HU228496B1

HU228496B1 - Non-pathogenic mutant e.coli strains, process for production and use thereof

Info

Publication number: HU228496B1
Application number: HU9800094A
Authority: HU
Inventors: Alain Milon; Rycke Jean De
Original assignee: Envt Toulouse; Agronomique Inst Nat Rech
Priority date: 1997-01-20
Filing date: 1998-01-20
Publication date: 2013-03-28
Also published as: FR2758568B1; HU9800094D0; EP0864644A1; EP0864644B1; HUP9800094A3; DE69831888T2; DE69831888D1; ES2251760T3; HUP9800094A2; FR2758568A1

Description

A találmány tárgyát új, nem-patogén. £. coli mutánsok képezik# amelyek különösen alkalmasak fiatal nyulakban coiibacillozist megelőző vakcinák előállítására.

A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti mutánsok alkalmazása vakcinák előállítására.# valamint a. találmány szerinti mutánsokat tartalmasó vakcinák.

A fiatal# elválasztott nyulak hasmenésének fő oka a colibacillózís. 'Ez a betegség fontos halál-okot jelent a tenyésztő egységekben és kutatásokat folytattak annak érdekében# hogy hatékony vakcinát állítsanak elő. A máig kifejlesztett fő vakcinációs stratégiák nem patogén vagy kismértékben patogén inaktiváit homológ törzseket vagy élő heterológ törzseket alkalmaznak# amely törzsek lokális inmunválas2t .indukálnak fantí iípopollszaccharid A íxaraungiobulinok indukciója) és/vagy ökológiai barrier effektust váltanak ki# amelyet a patogén 0103 törzsekkel szemben gyakorolnak.

Aktaszámunk; 87220-3568/FÁ

Eddig azonban egyetlen stratégia sem eredményezett teljesen ártalmatlan vakcinát, amely teljes védelmet nyújtana. A kutatás tehát folytatódott azon mechanizmusok azonosítására, amelyek néhány E. coli törzs patogenitásáért felelősek.

Az ember számára enteropatogén E. coli törzsek (vagyis az .EP.EC törzsek), amelyek kisgyermekek hasmenéséért felelősek, képesek specifikus foélhám léziók kiváltására, amelyet „öss zekapcsolődási-kitőrlesi láziénak („a11achment-effacement 1esiοn, azaz A/E-i ézló) neveznek,

Sgy összkapcsolódási-kitörlés.i femotipust, amely korrelál egy, a HeLa vagy Hep-2. sejt vonal epitelíális sejtjein végrehajtott in vitro vizsgálattal, vagyis a FÁS (fluoreszcens aktin festés”) teszttel, definiáltak .humán EPEC törzsekben. Ebben a vizsgálatban a sejtekhez lokalisáltan tapadó sejtek az adhéziós centrumokban polimerizált aktin tömörüléshez vezetnek, amelyet egy fiuorokrómfooz [Knutton és mtsai, Infect. Immun. 57, 1290 (1989)) kapcsolódó phalloidinnel detektálunk. Ennek az összekapcsolódásikitörlési fenotipusnak a főbb determinánsait egy LEE nevű lókusz <enterocita kitörlési lókusz) kódolja [McDaníel és mtsai, Proc. Natl.Acad. Scí,, 92, 1664 (1995)).

Megfigyelték, hogy a fiatal nyulak hasmenéséért felelős E. coli törzsek képesek arra, hogy a húsán EPEC törzsek által okozo11 összekapcsölőőási-kitör1ési léz.íöhoz hasónló lésiót váltsanak ki (Licoís és mtsai.., Infect. Immun., 59, 3796 (1991); Moon és mtsai, infect. Iwun., 41, 1340 (1.983); Peeters és mtsai.., Vet. Pathol., 22, 54 (1.985);

« « * « V

Takeuchí és mtsai., Infect. Imnn., 19, 686, (1978) ] , Eteket

ο; risztté	törzseket	egy	es szerzők [..Robins-Srowne
mtsai, Infect	. Immun.,	62,	3336 <19 9 4); Rofoi ns-Browne
m t s a i, 1 n f e c t	. Immun<,	62,	1584, (1994)] szokták RE'
törzseknek is	nevezni (”	nyűi	ί·ρκ·<» í 4-» i. { Λ

A 35 kpb-s kromoszomális lókusz homológját, amelynek létét eredetileg humán eredetű. EP.SC törzs prototípusban mutatták ki, vagyis az E2348/69-et .megtalálták [Karao'lis és mtsai, in Pröceedings: of the First International Rus'hmore Conference on Mechanisms in the Pathogenesis of Enteric Diseases*', Rapid City, 5.D., (1995); McDaniel és mtsai, Proc. Natl . Acad. Sci , , 92, 1664, (1.9.95)] a referencia REREC törzsben, amelyet RDEC-l-nek neveznek (O15.:H- serovar) és amelyet eredetileg Cantey és Blake írtak le (Infect. Dia,, 135, 454, (1977)].

Egy intíminnek nevezett., 96-100 kDa-os külső memhzénprotein, amelyet humán EPEC törzsének LEE-lótuszában levő eaeA nevű. gén kódol, részt vesz az összekapcsolásikitörlés 1 lézi-ók kialakulásában (Jerse és mtsai., Infect. immun., 59, 4302 (1991)1. Donnenberg és mtsai (J. Clin. Invest., 92, 1412 <1993)1 tanulmányozták az eaeA-gén szerepét a patogenításban. E2348/69 törzset teszteltek 11 önkéntesben, akiknek orálisan 2,10-^ CFU adagot adtak. Tizenegy további önkéntesnek ugyanolyan adag izogén eaeA mutánst adtak. Ar eredmények demonstrálják. az eaeá-gén szerepét a vírulencíában, ezért indirekt módon, a korrelációt az A/Eléziók, FAS-pozitiv fenotípus és az LEE-lökusz között (amely abban az időben, nem volt ismert) , valamint a viru»e * *

X >

«Α ***· i énei a között, isivel akkoriban úgy -gondolták/ hogy egyedül az eaeA-gén játszik szerepet a.z A/E~lézió kialakulásában és a FAS-pozitiv fenotipus .megjelenésében. & mutáns maradék patogenítása azonban azt mutatja, hogy az eaeA-gén mellett más virulene.tagénak is érintve vannak.

Ezenfelül az eaeA-gén jelen van a mem-entercpatog-én coli törzsekben is [Cantey és Moseley, Infec. lmun., 59, 3924 (1991); Leory és mtsal, J, Med. Mícrobio.1., 40, 90 ( i 9 9 3 ; ] .

Az intixaint ködoró eaeA-gén egy analógiát különböző nyúl ,F. coli törzsekben kimutatták [Ágin és Wölí, In: Proceedings of the First International Rushmo-re Conference on Me-chanísms in the Fathogenesis of Enteric Diseases”, Rapid City, S.D., 43. old. (1995); Leroy és mtsai, a. bed. bicrobiol., 40, 90 (19939; Pohl és latsai., Infect-. Immun., 61, 2203 (1993)].

hyugst-berópában végzett 'epidemiológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a nyulak elválasztása során fellépő, hasmenésért felelős törzsek számos szérumcsoporthoz tartoznak, amelyek közül a leggyakrabban előforduló szérumcsoport a 0103 {Blanco és mtsai. Vet. Microibiol., 38, 193 (1994)?

CanguiIhem és Milon, J. Clin. Microbiol.-, 27, 743 (1989) ].

Az 0103 törzsek (amelyek ezenfelül rendelkeznek azzal a megkülönböztető tulajdonsággal, hogy nem fermentálják a ramnözt) az emésztési úton való kísérleti inokuláciöt követően nagyon pató-gének nyarakban és olyan összekapcsolódási-kitörlési iéziót okoznak [lioois és mtsal, Infect. Immun., 59, 3796 (1991); Fohl és latsai, Infect. Immun.,- 61, 2203 «« ««« (1993); Bobins-Broune ss mtsal, Infect. Immun,, 62, 3329 (1994); Robins-Browne ss mtsal# Infect. Immun,, 62, 1584 (1994)], amelyek kinézetre hasonlók az emberi eredetű EPEC törzsek által okozottakhoz< A lézió létrehozásának ez a kritériuma, amely azzal a ténnyel együtt# hogy ezen törzsek kromoszomalis DNS-e hibrid!zálódik a humán EPEC referencia törzs eaeA~génjére specifikus próbákkal [Leroy és mtsal, u. Med. Microbiol., 40, 90 (1993); Pohl és mtsaí, Infect. Immun.# 61, 2203 (1993)]# mint az RDSC-1 törzs esetében# talán megengedi azt a· feltételezést# hogy ezek a törzsek emlékeztetnek az EPEC (vagy RSBEC) törzsekre. Az 0103 törzsekben azonban az eaeá-génsn kívül az LEE-iokuss egyetlen más génjével való homo légi a sem mutatható ki.

Az E. coli 0103 törzsek specifikus adhezíut állítanak elő, amelyet AE/R2-nek neveznek, amely képessé teszi a baktériumokat arra, hogy ho2zátapadjanak a nyűi enterocitákhoz és a fíe.La és Hep·-2 sejtvonala.k sejtjeihez [Miion és mtssi., Infect. Immun. 58, 2690 (1990)).

Kimutatták# hogy ez az adhezin hozzájárult a 0103 törzsek patogenitásához. fiatal nyulakban. Ezt ügy mutatták ki, hogy összehasonlították az 0103 .szérumcsoport reprezentatív törzsének (amelyet B10 törzsnek hívtak) patogenitását ennek a törzsnek egy mutánsával, amely elvesztette adhéziós tulajdonságát annak következtében# hogy az AB/R2 adhezínt kódoló operádba Tn5::phoA transzpozont inzertáltak [Piliien és mtsal, Vet, Microfoiol.. # 50, 105 (1996)]. Javasolták, hogy ezeket a mutánsokat használják, vakcinaként [Chalareng és mtsal, Communicatíon. aux. γτ·¹^© journées de l.a. recherche cnnicole (VI. nyílt nyűi-kutatási találkozó közleményeij ? La Rochelle, december 6 és 7, 1994, INRA-ITAVI-ASCF Publ.}.

Annak érdekében, hogy tisztázzuk a hasonlóság mérté-

két az	coli 01.03	törzsei és
között, vi	zsgáltuk	az 0103 tör
ennek oka	az vort.	hogy a FÁS
non, mint	.ami ka;	ocsolatban
lókuszával	(McDaníe	1 és mtsai,
1664 (1995	« J *

áll az EP.EC törzsek LEEProc. háti, Acad, Sci., 92,

Valójában azt találtuk, hogy a BIO törzs negatívan reagált a FÁS tesztre, miközben a RDEC-1 REPEC törzs, valamint a humán EPEC törzsek pozitív reakciót adtak azonos kísérleti feltételek mellett,

Másrészt azonban meglepd módon azt találtuk, hogy a BIO törzs újabb citopatikus hatást (CPE) hozott létre a BeLa sejtvonal epitelíáiís sejtjein, amely a cito-szkeleton és a fokális adhéziós plakkok reorganizációjában (átrendeződésében) nyilvánult meg. Akárcsak a FÁS típusú válasz esetében, ez a CPE Is összefüggésben volt a celluláris akt in intenzív polímerizációjávai. Ellentétben azonban .azzal, amit a PÁS típusú válasz esetében megfigyelünk, a polimerizált aktín nem válik lokalizálttá a bakteriális érintkezési pontokon, .hanem kábelek formájában rendeződik, amelyek áthúzódnak a sejt egyik végétől a másikig, A citoszkeleton ilyen módosulásai határozottan és megfordíthat atlanui nőnek az idő múlásával.

Ezen felül az aktin kábelek kialakulását a vinkulin mennyiségének fokozatos növekedése kíséri, amely jelenséget «» * φφ a FÁS típusú válasz esetében nem lehet megfigyelni [Finlay és latsai.-, Infect, Immun., SO, 2541 (19-92)] . A kontroli sejtekben a vínkulin pontszerű tömegek formájában van jelen, amelyek a sejtek kontúrján jelennek meg, míg a BIO hatásának kitett sejtek esetében a vínkulin az egész sejtfe'lszln mentén oszlik el, a pontszerű eloszlásbői majdnem szálas eloszlássá alakulva, ami emlékeztet az aktin kábelekre. A cítoszkelaton ilyen módosulása. együtt jár a sejtosztódás .leállásával és a sejtméret bizonyos fokú növekedésével. Miközben a. citosztázis hosszú ideig tart, a sejtek halálához vezet egy 5-6 napos periódus végén.

Más törzsek vizsgálatakor azt találtuk, hogy ez a CBE kifejeződött (expresszálödott) minden ramnoz-negativ 0103 törzsnél éppúgy, mint a RDEC-1 törzsnél. Ugyanúgy megfigyeltük ezt kőt humán eredetű klinikai EPEC ízoiátumban. Ezzel, ellentétben a humán eredetű referencia törzs, vagyis S2348/69, azonos körülmények között vizsgálva- nem mutatott semmilyen detektálható CPE-t.

Az erre a CPE-re jellemző cit-o-szkeleton változás emlékeztet arra, amelyet a CNF és CNE2 B. coli toxinok váltanak ki föswaid és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sói. USA, 91, 3811 (1994)1 . Nem találtunk azonban a Slö-ben semmi olyan gént, amely homológ lett volna az coli CNFÍ-gyel és

CNF2-vei> Ezenfelül, miközben a CN'F-ek aktivitása detektálható a CNF-efc termelő törzsek kultúráinak lizátumaifoan, a BIO kultúrák üzátumaiban nem lehetett semmilyen aktivitást detektálni. Az azonban lehetséges, hogy a CPE-hez vezető mechanizmus, amelyet a BIO indukál, hasonló a CNF toxincké»χ 4 ♦*#* ♦' ♦ ♦ « »*« Λ ♦ > * hoz, amely utóbbi hatásmechanizmus összefügg a Rho aktiválásával, amely a citoszkeleton és a fokális adhézió centrumai szabályozásában résztvevő kis G-pro-fcein {Elínn és Hídley, J. Cell. Sci., 1.Ö9, 113 3 (1996) j .

Párhuzamosan számos 0103 törzs (köztük a prototípus 810 törzs) kromoszomális DbS~ét híbridizáltuk a törzs 35 kb

LES vi.ru.lenc.ia egységéből származó négy próbával, és összehasonlítottuk a 0103 törzsek és az £2348/69 törzs által a kultúra-közegbe ürített (kiválasztott) proteineket oly módon, hogy analizáltuk megfelelő eiektroforetikus profiljaikat valamint kereszt immnn-precípítácíóvai. A 0103 törzsekben demonstráltuk egy iőkusz jelenlétét, amely homológ az 83348/69 LSE virulencia-egységgei, bár mutat némi szerkezeti különbségeket is az utóbbival összevetve (amely különbségeket a DNS restrikciós helyek polimorfiájával mutattunk ki, valamint a kiválasztott proteinek eiektroforetikus migrációjának kisebb különbségeivel). Szt a iőkusz az EPECtörzsekben, amely analóg az LEE-vei, a következőkben ugyancsak ”LEB~lókusznak” fogjuk nevezni.

Azt is megfigyeltük, hogy ez a CDS korrelált a 0103 törzsek in vivő patogenitásával.

Az E. coli O103~mal kezdve olyan törzseket konstruáltunk, amelyek ennek az LEE-lökusznak a mutációit hordozták és megfigyeltük, hogy egy törzs, amely ennek az LEElókusznafc az egyik génje inakfcíváiödott, már nem váltja ki a CPE-t és elveszti patogenitását, bár megtartja az AF/R2 adhezint és képes marad a bél kolonizálására. ügy tűnik tehát, hogy az 0103 törzsek LEE-lökusza olyan genetikus deχ* ♦ * ♦ *

Φ X

♦.» ♦·»·*' Φ terminánsokat hordoz, amelyek felelősek a CPE-ért és a patogenitásért.

Végül megvizsgáltak ezen LES-lókosz mutánsok immunogén tulajdonságait és azt. találtuk# hogy ezek a mutánsok nagyon hatékony védelmet ruháztak át a patogén szülő-törzzsel szemben.

