HU221186B1 - Chlorophyll and bacterio chlorophyll derivatives, method for producing them and diagnostic and pharmaceutical compositions comprising thereof - Google Patents

Chlorophyll and bacterio chlorophyll derivatives, method for producing them and diagnostic and pharmaceutical compositions comprising thereof Download PDF

Info

Publication number
HU221186B1
HU221186B1 HU9302149A HU9302149A HU221186B1 HU 221186 B1 HU221186 B1 HU 221186B1 HU 9302149 A HU9302149 A HU 9302149A HU 9302149 A HU9302149 A HU 9302149A HU 221186 B1 HU221186 B1 HU 221186B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
bchl
ester
formula
ser
chl
Prior art date
Application number
HU9302149A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9302149D0 (en
HUT64949A (en
Inventor
Leszek Fiedor
Yoram Salomon
Avigdor Scherz
Original Assignee
Yeda Res & Dev
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yeda Res & Dev filed Critical Yeda Res & Dev
Publication of HU9302149D0 publication Critical patent/HU9302149D0/hu
Publication of HUT64949A publication Critical patent/HUT64949A/hu
Publication of HU221186B1 publication Critical patent/HU221186B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0036—Porphyrins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0052—Small organic molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/68—Melanocyte-stimulating hormone [MSH]
    • C07K14/685—Alpha-melanotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Radiation-Therapy Devices (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát új klorofill- (Chl) és bakterioklorofill- (Bchl)származékok, előállításuk, valamint készítmények alakjában afluoreszcens detektálási és nyomkövetési technikában, valamint a rákfotodinamikus terápiában való alkalmazásuk képezi. A találmányszerinti eljárással a klorofill (Chl) és bakterioklorofill (Bchl)olyan konjugátumait állítják elő, amelyekben a konjugálódómolekularész a 17-propionil-Chl- vagy a Bchl-csoporthoz kapcsolódik. Atalálmány sze- rinti konjugátumok a daganatos sejtekben és szövetekbenfelhalmozódnak, és tumorok diagnosztizálására, valamint afotodinamikus terápiában (PTD) fotoszenzibilizálóként használhatók. ŕ

