.

Gyógyászati készítményeket állíthatunk elő az (I) vagy (II) általános képletű vegyületeknek gyógyszerkészítményeknek előállítása során általánosan használt hordozókkal való összekeverésével, a hordozók közé értve a késleltetett kibocsátású mikrokapszulákat (mikrogömböcskéket is).

A találmány szerinti citotoxikus vegyületek gátolják a növekedési hormon felszabadulását és hasonlóan a kiindulási peptidekhez feltehetően gátolják az inzulin, glukagon, gasztrin, szekretin és kolecisztokinin felszabadulását. Olyan esetekben, ahol a tumoros szövet növekedését befolyásolja a kiindulási peptidek egyike által szabályozott hormon, a peptidekbe beépített citotoxikus csoport növelte a következő hormonérzékeny rákok kezelésének hatékonyságát: prosztata adenokarcinomák, emlőrákok, inzulinómák, gasztrinómák, kondroszarkómák, oszteoszarkómák, pankreászvezeték rákok, acinus tumorok, gyomorrákok, vastagbélrákok, bizonyos tüdőrákok és agydaganatok.

Két találmány szerinti vegyület, amely nem tartalmaz citotoxikus csoportot, jobban gátolja a növekedési hormon felszabadulást, mint a Bauer-féle analóg vegyület és inzulinra .·*. *·♦: ...........ι ♦ · · ♦·· « • · · · · a · ···· ·· ·«·· ·«· ·· és glukagonra nézve kisebb inhibiciós hatást fejt ki patkányokban. Egyik találmány szerinti vegyület a kísérleti Dunning R3327 prosztata rák növekedését gátolta patkányokban, gátolta továbbá hörcsögökben a pankreatisz rákot, egerekben az MXT mellrákot és potenciális terápiás alkalmazással bírt mellkasrák, oszteo- kondoszarkómák, pankreátisz és a gasztrointesztinális malignómák és GH-kiválasztó hipofízis tumorok és bizonyos adenomák kezelésében. A szomatosztatin analógok kutatása során nyert legújabb eredmények azt mutatják, hogy különbségek létezhetnek a szomatosztatin receptorok között nemcsak normális és rákszöveteket vizsgálva, hanem más különböző daganatok esetében is.

A találmány leírásának megkönnyítése végett az aminosavak, peptidek és származékaik szokásosan alkalmazott rövidítéseit alkalmazzuk, ahogy azok a peptid kémiában használatosak és az IUPAC-IUB biokémiai nomenklatúrával foglalkozó bizottság által meghatározott [European J. Biochem., 138, 9-37 (1984)].

Az egyes aminosavcsoportoknak a rövidítései a megfelelő aminosav triviális nevén alapszik, lásd pl. pGlu piroglutaminsavat, His hisztidint, Trp triptofánt, Ser szerint, Tyr tirozint, Lys lizint, Leu leucint, Arg arginint, Pro prolint, Gly glicint, Alá alanint és Phe fenil-alanint jelent. Ahol az aminosav-csoportok izomer formákkal rendelkeznek, az aminosav L-formájú, hacsak másképpen nincs jelölve.

A jelen találmányban alkalmazott nem szokásos aminosavaknak a rövidítése a következő:

Mel: 4-[bisz-(2-klór-etil)-amino]-D-fenilalanint, A₂pr: 2,3-diamino-propionsavat jelent.

··♦· *··: .··, χ......χ • · ··· « • · · · · · ·· ···· «·· ·«

A peptid szekvenciákat aszerint a megállapodás szerint jelöljük, hogy az N-terminális aminosav a bal oldalon, és a C-

terminális a	jobb oldalon helyezkedik el.
További	rövidítések:
AcOH	ecetsav
Ac2O	ecetsavanhidrid
Azy	aziridin-2-karbonil
Boc	terc-butoxi-karbonil
Bzl	benzil
CISAL	5-klór-2-0-1-benz i1idén
DCB	2,6-diklór-benzil
DCC	N,N'-diciklohexil-karbodiimid
DCM	diklór-metán
DIC	N,N’-diizopropil-karbodiimid
DMF	dimetil-formamid
DOX	doxorubicin (adriamicin)
ÉPP	epoxi-propil
FMOC	9-fluorenil-met i1-oxi-karbon i1
ESP	esperamicin
HMAQG	antrakinon-2-metil-hemiglutarát
HOBt	1-hidroxi-benzotriazol
HPLC	nagynyomású folyadékkromatográfia
MBzl	metil-benzil
MeCN	acetonitril
MeOH	metil-alkohol
MIT	mitomicin C
MTX	metotrexát (ametopterin)
NQCE	1,4-naftokinon-5-oxi-karbonil-etil

POL

POLP

2-metil-3-0-5-hidroxi-metil-4-pikolidén

2-met i 1-3-Ο-5-f ofsz foxi-inetil-4-pikol idén

SÁL

2-0-1-benzilidén

TEA trietil-amin

TFA trifluor-ecetsav

Trt tritil benziloxi-karbonil

Z(2-Br) 2-bróm-benziloxi-karbonil

Z(2-C1) 2-klór-benziloxi-karbonil.

Az (I) általános képletű szomatosztatin analógok közül különösen előnyösek az alábbiak:

Q-R¹Cys-R³-D-Trp-Lys-R⁶-Cys-R⁸-NH₂ hol R¹ jelentése L vagy D-Phe, D-Trp, L vagy D-Mel,

R³ jelentése Mel, Tyr vagy Phe,

R⁶ jelentése Thr vagy Val,

R⁸ jelentése Thr, Trp vagy Mel,

Q jelentése hidrogénatom, L- és D-Mel, Mel-Mel dipeptid, ciklopropán-karbonil-, aziridin-2-karbonil-, 1,4-naftokinon-5-oxi-karbonil-etil-, epoxi-alkil és Ω-karbonil-alkanoil-származékai a 2-hidroxi-metil-antrakinonnak, doxorubicinnek, eszperamicinnek és mitomicin C-nek.

Különösen előnyösek továbbá az alábbi (II) általános képletű vegyületek, amelyeknél egy citotoxikus gyök kapcsolódik a rövid ciklusos szomatosztatin analóg szekvenciához:

Q¹-A-R¹-Cys-R³-D-Trp-Lys-R⁶-Cys-R⁸-NH₂ • · • · · · • · ·

ahol
R1	jelentése	L vagy D-Phe, L vagy D-Trp,
R3	jelentése	Phe vagy Tyr,
R6	jelentése	Val vagy Thr,
R8	jelentése	Thr vagy Trp,
A	jelentése	Ai2pr.

A Q², (B2)Q³ vagy (Q⁴)2 citotoxikus csoportokra a következők az előnyös formák:

Q² jelentése PtCl₂,

Q³ jelentése Cu⁺⁺ vagy Ni⁺⁺,

B jelentése SÁL, CISAL, POL vagy POLP,

Q⁴ jelentése L- vagy D-Mel, 1,4-naftokinon-5-oxi-karbonil-etil-, epoxi-alkil-, antrakinon-alkoxi-, aziridin-2-karbonil- vagy ciklopropán-karbonil-csoport.

A legelőnyösebbek az alábbi vegyületek:

- 19 I“I

Mel-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂

I-1

D-Mel-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂ l~,

D-Phe-Cys-Mel-D-Trp-Lys~Val-Cys-Thr-NH₂

II

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Mel-NH₂

I“~l

Mel-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂ i--—1

Mel-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂

I1

Mel-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂ l1

Mel-D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂

I!

Mel-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH₂ lI [ A₂pr (Mel) ₂ ] -D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂

I1

Mel-Mel-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val--Cys-Thr-NH₂

I1 [A₂pr (PtCl₂) ] -D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂ l!

[A₂pr (PtCl₂) ] -D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH₂

l) [ A₂pr (SÁL) ₂Cu] -D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂

I1 [ A₂pr (C1SAL) ₂Cu] -D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂

I

MTX-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂

II

MTX-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂

I

MTX-D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂ • · · ·

- 20 Az összes fenti vegyület előállítható gyógyászatilag elfogadható szerves vagy szervetlen savak vagy bázisok addiciós sóiként is. A sókra nem korlátozó jelleggel a következőket említjük: hidrogén-klorid, hidrogén-bromid, szulfát, foszfát, fumarát, glukonát, tannát, maleát, acetát, citrát, benzoát, szukcinát, alginát, pamoát, maleát, aszkorbát, tartarát, és hasonlók, mint például alkáli- és alkáliföldfémsók.

A találmány szerinti vegyületek erősen befolyásolják a hipofízisnek növekedési hormon (angolul: growth hormoné, rövidítve: GH) kibocsátó képességét tumoros sejtmembránokhoz kötődnek, gátolják a [³H]timidinnek a DNS-be való beépülését sejtkultúrákban, és bizonyos tumoros sejtek növekedését is gátolják.

A vegyületeknek GH- és prolaktin kibocsátó képességét in vitro vizsgáltuk szuperfuzionált patkány hipofízis sejtrendszerekben (S. Vigh és A. V. Schally, Peptides, 5. Suppl. 1, 241-247 (1984)).

A hormonkibocsátó hatás gátlásának a meghatározására minden egyes peptidet 3 percen át 20-500 pM koncentrációban áramoltattuk át sejteken (1 ml átáramoltatott folyadék) 1 nM GHRH-val együtt. A patkány GH-t az átáramoltatott folyadék alikvotjaiban mértük rádióimmunovizsgálati módszerrel (NIAMDDKból vett RIA-készlettel) és így határoztuk meg vagy a minimális vagy a gátolt kiválasztást. A peptidek aktivitását hasonló módon átáramoltatott 25 pM szomatosztatin (1-14) oldatokhoz hasonlítottuk.