Jelen találmány tárgya eljárás E, coli uem-patogén mutánsának előállítására E. coli olyan patogén mutánsából, amely képes citopatogén hatást kiváltani Héra epiteliáiis sejtekben# amely hatás részint abban nyilvánul meg# hogy polimerizált aktinból kábelek képződnek, amelyek az említett sejteken egyik végüktől a másikig áthúzódnak, részint abban, hogy nő a vínknlin mennyisége, azzal jellemezve, hogy a patogén E. coli törzs mutageni zá.l t és .hogy a citophatikus hatást kiváltani már nem képes mutánsok kerülnek kiválasztásra.

A 310 törzset, amelyet 1997. január 15,-én 1-1807' szám alatt letétbe helyeztünk a Coiiectíon Nafcionale de Cultures de Microorganísmes-néi ÍCKMC) [Mikroorganizmus kultúrák francia nemzeti gyűjteménye], 28, Rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CSDEX 15, csak példaként említjük azokra a patogén E. coli törzsekre, .amelyek képesek kiváltani a fent említett cítopatikus hatást, és amelyeket éppen ezért kiindulási anyagként alkalmazni lehet a találmány szerinti e I j á r ás as g va .1 ó s i t á s áná 1.

A találmány ugyancsak magába foglalja az Et coli olyan nem-patogén mutáns törzseit, amelyek az említett eljárás segítségével kaphatók. Ezek a törzsek legalább egy fi * * ·< Φ»Χ mutációt hordoznak, amelyek as LEE-lókusz legalább egy génjének inaktiválását eredményezik.

A találmány szerinti megoldás egy előnyös megvalósítási módja szerint a mutáns törzset egy olyan .3. coli törzsből nyerjük, amely patogén a nyálakra nézve és amely ..az 0103 szérumcsoporthez tartozik.

A találmány szerinti megoldás egy másik előnyös megvalósítása szerint a mutáns törzs legalább egy olyan mutációt hordoz, .amely az LHE-lókusz legalább egy sep-génjének az inaktiválását eredményezi.

A találmány szerinti mutáns törzs előnyösen legalább egy olyan mutációt hordoz, amely az LEE-lókusz esph vagy espB-génjelből legalább egynek az inaktiválását eredményezi .

Egy találmány szerinti törzset, amelyet BlÖ/C&l-gyel jelöltünk, 1997 január 15.-én 1-1808 szám alatt letétbe helyeztünk a Coliection. Natiouale de Cultures de Mícroorganismes-nél (CKMC) /Mikroorganizmus kultúrák francia nemzeti gyűjteménye], 28., Rue du Docteur B.cux, 75724

PARIS CEDSX 15.

Jelen találmány tárgyát képezik vakcinák, különösen olyan vakcinák, amelyeket orális úton lehet beadni, amelyek az coli legalább egy, a találmány szerinti mutáns törzsét tartalmazzák.

Az említett mutáns törzs előnyösen rendelkezik egy funkcionális AF/R2 adhezinnel és emiatt megtartja azt a képességét, hogy kolonizálja a belet.

Például a találmány -szerinti vakcinák, amelyek tartalmazzák a B10/CA1 törzset, szájon át beadhatók és megvédik a fiatal elválasztott nyálakat a 0103 szérumcsoporthoz tartozó patogén £b coli törzsekkel szembeni fertőzéstől.

A találmányt a leírás hátralevő, most következő része segítségével jobban, meg lehet érteni, amely nem kizárólagos példákat mutat be mutáns törzsek előállítására a. találmány szerint# valamint ezen törzsek vakcinaként való alkalmazását £. coli 0183 törzsek által létrehozott ci topa ti kus hatás demonstráláss Béla sejk sítúrákon

Az ebben a kisérlatsorozatban alkalmazott bakteriális törzsek a következők:·

- a nyűi számára enteropatogén BIO és RDSC-1 coli referencia törzsek;

- a ΒΙδ./1'βΕΙ törzs, amely BIO egy mutánsa, amelyet TnphoA mutagenezissel nyertünk és amely már nem termeli az AF/R2 adhezint [Pillien és mtsai, Vet. Microlbiol., 50, (1996) 1 ;

- 13 &. coli törzs, .amelyeket különféle nyúl hasmenéses esetekből izoláltak, és amelyeket előzőleg megvizsgáltunk kísérleti patogenitás szempontjából és abból a szempontból, hogy rendelkeznek-e bizonyos virulenciajellemzőkkel, mint AF/R2 és eaeA (Canguilhem és Miion, J. Clin. Microlb.iol., 27, 743 (1939); Leroy és mtsai, dl Med. Microbioi., 40, 90 ('1.993)1;

és kontrolként FÁS. pozitív humán törzseket:

- az E234S/6.9 humán EPBC referencia törzset;

- két humán EPEC törzset, amelyeket CFU201-gyel és CF517~tel jelöltünk (amelyeket Christíane Foresfier szívességéből kaptunk meg. Clermont-Férrend Gyógyszerészeti Tanszék) ; ezeket a törzseket gyermek hasmenéses estekből nyerték; ezek híbridizálnsk az eaeA specifikus és a &fp~ specifikus próbákkal és pozitívan reagálnak a FÁS tesztre.

- Interakciós teszt Haha sejteken

Sgy nappal az interakciós teszt előtt a HeLa sejteket •felosztott mikoszköplemezeken{ Lab-Tek, Míles Scientificj csíráztatjuk, vagy sejtkultúra titráló lemezeken (NUNCj a következő koncentrációban: 4„lcH sejt/ml Eagle minimális esszenciális közegben,· amely tartalmaz Earle sókat (BMEM, G1BC0; és tartalmaz 10% borjú embrió szérumot {FCS, GIBCOj és 50 pg gentamícint ml-nként (GIBCO). Ugyancsak a teszt előtti napon a baktériumokat „PEKASSAY broth-ban {DIFCO}. 24 óra inkubálás után 37 °C-on 5¾ CGy jelenlétében a sejteket Earle sós pufferrel mostuk (EBSS, G1BC0), majd összekevertük a baktériumokkal ugyanabban az BMEK tartalmú 25 mMos HEFE3 pufferben (GISCOI, amely tartalmazott 1% D~mannózt •(SIGMA) és 5t FCS-t (borjúembrió szérum) . 4 órás inkubáció után 37 °0~οη, 5% COg jelenlétében a sejteket bőségesen

mostul	; az EBSS-se.1,	máj d
amely	10·% FCS-t tarta.	Imazot
annak	érdekében, hogy	tonkr
A v. i Ö1 il	>öző inkubációs	idők

♦κ* °C-on) 5% CGy jelenlétében a sejteket EBS'S-sel mostuk, majd 1% formollal PBS-ben. fixáltuk 30 percig, szobahőmérsékleten .

Ezekután a különböző inkubációs idők után megbizonyosodtunk a történt morfológiai változásokról és kvantitatív módon meghatároztuk a sejtnövekedést.

*Váltósások a cítoazke1ebonban

F aktint rhodam inhoz kapcsolt phalloi-dinnel. tettük .láthatóvá (MOLEChLAR PBÖBESj a gyártó által ajánlott körülmények között. Vínvulirt közvetett immun £ Inoreszcencia segítségévei mutattunk ki egér anti-vinvulín monokionáiis antitestet használva (V2N-11-5 klón, Sigma), 1/100 hígítás mellett, valamint £Xuoreszceinnel kapcsolt, kecske antiegér antitest felhasználásával (0819 számú, IMMÜNOTECH). A mikroszkóplemezeket ISICA DMR fluoreszcencia-mikroszkóppal vizsgáltuk (40x-es ohjektÍvvel).

Az eredményeket az 1. és 2. ábrák mutatják.

Az 1, ábra a HeLa sejtek citoszkeletonjában bekövetkezett morfológiai változást mutatja a FÁS tesztben miután azokat kitettük a BIG-es E. coli törzs hatásának (A és 3), valamint az £2348/69 hatásának. (C és D), amelyet 4 óra inkubálás követett.

Az F aktín festését phalloídin/rhodamin alkalmazásával értük el, Minden egyes törzsre ugyanazt a mikroszkopikus területet mutatjuk íáziskontrasztban (A és C), valamint fluoresscenciás körülmények között (B és D) 4Öx objektívve 1, A vonal nagysága 20 pm«.

φ ΦΦ**

ΦΦ * * y 4 Κ « φ « Φ * φ Φ * Φ Φ *«

Α 2, ábra a cítoszkeleton változásait mutatja be és a fokális adhéziós plakkokat, amelyek a HeLa sejtekben jöttek létre a BIO E, coli törzs hatásának való kitétel után,· 24 órával (8 és E) valamint 48 órával (C és F) a kölcsönhatás után, vagy a mutáns- 810/CA.l törzs (amelynek előállítását az alábbiakban/ a 2. példában Írjuk le; hatásának való kitétel után, 24 órával a kölcsönhatás után (A és D).

Baloldalt (A, S és C) : as F-aktin festése pha1lo i dinnel/rhodaminna1 Jobboldalt (D, E és F|. : a vínvulin festése indirekt immunf luoreszcenoí a módszerrel anti~vin.vul.in antitestek felhasználásával,

A vonal nagysága 20 μη.

*A sej tnövekadés kvant1tat ίv me gmérése

Metilénkékkel specifikus módon lehet megfesteni sejtfehérjéket, és ez lehetővé teszi egyrészt, hogy megvizsgáljuk a sejtek morfológiáját, másrészt, hogy megmérjük a sejtpázsifcok teljes proteintarfcaimát. A sejtfehérjéket 1% metilénkékkel festjük meg 0,0 M borát pufferben a tilson által leirt módszer szerint [Animál cell cuiture: A practical approach# R.I. Frishney (szerk.} IRL Press Oxford, (199.2) ]. A sejttenyészetek maradék proteinjét kvantitatív módon megállapítjuk a kölcsönhatás napján, és 72 órával később olyan módon, hogy a festéket 8,1 14 HCi-val extránáljuk, majd automatikus ELISA iemezleolvason (model M 5800/7000, Dynatech) megmérjük az optikai sűrűséget 630 nm15

«.♦* *< «·***

Az eredményeket a 3. és 4. ábrák mutatják.

A. 3.. ábra a HeLa sejtek morfológiáját illusztrálja négy nappal a kölcsönhatás után, mind a BIO törzs esetében

CB}· mind a B10/CA1 mutáns esetében CA) . A festés metilénkékkel történt. A vonal hossza 20 gm...

A 4. ábra a bakteriális oltvány finoculumj dózisának hatását mutatja a He la sejtek növekedésére a BIO (0), Blö/CAl <0} és a ΒΙΟΖΙβΕΙ <» £„ coli törzsekkel való kölcsönhatást követően.

Az abszcisszán van megadva, az infekció multiplicitása (sokszorosódása) a CKJ-k száma sejtenként a kölcsönhatási teszt kezdetén;

az ordinátán van megadva a sejtnövekedés koefficiense - OD (optikai sűrűség) 72 órával a kölcsönhatás után/OD a kölcsönhatás napján.

Minden pont négy minta átlaga. A sejtnövekedési koefficiens standard deviációja minden esetben kisebb, mint

0.2.

Kovetkeztetés

Amint azt az 1. ábra mutatja, a Blö törzs nem. vált ki semmilyen FÁS típusú választ, vagyis nem vezet a polimerizált aktín semmilyen szignifikáns sűrűsödéséhez a baktériumok és a sejtek érintkezési pontjánál, és ez a RAS típusú válasz-hiány annak ellenére jelentkezik, hogy erős adhézlő lép fel és ellentétében az B234S/69 törzzsel kapott eredményekkel, amely erősen pozitív FÁS választ vált ki azonos körülmények között.

ψ -* « Φ ♦ < ·

Po2it.lv FAS-tipusu választ figyeltünk ®eg a RDEC-l törzs esetében is a nagyon csekély adhézió ellenére, valamint a humán CF11201 és CF517 törzsek esetében.

A. aás vizsgáit £. coli törzsek között a raianőznegativ 0103 fenotipusből négy törzs nem vált ki FÁS típusú választ.

Mégis., a BIO törzs hatásának kitett sejtek igen. mély változást mutatnak a citoszkeletonban, amelyet a kölcsönhatás befejezése után lehet detektálni (1. ábra), és amelynek nagysága nő az idővel (2B, 2C, 2S és 2F ábrák) .. Ezek a változások, amelyeket itt a CPE névvel jelölünk, a polimerizált aktin nagyszámú kábeljának kialakulásában jutnak kifejezésre, amelyek kötegekbe rendeződve áthúzódnak a sejten, és gyakran párhuzamosak egymással (2B és 2C ábra). Az aktin kőtegek megerősödésével párhuzamosan, fokozatos növekedés figyelhető meg a vi.nvu.tin formációkban, amelyek a fókái is adhéziós plakkokkal állnak kapcsolatban. Szék a formációk, amelyek általában pontszernek és azon sejtek peremén helyezkednek el, amelyeket előzőleg kitettünk £2348/09 törzs 'hatásának, a BIO törzs hatásának kitett sejtekben az inkubálás után. 48 - 72 órával általános és pszeudofibriilárís eloszlást vesznek fel. (2E és 2F ábrák).

A BIO törzs hatásának kitett sejtek mérete érzékelhetően nő az idővel, vagyis körülbelül 2.5 szeresére 4 nap inkubáció után, összhangban a sejtmag átmérőjével (3. ábra) ; ezzel párhuzamosan a sejtnövekedés blokkolt, amint azt a reziduális (visszamaradó) sejttenyészetekben végzett tel-

♦ * X*

Jf ♦ X es protein-m-eghatározás mutatja (4. ábra). A sejtek, csak az inkubáció ö.

Ezenfelül ként számolva i col ony- .forrni ng

50%-án mutatott napján kezdenek elpusztulni.

megbecsültük, hogy a teszt kezdetén sejtena BIO egy 50-100 telepfcépző egységéből unit, CFü) álló oltvány a sejtek legalább

CPE-t.

Bár a	Blö/16	IS X ÁÍVLí; <3.11 £.>	törzs egyáltalán nem	képez
fibrilláris		adhezint	(Pililén és mtsai,	Vet.
Microbiol.,	SO, iöS	(1996)), ’^!·	igyanazt a CPE-t hozza	létre,
mint a szülő	<· BIO tö	rzs; amint	azonban azt a 4, ábra	mutat-

ja, citopatogenifása kb, SO-szer alacsonyabb.

A. vizsgált egyéb, nyúl hasmenésből származó törzsek között a Blö-zel azonos fenotipust <0103 szérumcsoport/ ramnóz fermentáció hiánya, eaeá pozitív} mutató tizenegy törzs a CPE-t definiáló minden morfológiai, változást létrehoz. Ezt a CPE-t kiváltja a másik hat vizsgált törzsből három kiváltja, éppúgy, mint a referencia R.DEC-1 törzs. A humán eredetű EPEC törzsek közül az E2348/69 törzs nem hozott létre semmilyen detektálható CPE-t, míg a két CF112Ö1 és CF51? törzs erősen pozitívak voltak CPE-re nézve,

A. CPE-t nem lehetett reprodukálni a BIO kölcsönhatási kultúra tízszeresen betöményitett felülűszöjának alkalmazásával, sem a baktérinmtestek lízátumalval (oldataival), amelyeket ugyanabból a kultúrából nyertünk és hasonlóképpen tízszeresen tömény!tettünk

2. pe.íi'.líJ

CFE-negativ mutánsok eiöállitása, soeiekciója és genetikai vicegúláta

Annak -érdekében, hogy betekintést nyerjünk ennek a C?E~nek a molekuláris meghat ár o-zotts ágába és hogy megvizsgáljuk a lehetséges korrelációt a CFE és az ehteropatogemitás között nyulakban, a CFE kiváltásának képességét elvesztett, ki ónokat izoláltunk B1Ö mutánsok bankjából, amelyeket úgy nyertünk, hogy véletlenszerűen inzertáltuk a TnSISSOjy :pho.4 transzpozont (TnphoA) (Manoíl és Beckwith, Froc. Natl. Aead. Sex., §2., 8129 (1935)].

TnphoA-t a p.R7733 öngyilkos plazmiddal való konjugáció révén juttatjuk be a BIO törzsbe, amely az SH1Q (kpi:r+) K. coli törzsben található (Taylor és mtsai·., J. Bacteriol., 171, 1.870 (1989)].

A 'transzpozont befogadott kiónokat két lépésben szelektáltuk :

1) A Luxia-Bertani agaron (LA közeg) levő konjugációskeverékeket először is feldúsítottuk a transzponált kiónokban oly módon, hogy átvittük őket egy kanamicint (20 pg/ml! tartalmazó M9 minimál tápoldatba, majd 48 éráig 37 °C-on inkubáltuk. A ssülő-törzsek nem növekednek ebben a közegben, mivel az SM1.0 auxotróf (thy thr les), a BIO pedig érzékeny a kanamicinre.