Description

A találmány tárgyát új klorofill- (Chl) és bakterioklorofill- (Bchl) származékok, előállításuk és diagnosztikai készítmények alakjában való alkalmazásuk képezi.
Az elmúlt két évtizedben növekvő érdeklődés nyilvánult meg fényérzékenyítőknek (photosensitizers, fotoszenzibilizálók) a rák terápiájában való alkalmazása iránt. Ebben a fotodinamikus terápia (photodynamic therapy vagy PDT) néven ismert technikában szingulett oxigén, oxigéngyökök és peroxidok keletkeznek az előzetesen adott kromofórok in situ fotoszenzitizálása útján, és mérgezik a rosszindulatú daganatsejteket [Dougherty, T. J. Photochem. Photobiol., 45, 879-889 (1987)]. Ez a technika nemtoxikus hatóanyagokat alkalmaz nem veszélyes fotoszenzitizáló besugárzással kombinálva, és az általánosan alkalmazott kemoterápiához vagy radioterápiához viszonyítva potenciálisan szelektívebb és még kevésbé romboló is, ennélfogva várhatóan javítja a kezelt páciensek életminőségét.
A PDT-ben használt fényérzékenyítőknek a szingulett oxigén termelésére nagy kvantumhasznosítási tényezővel kell rendelkezniük, és a rosszindulatú daganatos szövetekre nagy affinitásúaknak és szelektíveknek kell lenniük. A porfirinek viszonylag magas kvantumhasznosításúak egy gerjesztett triplett állapot létrejötte esetében, és az ezen állapot és a szingulett alapállapotuk közötti energiakülönbség jó energiadonorokká teszi ezeket az alapállapotú (triplett) oxigén szingulett állapotba való gerjesztésére. Egy ideje ismeretes már, hogy a hematoporfirin (HP) (lásd az 1. ábrát) és a hematoporfirin-származékok (rövidítve HPD) hajlamosak felhalmozódni a daganatos (neoplazmás) szövetekben, így a HP- és HPD-keverékek a PDT részére előnyös vegyietekké váltak.
A kereskedelmi forgalomban levő, fotodinamikus szerként használt HPD-keverék, a Photofrin II (Quarda Logic Technologies, Inc., Vancouver, BC, Kanada) nagy részarányban olyan éter kötésű HP-oligomereket tartalmaz, amelyeknek 400 nm körül (az úgynevezett Soret-sávban) magas az extinkciós koefficiensértékük, míg ez az értékük a látható tartományban (500-630 nm közötti; az úgynevezett Q-sávok) sokkal kisebb. Sajnos az állati szövetnek az UV-látható fényt erősen gyengítő hatása miatt a HPD in situ kifejtett fotoszenzitizálásának kvantumhasznosítása igen kicsi. Ezért intenzív megvilágítás és nagy mennyiségű HPD szükséges tumorok kezeléséhez. Ahogy növekszik az alkalmazott HPD mennyisége, ugyanúgy erősen növekszik a normális szövetekben való felhalmozódás és a nemdaganatos helyek ezzel együtt járó károsodása veszélye. A HPD és analógjai egy további hátránya az, hogy lassú az emberi testből való kiürülésük. A HPD-vel kezelt páciensek hetes időszakokig szenvednek a bőr fototoxicitásától.
Az UV-látható (UV-VIS) fénynek az állati szövet által való erős elnyelése és a HPD-nek a daganatos helyekhez való korlátozott specifitása motiválta olyan új fototerápiás szerek kutatását és szintézisét, amelyek a 650 nm alatti hullámhosszú fényt abszorbeálják, és amelyeknek kedvezőbb a daganatos helyeken való retenciója [McRobert, A. J. et al., 1989, CIBA Foundation Symposium 146, „Photosensitizing Compounds: Their Chemistry, Biology and Chemical Use”, John Wiley & Sons, 4-12. old.].
A daganatos szövetekben való retenció és az ezen szövetekre való specifitás növelése érdekében számos olyan porfirinszármazékot megvizsgáltak, amelyek a porfirinszerkezet pirrolgyűrűihez kapcsolódva különböző kémiai csoportokat tartalmaznak. A vegyületek abszorpciójának a HPD-hez viszonyított vöröseltolódását a porfirin n-elektronrendszerében történt változtatásokkal érték el.
Ezt a kutatást folytatva növekvő érdeklődés nyilvánult meg a Chl- és Bchl-származékok PDT-szerekként való felhasználása iránt [Kreimer-Birnbaum, M., Seminars in Hematol. 26, 157-173 (1989); Spike, J. D. and Bommer, J. C., „Chlorophyll”, ed. Scheer, H., CRC Press, 1991, 1181-1204. old.]. A klorofillok (Chl) és a bakterioklorofillok (Bchl) di-, illetve tetrahidroporfirin-származékok, amelyek 4 pirrolgyűrűt és egy izociklusos gyűrűt tartalmaznak egymáshoz és a Mgatomhoz kapcsolódva, ahogy a klorofill a (Chla) esetében a 2. ábrán és a bakterioklorofill a (Bchla) esetében a 3. ábrán bemutatjuk. Az ábrákon bemutatott képletekben M jelentése Mg-atom, és az R szubsztituens jelentése fitil- vagy geranil-geranil-csoport a Bchla-ban és fitilcsoport a Chla-ban. A Bchla-molekula abban különbözik a Chla-molekulától, hogy két további β-szénatomja (a pirrolgyűrűk perifériális szénatomja) van redukálva. A klorofillok és a bakterioklorofillok változatait a makrocikluson levő szubsztituensek vagy a 17helyzetű propionsavmaradékot észterező alkohol változtatása eredményezi. A természetesen előforduló Bchlaban az alkoholmaradék fitil- vagy geranil-geranil-csoport, míg például a Bchlb-ben geranil-geranil-csoport. A klorofillből és bakterioklorofillból levezethető savakat klorofillidnek (Chlide), illetve bakterioklorofillidnek (Bchlide) nevezzük. A Chla-ból és Bchla-ból származó szabad savakat Chlidea-nak, illetve Bchlidea-nak nevezzük. A klorofillből és bakterioklorofillból levezethető olyan vegyületeket, amelyek nem tartalmaznak központi fématomot, feofitinnek (Pheo), illetve bakteriofeofitinnek (Bpheo) nevezzük. A Chla-ból és Bchla-ból származó feofitineket Pheoa-nak, illetve Bpheoa-nak nevezzük. A feofitinből és bakteriofeofitinből levezethető szabad savakat feoforbidnak, illetve bakteriofeoforbidnak nevezzük.
A klorofillok és a bakterioklorofillok összegyűjtik a napenergiát, és megindítják az elektronátmenetet a biológiai fotoszintézisben. Legalacsonyabb energiájú átmeneteik (az úgynevezett Qy átmenetek) a monomer formákban 670-800 nm-nél figyelhetők meg, és aggregált formákban 1000 nm-ig eltolódhatnak. Ezeknek az átmeneteknek extrém magas az extinkciós koefficiense. A klorofillok és bakterioklorofillok gerjesztett szingulett állapotából alacsonyabb triplett állapotukba való átalakulása során a rendszerek közötti energiaátadás valószínűsége elfogadhatóan magas (30-50%), és ez gerjesztett oxigénmolekulák magasfokú termelődését biztosítja. Az oxigénnek a klorofillok és bakterioklorofillok által való szenzitizálását megerősíti az a tény, hogy
HU 221 186 Bl a klorofillok és bakterioklorofillok fotoszintetizáló baktériumokban és növényekben fontos lebontási folyamatokban vesznek részt, és ezért az összes fotoszintetizáló szervezet rendelkezik különböző védekező mechanizmusokkal szingulett oxigén vagy oxigéngyökök ellen. Mivel a klorofillok és bakterioklorofillok természetes anyagok, amelyeket állatok rendszeresen fogyasztanak, in vivő lebomlásuk a HP-hez vagy HPD-hez viszonyítva nagyon gyors [Llewellyn, C. A. et al., Photochem. Photobiol., 52, 1043-1047 (1990)]. Ez fontos előny, amely csökkenti a páciens ismételt besugárzásnak való kitétele miatti károsodása veszélyét.
Mindazonáltal számos probléma merül fel a natív Chl- vagy Bchl-extraktumok PDT-re való felhasználásakor. Először is, csak nehezen juttathatók a daganatos helyre, mivel erősen hidrofóbok. Másodszor, normál beadási körülmények között, azaz szobahőmérsékleten, oxigén jelenlétében és normál fényviszonyok között nagyon labilisak. Harmadszor, nincs rajtuk olyan csoport, amely specifikusan a daganatos szövetbe juttatná ezeket. Ezen korlátok miatt ezeknek a fotoszintetikus pigmenteknek PDT-ben szenzitizálókként való lehetséges felhasználhatósága jelenleg nehezen valósítható meg. Nagyon kívánatos lenne olyan Chl- és Bchl-származékok szintetizálása, amelyek kiküszöbölnék ezeket a nehézségeket, és eredményesen használhatók lennének a PDT-ben. A találmány célkitűzése ilyen származékok létrehozása.
A Chl és Bchl oldallánccsoportjai határozzák meg a molekula különböző környezetekhez való általános affinitását.
A találmány célkitűzésének megvalósítása érdekében végzett kutatásaink során felismertük, hogy a Chlés Bchl-szerkezet 17-helyzetű szénatomjához kapcsolódó propionsav-oldalláncon levő észtercsoport módosításával előállíthatok a terápiában és diagnosztikában való felhasználásra alkalmas új Chl- és Bchl-származékok.
A találmány tárgyát az alábbi
X-CO-R (I) általános képletű amely képletben
X-CO-jelentése C17-propionil klorofill (Chl) vagy C17-propionil-bakterioklorofill (Bchl) csoport, amely csoportban a központi Mg-atom helyett adott esetben egy másik kétértékű fématom, amilyen a V-, Zn-, Cu-, Co-, Ni- vagy Snatom áll, vagy Mg-atom nincs jelen; és
R jelentése egy L-szerinből, egy L-szeril-alkil-észterből, tritil-L-szeril-alkil-észterből, L-szeril-szeril-alkil-észterből, benziloxi-karbonil-szeril-szeril-alkil-észterből, L-tirozil-alkil-észterből, Nterc-butoxi-L-tirozil-alkil-észterből, amelanocita stimuláló hormonból (α-MgH) vagy immunglobulin G-ből (IgG) leszármaztatható csoport, ahol az alkilcsoport 1 -4 szénatomos új Chl- és Bchl-származékok képezik.
A „Chl- vagy Bchl-származék” kifejezés az itt használt értelemben a Chl vagy Bchl bármely - természetes vagy szintetikus - származékára vonatkozik, beleértve az olyan vegyületeket is, amelyekből a központi Mgatom hiányzik, vagy amelyek helyette más kétvegyértékű fématomot, például Ζη-, V-, Cu-, Co-, Ni- vagy Sn-atomot tartalmaznak. A találmány szerint a Bchlszármazékok az előnyösek.
A találmány szerint célzottan, adott helyre irányított fotoszenzitizálók (site-directed photosensitizers; SDP) állíthatók elő. A találmány keretében felhasznált peptidhormonokra példaként a melanocitastimuláló hormonok (MSH, melanotropinok) valamelyike, például az α-, β- vagy γ-MSH említhető, amely specifikusan kötődik a melanocitákban levő receptorokhoz, és így melanómatumorokba juttathatja célba a fotoszenzitizáló gyököt.
A találmány tárgyát képezik továbbá az (I) általános képletű vegyületek előállítására szolgáló eljárások is.
Szintén a találmány tárgyát képezik az (I) általános képletű vegyületeket tartalmazó, diagnosztikai célokra szolgáló készítmények.
Az ábrák magyarázata:
1. ábra: A hematoporfirin (HP) szerkezete; R[=R2= 1-hidroxi-etil-csoport.
2. ábra: A Chla (M=Mg) Chlidea (M=Mg) és Pheoa (M=2H), szerkezete és IUPAC szerinti számozása.
3. ábra: A Bchla (M=Mg, R=fitilcsoport), Bchlidea (M = Mg, R=hidrogénatom) és Bpheoa (M = 2H, R=fitilcsoport) szerkezete.
4. ábra: A Chla klorofilláz jelenlétében L-szerinmetil-észterrel (L-Ser-OMe) végzett enzimatikus átészterezésének vázlata.
5. ábra: A Bchlidea [(benzil-oxi)-karbonil]-szerilszerin-metil-észterrel {Z-Ser2-OMe, ahol Z=[(benziloxi)-karbonil]-csoport} végzett katalitikus észterezésének vázlata.
6. ábra: A Chla (a), Chla-L-Ser-OMe (b), Bchla (c) és Bchla-L-Ser-OMe (d) optikai abszorpciós spektruma 100%-os acetonban.
7. ábra: A Pheoa-L-Ser-OMe (a), Zn-Pheoa-L-SerOMe (b) és Cu-Pheoa-L-Ser-OMe (c) optikai abszorpciós spektruma 100%-os etanolban.
8. ábra: Szilárd Chla (a), Chlidea (b) és Chla-LSer-OMe (c) Fourier transzformációs infravörös (FTIR) spektruma.
9. ábra: Szilárd Bchla (a), Bchlidea (b) és Bchla-LSer-OMe (c) FTIR-spektruma.
10. ábra: Chlidea (háromszögek), Chla-L-Ser-OMe (pontok) és HPD (négyzetek) M2R melanómasejtekre való adszorpciójának függése tenyészetben az inkubációs közegben levő pigmentkoncentrációtól.
11. ábra: Bchla-L-Ser-OMe (pontok) és Bchlidea (háromszögek) adszorpciója tenyészetben az M2R melanómasejtekre az inkubációs közegben levő pigmentkoncentráció függvényében.
12. A)-C) ábrák: A PDT hatása [3H]timidin M2R egér melanómasejtekbe (A), FS-11 humán preputium fibroblasztokba (B) és T47D humán mellráksejtekbe (C) való beépülésére Chla-L-Ser-OMe-vel végzett kezelés és ezt követő besugárzás után (vonalkázott oszlopok) és besugárzás nélkül (sötét oszlopok).
13. ábra: PDT hatása M2R melanómasejtek szaporodására; klónozási hatásosság Chla-L-Ser-OMe-vel vég3
HU 221 186 Β1 zett kezelés és ezt követő besugárzása után (vonalkázott oszlopok) és besugárzás nélkül (sötét oszlopok).
14. ábra: 4xlO~6M Chla-L-Ser-OMe-vel 1 óra hosszat inkubált és 670 nm hullámhosszú lézerfénnyel (5 mW) 10 percig besugárzott egyrétegű (monolayer) M2R sejttenyészet fáziskontraszt (bal oldali) és fluoreszcenciás (jobb oldali) mikroszkópos képe. A besugárzás után 3 órával a sejteket propidium-jodiddal (PID) kezeltük, és megvizsgáltuk ezek PID-fluoreszcenciáját. A lézersugámyalábbal besugárzott kerek terület (A) károsodott sejteket mutat és olyan területeket, amelyekről holt sejtek váltak le. A besugárzott zóna körüli területen (B) levő sejteknek, amelyeket sötétben tartottunk, a morfológiája normális (bal oldali ábra). Ugyanezen monoréteg fluoreszcens mikroszkópiás képén (jobboldalt) az (A) területen az összes megmaradt károsodott PID-jelzett lett, míg a (B) területen levő sejtek festetlenek maradtak, és ezért ezek nemkárosítottnak számítanak.
15. ábra: Egy, a 14. ábránál leírtak szerint kezelt egyrétegű (monolayer) M2R sejttenyészet fáziskontraszt/fluoreszcenciás mikroszkópos képe. Bemutatjuk a besugárzott területet, amelyben PID-t megkötött magok (Nu) láthatók károsodott sejtekben olyan kontrollsejtek (C) szomszédságában, amelyeket nem sugároztunk be, és ezért normál morfológiájúak és magjuk testetlen.
16. ábra: Szenzibilizátor nélkül 10 percig besugárzott egyrétegű (monolayer) M2R sejttenyészet fáziskontraszt-mikroszkópos képe. Semmilyen elváltozás nem látható a sejt megjelenésén. Egyetlen sejt sem jelződött PID-festéssel (ezek nem láthatók).
17. ábra: Fotodinamikusan kezelt meztelenegér (nude mouse) bőrének keresztmetszete (A: 30 χ-nagyítás; B: 70 χ-nagyítás.) Egy meztelenegeret 20 mg/testtömegkilogramm Chla-L-Ser-OMe-vel kezeltünk, és 24 órával később 4 óra hosszat tartó besugárzásnak tettünk ki. További 24 óra elteltével az egeret leöltük. A bőrt kimetszettük, és Bouin-féle fixatívban azonnal fixáltuk. A besugárzott bőrszövet paraffinmetszeteit módosítottuk, trikrómmal (hematoxilin/eozin/light green, foszformolibdénsav) megfestettük, a besugárzott terület orientációját állandóan tartva a kísérlet során. A metszetet a nekrotikus terület központjából (NC) vettük. Normális bőr - amely nem volt besugározva - látható a nekrotikus terület mindkét oldalán (A). A nekrózis behatol az irhába (dermis) és a felhámba (epidermis), és eléri a bőr alatti (subcutan) zsírréteget, amely tipikusan tele van zsírcseppecskékkel. A leukociták (LU) közvetlenül a nekrotikus terület melletti beszűrődése is látható.
18. ábra: Az A-C. ábra egy Bchla-L-Ser-OMe-vel kezelt CDI meztelenegérbe beültetett M2R melanómatumor mágneses rezonancia megjelenítési (MRI; magnetic resonance imaging) képeit mutatja az első kezelés előtt (A), az első kezelés után két héttel (B) és a második kezelés után két héttel (C). Míg a (B) képen némi kiújulás (R) még látható, a (C) képen már nincs kiújulás.
19. ábra: A Chla-L-Ser-OMe megoszlása CDI meztelenegér különböző szerveiben a kezelés után 12 órával.
20. ábra: cAMP-képződés Chla-a-MSH-val indukált (fekete pontok) és egy α-MSH-analóggal indukált (üres körök) egér M2R melanóma sejttenyészetben. A Chla-a-MSH koncentrációját a Chl-gyök legalacsonyabb lehetséges extinkciós koefficiense segítségével határoztuk meg.
A 21.a-c ábra a Bchl-IgG és a Bchl-Ser UV látható abszorpciós spektrumait mutatja be.
(a) : 3 μΜ Bchl-IgG 0,1 mM trisz-HCl-ben, pH 8,5 (b) : 3 μΜ Bchlid 0,1 mM trisz-HCl-ben, pH 8,5 (c) : 3 μΜ Bchlid acetonban.
A spektrumok 2,0 Bchl/IgG molekulaaránynak felelnek meg.
A 22. ábra a Bchl-IgG elektroforézises szétválasztását mutatja be.
csík: Bchlid, nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gél elektroforézis (SDS-PAGE) csík: Bchl-IgG, SDS-PAGE csík: molekulatömeg-marker (BioRad „rainbow”) 12%-os, nem festett gél; a csíkokat vizuálisan detektáltuk és komputerizált színes szkennerrel rögzítettük.
A 23. ábra a Bchl-IgG és a Bchl-Ser S. aureusra kifejtett dózisfiiggő fototoxicitását mutatja be. A baktériumot a jelzett koncentrációjú fotoszenzibilizálóval 60 percen át inkubáltuk. 5 percen át 140 mW/cm2 intenzitással végeztük a besugárzást (megvilágítást) (λ>550 nm).
A 24. ábra a S. aureus Bchl-IgG-vel végzett helyspecifikus fotolízisét mutatja be. A S. aureus szuszpenziókat a jelzett koncentrációjú Bchl-IgG-vel kezeltük 0,1 mM IgG, illetve 0,1 mM ovalbumin jelenlétében vagy távollétében. Az egyéb körülmények a 23. ábra szerintiekkel azonosak.
A 25.A. és 25.B. ábra a Bchl-konjugátumok kötődőképességét és fototoxicitását mutatja be.
25.A.: Bchl-IgG: S. aureus szuszpenziókat növekvő koncentrációjú IgG vagy Bchl-IgG és állandó koncentrációjú Eu-jelzett IgG jelenlétében inkubáltunk. Inkubálás után (1 óra, 4 °C) a baktériumot mostuk és mértük a megkötött Eu-IgG mennyiségét. Meghatároztuk a baktérium által megkötött Eu-IgG (üres háromszög) és Bchl-IgG (tele kör) koncentrációját és diagramban vettük fel. A fototoxicitási adatokat (üres kör) a 23. ábrából vettük át.
A beillesztett kisebb diagram a Bchl-IgG kötődési adatok Scatchard-módszerrel kapott elemzési eredményeit (R. J. Robb et al., J. Exper. Med. 154, 1455-1474, 1981) mutatja be. A számított Kd érték 1,3 μΜ, Pmax értéke 220 fetomol/106 baktérium (132 000 kötőhely/baktérium).
25.B.: Bchl-Ser: S. aureus szuszpenziókat növekvő koncentrációjú Bchl-Ser-nel inkubáltunk. Inkubálás után (1 óra, 4 °C) a baktériumot mostuk, a baktérium által megkötött Bchl-Ser-t metanollal extraháltuk, majd a megkötött Bchl-Ser koncentrációját spektroszkóposan mértük és felvettük a Bchl-Ser koncentrációval szemben (tele kör). A fototoxicitási adatokat (üres kör) a 23. ábrából vettük át.
26-32. ábra: ezek az ábrák a Chl-Ser antibakteriális aktivitását mutatják be S. aureusszal, B. subtilisszel,
HU 221 186 Β1
E. colival, P. acnesszel (aerob és anaerob körülmények között) és HSV-1-gyel (szuszpenzióban és fertőzött Vero-sejtekben) szemben.
A találmány egyik tárgyát tehát a Chl és Bchl aminosavakkal, peptidekkel és polipeptidekkel alkotott konjugátumai képezik. Különös jelentőségűek azok a konjugátumok, amelyeket (a) Chl és Bchl különböző aminosavakkal és ezek származékaival való konjugálásával, (b) Chl- és Bchl-aminosavkonjugátumok hormonokkal, például a-melanotropinnal (α-MSH) való további konjugálásával és (c) a Chl- és Bchl-konjugátumok központjában levő Mg-atom olyan fémekkel való helyettesítésével kapunk, amely fémek fokozzák a triplett állapot keletkezési valószínűségét.
Ezek a vegyületek az alábbi két módszer valamelyikével állíthatók elő:
(1) A 4. ábrán bemutatott új enzimatikus átészterezési eljárással, a klorofilláz (Chlase) enzimmel végzett kezeléssel, amelyhez az enzimet növények kloroplasztjaiból acetonnal extraháljuk, és acetonporként tároljuk. Az észterezést úgy hajtjuk végre, hogy a klorofilláz acetonport egy R-OH általános képletű primer alkohollal, például L-szerin-metil-észterrel inkubáljuk 37 °C-on 1 óra hosszat egy detergenst tartalmazó pufferoldatban, majd a kapott szuszpenzióhoz egy Bchlvagy Chl-származékot, például Bchla-t vagy Chla-t adunk, és 37 °C-on tovább inkubáljuk. A szilárd acetonpor eltávolítása után a kívánt észtert extraháljuk a reakcióelegyből és megtisztítjuk.
(2) Egy XCOOH általános képletű Chlide- vagy Bchlide-származék, például Chlidea vagy Bchlidea egy R-OH általános képletű vegyülettel való katalitikus kondenzálására szolgáló új eljárással, amelyben N-hidroxi-szukcinimidet (NHS) és diciklohexil-karbodiimidet (DCC) vagy 4-(dimetil-amino)-piridint (DMAP) és DCC-t használunk a Chlide vagy Bchlide karboxilcsoportjának aktiválására (5. ábra). Az utóbbi eljárás használható, amikor feoforbidokat és bakteriofeoforbidokat, a Chlidea, illetve Bchlidea Mg-mentes analógjait aktiválják etilénglikollal való kondenzálás előtt [Wasielewski, M. R. et al., J. Org. Chem. 45, 1969 (1980)].
A fenti módszerekkel számos észtert állítottunk elő szerin vagy származékai, például L-szerin-metil-észterhidroklorid, N-tritil-L-szerin-metil-észter, [(benziloxi)karbonil]-L-szerin-metil-észter felhasználásával. Ezek a származékok maguk is használhatók a találmány szerint alkalmazva, vagy összekötő hídként szolgálnak más alkalmas molekuláknak a Chl- vagy Bchl-makrociklushoz való kapcsolására.
Amikor kívánt esetben valamilyen észterre van szükség, de a kívánt pepiidben vagy proteinben nincs hidroxicsoportot tartalmazó aminosavmaradék, akkor a Chl- vagy a Bchl-makrociklust először egy szerinnel vagy más hidroxicsoportot tartalmazó aminosavval vagy valamilyen származékával kapcsoljuk a natív vegyületek átészterezésével vagy a megfelelő szabad savak (Chlide vagy Bchlide) észterezésével, és a peptidet vagy proteint ezután ezen az aminosavmaradékon keresztül kapcsoljuk a makrociklushoz.
Fémszubsztituált Chl- és Bchl-származékok előállítása esetén a magnéziumot a pigmentnek az aminosavhoz vagy sejtspecifikus ligandumhoz való konjugálása előtt helyettesítjük más fémmel. A Chl-ben és származékaiban levő központi Mg-nak más kétértékű fémekkel (Cu, Ni, Zn, V, Co, Sn) való helyettesítését standard eljárásokkal hajtjuk végre, például a megfelelő feofitint a kívánt fém valamilyen sójával, például cinkacetáttal vagy réz-acetáttal vízmentes etanolban szobahőmérsékleten kezelve [Hambright, P., „Porphyrins and Metalloporphyrins”, ed. Smith, K. M., Elsevier, 1975, 233-278. old.; Hynninen, P. A., „Chlorophylls”, ed. Scheer, H., CRC Press, 1991, 145-210. old.]. A Bchl és származékai esetében a központi Mg hasonló eljárással helyettesíthető cink- vagy réz-acetáttal ecetsavban argongáz alatt magasabb hőmérsékleten végzett kezeléssel (Fiedor, L. et al., előadás az 1993-as FEBS rendezvényen).
Az új észtereknek ugyanolyan optikai abszorpciós és fotofizikai jellemzőik vannak, mint a megfelelő Chleknek és Bchl-eknek. Ennélfogva, amennyiben megmaradnak a kezelt szöveten belül, az új Chl- és Bchl-észterek várhatóan hatékony fotodinamikus szerek.
Proteineknek, például hormonoknak, növekedési faktoroknak vagy származékaiknak, továbbá sejttápanyagoknak, például tirozinnak a Chl- vagy Bchlgyökhöz való konjugálásától az várható, hogy növekszik a tumorban és kezelt helyeken való visszatartásuk (retenciójuk). A vöröseltolódás fokozódása nagyobb behatolási mélységet enged meg a természetes rendszer mindenkori állapotának fenntartása mellett. A Mg más fémekkel való kicserélésétől az várható, hogy optimalizálja a Chl- vagy Bchl-gyök belső és metabolikus stabilitását és a gerjesztett triplett állapotba való rendszerek közötti átmenetét, és új diagnosztikai eljárásokra is lehetőséget ad.
A hormonokat és sejttápanyagokat a normális, nem transzformálódott sejtrészek veszik fel. A hormonok és sejttápanyagok célpontjaiknak kiválasztott sejtek, például melanociták, normális körülmények között elosztanak a többi sejt között, de mikor rosszindulatú sejtekké alakulnak át, szilárd tumorokba gyűlnek össze. Ennek eredményeképpen várható, hogy a fotoszenzitizáló koncentrációja a daganatos szövetben drámaian megnő a normális szövetben levő koncentrációjához képest, ahol a sejtek jobban elosztanak, és a koncentrációnövekedés a PDT-hatás megsokszorozódását eredményezi a tumoros helyen. Ez a normális szöveteket károsító küszöbértéknél alacsonyabb szintű fényadagok hatásos használatát teszi lehetővé, így csökken a térbelileg jól elhatárolt besugárzás szükségessége. Nagyon erős fluoreszcenciájuk miatt a helyre irányított Chl vagy Bchl a tumoros hely(ek) vagy egyéb célpontok fluoreszcenciás jelzésére használhatók.
A találmány szerinti Chl- vagy Bchl-származékok valamelyikét tartalmazó diagnosztikus készítmény számos típusú rák fotodinamikus terápiája keretében, beleértve a bőr-, petefészek-, mellrákot és -tumorokat és bőr-, tüdő-, nyelőcső- és hólyagrákot és más hormonszenzitív tumorokat, használható fel.
HU 221 186 Β1
A biofotonikus eljárásokat használó fotodinamikus terápia [Leupold, D. and Freyer, W., J. Photochem. Photobiol. B: Biology 311-314 (1992)] egy másikát a szenzitizálásnak a közeli infravörös felé való kiterjesztésére. A Chl- és Bchl-származékok rendszerek közötti energiaátadásának magas foka és magas hullámhosszú abszorpciós maximuma nagyon jó felhasználhatóságot valószínűsít a PDT ezen módszere keretében is.
A találmány szerinti Chl- és Bchl-származékok diagnosztikai célokra standard eljárások szerint radioaktívan jelezhetők, például 67Ga, 11 lIn, 201T1, 99mTc alkalmazásával, és a radioaktív diagnosztikai szer előnyösen intravénás injekcióval adható be a páciensnek. Néhány óra múlva a rák helye standard eljárásokkal megjeleníthető.
A helyre irányított szenzitizálókat alkalmazó PDT előre látható előnye a mellékhatások és a szenzitizáló alkalmazott mennyiségének drámai csökkenése. A Chlés Bchl-konjugátumok PDT-re való felhasználásának egyes különös előnyei a következők:
(1) Ezeknek a vegyületeknek olyan hullámhossznál van az optikai abszorpciós maximumuk, ahol a humán/állati szövetek által való optikai abszorpció erősen csökken (660-830 nm a monomer formában és 1000 nm-ig a dimer vagy nagyobb aggregátumokban). Ez a fényszóródás csökkentésével együtt nagyobb behatolási mélységet eredményez, vagy kevésbé intenzív és kevésbé drága fényforrások használatát igényli.
(2) Extinkciós koefficienseik a látható és a közeli infratartományban körülbelül tízszer nagyobbak, mint a PDT-hez jelenleg használt porfirinekéi.
(3) A központi Mg-atom más fémekkel való helyettesítése a fotoszenzitizáló magasabb triplett állapot kihasználása következtében fokozhatja a szingulett oxigéntermelés kihozatalát, és jelentősen stabilizálhatja a vegyületeket.
(4) A konjugátumok a célsejtek azonosítása esetében javult specifitást mutatnak, ezért a sejtnekrózishoz a szenzitizálók alacsonyabb dózisai elegendők. Továbbá a Chl- és Bchl-konjugátumok a jelenleg használt számos fluoroforhoz képest kiváló fotokémiai tulajdonságokat mutatnak, és ennélfogva más alkalmazásoknál is gyakorlati hasznuk lehet.
(5) A Chl-származékok testből való kiürülési sebessége magas [Spike, J. D. and Bommer, J. C., „Chlorophyll”, ed. Scheer, H., CRC Press, 1991, 1181-1204. old.] (6) A besugárzást általában lézerfényforrásokkal végzik, például 630 nm-es emisszióra beállított Ar-pumpás festéklézerrel vagy aranygőzlézerrel (pulzáló), amely 628 nm-nél emittál. Ennek a berendezésnek a magas költsége a PDT alkalmazását a nagyobb orvosi központokra korlátozza. A vörösben vagy közeli infravörösben abszorbeáló fotoszenzitizátorok használata azonban megnyitja az utat a közönségesebb és olcsóbb eszközök, például Xenon flash-lámpák, halogénlámpák, diódalézerek vagy a közvetlen napsugárzás használhatósága felé.
(7) A radioaktívan vagy más aktivitással jelzett Chl- és Bchl-származékok egyidejűleg használhatók mind diagnosztikai, mind terápiás célokra.
A találmányt a következő, az oltalmi kört semmiképp sem korlátozó példákkal szemléltetjük.
A Bchla és a Phe előállítását V. Rosenbach-Belkin írja le (Ph. D. Thesis, Weizmann Institut of Science). A Chlidea és a Bchlidea előállítása a J. Bioi. Chem. 267, 22043-47,1992 (L. Fiedor et al.) szerint történt.
1. példa:
Klorofill a előállítása.
Tisztított klorofill a-t Spirullina Galtieri-ből nyerünk a következőképpen: 2-3 g liofilizált sejtet porrá őriünk, majd háromszor extraháljuk 10 ml acetonnal, az extraktumot szűrjük és eldobjuk. A bamászöld maradékot metanollal eldörzsölve újra extraháljuk. Szűrés után a halványzöld, szilárd maradékot eldobjuk, és az extraktumból az oldószert vákuumban eldesztilláljuk. A zöld maradékot acetonban újraoldjuk, és egy 1,5 cm átmérőjű, 6 cm hosszú dietil-amino-etil-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals, DEAE-Sepharose CL-6B) oszlopon 5 °C-on kromatografáljuk. Az oszlopot acetonnal mosva eltávolítjuk a sárga anyagokat (karotinoidok), majd metanol/aceton 1:3 térfogatarányú eleggyel eluáljuk sötétkék oldatként a Chla-t. A kromatográfiás elválasztáshoz szükséges összes idő 10-12 perc. A Chla-t vékonyréteg-kromatográfiásan ellenőrizzük a maradék karotinoidokra és egyéb szennyezésekre, például feofitinekre vagy klorinokra, és szükség esetén újra kromatografáljuk. A metanol/aceton elegyet bepároljuk, a szilárd Chla-t vákuumban alaposan megszárítjuk, és -20 °C-on sötétben tároljuk. Az összes műveletet tompított fényben vagy sötétben végezzük, a lehető leggyorsabban, hogy minimálisra csökkentsük a bomlást. Analitikai tisztaságú oldószereket használunk további tisztítás nélkül.
2. példa:
Klorofilláz előállítása.
Klorofilláz (Chlase) acetonport Melia azedarach L. China fa leveleinek kloroplasztjaiból állítunk elő. 50 g friss levelet eldörzsölünk egy mozsárban 350 ml hideg (-20 °C-os) acetonnal. A homogenizátumot gézen át szűrjük, és a szűrletet éjszakán át hagyjuk 5 °Con állni, hogy a kloroplasztok kiülepedjenek. Az acetont szűréssel eltávolítjuk, a maradék port néhányszor mossuk 95%-os és végül 100%-os acetonnal, majd az így kapott klorofilláz acetonport vákuumban szárítjuk. A száraz por -20 °C-on legalább néhány hónapig tárolható.
3. példa:
Szerinszármazékok előállítása.
A következő szerinszármazékokat használtuk a Chla/Bchla átészterezési reakcióhoz:
(a) Az L-szerin-metil-észter-hidrokloridot (ΗΟ ΉSer-OMe) a Sigma Chemical Co.-tól szerezzük be.
(b) [(Benzil-oxi)-karbonil]-szeril-szerin-metil-észter (Z-Ser2-OMe):
Ennek az új származéknak a szintézisét a Nicolaides és munkatársai által leírt módszer [J. Med. Chem. 11, 74-79 (1968)] felhasználásával végezzük. 6,45 g
HU 221 186 Β1 (0,027 mól) [(benzil-oxi)-karbonil]-szerin (Z-Ser-OH) 50 ml dimetil-formamiddal készített hideg (5 °C-os) oldatához 3,9 g (0,028 mól) p-nitro-fenolt és 5,8 g (0,028 mól) diciklohexil-karbodiimidet adunk. Az elegyet 5 órán át 5 °C-on tartjuk, majd megszűrjük. A szűrlethez hozzáadjuk 4,2 g szerin-metil-észter-hidroklorid és 2,7 g (0,027 mól) trietil-amin 50 ml dimetil-formamiddal készített és megszűrt oldatát. A reakcióelegyet 18 órán át hagyjuk 25 °C-on állni, majd kis térfogatra bepároljuk. A maradékot 100 ml etil-acetátban oldjuk, és az oldatot vízzel, 5%-os vizes nátrium-karbonát-oldattal és híg sósavoldattal mossuk, szárítjuk, és körülbelül 30 ml-re bepároljuk. A maradékhoz petrolétert adunk, a kapott szilárd anyagot kinyerjük, és etil-acetát/metanol/dietil-éter elegyből átkristályosítva 190-192 °C olvadáspontú Z-Ser2-OMe-t kapunk.
(c) [(Benziloxi)-karbonil]-szerin (Z-Ser-OH):
Ennek az előbbi (b) szintézislépésben felhasznált származéknak a szintézisét a Moore és munkatársai által leírt módszer [J.A.C.S. 76, 2884-2887 (1954)] felhasználásával hajtjuk végre. 212 ml hideg (5 °C-os) 2M nátrium-hidroxid-oldathoz 44,3 g (0,42 mól) Lszerint adunk, így 9,8 pH-jú oldatot kapunk. Az oldathoz 10-15 perces időközönként 4-5 g-os adagokban klór-hangyasav-benzil-észtert adunk, és a pH-t 1M nátrium-hidroxid-oldat adagolásával 9,8-on tartjuk. Az adagolást addig folytatjuk, amíg 80 g (0,46 mól) klór-hangyasav-benzil-észtert beadagolunk. A pH-t ezután 10 °C-on 0,5 órán át a 10 értéken tartjuk. A lúgos oldatot 150 ml és utána 100 ml dietil-éterrel extraháljuk, majd 1 liter etil-acetátot adunk a vizes oldathoz. Az oldatot 30-35 ml tömény sósavoldat hozzáadásával pH 3,0-ra savanyítjuk, és a vizes réteget 250 ml és utána 150 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos oldatot magnézium-szulfáton szárítjuk, és vákuumban bepároljuk, amíg a Z-Ser-OH kiválik. Etilacetátból végzett átkristályosítással 117-119 °C olvadáspontú tiszta terméket kapunk. Összkitermelés: 79 g (78%).
(d) N-Tritil-L-szerin-metil-észter (Tri-Ser-OMe):
Ennek a származéknak a szintézisét a Guttman által leírt módszer [Helv. Chim. Acta 45, 2622 (1962)] felhasználásával végeztük. 15,5 g (0,1 mól) L-szerin-metil-észter 150 ml kloroformmal készített hideg (0 °Cos) oldatához 31 ml (0,22 mól) trietil-amint és 26,7 g (0,11 mól) trifenil-metánt adunk. Az oldatot 3 óra hosszat 0 °C-on tartjuk, majd vízzel mossuk, és nátrium-szulfáton szárítjuk. Az oldószert vákuumban lepároljuk, és a szilárd maradék benzol/petroléter (1:1) elegyből végzett átkristályosításával 28 g tiszta terméket kapunk. Kitermelés: 77%.
4. példa:
L-Szeril-metil-észter-klorofillid a (Chla-L-SerOMe) előállítása Chla L-szerin-metil-észterrel végzett enzimes átészterezésével.
4.1.: Chla-L-Ser-OMe előállítása
A 2. példa szerint előállított 200 mg klorofilláz acetonport szuszpendálunk 6 ml 0,5M nátrium-foszfát pufferban (pH=7,6), amely 0,7% ΤΧ-100-at (Triton X-100: Sigma Chem. Co.), 400 mg L-szerin-metilészter-hidrokloridot (Sigma) és 70 mg aszkorbinsavat (Merck) tartalmaz. A szuszpenziót 5 percig homogenizáljuk, és utána 1 óra hosszat keverjük szobahőmérsékleten. A kapott szuszpenziót tovább homogenizáljuk 5 mg szilárd Chla-val, és argonnal telítjük. Az elegyet lezárjuk, és keverés közben 7 óra hosszat inkubáljuk 36 °C-on teljes sötétségben. A reakció előrehaladtát szilikagélen (Merck) vékonyréteg-kromatográfiásan követjük nyomon; eluálószerként vagy hexán: aceton (6:4) elegyet vagy butanolt használunk. Három foltot észlelünk, amelyek a Chla-nak, Chlidea-nak és a cím szerinti Chla-L-Ser-OMe vegyületnek felelnek meg.
4.2. : Chla-L-Ser-OMe tisztítása
A reakcióelegyet 2 g nátrium-klorid és 100 mg nátrium-aszkorbát (Sigma) 20 ml vízzel készített oldatához adjuk, és utána enyhe szívatással szűrjük. A kékeszöld maradékot acetonnal mossuk, és ismét szűrjük. A szűrleteket egyesítjük, telítjük nátrium-kloriddal, és egy választótölcsérben összerázzuk dietil-éterrel. A dietil-éteres réteget elválasztjuk, és körülbelül 10 órán keresztül szilárd nátrium-kloridon tároljuk, majd száraz nitrogéngázáramban bepároljuk, és a kapott kékeszöld pigmentmaradékot vákuumban szárítjuk. A maradékot acetonban oldjuk, és 5 °C-on egy acetonnal egyensúlyozott CM-Sepharose CL-6B oszlopra töltjük. Az oszlopot addig mossuk acetonnal, amíg a feofitinek barna sávja megjelenik, és elválik a Chla-L-Ser-OMekonjugátum sávjától, amely kékeszöld sávként az oszlop tetején marad; a feoforbid eluálására 5% metanolt tartalmazó acetont, illetve 8% metanolt tartalmazó acetont használunk. Ezután a Chlidea-t és végül a Chla-LSer-OMe-konjugátumot eluáljuk 25% metanolt tartalmazó acetonnal. Ezt az utolsó kékeszöld frakciót összegyűjtjük, és szilikagélen butanol eluálószerrel végzett vékonyréteg-kromatográfiával ellenőrizzük a frakció tisztaságát, majd nitrogéngázárammal szárazra pároljuk, és vákuumban megszárítjuk, végül argongáz alatt 20 °C-on sötétben tároljuk.
Kitermelés: 75%.
4.3. : A Chla-L-Ser-OMe-konjugátum szerkezete
A Chla, Chlidea és a Chla-L-Ser-OMe-konjugátum optikai abszorpciós és FT1R spektrumait a 6., illetve 8. ábrán mutatjuk be. Minden egyes (a reakcióelegyben jelen lévő) vegyület különálló foltként jelent meg szilikagélen készített vékonyréteg-kromatogramon. A Chla-L-Ser-OMe-konjugátum (IV) perdeutero-metanolban (CD3OD) felvett 'H-NMR-spektrumában a kiindulási Chlidea spektrumához viszonyítva (a kémiai eltolódások az 1. táblázatban vannak felsorolva) új jelek mutatkoznak 3,57 ppm-nél - amelyek a szerinmaradék metilcsoportjának felelnek meg - és 5,31-5,37-nél, amelyek az észterkötés újbóli megjelenését jelzik. Az összes vegyület mutatja a teljes makrociklusos jelleget, de a Chla-L-Ser-OMe-konjugátumnál (IV) és a Chlidea-nál hiányzanak a fitilsávok.
A Chla (a) és a Chla-L-Ser-OMe-konjugátum (c) (amelyben észterkötés jele látszik 1728 cm-'-nél)
HU 221 186 Β1
FTIR-spektrumai hasonlók, de jelentősen különböznek a Chlidea (b) spektrumától, ahogy a 8. ábrán látható.
5. példa:
Chla enzimes átészterezése Z-Ser2-OMe-val és TriSer-OMe-vel.
A Chla-nak a Z-Ser2-OMe és Tri-Ser-OMe-szerinszármazékokkal (a 3.b. és 3.d. példák szerint előállított vegyületek) végzett átészterezését - 5 észter/Chla mólarány mellett - a 4. példában leírtak szerint végezzük. A vékonyréteg-kromatogram a Chla-szerin-származékkonjugátumok 35%-os kitermelését mutatja, és nem mutat hidrolízistermékeket.
6. példa:
L-Szeril-metil-észter-bakterioklorofillid a (BchlaL-Ser-OMe) előállítása Bchla L-szerin-metil-észterrel végzett enzimes átészterezésével.
A Bchla L-szerin-metil-észterrel végzett átészterezését a 4. példában leírtak szerint hajtjuk végre, és a Bchla-L-Ser-OMe-t 35%-os kitermeléssel kapjuk. A konjugátum tisztaságát vékonyréteg-kromatográfiával ellenőrizzük. A Bchla és a Bchla-L-Ser-OMe-kon10 jugátum optikai abszorpciós és FTIR-spektrumát a 6., illetve 9. ábrán láthatjuk. [A kémiai eltolódásokat az 1. táblázatban soroljuk fel (VII vegyület).]
1. táblázat
Chlidea, Bchlidea és származékaik Ή kémiai eltolódásértékei (csak magastartományú jelek) CD3OD-ben (ppm-ben)
Proton Chlidea Bchlidea IV V VIII IX I II III
C-10 9,16s 8,60s 9,6s 9,65s 8,80s 8,80s - - -
C-5 9,48s 8,25s 9,5s 9,33s 8,42s 8,45s - - -
C 20 8,34s 8,18s 8,55s 8,45s 8,25s 8,34s - - -
„észterkötés”* - - 5,33m 5,10m 5,33m - - - -
„aminosavmaradék” - - 7,35m 7,35m 6,7-7,0q 7,35m - 6,7-7,Oq
C-132 6,46s 6,15s 6,40s 6,70s 6,80s 6,80s - - -
* „csztcrkötcs” a Bchlidea karboxilcsoportja és Z-Scr,-OMc között az 5. ábra szerint.
I Z-Ser2-OMe [(benzil-oxi)-karbonil]-szeril-szerin-metil-észter,
II L-szerin L-szerin-metil-észter,
III N-tBoc-Tyr-OMe N-(terc-butoxi-karbonil)-tirozinmetil-észter,
IV L-Szeril-metil-észter-klorofíllid a,
V [(Benziloxi)-karbonil]-L-szeril-metil-észter-klorofillid a,
VIII [(Benziloxi)-karbonil]-L-szeril-metil-észter-bakterioklorofillid a,
IX N-(terc-Butoxi-karbonil)-tirozil-metil-észterbakterioklorofillid a.
7. példa:
[(Benziloxi)-karbonil]-szeril-szeril-metil-észterkloroftllid a előállítása Chlidea Z-Ser2-OMe-vel végzett katalitikus észterezésével.
mg szárított Chlidea-1, 5,1 mg DCC-t, 1,2 mg DMAP-t és Z-Ser2-OMe-t (5-szörös felesleg) oldunk 1 ml vízmentes metilén-dikloridban. Az oldatot argongáz alatt lezárva 36 óra hosszat keverjük sötétben, szobahőmérsékleten. A cím szerinti terméket (V) preparatív szilikagél vékonyrétegen izoláljuk, és utána DEAESepharose oszlopon tisztítjuk. A végtermék NMRspektrumának adatai az 1. táblázatban láthatók. Kitermelés: 18%.
8. példa:
N-(terc-Butoxi-karbonil)-tirozil-metil-észterklorofillid a előállítása Chlidea N-(terc-butoxi-karbonil)-tirozin-metil-észterrel (N-tBOC-Tyr-OMe) végzett katalitikus észterezéssel.
3,4 mg száraz Chlidea-t, 58 mg DCC-t, 1,38 mg DMAP-t és N-tBOC-Tyr-OMe-t (a Sigma cégtől) (15szörös felesleg) oldunk 1 ml vízmentes metilén-dikloridban, az oldatot argongáz alatt lezárva 40 óra hosszat keverjük sötétben, szobahőmérsékleten. A terméket preparatív szilikagél vékonyréteglemezeken izoláljuk, és DEAE-Sepharose oszlopon tovább tisztítjuk. Kitermelés: 25%.
9. példa:
Bchla-szerin és Bchla-tirozin-konjugátumok előállítása Bchlidea Z-Ser2-OMe-vel és N-tBOC-Tyr-OMevel végzett katalitikus észterezésével.
A Bchlidea-nak a címben megadott vegyületekkel való észterezését (kondenzációját) a 7., illetve 8. példában a Chlidea észterezésére leírtak szerint hajtjuk végre. Az N-(terc-butoxi-karbonil)-tirozil-metil-észter-bakterioklorofillid a (Bchla-N-tBOC-Tyr-OMe; IX jelű vegyület) és a [(benzil-oxi)-karbonil]-szeril-szerin-metil-észter-bakterioklorofillid a (Bchla-Z-Ser2-OMe; VIII jelű vegyület) NMR eltolódási adatai az 1. táblázatban láthatók.
HU 221 186 Β1
10. példa:
A központi Mg-atom Zn- és Cu-atomokkal való helyettesítése klorofillokban és bakterioklorofillokban.
Zn vagy Cu Chlidea-L-Ser-OMe-be való bevitele szobahőmérsékleten, nagyon enyhe körülmények között könnyen végbemegy.
L-Szeril-metil-észter-feoforbid a-t (Pheo-Ser-OMe; X jelű vegyület) Chla-L-Ser-OMe ecetsavban végzett demetilezésével állítunk elő. Kevés Chla-L-Ser-OMe-t feloldunk pár csepp ecetsavban, és 10-15 másodperc múlva a savat nitrogéngázban eldesztilláljuk. A barna Pheo-Ser-OMe maradékot feloldjuk 2 ml O,1M etanolos Zn(II)-acetát vagy [Cu(II)-acetát] oldatban, és 20 percig keverés közben szobahőmérsékleten argongáz alatt tartjuk. A makrociklus koordinációs állapotában történő változás együtt jár a látható tartományban az abszorpciós spektrumban fellépő változásokkal, és a reakció előrehaladása spektroszkópiásan követhető. A termékek látható tartományban felvett abszorpciós spektrumát a 7. ábrán mutatjuk be. Ilyen körülmények között a fématom beviteli reakció csaknem kvantitatív, és a Chla-L-Ser-OMe tiszta Zn- és Cu-származékait eredményezi.
11. példa:
Chlidea, Bchlidea és Chla- és Bchla-szerinkonjugátumok adszorpciója melanómasejtekre tenyészetben.
(a) In vitro meghatározás
A Chl- és Bchl-származékok melanómasejtekhez való kapcsolódását a következőképpen követjük nyomon: M2R egér melanómasejteket [Gerst, J. E. et al., Mól. and Cell. Endocrinol., 46, 137-147 (1986)] 10% lószérumot tartalmazó DMEM/F12 táptalajon 37 °C-on 8% szén-dioxidot tartalmazó nedvesített atmoszférában egyrétegű tenyészetként tenyésztünk (100% egybefolyásig). 48 órával később a sejteket 3 óra hosszat Chlidea, Bchlidea, Chla- és Bchla-szerin-konjugátumok és HPD (Photofrin II) különböző koncentrációival (1-100 μΜ) kezeljük. A Chl- és Bchl-származékoknak a sejtekhez való adszorpciója mértékének meghatározása céljából a tenyészet táptalaját leszívatjuk, a sejteket háromszor mossuk foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS), és a pigmenteket acetonnal extraháljuk. A Chl- és Bchl-származékok koncentrációját az oldatban optikai abszorpciójuk és fluoreszcenciájuk ismert pigmentkoncentrációjú acetonos oldatok abszorpciójával és fluoreszcenciájával való összehasonlításával határozzuk meg.
A 3 órás inkubációt követően lószérum jelenlétében az M2R sejtekre adszorbeálódott Chlidea és Chla-LSer-OMe és a megfelelő Bchla-származékok molekuláinak számát a 10. és 11. ábrán mutatjuk be. Amint látható, a Chlidea és Chla-L-Ser-OMe jobban adszorbeálódik M2R melanómasejtekre, mint a Photofrin II (HPD). A Bchlidea és Bchla-L-Ser-OMe azonos mértékben adszorbeálódnak a melanómasejtekre, és körülbelül 5ször kisebb mértékben, mint a Photofrin II. Az adszorbeált molekulák száma lineárisan függ a táptalajban levő kezdeti koncentrációjuktól, és a pigment abszorpciója az inkubáció első órája alatt eléri az egyensúlyt (2. táblázat). A szérum távollétében a Chla-L-Ser-OMe körülbelül 15-ször jobban adszorbeálódik, mint a Chla (adatok nélkül).
2. táblázat
Chla-L-Ser-OMe (2,7 χ 10~5M) celluláris adszorpciója az idő függvényében
idő (óra) Chla-L-Ser-OMe molckula/sejt
1,0 2,7 xlO7
1,5 1,3x10«
2,0 1,3 xlO8
(b) In vivő meghatározás
Chl-t vagy Bchl-t 10% etanol/PBS-ben oldva injektálunk egerekbe intraperitoneálisan (ip.). Kontrollcsoportként injekciót nem kapott, illetve hordozóval injektált egereket használunk. Az állati szövetek egyes részeit vagy érintetlen szerveket (például lépet, májat, agyat stb.) kimetszünk, ezeket acetonban homogenizáljuk, és utána centrifugáljuk. A felülúszó tartalmazza a pigmenteket. A pigment koncentrációját a felülúszóban fluoreszcens spektroszkópiával határozzuk meg.
12. példa:
Chl- és Bchl-származékok toxicitása melanómasejtekre tenyészetben
A Chlidea és Chla-L-Ser-OMe-konjugátum melanómasejtekre gyakorolt fotodinamikus hatását tenyészetben a következőképp vizsgáltuk:
M2R egér melanómasejtek egyrétegű (100%-ig összefüggő) tenyészetét a Chla, Chlidea és Chla-L-SerOMe-pigmentekkel 30 percig kezeljük. Ezt követően a tenyészeteket felülről 10 percig besugározzuk egy 5 mW-os GaAs diódalézerrel 670 nm-nél (A fényforrás), egy 150 W-os Xenon lámpával 5000 pEinstein/cm2-rel (B fényforrás) vagy egy 90 W-os halogénlámpával 1500 pEinstein-nel (C fényforrás). A kontrollcsoportok kezeletlen sejtek, pigmenttel kezelt, de sötétben tartott sejtek és besugárzott kezeletlen sejtek. A besugárzás után 3 órával fáziskontraszt-mikroszkóppal megvizsgáljuk a besugárzás következtében a sejt morfológiájában végbement változásokat.
A különböző Chl- és Bchl-származékok citolitikus aktivitásának kiértékelését az egyes réteg fotodinamikusan kezelt területén levő sejtelhalás becslése alapján végezzük úgy, hogy a sejteket megfestjük propidium-jodiddal {2,7-diamino-9-fenil-10-[(dietil-amino)-propil]fenantridium-jodid}-metojodid; PID), amely nem hatol be az érintetlen/élő sejtekbe, de szelektíven felhalmozódik a károsodott sejtek magjaiban, és megfigyeljük a propidium-jodid vörös fluoreszcenciáját. A megfestett tenyészetben a fluoreszkáló magok vizsgálatát fluoreszcens mikroszkópiával [Yeh, C.-J. G. et al., J. Immunoi. Methods, 43, 269-275 (1981)] végezzük. Az eredményeket a 14. és 15. ábrán mutatjuk be. Ez a módszer azonban - mivel a kezelt sejttenyészetek mikroszkópiás vizsgálatán alapul - nem a legalkalmasabb nagy9
HU 221 186 Bl számú sejttenyészetnél alkalmazott PDT hatóanyagok citolitikus aktivitásának szisztematikus kvantitatív szűrésére és kiértékelésére.
Más módszer szerint a fotodinamikus toxicitást a [3H] timidinbeépülés alapján határozzuk meg. Ebben az esetben a következőképpen határozzuk meg a PDT-t követően a [3H] timidin beépülésében fellépő változásokat:
Sejttenyészeteket (4-5 xlO4 sejt/lyuk; körülbelül 40-50% összefüggésig növesztve 10% borjú magzatszérumot tartalmazó táptalajon) 1 pCi/ml [metil-3H] timidinnel 37 °C-on 2 óra hosszat inkubálunk. Utána a tenyészeteket kétszer mossuk hideg foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS), majd 4 °C-on 30 percig kezeljük 7,5%-os jéghideg triklór-ecetsav-oldattal (TCA), és végül kétszer mossuk etanollal. A sejteket ezután 0,3 ml 1M nátrium-hidroxid-oldattal 37 °C-on 15 percig tartó kezeléssel oldjuk. 100 μΐ térfogatú mintákat semlegesítünk 100 μΐ 1M sósavoldattal és 4 ml 0,1 M imidazol-oldattal, majd 20:8 xilol szcintillátor/Lumax elegyben méijük. A 12. A. ábrán bemutatott kísérletben M2Rsejteket 60 percig kezeltünk növekvő koncentrációjú Chla-L-Ser-OMe-vel, és ezt követően a B fényforrással besugároztuk. Amint látható, a fotodinamikus károsodás abban fejeződik ki, hogy 24 órával később a dózistól függően csökken a sejtek képessége [3H] timidin beépítésére. A hatás teljességgel a fénytől függő, és nem észlelhető sem a megvilágítatlan, sem a kezeletlen megvilágított kontrolioknál. Hasonló eredményeket kaptunk FS11 humánfityma-fibroblasztokkal (12.B. ábra) és humán T47D mellráksejtekkel (12.C. ábra) is (a B fényforrást használva). Az eredményeket három párhuzamos meghatározás átlagaként ±S.D. (standard deviáció) adtuk meg.
A PDT-hatást a klonogén mérési módszer segítségével is meghatároztuk: A sejtek különböző koncentrációjú Chla-L-Ser-OMe-vel való kezelése és az előbb leírtak szerint (12.A. ábra) végzett besugárzásos kezelés befejezése után 24 órával a tenyészeteket tripszinnel kezeljük, és az életképes sejtek számát tripánkék kizárásos módszerrel meghatározzuk. Megfelelő hígításokat készítünk, és lyukanként 250 sejtet oltunk 6 lyukas Costar lemezekre. 11-12 nap tenyésztés után a táptalajt leszívatjuk, a telepeket fixáljuk, és metanolban oldott kristályibolyával festjük, majd a telepek számát (40-nél több sejt telepenként) boncolómikroszkóp alatt megszámoljuk. Amint a 13. ábrán látható, a Chla-L-Ser-OMe esetében a fotodinamikus kezelés a dózistól függően csökkenti a túlélő sejtek számát, de ez a hatás nem lép fel a sötétben tartott vagy a kezeletlen, megvilágítatlan sejtek tenyészeteiben. A 12.A. és a 13. ábrán feltüntetett eredmények összehasonlítása jó egybeesést mutat a két módszer között. Az eredményeket három párhuzamos meghatározás átlagaként±S.D. adjuk meg.
Egyéb felhasználható módszerek, amelyek a sejtcitolízisre engednek következtetni, a következők: (1) a citolitikus aktivitás meghatározása a kezelt sejtek [3H] adeninfelvételét követően, (2) a citolitikus aktivitás meghatározása 51Cr-felvétel alapján és (3) a nekrotikus területek meghatározása video-mikromegjelenítéses (video-microimaging) technikával. Míg a PID használata a fluoreszcens színezéknek egyedül csak a károsodott sejt által való felvételén alapul, az (1) és (2) módszer a radioaktív nyomjelzőnek az előinkubációs lépés alatt végbemenő felvételén és a radioaktív markemak a második lépésben a hatóanyag által kiváltott elengedésén alapul. Az utóbbi két módszer alkalmas minták tizeinek vagy százainak megfelelő számú párhuzamosban végrehajtott részletes titrálásához szükséges többszörös meghatározások elvégzésére.
A 14. ábra két területet mutat egy 30 percig 4 χ 10-6 M Chla-L-Ser-OMe-vel inkubált melanómasejtegyrétegen. Az A terület (14. ábra, bal oldal) besugárzott (A fényforrás), míg a B terület sötétben volt tartva. A besugárzott sejtek (A terület) észrevehetően összezsugorodottaknak tűnnek, és úgy látszik, hogy elvesztették a kapcsolatot az edény falával, továbbá sejtmembránjuk töredezettnek és szabálytalannak látszik. Ugyanennek a tenyészetnek a PID fluoreszcenciás mikroszkópos képe (14. ábra, jobb oldal) azt mutatja, hogy a sejtkárosodás a fotodinamikusan kezelt területre korlátozódik, és 1:1 összefüggés van a morfológiai változások és a sejtpusztulás között, míg az élő sejtek magjai nem mutatnak fluoreszcenciát a PID-től (lásd az A és B területeket a 14. ábra bal és jobb oldalán). A besugárzott zóna szélének erősebb nagyítású képén PID-vel kezelt olyan sejtek fluoreszkáló magjai láthatók, amelyek besugárzást kaptak, velük szomszédosán pedig besugározatlan, normál morfológiájú és festetlen magú kontrollsejtek (15. ábra). Nem figyelhető meg károsodás azokon a kezeletlen kontrolisejteken, amelyek ugyanolyan besugárzást kaptak (16. ábra). Hasonló morfológiai elváltozások voltak láthatók a 4χ 10~6 M Chlidea-val inkubált melanómasejtek 10 perces besugárzása után is.
13. példa:
Chl- és Bchl-konjugátumok hatása egértumorokra (a) Tumorimplantáció:
M2R sejteket rutinszerűen tartunk fenn egyrétegű tenyészetként. A sejteket egy gumipálcával lekaparjuk, és normál sóoldatban szuszpendáljuk. lxlO6 sejt/0,1 ml adagokat injektálunk bőr alá C57B1 vagy CDI hím meztelen egerek lágyékába vagy hátába. Körülbelül 35 hét múlva a tumor látható lesz. Ezek a tumorok szilárd, jól behatárolt szerkezetűek, és körülbelül 10 g tömegűre nőnek a beültetés után 7-8 héttel. Hasonló eljárást alkalmazunk olyan meztelenegereknél is, amelyekbe vagy egér M2R vagy humán (FO/1, MRI/H/221, HS695T amelanotikus melanóma vagy SK/MEL/28) melanómatumorokat implantálunk.
(b) Injekció és besugárzás:
Egereknek intraperitoneálisan 20 mg/kg Chl- és Bchl-származékokat, Chla-L-Ser-OMe-t és Bchla-LSer-OMe-t adunk be 10% etanolt tartalmazó PBS-ben oldva. A tumort 5 óra múlva 1 óra hosszat besugároztuk. Kontroliegerekbe (i) etanol-PBS oldatot injektáltunk, és 1 óráig besugároztuk; (ii) Chl- és Bchl-származékokat injektáltunk, és sötétben tartottuk őket.
(c) A besugárzás után 24 órával az egereket nyakcsigolya-elfordítással leöltük. A tumorok elhelyezkedé10
HU 221 186 Β1 sét szövetfestés segítségével rögzítettük, és a tumorokat a továbbiakban standard hisztológiai eljárásokkal dolgoztuk fel.
(d) A Chla-L-Ser-OMe és Bchla-L-Ser-OMe Chlés Bchl-szerin-konjugátumok toxicitását C57B1 egerekben normál tartási körülmények között, besugárzás nélkül, 10% etanol/PBS-ben oldott vegyület injektálásával határoztuk meg. A kontroliegerekbe csak a hordozót injektáltuk. Azt találtuk, hogy az injekcióknak 40 mg/testtömegkilogrammig nem volt észrevehető hatása az egerek viselkedésére és életvitelére 14 napig. Ez a hatóanyagdózis volt messze a legmagasabb használt adag, és az LD50 és EC50 értékek (a terápiás index szélső határai) még meghatározandók.
(e) Vizsgáltuk Chla-L-Ser-OMe-vel kezelt meztelenegerekben a fókuszált besugárzás (5 mW Ga/As diódalézer 670 nm) következtében fellépő bőr citotoxicitást. 20 mg/kg Chl/Bchl konjugátumokat injektáltunk intravénásán 10% etanol/PBS-ben oldva meztelenegerekbe, és 24 órával később az egerek bőrét 4 óra hosszat besugároztuk. A kontrollegereket (i) etanol/PBS oldat injektálásával kezeljük, és sötétben tartjuk; (ii) nem kezeljük, és 4 óra hosszat besugározzuk (A fényforrással). A besugárzás után 24 órával az egereket a nyakcsigolya elfordításával leöltük. A besugárzott zóna elhelyezkedését szövetfestés segítségével rögzítettük, és bőrmintákat a továbbiakban standard hisztológiai eljárásokkal dolgoztuk fel. Azt találtuk (15. ábra), hogy a bőr besugárzása a kísérleti állatban a besugárzott területen roncsolást okozott az irharétegen (dermis), epidermisen és a bőr alatti zsírrétegen (subcutaneous fát layer; SF) keresztülhatoló szövetnekrózissal (NC). Közvetlenül a nekrotikus terület melletti régióban a leukociták (LU) infiltrációja által okozott világos immunválasz jelentkezett. A nekrotikus területtel szomszédos besugározatlan bőr normálisnak tűnik. A bőrirritáció semmilyen jele nem volt megfigyelhető a kontrollcsoportban.
(f) Bchla-L-Ser-OMe fotodinamikus hatása M2R melanómatumorokra
50-150 pg Bchla-L-Ser-OMe-t injektálunk 0,05 ml (1:1) etanol/sóoldat elegyben oldva anesztetizált (Nembutal, 6,0 mg/kg) CDI meztelenegérbe előzetesen implantált 5-6 mm átmérőjű tumorba és a tumor köré. Az injekciót úgy adjuk be, hogy a tűt a tumortól 10-15 mm-re szúrjuk át a bőrön, és a hatóanyagot magába a tumorba, annak belső oldaláról juttatjuk úgy, hogy a tumor feletti bőr és a tumor külső felülete érintetlen maradjon. Az anesztetizált egeret utána a tumor felőli oldalról fehér halogén fénnyel 19 000 pEinstein/cm2 intenzitással 60 percig besugározzuk. A besugárzott hely átmérője 9 mm, és csak a tumor területére korlátozódik. A tumor szerkezetében és méretében végbemenő változásokat néhány héten keresztül mágneses rezonancialeképezéssel (magnetic resonance imaging; MRI) követjük nyomon. A kezelés előtt és után a tumor körvonalaiban fellépő különbségeket a 18. ábra mutatja. A mellkas felső részébe a lapocka mellé implantált tumor világosan megfigyelhető a 18.A. ábrán a kezelés előtt magas MRI jelet adó világos szerkezetként (T), és 84 órával később lényegében eltűnt. Két héttel később egy kis kiújulás látszott (18.B. ábra). Egy második kezelés (Bchla-L-Ser-OMe és megvilágítás) 3 héttel később a kiújulás eltűnését eredményezte (18.C. ábra).
(g) Vizsgáltuk a Chla-L-Ser-OMe-kezelt meztelenés feketeegerek különböző szöveteiben, szerveiben és a tumorban való retencióját. 20 mg/kg Chla-L-SerOMe-t 10% etanol/PBS oldatban oldva injektáltunk intraperitoneálisan (ip.) C57B1 hím és CDI hím és nőstény meztelenegerekbe (átlag 5-10 egérbe). Szövetmintákat (zsír, izmok, bőr, vér) vettünk, érintetlen szerveket (lép, máj, agy, tüdő, szív stb.) és tumort távolítottunk el, acetonban homogenizáltuk, és utána centrifugáltuk. A felülúszóban fluoreszcencia-spektroszkópiával meghatároztuk a pigment koncentrációját. A ChlaL-Ser-OMe megoszlása 12 óra elteltével a tumorban és különböző szövetekben és szervekben a 19. ábrán látható.
14. példa:
Tirozil-etil-észter-klorofillid és -bakterioklorofillid előállítása (a) Chlidea vagy Bchlidea aktiválása N-hidroxiszukcinimiddel (NHS).
mg vákuumban szárított Chlidea vagy Bchlidea és 9,6 mg száraz NHS és 5 mg DCC keverékét feloldjuk 2 ml-nyi alumínium-oxidon szárított tetrahidrofuránban. A reakcióelegyet argongáz alatt lezárva 48 óra hosszat keverjük szobahőmérsékleten, és utána további 48 óra hosszat 5 °C-on tartjuk. Mindegyik műveletet sötétben hajtjuk végre. A reakció befejeződése után az oldószert nitrogéngáz alatt desztilláljuk, és a zöld maradékot újraoldjuk acetonban, majd felvisszük egy acetonnal egyensúlyba hozott kis CM-Sepharose oszlopra (Pharmacia; 0,5 χ 5,0 cm). Az oszlopot 15-20 ml acetonnal mossuk, és az aktivált klorofillidet (NHSChlide vagy NHS-Bchlide; klorofillinsav-, illetve bakterioklorofillin-sav-N-hidroxi-szukcinimid-észter) 35% metanolt tartalmazó acetonnal eluáljuk. Az eluált NHS-Chlidea-t vagy NHS-Bchlidea-t ugyanilyen módon tisztítjuk tovább. Kitermelés: 2,95-4,15 mg (50-80%).
(b) NHS-Chlidea és NHS-Bchlidea katalitikus konjugálása tirozin-etil-észterrel (Tyr-OEt).