A vegyületeknek humán mellkasrák sejtmembránokhoz való • · • · · · • · · ·· • · · · • ···· ···

- 21 affinitását ¹²⁵l-címkézett (Tyr¹¹)-szomatosztatin felhasználással határoztuk meg. A kötődési vizsgálatot az alábbi műben leírtakhoz hasonlóan végeztük:

M. Fekete és tsai, J. Clin. Láb. Anal. 3, 137-141, 1989.

A találmány szerinti vegyületek citotoxikus aktivitását in vitro határoztuk meg a Finlay és mtsai által kidolgozott félautomatikus eljárás módosításával (Anal. Biochem., 139, 727 (1984) és Dawson és mtsai, J. Interferon Rés., 6, 137 (1986)). Különféle humán rákos sejtvonalakat tenyésztettünk RPMI-164 vagy Dulbecco-féle módosított Eagle közegben. A peptideket 1-10 000 ng/ml koncentrációban adagoltuk és a sejtek növekedésének gátló hatását (frakcionális százalékos túlélés) kvantitatív határoztuk meg a sejtek festésével, szolubilizálásával, majd az optikai sűrűség meghatározásával.

Az (I) általános képletű peptideknek a [³H]timidinnek a H—69 kisséjtű tüdőrák sejtvonal és MiaPaCa sejtvonal egyrétegű kultúrájának DNS-ébe való beépülését a Kern és tsai által leírt módszerrel vizsgáltuk (Cancer Rés., 45. 5436 (1985).

A találmány szerinti peptideket előállíthatjuk bármely, a peptid kémiában ismert módszer alkalmazásával. Ezen módszerek összefoglalása található a következő műben: M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Heidelberg, 1984. A klasszikus oldatos szintézist részletezi a következő mű: Methoden dér Organische Chemie (Houben-Weyl), 15. kötet, Synthese von Peptiden, I. és II. rész, Georg Thieme kiadó, Stuttgart, 1974. A kifejezetten szilárd fázisú szintézis módszereket a következő könyv ismerteti: J. M. Stewart és J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co.,

Rockford, IL, 1984 (2. kiadás) és G. Bárány és tsai, Int. J. Peptide Protein Rés. 30, 705-739, 1987.

A találmány szerinti intermedier peptideket és a melfalant tartalmazó peptideket szilárd fázisú eljárással állítjuk elő. A szilárd fázisú szintézis során megfelelően védett aminosavakat (néha védett peptideket) adunk C—> N irányban lépésenként, miután a C-terminális aminosavat megfelelő módon rögzítünk egy szilárd hordozóhoz, például egy gyantához. A kapcsolási lépés teljessé válása után az N-terminális védőcsoportot eltávolítjuk az újonnan hozzáadott aminosav gyökről, majd a következő aminosavat, ami szintén megfelelően védett adagoljuk, stb. Miután az összes kívánt aminosavat a megfelelő sorrendben bekapcsoltuk, a peptidet lehasítjuk a hordozóról és megszabadítjuk a még megmaradt védőcsoport(ok)tói olyan körülmények között, melyek legkevésbé roncsolőak a szekvenciára nézve. Ezt követően a terméket gondosan tisztítjuk, majd körültekintően jellemezzük a szintetizált terméket, hogy megbizonyosodhassunk, hogy a kívánt szerkezetet kaptuk.

Az (I) általános képletű vegyülettek előállítására egy különösen előnyös módszer a szilárd fázisú szintézis, pl. egy a O-pozícióban Mel-t tartalmazó peptidet előállíthatunk ilyen módszerrel és klasszikus eljárással is (az oktapeptid analógnak egy Boc-Mel vegyülettel oldószerben történő kapcsolásával).

Az (I) általános képletű peptideket előnyösen az alábbi (VIIA) általános képletű intermedier peptidekből állíthatjuk elő:

xf-Rl-R²(X²)-R³(X³)-D-Trp-Lys(X⁵)-R⁶-R⁷(X⁷)-R⁸(X⁸)-NH-X⁹ ahol RÍ,R², R³, R⁶, R⁷, R⁸ és X¹ jelentése a fentiekben megadott,

X² és X⁷ jelentése a Cys szulfhidril csoportjának védésére szolgáló metil-benzil-csoport (MBzl),

X³ jelentése a Tyr fenolos hidroxilcsoportjának a védelmére szolgáló 2-bróm-benzil-oxi-karbonil [Z(2-Br)J vagy 2,6-diklór-benzil (DCB),

X⁵ jelentése a Lys oldalláncban helyet foglaló aminocsoportjának a védelmére szolgáló [Z(2—Cl)] vagy FMOC csoport,

X⁸ jelentése a Tyr fenolos hidroxilcsoportjának a védelmére szolgáló (Z(2-Br)] vagy DCB csoport,

X⁹ jelentése egy gyanta hordozóba beépített amid védő benzhidril vagy metil-benzhidril-csoport; a peptidamidok előállítására előnyösen a kereskedelemből beszerezhető benzhidril-amino-polisztirén/2 % divinil-benzol kopolimert alkalmazunk.

A (II) általános képletű vegyületek előállítására alkalmazható diamino-acil-csoportot tartalmazó (VIIIA) általános képletű intermedier peptidek előállításának előnyös módja a szilárd fázisú peptidszintézis. A (VIIIA) általános képletű vegyületeket a (VIIA) általános képletű peptidek (ahol X¹ jelentése hidrogénatom) Boc2A2Pr való kapcsolásával, majd az ezt követő védőcsoport mentesítéssel állítjuk elő. így kapjuk az alábbi (VII) képletű vegyületet:

X₂A₂pr-D-Phe-Cys(X²)-Tyr(X³)-D-Trp-Lys(X⁵)-Val-Cys(X⁷)-R⁸(X⁸)-X⁹ • · · · · • · · · · ·'··· · · · ···· · · ······· ··

- 24 ahol R⁸, X², X³, X⁵, X⁷, X⁸ és X⁹ jelentése a fentiekben megadott és X jelentése az A₂pr aminocsoportjának a védelmére szolgáló Boc csoport.

A (VIIA) és (VIIIA) általános képletű redukált vegyületekből a (VIIB) és (VIIIB) általános képletű ciklusos vegyületeknek az előállítására egy különösen előnyös eljárás az, amikor a ciszteinek két szulfidilcsoportját savas oldatban oldott jóddal oxidáljuk.

A (VIIA) általános képletű peptidek szilárd fázisú szintézisét Boc-védett Thr, Trp vagy Mel-nek benzhidril-amin -gyantával való kapcsolódásával indítjuk elő CH₂C1₂ közegben.A kapcsolódást DIC vagy DIC/HOBt alkalmazásával a környezet hőmérsékletén hajtjuk végre. A Boc csoport eltávolítása után az egymást követő védett aminosavak kapcsolását (mindegyiket háromszoros moláris feleslegben alkalmazzuk) CH₂C1₂ vagy DMF/ /CH₂C1₂ keverékben hajtjuk végre a Boc-aminosav oldékonyságától függően. Minden fázisban a kapcsolódási reakció sikerességét előnyösen a ninhidrin teszttel követhetjük (lásd Kaiser és tsai Anal. Biochem. 34/ 595 (1970)). Amennyiben nem teljes a kapcsolódás a kapcsolási eljárást megismételjük azelőtt, hogy az alfa-amino védőcsoportot eltávolítanánk a következő aminosav reakciójához.

Miután a (VIIA) általános képletű intermedier peptidnek kialakult a kívánt aminosav sorrendje, a peptid-gyanta komplexet folyékony hidrogénfluoriddal kezeljük anizol jelenlétében és így kapjuk azon (VIIA) általános képletű peptideket, amelyeknél X², X³, X⁷, X⁸ és X⁹ jelentése hidrogénatom.

···· • ·

- 25 A (VIIIB) általános képletű peptideket (II) általános képletű peptidekké (ahol Q¹ jelentése PtC12) alakíthatjuk át a kiindulási peptideknek ekvivalens mennyiségű vizes DMF-ben készült 60-80 %-os K2PtC14 oldattal, a környezet hőmérsékletén végzett reagáltatással, majd ezt követő HPLC tisztítással. A platinatartalmú vegyületeket kívánt esetben PtY2 képletű származékává, amely hasonló szubsztituenseket tartalmaz, alakíthatjuk ismert eljárásokkal.

Azon (I) általános képletű vegyületek előállítása esetén, melyeknél Q jelentése MTX, egy (VIIB) általános képletű vegyűletet MTX-szel kapcsolunk karbodiimides eljárással.

Azon (II) általános képletű peptideket, ahol Q¹ jelentése (^b2)Ö3) és amely nem platinafém csoportbeli fématomot hordoz citotoxikus csoportként, a (VIIIB) általános képletű intermedier peptidekből nyerjük úgy, hogy azt egy hidroxil-oxo-Q³ vagyületnek réz vagy nikkel kationt tartalmazó 60-80 %-os vizes DMS-ben készült oldatával előre elkészített komplexével reagáltatjuk, majd a kívánt peptid-fém komplexet HPLC módszerrel izoláljuk.

Egy másik módszer szerint azon (II) általános képletű vegyületeket, ahol Q¹ jelentése (B2)Q3) előállíthatjuk a (VIIIB) általános képletű intermedier peptidekből (ahol X⁵ jelentése FMOC védőcsoport) úgy, hogy a megfelelő hidroxil-oxo-Q³ vegyülettel reagáltatjuk, majd ezt követően egy gyógyászatilag elfogadható sav fémsójával előnyösen Cu⁺⁺ és Ni⁺⁺ acetátjával reagáltatjuk, majd ezt követően 30-50 %-os piperidin-oldattal védőcsoportmentesítést hajtunk végre és végül a terméket HPLC módszerrel izoláljuk.

• · · ··· · · ··· · · · ···· ·· ··· · ♦ ·· ··

- 26 A Mel-Mel tartalmú (II) általános képletü vegyület analógokat a (VIIIA) általános képletü peptidnek szilárd fázisú peptidnek, Boc-Mel vegyülettel végrehajtott acilezésével, majd ezt követő védőcsoportmentesítésével, oxidálásával és tisztításával kapjuk.

Azon (VIIB) és (VIIIB) általános képletü intermedier peptideket, amelyeknél az összes védőcsoportot eltávolítottuk, két lépésben tisztítjuk. Először az oxidációs reakcióból kapott oldat liofilizátumát gélszűrésnek vetjük alá, amelyet egy Sephadex G15 oszlopon (1,2x100 cm) hajtunk végre, hogy eltávolítsuk a polimerizált termékeket, a szabad jódot és sókat 50 %-os ecetsavval végrehajtott eluálással. A második lépésben a gélszűréssel kapott liofilizátum (amely a kívánt peptidet tartalmazza) HPLC módszerrel reverz fázisú oszlopon tisztítjuk. A félpreparatív HPLC tisztítást RAININ HPLC SYSTEM (RAININ Inc., Co., Woburn, MA) oszlopon hajtjuk végre, amely három Rainin Rabbit HP HPLC pumpát tartalmaz, a mérést APPLE MACINTOSH PLUS komputerrel egy Rheodyne injektorral és egy KNAUER Model 87 különféle hullámhosszú UV monitorral követjük. A nyers peptideket DINAMAX makrooszlopon (21,2 x 250 mm) tisztítjuk, amely gömbalakú C18 szilikagéllel töltött (pórusméret 300 A, részecskeméret 12 yum), Rainin Inc., Co. , A jelű oszlop). Az oszlopot I jelű oldószerrendszerrel eluáljuk, amely tartalmaz: A 0,1 % vizes TFA-t és B 70 %-os vizes acetonitrilben készült 0,1 %-os TFA-t. (A HPLC eluens előállításához az UV fokozatú acetonitrilt a Burdick & Jackson, cégtől szereztük be, a TFA és az AcOH HPLC/Spektro fokozatú (Pierce Chem.) és a vizet üvegen kétszer desztilláltuk és

Milli-Q víztisztító rendszeren (Millipore) bocsátjuk keresztül.)

A melfalant tartalmazó (I) és (II) általános képletű peptideket szintén két lépésben tisztítjuk. A melfalan (és ennélfogva melfalan tartalmú peptidek is) könnyen bomlanak vizes oldatban, így a tisztítást a lehető legrövidebb idő alatt kell végrehajtani. Az oxidálódott polimerek a jód és a sók eltávolítására Sepahdex G15 oszlopot (0,6x10 cm) alkalmazunk. A bomlás minimalizálása érdekében a tisztítást 4 °C-on hajtjuk végre. Az oszlopot 90 %-os vizes AcOH oldattal eluáljuk. Az összegyűjtött oldatot azonnal liofilizáljuk és a peptideket HPLC módszerrel tisztítjuk. Egy VYDAC Protein & Peptide C^g reverz fázisú oszlopot alkalmazunk (10x250 ml C^g szilikagéllel töltve, amelynek pórusmérete 300 A, részecskenagysága 5 yum, gyártó: ALTECH, Deerfield, IL) (B jelű oszlop). Az oszlopot ii jelű oldószerrendszerrel eluáljuk, amely 2 %-os vizes ecetsavat és B 70 %-os vizes acetonitrilben készült 0,2 %-os ecetsavat tartalmaz. Az izokratikus és gradiens módszer kombinálva. Az oszlop eluenst 220 nm-en vizsgáljuk és a frakciókat jeges hűtés közben gyűjtjük.

A platinatartalmú (II) általános képletű peptideket egylépéses HPLC módszerrel tisztíthatjuk. A tisztítást 10x250 ml-es W-POREX Cjg oszlopon hajtjuk végre, amelynek pórusmérete 300 A és részecskemérete 5 yum (Phenomenex,Rancho Pálos Verdes, CA, C jelű oszlop) és eluensként az i oldószert alkalmazzuk. A kromatografálást a környezet hőmérsékletén hajtjuk végre és az eluenst 220 nm-en vizsgáljuk.

A réz vagy nikkel citotoxikus csoportokat tartalmazó (II) • · · ·

4··· ·· ···· ···· • · 4 · • 4 ··· · • · · · · * ·· 444· ··* ’*

- 28 általános képletű peptideket enyhe körülmények között tisztíthatjuk HPLC módszerrel, mivel a fénykomplexek a savas oldatban instabilak. Az analógokat a B jelű oszlopon tisztítjuk, eluensként az iii jelű oldószerrendszert alkalmazva, amely a 0,1 mól/liter ammóniumacetátot (pH = 7,0 és B 65 %-os vizes MeCN-ben készült 0,1 mól/literes ammónium-acetát oldatból áll.

A nyers és tisztított peptideknek a minőségét és eluens jellemzőit analitikus HPLC módszerrel állapítjuk meg, melyet egy Hewlett-Packard Model 1090 (1986) folyadékkromatográffal hajtunk végre, amely egy 220 és 280 nm-en érzékelő dióda detektorral van ellátva és egy 4,6x250 mm-es W-POREX reverz fázisú oszloppal is rendelkezik, amelynek pórusmérete 300 A, részecskemérete 5 /um, D jelű oszlop). Az i vagy iii oldószerrendszernek 1,2 ml/perces átfolyási sebességét tartjuk fenn és az elválasztást szobahőmérsékleten hajtjuk végre. Aminosavanalízis céljából a peptidmintákat 110 °C-on 20 órán át vákuum alatt lepecsételt tubusokban hidrolizáltuk, mely tubusok 4 mól/liter metán-szulfonsavat tartalmaztak. Az analízist Beckman 6300 aminosav-analizátorral hajtottuk végre.

A találmány szerinti peptideknek poli(DL-laktid-ko-glikolidból előállított mikrokapszulái vagy mikrorészecskéi előnyösen alkalmazhatók elnyújtott hatástartalmú rendszerek előállítására, melyek intramuszkuláris vagy szubkután injekciókban alkalmazhatók. A peptideket intravénásán adagolhatjuk izotóniás só, foszfátpuffér oldatokban és hasonlókban.

A gyógyászati dózisformák a peptideket más gyógyászatilag • · • · · · · · · • · · · · · · ···· ·· ······· ··

- 29 elfogadható hordozóval együtt tartalmazhatják. A dózisok 1-100 /ug/testsúlykg között mozoghatnak, amikor intravénásán vagy intramuszkulárisan alkalmazzuk a peptideket. Általánosságban a találmány szerinti peptidekkel végzett kezelést hasonló módon hajtjuk végre a klinikai gyakorlatban, mint más LHRH agonisták és antagonisták esetében.

A peptideket beadhatjuk emlősöknek intravénásán, szubkután, intramuszkulárisan, intranazálisan vagy intravaginálisan a kívánt tumorellenes hatás elérése érdekében. A hatásos dózis változik a különféle emlős egyedektől és az adagolás módozatától. Egy tipikus dozírozási forma az, amikor fiziológiai sóoldat tartalmazza a peptidet 0,1 - 2,5 mg/testsúlykg tartományban.

Megjegyezzük, hogy mivel találmányunkat az előnyös megvalósítási módszerekkel ismertetjük, az oltalmi kört nemcsak ezekre tartjuk fenn, és az felöleli az átlagos szakember által végrehajtható változtatásokkal előállított vegyületeket is.

Alkalmazhatunk olyan ismert szubsztitúciókat is, melyek nem csökkentik szignifikánsan a vegyületek hatékonyságát.

I. előállítás l1

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2IA

I1

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH₂IB

I1

D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂IC

Ii

D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂ID • · ·· • · · · • · • · · · · · ·

- 30 Az IA előállítás során a peptideket lépésenként építjük fel egy kb. 0,55 miliekvivalens (továbbiakban: mekv) NH₂/g tartalmú benzhidril-amin-HCl gyantán (Advanced Chem. Tech. Louisville, KY) egy szilárd fázisú szintézis manuális levezetésére alkalmas reakcióedényben. A 0,5 g benzhidril-aminHCl gyantát (kb. 0,27 mmol) CH₂Cl₂-ben készült 10 %-os trietilaminnal semlegesítjük két alkalommal 3-3 percen át, majd hatszor CH₂Cl₂-vel mossuk. A gyantát háromszoros moláris feleslegben vett Boc-Thr(Bzl)-van (0,75 mmol) és DMF-ben készült HOBt-vel (0,82 mmol) keverjük össze 3 percen át. CH₂Cl₂-ben készült 5 %-os dihidropropil-karbodiimid (0,82 mmol) oldatot adagolunk. A keveréket 90 percen át rázatjuk szobahőmérsékleten. A kapott gyantát hatszor mossuk DCM-mel, majd Kaiser-féle tesztnek vetjük alá (Kaiser és mtsai, Anal. Biochem. 34, 595 (1970)).

A Boc-Thr(Bzl)-BHA gyantáról a Boc-csoportok eltávolítását (védőcsoportmentesítés) DCM-ben készült 1:1 arányú trifluor-ecetsav-oldattal hajtjuk végre 5 perc alatt, majd ezt követően szűrjük a gyantát, majd ismételten kezeljük 25 percen át, majd szűrjük a gyantát és DCM-mel mossuk hatszor.

A benzhidril-amin-gyantánál leírt módon eljárva semlegesítést hajtunk végre 10 %-os trietil-amin-oldattal is.

Ezt követően a megfelelő aminosav-csoportokat (Boc-Cys(MBzl), Boc-Val, Boc-Lys[Z2-C1), Boc-D-Trp, Boc-Tyr[Z(2-Br)], Boc-Cys(MBzl) és Boc-D-Phe) visszük be az egymást követő kapcsolási lépésekhez, melyeket a fentiekben leírt módon hajtunk végre. így kapjuk a következő szerkezetű peptidet:

• · · • · · · · • · · · · · ·

- 31 Boc-D-Phe-Cys(MBzl)-Tyr[Z(2-Br)]-D-Trp-Lys[Z(2-C1)]-ValCys(MBzl)-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-BHA gyanta.

A védőcsoportmentesítést a Boc-Thr(Bzl)-BHA gyantánál leírt módon hajtjuk végre. A Boc-D-Trp beépítése után 5 %-os merkapto-etanolt adagolunk 50 %-os DCM-ben készült trifluor-ecetsav-oldathoz.

Végül a Boc védőcsoporttól mentesített peptid gyantát 3-3 alkalommal mossuk DCM-mel, metanollal és újra DCM-mel.

500 mg védett oktapeptid-BHA-gyantát 0,5 ml anizollal keverjük össze, majd a kapott anyagot 10 ml folyékony HF-fel 0 °C-on 1 órán át. Miután vákuumban eltávolítjuk a HF-t, a peptid és gyanta keverékét száraz etil-acetáttal mossuk. Ezt követően a peptidet 30%-os AcOH-val extraháljuk, a gyantát szűréssel eltávolítjuk, majd liofilizálunk.

100 mg nyers, redukált peptidet 100 ml 95%-os vizes AcOH oldatban oldunk, majd ezt követően jégecetben készült 0,005 Mes jódoldatot csepegtetünk a keverékhez, amíg a sárga szín el nem múlik. Ecetsav lepárlása után a nyers diszulfid hidakat tartalmazó peptidet Sephadex G15 oszlopon gélszűrésnek vetjük alá. További tisztítást hajtunk végre az A jelű oszlopon végzett félpreparatív HPLC módszerrel, oldószerként i jelű lineáris gradiens oldószerrendszert alkalmazva 5,0 ml/perc átfolyási sebességnél.

Az IB jelű peptid előállítását a fentiekhez hasonló módon hajtjuk végre azzal az eltéréssel, hogy Boc-Trp-t rögzítünk a gyantához Boc-Thr(Bzl) helyett az első lépésben.

Az IC jelű peptidet az IA peptid előállításával megegyező módon hajtjuk végre, azzal az eltéréssel, hogy a harmadik • · · · · · · • · · · · · · ···· ·· ···· · · · ··

- 32 lépésben Boc-Thr(Bzl)-t építünk be Boc-Val helyett. Az ID jelű peptidet fentiekhez hasonló módon hajtjuk végre azzal az eltéréssel, hogy az utolsó lépésben Boc-D-Trp-t építünk be Boc-D-Phe helyett.

Az ΙΑ, IB, IC és ID tisztított peptidek (28 mg, 21 mg, 32 5 mg) analitikai HPLC módszerrel vizsgálva tisztának (>95 %) bizonyultak i jelű lineáris grandiens oldószerrendszert alkalmazva, és az aminosavanalizis a kívánt eredményt szolgáltatta.

• · ·

- 33 • ·· ·

Előáll!- Peptid

Retenciós idő tás

IA

IB

IC

ID

Gradiens (%) B/perc

tisztítás esetén	analízis	D jelű csoporton
25-55/60	20-60/40	15.5
30-60/60	25-65/40	19.5
25-55/60	20-60/40	17.4
25-55/60	25-85/40	12.6

II. előállítás

I1

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(FMOC)-Val-Cys-Thr-NH2HA

X·,

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(FMOC)-Val-Cys-Trp-NH2IIB

I--------------—--------Γ

D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys(FMOC)-Thr-Cys-Thr-NH2IIC l1

D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys(FMOC)-Thr-Cys-Thr-NH2IID

A IIA peptid lépésenkénti előállítását az IA peptid előállításánál leírt módon BAH gyantán hajtjuk végre azzal az eltéréssel, hogy Boc-Lys(FMOC)-t alkalmazunk Boc-Lys[Z(2-C1)] helyett. A peptidet nyolc egymást követő kapcsolási lépéssel állítjuk elő és így kapjuk a következő vegyületet: Boc-D-Phe-Cys(MBzl)-Tyr(Z(2-Br)]-D-Trp-Lys(FMOC)-Val-Cys(MBzl)-Thr(Bzl)-BHA gyanta. A Boc védőcsoportmentesített gyantát HF/anizollal kezeljük, jóddal oxidáljuk, majd Sephadex G15 • ·

- 34 oszlopon és A jelű oszlopon i oldószerrendszert alkalmazva tisztítjuk.

Előállí-	Peptid	Gradiens (%)	B/perc	Retenciós idő
tás	kód	tisztítás	analízis	D jelű cso-
		esetén		porton
IIA		55-85/60	50-90/40	12.2
IIB		55-85/60	50-90/40	14.6
IIC		50-80/60	50-90/40	12.0
IID		50-80/60	50-90/40	13.9

III. előállítás

A₂pr-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂ IIIA

A₂pr-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH IIIB

A IIIA jelű peptidet az első peptid előállításánál leírt BAH gyantán (1,0 g, 0.55 mekv NH₂) szilárd fázisú technikát alkalmazva állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy a szintézist nem állítjuk le a D-Phe adagolásává. Az oktapeptidet (Boc)A₂lal aciláljuk és így kapunk 391 mg (Boc)₂-A₂pr-D-Phe-Cys(MBzl)-Tyr[Z(2-Br)]-D-Trp-Lys[Z(2-C1) ]-Val-Cys(MBzl)-Thr(Bzl)BHA gyantát. A Boc csoportok eltávolítását követően a peptidgyantát HF/anizollal kezeljük, hogy megkapjuk a szabad peptidet. Az oxidálást Sephadex G15 oszlopon és A jelű oszlopon végzett HPLC módszerrel tisztítjuk az i jelű grandiens • *

- 35 oldószerrendszert alkalmazva (20-50 %, B eljárás, 60 perc). 86 mg IIIA jelű peptidet kapunk.

A fentiekhez hasonló módon eljárva, de az első lépésben Boc-Trp-t alkalmazva Boc-Thr(Bzl) helyett 77 mg IIIB jelű peptidet kapunk.

A nyers peptidek (>94%) 14,5 perces, illetve 23,7 perces HPLC retenciós idővel rendelkeznek, amikor az i jelű lienáris gradiens oldószerrendszert alkalmazzuk (20-50 %, B, 30 perc). A kapott anyagok a várt aminosavszerkezettel rendelkeznek.

IV. előállítás

A2pr-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(FMOC)-Val-Cys-Thr-NH2 IV

A IV jelű peptid előállítása során az I jelű peptidek előállításánál leírtak szerint járunk el azzal az eltéréssel, hogy a negyedik kapcsolási lépésben Boc-Lys(FMOC)-t alkalmazunk Boc-Lys[Z-(2-C1)] helyett. HF-s hasítást, oxidálást és tisztítási eljárást követően (A jelű oszlop, i jelű gradiens oldószerrendszer: 50-80 % B, 60 perc) 47 mg IV jelű peptidet kapunk. A nyers peptid analitikai HPLC vizsgálat során egy csúcsot mutat 12,5 perces retenciós idővel.

V. előállítás

I-------------------------------------------------------------------------------------------------------1

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys-Thr-NH₂ VA l-------------------------------------------------------------------------------------------------------1

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys-Trp-NH₂ VB

Az VA peptidet az IA peptid előállításánál leírt módszer szerint állítjuk elő azzal az eltéréssel, hogy FMOC-D-Phe-t alkalmazunk Boc-D-Phe helyett. A peptid-gyantát HF/anizollal • « • · · · ·· · • « · · · · · ···· ·· ···· ··« ··

- 36 kezeljük, majd ezt követően a diszulfid hidat oxidálással alakítjuk ki és a peptidet Sephadex G15 oszlopon és HPLC módszerrel (A jelű oszlop, i jelű gradiens oldószerrendszer: 55-85 % B, 60 perc) tisztítjuk. Az FMOC védett peptidet DMF-ben oldjuk, majd 1,2 ekvivalens di-terc-butil-dikarbonátot és 1,2 ekvivalens TEA-t adagolunk és így kapjuk a Boc-Lys( -Boc)tartalmú peptidet. Mikor a reakció teljessé válik, a védett peptidet éterrel kicsapatjuk és az FMOC csoportot 50 %-os piperidinnel eltávolítjuk. A Boc-védett peptidet A jelű oszlopon kromatografáljuk i jelű oldószerrendszert alkalmazva (45-75 % B, 60 perc) és így kapjuk az Va jelű peptidet.

Az VB jelű peptidet hasonló módon a fentiekhez hasonló módon állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy Boc-Trp-t alkalmazunk Boc-Thr(Bzl) helyett. A peptid tisztának bizonyult az i jelű oldószerrendszer (45-85 % B, 40 perc) alkalmazásával végrehajtott analitikai HPLC vizsgálat során.

VI. előállítás

I---------------------------------------------------------------------------------------------------------1

Glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(FMOC)-Val-Cys-Thr-NH₂ VI A VI jelű peptidet a IIA peptid előállításánál leírtak szerint és az N-terminális aminosavnak glutársavanhidriddel való acilezésével állítjuk elő. A peptid-gyantát HF/anizollal kezeljük oxidációval kialakítjuk a diszulfid hidat, majd Sephadex G15 oszlopon és végűi HPLC módszerrel végzett tisztítást hajtunk végre. (A jelű oszlop, i jelű gradiens oldószerrendszer: 50-80 % B, 60 perc).

VII. előállítás

Antrakinon-2-metil-hemiglutarát a 4 • · · ··· · • · · · · · « • «· · «· ···· ··· · ·

- 37 576 mg (2 mmol) 2-(hidroxi-metil)-antrakinont 6 ml vízmentes piridinben szuszpendálunk, majd a keveréket 24 órán át 456 mg (4 mmol) glutársavanhidriddel refluxáltatjuk. A piridint vákuum alatt eltávolítjuk és a maradékot savanyítjuk, majd etil-acetáttal extraháljuk. A sárga terméket etil-acetát/ /hexán elegyből átkristályosítva 580 mg terméket kapunk (150-151 °C). Az i jelű lineáris gradiens oldószerrendszer (30-60 % B; 30 perc) alkalmazása esetén a cím szerinti vegyület HPLC retenciós ideje 19,7 perc.

VIII. előállítás

5-(3-Klór-propionil-oxi)-1,4-naftokinon Trietil-amin (1,4 ml) és 1,27 g 3-klór-propionil-kloridnak 5 ml DCM-ben készült oldatát adjuk 1,73 g 5-hidroxi-l,4naftokinon oldatához. A reakciókeveréket 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Az oldatot szűrjük és kis térfogatra töményítjük, majd szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk (etil-acetát/ciklohexán/DCM). 741 mg cím szerinti terméket kapunk.

1. példa t—ι

Mel-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH21

I1

D-Mel-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH22

Az 1 jelű peptid előállítása során a következő aminosavakat kapcsoljuk BAH gyantához (100 mg) az I előállításnál megadott módon: Boc-Thr(Bzl), Boc-Cys(MBzl), Boc-Val, Boc-Lys[Z(2-C1)],Boc-D-Trp, Boc-Tyr[Z(2-Br)], • « · ··· · • · · · · * · ···· ·· ···· ··· ··

- 38 Boc-Cys(MBzl) és Boc-Mel. A következő aminosavak lépésenkénti összekapcsolása BAH gyantán (100 mg) vezet a 2. jelű peptidhez: Boc-Thr(Bzl), Boc-Cys(MBzl), Boc-Val, Boc-Lys[Z(2-Cl)], Boc-D-Trp, Boc-Tyr[Z(2-Br)], Boc-Cys(MBzl) és Boc-D-Mel. A peptideknek a gyantáról való lehasítását követően azokat oxidáljuk és liofilizáljuk, majd Sephadex G15 oszlopon végzett gélszűrésnek vetjük alá, melynek során 80 %-os AcOH-val végzett mosással távolítjuk el a jódot. B jelű oszlopon ii jelű lineáris gradiensű oldattal (55-85 B%, 60 perc) végzett HPLC tisztítással kapjuk az 1 peptidet (13 mg) és a 2 peptidet (14 mg) 95 %-nál nagyobb tisztasággal. Az 1 illetve 2 jelű peptidhez tartozó retenciós idők: 20,1 perc és 22,8 perc, amikor i jelű oldószerrendszerrel (30-70 B%, 40 perc) végrehajtott analitikai HPLC-t hajtunk végre.

2. példa

D-Phe-Cys-Mel-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 3

A 3 jelű peptid előállítását az I. előállításnál megadott módon BAH gyantán hajtjuk végre a következő vegyületeknek lépésenkénti kapcsolásával: Boc-Thr(Bzl), Boc-Cys(MBzl), Boc-Val, Boc-Lys[Z(2-C1)], Boc-D-Trp, Boc-Mel, Boc-Lys(MBzl) és Boc-DPhe. A peptid-gyantát HF/anizollal kezeljük, majd ezt követően oxidáljuk, majd kisméretű Sephadex G15 oszlopon gélszűréssel és HPLC módszerrel tisztítjuk, mely utóbbinál B jelű oszlopot és eluensként ii jelű oldószerrendszert (50-80 % B, 60 perc) alkalmazunk. így kapjuk a kívánt peptidet (11 mg) >91 % tisztasággal. A 3 jelű peptid a D jelű oszlopon i oldószerrendszer alkalmazásánál (3039 % Β, 40 perc) 19,2 perces retenciós idővel rendelkezik.

3. példa

I------------------------------------------------------------------------------------'---------1

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Mel-NH2 4

A 3 jelű peptid előállítását az I. előállításnál megadottakkal megegyezően hajtjuk végre azzal az eltéréssel, hogy az első lépésben Boc-Mel-t kötünk a BAH gyantához a BocThr(Bzl) helyett. A peptidet HF/anizollal hasítjuk le a gyantáról, majd jóddal oxidáljuk, liofilizáljuk, kisméretű Sephadex oszlopon gélszűrésnek vetjük alá, majd HPLC módszerrel tisztítjuk ii oldószerrendszert (50-80 % B, 60 perc) alkalmazva. így 9,2 mg 4 peptidet kapunk, amely > 92 %-osan tisztának bizonyult analitikai kromatografálás során i lineáris gradiens oldószerrendszer alkalmazása esetén (30-70 % B, 40 perc). A retenciós ideje 20,1 perc.

4. példa

Mel-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂(5) í1

Mel-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂(6) i1

Mel-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂(7) i1

Mel-D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂(8) i

Mel-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH₂(9)

D-Phe-Cys(MBzl)-Tyr[Z(2-Br)]-D-Trp-Lys[Z(2-CI)]-Val-40-Cys(MBzl)-Thr(Bzl)-BAH-gyantát állítunk elő az I. előállítás szerinti módon, majd az N-terminális védőcsoport mentesítése után Boc-Mel-lel acilezést hajtunk végre és így kapjuk a védett 5-nonapeptidet.

Boc-Thr(Bzl), Boc-Cys(MBzl), Boc-Thr(Bzl), Boc-Lys

-Lys[Z(2-CI)], Boc-D-Trp, Boc-Phe, Boc-Cys(MBzl), Boc-D-Phe és Boc-Mel benzhidril-amin-gyantán az I. előállítás szerint végrehajtott kapcsolásával állítjuk elő a 6 jelű védett nonapeptidet.

Boc-Thr(Bzl), Boc-Cys(MBzl), Boc-Thr(Bzl), Boc-Lys -Lys[Z(2-Cl)], Boc-D-Trp, Boc-Phe, Boc-Cys(MBzl), Boc-Phe és Boc-Mel BAH-gyantán végzett kapcsolásával kapjuk a védett 7 jelű peptidet.

Boc-Thr(Bzl), Boc-Cys(MBzl), Boc-Thr(Bzl), Boc-Lys[Z(2-C1)], Boc-D-Trp, Boc-Phe, Boc-Cys(MBzl), Boc-D-Trp és Boc-Mel BAH-gyantán végzett egymás utáni kapcsolásával kapjuk 8 jelű védett peptidet.

Mel-D-Phe-Cys(Bzl)-Tyr[Z(2-Br)]-D-Trp-Lys[Z(2-Cl) ]-Val-Cys(MBzl)-Trp-BAH-gyantát (9 jelű védett peptid) az I. előállításnál leírt kilenc kapcsolási lépéssel állítjuk elő.

Az 1. példában leírt hasítás, oxidálás, kisméretű Sephadex G15 jelű oszlopon végzett gélszűréssel és a B jelű oszlopon ii jelű oldószerrendszert alkalmazva kapjuk >92 % tisztasággal az 5, 6, 7, 8 és 9 jelű peptideket (a megfelelő tömegek 8,4 mg, 10,6 mg, 9,9 mg, 12,4 mg, 7,9 mg).

- 41 HPLC adatok

Előállí-	Peptid	Gradiens (%)	B/perc	Retenciós idő
tás	kód	tisztítás	analízis	D jelű cso-
		esetén		porton
5		60-90/60	40-80/40	16.1
6		60-90/60	40-80/40	14.0
7		69-90/60	35-75/40	17.8
8		60-90/60	40-80/40	19.9
9		65-95/60	40-80/40	22.4

Annak bizonyítására, hogy a szilárd fázisú peptidszintézis alkalmazható az instabil melphalannak a szekvenciába való beépítésére, egy másik úton is előállítottuk az 5 peptidet.

[----------------------------------------------------------------------------------------------1

FM0C-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2-t állítunk elő az IA előállításnál megadott módon azzal az eltéréssel, hogy FMOC-D-Phe-t alkalmazunk Boc-Phe helyett.

Ehhez az oktapeptidhez klasszikus szintézis eljárásokkal kapcsoljuk a Boc-Melt.

- 42 11

FMOC-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂

Boc₂0

I—I

FMOC-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys-Thr-NH₂ 50% piperidin DMF-ben 30 percen át ,|

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys-Thr-NH₂ Boc-Mel-lel végzett kapcsolás DCC + HOBt

I-------------------------------------------------------------------------------------------------------1

Boc-Mel-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys-Thr-NH₂ DCM-ben 50 %-os TFA-val végzett védőcsoport eltávolítás t------------------------------------------------------------------1

Mel-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂ (5)

A fenti úton előállított 5 jelű peptid a szilárd fázisú eljárással előállított vegyülettel megegyező aminosavösszetételt, UV-spektrumot és HPLC retenciós időt mutatott.

5. példa |------------------------------------------------------------------------J [(Mel)₂A₂pr ] -D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂ (10)

A 10 jelű peptid előállítása során a III. előállításban kapott A₂pr-D-Phe-Cys(MBzl)-Tyr[Z(2-Cl)]-Val-Cys(MBzl)~ Thr(Bzl)-BAH-gyantát (150 mg) ekvivalens mennyiségű Boc-Mellel reagáltatjuk. A védőcsoportokat HF/anizol oldattal távolítjuk el; a nyers peptidet jóddal oxidáljuk és gélszűrésnek vetjük alá. A 10 peptidet tartalmazó liofilizált frakciókat B jelű oszlopon injektáljuk és i jelű oldószerrendszert (60-90 % B, 60 perc) alkalmazásával tisztítjuk. D jelű oszlop és i jelű oldószerrendszer (40-80 % B, 40 perc) alkalmazása esetén a nyers peptid (7,6 mg) retenciós ideje 17,1 perc.

6. példa i----------------------------------------------------------------------------------1

Mel-Mel-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂ (11)

A 11 jelű dekapeptidet a D-Phe-Cys (MBzl) -Tyr ([Z (2-Br) ]-D-Trp-Lys(Z(2-CI)]-Val-Cys(MBzl)-Thr(Bzl)-BAH-gyantából (az IA előállításból származó vegyület, melynek N-terminális aminocsoportjárói a védőcsoportot eltávolítottuk) Boc-Mel vegyülettel végzett két egymás utáni lépésben végrehajtott kapcsolásával kapjuk. A peptid-gyantát HF/anizol oldattal kezeljük, majd a diszulfid hidat jóddal végzett oxidálással alakítjuk ki. A liofilizált sreakciókeveréket gélszűrésnek vetjük alá, majd HPLC módszerrel tisztítjuk ii jelű • · · · · * • · fc·· · • · · · · · • ·· ······· ·· oldószerrendszert (70-80 % B, 60 perc) alkalmazva. így 6,9 mg 8 jelű peptidet kapunk. Az i jelű lineáris gradiensű oldószerrendszer (50-90 % B, 40 perc) alkalmazása esetén a nyers peptid 14,9 perces HPLC retenciós idővel rendelkezik.

7. példa

I1 (A₂pr(PtCl₂)]-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂ (12)

Ií (A₂pr(PtCl₂)]-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH₂ (13)

A (12) jelű platina-tartalmú peptidet 30 mg i1

A₂pr-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂ intermedier peptid TFA sójának (IIA előállítás), 100 /ul DMFben oldva és nátrium-hidroxiddal semlegesítve) kálium-klórplatinát (8,4 mg) 4 nátrium-acetát jelenlétében 48 órán át reagáltatásával állítjuk elő. Ezt követően a reakciókeveréket vízzel hígítjuk, majd C jelű oszlopra injektáljuk és kromatografáljuk i jelű oldószerrendszer (25-50 % B, 50 perc) alkalmazásával.

A (13) jelű peptidet a fentiekhez hasonló módon állítjuk elő azzal az eltéréssel, hogy i--------------------------------------------------------------------------1

A₂pr-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH₂ trifluor-ecetsav-sót (31 mg, IIB előállítás) alkalmazunk kiindulási anyagként a megfelelő THF⁸ származék (IIA előállítás) helyett.

Az i jelű oldószerrendszer (30-60 % B, 30 perc) • ♦ « *··

- 45 alkalmazása esetén a kapott metallopeptidek (4,8 mg, illetve 5,3 mg) egy-egy HPLC csúcsot mutatnak 9,1 perces, illetve 19,5 perces retenciós idővel.

8. példa

Ϊ--------------------------------------------------------------------------1 [A₂pr (SÁL) ₂Cu) ]-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂ (14) i-----------------------------------------------------------------------------------1 [A₂pr (C1SAL) ₂Cu] -D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH₂ (15)

A (14) jelű metallopeptidet két különböző úton is előállítottuk annak bizonyítására, hogy a Cu komplex előállítható a szabad Lys-e-csoport ellenére is.

Az A eljárás szerint az

A₂pr-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-(FMOC) -Val-Cys-Thr-NH₂-t (III. előállítás, 100 /ul DMF-ben oldjuk, majd a pH-t 8-ra állítjuk be NaOC és NaOAc adagolásával, majd ezután 4 mg szalicilaldehidet adagolunk. 1 órás szobahőmérsékleten végzett állást követően a fémkomplexet réz(II)acetáttal végzett (3 mg, 50 yul vízben) 30 percen át való reagáltatással állítjuk elő. Az FMOC védőcsoport eltávolítása végett a keveréket 50 yul piperidinnel keverjük össze, majd 30 perc múlva az elegyet 100 yul vízzel hígítjuk. A kivált anyagot centrifugáljuk, a zöld felülosztó oldatot C jelű oszlopra visszük, majd i jelű oldószerrendszerrel (35-50 % B, 40 perc) eluáljuk és így izoláljuk a (14) jelű métalopeptidet (4,1 mg). D jelű oszlopon i jelű oldószerrendszerrel (40-85 % B, 30 perc) vizsgálva a peptid tisztának bizonyul és a retenciós ideje 11,2 perc.

• · « ··« • * ···

A B eljárás szerint 30 mg szabad intermedier peptidet (IIA előállítás) reagáltatunk 7,4 mg előre kialakított bisz(szalicil-aldehideato)-réz(II) vegyület [Y. Nakao és A. Nakahara, Bull. Chem. Soc. Japan 46, 187 (1973)] 300 yul 90 %os vizes DMF-oldatával, amely nátrium-acetátot tartalmaz (2 mg). A reakciót 48 órán át vezetjük le. A peptid-SAL rézkomplexet C jelű oszlopon választjuk el iii oldószer-rendszert alkalmazva (40-60 % B, 40 perc). Az így kapott (14) jelű peptid (7,6 mg) az A eljárással előállított peptiddel megegyező retenciós idővel és UV-spektrummal rendelkezik.

CISAL-lal ellátott (15) jelű peptidet állítunk elő a B eljárással a következők szerint:

mg intermedier peptid TFA sót (IIA előállítás) reagáltatunk 48 órán át 3,9 mg bisz-(5-klór-szalicil-aldehidáto)-réz(II) vegyület NaOAc pufferát vizes DMF-oldatában. A reakciókeveréket C jelű oszlopon kromatografáljuk eluensként az iii oldószerrendszert (45-70 % B, 50 perc) alkalmazva. Az izolált zöldes színű peptid (4,1 mg) retenciós ideje 11,4 perc volt, amikor azt D oszlopon ii jelű lineáris gradienst!

oldoszerrendszerrel (45-90 % B, 30 perc) vizsgáltuk.

9. példa t i

MTX-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 ( i

MTX-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2

I-----------------------------------------------------------------------1

MTX-D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2 (16) (17) (18) « ···

- 47 • · · · • · • ♦ · · ··«· ·· ··«· ·*·

A (16) peptidet tartalmazó antimetabolit szintézise során

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(FMOC)-Val-Cys-Thr-NH₂-t (IIA előállítás) metotrexáttal végzett acilezésével állítjuk elő. 5,6 mg metotrexátnak 100 yul DMF-ben készült oldatához ekvivalens mennyiségű diizopropil-karbodiimidet adunk. 15 perc után az elegyet összekeverjük 14 mg peptidnek semlegesített oldatával (DMF) majd az elegyet egész éjen át 0 °C-on tartjuk. Az FMOC védőcsoportot 50 /ul piridinnel való kezeléssel eltávolítjuk, majd a peptidet C jelű oszlopon i jelű oldószerrendszer alkalmazásával (25-50 % B, 50 perc) eluáljuk. Két peptidet detektálunk és izolálunk, melyek retenciós idejei 14,9 illetve 15,4 perc. Ezek a vegyületek a metotrexát a-karboxil- vagy karboxilcsoportján acilezett származékok és ezt a D jelű oszlopon i jelű oldószerrendszer (30-50 % B, 20 perc) alkalmazásával vizsgáltuk meg.

A (17) és (18) peptideket a fentiekkel egyező módon állítottuk elő azzal az eltéréssel, hogy kiindulási anyagként t1

D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys(FMOC)-Thr-Cys-Thr-NH₂-t(IIC előállítás) illetve l1

D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys(FMOC)-Thr-Cys-Thr-NH₂-t (IID előállítás) alkalmazunk.