2) Második lépésben a feldúsított kultúrákat kanm.ic.int (50 pg/ml) és 5-bromo-4-fcIoro-3-in.dol.il foszfátot (X?) (40 pg/ml) tartalmazó LA közegre szélesztettük (40 p.g~ mi) . A kékre szineződött klánokat ezután fenolvörös aaarra •ί replikáituk_z amely 1¾ ramnózt tartalmazott és LA közegre, amely vagy kanamicint (100 ^ig/rai} vagy ampicíllint (100 μ g/mi) tartalmazott annak érdekében, hogy elim.inálja azokat a kiónokat, amelyekben az egész pRT733 plazmád koíntegráiódott a BIO ge&oaaal·

Azokat a klánokat tartottuk meg további vizsgálat céljából, amelyek rendelkeztek a ramnőz negatív fenotípussal és a kanamícin rezisztenciával, valamint az ampicíilín érzékenységgel.

Az igy kiválasztott mutánsokat ezután egy éjszakán keresztül kanamícint (50 gg-mi) tartalmazó PENASSAY közegben tenyésztettük, majd utána glicerin hozzáadása után (végső koncentráció 20¾} -20 °C~ on tároltuk. Ezután .96 üreges sejt kultúr a lemezen. (FALCOK) meghatároztuk GPS. kiváltó képességüket HeLa sejteken a fent. leírt 1. példában megadott módszerek alkalmazásával.

A megvizsgált közel 2700 klón közül 7 független klón (vagyis azok a kiónok, amelyeket független konjugációs keverékekből különítettünk el} volt CPE-negativ és nem integrálta a teljes öngyilkos piazmidot.

A 2, ábra (A és Bl illusztrálja azt, hogy az egyik ilyen mutáns (B10/CA1} elvesztette a CPE-t. Az ábra azt mutatja, hogy az ennek a mutánsnak kitett sejtek nem mutatnak változást a oítoszkeletonban, ami a vad típusú B10 törzs által kiváltott CP'E jellemzője.

A 3A ábra azt is mutatja, hogy a B1Q/ÁC1 mutáns nem okoz semmi olyan morfológiai változást, amit a B10 törzs vált ki. A 4. ábra mutatja, hogy citopatogenitása majdnem nulla, inek a mutánsnak a

Harbor, NY (	1983)) s
A C?E~	negatív
meghatározás	a céljá
Boehringer)	segí tsé<
3.4 kpb-s	Hindi .11
(DIG-ÜTP). )	irt a ε

A C.PE-negatív mutánsok genetikai jellemzése

Hacsak másképp nem jelöljük, az alkalmazott technikákat a Sambrook és mtsai. által előirt standard protokolloknak (Holecular Cloning: A Laboratory Manual# Co'ld Spring :1.989) ] megfelelően valósítottuk meg.

-negatív mutánsokba inzertéit egységek számának >a céljából egy kereskedelmi kit (DIG DNA, segítségével.# a gyártó javaslatait követve TnS Hindi .11 fargsmensét csatoltuk digoxigeninhez Ezt. a próbát Southern-blottal ellenőriztük a teljes BbS Clal, BamHI és Sáli emésztési fragmen.seive.1 szemben.

A ? előzetesen kiválasztott kiónbbl kettőt kiküszöböltünk# mert kettős inzertálást tartalmaztak.

Az 5 fennmaradó mutánsban az inzert a következőképpen lokalizálható:

Megfigyeltük# hegy a BIO kromo-s tornál is DNS~e az E2348/69 törzs LSE--fókuszának.# amelyet McDaniel és mtsai írtak le (Proc. Natl. Acad. Sci., 92, 1664 (1995)) négy specifikus fragmensével (az 5. ábrán A, C és D~vel jelölve)

hibridizá	it.# amint	az	;t az 5a ábra	mutatja. Ez a hibrid!z
cié és te	bb, mint	3 5	kh-s régión t	hrténik (amint azt az
ábra muté	at ja) , as	U2ly	f ezért úgy '	tűnik, hogy az E2 3 4.8/
lókusszal	analóg	lök'	uset képez, a	restrikciós polimorf!
musban az	ónban jel	ént	ős küiönbséoe]	fe vannak.

«·*«

Próbákat készítettünk olyan módon, hogy az A, B, c és D fragxaenseket megjelöltük digoxin~DÍP-vei, A teljes DNS különböző restrikciós enzimekkel történő emésztése, majd a Southern biot végrehajtása után a CPE-negativ 31 ö mutánsokra ezekkel a próbákkal, kapott hibridizációs profilokat őszszehasonlltottuk a szülői. BIO törzsre és az S2348/63--re kapottakkal. V

Ezen próbák -alkalmazása arra. a következtetésre vezet, hogy az öt mutáns az LEE-ló-kusznak megfelelő régióba Inzertálodott a TnphoA inzert. Az 5b ábra körrel körülvett nyíllal mutatja a TnpboA inzert helyét ebben as 5 mutánsban .

E mutánsok közül háromban {BÍO/CAi, BÍ0/S2 és B10/PA12} az inzert a 8 kB-os ScoRI fragxaensben helyezkedett el, amely a 3 próbával hibrid!zált, vagyis a szekréciós {.kiválasztási} génekkel (sepá - sepD} homológ gének kö-

ében <. A	BIO/Hl2

ridizáiő	régiók
sban az	ergo és

kedík el ób példa

Λ TAS-választ adö törzsek, a CPB-t kiváltó- törzsek és a CPE~o-s.gat.i.v mutánsok protein-profiljának Összehasonlítása

Annak érdekében, hogy azonosítsunk bármilyen lehetséges kiválasztott baktérium-proteint, amely kapcsolatba hozható a CPE-vei, analizáltuk a kultúrák íelüiúszójában levő proteinek elekfcroforetikus migrációs profilját az £2348/6:9 « * »*·* «4 ««Λ *

Λ >**♦

* * humán S.PEC törzs esetében, a BIO', RDEG-l és a S10/16E1 teresek esetében, valamint a CFE-negativ BIO mutánsok esetében .

A baktériumokat a fenti 1. példában leírt kölcsönhatási teszt körülményei között tenyésztjük, de a sejtek jelenléte nélkül, a kezdeti oltvány hozzávetőleg 10⁷ CFU/ial. 2 órás inkubáció után a baktériumokat centrifugáljuk (4000 g, 15 min, 20 °Ci és 1 ml metíonín nélküli EMEM-ben (No.. 31900-020, GlüCO; szuszpendáijuk, amely tartalmaz még S% hozzáadott dializáit FC5-t. 20 perces inkubáció után 37 °Con annak érdekében, hogy kimerítsük az endogén metíonín készletet, -^S-nel jelzett metionint adunk hozzá 100 uCi/mi mennyiségben. További. 1 órás inkubáció után a baktériumokat két egymás utáni eemtrifugálással (12000 gy 10 min} eltávolítjuk, majd a centrifugálásí felülűszoban a proteineket 40Oö-es políetilén-glíkoilai (PSG, 200 mg/ml, MERCK} kicsapatjuk. 1 órás 0 °C-os Inkubáció után a keveréket ismét centrifugáljuk (1200Ό g, 30 min} „ A. centrifugálásí üledéket 30 μί elekt.roforézises felviteli pufferben szuszpendáijuk és a proteineket eiektroforetikus migráció segítségével szétválasztjuk 12%-os pol íakr Hantid gélben SDS jelenlétében (SDS-PAGE). A gélt vákuumban szárítjuk, majd szobahőmérsékleten 6 napra érintkezésbe hozzuk egy β-msx (AMEASBAM) filmmel, A filmet a szokásos módon hívjuk elő.

Az eredményeket a 6A ábra mutatja.

A Blö szülői törzsben (3. sáv} három főbb proteint azonosítottunk, amelyek molekulatömege rendre 39, 37 és 25 kDa volt, valamint egy kevésbé fontos csíkot 40 kDa-nál.

X* · Φ ΦΦΦ * X * φ ·*'♦

Miközben a nyúl RBBC-l és a B10/16EI mutánsok profiljai megegyeznek a Blö-ével, a humán SPEC referencia törzs, £2348769 (6. sáv) négy csíkot mutat viszonylag hasonló molekulatömeggel NO, 39, 36 és 26 kDa), valamint egy további nagyobb csíkot kb. 29 kDa értékkel, amelynek nincs meg az ekvivalense a BIO profilban (6A ábra) . Ezen csíkok egyike sem. jelenik meg a CPE-negativ B10/CA1 mutánsban. (4. sáv). A 2. sáv a molekulatömeg markereket tartalmazza.

Ezeket a proteineket immunológiai. összefüggésük szerint is megvizsgáltuk,, poliklonális nyúlszérumot használva, amelyet a PEG-gel kicsapatott BIO felülűszö proteinekkel szeriben termeltettünk.

Az Ímmunpreciptiációt a felülúszó proteinekkel szembeni antiszérummal a tenyészet felülúszóján hajtottuk végre, miután megjelöltük -^S-nel, amint az fentebb leírtuk. Az Ímmunpreciptiációt a standard módszerek felhasználásával végeztük el [Sambrook és mtsai.: Moíecuiar CIoning: A Laboratory Manuai, Cold Spring Barbor, b.Y. (1989)j,

Az eredményeket a 6B és a 7. ábra mutatja.

A 6B ábrához tartozó lábjegyzet: 1. sáv: BIO preimmun szérummal; 2: BIO; 3: BiO/CAl; 4: B1Q16E1; 5: molekulatömeg markerek; 6. BDSC-1; 7: £2348/69.

A 6B ábra mutatja, hogy az antiszérumnak a BIO {3.

S£V ·	és RBSü-l (6. sáv) bárom	fő proteinjével (39,	í ? 5	25
kDA)	, valamint az £2348/69 né	gy pro te injéve1 (39,	36, 29
26 í	:Da) való precipitátumát.	Miközben a BIO három	fő prof

inje jelen van az AF/R2-negativ mutáns (B.1.0/16E1# 4. sáv) felüiűszójában, nem jelennek meg a CPE-negativ mutáns (Blü/üAI, 3. sáv) felüiúszójában, Meg kell azonban jegyezni, hogy a preímmuu szérumnak is van bizonyos fokú képessége arra, hogy a BIO 40 kDa~s kisebbségi proteinjével

immunpr ec í pi tá t-u?	sót képezzen.	Ezek
zik,	hogy a Blö	felülúszó pro	teinj
ével	és as E2 348	/69-ével (még	ha e:

Xekuistömege érzékelhetően különböző is), és hogy a CPEnegativ mutánsban ezen proteinek képződése a feiüiűszőban megváltozik.

Annak eldöntésére, hogy a felülúszóban levő proteineknek ezt az eltűnését a. megfelelő gének expressziójának hibája, vagy a proteineknek a baktérium általi kiválasztásának hibája okozta, összehasonlítottuk a BIO törzs és a CPE-negativ mutánsok (CA1, FA12, E2, A9, és H12) felülúszó proteinjeinek ismmnprecipítáoiös profilját az azonos kultúrából vett baktériumok lizátumaínak (oldatainak) iffimunprecítpítácíós profiljával.

A lizátumokat három fagyasztásiy felengedésl ciklus révén nyertük (-20 °C és 20 °C között), amelyet centrifugalás követett (12000 g, 10 perc), majd kinyertük az lizátum felüiűszóját. Az immnnprecipítáciőt azután hajtottuk végre, hogy megjelöltük -^Ο-ηοΙ, ugyanolyan körülmények között, mint amiket a feiülússó proteinek esetében használtunk. Mielőtt azonban ezt elvégeztük volna az B. coli HBlöl laborétórium törzsének lisátumát használtuk az antiszérum depletálasára, hogy kiküszöböl jük a nem-specifikus reakciókat .

felülúszó proteinek

7B (a bakteriális

Az eredményeket a 7A (a üsmunprecipi feác.iős profilja] és lizátumok immunpreciptíciós profilja) ábra mutatja.

Lábjegyzet a	7A	ábrához: sáv	OK	1:	BIO;	2: mólókul
meg markerek; 3; CA	.1;	4: FAI2; 5:	E2;	0	: AB;	7: H12,
A 7A ábra azt	mt	itatja, hogy	a S	hlG-	-zel	összehasonl

a ielülöszó proteinek jelentősen csökkennek minden mutánsban. Ez a csökkenés még hangsúlyosabbnak tűnik három mutánsban, nevezetesen a CA1-ben, Ε-2-ben és A9-foen. Az imaunprecipítáció kimutat egy csíkot kb. 110 kDa-nái, amelynek Intenzitása többé-kevésbé egyforma minden törzsben, és amelyet ezért nem befolyásolnak a mutációk.

Megjegyzés a 7S ábrához; sávok; 1; molekulatömeg markerek,* 2; BIO; 3: CA1; 4; FAI2; 5: 2B7 6: A9;7: H12.

A 7B ábra azt mutatja, hogy a fentebb leírt főbb proteinek többé-kevésbé azonos mennyiségben jelen vannak a BIO lizátumokban és a. mutáns lizátumokban, a CA1 mutáns kivételével, amely különösen szegénynek mutatkozik a 25 kDa-s proteinben.

4, példa

A patogenitáa elvesztése a BIO egy CFE-negativ mutánsában

Annak tanulmányozására, hogy a CPE elvesztése hatással van-e a virulencíára, összehasonlítottuk a BIO törzsnek a nyulakra vonatkozó patogén itá-s át orális adagolás esetén az egyik mutánséval, jelen esetben a B10/CA1 törzsével.

A patogenitást új-zéiandi fehér tenyészetből (INRA törzs) származó, 35 napos fiatal nyálakon vizsgáltuk.

φ φφ ί *** * » * * « · ** ♦ * * φ * * φ » ♦ * * * ί *_Λ φ Κ-.φ Λ Φ » # •φφφνφ amelyeket. 28 napos korukban választóttünk el, a Pillien és mtsai által leírt módszerrel. [Vet. Microbiol. 50, 105 (1996! 'j. 51 nyalat három csoportba osztottunk, amelyek súlyuk és alom tekintetében homogének voltak, majd orálisan beoltottuk őket a teszt törzsek 2.1<P CFü egységével, név szerint a következőkkel: a Blö szülő törzzsel (18 állat), a CFB-negativ Blö/CAl mutánssal (13 állat) és egy nem-patogén KI2 laboratóriumi BM21 törzzsel (1.5 állat). A hasmenéses és haláleseteket, valamint a súlyt fej legyeztük, és az B. coli törzseket a székletben megszámoltuk és osztályoztuk, amint azt Billien és mtsai leírták (1996. id. mű].

A BIO szülő törzzsel való orális beoltás mind a 18 beoltott állat esetében súlyveszteséget okozott, közülük 17 esetben hasmenést, 16 esetben halált. Az elhullások a beoltást követő harmadik és tizenkettedik nap között következtek be. összehasonlításképpen az azonos mennyiségű Blö/CAl mutánssal beoltott állatok, hasonlóan az B. coli KI2 törzszsel beoitottakhöz, nem mutattak semmi sűlyveszteséget vagy klinikai tünetet. A két utóbbi csoport esetében felvett súly-görbék gyakorlatilag azonosak voltak.

A 8A ábra mutatja den csoportban a kísérlet során: BIO (két tólélö/18 állat Δ; K12 (kontroll; 15 túiélö/15 állat) - 0; B10/CA1 (18 túlélő/ 18 állat) - □.

A 88 ábra mutatja, a coli hacillusofc populációját a beoltás után különböző Időkkel azon állatok székletében, amelyeket a KI2 kontroll törzzsel, a Blö törzzsel és a Blö/CAl törzzsel oltottak be:

túlélő állatok átlag súlyát min· □ : Blö/'CAl törzsből állóként azonosított Collbaciilus flóra

Q: BIO törzsből állóként azonosított Colibaoillus

f. 1 o r a.

Jelentős S. coli kolonlzációt (elszaporodást) figyel tünk meg a szülői SIO törzzsel beoltott nyulak esetében, a kolonizáciő elérte a túlélőkben a .10^ CFU/g szintet a széklet tartalomban több, mint két héttel a beoltás után. Minden azonosított colibacillus flóra BIO törzset tartalmazott.

Ez a teljes E. coli populáció ICp-IO^-szer nagyobb volt, mint az, amit a kontrollcsoportban levő nyulak esetében láttunk, amelyeket a Klz-es E. coli törzzsel oltottak be, amelyet ezen felül nem. is detektáltak a megfelelő állatokban.