A fenti (a) lépés szerint előállított 2 mg NHSChlidea-t vagy NHS-Bchlidea-t oldunk 1 ml vízmentes tetrahidrofuránban, és az oldathoz 5 mg tirozin-etil-észtert (a Sigma cégtől) adunk. A reakcióelegyet argongáz alatt lezárjuk, és szobahőmérsékleten 48 órát keverjük, majd 48 óra hosszat 5 °C-on tartjuk sötétben. A reakcióelegy összetételét Vydac C-18 HPLC oszlopon (Alltech Associates, Inc., Deerfield, 111., USA) analizáljuk. Az elválasztás körülményei a következők: oszlopméret 250 mm χ 4,6 mm; töltet Vydac 218TP; részecskeméret 10 pm; pórusméret 30 nm (300Á; mozgó fázis: acetonitril/víz 7:3; átfolyási sebesség: 1 ml/perc. A Chlidea-Tyr-OEt vagy Bchlidea-Tyr-OEt-konjugátum 9,5 perc retenciós idővel eluálódik. A reakciótermékeket a 4. példában leírtak szerint CM-Sepharose segítségével tisztítjuk.
HU 221 186 Β1
15. példa:
Chla- és Bchla-a-MSH-konjugátumok előállítása.
Az α-melanocita stimuláló hormon (MSH) képlete az alábbi: H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-TyrGly-Lys-Pro-Val-NH2.
Egy polietilén kémcsőben 1 mg α-MSH 1 ml acetonitril/víz 8:2 térfogatarányú eleggyel készített és 0,07 mg trietil-amint tartalmazó oldatához argongáz alatt hozzáadunk 2,15 mg NHS-Chlidea-t (a 14.(a) példa szerint előállítva) kevés (körülbelül 0,2 ml) acetonitrilben oldva, és rövid ideig ultrahanggal kezeljük. A reakcióelegyet argongáz alatt lezárva szobahőmérsékleten, sötétben 66 óra hosszat keveijük. A reakció során 15 μΐ-es aliquot mintákat veszünk a reakcióelegyből a reakció kezdete után 0, 3, 19, 45 és 66 órával, és HPLC-vel analizáljuk.
A reakcióelegyből vett mindegyik 15 μΐ-es aliquot mintát nitrogéngáz alatt beszárítjuk, és 50-100 μΐ 20 térfogat% acetonitrilt és 0,1 térfogat% trifluor-ecetsavat (TFA) tartalmazó vízben oldjuk. Az oldatot injektáljuk a C-18 HPLC kolonnára. Az összegyűjtött frakciók retenciós ideje a következő: 24 perc - elreagálatlan a-MSH; 36 perc - Chla-a-MSH-konjugátum; 76 perc - Chlidea. Az elválasztás körülményei a következők: oszlop - 250 mm χ 4,6 mm; töltet - Vydac 218TP; részecskeméret - 10 pm; pórusméret - 30 nm (300 Á); mozgó fázis (A) - 0,1 térfogat% TFA vízben; mozgó fázis (B) - 0,1 térfogat% TFA acetonitrilben; gradiens - 20% B O-tól 5 percig, utána 20-55% B 10 perc alatt és 55-80% B 25 perc alatt, majd ezután mosás 80% B-vel; átfolyási sebesség - 1 ml/perc.
A Bchla-a-MSH-konjugátumot hasonló módon állítjuk elő, de Bchlidea-ból kiindulva. Tisztítás után a peptid és Bchla spektrális jellemzőit mutató frakciókat gyűjtjük.
A Chla-a-MSH-konjugátum biológiai aktivitását ciklikus AMP-t (cAMP) stimuláló képességének meghatározásával állapítjuk meg egér M2R sejttenyészetekben egy hatásos α-MSH-analóghoz, a (Nle4,D-Phe7)aMSH-hoz viszonyítva. A cAMP-felhalmozást a Gerst és munkatársai által leírtak szerint [Gerst, J. E., et al., Mól. and Cell. Endocrinol., 46, 137-147 (1986)] hajtottuk végre. Amint a 20. ábrán látható, a Chla-a-MSHkonjugátum az α-MSH-konjugátum aktivitásához viszonyítva megőrzi azonos hatásosságát.
16. példa:
Chla- és Bchla-protein-konjugátumok előállítása
Néhány milligramm protein, például borjú szérumalbumin (BSA), gamma-immunoglobulin G (IgG) és fóldimogyoró-agglutinin (PNA) 1 ml pufferolt PBS-sel (0,1 M foszfátpuffer; pH = 7,6) készített oldatához, amely még 0,1 mg trietil-amint (TEA) is tartalmaz, egy polietilén kémcsőben nitrogéngáz alatt fölös mennyiségben hozzáadunk a 14.(a) példa szerint előállított NHS-Chlidea-t vagy NHS-Bchlidea-t tömény acetonos oldatként 30 perc alatt néhány 10 μΐ-es adagban, és ezt követően rövid ideig ultrahanggal kezeljük.
A reagensek mennyisége az egyes esetekben a következő :
- 2,5 mg BSA - 0,045 mg NHS-Chlide,
- 3 mg IgG - 0,041 mg NHS-Chlide,
- 1 mg PNA - 0,070 mg NHS-Chlide.
A reakcióelegyet argongáz alatt lezárva szobahőmérsékleten, sötétben 24 óra hosszat keverjük.
A Chla- vagy Bchla-protein-konjugátumot egy BioGel P-10 (Bio-Rad, Hercules, Ca., USA) minioszlopon (0,5 cmx5 cm) tisztítjuk. Az oszlopot a PBS-ben előre duzzasztott gélből a következőképp készítjük: PBS-sel való kiegyensúlyozás után az oszlopot néhány milliliternyi PBS-ben oldott BSA-t (1-2 mg) tartalmazó oldattal mossuk, és a BSA feleslegét PBS-sel eluáljuk. A reakcióelegy egy kis mintáját (50-60 pl) feltöltjük az oszlopra, és PBS-sel eluáljuk. A reagálatlan NHS-Chlidea vagy NHS-Bchlidea az oszlop tetején marad, és a konjugátum zöld sávját, amely végigvándorol az oszlopon, összegyűjtjük.
A Chla- és Bchla-konjugátumok vizes oldatban zöld színű csapadékot képeznek, amelyet ultracentrifugálással összegyűjtünk. A csapadékok ultrahangos kezeléssel valamilyen detergens, például 1% TritonXI00 segítségével újra oldatba vihetők. A konjugátumok mind a Chla (vagy Bchla), mind a protein spektrális jellemzőit mutatják. Erősen abszorbeálják a fényt az UV-tartományban és a monomer és aggregált Chla vagy Bchla abszorpciós sávjaiban is.
17. példa:
A Bchla-IgG-konjugátum előállítása Kísérleti módszerek Anyagok:
A nyúl-immunglobulin-G Cohn V. frakcióját (kát. számú: G-0261) és az N-hidroxi-szukcinimidet (NHS) a Sigma Chem. Co.-tól (AEÁ) szereztük be. Az Eu-IgG késleltetett fluoreszcenciás méréséhez (O. Mazor et al.: Anal. Biochem. 301, 75-78, 2002) alkalmazott gyorsító oldatok a Delfia Turko (Finnország) termékei. A diciklohexil-karbodiimid (DCC) a Pierce terméke (AEÁ); a DEAE-cellulóz a Whatma nChem. Co. (Nagy-Britannia) gyártmánya. Valamennyi vegyszer analitikai tisztaságú.
A Bchl-származékok előállítása
A Bchla-t liofilizált Rhodospirillum rubrumból extraháljuk. A Bchl-Ser-t és a Bchlide-t a geranil-geranoil-lánc enzimes átészterezésével, illetőleg hidrolízisével állítjuk elő, klorofílláz alkalmazásával. 11 mg IgG-t 2 ml karbonátpufferben (0,1 M, pH 8,6) tartalmazó oldathoz keverés közben 30-szoros moláris feleslegben 200 μΐ dimetil-formamidban (DMF) oldott
1,5 mg Bchlid-NHS aktivált/észtert adagolunk részletekben, 50 perc alatt, majd rövid időtartamú ultrahangos kezeléseket végzünk. A reakcióelegyet 24 órán át keverjük. Valamennyi műveletet argongáz atmoszférában, sötétben, 4 °C-on végezzük.
A Bchl-IgG-konjugátum tisztítása
A reakcióelegyet 10 percen át 15 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk és a felülúszót egy éjjelen át dializáljuk 2 χ 1000 ml 10 mM trisz-HCl (pH 8,5) pufferrel szemben. A dializátumot 5 ml 50%-os DEAE-cellulóz szuszpenzióval keverjük össze, amelyet előzete12
HU 221 186 Β1 sen 10 mM trisz-HCl-pufferrel (pH 8,5) ekvilibráltunk. A kapott keveréket betöltjük egy kis üvegoszlopba (0,5 cm χ 5 cm) és az oszlopot 5 oszloptérfogatnyi azonos pufferrel mossuk. A Bchl-IgG-t 10 mM trisz-HCllel készített 0,5 mM NaCl (pH 8,5) oldattal eluáljuk. 3 ml-es frakciókat szedünk, a zöld Bchl-IgG-t tartalmazó frakciókat egyesítjük és egy éjjelen át 4 °C-on dializáljuk 1000 ml pH 8,5 10 mM trisz-HCl-pufferrel szemben. A terméket argongáz alatt sötétben, 4 °C-on tároljuk a további felhasználásig.
Spektroszkópiás elemzés
Felvesszük a tisztított Bchl-IgG abszorpciós spektrumait és a koncentrációkat a 770 nm-en mért abszorpcióból számítjuk ki. (Bchlid vizes oldatban; ε=4,37 χ 104 mol/liter.cm). Ez az abszorpció bizonyos mértékben oldószerfuggő és az energia körülbelül 763- és 772 nm közötti eltolódásokat mutat. A Bchl-IgG fehérjekoncentrációját ugyancsak abszorpcióval határozzuk meg (280 nm; ε=2,27χ105 mol/liter.cm az IgG-re). A spektrumban fellépő átfedés korrigálása érdekében a fehétjekoncentrációt a következőképpen számítjuk ki:
[IgG]=/o.d.28o-(0,803 o.d.770)/:2,27x 105, ahol 0,803 a pigment/fehérje átlapolásnak megfelelő korrekciós tényező a Soret-sáv régióban, a pigment 770 nm-en mért abszorpciójára vonatkoztatva. A Bchl: IgG mólarány a különböző konjugátumsarzsok körében a 0,5-2,5 tartományba esik.
Az izolált konjugátum nagyobb hullámhosszúságoknál mért fluoreszcenciája (785 nm) a legalacsonyabb energiaátmenetnek felel meg (770 nm). Egy második, körülbelül 700 nm-en észlelt fluoreszcenciasáv valószínűleg e konjugátum oxidált alakjának felel meg, amely abszorpciót mutat 680 nm-en és a végtermék körülbelül 10-15%-át (mólarányra vonatkoztatva) alkotja.
Lángfotometria
A Mg-atom koncentrációját lángfotometriával határozzuk meg, standardként MgCl2-t (Spectroflame ICP, Németország) alkalmazva. A Bchl-Ser-t ugyancsak Mg-tartalma alapján határozzuk meg. Az eredmények jó egyezést (±10%) mutatnak az előbbiekben leírt spektroszkópos módszerrel meghatározott Bchl-koncentrációval. Azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a konjugáció során nem következett be jelentős mértékű feofitinizálódás és hogy a megkötött Bchl extinkciós együtthatója hasonló a szabad pigmentéhez.
Nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE).
Az SDS-PAGE-t denaturáló körülmények között végezzük (Shafir et al., Melanoma Rés., 3, 157-168, 1993), a 12% SDS-nek és a „rainbow” markemek megfelelő molekulatömeg standardokkal (BioRad). A festetlen géleket megszárítjuk és optikai úton szkenneljük.
Fényforrás
Valamennyi fototoxicitási vizsgálatot laboratóriumi xenonlámpával végezzük, amelynek függőleges emissziója a célzott szinten 140 mW/cm2-t biztosít; üvegszűrőt vagy Cr2K2O7 folyadékszűrőt alkalmazunk, amelyek a 550 nm vagy ennél nagyobb hullámhosszúságú fényt engedik át.
Baktériumtenyészet
Liofilizált Staphylococcus aureus-t folyékony agyszív infúziós (BHI) közegben tenyésztünk 18 órán át 37 °C-on, folyamatos rázás közben.
Fototoxicitási vizsgálatok
A standard kísérleti menetrend négy lépésből áll; ezek:
(i) Előinkubálás: frissen elkészített baktériumszuszpenziót (200 pl) 0,1 M pH 8,6 karbonátpufferben inkubálunk a vizsgálandó szenzibilizálóval és/vagy inhibitorral a megadott koncentrációkban 1 órán át, sötétben.
(ii) Mosás: a meg nem kötött szenzibilizálót háromszori mosással távolítjuk el, ugyanazzal a pufferrel, a mosások között ebben reszuszpendálva a tenyészetet.
(iii) Besugárzás: a baktériumszuszpenziókat 5 percen át fény hatásának tesszük ki (140 mW/cm2, λ>550 nm).
(iv) A túlélés értékelése: 30 pl-es mintákat veszünk a baktériumszuszpenzióból és ezeket 2 ml folyékony BHI táptalajban tenyésztjük 37 °C-on rázás közben, 2 órán át. A baktériumtenyészet sűrűségét zavarosságmérésekkel követjük λ=660 nm-en; az o.d.660=l értéket 5xl07 baktérium/ml sűrűségnek feleltettük meg. Mindegyik kísérlet egy vizsgált és három kontrollcsoportra vonatkozik.
Kísérleti csoport
A baktériumokat teljes vizsgálati ciklusnak vetjük alá, egyetlen kísérleti paraméter változtatása mellett. A vizsgálatok a következők:
fénykontroll: megvilágított (besugárzott), szenzibilizálóval nem kezelt baktérium, sötétkontroll: meg nem világított, sötétben szenzibilizálóval kezelt baktérium kezeletlen kontroll: a 100%-os túlélés számításához használt értékek.
A Bchl-IgG kötődése
120 ng Eu-jelzett IgG-t; IgG-t vagy Bchl-IgG-t (0-1 nmol), 10 pmol pH 8,6 karbonátpuffert és baktériumokat (5xl07, előzetesen mosva, 0,1 mM ovalbuminban) 100 pl végtérfogatban 1 órán át 4 °C-on inkubálunk, enyhe rázás közben. A kötődési reakciót 10szeresre való hígítással leállítjuk és a baktériumokat háromszor mossuk (2 perces, 15,000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálás mellett) 1 ml pH 8,6 karbonátpufferrel, 4 °C-on. A mosott baktériumpelleteket 300 pl gyorsítóoldattal újraszuszpendáljuk és 15 percen át 4 °C-on inkubáljuk. A keverékeket ezután - a baktériumok eltávolítására - 15,000 fordulat/perc mellett Eppendorff-centrifugában 5 percen át centrifugáljuk. A tiszta felülúszóból 200 pl-t veszünk és idő reszolvens fluoreszcenciával meghatározzuk az Eu-tartalmat egy LKB-Wallac, Arcus 1230 fluoriméter alkalmazásával. Az aspecifikus kötődésre vonatkozó kontrollok 0,1 mM szabad IgG-t tartalmaznak. Az aspecifikus kötődésnek megfelelő értékek rendszerint a teljes bevitt fluoreszcenciaegység-szám 1%-ánál kisebb mennyiségnek felelnek meg és a teljes Eu-IgG kötés maximum 10%-áért felelősek. A kötődés a teljes bevitt fluoreszcenciaegység-szám 10-50%-ának megfelelő tartományban lép fel. A specifikus kötődést úgy számítjuk ki, hogy az aspecifikus kont13
HU 221 186 Β1 rollok értékét kivonjuk a teljes kötődési értékekből. Valamennyi érték két párhuzamos meghatározás eredménye. A kísérleteket legalább háromszor végezzük el, hacsak mást nem tüntetünk fel.
A Bchl-Ser felvétel
S. aureus szuszpenziókat (109 baktérium/20 ml) 0,05-50 μΜ Bchl-Ser-nel inkubálunk 1 órán át 4 °C-on pH 8,6 0,lM karbonátpufferben, majd pH 8,5 O,1M trisz-HCl-pufferrel mossuk a szabad pigmentnyomok eltávolítására. A baktériumpelleteket 1 ml metanolban újraszuszpendáljuk, 1 percen át ultrahanggal kezeljük és centrifügáljuk. A felülúszóban jelenlevő extrahált BchlSer-t spektroszkóposan elemezzük (300-850 nm). A Bchl-Ser koncentrációját az abszorpció alapján számítjuk ki, ε770=5,92 χ 104 7,28 χ 104 értéket, metanolban tételezve fel. A 6780 nm-en abszorbeáló oxidációs termékekre vonatkozó korrekciót - ezek mennyisége maximum 10%-ε680=7,28χ104 érték alapján (metanolban) számítjuk ki.
Eredmények
A Bchl-IgG (3 μΜ) spektruma 0,1 mM pH
8,5 trisz-HCl-pufferben (21.a. ábra) négy nagyobb csúcsot mutat. Három maximum a pigment maradék abszorpciójának felel meg: ezek a Soret-sáv (360 nm) - K. M. Smith, Ed.: Porphyrins and Metalloporphyrins; Elsevier Sci. Publ. Co., New-York, 1975, p. 10, 1, 57 -, valamint a Qx (580 nm) és a Qy (765 nm) átmenet, míg a negyedik sáv (körülbelül 280 nm) a fehérjeabszorpciónak tulajdonítható. Egy ötödik kisebb abszorpciós sáv (körülbelül 680 nm-en) a Qy átmenet 0-1 vibronkomponenséből és az oxigéntartalmú termék részéről egy kisebb komponensből tevődik össze. A Bchlid (3 μΜ) spektruma pH 8,5 0,1 mM trisz-HClben (21.b. ábra), illetve acetonban (21.c. ábra) a meg nem kötött pigmentet mutatja be.
A Bchl-IgG konjugáció megtörténtét SDS-PAGEvel (22. ábra) igazoljuk. A festetlen gél szemmel való vizsgálata két, kékeszöld színű sávot mutat körülbelül 62 KDa-nál és körülbelül 28 KDa-nál, ezek az IgG nehéz, illetve könnyű láncának megfelelő Bchl-konjugátumokat szemléltetik (2 csík). Ezeknek a csíkoknak a fehérjetartalmát a gél Coomassie brilliant kékkel való festésével is igazoltuk. Ugyancsak látható (1 csík) a Bchlid zöld sávja az alacsonyabb molekulatömegű tartományban. Ezek az eredmények arra mutatnak, hogy a BchlIgG preparátum nem tartalmaz meg nem kötött pigmentet és kovalens fehérje-fehéije konjugátumokat.
A Bchl-IgG és a Bchl-Ser fototoxicitása függ mind a szenzibilizátor koncentrációjától, mind a fénytől (23. ábra). A megfelelő LD50 értékek: 1,7±0,3, illetve 0,07±0,02 μΜ (n=3). Megjegyzendő, hogy a BchlIgG és a Bchl-Ser egészen a legmagasabb vizsgált szenzibilizáló koncentrációig (10 μΜ) nem mutat észlelhető „sötét” toxicitást.
Annak kimutatására, hogy a Bchl-IgG fototoxicitást visz-e be egy A-fehérje maradékhoz vagy a célbaktériumok tetszés szerint megválasztott helyeihez való kötődéssel, természetes IgG hozzáadásával vizsgáljuk a fototoxicitás-hatás tekintetében fellépő kompetíciót (24. ábra). Látható, hogy 0,1 mM IgG hozzáadása csaknem teljesen kiküszöböli a Bchl-IgG által indukált fototoxikus károsodást. Az IgG azonban, mint ez várható, nem befolyásolja a nem célbavett Bchl-Ser fototoxicitását (3. táblázat). Ugyanebben a koncentrációban az ovalbumin a Bchl-IgG által indukált fototoxicitási hatást csak kis és jelentéktelen mértékben gátolja és ez a hatás nemkompetitívnek látszik. Ezek az eredmények összességükben arra mutatnak, hogy a Bchl-IgG csak azáltal fejt ki fototoxicitást a S. aureusra, hogy az Afehérjéhez kötődik. A Bchl-származék fototoxikus hatásának kvantitálására meghatározzuk ezeken a baktériumokon az A-fehérjekötő helyek számát. A nyúl-IgG kötődését Eu-jelzett IgG alkalmazásával határozzuk meg (25.A. ábra). Scatchard elemzéssel (inszert a 25.A. ábrában) kimutatható, hogy Bmax =220 ±50 fettomol/106 baktérium (n=3), azaz 132 000±30 000 IgG kötőhely van jelen baktériumonként. Az IgG disszociációs állandója (Kd) a számítások szerint l,3±0,7 μΜ (n=3).
A Bchl-IgG baktériumhoz való kötődését Eu-IgG alkalmazásával kompetíciós vizsgálatban határozzuk meg (25.A. ábra). A Bchl-IgG Kd értéke (2,7±l,0 μΜ), illetve Bmax értéke (210 fettomol/106 baktérium) nagyon hasonló az Eu-IgG megfelelő értékeihez, ami arra mutat, hogy a fehérje kötődési tulajdonságait a konjugálás! eljárás nem befolyásolja hátrányosan. A Bchl-IgG fototoxicitási adatai - LD50(Bch|_lgG)=l,7±0,3 (23. ábra) ős Kd(Bchi-igG)= 13±0,7 (25.A. ábra) - körülbelül azonosak, ami arra mutat, hogy a toxikus hatás kialakulásában a sebesség meghatározó lépés a Bchl-IgG-nek a baktériumokhoz való kötődése.
Azt találtuk, hogy a Bchl-Ser-nek a S. aureusra való adszorpciója alapján a Bchl-IgG fototoxikus aktivitása összefüggésbe hozható a megkötött pigment mennyiségével (25.B. ábra). Egészen 10 μΜ-ig (ez a legmagasabb vizsgált koncentráció) a Bchl-Ser adszorpciója a baktériumon láthatóan lineáris, és a koncentrációk 7,8 xlO6 molekula/baktérium értéket érnek el (25.B. ábra). Összehasonlításként megemlítjük, hogy a Bchl-Ser fototoxicitása ugyanebben a koncentrációtartományban szigmoid görbével írható le, emellett az LD5() 0,07 μΜ BchlSer-nél (vagy 1,9 χ 106 Bchl-Ser molekula/baktérium értéknél) jelentkezik. A maximális fototoxicitás 0,5 μΜnál (2,1 χ 106 molekula/baktérium) figyelhető meg; efelett további növekedés nem figyelhető meg.
Annak ellenére, hogy azonos fénydózist alkalmaztunk, az LD5o értékben hússzoros különbség figyelhető meg a két fotoszenzibilizátor között (23. ábra). Érdekes módon számításaink során azt találtuk, hogy az LD50 eléréséhez csupán 66 000 molekula Bchl-IgG szükséges, míg a Bchl-Ser esetében 1 900 000 molekula/baktérium a megfelelő érték. Ez az eredmény arra mutat, hogy a Bchl-IgG fototoxikus hatékonysága körülbelül 29-szeres.
A fotolitikus folyamat hatékonyságát annak alapján számítottuk ki, hogy meghatároztuk az egyetlen baktérium elpusztításához - Bchl-IgG-vel vagy Bchl-Sernel végzett kezelés során - szükséges fotonok minimális számát.
A számításokat a következők szerint végeztük.
A fényintenzitás (I) a cél szinten:
1.) 1=1000 με cm1 (300 sec, λ>550 nm).
HU 221 186 Β1
A kibocsátott fotonok összes száma:
2. ) nF(T)=NA.I.t=l,8x 1023 foton cm-*, ahol Na az Avogadro-szám és τ a besugárzási idő, másodpercben.
A Bchl-abszorpció keresztmetszete:
3. ) a=23038‘NA-‘ = 1,9x10-1·» cm2 BchH, ahol ει a szenzibilizátor integrált abszorpciója az adott megvilágítási tartományban (λ>550 nm).
A Bchl-IgG-vel:
Az LD5o értéknél (1,7 μΜ Bchl-lgG) körülbelül 33 000 Bchl-lgG molekula/baktérium kötődik (ez egyenértékű 66 000 pigmentmolekula/baktérium kötődésével), ami az A-fehérje kötőhelyek körülbelül 25%ának elfoglalását jelenti (25. ábra). A teljes elérhető keresztmetszet az abszorpció/baktérium (σΤ) vonatkozásában :
4. ) σΤ=ηΒ.σ=1,25χ10“9 cm2.
Egyetlen baktérium keresztmetszete:
5. ) Sb=7t,R2=2,2x 10~8 cm2 bac-1, ahol R a baktérium megközelítő sugara (1,5 pm). Annak a valószínűsége — Pt —, hogy egy Bchl-molekula abszorbeál egy fotont, feltéve, hogy ez a foton eléri a baktériumot:
6. ) P,=a.T,Sb i =0,055 vagy 5,5%.
Annak a valószínűsége, hogy egy foton eltalál egy baktériumot :
7-)P2=vbac-Dbac1=0,01 vagy 1%, ahol vbac egyetlen baktérium térfogata (4nR3/3 cnHbac1) és Dbac a baktériumszuszpenzió sűrűsége (2,5 χ 108 bac.cm-3).
Ezért annak a teljes valószínűsége, hogy a Bchl-t abszorbeálja a foton,
8. ) P3=P, χΡ2=5,5 χ 10-4 vagy 0,055%.
Az 1 ml baktériumszuszpenzióban a Bchl-molekulák által 5 perces megvilágítás mellett abszorbeált fotonok összes számát a következő egyenlet adja meg:
9. ) nP(A)=nP(T)xP3 = l χ 102« foton.
Ezért az egyetlen baktérium elpusztításához szükséges fotonok minimális száma az LD50 értéknél:
10. ) nP(B)=nP(A).Dbac 1=4x 10 foton/baktérium.
A Bchl-Ser-nel:
Az LD50 értéknél (0,07 μΜ) egy baktérium által megkötött Bchl-Ser-molekulák száma:
11. ) n(B) = 1,9 χ 108 Bchl-Ser/baktérium.
Ezért azonos fénydózis mellett:
σΤ=ηΒ.σ=3,4 χ 10-8 cm2.
P( = l,6 vagy 160%, Ρ3 = 1,6χ10 2 vagy 1,6%; ηΡ(Α)=2,9χ ΙΟ21 foton.
Ezért
12. ) ηΡ(Β)=1,16χ 1013 foton/baktérium.
A szenzibilizátor fotolitikus hatékonyságának - ami a cél elérését illeti - növekedése kifejezésére definiálunk egy (Δτ) értéket: ez a célzott és a nem célzott szenzibilizátor belső fotolitikus hatékonysága arányának reciproka:
13. ) (AT)=nP(B)Bchl_Se/nP(B)Bchl_IgG
A Bchl-IgG-re, a Bchl-Ser-hez képest (Δτ) (Bchl-lgG)=29 és ez az érték a célbajutást illető előnyös hatást fejezi ki ebben az adott rendszerben.
3. táblázat
A Bchl-Ser és a Bchl-lgG fotocitotoxicitása és fotolitikus hatékonysága S. aureusra nézve
Fototoxicitás (LD50) (μιΜ) Fotolitikus hatékonyság
- + IgG (0,1 mM) + OA (0,1 mM) nB* (106 molekula/baktcrium) nP(B)· (1010 foton/baktérium)
Bchl-Ser 0,07±0,02 (n=3) 0,08 - 1,9 1160
Bchl-lgG Ή ---4 II H- © >10 2,5 ±0,4 (n=3) 0,066 40
*nB az LD50 értéknél egyetlen baktériumhoz kötődő szenzibilizátormolekulák száma •nP(B) az LD50 érteknél egyetlen baktérium elpusztításához szükséges fotonok száma
Az eredmények értékelése
A PDT által kifejtett sejtmérgezés hatékonysága a fotoszenzibilizátor eloszlásától, különösen ami a sejtszint alatti területeket illeti, és aggregációs állapotától függ. Irodalmi források a PDT esetében a sejtmembránokat jelölték meg kitüntetett célpontként, a membránperforáció jelentősége azonban nem volt teljes mértékben vizsgálható annak következtében, hogy más szubcelluláris helyeken szenzibilizátorok voltak jelen. Mi egy egyszerű modellt alkalmazunk a fotoszenzibilizálás szerepének vizsgálatára, amelyet egy jól definiált helyen, egy baktérium sejtfalán, extracellulárisan indítunk meg. A modell azon alapul, hogy a Bchl-lgG az A-fehérjemolekulákhoz kötődik, amelyek kizárólag a S. aureus sejtfalán helyezkednek el. A megkötött pigmentek megvilágítása nagyon magas kvantumkitermeléssel mérgezi a baktériumot.
Az új, szintetizált Bchl-IgG-konjugátum spektrális, biokémiai és fotodinamikai tulajdonságainak vizsgálata arra mutat, hogy a konjugátum szintézisével összefüggő műveletek nem változtatják meg a pigment spektrális tulajdonságait (21. ábra) vagy az IgG fehéijekötő paramétereit (25. ábra). Megállapítottuk, hogy a sikeres konjugálás optimális mólaránya 30:1 Bchlid-NHS/IgG; a kitermelés 0,52,5 Bchl/IgG, körülbelül 10%-os pigmentkitermelés mellett. Ez lehetővé teszi, hogy 5-20 μΜ végső munkakoncentrációkkal dolgozzunk.
HU 221 186 Β1
Azt találtuk, hogy a Bchl-Ser és a Bchl-IgG a S. aureusra erősen fototoxikus. Ez várható, mivel a Grampozitív baktériumok nagy mértékben érzékenyek a PDT-re, míg a Gram-negatív törzsek kevésbé. (Z. Malik et al.: J. Photo-chem. Photobiol. B, 5, 281 293, 1990). Bár a két preparátum fototoxicitása azonos kromofóron alapul, a Bchl-maradék fototoxicitása az antitest-konjugátum alakban 29-szer akkora, mint a Bchl-Ser-é. A sejtmérgezéshez csupán körülbelül 66 000 Bchl-IgG molekulára van szükség, szemben az 1 900 000 Bchl-Ser molekulával. Az utóbbi vegyület LD50 értéke ugyanakkor sokkal alacsonyabb (0,07 μΜ, szemben a Bchl-IgG 1,7 μΜ értékével; 23. ábra és 3. táblázat). Ez a megfigyelés a különböző felvételi mechanizmusokkal és a baktériumok közötti eloszlással függhet össze. A Bchl-IgG fototoxicitását fölös mennyiségű szabad IgG gátolja, míg Bchl-Ser-ét nem. Ebből arra lehet következtetni, hogy a Bchl-IgG specifikusan kötődik, az A-fehérje révén, a baktériumhoz. A BchlSer láthatóan (3. táblázat) aspecifikus módon adszorbeálódik és oszlik meg a baktériumban.
A Bchl-IgG LD50/ és Kd/ értékeinek hasonlósága (l,7±0,3 μΜ, illetve l,3±0,7 μΜ/η=3) összhangban áll azzal a feltevéssel, hogy a fotolitikus folyamatsebesség meghatározó lépése a szenzibilizátor kötődése. Az A-fehérje elhelyezkedése a baktérium sejtfalán olyan, hogy a Bchl-IgG kötődését teljes mértékben erre a területre korlátozza; ez közvetlenül a sejtmembránon kívül található. A Bchl-IgG-nak a nem célra irányított BchlSer-hez képest mutatkozó magasabb belső fotolitikus hatékonysága a következőkkel magyarázható:
i) Bchl-IgG-nek a sejtfalon való korlátozott szubcelluláris elhelyezkedése ezt az organellumot - és lehetséges, hogy a közeli citoplazmamembránt is - szelektíven a legmagasabb arányú károsodásnak teszi ki. Az eredmények arra mutatnak, hogy a kívül elhelyezkedő pigmentmolekulák szenzibilizálása révén képződött reakcióképes fotótermékek valószínűleg károsítják a sejtfalat. A sejtmembránban okozott károsodás azonban sokkal kritikusabbnak tűnik, mivel ismert, hogy azok a szferoplasztok, amelyekből mesterségesen eltávolítottuk a sejtmembránt, teljesen életképesek. Ezen két sejtterület szerepe (vagyis az, hogy ezek Gram-pozitív baktériumokban a PDT-t kifejtő ágensekre érzékenységet váltanak ki), az irodalomból ismert (Z. Malik et al., loc. cit.).
ii) Az adszorbeált Bchl-Ser magas koncentrációja egy belső szűrőhatást eredményezhet, és így csökkenti az eljárás fotokémiai hatékonyságát, valamint fokozhatja a fény hatására fellépő saját bomlás (kilúgozódás) sebességét. Ugyanezen logika alapján a BchlSer által indukált nagyobb mértékű károsodás a fény hatására olyan területeken következhet be, amelyek kevésbé kritikusak az organizmus életképessége szempontjából. Az eredmények tehát arra mutatnak, hogy kevesebb szenzibilizátormolekulának a kritikus szubcelluláris tartományhoz való kizárólagos kötődése nagyobb hatékonysággal eredményezhet intenzív helyi károsodást a fény hatására. A Bchl-IgG-nek a baktérium valamely más, az
A-fehérjétől különböző szubcelluláris részéhez való kötődése kizárható annak a megfigyelésnek az alapján, hogy ennek a szenzibilizátomak a kötődését és fototoxicitását az IgG teljesen gátolja. A szenzibilizátor célzott fotolitikus hatékonyságának járulékos hányada (Δτ) ezért figyelembe veszi egyrészt ennek szubcelluláris eloszlását, valamint a károsodott organellumok érzékenységét, szerepét az életképességben és e hatások speciális egybeesését, másrészt az esetleges spektrális kölcsönhatásokat, amilyen az önabszorpció.
A fotodinamikus biodestrukció kettős természete (biológiai hatás és fényhatás) miatt a fotoszenzibilizátorok célzott viselkedése jelentős előnyöket mutat a klinikai alkalmazásban más célzott reagensekhez képest. A találmány szerinti megoldás keretében a fototoxikus aktivitás a térben és időben pontosan ellenőrizhető, azaz a beviteli fázisban, mielőtt az anyag a célponton felhalmozódna, a toxikus mellékhatások elkerülhetők a szenzibilizáló fénysugár pontos időzítésével és elhelyezésével. A PDT keretében alkalmazható reagensek kellően magas belső koncentrációjának elérése azonban bonyolult. Ezért nagy jelentőségű a sejttoxicitásnak a találmány szerint az extracelluláris felületen való indukálása. Ez a megállapítás érvényes mindazon PDT-alkalmazásokra, amelyekben patogén mikroorganizmusok (vírusok, baktériumok és gombák) okozta betegségeket korlátozott fertőzéssel próbálnak kezelni (F. Berthiaume et al.: Biochemistry 12, 703-706, 1994), valamint a rosszindulatú daganatok PD-terápiájában. A Bchlkonjugátumok ebben a vonatkozásban különösen a spektrum (λ=780 nm) alapján tekinthetők nagyon előnyösnek, mivel a kilépő fénysugár nagyobb mélységű behatolását teszik lehetővé.
18. példa:
A Chl-Ser és a Bchl-Ser antibakteriális és vírusellenes hatása
A klorofill-szerin (Chl-Ser) és a bakterioklorofillszerin (Bchl-Ser) antibakteriális és vírusellenes hatását több mikroorganizmus-törzzsel szemben vizsgáltuk.
Ezen vegyületek fotodinámiás szerként a rák terápiájában megnyilvánuló kiváló tulajdonságai az antimikrobiális hatás tekintetében is érvényesülnek. Spektrális tulajdonságaik, vízoldhatóságuk, a nanomoláris tartományban (10-100 nM) kifejtett magas fototoxicitásuk, valamint az állati szövetekből való kiürülésük (clearance) nagy sebessége kitűnő antimikrobiális fotodinámiás anyagokká teszi ezeket. A következőkben bemutatandó módon ezek aktívak anaerob körülmények között is például a Propionibacterium acnes ellen, ami szélesítheti alkalmazási spektrumukat az anaerob patogének irányában, in vitro és in vivő. Herpes simplex-1 vírus elleni aktivitásukat mind vírus szuszpenziók, mind fertőzött sejtekben jelen levő intracelluláris vírusok esetében kimutattuk.
Ezek az antibakteriális és antivirális hatású konjugátumok tehát különböző területeken használhatók fel, amilyen az emberi vér transzfúzió céljából való sterilizálása (J. L. Matthews et al.: Transfusion 28, 81-83,
HU 221 186 Β1
1988, E. Ben-Hur et al.: Photochem. Photobiol. 62, 383-388, 1995); Helicobacter-fertőzések kiküszöbölése a gyomorban (C. E. Millson et al.: J. Photochem. Photobiol. B 32, 59-65, 1996), valamint célzott alakban a korlátozott helyi bakteriális fertőzések in vivő felszámolása (F. Berthiaume et al., loc. cit.).
A fotodinámiás hatás (PDT) vizsgálata
A vizsgálat három lépésből áll, ezek:
1. Előinkubálás
A baktériumot vagy vírust a fotoszenzibilizátor távollétében (kezeletlen kontroll) és növekvő koncentrációjú fotoszenzibilizátor jelenlétében 1-2 órán át sötétben, szobahőmérsékleten vagy 37 °C-on inkubáljuk.
2. Fény hatásának való kitétel
A kezeletlen kontrollt és egy sorozatot a szenzibilizátorral kezelt mintákból 5-10 percen át fény hatásának teszünk ki. Egy azonos csoportot sötétben tartunk („sötét kontroll”).
3. Életképesség
A kontroliokban és a kísérleti csoportokban meghatározzuk a túlélők számát és az életképességet a kezeletlen kontroll %-ában számítjuk ki.
Megvilágítási forrás
A megvilágítás során fényforrásként egy 250 W-os halogénlámpát alkalmazunk. A fényt egy üveg alátéten fókuszáljuk és a 630 nm feletti fény kiküszöbölésére szűrjük. A cél szinten a fény intenzitása 1500 pEinstein/cm2. (A Bchl-Ser besugárzásának menetét a S. aureus elleni alkalmazás esetében a 17. példában mutattuk be). Baktériumtenyésztés
A baktériumtörzseket (S. aureus, B. subtilis, E. coli) szilárd LB ferde agar tenyészetekben 4 °C-on tartottuk fenn. A kísérlet előtt 2 órával a baktériumokat folyékony LB táptalajra visszük át és 37 °C-on tenyésztjük, folyamatos rázás közben.
A P. acnest (ATCC-CR 8919) 1053 agaron (Oxoid CN 149; kiegészített klosztrídium táptalaj) tenyésztettük és 37 °C-on tartottuk fenn. A tenyésztést átlátszó edényzetben végeztük, amelyet egy palládiumkatalizátort tartalmazó gázgenerátor-köpennyel (Beckton Dlckenson, Cockesyville, AEÁ) tettünk anaerobbá, vagy szabad levegőn aerob tenyésztést végeztünk.
A baktériumokat a kísérletek elvégzése előtt 3-4 napon át inkubáltuk.
A baktériumok (S. aureus, B. subtilis, E. coli, P. acnes) kvantitatív meghatározása telepszámlálással
A baktériumszuszpenzióból aliquot mennyiségeket (20 vagy 30 pl) LB agarlemezeken tenyésztünk 24 órán át 37 °C-on, illetve a P. acnes esetében 1053 agaron. Ezután megszámláljuk a telepeket és a kezeletlen kontroll alapján kiszámítjuk a %-os életképességet.
A baktériumok kvantitatív meghatározását az optikai sűrűség mérésével a 17. példa szerint végezzük. Baktériumokkal végzett PDT
A baktérium (S. aureus, B. subtilis, E. coli, P. acnes) szuszpenziókat A650 nm körülbelül 0,035 optikai sűrűség értéken LB közeggel 1000-szeresen, illetve 10 000-szeresen hígítjuk. 100 pl-es mintákat átlátszó kémcsövekben a megadott koncentrációjú ChI-Ser távollétében vagy jelenlétében 2 órán át 37 °C-on sötétben inkubálunk. A kísérleti csoportokat 10 percen át fény hatásának tesszük ki. Mindegyik kísérletben az előbbiekben ismertetett kontrollokat alkalmazzuk.
A P. acnest A650nm körülbelül 0,014 optikai sűrűségérték elérésekor PBS-szel ezerszeresre hígítjuk és a szuszpenziót 200-200 pl mennyiségben kémcsövekbe osztjuk szét. A mintákat vagy nem kezeljük, vagy növekvő koncentrációjú Chl-Ser-nel inkubáljuk. A sötétben tartott mintákat alumíniumfóliába csomagoljuk. Valamennyi kémcsövet behelyezzük az anaerob edénybe és 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk. Az anaerob edényt ezután a fényforrás üveghordozójára helyezzük és a mintákat 5 percen át fény hatásának tesszük ki. Az anaerob vizsgálatok céljára szolgáló kémcsöveket, a baktériumokkal és a szenzibilizátorokkal, 2 órán át inkubátorban tartjuk, majd szabad levegőn 5 percen át fény hatásának tesszük ki. Az anaerob, illetve aerob kísérleti mintákból 20 pl-es aliquotokat veszünk ki és ezeket agarlemezeken szélesztjük, majd anaerob körülmények között tenyésztjük. 4 napi, 37 °C-on végzett anaerob inkubálás után a képződött telepeket megszámláljuk és a kontroll alapján kiszámítjuk az életképes sejtek számát. 6-7 kísérlet alapján vesszük fel a túlélési görbéket.
A Bchl-Ser S. aureusra kifejtett hatására vonatkozó kísérleteket a 17. példa szerint végezzük.
Herpes simplex vírus 1 (HSV-1)
A HSV-l-t tartalmazó sejtek tenyésztése
Vero-sejteket (afrikai zöldmajomvese-sejttenyészet) 25 mM HEPES közeggel - amely 10% szarvasmarhaembrió-szérumot (FBS) is tartalmaz - pufferolt DMEM+F12 közegben tenyésztünk. A HSV-l-et egy dendrites keratitiszben szenvedő egyén szeméből izoláljuk és tenyésztjük.
A vírussal való fertőzéshez a Vero-sejteket (2xl04/lyuk) egy 24 helyes mikrotitráló lemezen tenyésztjük 2 napon át, 37 °C-on. A táptalajt friss közeggel cseréljük ki, amely 2% FBS-t tartalmaz és a sejteket HSV-l-gyel (200 pl) fertőzzük 1-3-szoros fertőzésfokozás (MOI) mellett. Ezután a sejteket 3 napon át 37 °C-on tovább inkubáljuk. A mintákat összeöntjük és a sejt, illetve sejttöredékek eltávolítására 5 percen át klinikai centrifügában centrifügáljuk. A vírusrészecskék koncentrációját a következőkben leírtak szerint meghatározzuk és a szuszpenziót részletekre osztjuk fel, amelyeket a felhasználásig -80 °C-on tárolunk.
A HSV-1 kvantitatív meghatározása a plakk módszerrel
Vero-sejteket 10-szeres hígítású HSV-1 tenyészetekkel inokulálunk és tenyésztünk 2 órán át 37 °C-on. A táptalajt ezután friss DMEM-mel cseréljük ki (amely 2% FBS-t és 0,7% metil-cellulózt tartalmaz) és a sejteket 3 napon át tovább tenyésztjük. A felülúszó réteget dekantáljuk és a sejteket fixáljuk és kristályibolyával festjük. A vírus által okozott plakkokat megszámláljuk és meghatározzuk a plakk-képző egységek számát (pfü/ml).
PDT a HSV-l-et tartalmazó Vero-sejtekkel
Vero-sejteket HSV-l-gyel fertőzünk és 4 órán át inkubálunk. A sejteket ezután sötétben tovább tenyésztjük 1 órán át, Chl-Ser nélkül, illetve a megadott koncentrációjú Chl-Ser jelenlétében. A sejteket háromszor
HU 221 186 Β1 mossuk a táptalajjal, majd azonnal fény hatásának tesszük ki, 10 percen át. A vírus szaporítására ezután a sejteket 3 napon át inkubáljuk, majd a közeget összegyűjtjük és kvantitatív meghatározást végzünk. Mindegyik kísérletbe beiktatjuk az előbbiekben ismertetett megfelelő kontrol lókat.
PDT szuszpenzióban jelen levő HIV-1 sejtekkel
A táptalajjal 2xl06 pfu/ml koncentrációjú HSV1 szuszpenziót állítunk elő, majd ezt szétosztjuk egy 24 helyes mikrotitráló lemezen (0,5 ml/lyuk) és a lemezt 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk Chl-Ser nélkül, illetve a megadott koncentrációjú Chl-Ser jelenlétében. A vizsgált csoportot 10 percre fény hatásának tesszük ki. Mindegyik kísérletbe beiktatjuk az előbbiekben ismertetett megfelelő kontrollokat. A vírus túlélését az előbbiekben leírt módon határozzuk meg.
Eredmények
A Chl-Ser-t a következő mikroorganizmusokkal szemben vizsgáljuk:
S. aureus, B. subtilis, E. coli, P. acnes (aerob körülmények között), P. acnes (anaerob körülmények között), HSV-1 (szuszpenzióban), HSV-1 (fertőzött Verosejtekben). A Bchl-Ser-t S. aureusszal szemben vizsgáljuk.
A Chl-Ser és a fény antibakteriális hatása (2-10)χ 103 baktérium/ml koncentrációjú S. aureus (26. ábra) és B. subtilis (27. ábra) szuszpenziókat ChlSer-nel kezelünk. Mint látható, a Chl-Ser dózisfüggő baktericid hatást fejt ki a fény alkalmazásakor. A fototoxicitás fél-maximuma (13) χ 10 7M Chl-Sernek felel meg. Ugyanezen körülmények között sem önmagában a fény, sem a Chl-Ser sötétben nem fejt ki semmilyen hatást. Az E. coli (28. ábra) viszont jelentős rezisztenciát mutat a Chl-Ser-nel és fénnyel szemben. A fototoxicitás körülbelül 5 χ 10 6M Chl-Ser koncentrációig figyelhető meg; ezentúl a szenzibilizátor sötétben toxikus.
A P. acnes kezelése aerob, illetve anaerob körülmények között (29., illetve 30. ábra) Chl-lel sötétben, illetve fényben dózisfüggő fototoxicitást mutat a (0,1 —l)x 10-7 M koncentrációtartományban. Az LD50 érték aerob körülmények között 0,1 χ 10 7M, míg anaerob körülmények között 0,3 χ 10 7M. A csupán fénnyel vagy sötétben csupán szenzibilizálóval kezelt minta telepszámai nem térnek el a nem kezelt mintákéitól.
A Bchl-Ser és a fény antibakteriális hatása
A 17. példa szerint S. aureusszal szemben vizsgált Bchl-Ser igen magas fototoxicitást mutat: az LD50 érték 7χ10~8Μ. Az eredményeket a 23. és 25.B. ábrán mutatjuk be.
A Chl-Ser és a fény antivirális hatása
A Chl-Ser és a fény antivirális hatását in vitro vizsgáljuk HSV-1-gyei fertőzött sejtekkel és sejtmentes HSV-1 vírusszuszpenziókkal. A Chl-Ser fototoxikus hatását először HSV-l-gyel fertőzött Vero-sejtekkel határozzuk meg (31. ábra). Látható, hogy a vírus túlélése dózisfüggő módon csökken a szenzibilizátor vizsgált koncentrációtartományában. A maximális toxicitás körülbelül 5 χ 10~7M, míg a félmaximális hatás körülbelül
1,5 χ 10'7M-nál figyelhető meg. Egy hasonló vizsgálatban, amelyet sejtmentes vírusszuszpenziókkal végeztünk (32. ábra), a vírus a Chl-Ser-re sokkal magasabb fényérzékenységet mutatott. A félmaximális hatás eléréséhez szükséges szenzibilizátorkoncentráció tizedrésze (körülbelül 1 χ 10 *M) annak, amely a vírussal fertőzött Vero-sejtek esetében szükséges. A maximális toxicitás >2xlO 8M koncentrációknál érhető el. A vizsgált koncentrációtartományban a Chl-Ser sötétben nem bizonyult toxikusnak.