10. példa l1

Azy-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂ • · · · · * · « 4 « « ·· »*····* ··

A nonapeptidet a D-Phe-Cys(MBzl)-Tyr([Z(2-Br)]-D-Trp-Lys-[Z(2-C1)]-Val-Cys(MBzl)-Thr(Bzl)-BAH-gyantának (az IA előállítással kapott vegyület N-terminális aminocsoportjának védőcsoport-mentesítésével kapjuk) Trt-Azy-val történő kapcsolásával állítjuk elő.

A peptid-gyantátn HF/anizol-oldattal kezeljük, majd a diszulfid hidat jóddal végzett oxidálással állítjuk elő. A liofilizált reakciókeveréket ii oldószerrendszerrel (70-100 % B, 60 perc) végzett HPLC tisztításnak vetjük alá.

11. példa

I--------------------------------------------------------------------------------<

EPP-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2

A cím szerinti peptid előállítása során a D-PheI----------------------------------------------------------------1

-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2~t epibróm-hidrinnel alkiláljuk. 25 mg peptidnek (VA előállítás), 200 /ul DMF-ben készült oldatához 6 /ul TEA-t és 2 yul epibróm-hidrint adagolunk. A reakciókeveréket 24 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd ezt követően a peptidet éterrel kicsapatjuk. 30 %-os DCM-ben készült TFA-oldattal távolítjuk el a védőcsoportokat, majd a terméket C jelű oszlopon ii jelű oldószerrendszer (25-55 % B, 60 perc) alkalmazásával kromatogra f á1j uk.

12. példa i---------------------------------------------------------------1

HMAQG-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 »4* «««*· ·'

- 49 A cím szerinti peptidet ________________________|

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2~ -nek antrakinon-2-metil-hemiglutaráttal karbodiimid jelenlétében végzett kapcsolással állítjuk elő. 10,6 mg antrakinon-2-metil-hemiglutarátot és 4,6 mg HOBt-t oldunk 300 yul DMF-ben, majd az elegyet 0 °C-ra hűtjük és 3,4 yul DIC-cel reagáltatjuk. 15 perc elteltével az oldatot 25 mg D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂ (VA előállítás) 200 /ul DMF-ben készült hideg oldatával keverjük össze, majd az elegyet 24 órán át 0 °C-on állni hagyjuk. A peptidet dietil-éterrel kicsapatjuk, majd a Boc védőcsoportot 30 %-os TFA-val végzett kezeléssel eltávolítjuk. Bepárlást követően a terméket C jelű oszlopon i jelű oldószerrendszerrel tisztítjuk.

13. példa

1--------------------------------------------------------------------------1

NQCE-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2

A cím szerinti vegyületet a

I---------------------------------------------------------------------------------1

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2~nak (VA előállítás) 5-(3-klór-propioniloxi)-1,4-naftokinonnal végzett alkilálásával állítjuk elő. 25 mg VA előállítás szerinti peptidet 200 /ul DMF-ben oldunk, majd 1,2 ekvivalensnyi 5-(3-klór-propioniloxi)-naftokinont adagolunk ekvivalens mennyiségű K2CO3 jelenlétében, majd a keveréket 24 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A sókat kiszűrjük majd a Boc-védett peptidet éterrel kicsapatjuk, majd védőcsoport-mentesítést hajtunk végre DCM-ben készült 30 %-os TFA oldattal. A nyers peptid-naftokinon• · · ·

- 50 konjugátumot C jelű oszlopon i jelű oldószerrendszerrel HPLC tisztításnak vetjük alá.

14. példa

1---------------------------------------------------------------------------------1

MIT-Glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂

A cím szerinti vegyületet a Mitomycin C-nek i 1

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(FMOC)-Val-Cys-Thr-NH₂-vel végrehajtott acilezésével állítjuk elő. 27,5 mg VI. előállítás szerinti vegyületet 200 yul DMF-ben oldunk, majd 7 yul Mitomycin C-vel és 4 yul DIC-cel reagáltatjuk 2,8 /ul TEA és 3,3 yug HOBt °C jelenlétében egész éjen át. Az FMOC csoportot 50 %-os piridinnel 30 percen át végzett kezeléssel távolítjuk el. A peptid-mitomycin C konjugátumot C jelű oszlopon ii jelű oldószerrendszert alkalmazva tisztítjuk.

15. példa

I--------------------------------------------------------------------------------1

ESP-Glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂

A cím szerinti vegyületet D-Phe-Cys-Tyr-D-TrpLys(FMOC)-V^L-Cys-Thr-NH₂ előre kialakított hemiglutarileszperamicinnel (nem azonosított acilezési pozíció(k)) végzett kapcsolással állítjuk elő. 2 mg hemiglutarileszperamicinnek 100 /ul DMF-ben készült oldatát és 1,3 mg HOBt-t 0 °C-ra hűtünk és 1 /ul DIC-cel reagáltatunk. 10 perc elteltével 12,5 mg IIA előállítás szerinti peptidet • · ·

- 51 adagolunk 50 /ul DMF-fel semlegesítve, majd a reakciókeveréket 24 órán át °C-on tartjuk. HPLC módszerrel számos terméket izolálunk (C jelű oszlop, ii jelű oldószerrendszer).

16. példa i-----------------------------------------------------------------------1

D0X-Glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 A cim szerinti peptidet a doxorubicin amino cukorcsoportjának a

Glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2“nek glutarilcsoportjához való kapcsolásával állítjuk elő. 27,5 mg (VII) előállítás szerinti vegyületet 200 yul DMF-ben oldunk, majd 14 mg doxorubicinnel és 4 ml DIC-cel reagáltatjuk 2,8 yul TEA és 3,3 /ul HOBt jelenlétében 0 °Con egész éjen át. A reakciókeveréket C oszlopon, i jelű oldószerrendszerrel (40-70 % B, 60 perc) végzett HPLC tisztításnak vetjük alá.

17. példa

A találmány szerinti peptideknek biológiai hatásait, receptor kötődési képességüket, citotoxikus aktivitásukat az 1- 4. táblázatok foglalják össze.

Az 1. táblázat mutatja be a találmány szerinti vegyületeknek növekedési hormon kibocsátást gátló aktivitását szomatosztatin(1-14)-hez viszonyítva, in vitro vizsgálva diszpergált patkány hipofízis szuperfuzionált sejtrendszerben [S Vigh és A. V. Schally, Peptides 5, 241247 (1984)]. Az 1. táblázat tartalmaz még adagokat ezeknek a vegyületeknek patkány agykéreg és patkány prosztata tumor • ·

- 52 (Dunningt R3327H) receptor membránokhoz való affinitásukról.

A 2. táblázat adatai mutatják a (7) jelű peptidnek a 3T3 fibroblaszt sejtek növekedésére való hatását spektrofotometriás módszerrel mérve. 10⁵ sejtet növesztünk DME-ben készült 10 %-os NCS oldatban 96 lyukú tányéron, a sejteket poli-D-lizinnel kezeltük előzetesen, és hagytuk a sejteket erősen letapadni. A sejteket 3 napon át kezeljük úgy, hogy naponta cseréltük a citotoxikus peptideket 1-10 000 ng/ml koncentrációban. Az inkubálási periódust követően metabolikus festéket, MTT-t (3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]2,5-difenil-2H-tetrazolium-bromid) adagolunk, majd élő sejtek lila formazán színének kialakulása után 590 nm-en mérjük az abszorbanciát (4. nap).

Ismert számos sejttel előzetesen végrehajtott standardizálással következtetünk az abszorbanciából az aktuális élő sejtszámra.

A 3. táblázat mutatja be a ³H-timidinnek

DNS-be való beépülésének szomatosztatin analógokkal történő gátlására vonatkozó adatokat, humán pankreatisz MiaPaCa rákos sejtvonalon tenyésztve. A 0. napon lxlO⁵ sejtet viszünk tányérokra 10 % magzati borjúszérumot (FCS-t) tartalmazó DME közegben. 24 óra múlva a közeget eltávolítjuk és szérum nélküli DME közeggel helyettesítjük azt, majd 2 napon át 37 °C-on végzünk inkubálást. Ezt követően a közeget eltávolítjuk és 5 %-os FCS tartalmú DME közeggel helyettesítjük, amely vagy tartalmaz szomatosztatin analógot vagy nem. A peptideket tartalmazó közeget naponta cseréljük 4 napon át. A negyedik napon egy yuCi ³H-timidint adagolunk, * · • · · majd további 17 órán át folytatjuk az inkubálást. Ezt követően a közeget eltávollítjuk és a sejteket tripszinálással feltárjuk. A DNS-t 1 n perklórsavval extraháljuk és a rádióaktivitást mérjük.

A 4. táblázat tartalmaz adatokat arra vonatkozóan, hogy a szomatosztatin analógok hogyan gátolják a ³H-timidin beépülését H-69 kis sejtű tüdőrák sejtvonalak DNS-ébe.

6,5xl0⁴ sejtet viszünk be steril polipropilén tubusokba 10 % lószérumot és 5 % magzati borjúszérumot tartalmazó RPMI-1640 közegben. 3 nap után adagoljuk a szomatosztatin analógokat, majd 5 napon át inkubálunk 37 °C-on. A negyedik napon 1 /uCi triciumozott timidint adagolunk, majd az 5. napon a sejteket mossuk, üvegpapírra gyűjtjük, 10 %-os vizes triklórecetsawal, majd etil-alkohollal mossuk, végül folyadékszcintillációs számlálóval beütésszámot mérünk.

1. táblázat

Citotikus csoportot hordozó szomatosztatin analógok GHfelszabadulást gátló és receptörkötődési aktivitása

Peptid száma	Gátló aktivitás	Affinitási konstans* **
patkány agykéreg	Dunning tumor
SS-14	12.0	15.795	1.378

1.	26.0	13.355	0.188
3.	7.2	0.032	N.
4.	0	0.744	N.
5.		18.790	N.
6.		N.B.	0.111
9.		5.371	0.694
10.		' N.	0.459
11.		N,	N
12.	44.6	49.529	1.947
13.		N	0.115
14.	7.3	166.035	0.004
15.	38.5	4.027	0.277
16A.	30.5	11.396	0.642
16B.	26.4	3.287	9.589

* GH-felszabadulást gátló aktivitást 200 nM-nél ellenőriztük ** [1251-Tyr¹]szomatosztatin(1-14)-et alkalmaztunk címkézett ligandumként

N.K.: nincs kötődés

- 55 2. táblázat

A 7 jelű peptideknek a 3T3 fibroblast sejtek növekedésére való hatása MTT spektrofotometriásán vizsgálva

Vegyület	Dózis	Abszorbancia	%-os csökkenés
Kontroll	—	0.252	0
7 jelű peptid	10	0.125	50*
	100	0.192	24*
	100	0.206	18*
	1000	0.186	26*
	10000	0.121	52*

* p < 0,01 Duncan-féle meghatározás (multiple rangé test)

3. táblázat

A 7 jelű peptideknek és melfalannak MiaPaCa sejtek növekedésére való hatása sejtszámlálással és ³H-timidinnek DNS-

-be való	beépülésével meghatározva
Vegyület	Dózis	%-os sejtszám-	3H-timidin
		csökkenés	beépülésének %-os gátlása
Kontroll	0	—	—
7 jelű peptid 10® M	22**	68**
	10’7M	33**	63**
	ΙΟ8 M	35**	53**
Melfalan	W6 M	29**	20
	10’7M	1	18
	W8 M	1	—

- 56 * <0,05 Duncan-féle meghatározás (multiple rangé test) ** < 0,01

I

- 57 • · · · ·· · • · · · * · · ···· ·· ···· ··· ··

4. táblázat

A 9 jelű peptidnek hatása ³H-timidinnek SCLC H-69

sejtvonal	DNS-ébe való beépülésén vizsgálva
Vegyület	Dózis %-os gátlása a	P*
	3H-timidin beépü-
	lésének

Kontroll 0	0
7 jelű peptid ]	37	0.01
10	34	0.01
-100	25	0.01
1000	29	0.01
10000	36	0.01

* a szignifikanciát a

Duncan-féle meghatározás (multiple rangé test) teszttel határoztuk meg.

Claims (13)

1. A Q-R¹-Cys-R³-D-Trp-Lys-R⁶-Cys-R⁸-NH₂ képletű vegyületek,ahol

R¹ jelentése L vagy D-Phe, D-Trp, L vagy D-Mel,

R³ jelentése Mel, Tyr vagy Phe,

R⁶ jelentése Thr vagy Val,

R⁸ jelentése Thr, Trp vagy Mel,

Q jelentése hidrogénatom, L- és D-Mel, Mel-Mel dipeptid, ciklopropán-alkanoil, aziridin-2-karbonil-, metotrexoil-, 1,4-naftokinon-5-oxi-karbonil-etil-, epoxi-alkil-csoport valamint ezek Ω-karbonil-alkil-amino-származékai, továbbá az Ω-karbonil-alkanoil-származékai a 2-hidroxi-metil-antrakinonnak, doxorubicinnek, eszperamicinnek vagy a mitomicin C-nek, ahol az Ω-karbonil-alkil-aminocsoport a -CO-(CH₂)_n -NH- képlettel jellemezhető, ahol n jelentése 2-6, és az Ω-karbonil-alkanoil-csoport a -CO-(CH₂)_n -CO- képlet jellemezhető, ahol n jelentése 2-6 és gyógyászatilag elfogadható savakkal és bázisokkal képezett sóik.

I I

2. A Q¹-A-R¹-Cys-R³-D-Trp-Lys-R⁶-Cys-R⁸-NH₂ képletű vegyületek, ahol

R¹ jelentése L vagy D-Phe, L vagy D-Trp,

R³ jelentése Phe vagy Tyr,

R⁶ jelentése Val vagy Thr,

R⁸ jelentése Thr vagy Trp,

A jelentése egy

-HNCH₂-(CH₂)_m-CH(NH)-(CH₂)_n-C0- (III) általános képletű diamino-acil-csoport ahol m jelentése 0 vagy 1 és n jelentése 0 vagy 1,

Q¹ jelentése Q² vagy (B2)Q³ vagy (Q⁴)2 csoportok - ahol

Q² jelentése Pt(Y)₂ ahol Y jelentése egy gyógyászatilag elfogadható savból származó anion,

Q³ jelentése egy nem platina fém csoportbeli fém, előnyösen titán, vanádium, vas, réz, kobalt, arany, nikkel, kadmium vagy cink,

Q⁴ jelentése L- vagy D-Mel, Mel-Mel dipeptid, ciklopropán-alkanoil-, aziridin-2-karbonil-, epoxi-alkil-, 1,4-naftokinon-5-oxi-karbonil-etil-csoport vagy azok Ω-karbonil-alkil-amino-származékai, vagy az Ωkarbonil-alkanoil-származékai a 2-hidroxil-metil-antrakinonnak, doxorubicinnek, eszperamicinnék és mitomicin C-nek, ahol az Ω-karbanoil-alkil-amino-csoport a

-CO-(CH₂)-NHáltalános képlettel jellemezhető, ahol n jelentése 2-6, és az Ω-karbonil-alkanoil-csoport a

-CO-(CH₂)-C0általános képlettel jellemezhető, ahol n jelentése 2-6,

B jelentése egy szubsztituált aralkilidén- vagy heteroaralkilidén-csoport, amely lehet halogénatommal vagy nitrofenil-csoporttal szubsztituált kis szénatomszámú ···«

99 9999 9*99

I V * · « « 4 Α·« · · * « · ♦ ·« ·*·* ··· ·* <

- _ - 60 * alkilidén, kis szénatomszámú alkil-hidroxi-metil- vagy foszforoxi-metil-piridil-csoporttal szubsztituált kis szénatomszámú alkilidén, ahol a kis szénatomszámú alkil megnevezés 1-6-szénatomos részt jelöl és gyógyászatilag elfogadható savakkal és bázisokkal képzett sóik.

3. Az 1. igénypont szerinti peptid, ahol R¹ jelentése DPhe, R³ jelentése Tyr vagy Mel, R⁶ jelentése Val, R⁸ jelentése Thr vagy Mel, Q jelentése hidrogén.

4. Az 1. igénypont szerinti peptid, ahol R¹ jelentése Mel, R³ jelentése Tyr, R⁶ jelentése Val, R⁸ jelentése Thr,

Q jelentése hidrogén.

5. Az 1. igénypont szerinti peptid, ahol R¹ jelentése DMel, R³ jelentése Phe, R⁶ jelentése Thr, R⁸ jelentése Thr,

Q jelentése hidrogén.

6. Az 1. igénypont szerinti peptid, ahol R¹ jelentése Lvagy D-Phe, R³ jelentése Phe, R⁶ jelentése Thr, R⁸ jelentése Thr és Q jelentése Mel.

7. Az 1. igénypont szerinti peptid, ahol R¹ jelentése D-Phe, R³ jelentése Tyr, R⁶ jelentése Val, R⁸ jelentése

Thr vagy Trp és Q jelentése Mel.

8. Az 1. igénypont szerinti peptid, ahol R¹ jelentése D-Trp, R³ jelentése Phe, R⁶ jelentése Thr, R⁸ jelentése

Thr és Q jelentése Mel.

9. Az 1. igénypont szerinti peptid, ahol R¹ jelentése D-Phe, R³ jelentése Tyr, R⁶ jelentése Thr, R⁸ jelentése

Thr és Q jelentése Mel-Mel vagy MTX.

10. Az 1. igénypont szerinti peptid, ahol R¹ jelentése D-

-Phe vagy D-Trp, R³ jelentése Phe, R⁶ jelentése Thr, R⁸ jelentése Thr és Q jelentése MTX.

11. A 2. igénypont szerinti peptid, ahol R¹ jelentése DPhe, R³ jelentése Tyr, R⁶ jelentése Val, R⁸ jelentése Thr vagy Trp, A jelentése A₂pr or A₂bu, Q¹ jelentése Q², ahol Q² jelentése PtCl₂.

12. A 2. igénypont szerinti peptid, ahol R¹ jelentése DPhe, R³ jelentése Tyr, R⁶ jelentése Val, R⁸ jelentése

Thr vagy Trp, A jelentése A₂pr vagy A₂bu, Q¹ jelentése (B2)Q³, ahol Q³ jelentése réz(II) vagy nikkel(II), B jelentése 2-O-benzilidén, fluor-, klór-, nitro-2-0-benzilidén-, 2-metil-3-0-5-hidroxi-metil- vagy foszforoxi-metil-4-pikolidén.

13. A 2. igénypont szerinti peptid, ahol R¹ jelentése D-Phe, R³ jelentése Tyr, R⁶ jelentése Val, R⁸ jelentése

Thr vagy Trp, A jelentése A₂pr vagy A₂bu, Q¹ jelentése (Q⁴)₂, ahol Q⁴ jelentése L- vagy D-Mel.