Azokban a nyu.la.kban, amelyeket a S1Ö/CA1 mutánssal oltottak be, ez utóbbi a beleket magas szinten kolonizálta, ami után az E, coli populáció kb, lö& CFJ/g széklettartalom szinten .stabilizálódott legalább két hétig. Ezalatt az idő alatt a teljes E. coli populáció '?0~lö0%--át a B10/CA1 alkotta .

ő. oe 3da

Egy CBE-negativ törzs által átvitt védelem viszonya a szülői B20 törzzsel valő fertőzéshez

A patogén BIO törzs 10^ CFU-s dóziséval vali raíií napo s nyutón., beoltás hatásait összehasonlítottuk 2, 13 egyébből álló 35 amelyek közül az egyik csoportnak egy héttel φ * *

X Φ* *« φ ·♦·>«* * φ

Λ * * * korábban orálisan a B18/C&1 mutáns törzset adtuk be (2xlí)·'

CFÜ!

Harminchat fiatal nyalat <a faj és a tenyésztési körülmények megegyeznek a fenti 4. példában leírtakkal) két csoportba osztottunk, .amelyek a súly és az alom szempontjából homogének voltak. 30 napos korukban az egyik csoportba tartozó állatoknak 2x10^ CFÜ B1Q/CA1 mutánst adtunk be orálisan 2 ml PBS-ben. Hét nappal később mindkét csoporthoz, tatoző állatoknak a patogén BIO eredeti szülői törzsből orálisan, egy 2x10^ CFÜ dózist adtunk (ami a halálos dózis kb. 150S~a). A hasmenése» és haláleseteket valamint a súlyt feljegyeztük és a székletben az £. coli törzseket megszámláltuk és típusba soroltuk, amint azt a fenti 4. példában leírtuk.

Az egész megfigyelési időszak alatt semmilyen klinikai tünetet vagy súlyveszteséget nem figyeltünk meg azokon a fiatal nyulakon, amelyeknek előzőleg orálisan beadtak a

B10/CA1 törzset.

Másrészt 18 nyálból 11 azok közül, amelyeket nem vakcináitünk BIO/CAl-gyel súlyveszteséget mutatott, míg a nynlak közül 9 hasmenést mutatott és 18-ből 7 elpusztult,

A bél-kolonizáoiő vizsgálata megmutatta, hogy a B1Ö/C&1 törzs hatásosan kolonizálta a beleket akkorra, mikor a patogén BIO szülői törzset beadtuk; ezután a B10/CA1 törzs a kb. 10' CFU/g stabil szinten maradt két hétig, ezáltal megakadályozta azt, hogy a B10 detektálható szinten megjelenjék.

* * * * ♦ x«i

Párhuzamosan ELISA-t használtunk a lokális anti 0103 LES XgA antitestek mérésére a székletben, A 9. ábra mutatja a székletben levő IgA antitestek .kifejlődését a CPE-nsgativ 310/CA1 törzzsel való orális beoltás (0 nap) után, majd a virulens 810 törzzsel való beoltás után (a 7, napon} (0), vagy csak a 810 virulens törzzsel való beoltás után a 7, napon . Látható, hogy az antitest válasz szignifikánsan nő körülbelül 15 nappal a B10/CA1 törzzsel való orális beoltás után.

o. példa

LEE-mutánsck izolálása helyspeclfukcs mu tagé nézessél

A B10 törzs LES-fókuszának jobboldali végét klónoztuk és szekvenáitufc, A szekvenált régié szerveződését diagramszérűén mutatja a 10. ábra, és a kapott szekvenciát a csatolt szekvencia-Iistában Írjuk le 1. szekvencia azonosító szám alatt. Ezenfelül tanulmányoztuk az LEE;-fókusz általános szerveződését a patogén 0103 törzsekben és megerősítettük, hogy ez azonos volt mindezekben a törzsekben.

Létrehoztuk az 0103 törzs LES-lókusz mutánsait az

E22-vel jelölt mutáns törzzsel kezdve, Míg ez a patogén törzs analóg a S10 törzzsel, érzékeny a streptomieínre {éppúgy mint továbbá minden megvizsgált Graa-nagativ spektrum an tibo t i Rumra}.

Ezeket a mutánsokat az ai léi-csere 'módszerével állítottuk elő.

Minden egyes választott lókuss esetében {eaeA, espA, espB és espDi a vad típusú E22 törzs alléiját kicseréltük

S22

Λ¹ ♦* ί

fc- « «••Οί'ί *- +

Φ » • «·«· ♦♦ »

* φ ♦

φ *»«« egy olyan alléllel# amelyet egy expressziós kazetta [-Gálán és mtsai.# J. Bacterioi.# 174# 4338 (.1.992)1 izertálásával# amel.y tartalmazott egy kanamícinnel szembeni rezisztenciagént (aph.T-gén: amlnoglikozíd 3'-foszfotranszerás) egy erős pr omo te.r szabályozása alatt# tarnszkripciós terminátor nélkül. Ez a kazettát# amelyet a mutálandó gének szegélyeznek# és amelyet egy öngyilkos piazmid [Kaniga és mtsaí# Gene# 109, 137 (.199.1)] hordoz# bejuttatjuk a vad típusú törzsbe, majd kiválasztjuk a rekomblnáns baktériumokat.# amelyekben a vad típusú alléit a mutált alléi váltotta fel.

Az eaeá és espő-géneket a kazettának a természetes Eco-RV-be ill. a Bglll restrikciós helyre való inzertálása által inaktiváljuk. Az espB és espA esetében de .novo egy SgJJT (GACATCj helyet hoztunk létre hely-specifikus mutagenezisse.1 (PCR degenerált oligonukleotido-k alkalmazásával és a plazmidok szelekciója restrikcióval).

A kapott mutánsok által előállított proteineket immun-b-Iotto-lás segítségével analizáltuk az EaeA esetében és isaauiyp-recipítációva.! az EspA, EspB és S-s-pD esetében. Ez az analízis megerősítette# hogy ezek a mutánsok csak abban különböztek a. vad típusú törzstől., hogy nem termelték azt a proteint# amelynek génjét a mutáció inaktiválta.

A kapott mutánsok a következők voltak:

- EzzAespA# amely már nem szintetizálja az EspA proteint, ~ E22ÁespB# amely már nem szintetizálja az EspB proteint.

- E22AespG# amely már nem szintetizálja az EspB proteint.

- S22AeaeA# amely már nem szintetizálja az EaeA proteint, ezért nem építi azt be külső membránjába.

# *.<ν*.* * *'*·.

«8 <fr ♦ '*♦ * ♦ *«-«1 \ * ♦ φ 9 * ♦ » «*<· * **''*

Az egyéb proteinek szintézise lényegileg normális marad mindegyik mutánsban. Az E'2'2áespA mutáns például már nem termel SspA-t, de normálisan kiválaszt EspB-t és EspD-t éppúgy, mint ahogyan, normálisan szintetizál EaeA-t és normálisan beépíti azt külső membránjába. Ügy tűnik tehát, hogy ezen mutánsok mindegyike tartalmaz egy szigorú, nem poláris („sáriét, non-polar) mutációt, amely kizárólag a mutáció cél-génj ét érinti.

A 10. ábra a 0103 törzsek LEE-lőkuszának jobboldali végét mutatja és a különböző gének pozícióját, is jelzi és a kazetta inzertáiásának helyét mind a 4 kapott mutánsban.

Ezeket a mutánsokat in vitro vizsgálatoknak vetettük alá, a melyek célja az volt, hogy megállapítsuk CPE kiváltási képességüket HeLa sejtekben, amint azt a fenti 1. példában leírtuk.

Az esp-gen mutánsok patogenitását is ügy ellenőriztük elválasztott nyuiakban, hogy 35 napos nyulak csoportjainak orálisan beadtunk 2x10'’ CFb mutánsot nyálanként ugyanannak a protokollnak az alkalmazásával,a melyet fentebb a 4, példában leírtunk.

*♦»««*** * ♦* ♦ )ί » «. ** * * » * .*.♦* X * « A X X * κ«« « ««« >» »«*»

- 32 ~

A kapott eredményeket az 1 táblázat foglalja, össze

1, Táblázat

Törzs	CPE/Keka	in vivő patogentíás³
		süiyveszte- ség	hasmenés	halandóság
£22*	4-F+	23/34	26/34	25/34
E22ÁespA		0/16	0/16	0/16
£22AespB	-	0/16	0/16'	0/16
E22Áesp£>	-	3/18	2/18	2/18
E22ÁeaeA	•S-4-4-	NT	NT	NT

a: A klinikai tüneteket mutató állatok száma/beoltott állatok száma *: vad tipo.su törzsek

NT: nem vizsgáit,

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az Esp protein szintézis mutánsok, már nm expresszál ják a citopatogén hatást Heha sejteken, szemben az eaeA mutánssal. Ennek következtében két .Esp protein mutáns (ÁespA és ÁespS) teljesen elvesztette patogentiáeát és a ÁespD mutáns patogenitása sokkal gyengébb, mint a vad típusú törzsé.

SZEKVENCIÁLISΤΑ

Α2 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: .12620 basispár TÍPUSA: nukleotíd

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

JELLEMZŐK:

NÉV/KULCS: cds

E LHELYE ZKEUÉ S: 1768,..4587

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /produkt - eaeA JELLEMZŐK:

NÉV/KULCS: cds

ELHELYEZKEDÉS: 7278. . .7856

EGYÉB INFORMÁCIÓK: /produkt = ^wespA^!5JELLEMZŐK:

NÉV/KULCS: cds ELHELYEZKEDÉS: 7869...3011 EGYÉB INFORMÁCIÓK: /produkt = ^MespD* JELLEMZŐK:.

NÉV/KULCS: cds

ELHELYEZKEDÉS: 9032...937 6

EGYÉB INFORMÁCIÓK: Zprodukt - ”espB”

AZ' 1.. AZONOSÍTÓ SZÁM.Ö SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

OATATWCCO AACCCCGTCA CWSATMTA SmWAOTOWM T&CMAffiMC SÖ &CG&WASC CASGffiS&TCC AA4TASTGÖC Ö&ÖGSÁ&A&A TOmWSAT TCATACtTCA X2Ö

ACCTOACTT CMCCTCCS TÖCAÖATCCT AAACTTW3T TSTShOT SACTATTGCT 188

8CM3OTSTO& TAGGÖATÖOC TGCGACGGGS &TTGC&C&GG OTGTTGCWT SACTCCAOAÖ 24ö

CCGG&TO&CC CAATCACTAC CÖACCCTÖAT GCTGCMCAA &C&Ö&3CTG& mOJ® 388

AAAÖATCAST TAACOWO, ASCMTSOS AACCCAGATA AŐbSAMST ΤΜΤΑΤ03ΑΤ 388

8AÖAACG0AA ATGCÓATTCC STOT$KM CTO&&3&TG ATSTTÖTTSC GCAAATAGCÁ 420

S&AC&ftSCTA AAÖCSOCÖGG TÖAACN38CC A®CO« CTATTGAAAG TMTTCTCW 488

SCGCAGOAA JWATOAWL KCAÖOmCT AAACSO3MC K«MW TCOTTCATCG 54 S

GQGGrmOCT ACOSTATTAS XWTGCGCKS ATTCTTOOS GGGCAATTGG TÖCCT3TOT? 888

Μ 9 » X XX * * **

* φ - 35 - : ...¹	I ♦ ♦ ♦♦*:>
ACTGCCTCTC TTC&TCGCAA AAACCAACTS δΜΑΑΟΜ CAATt&CTAC ACGTACTGTA	888
STCG&TAATC AGCCTACGAA TAACGCACTT GCGC&CTGCA ATACTGACAC AAGTGGSCCA	728
GAAÖAGTCCC C3GCGASCAG ACTTAáTTCG AATGCCAGCC TCTCATCGA& CCTGTCTGAC	788
ACCTCCAGCA CGCTCACGGT AGAGAATCCG TACTCTGACT TCTGAATGCC CAGAAACTAT	850
TCACCTGCTC GCATTTC&GA G8AACCTATT TATGACTAW TCGCCTCAGA TCTTAATTAT	208
AGCGTCATTC AACATTTTTC A8CTAACAGC KWW GAACTTTAG? GCTAACCCCA	Μ8
GSGCAAGGTA TCCAAAGT&C TTATGCTCTT CTOWa GÖSSO0S&TT GCTTTTAGGT	1823
ATCTGACTAT TAACGGGGCT GCTCGAGAOC GCMGTAAGTA CCTCCAATGC CGCACCAACG A ,»^v	1888
CCSGGACCCT CACGTTTCGT TTAAATATAT CCTTGAGTAT TTAGTCTACT TTGGGAGGGG	1148
GGGACTTTTA CTAATATTAA CTTTCTAGAG AATAAAGTTG CAGCACTGÖT AACTCTTGAA	1288
CTTCTOTAAT TATAAATTCA ATTAAGMGAA ATT&TAACT? CATCAAGATC CTACCTTTTA	T2CO
T7AGATAGAT TTSCACAAAA AATTCTTATT GGATCTATCT αΏΏΛ®Α AAATAGATTG	1820
worr® ctatctatga gattcattat atttcgttat ctgatgctaa ctacgaatat	12 SS
ACTATGATCT &TGSCGTCTG TGCTAAATTC CCGACAGATA ATÖCTRACTT CGCTCTTGAG	1448
ATTTCTAATG CAAACTTACT GTTTGCAGAG AATCTCTGAC CATACCTGTG TTACTAATCA >>:·. Λ' · · · >. A í: > CTAGCACAAT CTCWTCTTT AGCTTTACTT TTTCCSCTCT ACTATGCTAC ACCTGAAAAA aSí . , X«?y «5 ·? ' íf CTWAGAATG AAATAGAAGT CTTCSTTAAG TCAATW&AA ACCCTTATTT GGTATTACAT	2588 1558 1520
WKO» TAACATTAGA AAACÖAACAT AWAA&&TAG ACTAAATTAG TTCA&SCTAT	1888
AATAAACATT ATTACTCCT© AAGATAAAAG ATTATTTATT AATATAATTT ACTATTCATT	1740
CTAACTCATT GTGGTGGACC CCATAAC ATG ATT ACT CAT GGT TTT TAT GCC Met Tie Thr Kis Gly Lhs Tyr Aia 1 5	1721

CTG ACC CGG CAC AAG’GAT AAG CTA AAA AAA. ACA TTT’ ATT ACT CT? AGT Arg T&r Arg Kis Lye/His Lys Leó Lys Lys Thr Lhe.lle Met Leu Ser 18 l IS 28' x<X ?>VV Λ «·>·<· * ·\? ·!$·-.· GCT GG? TTA GG& TCT TTT TTT TAT GTT AAC CAG AAT TCA TTT GCA AAT Ale Gly Leu Gly Leu The Fhe Tyr Vei A»» Gin As» Ser The Ale A®» 25 20 25 88	1832 1887
GGT GAA AAT TAT TTT AAA TTG AGT TCA GAT TCA AAA CTG TTA ACT CAA Gly Glu Asn Tyr Phe Lys Leu Ser Ser Asp Ser Lys Leu Leu Thr Glu 45 50 55	1535
AAT GCC GCT CAG GAT CSC CTT TTT TAT ACT TTA AAA ACA GGT GAA ACT As» Alá Ale Gi» Asp Arg Leu Phe Tyr Thr Leu Lys Thr Gly Glu Thr 88 85 > 70	1283

Χ« V « ** * * « ΦΧ <44

/.4 * *

GTT GCC AAT ATT TCT

AAA Lys

TCA Ser

CAG GGT ATC AGT TTA TCG ÓTA ATT TGG

2031

Vei

Ale

Asn.Tle 75

Ser

Gin Gly 80

H e Ser

Len

Ser 85

Val

lle

Trp

TCA

CTG

AAT AAA

CAT

TTA

TAC

AGT TCC

GAA ACC

GAA

ATÜ

ATG

AAG

GCT

2075

Ser

Lea

Asn Lye

SÍ®

Len

Tyr

Ser Ser

Gin Ser

Gin

Mét-

Mer

Lys

Ale

PO

PS

100

GGA

CCT

GGT CAG

CAG

ATC

ATT

TTG CCA

GTC AAA

AAA

ere

TCT

GTT

GAA

2127

Sly

Pr©

Gly Gin Gin

He

Len Pre

Len Lye

Ly®

Len

Per

Val

Gin

105

110

22S

120

TAT

AÜT

GCC TTA

CCT GTC

TTA GGT TCG

GCA CCT

GTT.