Claims (15)

1. Egy X-CO-O-R (I) általános képletű vegyület; e képletben
X-CO-jelentése C17-propionil-klorofill (Chl) vagy C17-propionil-bakterioklorofill (Bchl) csoport, amely csoportban a központi Mg-atom helyett adott esetben egy másik kétértékű fématom, amilyen a V-, Zn-, Cu-, Co-, Ni- vagy Snatom áll, vagy Mg-atom nincs jelen; és
R jelentése egy L-szerinből, egy L-szeril-alkil-észterből, tritil-L-szeril-alkil-észterből, L-szeril-szeril-alkil-észterből, benziloxi-karbonil-szeril-szeril-alkil-észterből, L-tirozil-alkil-észterből, Nterc-butoxi-L-tirozil-alkil-észterből, a-melanocita stimuláló hormonból (α-MgH) vagy immunglobulin G-ből (IgG) leszármaztatható csoport, ahol az alkilcsoport 1-4 szénatomos.
2. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képlet körébe tartozó klorofillid a-L-szeril-metil-észter.
3. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képlet körébe tartozó bakterioklorofillid a-L-szeril-metil-észter.
4. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képlet körébe tartozó klorofillid a-N-(terc-butoxi-karbonil)-tirozilmetil-észter.
5. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képlet körébe tartozó bakterioklorofillid a-N-(terc-butoxi-karbonil)-tirozil-metil-észter.
6. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képlet körébe tartozó vegyület, amelyben R jelentése [(benziloxi)karbonilj-szeril-metil-észter-maradék.
7. Egy 1. igénypont szerinti (I) általános képletű vegyület, amelyben X-CO egy olyan Cl7 propionil-Chl vagy -Bchl csoport, amelyben a központi Mg-atom hiányzik.
8. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képlet körébe tartozó feoforbid a-L-szeril-metil-észter.
9. Egy 4. igénypont szerinti vegyület, amelyben X-CO egy olyan C17 propionil-Chl vagy -Bchl csoport, amelyben a központi Mg-atom helyett egy kétértékű fématom van jelen.
10. Egy 9. igénypont szerinti vegyület, amelyben a kétértékű fématom Zn vagy Cu.
11. Az 1, igénypont szerinti (I) általános képlet körébe tartozó Zn-klorofillid a-L-szeril-metil-észter.
12. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képlet körébe tartozó Cu-klorofillid a-L-szeril-metil-észter.
13. Eljárás az 1. igénypont szerinti (I) általános képletű vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy
HU 221 186 Β1
a) a klorofill vagy a bakterioklorofill fitil-észterét vagy a bakterioklorofill geranil-geranil-észterét egy R-OH általános képletű alkohollal - ahol R jelentése az 1. igénypontban megadott - reagáltatjuk klorofilláz jelenlétében, vagy
b) egy X-COOH általános képletű klorofillidet vagy bakterioklorofillidet szobahőmérsékleten egy R-OH általános képletű alkohollal - ahol X és R jelentése az 1. igénypontban megadott - reagáltatunk N-hidroxi-szukcinimid és diciklohexil-karbodiimid vagy 4dimetil-amino-piridin és diciklohexil-karbodiimid jelenlétében.
14. Tumordiagnózishoz alkalmazható készítmény, amely hatóanyagként egy, az 1-12. igénypontok bár5 melyike szerinti (I) általános képletű vegyületet tartalmaz.
15. Fotodinamikus terápiás célokra szolgáló gyógyszerkészítmény, amely hatóanyagként egy, az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti (I) általános képletű
10 vegyületet tartalmaz.
HU9302149A 1992-07-26 1993-07-23 Chlorophyll and bacterio chlorophyll derivatives, method for producing them and diagnostic and pharmaceutical compositions comprising thereof HU221186B1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IL102645A IL102645A (en) 1992-07-26 1992-07-26 Chlorophyll and bacteriochlorophyll derivatives, their preparation and pharmaceutical compositions comprising them