OTT

GCT

GCA

GGT

2175

Tyr

Ser

Ale Len

Pro

vei

Len

Gly Ser

Ale Pro

Val.

Val

Alá

Als

Gly

12K

130

*5?>k

135

GGT

GTC

GCT GGT

CAT

ACG

AAT

AAA ATS

ACT AAA

ATG

TCC

CCÜ

GAC

CCS

2223

Gly

Val

Ale Gly

Mis

Thr

Asn

Lys heh

Thr Lys

Méh

Ser

Pr©

Asp

Alá

140

14$

150

ACT

AAA

AGC AAC

ACG

ACC

GAT

GAC AAG

GCT CTA AAT

TAT

GCG

GCA

CAA

2271

Thr

Lye

Ser Asn

Thr

Asp

Asp Lys

Ale Len

Asn

Tyr

Alá Ale

Gin

155

140

185

CAG

GCG

GCG AGC

CTT

GGT

AGC

CAG CTG

CAG TCG

CGC

TCA

CT®

AAC

GGC

232.P

Gin

Ale

Ale Ser

Len

Gly

Ser

Gin Len

Gin Ser

Arg

Ser

Len

Aon

Gly

27©

17S

2P0

GAT

TAC

GCG AAA

GAT

ACC

GCT

CTT GGT

ATG GCC

AGG

AGC

CAG

GCT

TCG

2387

Asp

Tyr

Alá lys

Asp.

Thr

Ale

Len Gly

Met Ale

Ser

Gin

Ale

Ser

185

ÍS©

185

200

TCA

CAG

TTG CAG

GCC TGG

TTA

CAA CAT

TAT GGA

ACG

GCA

G&G-

GTT

AAT

2415

Ser

Gin

Len Gin

Alá

Trp Len

Gin Ki®

Tyr Gly

Thr

Ale

Gin

Val

Asn

205 220 215

CTG CAG AÜT GGT AAT AAC TTT GAC SÜT AGT TCA CTG GAC TTC TTA TTA · 24S3

Len Gin Ser Üly Asn Asn Phe Asp Sly Ser Ser Len Asp Phe Asn Len

220 225 230

CCG TTC TAT GAT TCC GAA AAC ATG CTG GCA TTT GGT CAG GTC ÜST GCG 2511 ?» Phe Tyr Asp Ser Sin Asn Mer Len Ale Phe Gly. Sin v&I Gly Alá

235 24© . 245

CGT TAS ATT GAC TGC CSC TTT AGG GCA AAT TTA CGT GCT GGC CAG CGT 2SS9

Arg Tyr Tle Asp Ser Arg The Thr Ale Asn Len Gly Ale Gly Sin Arg

2SÖ 255 25©

TTT TTC GTT CCT GAA AAT ATG TTG GGC TAT AAC GtC TTC ATT GAT CAG 2507

Phe Fte Len. Pro Gin Asn hét L«u Gly Tyr Asn Vei Phe lle Asp Sin

255 272 275 28©

GAT TTT TCT GGT GAT AAT ACC CGT TTA GGT ATT SÜT GGC GAA TAC TGG

Asp Phe ser Sly Asp Asn Thr Arg Len Gly Π® Gly Gly Gin Tyr Trp

255 25© 2PS

2585 * * *· » * ' ··*, 5 .* χ λ r»*s

CGA SAS TAT TTC m AGT AGC GTT AAC CGC TAT TTC CGC ATG AGC GGC 2783

Arg Asp Tyr Phe Lys Ser Sár Val Asa Gly Tyr Phe Arg Mer ser Gly

388 385 Γ 3X8

TGG CAT GAG TCA TACjAAT &%8 AAA GAT TAT GAT g|g CGC CCG GCA AAT $751

Trp His Glu Per Tyr Asa Lys Lys Asp Tyr Asp Óla Arg Pre Al® Asa

335 320 333

GGT TTT GÁT ATT CGC TTT AAT CGC TAT TTA CCA TCA TAT CCG GCA 27»

Gly Phe Asp XXe Arg Phe te Gly Tyr Leu Pre Ser Tyr Pre Alá he»

133 333 343 ®C GCC AAA CTG ATG TAT CAA CAG TAT TAT CGT CAT AAT GTT GOT TTG 2347

Gly Alá Lys he» Mer Tyr cl» Gla Tyr Tyr Gly Asp Asa v®X Al® Le»

343 358 355 . 358

TTT AAT TCC GAT AAG TTG C&G TCG AAT CCT GGC GCÖ GGG ACC GTT CCT 2885

Phe Asn Ser Asp Lys Le» Gl® Ser Asa Pre Gly A1& Al® Thr Vei Gly

355 373 ? 373 * \ .^w

GTA AAC TAC AGT COS ATT CCT CTG GTG ACG ATS CSC ATC GAT TAG CGT 2 343

Val Asa Tyr Thr Pro lle Pro Leó Vei Thr Mefc Gly Ile Asp Tyr Arg

388 335 353

CAT GGT ACG GGT AAT GAA AAT GAT CTC CTT TAC TCA ATG CAG PTC CGT 2»1

His Gly Thr Gly Asa Gla Asa Asp Leu he» Tyr Ser Mer Gla Phe Arg

385 403 435

TAT CAG TTT GAT AAA CCG TGG TCT CAG CAA ATC GAG CCA CAC TAT GTT 3333

Tyr Gla Phe &sp Lys Pro Trp Ser Gla Gla lle Glg Pro Gla Tyr v&l

4X8 433 423

Λ

AAC GAG TTA AGA ACA TTA TCG GGC' AGC CGT TAC GAT CTG GTT CAG CGT 3357

Asa Glu Leu Arg Thr: Les. Ser Gly Ser Arg Tyr Agg Leu V®1 Gla Arg

425 433 435 ·' 440 ' s

AAT AAC AAT ATT ATT CTG GAG TAC AAA AAG CAG GAT ATT CTT TCT CTG 313S

Asa Asa Asa He He Leu Glu Tyr Lys Ly® Gla Asp 21® Leu Ser Leu

445 453 455

AAT ATT CCG CAT GAT ATT AAT GGT ACT GAA CAC AGT ACG CAG AAG ATT 3133

Asa lle Pro Mis Asp He Asa Gly Thr Glu His Ser Thr Gla Lys He

458 455 478

CAA TTG ATC GTT AAG AGC AAA TAC GGT CTG GAT CGT ATC GTC TGG GAT 3231

Gla Leu He Val hy® Ser Lys Tyr Gly Leu Asp Arg He Val Trp Asp

475 400 485 . ’*·

CAT AGC CCA TTA CGC AST CAG GGC W CAG ATT CS CAT GGC GGA AGC 3272

Asp Ser Al® Leu Arg Ser Gla Gly Gly Gla He Gla His Gly Gly Ser

428 425 588

CAA AGC GCA CAA GAC TAC CAG GCT ATT TTG CCT GCT TAT GTG CAA GCC 3327

Gla Ser Al® Gla Asp Tyr Gla A1& He Leu Pro Alá Tyr vei Gla Gly

585 510 515

520 » X«r ♦ X « * * ♦ fi ♦ X ♦ ♦ Λ

CTC AGC AAT ATT TAT AAA

CTG ACC GCT CGG GCC TAT GAC CGA AAT GGT

3375

^W

Ser

Asn He

Tyr Lya 525

Vei Thr

Alá

Arg Alá 530

Tyr

Asp

Arg

Asn 535

Giy

MT

AGT

TCT

AAT

GTA

C$3

CTC ACT ATT

ACC

GTT

TTA

CCT

AAT

CTG

3433

Aon

Ser

Asn

Val

Gin

Len

Thr

lie

Thr

Val

Len

Pr©

Asn

GXy

540

545

550

SAS

GTT

GTG

GAC

CAG

GTT

CTG

GTA

ÁCS

GAC

TTT

&CT GCT

GAT

AAA

ACA .

3471

Gin

Val

Asp

Gin

Val

Giy

Vei

Thr

Asp

The

Thp

Alá

ASp

Lya

Thr

SSS

550

555

TCG

GCT

AAA

GCG

GAT

GGC

ATA

GAA

GCT

ATT

ACC

TAT

ACC

GCG

ACG

GTT

3515

Ser

Alá

Lys

Alá

Asp

GXy

lle

Gin

Aia

lle

Thr

Tyr

Thr

Alá

Thr

Val

§70

575

550

W

AAG

MT

GGT

GTA

GCT

CAG

GCT AAT

GTC

CCT

GTA

ACA

TTT

AGT

ATT

3557

Lys

ÁSS

GXy

vei

Alá

Gin

Alá

Asn

Val

Prn

Val Thr

The

Ser

Xle

sss

550

555

500

GTA

TCT

GGG

AGT

GCT

AGT

CTT

GGG

GCA

AAT

AGT

GCG AGA

ACG

GAT

CTT

3515

Val

Ser

GXy

Thr

Alá

Thr

Len

GXy

AXa

Asn

Ser

Alá

Arg

Thr

Asp

Giy

SSS

510

3$

5X5

AAC

GGT

AAG

GCG

ACC

GTA

ACG

GTG

AAG

TCG

GCT

CTA CAG

GTC

3583

Aan

Giy

Lys

Alá

Thr

Vei

Thr

Len

Lys

Ser

Alá

Thr

Pro

GXy

Gin

Val

520

535

530

GTC

GTG

TCT

GCT

AAA

ACC

GCT

GAG

ATG

ACT

TCG

CCT

CTT

AAT

GCC

AGC

37X1

vei

Vhl

Ser

Alá

Lys

Thr

Alá

Gin

hhfc

Thr

Ser

Pro

Len

Asn

A1&

Ser

OS

540

545

GCG

GTT

ATA

TTT

GTT

GAT

CAA

ACC

AAG

GCC

AGT

ATT

ACT

GAG

ATT

AAG

3755

Alá

Val

Tle

Phe

Val

Asp

Gin

Thr

Lys

Alá

5er

lle:

Thr

Gin

lle

Lys

550

555

SO $

GCT

GAT

AAA

AGA

GCG

SAS

GCA

GAT

CTT

TCT

GAT

GCG

ATT

ACC

TAT

3307

Alá

Asp

Ly®

Thr

Alá

Lys

Alá

Asp

GXy

Ser

Alá

lle

Thr

Tyr

sss

57®

575

ü/

580

ACT

GTC

AGA

GTG

ATG

AAG

GAG

GGG

GCA

CCC

GTA

GAT

CAG

AAA

GTG

3 855

Thr

Val

Arg

Val

Msr

Lys

Gin

Giy

Alá

Pr©

Vei

Val

ASp

Gin

Lys

Val

555

550

505

AGC

TTT

TCT

AAG

GAT

TXT

GCG

ACC

CTG

AAT

MG

ACT

GAA

GCA

ACA ACC

3803

Thr

The

Ser

Lys

Asp

Phe

GXy

Thr

Len

Asn

Lys

Thr

Gin

Alá

Thr

700

705

710

GAT

CAG

AAT

GGT

TAT

GCT

ACT

GTA

AAA TTA TCA

TCG

AAT

ACT

CCT

GGC

3351

Asp

Gin

Asn

Giy

Tyr

Alá

Thr

Val

Lys Len Ser

Ser

Asn

Thr

Ar©

Giy

7X5

728

725

AAG

GCC

ATT

GTT AGT

GCA

MA

GTG

AGT

GGA

GTA

GC^

ACA

GAA

CTT

MG

3333

Lys

Alá

Tle

Vei

Ser

Alá

Lys

Val

Ser

Giy

val

GXy

Thr

Gin

Val

Lys

730

735

700

404?

*Χ«Φ **

OCT ACT ACC OTT GAG TTT TTT ÖCS CCS TTG AGT ATT GAT GOT GAT M Ma Thr Thr Val 01« Phe Phe Alá Pro hév S®r n© Asp oly Asp Lys

755 720

GTO

ACC

ÓTA

ATT

sor

ACT

GGT

ATC

ÁCS GGS

GCT

dó CCA

AAO

AAC

T00

Val

Thr

Val

lle

Oly

Thr

Oly

lle

Thr Oly

Alá

Leú

Pro

Ly®

Asn

Trp

705

770

775

%

TTA

OAO

TAT

GGT

CAG

OTT

AAO

CTA

CAG OCA

ACA

ooo

GGC

AAT

80A

AAA

Leu

öla

Tyr Oly

Sin

vsl

Lys

Leu

Gin Alá

Thr

Oly

Asn

Oly Lys

790

725

792

TAG

ACA

TOO

AAA

TCC

AST

AAT

ACT

AAA ATT

GOT

TCT OTT

GAT

AAG

TCO

Tyr

Thr

Trp

Ly®

Ser

Asn

Thr

Lys lle

Alá

Ser

Val

Asp

Asn

Ser

?>5

200

SOS

OOA

CTG

ATA

ACC

TTA

AAT

G&A

AAA

GGG AGT

GCC

AGA

ATT

AGT

CTA

ÓTA

Oly

Val

Xle

Thr

Lee

Asn

Glu

Lys

Oly Ser

Alá

Thr

Xle

Thr

Val

val

2X0

9X5

22,0

TCT

sor

GAT

AAT

CAO

AGT

GCG

ACA

TAG ACA

ATT

aa!

GCA

CCG

GGT

AST

Ser

Gly

Asp

Asn

Sin

Ser

Alá

Thr

Tyr Thr

lle

Asn

Alá

Ar®

Oly

Ser

225

230

835

240

ATT

ÓTA

ATT

OTT

OTS

GAT

AAA

AAT

ACT CGA

OTT

AGÖ

TAT

TTT

GAT

OGG

lle

Vsl

lle

Alá

Val

Asp

Ly®

Asn

Thr Arg

Val

Thr

Tyr

Phe

Asp

Alá

295

250

255

m

AAC

AAA

TCT

AAG

ACA

AAT

AGG

GCA AAT

TTA GCA

CAO

CCA

AAA

OAA

Glu

Asn

Lys

Cys

Lys

Thr

Asn

Ser

Alá Asn

Len Alá

Gin

Pre Lys

Gin

200

9«S

870

ÓTA

TTG

SCO

AAT

ATS

TAT

TCA.

ACA

TOG GGT

GGT

GCA

AAT

AAA

TAT

CCT

Leu

Alá

As»

lle

Tyr

Ser

Thr

Trp Oly Alá

Al|

Asn

Lys Tyr

Pro

975

920

4

225

TAC

TAT

TCT

SÓT

TCT

AAA

TCA

TTG

ACT GOT

TGO

AT^

AAA

CAA

TCT

Tyr

Ser

oly

ser Lys

ser

Len

Thr Alá

Trp

lle Lys

Gin

Ser

290

292

900

TCT

OAA

CAO

TCA

GGT

ÓTA

TCA

AGG ACA

TAT

GAT

TTG

OTT

ACG

AAO

ser

Glu

Sin

Ser

Oly

Vei

Ser

Ser Thr

Tyr Asp

L®«

Val

Thr

Lys

m

9X5

920

4095

4143

4X91

4039

422?

3 S

4323

4431

4479

4527

AAC CAO TTG ATS AAT OTT OOA ÓTA AAC AAT AAO AAT OCT TTT TCT OTT Asm Sin Len Ti® Áss Val Gly V®1 Asn Asn Lys Asn Alá Phe Ser val

925 520 935

4575

402?

GTCTCATTTO SOAATAAOTT TTTCGTSTAT CTTGTTTOAT AGAGACCTTG TTTACCATAT

CTACAACATC TOCACAATAA AAMCCCTCC OA&OAOOGGO MOAXAATAA TAAOTTMTA

AGA8AACGGA ATMGOTS&T

AATCGCGTCT ATOAC&T&GC

ATtAAG&SCA ATTGWOAS' «wcm mwm

STCCATCGCA TTTATAA7GG á»ASO ACATCAT2CT

GA&dCT8AT GCCAGTTC&T

Meccowc GmTTCAöTA

GTATCCCÖAT AAGAGGAAGA

ACCGTATTCC GTXAAAATAT

G7WTAATAA AMATATTTT

Λ tgattcgcaa csccmm

AAGTTTGTTT TCrnTÁGOT

VHW3GGAA AGCAAAACGT

OWCTAGCC AGGWsAGAC

ATCASACAAT GGCAASGIGT

GATSACCTTT CC8OSST&

< ·«ΐ(; ( / ^{γ : :} ' 1 1'' :( : )( ( :('<)( ( ( ^{: :} 1 : 1 : ) ) :>' mmATTCA AOT3&AÖATA ·<$?

ATTGAWCCT TSTKMO emcecsss gömstwa

AT&TOAGWt AACATTtTTA

TGG7ÖAACTT ACATCAACTA

ATGG&ATATT CATAACTAA2

TCAAAACACC GCATCTGTiT attaaöscaa wwrrm'

AOTOS&TT ACTAGTTCAT

CAAAGGCAGT GCAAGSAAAG

GC&ASAGCSG CTTACTCTGA

TGGGCTGCTS GAACAGCA7G

- 40 ATICG75TGG GCGGGAGATO

CXCTTTCAG AAT8CTACCA

TCTTCATCGT SCCGCTGATT

GOTMW? CTGAAATMT cogg&tctt ktctsotk

TTTTWmT &TTGMATA5 τοαττημτ Grmcwrm

ACASATTTIC AACTTCSCTC atccwot ^wcm

CATTAATCGC GGiVSATOATT

WTCTTÖ© GTAATTMAA

GCGO3ACATT TrmX&TSC

GCTGGTA2&C ATCAGCTCTÖ

MCTSCCQ&T GGCTCCAGAC

Gcrrrmns tcoatttttg

8S7CAATATC ACCAATGA7G

AT8&OT&TC TSCTTCATAG

AMS8AAAAC ACCTOTCA wm»c sg®em

ATTSCCGATV ACÖC&TCOC&

AATTTTTTTC ATCCT38W3

ACAATAGAG? AGAAAGGAAG

GAT7&CGTG& OTTCCAA'TG

TXAATSCTAA TTC&n&ŐAT

CTMTAGTTA ttctccatea

CbSTTTCTGA AACGATTGAA

AASAG8AAGG WSACAACG

CCGATASCGA ΤΑΜ2ΤΜΑΑ

A2CCTAATTT ©TCTATGITT * * » ♦ ♦♦ :* * »»* x * « * x· * ♦ * *· »4·» X .

'TOATACCAT CTTTAGGATC &TTCCC&3GC TKJIACCG’TT l((()(ij_:(((l<<l>:((<l(^:Í ))((1( ()(( (()Ö<<<(():)((

C1ÚAÖTATTT TTCCGGGSM l^O)l)í^)l)))t)8)llÍ8)l)(((((8(·

MmsAmr TAcr&rrm

TGT2GMAAA CCnXCCCOC

TTTATTAATT TATTCrmr

TT&TGTMTT CCS&TCCAGC anrWTG AAÖGGGGAAT

GT&ATGATSA TATCCTTATA

WTWmC AAATGATATT

V*

AAW3AGTTA AATCAGTGGT γ**;·*

C&T&CSAGAö TGATTGCATG

CTAÁACGCTC GGGGrfCAGC

AAOGCAATCG CAGCACXAAT scmocc TTTCTGGCAC

AAGCAACAtC CCGCT&T&TC

Ί lx·

GGGGTO3SCT CTCG&TCMT 'ol

CS7ATA2CAA CTAAAAACTG e

TOTXTGTGC CTAWGATAG

CCATTSAGAA όΤΓΠΑΤΓΠ¹

-TWAAOATG Ά8ΑΑΑΑΑΑΤΑ

CTCTTGTACA ÖTACTATTTA

8CM3S® TTGAATOTAA T^AATTGÖ MTCTOAACA TTAAATTTAC AAAA'TÖAATT G^CTAAGCC TGGGATATCG GAGA&3CTGC TVAATGATAT

GAACTATCAT WUWAC&8

G8TAA7A1GC CAAAAdGGGA «8?

4537

4«?

5887

518?

5157

5227

52«?

8347

5857 e?

852?

5587

5547

5787

5757

5537

58S7

588?

5087

8857

5127

5187

5247

5387

8357

8527

8457

5557 * **** »#♦» Φ Φ* * * * * XX X ♦ » Χ«« χ

- 41 CATTGTTCCA CTTATATCTT CTTTATTASA ATCTAAGTTT GTTMCATT3 AATTAMAAA OS»?

CAAATACCCC AAATTATTAT TAG&TTT&TT ASGCGMÖAT GATTCCCAGT TGGCTCTGCT SOS?

TTCCTGCTTA GGGGTSSSTG AGT7AAATCA GG&AGCTATC CAS&AG&TCA AAAAGCTTTA 072?

TGAAAASCCC AAGGATGAgG ATTCTGAAAA CCGAGCCTCT TTpJSACT CCTTTATGCA S787

CATTAAGCAT CTTCCAGAGC GTS&CA&CCA CTTAAAGGTT .J^«86© CGGTATCGTT 0S47

CGATSTGTCT TATATGTCTT CTTTTGAAGA TAAGGTGMA ASATCTTCAA TTATTASCGA SS 07

TTTA7GCCGG GTAATCATTT THTATCGCT TGATAACTAT ACAGATATTA TTCCAATCTC 0307

TATT.AATAAA GATAAAGATG TCATTTTAAA TGA&GTATTG TCTATTATTG AACATGTATG 702?

GTTAACAGAA GACTGCCTCC TSG&AASCCC TTCTCGGGTA TCGATTGTCG AACATAAACA 7087

TGTTTATTAT TTCCACCTAT TG&AAG&CTT TTTTGCATCA TWXTCACG CTTGTTTTAT 7147

.............0

TCATAGGCAA CAGAGAGAXA ATACATTATT AATGATTGGT AM37»TO ATTATAACCA ?287 '· f‘$ gg&tgttatt tgatattggt tttttaatcs ttttlggtct tgctaagaaa gattattaag ?3«? «. . *#

AGCTATATAC ATG GAT ACA. TCA ACT GCA ACA TCA GTT. GCT AGT GCG K 7310

Bet Áss Thr Ser Thr Alá Thr Ser Vei Alá Ser ΑΧ» Asn

IS 10

GCC W ACT TCG ACA TCG ACA CTG TAT GAC TTA GGC AOT ATG TCG MA 7304

Al® Ser Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Asp Lee Gly Ser Bet Ser Lys

28 25

GAC GAA GTA GTT CAG CTA TTT AAT AAA GTG GGT GTT TTT CAG GCT GCG 7412

Asp Glu Vei v®X Gla Lén The Asn Lys Vei Gly V&j^ Ohu Gin Alá Alá _; JS 48 <5 .?'· Sí:

CTT CTG ATG TTT GCC TAT ATG TAT CAG GCA CAA AGG)GAT CTG TCG ATT 7400

Len Leu Met Phe Alá Tyr Bet Tyr Gin Alá Gin Seri Asp Len Ser Ile

SS - «0

GGA AAG TTT GCT GAT ATG AAT SAS GGA TCT AAG GAG TCA ACC ACA CCC 750»

Ale Lys The Ale Asp Bet Asn GXe Als Ser Ly® Gla Ser Xhr Thr Al®

70 75

CAA AAA ATG GCT AAT CTT CTG GAT GCT AAA ATT GCT GAT GTT CAG AGT 755«

Cin Ly® Bet Ale Asn Leu WX Asp Alá Ly® Xlé Alá Asp Val Gin Ser «8 85 88

AGT TCT CAC AAG AAT AAG AAA GCC AAA CTT CCT CA^> CAA CTG ATT GAC 7004

Ser Ser Asp Lys Asn Lys Lys AX® Lys Leu Pro Glu Glu Val Ile Asp ' 100 XOj

TAT ATA AAT GAT CCT±GC AAT CAC ATT ACA GTA GOT ATT AGC GAT 7053

Tyr XX® Aon Asp Pre Arg Asn Asp Ile Thr V&l Ser Gly Xle Ser Asp

210 1X3 228 125 # ♦♦♦**♦*

Κ 9 * ♦ <

Φ φ

ΦΦ Φ »»*

GTA ΑΑΤ Leu Asn	CT? Als	CTA Glu	TTA Leu 13 8	CTG GG? GGT GAT TTG CTA AGG CTG AAC GCC GCT	7700
Gly Als	Gly	Asp Lea 135	Gla	Thr	vsl	Lys Als Alá 140
ATT TCG	GCC	AAA	TGG	AAT AAC	TTG	AGG AGG	ÓTA		AAT	AAT AGG CAC	7748
lle Ser	Als	Lys 145	ser..	Asn Asn	Len	Thr Thr 150	Val	val	Asa	Asa Ser Gla 155
CTT δ»	ATA	CAG	GAAí	ATS TCT	AAT	ACT TTA	AAC	C?A	TTA	AGG ACT GCA	7735
Leu Glu	lle 1SÖ	Gla Glahefc Ser	Asa i«5	Thr Leu	Asn	Len	Len 170	Thr Ser Alá
CCT TCT	CAT	ATT	CAC	TGA CTG	CTA	TAG AGA	ACT	ATT	TCA	GGA ATA TGG	7844
Arg Ser 175	Aap	lle	Gla	Ser Leu XSÖ	Cin	Tyr Arg	Thr	lle 185	Ser	Alá lle Ser
OT GCT Leu Gly m	MA Lys	TAA	CCGG&GAT&A <	ET ATS OT AAT GTA AAT AGG GAT ATG Mer Leu Asa Vsi Aeu ser Asp Xle X ., 5 w	7833
c&o tgt	ATG	AGG	TGT CTG GGC	AGG	GGT CTT	AGG	GGT	ACT	TCA GGT ATT	7840
Gla ser lö	ífet	Arg	Ser	Gly Als 15	Ser	Als Al®	Thr	Alá í&	Thr	Ser Gly 11®
AAT CAG	CCT	GAA	CTG	ACT TCC	GCT	CTG GAT	TTA CAA	CTG	GTT AAA TGG	W
Asn Gin IS	Ere	Glu Vsl	Thr Ser 38	AX&	Len Asp	Len Gla 35	Len	Val Lys Ser 4Ö
áS gcg	CCA	TCA CGA	AC? TG?	AGA	CA& AC?	AGG	CTT	TTA	GGA AGG CTA	803$
The Alá	Tro	Ser	Alá «5	Ser Trp	Thr	Glu Ser 50	Thr	Als	Leu	Fre Thr Pre 55
GCG CGA	GGC	CAC	TGA	TTA CTG	ACG	CCT TCT	GTT	GCT	SÁG	CAT CTG CTG	8ÖS4
Fra Als	Gly	His Sö	Ser	Leu Vsl	Thr	Fro Ser SS	Vsl	Alá	Gin	ASp Vsl Leu 70
AG? AA&	CTG	TTT	GG?	GGT ATT	AST	CCT CAA	CTT	ACT	AST	CGA AGA SÁG	8137
Ser Lys	Leu 75	Phe	Gly	Gly lle	Ser 88	Gly Gin	Val		Ser SS	Arg Thr Gin
CTA AGG	GA&	GCA	CAG	CGC AGG	ACT	CAG AAT	GCA	AGG	TCT	GCG TAT GCT	8188
Gly Thr Fö	Glu	Fre	Gla	Arg Ser Thr $5	Gla Asa	Als	Ser 188	Ser	Sly Tyr Pro
TAT OT	TGT	CAG	CTG	AAT AAC	GTT	CAG CCT	CAG	CTG	ATG	ATG ATG ATC	8320
Tyr Len X05	Ser	Gin	Vsl	&sa Asn 118	Vei	Asp Fre	Gla 115	Als	Met	Met Hét Hét 110
CTG AGG	CTG	TTA	TGG	CTG GAT	CTT	TGA GCG	CAG	Ahh	CT?	GGG ACT ATC	827«
Val Thr	Leu	Leu	Ser 13 5	Leu Asp	Alá	Ser Alá 138	Gla	Lys <$*.	val	Alá Ser Hét 13 S
AAA AAC	ÓMjdAudrik TGC	AAC	GAC	ATG TAG	ACT	CA? CCT	CAA	AAT	AAG	GCG CTG CAT	8324
Lys Aaa	Ser	Asa xes	Glu	lle Tyr	Thr	Asp Oly 145	Gla	Asa	Lys	Alá Len Asp 150

« 9 ΦΦΦ Κ + φφ * φ

AAT Ara

AAA Lys

AGG Thr 155

CTG Leu

GAG Gla

TTT Phe

AAA Lys

AAG Lys 15«

CAG Gla

CTG Leu

GAA Gla

CAA Gin X55

CAG Gla

AAA Lys

GCC Ale

8372

GAA

GAG

AAA

GGA

CAA

AAA

AGT

AAA

ATT

GTT

GGT

CAG

GTC

TTT

GGT

TGG

8420

Glu

Gla

Lys

Ale

Gin

Lys

Ser

hys

lle

Lee

Gly

Gin

Vei

Phe

Gly

Trp

17«

175

18«

TTG

GTC

GCG

GTA.

ACT

GCT

ATT

GGA

GCT

ATT

TTT'

AAC

CCG

GCA

CTG

3455

Pee

Gly

Vei

Ale

Vei

Thr

Ale

Xle

Ale

Als

Xle

Phe,

Aee

Pre

Alá

Leu

155

130

135

20«

TGG

GCT

GTT

GCC

GTT

ACC

GGA

AGA

GCA

ATG

GCA

CTG

CAA

AGT

GCA

8515

Trp

Alá

val

Vei

Ale

vei

Ser

Alá

Thr

Ale

Met

Ale

Leu

Gla

Thr

Alá

SOS

318

315

GTT

GAT

GTA ATG

GGC

GAT

AAG

GCC

CCG

GAG

GGG

TTA AAG

ACA

GCA

GCG

8554

Vei

Aep

m

Mse

Gly

Aeg

Lys

Ale

«re

Gl«

Alá

Lee

Lys

Thr

Alá

Ale

SSG

335

33«

GAA

GTG

TTT

GGC

GGA

GTA

TCT

ATT

GCT

GCA

AGT

ATT:,

CTG

ACA

GCC

GGC

S512

Gla

%1

The

Gly Gly Val

Sár

He

Ale

Ser

Xle

Leu

Thr

Ale

Gly

SIS

<

sec

.345

ATT

GGC

GGG

GTG

TCT

TCA

GTT

ATG

Φ» Φν> JL.

AAA

GTT

GGC

GAT

GTC

GGT

AAC

055«

Xle

Gly

vei

Ser

Lea

hefc

Ser

Lys

vei

Gly

Asp

vei

Ale

Asn

250

355

350

AAA

GTT

GGT

TGA AAC

ATC

GTG

AAA

AGA

GTT

ACT

AAA

CTG

GCC

GAT

GTA

G7«8

Lys

Vei

Gly

Ser

Aea

lle

Val

Lys

Thr

Vei

Thr

Lys

Lee

Ale

Aep

Val

255

370

375

30«

TTT

GTT

GAG

AAC

GTT

TCA

AAA

GTT

GCG

GCA

ACG

GCA

AAT

GGA

TTT

8755

«he

Vei

Gla

Asn

Vei

Val

Ser

Lys

Vei

Alá

Ale

Thr

Ale

Aaa

Gly

«he

255

28«

305

ACG

ACC

TCT

GCA

CGT

TCT

ATT

GGG

ACA

ACT

GTG

CTG

AAT

GAT

TCT

8004

Thr

Ser

Alá

Arg

Ser

lle

Gly

Thr

Val

Lee

Asn

Aea

Asp

Ser

30«

7

305

31«

GCG

GAA

TAT

AGG

ATA

TTG

GCT

CAG

TTA

TCT

GCT

TAC

GCG

GTA

CA&

AAC

0852

Ale

Gla

Tyr

Ser

lle

Lee

Ale

Gla

Leu

Ser

Ale

Tyr

Alá

Val

Gin

Asn

315

330

335

TTA

ACT

GGA

CAG

AGT

GAA

AAC

CTG

GGT

GAG

AGT

GGG AAG

GTT

GAG

CTG

8300

Aee

Thr

Arg

Gla

Ser

Glu

Asn

Leu

Gly Gla

Ser

Alá

Lys

Vsl

Gla

Leu

SS®

335

w

GAT

AAA

GCT

GCA

GCC

GAG

TTG

GGA

AAC

CAG

GCA

AGG

TAT

TTA

CAA

AAC

8540

Asp

Lye

Ale

Alá

Gla

leu

Arg

Aea

Gla

Alá

Ser

Tyr

Leu

Gla

Aea

Ser

GCT TCT CAG ΤΤΑ ΑΤΑ TGG GAC TCA GCA CGA GXA &ΑΤ AGG CGT ATT GTT Alá Ser Gla Leu Xle Ser Asp Ser Ale Arg Val Aaa Ser Arg lle Vei 378

355 * *♦»#♦**♦

Λ* > * * ♦ * * * * *♦# » «·*♦

AGT ©GT CGA ©η

TAA *

TTATTAAAGA GAATTTAATT ATG AAT ACT ATT GAT Két Asa Thr Xle Asp

5045

Ser Gly

Arg Vei 350

1

5

TAT

ACT

AAT CAA

©TA AT© AGG GTT AAT TCT

GTT

TCG GAG

AAT

ACT

ACC

sose

Tyr

Thr

Asn ©le

Vei

Met

Thr va l

Asa

Ser

Val

Ser ©lu

tos

Thr

10

X5

20

GGC

TCT

AAT GCA

ATT

ACC GCA TCT

©CT ATT AAT

TCA TCT

TT©

CTT

ACC

3X42

©ly

Ser

Aon Alá

Xle

Thr

Alá Ser

AX&

Xle

Asn

©er ©er

Leu

Thr

25

30

35

GAT

GGT

AAG

GTC

GAT

GTT

TCT AAA

CTG

ATG

CTG

©AA ATT

CAA

AAA

CTC

0150

Asp

GXy Lys

Val

Asp

VAX

Ser Lys

Lee

Mer

Leu

Giu Xle

Gin

Lys

Leu

40

45

50

CTG

GGC

AAG

ATG

©X©

CGT

ATA TT©

CAG

GAT

TA©

CAA. CA©

CAA

CA©

TT©

5230

Leu

ciy

Lys

Met

Val

Ar®

xle Leu

©la

top Tyr

©In Glu

©la Gin

Leu

55

SO

SS

TG©

CAG

AGG

TAT

CAG ATC

CAA CTG

GCC

GTT

TTT

©A© AGC

CAG

AAT AAA

3280

Ser Gin

Ser

Tyr

©la, Xle

Gin Leu Alá

Val

Ph®

Giu. Ser

©la

tor Lys

TO

75

00

S5

GCC ATT

GAT

GAA

AAA AAG

GCC ©CT

©CA

ACA

GCC

GCT CT©

GTT

©GT

GGG

3334

Alá

Xle

Asp

Glu

Lys

AXa Alá

Alá

Thr Alá

Alá Leu

Val

©ly Gly

00

SS

100

GCT

ATT

TCA

GTA

TTG

GGG ATC

TTA GGC

TCT

TTT GCA GCA

ATT

AAC

3302

Alá.

Xle

Ser

Val

Lee.

Giy Xle

Leu

Gly

Ser

Phe Al®

Aia

Xle

Asn

205

110

115

AGT

GCT

AC©

AAA

GGC

©CG

AGT ©AT

ATT

GCT

CAA

AAA ACC

©cc

TCT ACA

3430

Ser

Alá

Thr

Lys

Gly

Ma

Ser Asp

Xle

Alá

©le

Lya Thr

Alá

Ser

Thr

ISO

125

. 130 7*'·

TCT

AAG

GCT

ATT

GAT

GC© ©CT

TCT

©AT

ACT

GCG ACT

AAA

ÁCS

TTG

5470

Ser

Lys

AXa

Xle

Asp

Alá Aia

Ser

top

Thr Alá Thr

Lys

Thr

Leu

135

140

245

ACT

AAG

GCA

ÁCS

GAA AÖC

©TT GCT

©AT

GCT ©TT

GAA GAT

©CA

TCC

AGC

3525

Thr

Lys

Alá

Thr

Glu

Ser Val Al®

Asp

Alá

vai

©lu Asp

Alá

Ser

ISO

155

150

XS5

GT©

ATG

CA©

©CA AC©

AGA

©CG GCC

AGC

CGT

ACA

3574

Val

Met

©In

©In Alá

Thr Thr Aia

Thr

Ar®

Alá Alá

Ser

Ar®

Thr

170

175

4 ' :«·

XOO

TCC

GAC

GTT

GCT

GAT

GAC

ATT GCC

GAT

TCT

©CT

CA© AGA GCT

TCT

CA©

SS22

Ser

top

Val

Alá

top

Asp

Xle Alá

top

Ser

Alá

Gin Arg Ma

Ser

©la

105

ISO

105

CT©

GCT

GAA

AAC

©CT

GCA GAT GCC

©CT

CAG

AA©

©CA AGT

CGG

©CA

AGC

3S7©

Lee

Alá

Gitt

&Sh

Alá Alá Aep Alá

Alá

©la

Lys

AXa Ser

Ar®

Ma

Ser

200 205 2ΧΟ

Φ 4*,. φ W * ♦ ♦ Φ * 9 9 Μ

X φ Φ*Χ· φ * * * · φ φ

Χ.« Φ 4*Χ «V ·ΦΦ*Χ

O3C TXT ATG GCT GCA CTA GAT AAG ATT ACT GGC TCT ACA CCA TTT ATT 8?28

Arg Phe hht AXa Als Val Asp Lys He Thr Gly Ser Thr Pro Phe Xle

21S 220 225

AX& Val Thr Ser Leu Alá Glu Gly Thr Lys Thr to Pro Thr Thr VaX

339 235 240 245

TCT GAA TCA GTC AAA TGT AAC CAT GAG ATT AGC GAA CAG CGT TAT AAG 38X4

S®r 81« Ser Val Lys Ser Asn His Glu XX® ser Glu Glu Arg Tyr Lys

25« 255 280

TCT GTG GAG AAC TTC CAG C&íS GGT AAT TTG GAT CTG TAT AAG CAA GAA 3862

Ser Val Glu Asn Phe Gin Gin Gly Asn X»e« Asp Len Tyr Lys Gin Glu

265 279 275

Val Arg Arg Alá Gin Asp Asp 11® Alá Ser Arg heh Arg Asp hét Thr

AGA GCC GCT CGC GAT CTC ACT GAT CTT CAG AAT CÖt ATG GGT CAA TCG 835S

Thr Al® Alá Arg Asp to Thr Asp Leu Gin Asn Arg Siet Gly Gin Ser

255 30« 505

GTT CGC TTA GCT GGG TAA TTGATCATGG TCGATACGTT TAATGATGAA 10995

Val Arg Lau Alá Gly *

21« 315

GTGCTTAATC ACTATCTTGA ACAAAAAGGG TACACA&T&C AGAAGGAGTT TCTTTGTGGC 10966

A8T8GCTTTT TTATCGGATG GCGGATTGAG ACCTCTTTTT TCTCATTAGC GTACAGACTT 10125 6 ©ATGAACAAG AACTGATTTT GTGCTCTTTT GAAGCACGTA ACÖU&C&GG GCTTAACÖGC 10136 CCTGTTTTAT CACTGACTCG CTTGCTCGAA GAGTTGTACC AC^TTTTTC GGGTATTAAG 18245 AAAATCAGTG CGATGAAATŐ TAAGATTGST TCAGATTCA© AACGTCAAAA GCGCGAAGAG 10385

TTGTTTAATT ACTTCATCAG AAAGGGCGCT 62GCASCAA6 AAACAGAAGA CGGAATTTGG 18355

TTCGTAAVGA ATGTAAATAG TTACAAATTT TTATTTCTAT TAACTATTGA GGAAAATTTA 10525

ATGAATTTAT CTGAAATTAC TChACAAATG GGTGAAGTAG GTAAAACGCT GAGTGATTCT 195 8 5

TTTCTGCCAA CAAGCTACTG GTGTGGGCGG CTGTAGCTGC GGCAAATCAT AAGCTTCCCA 10726

AATAT8C&GA ATCTATCCTG GATGTATXGC CGCAAATTAT ACCCGATA&A AAAGATATCG 1078®

CACATTTAGA ATTTATTATT TTATATGGAT TAAATAGAAA AAATOATGCG GTAAASGCTC 10845

TGGAGGACTT TATGGATGAT GAGACAAGCC AGTTGTTATG CTGTCTGGTC CACGAGAATA 18506

ATAGAAGCTS GACACTAATG

GTAC0AAA2T TTCTMGTTr

TTWAKn AATOAAATT

TATGtTTAM GGAATTAGTC

AAÖCCGÖQTA ASCTCWTOG

GAATSCSAXT AÖW2TCAAT

GACTTTTMT osactagcc

GTOSACAAGT SGAOÚ3XCTT

AAAAGATCAT TTAGCTSCCT

AAGCCGCCCS GCACCGGGGS

ACXGCCCACT GCTCM^CÓC

WATACTSA SGTCTTAAOC &TCCGASGC& TCCSSS^CÁT otatgaactg tcsaaaaagg

TTTAGASAST· TA&&&OTAA

ATATCWXT2 «M2GAAAX

AÖW3GÖT3T XTCSTTAACC

AXGTTSGATl 'TGACATATCA csotatttttt ttetwra®

Aöcxsmtím WSTGGG3S.

AWCTTTTGG AAGAACTGÖT

TACTrCTCXA CTCACTfóXT

ÖATTATGASA TGGXTS&TAG

CTTTTCAATX ®ΤΠ»Μ

AGCACAATAT TTGTCAATTC

TCTOTCCAG' SCATTAAIAT

QTTCAGCGXA TTTCTSÖ&TA

ATCAGATTTC STCÜAGCAGG

- 46 ~ ttttaatctc atattgagtt

TAACAGAGAT ATTTATAATA cawww? nsw?w wwtssts romw tóswmc 1ACAC1AGGA

OGTTATCTGÜ CTTTTCACTG

CTCOTTTTt TCCCSGXAC2

OTgeSASTTC ATTTACTOSG ccsssccatc coAxcrm

AXSAAAAXXC SAAAAGTSTT

ÖGCCGACAAG CSGGTTGGTA

TAAAAGAXCA TTTGGCXGCC

CAAGCCGttt GGCACO3CCG

TACC8CSTAT TGCTCAÖ2CA

C&TAAAAAGT ΑΟΑΤΓΓΑΑΑΑ

AAACWATAT T&&STTGCAT

AAAXAXTG1A ATMAXGATÖ

ASAffiXXÚTA ATTTTTIATC acatőasöca ssssome

Í5T»» TAICTCIATT txxcatcwx TAíseteros

CTGOTWTG ATTGÖCTATT

T8CTAASC&T ATTTATTTTA

AGCTTTÖCGC XGGXATGAXA

CTCTTTGGCG XAOTCACTO

CCTWrWAT CACGCGAOAT ctthsgt&ct rmrceoGCG

ACTOATAGT OTCTWCC

ACTGTTTCTÖ ÖATA&ASCTT φ $.>·... > <**» X ** ♦ * * * *X X 0 * * *»x * * * 0 * ·* * #*0 -0 ««* i* *«*»

TAAACMTTG ATAMtTTCA

CCTTMTGAA AAAXAX^GCT

AGTTTATA3T CGtTAACTAT

ASATATAAAA AGGSATGA&T

CGÓCATA11A CTAÜTGCGGC

WCCTCWG CTSTTCGTCT

TOMATATSA ATGCGAO&AC

TCTCGTCtW CCCCACCGCC

COXCCCATTG CTCAGGCATT

ÖATACTTCAA ÖSCTTAAGCC

TCÍGGGTCAT GCCGGTCTTX

TATGAAAA&X CGAAAAGTCT C^CCCACAA GTGGACAOGC

Λ\'γ

TTAAAASATC AWWCTSC

TTATTAATTA CTGTTÜATTG

TCTGATAAAT GTSATTGGTA

AAAGAGWTA ATAGAGCAAG

CA1AAATTTA CCGC1ATXTG

TGX&TGTACA GGC1CTTATA ·*<· k.

XAWCCGATA 2dASGCT3GC „Av

AihoAC&T ertmcTAAT ACATCCACTG TCTGGTTCTT

TCACOSAA&C SACCATTXC

TTCAACTXGA GACTGXAATG

GAAATGTTTC TGOTATTTTC

GWTAA&CTO XTCGCXCATC

ACGGAGGTCA AAATTCOGTT

AWJAACATC GCW3AT&TC •'\·ν:.

xo$s«

1X22«

XXÖSS mo

XX2ÖS

1120

XX32S

ΧΧ3Ο

UUŐ nsM

XX5O

XX8GS »538

XX98S

X284S

1210« mss

12228

1228«

12X4«

X24®8

124««

1252«

X2S8S

12«2« *♦ « # ♦♦ * * » y *♦« κ ♦ » * * * κι*# 9 «<Χ4Γ ί» Λ»<·Χ

- 47 A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 940 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULÁT íPVS: fehérj e

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Ile Thr Hi® Gly Phe Tyr AI® Arg Thr Arg His Lys Hi® Lys Le»
1	5	lö	IS
Lys	Lys Thr Ph© Ile Met Leu 2® y	Ser Ale Gly Leu 25	Gly Leu Phe Phe Tyr J 3®
Val	Asn Gin Asn SeriPhe Alá 3S A _:g<	Asn Gly Glu Asn 4®	Tyij Phe Lys Leu Ser L·· 45
Ser	Asp ser Lys Lee Lee Thr Gin Áss Alá Ale SS SS	Gin Asp Arg Leu Phe 5®
Tyr SS	Thr Leu Ly® Thr Gly Glu 7®	Thr Val Al® Asn 75	Ti® Ser Lys Ser Gin SS
Gly	Xle Ser Leu Ser Vei He SS	Trp Ser Leu Áss. 0®	Ly® Hl® Leu Tyr Ser 55
Ser	Glu Ser Glu hét Met Lys 10®	Ale Gly Pro Gly 305	Gin.. Sin ile Ile Leu Ú 110
Pro	Leu Lys Lys Leu .Ser Vei I1S í	Glu Tyr Ser Aia 32®	LeuPro Vei Leu Gly Á 125
Ser	Al® Pro Val Val Aia Al® 136 325	Gly Gly v»X Alá	Gly Mi® Thr Asn Lys 14®
m 14S	Thr Lys Hét Ser Pro Asp 1SÖ	Ale Thr Lys Ser 155	Asn Thr Thr Asp Asp IS®
Lys	Ale Leu Asn Tyr Al» Al® 3SS	Gl» Gin Al® Al® 17S	Ser Leu Gly Ser Sin 175
Leu	Gl» Ser Arg Ser Le» Asn is®	Gly Asp Tyr Ale 1S5	Ly© Asp Thr AI® Leu IS®
Oly	hét Al® Ser Ser Gin Ale 1S5	Ser ser Gin Leu 200	Glh Alá Trp Leu Gin 205
Kb	Tyr Gly Thr Al® Glu Val 21® ' 235	Asn Leu Gin Ser	Gly Asn Asn Phe Asp 22®
SXy 225	Ser Ser Leu Asp Phe Leu 250	Leu Pro Phe Tyr 235	Asp Ser Glu A»» Met 24®
Leu	Ale Phe Gly Gin Vei Gly	Ale Arg Tyr ile Asp Ser Arg Phe Thr

24S 25® 255

X fc «4 ♦ fc· ♦ ♦ ♦ 4 ♦ ♦ 4

Aln Asn leu Gly Alá

Ile

Gin Arg Phe

Phe Phe

Le® Pro Gin

Asn 278 Asn

Ke® Thr

Len Arg

Gly Tyr Asn

258

Asp Gin 288

255 Aep

8er

Gly Asp 23$

Val

Phe

275

les

Gly Ile 288

Gly

^aly

Glv

Tyr Trp Arg Asp Tyr 285

Phe Lys 388

Ser

vei

Asn 385

Gly Tyr

Phe

Arg heh 318

Ser Gly

Trp

His

Gin 315

Ser Tyr

Asn

Lys

Lys 320

Asp

Tyr Asp

Gin

Arg 325

Pro

Als Asn

Gly

Phe 330

Asp

ile Arg

Phe

Asn 335

Gly

Tyr

Les Pm

Ser 348

Tyr

Pro

Alá Lee

GXy 34$

Als

Lys

Lei Két

Tyr 388

Gin

Tyr Tyr Gly 35$

Asp

Aen

Val

Alá Len 358

Phe

Asn

Ser

ASp Lys 355

Len

Gin

Ser

Asn

Pro Gly $78

Ale

Alá

Thr

Val Gly 375

Vei

Asn

Tyr

Thr Pro 388

Ile

Pro

Len

Vei 38$

Thr Get

«X

Ile

Asp 388

Tyr Arg

Als

Gly

Thr 385

Gly Asn

Gin

Asn

Asp 488

Len

Len Tyr

$®r

Kei 485

Gin

Phe Arg Tyr

Gin 418

Phe

Asp Lys

Pm

Trp «15

Ser

Gin

Gin Ile

Gin 428

Pro Gin

Tyr val

Asn 525

Gin

Len

3A Arg Thr

Les «38

Ser

Gly

Ser

Arg Tyr 835

Asp

Len

Val

Gin Arg «48

Asn

Ile Ile «45

Len

81®

Tyr

lys

Lys Gin 558

Asp

lle

Len

Per Leu «55

Asn

Ile

Pro

Kis Asp 558

Ile

Asn

Gly

Thr 555

Gin Síé

Ser

Thr

Gin 478

Lys lie

Gin

Len

lie «75

Vei Lys

Ser

Lys

Tyr 4S0

Gly

lsen Asp Arg

lle

Val

Trp Asp Asp

Ser

Als

Les Arg

Ser

Sin

Gly

48$ «80 «85

GXy Sin Ile óla Kis 8ly Oly Ser Sin Ser Us Gla Asp Tyr Gin Alá w sós sic

Ile Leu Pro Als Tyr Val Gin Öly Gly Ser As® Ile Tyr Lys Vél Thr SIS §2& 52S

Als Arg Als Tyr Asp Arg Áss Gly Áss Ser Ser Áss Áss v&i Gin Le® 538 $35 S«0

Thr Ile Thr Vei Len Pro Áss Gly Gin Vei vei Asp Gin val Gly Val 54$ 558 SS5 SSG φ φ

Thr Asp Phe Thr Alá Asp Lys Thr Ser Alá lys Alá Asp	Gly Xle 875	Gitt
555	570
Mis Xle Thr Tyr Thr Alá Thr Val Lyg 589 585	lys Áss Gly Val	Alá Gl® 559	Alá
As® val Pr© val Thr Phe Ser Xle Val 985 890	Ser Gly Thr Alá 895	Thr léé	Gly
Alá As® Ser Alá. Arg Thr Asp Oly &s& Sly lys Alá Thr 810 815 820	Val Thr	lett
Lys Ser Alá Thr Pro Gly Sin Val Val 825 810	Val Ser Als lys 855	Thr Alá	Gitt 840
Met Thr Ser Pro leu A®» Alá Ser Ale 885	val xle Phe Val 880	Asp Gitt 855	Thr
lys Alá Ser Xle Thr Gle Xle lys Alá 889 885	Asp lys Thr Thr	Alá Lys 870	Al®
Asp Gly Ser Asp Alá Xle Thr Tyr Thr 875 859	Val Arg Val' Mer 885	Lys Gitt	Gly
Alá Pró Val Val Asp Gin lys Val Thr 889 SS5	Phe Ser ly® Asp 799	Phe Gly	Thr
lev As® lys Thr Gle Alá Thr Thr Asp 795 719	Gitt Áss Gly Tyr 715	Alá Thr	Val 720
lye les Ser Ser As® Thr Pre Gly lys 725	Alá Xle Val Ser 730	Alá lys 735	Val
Ser Oly Val Gly Thr Gitt vei lys Alá 740 745	Thr Thr Val Gitt	Phe Phe 750	Alá
Pre Leu Ser Xle Asp Gly Asp lye Vei 75S 780	Thr Val Xle Gly 788	Thr Gly	Xla
Thr Gly Alá lett Pro lys Asn Trp le® 770 775	01® Tyr Gl/ Gitt 750	val Lys	lett
Glh Alá Thr Gly Gly Asn Gly lye Tyr 785 799	Thr Trp lys Ser 795	Ser As®	Thr 990
lys lle Alá Ser val Asp As® Ser Gly 595	Val Xle Thr le» 910	As® Glu §15	Lys
Gly Ser Al® Thr lle Thr Val Val Ser 820 825	Gly Asp As® Gl®	Ser Alá 950	Thr
Tyr Thr lle As® Alá Pre Gly Ser Xle 535 989	Val Xle Alá val 585	Asp Lys	AStt
Thr Arg Val Thr Tyr Phe Asp Alá Gitt	as® Lys Gye Lys	Thr As®	Ser

859 855 δ«0 *» * » * * * *» * * «** * ♦** »·*· ♦ * * ·>

♦ ♦ * X

Ma m

Trp

Thr

SÍ»

Le» Lett

As» Lys Tyr Pro Tyr Tyr 5SS 880

Lys-Sin ser Ser Ser 81« SOS

Π® Tyr Ser Thr

W

Ser Lys Ser Le»

835

Ser Oly Val Ser SIS

Ser Thr Tyr Asp Leu/v&X Thr Lys SIS 320

A®» Val Gly Val ’ $2$

Asn Asn Lys Asn AU Phe Ser V&X Cys Val Lys *

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÓ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HŐS S E A: 193 ami no s a v

TíPUS A: aaínosav

TOPOLÓGIÁJA: 1 i n-eári s .> Οώ

EKVSNCIA LEÍRÁSA:

Ne»

Asp

Thr

Ser

Thr

Alá

Thr

Ser

Val

Alá

Ser

AXa

Asn

Alá

Ser

Thr

X

5

20

25

Ser

Thr

Ser

Thr

Val

Tyr

Asp

le»

Oly

Ser

Net

Ser

Lys

Asp

82»

Vei

20

25

30

vax

81»

Le»

Phe

As»

Lys

val

8Iy

Val

Phe

Gin

Alá

Le»

Lee

Net

35

20

<5

Phe

Alá

Tyr

Met

Tyr

81»

Alá

81»

Ser

Asp

LStt

Ser

XXe

Alá

Lys

Phe

50

55

80

Als

Asp

Net

As»

81»)

Alá

Ser

Lys

81»

Ser

Thr

Alá

01»

Lys

Net

55

' TO

75

80

Α1»

Asn

Leu

Val

Asp

Alá

Lys

lle

Alá

Asp

VaX

Sin

Ser

Asp

SS

30

35

Lys

As»

Lys

AXa

Lys

La»

Pro

81»

Val

He

ASp

Tyr

22«

Asn

200

105

120

Asp

Pro

Arg

AS»

Asp

XXe

Thr

Vei

Ser

Oly

Xle

Ser

Asp

Le»

Asn

Alá

115

120

225

Sí».

Le»

Oly

Alá

Gly

Asp

Leu

81»

Thr

Val

Lys

Alá

lle

Ser

Alá

120

135

240

Lys

Ser

Asm

As»

Le»

Thr

Val

Un

As»

ser

81»

Le»

81»

lle

245

ISO

155

ISO

8ln

81»

Met

Ser

AS»

Thr

Le»

As»

Le»

Thr

Ser

Alá

Arg

Ser

Asp

1S5

170

175

y» #6 9 «· * *' » « ♦ Λ » ν * » » * ♦ *

Φ«Κ χ *·»* *♦. ♦**« * ♦·« e

Ue din Ser Leu Sin Tyr fcg Thr Ih Ser Alá Xle Ser Leu Gly Lys .„_Λ t*c 190

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁNÓ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 381 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

4. AZONOSÍTÓ SZÁNÓ SZEKVENCIA	LEÍRÁSA:
Mer Le» Asn Val Aaa Ser Asp ile Gin	Ser Met Arg Ser Gly Alá Ser
1 5	18 15
Alá Alá Thr Alá Thr ser Gly Ile Asn	Gin pr© Glu val Thr Ser Alá
28 2$	38
Len Asp Len Sin Len val 5yg Ser Thr	Alá Pr© Ser Alá Ser Trp Thr
IS ' 48	45
Sin Ser Thr Alá leu Pr© Thr Pr© Pro	Alá Gly Kis Ser Leu val Thr
58 55	88
Pro Ser Vei Alá Sin Asp Val Len Ser	Lys Leu Phe Gly Gly Xle Ser
SS 70	75 88
Gly Glu Val Arg Ser Arg Thr Sin Gly Thr Glu Pr© Gin Arg Ser Thr
85	28 25
Gin Asn Alá Ser Ser Gly Tyr Pr© Tyr	Leu Ser Gin Val Asn Asn Val
188 ν 18s	118
Asp Pr© Gin Alá Mer két hét Met Val	Thr Leu Leu Ser Leu Asp Alá
US 138	185
Ser Ale Gin Lys Vei Alá Ser Mer Lys	Asn Ser Asn Glu xle Tyr Thr
138 135	148
Asp Gly din Asn Lys Alá Len Asp Asn	Lys Thr Leu Glu Phe Lys Lys
145 158	155 158
din Leu Glu Glu Gin Gin Ly® Alá Glu	Glu Lys Alá Glu Lys Sár Lys
185	178 175
Ile Leu Gly Gin Val Phe Gly Trp Leu	Gly Val Ali Val Thr Alá Xle
188 1S5	188
Alá Alá Xle Phe Asn Pr© Al» Leu Trp	Alá Val val Alá Val Ser Alá
155 > 288	285

ΧΦ * Φ ** fc fc «« ♦ * φ «' »** $ ♦ * fc * S * «44 ♦ «♦· *fc «»νΦ ~ 52 -

Thr Alá mt Π3	AiA Les	81a	Thr Al» Val Asp Val h»fe Cly A»g	lya	Alá
215	223
81» Alá	le» lys	Thr Als	A) a 81» rrl Ph» Gly 8ly Vei	Ser	XI®
225		233		235		2» 8
Alá Ma Ser	lls Lea	Thr	Alá	Giy lle 8ly 81y val Ser Ser	Ae«
	áss			258 ,;	255
ssa hyg Val	Giy Asp	V&i	Als	Aa» lys Val Sly 8sh As» Xle	Val	lys
	288			2®» s?e
Thr val Thr	lys les Als	Asp	Val Phe Val 81» hsa Vei Val	Ser	lys
27$				2S8 285
VAX Alá Alá	Thr Alá	Asm	8Xy	Ahe Thr thr S»r Alá Arg Ser	Xl<	81 y
2 SS			2 SS	388
Thr Thr Val	1®« Áss	As»	Asp	Sár Als 81» Tyr Ser 11« 1«»	Als	81»
389		319		313		328
Xísö Ssr Alá	Tyr Als	Val	81»	As» t-eu Thr Arg 81a Ser 81»	As»	leu
	325			338 A	335
Gly 81» Sár	Als lys	Val	81»	le» Asp lys Als Als Alá 81»	Lse	Arg
	3« .»			345 358
AS» 8ls Als	§»r Tyr	Ims	81»	&»» Als Ser 81a les Xle Ser	Asp	Ser
355				3AV 355
Als Arg val	Asn Ser	Arg	11«	Val Ser Cly Arg Val *
37S			37»	388

ΑΖ 5, AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 315 aminosv

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓG IÁJA: 1 i n sár í s

MOLEKULATÍPUS: fehérje

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

WV

Aea

Thr

11»

ASp

Tyr

Thr

As»

81»

Val

Hét

Thr Vei

As»

8er

Val

1

5

18

Ser

81»

As»

Thr

8ly

Ser

As»

Als

Xle

Thr

Al» Ser

Alá

Xle

A»»

Ah

25

78

Ser

Per

ΙΑ»

hee

Thr

Asp

Sly

Lys

y&x

Asp

Val

Ser lys

Les

fíefe

Χλ«

15

48

. 88

81«

xle

81»

Lys

les

X>»«

8iy

hy»

M»fc

Val

Arg

tle les

81»

Asp

Tyr

58

55

88

81»

A®»

S»r

81a

Ser

Tyr

81»

Xle

81» A»»

Alá

Val

Phe

55

73

75

58

* »« Φ ν *Φ * χ t * Φ 0 ϊ. Λ * * * * « »Χ« « »·*« *Φ Ή ν«

Gitt Ser Gla A®» Lys Al® XI» Aap Glu	lya Lys Al® Alá Alá Thr Al®
	SS	90	55
Alá les Vei	Gly Gly-Alá Xle Ser Ser 100 lóg	Val	Les Gly Xle Leu Gly Ser 110
Phe Ma Al® 1X5	Xle Asn Ser Alá Thr Lys GXy Al® Ser Asp Xle Al® Gle 128 125
lys Thr Al® 130	Ser Thr Ser Ser lys AX® 135	Xle	Asp Alá Alá Ser Asp Thr xao
Alá Thr lys 145	Thr lett Thr Lys AX® Thr 158	Gitt	Ser V®X Ale Asp Alá val 155 ISO
Gitt Asp AX®	Ser Ser Vei Kel Gla Gin 155	Al® 170	Met Thr Thr Alá Thr Arg 175
Alá Al® Ser	Arg Thr. Ser Asp Val Ale ISO 18S	Asp	Asp Xlé' Alá Asp Ser Als 190
Gin Arg Al® X95	Ser Gin Lee Al® Glu Asa 290	Alá	Al® Μρ Alá Alá Gitt lys 205
Alá Ser Arg 2X0	Alá Ser Arg Phe Két AXa 215	&X&	Val Asp ly® Xle Thr Gly 220
Ser Thr Pre 225	Phe Xle Alá Val Thr Ser 230	Les	Ale Gle GXy Thr Ly® Thr 235 250
Les Pre Thr	Thr Vsl Ser Gla Ser Val 245	lys 250	Ser Aaa His Gls lle Ser 285
Gle Gle Arg	Tyr lys Ser Val Glu Aen 280 2 SS	Phe	Gitt Gitt Gly AStt Lett Asp 270
Les Tyr lys 275	Gin Gis Vei Arg Arg .Al® 280	Gla	Aap Asp Xle Al® Ser Arg 285
les Arg Asp 2S0 Arg Met Gly	Kér Thr Thr Alá Alá Arg Asp 2 SS Sin Ser Val Arg lev Alá Gly	Les Thr Asp les Gla Asn 300 4

305 ' 3X8 3X5

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1) Eljárás nem-patógán E. coll mutáns előállítására epiteliális HeLa-sejtekben citopatogén hatást kiváltani képes patogén. B. coli mutánsból - amely citopatogén hatás részint abban nyilvánul meg# hogy polimerizált .aktínból kábelek képződnek# amelyek a sejtek egyik végétől a .másikig áthúzódnak, részint pedig abban# hogy nő a vinvulin mennyisége- -# azzal jellemezve# hogy a patogén S, coli törzset mutagenízárjuk és a cítoptatikus hatást kiváltani nem képes mutánsokat kiválasztjuk.
2} Nem-patogén mutáns E. coli törzs# azzal jellemezve# hogy az az I. igénypont szerinti eljárással lett előállítva.
3j A 2. igénypont szerinti nem-patogén mutáns E. coli törzs# azzal jellemezve, hogy legalább egy olyan mutációt hordoz# amely az LEE-Iökusz legalább egy génjét inaktiválja.
4) A 2. vagy 3. igénypont szerinti nem-patogén mutáns B. coli törzs# aszal jellemezve, hogy az olyan E. coli törzsből nyerhető# amely nyulakra nézve patogén# és amely az 01.03 szérumcsoporthoz tartozik.
5) A 4, igénypont szerinti mutáns törzs, azzal jellemezve# hogy 0103 szérumcsoporthoz tartozó nyálakra nézve patogén E, coli törzsként a CNCM-nél (.Mikroorganizmus' Tenyészetek Francia nemzeti Gyűjteménye) 1997 január 15.-én 1-1807 szám alatt letétbe helyezett BIO jelű törzsből állítható elő.

δ) A 2-5. igénypontok bármelyike szerinti nem-patogén. mutáns E. coli törzs# azzal jellemezve# hogy legalább egy **· * .*<**» ** «. » * « « 9* » ♦ »χ» az LSE-iőkusz legalább egy aep-~génj ének inaktiválását eredményező - mutációt hordoz.
7) A Blö/C&l jelű nem-patógán mutáns .5. coli törzs, amely a CNCM-nél (Mikroorganizmus Kultúrák Francia Nemzeti Gyűjteménye) 1997 január 15,-én 1-1808 szám alatt letétbe lett helyezve.

S) Vakcina, amely legalább egy, a 2-7, igénypontok bármelyike szerinti nem patogén mutáns £. coli törzset tartalmaz .
9) A 8,- igénypont sserinti vakcina, amely orálisan, alkalma zhat ő ,
10) A 2-7. Igénypontok bármelyike szerinti mutáns £. coli törzs alkalmazása vakcina előállítására.
11) A 10. igénypont szerinti, alkalmazás, azzal jellemezve, begy nyuiaknak beadni kívánt vakcinát állítunk elő.