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9302149D0 HU9302149D0 (en) 1993-10-28
HUT64949A HUT64949A (en) 1994-03-28
HU221186B1 true HU221186B1 (en) 2002-08-28

Family

ID=11063865

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9302149A HU221186B1 (en) 1992-07-26 1993-07-23 Chlorophyll and bacterio chlorophyll derivatives, method for producing them and diagnostic and pharmaceutical compositions comprising thereof

Country Status (16)

Country Link
US (3) US5726169A (hu)
EP (1) EP0584552B1 (hu)
JP (1) JP3612343B2 (hu)
CN (1) CN1040212C (hu)
AT (1) ATE196850T1 (hu)
AU (1) AU674315B2 (hu)
CA (1) CA2101227C (hu)
DE (1) DE69329538T2 (hu)
DK (1) DK0584552T3 (hu)
ES (1) ES2153367T3 (hu)
GR (1) GR3035195T3 (hu)
HU (1) HU221186B1 (hu)
IL (1) IL102645A (hu)
PL (2) PL173128B1 (hu)
PT (1) PT584552E (hu)
ZA (1) ZA935310B (hu)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6147195A (en) * 1993-07-26 2000-11-14 Yeda Research And Development Co., Ltd. Chlorophyll and bacteriochlorophyll derivatives, their preparation and pharmaceutical compositions comprising them
IL116126A0 (en) 1995-11-24 1996-01-31 Yeda Res & Dev Process for the preparation of bacteriochlorophyllis some novel compounds of this type and pharmaceutical compositions comprising them
GB9625895D0 (en) * 1996-12-13 1997-01-29 Riley Patrick A Novel compound useful as therapeutic agents and assay reagents
CN1074771C (zh) * 1996-12-30 2001-11-14 中国科学院长春应用化学研究所 聚合物载体茂金属催化剂的制备
US6066628A (en) * 1997-01-09 2000-05-23 Emory University Non-iron metalloporphyrins and methods of use
DE19731741A1 (de) * 1997-07-23 1999-01-28 Deutsches Krebsforsch Konjugat zur Unterscheidung von krankhaftem und gesundem Gewebe
US6299860B1 (en) 1998-10-15 2001-10-09 Fluoro Probe, Inc. Method for viewing diseased tissue located within a body cavity
US6652836B2 (en) 1998-10-15 2003-11-25 Fluoroprobe, Inc. Method for viewing tumor tissue located within a body cavity
US6284223B1 (en) * 1998-10-15 2001-09-04 Fluoroprobe, Inc. Method for viewing tumor tissue located within a body cavity
NZ512093A (en) 1998-12-09 2003-04-29 Yeda Res & Dev Palladium-substituted bacteriochlorophyll derivatives and use thereof
IL133253A0 (en) 1999-12-01 2001-04-30 Yeda Res & Dev Chlorophyll and bacteriochlorophyll esters, their preparation and pharmaceutical compositions comprising them
US7045117B2 (en) * 1999-12-01 2006-05-16 Yeda Research And Development Co. Ltd. Method for tumor diagnosis comprising administering of palladium-substituted bacteriochlorophyll derivatives
AU2001227837A1 (en) * 2000-01-12 2001-07-24 Light Sciences Corporation Novel treatment for eye disease
US7235685B2 (en) * 2001-07-03 2007-06-26 Mallinckrodt, Inc. Aromatic sulfenates for type I phototherapy
US20020169107A1 (en) * 2001-01-19 2002-11-14 Mallinckrodt Inc. Novel aromatic azides for type I phototherapy
EP1303481A1 (en) * 2000-07-26 2003-04-23 Patrick Anthony Riley Phenylethylamine derivatives and their use in the treatment of melanoma
EP1318807A4 (en) * 2000-08-11 2008-02-20 Ceramoptec Gmbh LIGHT-SENSITIVE OINTMENT
AU2006200164B2 (en) * 2001-04-09 2007-03-08 Oncofluor, Inc. Method for viewing tumor tissue located within a body cavity
IL148921A0 (en) * 2002-03-26 2002-09-12 Peptor Ltd Photo active backbone cyclized somatostatin analogs for optical imaging and photodynamic therapy
EP2401962A1 (en) 2002-05-08 2012-01-04 Yeda Research And Development Co., Ltd. Sensitized online BOLD-MRI imaging method
IL152900A0 (en) * 2002-11-17 2003-06-24 Yeda Res & Dev Water-soluble bacteriochlorophyll derivatives and their pharmaceutical uses
GB0323358D0 (en) * 2003-10-06 2003-11-05 Green Grass Design Ltd Novel compounds and processes
MXPA06014326A (es) * 2004-06-07 2007-02-19 Yeda Res & Dev Derivados de bacterioclorofila cationica y sus usos.
US7947827B2 (en) * 2006-06-30 2011-05-24 State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University Pharmaceutical formulation comprising a metaloporphyrin and method for its purification and use
AU2007287205B8 (en) * 2006-08-23 2013-08-15 Yeda Research And Development Co. Ltd Conjugates of RGD peptides and porphyrin or (bacterio)chlorophyll photosynthesizers and their uses
US9957293B2 (en) 2006-08-23 2018-05-01 Yeda Research And Development Company Ltd. Conjugates of RGD peptides and porphyrin or (bacterio)chlorophyll photosynthesizers and their uses
US8463365B2 (en) 2007-09-19 2013-06-11 Oncofluor, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
FR2924021B1 (fr) * 2007-11-27 2010-08-13 Du Vernet Michele Eymard Composition pour le traitement de la peau par therapie photodynamique
CN101925382A (zh) * 2008-01-28 2010-12-22 耶达研究及发展有限公司 内窥镜成像光动力学治疗系统及其使用方法
EP2259794A1 (en) * 2008-02-22 2010-12-15 Clinuvel Pharmaceuticals Limited Method for treatment of photosensitivity and phototoxicity
BRPI0907791A2 (pt) 2008-02-27 2015-08-04 Yeda Res & Dev Conjugados rgd-(bacterio)clorofila para terapia fotodinâmica e formação de imagem de tumores necróticos
JP6215203B2 (ja) 2011-08-23 2017-10-18 イェダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッドＹｅｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ． Ｌｔｄ 眼疾患および障害の治療用の（バクテリオ）クロロフィル光増感剤
EP2934303B1 (en) * 2012-12-19 2019-09-04 The Research Foundation for the State University of New York Compositions and method for light triggered release of materials from nanovesicles
CN105579063A (zh) * 2013-06-05 2016-05-11 法尔哈德·哈菲泽 包括光活化活性组分的施用组合物的方法和具有给予药物组合物的方案的药物组合物
RU2536109C1 (ru) * 2013-07-25 2014-12-20 федеральное государственное бюджетное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ комбинированной обработки склерального ложа после эндорезекции внутриглазного новообразования
RU2536116C1 (ru) * 2013-07-25 2014-12-20 федеральное государственное бюджетное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ фотодинамической обработки склерального ложа после эндорезекции внутриглазного новообразования
SG10201506686WA (en) * 2015-08-24 2017-03-30 Agency Science Tech & Res Conjugates
CN111171030B (zh) * 2018-11-12 2022-11-22 浙江海正药业股份有限公司 细菌叶绿素衍生物及其制备方法
CN115093422B (zh) * 2022-06-15 2023-06-20 西北工业大学 一种基于代谢标记策略的新型光敏剂及其制备方法和应用
CN116585530B (zh) * 2023-05-05 2024-02-02 暨南大学 一种高效产氧的叶绿体复合水凝胶及其制备方法与应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5156840A (en) * 1982-03-09 1992-10-20 Cytogen Corporation Amine-containing porphyrin derivatives
US4977177A (en) * 1985-04-30 1990-12-11 Nippon Petrochemicals Company, Ltd. Tetrapyrrole polyaminomonocarboxylic acid therapeutic agents
HU204856B (en) * 1987-08-12 1992-02-28 Orszagos Mueszaki Fejlesztesi Process for releasing cell mixtures and tissues from undesired populations and for producing monoclonal antibody - hematoporphyrin conjugates
US4876190A (en) * 1987-10-21 1989-10-24 Becton Dickinson & Company Peridinin-chlorophyll complex as fluorescent label
EP0350948B1 (en) * 1988-07-14 1998-03-18 Toyohakka Kogyo Kabushiki Kaisha Porphyrin derivatives
US5002962A (en) * 1988-07-20 1991-03-26 Health Research, Inc. Photosensitizing agents
US5567687A (en) * 1989-03-06 1996-10-22 University Of Texas Texaphyrins and uses thereof
US5171741A (en) * 1989-04-21 1992-12-15 Health Research, Inc. Bacteriochlorophyll-a derivatives useful in photodynamic therapy
US5238940A (en) * 1990-03-22 1993-08-24 Quadra Logic Technologies Inc. Compositions for photodynamic therapy
DE4121876A1 (de) * 1991-07-02 1993-01-14 Scheer Hugo Modifizierte bakteriochlorophylle, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
US5330741A (en) * 1992-02-24 1994-07-19 The Regents Of The University Of California Long-wavelength water soluble chlorin photosensitizers useful for photodynamic therapy and diagnosis of tumors

Also Published As

Publication number Publication date
EP0584552A2 (en) 1994-03-02
PL173150B1 (pl) 1998-01-30
US5955585A (en) 1999-09-21
JPH0733772A (ja) 1995-02-03
DE69329538T2 (de) 2001-06-07
EP0584552B1 (en) 2000-10-11
IL102645A (en) 1998-02-22
HU9302149D0 (en) 1993-10-28
HUT64949A (en) 1994-03-28
AU4214893A (en) 1994-01-27
JP3612343B2 (ja) 2005-01-19
PL173128B1 (pl) 1998-01-30
DK0584552T3 (da) 2001-02-05
IL102645A0 (en) 1993-01-14
AU674315B2 (en) 1996-12-19
DE69329538D1 (de) 2000-11-16
US5650292A (en) 1997-07-22
GR3035195T3 (en) 2001-04-30
PT584552E (pt) 2001-04-30
CA2101227C (en) 2002-11-12
CN1088210A (zh) 1994-06-22
EP0584552A3 (en) 1994-08-17
CA2101227A1 (en) 1994-01-27
ES2153367T3 (es) 2001-03-01
CN1040212C (zh) 1998-10-14
PL299803A1 (en) 1994-02-07
ZA935310B (en) 1994-02-11
US5726169A (en) 1998-03-10
ATE196850T1 (de) 2000-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU221186B1 (en) Chlorophyll and bacterio chlorophyll derivatives, method for producing them and diagnostic and pharmaceutical compositions comprising thereof
JP5566945B2 (ja) 水溶性陰イオン性バクテリオクロロフィル誘導体及びそれらの使用
Spikes New trends in photobiology: Chlorins as photosensitizers in biology and medicine
Berg et al. Intracellular localization of sulfonated meso‐tetraphenylporphines in a human carcinoma cell line
Oseroff et al. Strategies for selective cancer photochemotherapy: antibody‐targeted and selective carcinoma cell photolysis
EP1246826B1 (en) Chlorophyll and bacteriochlorophyll esters, their preparation and pharmaceutical compositions comprising them
US8207154B2 (en) Catatonic bacteriochlorophyll derivatives
US6740637B1 (en) Chlorophyll and bacteriochlorophyll derivatives, their preparation and pharmaceutical compositions comprising them
Brandis et al. Bacteriochlorophyll sensitizers in photodynamic therapy
WO2019003155A1 (en) COMPOSITIONS FOR PHOTODYNAMIC THERAPY AND FLUORESCENCE DIAGNOSIS OF CANCERS AND OTHER DISEASES
Margalit et al. Porphyrin binding and aggregation
Boateng Design, synthesis and biological evaluation of folate-targeted photodynamic therapy agents
Jinadasa Design, synthesis, and characterization of porphyrin derivatives for biological applications

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees