PT584552E - Derivados da clorofila e da bacterioclorofila a sua preparacao e composicoes farmaceuticas que os incluem - Google Patents

Derivados da clorofila e da bacterioclorofila a sua preparacao e composicoes farmaceuticas que os incluem Download PDF

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Description

t b*,yfr i/ -1 -
DESCRIÇÃO "DERIVADOS DA CLOROFILA E DA BACTERIOCLOROFILA, A SUA PREPARAÇÃO E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS INCLUEM" O presente invento relaciona-se com novos derivados da clorofila (Chi) e da bacterioclorofila (Bchl), com a sua preparação e sua aplicação em terapêutica fotodinâmica, assim como nas técnicas de detecção e de monitorização.
Durante as duas últimas décadas, tem havido um interesse crescente na utilização de fotosensibilizadores para terapêutica do cancro. Nesta técnica, conhecida como terapêutica fotodinâmica (PDT), oxigénio singeleto, radicais de oxigénio e superóxidos ou peróxidos são produzidos por meio de fotosensibilização in situ de cromoforos aplicados previamente e que intoxicam as células malignas (Dougherty, 1987). A técnica utiliza drogas não tóxicas em combinação com radiação fotosensibilizadora não perigosa, e tem o potencial de ser mais selectiva embora não menos destrutiva quando comparada com a quimioterapia ou radioterapia habitualmente usada, e assim espera-se aumentar a qualidade de vida dos pacientes tratados.
Os fotosensibilizadores usados em PDT necessitam de ter um rendimento quantitativo elevado para produção de oxigénio singeleto e uma afinidade e selectividade elevadas em relação ao tecido maligno. Porfirinas apresentam um rendimento quantitativo relativamente elevado para a formação de um estado tripleto excitado e a diferença entre as energias deste estado e o seu -2-
estado fundamental singeleto toma-os bons dadores de energia para excitar o oxigénio (tripleto) em estado fundamental até ao seu estado singeleto. É sabido desde há algum tempo que a hematoporfirina (HP) (Fig. 1) e o derivado da hematoprofirina (HPD) tendem a acumular-se em tecidos neoplásicos. Assim, misturas de HP e de HPD tomaram-se os compostos preferidos para PDT. A mistura HPD usada comercialmente como agente fotodinâmico, Photofrin II (Quarda Logic Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canada) contem uma elevada proporção de oligómeros HP ligados a éter que apresentam valores de coeficiente de extinção elevados à volta de 400 rnn (a chamada banda Soret), mas valores muito mais pequenos no visível (500-630 nm; as chamadas bandas Q). Infelizmente, devido à atenuação extensa de radiação Uv-Visible pelo tecido animal, o rendimento quantitativo de fotosensibilização por HPD in situ é muito baixo. Assim, radiação intensiva e grandes quantidades de HPD são requeridos para tratamento eficaz de tumores. A medida que a quantidade de HPD aplicado aumenta, as hipóteses da sua acumulação em tecidos normais e o risco concomitante de prejudicar sítios não malignos, aumenta profundamente. Uma desvantagem adicional de análogos relacionados com HPD é a sua eliminação lenta a partir do organismo humano. Pacientes tratados com HPD sofrem de fototoxicidade da pele durante períodos de semanas. A forte atenuação de radiação UV-VIS pelo tecido animal e a especificidade limitada de HPD em relação aos sitios malignos motivaram pesquisa e síntese de novos agentes fototerapêuticos que absorvem radiação para além de 550 nm e têm retenção aumentada no sítio maligno (McRobert et al., 1989). A fim de aumentar a retenção em, e a especificidade para, tecidos malignos, foram testados vários derivados de porfirina contendo grupos químicos particulares ligados aos resíduos de pirrole a estrutura de profirina. O desvio vermelho da absorção em relação a HPD é conseguido por variações no sistema de π-electrão da porfirina.
Seguindo esta abordagem, manifestou-se um interesse cada vez maior pela utilização de derivados de Chi e de Bchl como agentes PDT (Kreimer-Bimbaum, 1989; Spike and Sommer, 1991). Chis e Bchls são derivados de di- e tetrahidroporfirina, respectivamente, consistindo em 4 anéis de pirrole e um anel isocíclico ligados uns aos outros e ao átomo de Mg, tal como é indicado na Fig. 2 para clorofila a (Chia) e na Fig. 3 para bacterioclorofila a (Bchla), M representando Mg e sendo o radical R fitilo ou geranilgeranilo em Bchla, e fitilo em Chia. A molécula Bchla difere da molécula Chia por ter mais dois β-carbonos (carbonos periféricos dos aneis pirrole) reduzidos. A variedade de Chis e de Bchls resulta da variação de substituintes no macrociclo ou no resíduo de álcool que esterifica o resíduo de ácido 17-propiónico. No Bchla ocorrendo naturalmente, o resíduo de álcool é fitilo ou geranilgeranilo, enquanto que em Bchlb, por exemplo, é geranilgeranilo. Os ácidos derivados da clorofila e da bacterioclorofila são designados clorofilida (Chlide) e bacterioclorofilida (Bchlide), respectivamente. Os ácidos livres derivados de Chia e de Bchla são designados Chlidea e Bchlidea, respectivamente. Os compostos derivados de Chi e de Bchl desprovidos de de um átomo de metal central são designados feofitina (Pheo) e bacteriofeofitina (Bpheo), respectivamente. As feofitinas derivadas de Chia e de Bchla são designados Pheoa e Bpheoa, respectivamente. Os ácidos livres derivados de feofitina e de bacteriofitina são designados feoforbida e bacteriofeoforbida, respectivamente.
Os Chis e os Bchls colhem energia solar e iniciam transferência de electrões na fotosíntese biológica. As suas transições da energia mais baixa (as chamadas transições Q3) nas formas monoméricas são encontradas a 670-800 nm e podem ser desviadas até 1.000 nm em formas agregadas. Estas transições apresentam coeficientes de extinção extremamente elevados. A probabilidade de cruzamento inter-sistema a partir do estado singeleto excitado dos Chis e dos Bchls originando os seus estados tripleto mais baixos é razoavelmente elevada (30-50%) e assegura um rendimento elevado de moléculas de oxigénio excitadas. Com efeito, a fotosensibilização de oxigénio por Chis e de Bchls é sublinhada pelo facto de eles estarem envolvidos em processos degradativos importantes em bactérias e plantas fotossintéticas e assim todos os organismos fotossintéticos apresentam uma série de mecanismos protectores contra oxigénio singeleto ou radicais de oxigénio. Como Chis e Bchls são compostos naturais que são habitualmente consumidos por animais, a sua degradação in vivo é muito rápida em relação e HP ou HPD (LLewellyn, et al., 1990). Isto constitui uma vantagem importante que reduz a exposição do paciente a radiação prologada. A utilização de Chis e de Bchls naturais como fotosensibilizadores para a terapêutica do cancro e a sua rapida degradação in vivo é descrita por exemplo por Park, Y. J. et al., Yonsei Med. Journal (1989), 30, (3), 212-218 e por Henderson, B et al., Journal Photochem. (1991), 10(4), 303-313.
Até agora, existem vários problemas na utilização de extractos de Chi ou de Bchl nativos para PDT. Em primeiro lugar, são de difícil administração ao sítio maligno visto serem fortemente hidrofóbicos. Em segundo lugar, são muito lábeis em condições de administração normais, isto é, na presença de oxigénio à temperatura ambiente e em condições de luz normais. Em terceiro lugar, não apresentam qualquer porção para os dirigir especificamente para o tecido maligno. Devido a estas limitações, o potencial destes pigmentos fotossintéticos como sensibilizadores em PDT é presentemente difícil de realizar. Seria altamente desejável sintetizar derivados de Chi e Bchl que pudessem ultrapassar estas dificuldades e que pudessem ser utilizados com sucesso em PDT. Constitui o objectivo do presente invento proporcionar esses derivados. -5-
*-( *-A
Os grupos laterais de Chi e de Bchl determinam a afinidade global da molécula para diferentes meios ambiente.
Verificou-se actualmente de acordo com o presente invento que novos derivados de Chi e de Bchl podem ser preparados para utilização como fotosensibilizadores em terapêutica e diagnósticos por modificação do grupo éster no grupo lateral do ácido C17-propiónico da estrutura Chi ou Bchl.
O presente invento relaciona-se assim com novos derivados de Chi e de Bchl da fórmula geral I
X-CO-Y-A-R em que X-CO- representa um resíduo C17-propionilo de Chi ou Bchl; Y é O, S ou NH; A é uma ligação covalente ou uma cadeia hidrocarboneto ramificada, saturada ou insaturada tendo 2 a 20 átomos de carbono e que pode ser substituído e/ou interrompido por grupos funcionais, heteroátomos e/ou porções carbocíclicas ou heterocíclicas, e R é um aminoácido, um peptídeo ou um resíduo de proteína ou um seu derivado. O termo "resíduo de Chi ou de Bchl" aqui significa qualquer derivado de Chi ou de Bchl, ambos derivados naturais e sintéticos, e inclui os compostos em que o átomo Mg central foi eliminado ou substituído por outros metais divalentes, tais como Zn, V, Cu, Co, Ni ou Sn. Derivados de Bchl são preferidos de acordo com o invento.
Numa apresentação preferida, Y é O e X-CO- é o resíduo de Chia ou de Rchla, indicados nas Figs. 2 e 3, respectivamente. -6- CL~ ( «Ά A cadeia hidrocarboneto A tem de preferência de 5 a 20 átomos de carbono. A cadeia pode ser saturada ou insaturada, interrompida por heteroátomos, tais como O, N e/ou S, e/ou substituída ou interrompida por porções mono- ou poli- carbocíclicas ou heterocíclicas, tais como OH, NH2, CONH2, COO. Por exemplo, A pode compreender ou ser o resíduo de um hidrato de carbono, por exemplo, de um mono- ou oligossacarídeo, de um triglicerídeo ou de outras porções lipídicas, de um anel policarbocíclico, por exemplo, esteroides, tais como colesterol, ou de um composto heterocíclico, por exemplo, uracilo e 2,5-dioxo-3, 6-di-hidroximetilpiperazina e uracilo A estará ligado a T através de um grupo funcional, por exemplo éster, amida, éter. O radical R pode ser derivado de um aminoácido ou de um seu derivado, tal como serina, tirosina e lisina e seus derivados, por exemplo, ésteres metílicos de L-serina ou tirosina, ou de um peptídeo, por exemplo, éster metílico de seril serina, hormonas que estimulam melanócito (MSH), ou de uma proteína.
Em particular é encarada pelo invento a conjugação de Chi e de Bchl com diferentes aminoácidos, e posterior conjugação destes conjugados Chl/Bchl aminoácido com hormonas, factores do crescimento ou seus derivados, ou anticorpos específicos em relação ao tumor, ou quaisquer outros ligandos específicos das células, obtendo-se assim fotosensibilizadores dirigidos ao sítio (SPD) apropriados.Um exemplo de uma hormona peptidica usada no invento é uma das hormonas que estimulam melanócitos (MSH) (melanotropinas), tais como α-, β- ou gama-MSH, que se liga de um modo específico a receptores nos melanócitos, podendo assim dirigir a porção fotosensibilizadora para tumores melanoma. O invento compreende ainda processos para a preparação dos compostos da fórmula (I). São também incluídas no invento composições compreendendo um composto da fórmula (I) com finalidades diagnósticas e de terapêutica fotodinâmica, e um método de terapêutica fotodinâmica de dooentes com cancro que compreende o tratamento do doente com um composto da fórmula (I) seguindo-se irradiação local. A Fig. 1 apresenta a estrutura de hematoporfmna, HP : R1=R2= - CHOH-CH3. A Fig. 2 apresenta a estrutura de Chia (M=Mg, R=fitilo), Chlidea (M-Mg, R=H) e Pheoa (M=2H, R=fitilo). A Fig. 3 apresenta a estrutura de Bchla (M=Mg, R=fitilo), Bchlidea (M=Mg, R=H) e Bpheoa (M=2H, R-fitilo). A Fig. 4 apresenta um esquema da transesterificação de Chia com éster metílico de L-serina (L-Ser-OMe) na presença de clorofilase (Chlase). A Fig. 5 apresenta um esquema para esterificação catalítica de Bchlidea com éster metílico de carbobenzoxiserilserina (Z-Serç-OMe, em que Z é carbobenzoxi). A Fig. 6 apresenta os espectros de absorção optica de (a) Chia, (b) Chla-L-Ser-OMe, (c) Bchla, e (d) Bchla-L-ser-OMe, em acetona a 100%. A Fig. 7 apresenta espectros de absorção optica de (a) Pheoa-L-SEr-OMe, (b) Zn-Pheoa-L-Ser-OMe, e (c) Cu-Pheoa-L-Ser-OMe, em etanol a -8-
At ί'Μ. yt^ ^ „ ι ( A Fig. 8 apresenta espectros infravermelhos de iransfomiação de Fourier (FTIR) de (a) Chia, (b) Chlidea, e (c) Chla-L-Ser-OMe sólidos. A Fig. 9 apresenta espectros FTIR de (a) Bchla, (b) Bchlidea, e (c) Bchla-L-Ser-OMe. A Fig. 10 apresenta a dependência da adsorção de Chlidea (triângulos a cheio), Chla-L-Ser-OMe (círculos a cheio) e de HPD (quadrados a cheio) para as células de melanoma M2R em cultura na concentração de pigmento no meio de incubação. A Fig. 11 apresenta a dependência da adsorção de Bchla-L-Ser-OMe (círculos a cheio) e de Bchlidea (triângulos a cheio) para as células de melanoma M2R em cultura como tuna função da concentração de pigmento no meio de incubação. A Fig. 12 A-C apresenta o efeito de PDT sobre a incorporação de [^H] timidina em (A) células de melanoma de ratinho, (B) fíbroblastos de prepúcio humano e (C) células de cancto da mama humano T47D, após tratamento com Chla-L-Ser-OMe com (luz) e sem (escuro) subsequente irradiação. A Fig. 13 apresenta o efeito de PDT sobre a eficiência de clonagem da proliferação de células de melanoma M2R após tratamento com Chla-L-Ser-OMe (luz) e sem (escuro) subsequente irradiação. A Fig. 14 apresenta contraste de fase (à esquerda) e micrógrafos de flurescência (à direita) de uma monocamada de células M2R incubada com Chla-L-Ser-OMe 4 x 10"6m durante 1 hora e irradiada durante 10 minutos com radiação laser 670 nm (5mW). Após 3 horas, as células foram tratadas com -9-
Propidíum Iodide (PID) e a sua fluorescência PID foi examinada. Uma área circular irradiada pelo feixe de laser (A) revela células e regiões lesionadas a partir das quais se separaram células. Células na área em redor da zona irradiada (B) que foram mantidas no escuro apresentam uma morfologia normal (à esquerda). No micrógrafo fluorescente da mesma monocamada (à direita) todas as restantes células lesionadas na área (A) ficaram marcadas com PID, enquanto que as células na área (B) permaneceram não coradas sendo assim contadas como não lesionadas. A Fig. 15 apresenta contraste de fase/micrógrafo de fluorescência de uma camada de células M2R tratada tal como foi descrito na Fig. 14. É revelado o limite da área irradiada em que núcleos (Nu) marcados com PID podem ser observados em células lesionadas contíguas a células de controlo adjacentes (C) que não foram irradiadas e têm assim uma morfologia normal e núcleos não corados. A Fig. 16 apresenta micrógrafo de contraste de fase de uma monocamada de células M2R irradiada durante 10 minutos sem agente sensibilizador. Não se observou qualquer modificação no configuração das células. Não havia células marcadas por coloração com PID (não apresentadas). A Fig. 17 apresenta um corte transversal de pele de um ratinho nu tratado fotodinâmicamente (A: mag x 30; B: mag x 70). Um ratinho nu foi tratado com Chla-L-Ser-OMe (20 mg/kg) e 24 horas mais tarde foi irradiado durante 4 horas. A seguir a um período adicional de 24 horas o ratinho foi sacrificado. A pele foi dissecada e fixada imediatamente em fixador de Bouin. Cortes de parafina do tecido da pele irradiado foram coradas com tricrómio modificado (hematoxiíina/eosina/ Light green, ácido Fosforomolibdico), sendo a orientação da área irradiada mantida constante ao longo da experiência. O corte foi retirado -10-
através do centro da área necrótica (NC). Pele normal que nâo foi irradiada é observada em ambos os lados da área necrótica (A). A necrose penetra na derme e epiderme e atinge a camada de gordura subcutânea que está tipicamente carregada com pequenas gotas de gordura. E também observada a infiltração de leucócitos (LU) justamente debaixo da área necrótica. A Fig. 18 A-C apresenta imagem de ressonância magnética (MRI) de tumor (T) melanoma M2R implantado num ratinho nu CD1 tratado com Bchla-L-Ser-OMe, antes de (A), duas semanas após o primeiro tratamento (B), e duas semanas após um segundo tratamento (C). Enquanto que se observa uma certa recorrência (R) em (B), não existe recorrência em (C). A Fig. 19 apresenta a distribuição de Chla-L-Ser-OMe em vários orgãos de ratinhos nús CD1 12 horas após tratamento. A Fig. 20 apresenta formação de cAMP em cultura de células de melanoma MR2 em ratinho, induzida por Chla-a-MSH (círculos a cheio) e por um análogo alfa-MSH (círculos vazios). A concentração do Chla-alfa-MSH é determinada pelo coeficiente de extinção possível mais baixo da porção Chi. O presente invento proporciona conjugados de Chi e de Bchl com aminoácidos, peptídeos e polipeptídeos. De particular importância são conjugados obtidos por (a) conjugação de Chi e de Bchl com diferentes aminoácidos e seus derivados; (b) posterior conjugação de conjugados Chi- Bchl-aminoácido com hormonas, por exemplo α-melanotropina, ou (c) com anticorpos específicos em relação ao tumor, e (d) substituição do Mg central nos conjugados Chi e Bchl com metais que melhoram o rendimento do estado tripleto.
Numa apresentação preferida A é uma ligação covalente, Y é O e o -11 - /4ft k*.rh CL— resíduo R está ligado directamente ao grupo ácido C17-propiónico de Chi ou Bchl através de uma ligação éster. Estes compostos podem ser preparados por um de dois métodos: (1) Um novo processo de transesterificação enzimática apresentado na Fig. 4 com o enzima clorofilase (Chlase), extraído com acetona a partir de cloroplastos de plantas e armazenado sob a forma de pó de acetona. A esterificação é realizada por incubação de pó de clorofilase acetona com um álcool primário R-OH, por exemplo, éster metílico de L-serina, numa solução tampão contendo detergente, a 37° C durante 1 hora, adicionando um derivado de Bchl ou de Chi, por exemplo Bchla ou Chia, à suspensão resultante e posteriormente incubando a 37° C. Após remoção do pó de acetona sólida, o éster desejado é extraído da mistura da reacção e é purificado. (2) Um novo processo para condensação catalítica de um derivado de Chlide ou de Bchlide, por exemplo Chlidea ou Bchlidea, com um composto R-OH, por exemplo, Z-Ser2-OMe, usando N-hidroxi-succinimida (NHS) e diciclohexil-carbodiimida (DCC) ou 4-dimetilaminopiridina (DMAP) e DCC para activar o grupo Chlide ou Bchlide carboxílico (Fig. 5). Pode ser uado o último processo no qual feoforbidas e bacteriofeoforbidas, os análogos sem Mg de Chlidea e de Bchlidea, respectivamente, são activados antes da condensação com etileno glicol (Wasielewski, 1980). São preparados vários ésteres pelos métodos acima referidos com serina ou seus derivados, tais como hidrocloreto de éster metílico de L-serina, éster metílico de N-tritil-L-serina, éster metílico de carbobenzoxi-seril-L-serina. Estes derivados podem ser usados eles próprios nas aplicações do invento, ou podem servir como uma ponte para ligar outras moléculas apropriadas ao macrociclo de Chi ou de Bchl. - 12-
Quando é desejado um éster e o peptídeo ou proteína desejado é desprovido de um resíduo de aminoácido contendo hidroxilo, o macrociclo de Chi ou de Bchl poderá em primeiro lugar ser ligado a uma serina ou a qualquer outro aminoácido contendo hidroxilo, ou com um seu derivado, por transesterificação dos compostos nativos ou por esterificação dos correspondentes ácidos livres (Chlide ou Bchlide), e o peptídeo ou proteína é então ligado ao macrociclo através deste resíduo de aminoácido.
Conjugados da fórmula I em que Y é S e A é uma ligação covalente podem ser obtidos quer por transesterificação enzimática de um derivado de Chi ou de Bchl como clorofilase e um composto R-SH, por exemplo, cisteina ou um seu derivado ou um peptídeo ou proteína contendo cisteina, ou por condensação catalítica de um derivado de Chlide ou de Bchlide com um composto R-SH, na presença de DCC e de DMAP.
Conjugados da fórmula I em que Y é NH e A é uma ligação covalente podem ser obtidos por condensação catalítica de um derivado de Chlide ou de Bchlide com um composto R-NH2, por exemplo uma amina ou o grupo amino terminal de um peptídeo ou proteína, na presença de DCC e de DMAP ou por meio de NHS e DCC.
Quando um derivado de Chlide ou de Bchlide é feito reagir com um peptídeo ou proteína compreendendo porções de aminoácido, contendo hidroxilo, radicais mercapto e/ou amino, poderá nem sempre ser claro se a conjugação será feita através de um átomo de O ou S ou um grupo NH, mas todos esses conjugados são abrangidos pelo presente invento, de um modo independente da identificação da sua estrutura.
Para preparação de derivados de Chi e Bchl substituídos com metal, -13- o Mg é substituído antes da conjugação do pigmento com o aminoácido ou ligando específico da célula. A substituição do Mg central em Chi e seus derivados com Cu, Ni, Zn, V, Co, Sn e outros metais divalentes é realizada por meio de processo padronizados, por exemplo, tratando a feofitina correspondente com um sal do metal desejado, por exemplo acetato de Zn ou acetato de Cu em etanol absoluto à temperatura ambiente (Hambright, 1975; Hynninen, 1991). No caso de Bchl e seus derivados, o Mg central pode ser substituído por Zn ou por Cu por meio de um processo semelhante envolvendo tratamento com acetato de Zn ou de Cu em ácido acético glacial sob argão a temperaturas elevadas (Fiedor etal., 1993).
Quando A é uma cadeia hidrocarboneto tal como foi definido, ela irá conter um grupo funcional terminal através do qual está ligada ao resíduo R. Por exemplo, um grupo éster é formado por reacção do grupo carboxilo terminal de A com um grupo hidroxilo do aminoácido ou do grupo hidroxilo terminal de A com um grupo carboxilo do aminoácido; um grupo amida é formado por reacção do grupo carboxilo terminal de A com um grupo amino do aminoácido ou do grupo amino terminal de A com um grupo carboxilo do aminoácido.
Os novos ésteres apresentam as mesmas caracteristicas de absorção e fotofísicas que os respectivos Chis e Bchls. Assim, uma vez residindo no interior do tecido tratado, espera-se que os novos ésteres de Chi e de Bchl sejam agentes fotodinâmicos eficientes. A conjugação de proteínas, por exemplo, hormonas, factores de crescimento ou seus derivados e anticorpos, e de nutrientes da célula, por exemplo tirosina, à porção Chi ou Bchl pretende aumentar a sua retenção no tumor e sítios tratados. O aumento do desvio vermelho permite uma maior profundidade de penetração mantendo-se entretanto a ubiquidade do sistema natural. A substituição do Mg por outros metais pretende optimizar a estabilidade intrínseca e metabólica da porção Chi ou Bchl e seu intersistema atravessando para o estado tripleto excitado, e também abre a possibilidade de novos processos de diagnóstico.
Anticorpos específicos em relação ao tumor irão atingir exclusivamente as porções Chi e Bchl para o tumor ou sitio tratado, enquanto que hormonas e nutrientes da célula podem também ser fixados pelas suas contrapartidas não transformadas. Contudo, as células seleccionadas como alvo para hormonas e nutrientes celulares, tais como melanócitos, são espalhadas entre outras células em condições normais e quando transformadas em células malignas, reunem-se formando tumores sólidos. Como resultado, espera-se que a concentração de agente de fotosensibilização no tecido maligno aumente de um modo dramático em relação à sua concentração no tecido normal, em que células são mais dispersas, assegurando amplificação do efeito PDT no sítio do tumor. Isto permite uma utilização eficaz de doses de radiação mais baixas do que o limiar que provoca lesão do tecido normal, reduzindo desse modo a necessidade de irradiação espacialmente bem definida. Além disso, tendo uma muito forte fluorescência, o Chi ou o Bchl dirigidos ao sítio podem ser utilizados para marcação de fluorescência do(s) sítio(s) do tumor ou outros alvos.
Os tumores melanoma são apropriados para tratamento com os novos fotosensibilizadores Chi e Bchl do invento por várias razões: (a) em estádios precoces (sem metastases), melanoma maligno e outros tumores da pele são muito acessíveis a PDT: (b) terapêutica fotodinâmica usando luz verde assim como quimioterapia e radioterapia convencionais falharam até agora no tratamento do melanoma; (c) existem, contudo, vários ligandos específicos para o melanoma que podem dirigir a porção fotosensibilizadora para o sítio do tumor, e (d) espera-se que a utilização das porções Chi e Bchl excitáveis de comprimento -15- 4t h*.yh C.-«- (·~χ de onda longo ultrapasse as deficiências dos agentes de fotosensibilizaçEo convencionais, os quais são avaliados devido à absorção pela melanina. Tumores melanoma evoluem a partir de transformação carcinogénica (incluindo mutagénese induzida por UV) de melanócitos. Melanócitos normais compreendem uma certa percentagem da população celular da pele humana normal e são encontradas normalmente na camada de células basais entre a epiderme e a derme onde cada um deles é rodeado por 30-40 ceratinócitos e uma célula de Langerhans. PDT enfrenta um desafio particularmente difícil com tumores melanoma visto que as células do tumor melanoma podem conter as eumelaninas pretas insolúveis (poli-5,6-indole quinonas), que apresentam uma banda de absorção ampla à volta de 540 nm e assim competem com qualquer agente fotosensibilizador para a irradiação com comprimentos de onda mais curtos do que 650 nm. Além disso, as moléculas de melanina podem extinguir os radicais de oxigénio que se tenham formado e desse modo prevenir a intoxicação de organelos celulares vitais. Consequentemente, PDT de melanomas melanóticos com o HPD habitualmente usado não é muito prometedor. Contudo, tendo a sua absorção optica máxima num comprimento de onda acima de 650 nm, Chis e Bchls e seus derivados sintéticos não devem ser ocultados pela melanina. Além disso, células do tumor melanoma (isto é melanócitos transformados) consomem quantidades consideráveis de tirosina durante a síntese de melanina, apresentam uma elevada afinidade para as melanotropinas (as hormonas da pituitária que estimulam α-, β- e gama-melanócitos (MSH)) e para vários anticorpos conhecidos. Assim, podem ser um bom alvo para conjugados de tirosina, melanócortina ou anticorpo de Chi e Bchl, contanto que a conjugação não afecte fortemente o reconhecimento do ligando pelos receptores celulares. Como a concentração dos melanócitos aumenta por um factor próximo de 40 nos sítios de melanoma (em relação a um tecido da pele normal), espera-se que o efeito fotodinâmico aumente drasticamente. -16- -16- * O presente invento proporciona assim composições farmacêuticas compreendendo um derivado de Chi ou de Bchl do invento para terapêutica foto-dinâmica de vários tipos de cancro, incluindo cancros do cérebro, ovário, mama e tumores da pele, pulmão, esofago e bexiga e tumores sensíveis a hormonas.
Numa apresentação, o invento relaciona-se com teratamento fotodi-nâmico de melanoma maligno. O efeito fotodinâmico dos compostos é monitorizado em células de melanoma em tumores e culturas de células. Exemplos de derivados que podem ser usados com esta finalidade são conjugados de Chi ou Bchl com uma α-melanotropina, ligada a uma porção pigmento quer por meio dos seus resíduos de serina, tirosina ou lisina ou através do grupo amino terminal.
As composições farmacêuticas do invento serão administradas ao paciente por meio de processo padronizados usados em PDT. A quantidade de composto a ser administrada e a via de administração serão determinadas de acordo com o tipo de tumor, estádio da doença, idade e condições de saúde do paciente, mas será uma quantidade muito mais baixa do que a dosagam habitualmente usada de Photofrin II de cerca de 20-40 mg de HPD/kg do peso corporal. As vias de administração preferíveis são a intravenosa ou a injecção directa no tumor sólido da solução aquosa do composto activo compreendendo veículos e aditivos convencionais farmacêuticamente aceitáveis, e tratamento tópico de tumores da pele com composições tópicas apropriadas. O invento relaciona-se ainda com um método de terapêutica fotodinâmica do cancro que compreende a administração a um paciente atingido por um tomor canceroso sólido de uma composição farmacêutica compreendendo um derivado de Chi ou de Bchl de acordo com o invento, e em seguida irradiando o sítio do tumor com fontes de radiação a 670-780 nm. -17- São assim previstas várias aplicações para os derivados de Clil e de Bchl do invento, tais como fotodestraição de células ou tecidos benignos ou malignos por meio de terapêutica fotodinâmica dirigida ao sítio (SDP). O conjugado transporta a molécula de Chi ou de Bchl para as células que se reúnem em tecidos tumorais após transformação, mas que estão bem separadas umas das outras em tecidos normais (por exemplo melanócitos em melanoma). Como resultado, o efeito fotodinâmico do agente de fotosensibilização no tumor pode ser mais elevado por ordem de magnitude que o seu efeito no tecido normal. Consequentemente espera-se que o limiar de irradiação que é destrutivo para o tumor seja reduzido até um nível que seja não destrutivo para o tecido normal. Nestas circunstancias, o efeito fototóxico será limitado ao sítio do tumor sob irradiação não específica. Esta aplicação tem particular importância para tumores que sejam inacessíveis a cirurgia convencional. A terapêutica fotodinâmica usando processos bifotónicos (Leopold and Freyer, 1992) constitui um outro meio para alargar a gama de efeito de sensibilização para ο IV próximo. A taxa de cruzamento inter-sistema dos derivados de Chi e de Bchl e o seu comprimento de onda longo para absorção máxima faz deles muito bons candidatos para este modo de PDT.
Os conjugados do invento são também úteis para fotodestraição de células animais normais ou malignas assim como de microorganismos em cultura com ou sem SDP, permitindo uma fotodestraição selectiva de certos tipos de células em cultura ou agentes infecciosos; para dirigir a porção profirina para células seleccionadas por ligação dos conjugados de Chi- e de Bchl-serina a polipeptídeos específicos, tais como hormonas ou outros ligandos do receptor, a anticorpos específicos em relação a células ou tecidos ou a outros ligandos, por exemplo, lectinas; para marcação/rotulagem de moléculas para fins analíticos em laboratório, aplicações diagnósticas e industriais; e para marcação fluorescente de -18-
At f células animais ou microorganismos ou partículas para aplicações laboratoriais, diagnósticas ou industrais. Podem substituir vários dos rótulos de fluorescência habitualmente usados, tais como o isotiocianato de fluoresceina (FITC) ou ficoeritrina, devido aos seus superiores coeficientes de extinção e mais elevado rendimento da fluorescência.
Para fins de diagnóstico, os derivados de Chi e de Bchl do invento, podem ser marcados radioactivamente por processos padronizados, por exemplo com Ga, Hlln, 201χι? 99mTCj e o agente radioactivo de diagnóstico é administrado ao paciente, de preferência por injecção intravenosa. Após algumas horas, o locus (local) do cancro pode ser visualizado por meio de processos padronizados. O benefício esperado de PDT usando agentes de sensibilização dirigidos ao sítio consiste numa diminuição dramática de efeitos secundários e da dose aplicada de agente de sensibilização. Algumas vantagens particulares da utilização dos conjugados propostos de Chi e de Bchl para PDT são como se segue: (1) Estes compostos apresentam absorção optica máxima com comprimentos de onda em que a absorção optica/atenuação por tecidos humanos/animais diminui grandemente (660-830 nm na forma monomérica e até 1.000 nm em dímeros ou agregados mais elevados). Juntamente com uma diminuição no espalhar da irradiação, isso deveria permitir uma maior profundidade de penetração ou a utilização de fontes de irradiação menos intensas e expansivas. (2) Os seus coeficientes de extinção nos IV visíveis e próximos são aproximadamente dez vezes maiores do que os das porfirinas utilizadas habitualmente para PDT. (3) A substituição do átomo de Mg central por outros metais aumenta o rendimento da produção de oxigénio singeleto devido a um rendimento de estado triplo mais elevado do agente de fotosensibilização e pode estabilizar os compostos de um modo significativo. (4) Deverão apresentar especificidade aumentada para reconhecimento das células alvo. Assim, doses mais baixas de agentes de sensibilização serão suficientes para necrose celular. Além disso, os conjugados de Chi e de Bchl apresentam propriedades fotoquímicas superiores em relação a muitos fluoroforos presentemente usados e podem, assim, ser práticos noutras aplicações. (5) Existem alguns relatórios indicando uma elevada taxa de clearance (eliminação) de certos derivados de Chi a partir do organismo (Spikes andBommer, 1991). (6) Usualmente, a irradiação é realizada com fontes de laser tais como laser com pigmento bombeado por Ar sintonizado para emitir a 630 nm ou laser de vapor de ouro (pulsado) que emite a 628 nm. O elevado custo deste equipamento limita a aplicação de PDT para centros médicos maiores. A utilização de agentes de sensibilização que absorvem IV vermelhos ou próximos de acordo com o invento abre o caminho para meios mais convencionais e de baixo custo, tais como lampadas de flash Xenon, lampadas de halogénio, lasers de diodo ou radiação solar directa. (7) Derivados de Chi e de Bchl marcados radioactivamente ou activamente podem ser usados de um modo simultâneo para fins tanto de -20- ky. f f*1· C— í diagnóstico com terapêuticos. O invento irá agora ser ilustrado pelos exemplos não limitativos que se seguem.
EXEMPLOS
Exemplo 1 : Preparação de Clorofila a
Clorofila a foi purificada a partir de Spirullina Galtieri como se segue: Células liofílizadas (2-3 g) foram moidas até se obter um pó, extraídas três vezes com acetona (10 ml), sendo o extracto filtrado e eliminado. O resíduo verde acastanhado foi extraído de novo por moagem com metanol. Após filtração, o sólido cinzento pálido foi eliminado e o solvente foi evaporado a partir do extracto sob vácuo. O resíduo verde foi dissolvido de novo em acetona e foi cromatografado numa coluna (1,5 cm de diâmetro, 6 cm de comprimento) de dietilaminoetilsefarose (Pharmacia Fine Chemicals, DEAE-sefarose CL-6B) a 5o C. A coluna foi lavada com acetona para remover materiais amarelos (carotenoides), e em seguida com metanol/acetona (1:3, v/v) para eluir uma solução de Chia azul escura. O tempo total requerido para a separação croma-tográfica foi de 10-12 minutos. O Chia foi avaliado por TLC (cromatografia de placa delgada) e espectrofotometricamente para carotenoides residuais e outras impurezas tais como feofitinas ou clorinas, e foi cromatografado de novo, quando necessário. O metanol/acetona foi então evaporado, e o Chia sólido foi seco minuciosamente sob vacuo e armazenado no escuro a -20° C. Todas as operações foram realizadas em luz pouco perceptivel ou na escuridão, e foram completadas tão rapidamente quanto possível a fim de minimizar a degradação. Foram usados solventes de grau analítico sem posterior purificação. -21 -
Ath^ro CL—
Exemplo 2: Preparação de clorofilase Pó de acetona clorofilase (Chlase) foi preparado a partir de cloroplastos de folhas da árvore Melia Azedarach L. China. Folhas frescas (50 g) foram moidas com 350 ml de acetona fria (-20° C) num misturador. O homogenato (produto homogeneizado) foi filtrado através de gaze, e o produto filtrado foi deixado durante a noite a 5o C a fim de permitir a sedimentação dos cloroplastos. A acetona foi removido por filtração e o restante pó foi lavado várias vezes com acetona a 95% e finalmente com acetona a 100%, proporcionando pós de acetona clorofilase que foram secos sob vácuo. Esse pó pode ser armazenado a -20° C durante pelo menos vários meses.
Exemplo 3: Preparação de derivados de serina
Os derivados de serina que se seguem foram usados para a reacção de transesterificação de Chla/Bchla: (a) Hidrocloreto de éster metílico de L-serina (L-Ser-OMe.HCl) foi fornecido por Sigma Chemical Co. (b) Éster metílico de carbobenzoxi seril serina (Z-Serç-OMe): A síntese deste novo derivado foi realizada usando o método descrito por Nicolaides et al., 1968, J. Med. Chem. ϋ : 74-79. A uma solução fria (5o C) de 6,45 g (0,027 mole) de carbobenzoxiserina (Z-Ser) em 50 ml de DMF, foram adicionados 3,9 g (0,028 mole) de p-nitrofenol e 5,8 g (0,028 mole) de DCC. A mistura foi mantida a 5o C durante 5 horas e foi filtrada. Ao produto filtrado, foi adicionada uma solução filtrada a partir de 4,2 g de éster metílico de serina e 2,7 -22- fô*. Y d~~~—4r Í ‘'i g (0,027 mole) de Et3N em 50 ml de DMF. A mistura da reacção foi deixada repousar durante 18 horas a 25° C, sendo em seguida evaporada até um volume pequeno. O resíduo foi misturado com 100 ml de EtOAc, e a solução, lavada com H2O, solução de Na2CC>3 a 5%, e HC1 diluído, foi seca e evaporada até cerca de 30 ml. Foi adicionado éter de petróleo, e o sólido resultante foi removido e recristalizado a partir de EtOAc-MeOH-Et20 para dar origem a Z-Serç-OMe, p.f. 190-192° C. (c) Carbobenzoxiserina (Z-Ser) : A síntese deste derivado, usado na síntese de (b) acima referido, foi realizada usando o método descrito por Moore et al., 1954, JACS 76 : 2884-2887. A uma solução fria (5° C) de NaOH (212 ml, 2N), foram adicionados 44,3 g (0,42 mole) de L-serina para dar origem a um pH de 9,8. Com 10-15 minutos de intervalo, foram adicionadas porções (4-5 g) de cloroformato de benzilo e o pH foi ajustado para 9,8 usando solução de NaOH IN. A adição foi continuada até terem sido adicionados 80 g (0,46 mole) de cloroformato de benzilo. O pH foi então mantido a 10 durante 0,5 hora a 10° C. A solução básica foi extraída com 150 ml e em seguida com 100 ml de éter dietílico e 1 L de EtOAc foi adicionado à solução aquosa. Por adição de 30-35 ml de HC1 concentrado, a solução foi acidificada até pH 3 e a camada aquosa foi extraída com 250 ml de EtOAc, e em seguida com 150 ml de EtOAc. A solução de EtOAc foi seca sobre MgS04 e foi concentrada sob vácuo até Z-Ser se precipitar. Recristaiização a partir de EtOAC deu origem a um produto puro, p.f. 117-119° C, rendimento total 79 g (78%). (d) Éster metílico de N-tritil-L-serina (Tri-Ser-OMe) : A síntese deste derivado foi realizada usando o método descrito por Guttmann, 1962. Helv. Chem. 45 : 2622. A uma solução fria (0° C) de 15,5 g (0,1 mole) de L-Ser-OMe em 150 ml de clorofórmio, foram adicionados 31 ml (0,22 mole) de Et3N e 26,7 g (0,11 mole) de trifenilmetano. A solução foi mantida a 0o C durante 3 horas, sendo então lavada com água e seca sobre Na2SC>4. O solvente foi evaporado sob vácuo e foram obtidos 28 g (77%) de produto puro, por recristalização do resíduo sólido numa mistura de benzeno-éter de petróleo (1:1).
Exemplo 4 : Preparação de éster metílico de L-serilo de clorofilidaa (Chla-L-Ser-OMe) por transesterificação enzimática de Chia com éster metílico de L-serina 4.1 Preparação de Chla-L-Ser-OMe 200 mg de pó de acetona clorofilase do Exemplo 3 foram suspensos em 6 ml de tampão fosfato de sódio 0,5M, pH 7,6, contendo TX-100 a 0,7% (Triton X-100, Sigma Chem. Co.), 400 mg de hidrocloreto de éster metílico de L-serina (Sigma) e 70 mg de ácido ascórbico (Merck). A suspensão foi homogeneizada durante 5 minutos e em seguida foi agitada durante 1 hora à temperatura ambiente. A suspensão resultante foi ainda homogeneizada com 5 mg de Chia sólido e saturada com Ar. Esta mistura foi selada e incubada durante 7 horas na escuridão completa a 36° C, mantendo-se a agitação. A evolução da reacção foi monitorizada por TLC sobre gel de sílica (Merck) usando n-hexano:acetona - 6:4 ou 1-butanol como um eluente. Foram observadas três bandas que correspondem a Chia, Chlidea e o composto do título Chla-L-Ser-OMe. 4.2 Purificação de Chla-L-Ser-OMe A mistura da reacção foi adicionada a 20 ml de água contendo 2 g -24-
f t-I de NaCl e 100 mg de ascorbato de sódio (Sigma), e foi filtrada sob vácuo baixo. O resíduo verde azulado foi lavado com acetona e foi filtrado com acetona e filtrado de novo. Os produtos filtrados foram combinados, saturados com NaCl e agitados com éter dietílico num funil separador. A camada etérea foi recolhida e mantida sobre NaCl sólido durante aproximadamente 10 horas, sendo em seguida evaporada numa corrente de azoto seco e o resíduo verde azulado resultante do pigmento foi seco sob vácuo. Este resíduo foi dissolvido em acetona e submetido a uma coluna de CM-Sepharose CL-6B a 5o C, equilibrado com acetona. A coluna foi lavada com acetona até aparecer uma banda castanha de feofitinas, e foi separada da banda do conjugado Chla-L-Ser-OMe, que permaneceu como uma banda verde azulada no topo da coluna, 5% metanol/acetona e 8% metanol/acetona foram usados para eluir o feoforbida, respectivamente. Chlidea foi eluido a seguir e o conjugado Chla-L-Ser-OMe foi finalmente eluido com 25% metanol/acetona. Esta última fracção verde azulado foi recolhida, avaliada quanto à sua pureza por TLC sobre gel de sílica usando 1-butanol para fraccionamento, irrigada com N2 até à secura, sendo em seguida seca sob vácuo e selada sob Ar para armazenamento a -20° C no escuro. Rendimento de 75%. 4.3 Estrutura do conjugado Chla-L-Ser-OMe A absorção optica e os espectros FTIR de Chia, Chlidea e de conjugado Chla-L-Ser-OMe são apresentados nas Figs. 6 e 8, respectivamente. Cada composto (na mistura da reacção) apareceu como uma mancha distinta sobre uma TLC de gel de sílica. O espectro iH-RMN do conjugado Chla-L-Ser-OMe (IV) em CD3OD em comparação com Chlidea de partida (desvios químicos são indicados no Quadro 1), tem novos sinais a 3,57 ppm, correspondendo ao grupo metilo da porção serina, e a 5,31-5,37 ppm, que indica a reaparição da -25- fo*. κη —-J ^ ligação éster. Todos os compostos apresentam o padrão completo de macrociclo mas o conjugado IV Chla-L-Ser-OMe e Chlidea não apresentam bandas fitilo.
Os espectros FTIR de Chia (a) e do conjugado (c) Chla-L-Ser-OMe (tendo uma banda éster a 1728 cnrl) são semelhantes mas são significativamente diferentes do espectro de Chlidea (b), tal como é indicado na Fig. 8.
Exemplo 5 : Transesterífícacão enzimática de Chia com Z-Sere-OMe e Tri-Ser-OMe A transesterificação de Chia com os derivados da serina Z-Serç-OMe e Tri-Ser-OMe (compostos (b) e (d) do Exemplo 3 acima referido) foi realizada tal como no Exemplo 4 acima referido. A CTL revela um rendimento de 35% dos conjugados de derivados de Chla-serina e nenhuns produtos de hidrólise.
Exemplo 6 : Preparação de éster metílico de L-serilo bacterioclorofilida a (Bchla-L-Ser-OMe) por transesterífícacão enzimática de Bhcla com éster metílico de L-serina A transesterificação de Bchla com éster metílico de L-serina foi realizada tal como foi descrito no Exemplo 4, produzindo Bchla-L-Ser-OMe, rendimento de 35%. A pureza do conjugado foi avaliada por TLC. A absorção optica e espectros FTIR do conjugado Bchla e de Bchla-L-Ser-OMe são indicados nas Figs. 6 e 9, respectivamente. (Os desvios químicos estão indicados mo Quadro 1 (composto VII)). -26- IQA.rh QUADRO 1
Desvios Químicos de Chlidea, Bchlidea e de seus derivados (apenas sinais de campos elevados) em CD3OD, em ppm.
Protão Chlidea Bchlidea TV V vra IX I II m C-10 9,16s 8,60s 9,6s 9,65s 8,80s 8,80s - - - C-5 9,48s 8,25s 9,5s 9,33s 8,42s 8,45s - - - C-20 8,34s 8,18s 8,55s 8,45s 8,25s 8,34s - - - "ligação - - 5,33m 5,10m 5,33m - - - - éster"* "resíduo amino - - - 7,35m 7,35m 6,7- 7,3 5m - 6,7- ácido" 7,0q 7,0q C132 6,46s 6,15s 6,40s 6,70s 6,80s 6,80s - - -
* "ligação éster" entre o grupo carboxilo de Bchlidea e Z-Se^-OMe de acordo com a Fig. 5. I Z-Ser2-OMe II L-Serina III N-tBOC-Tir-OMe Éster Metílico de Carbobenzoxi Seril-Serina Éster Metílico de L-Serina Éster Metílico de N-tert Butoxicarbonil Tirosina IV Éster Metílico de L-Serilo Clorofiíida a V Éster Metílico de Carbobenzoxi Seril-Seril Clorofiíida a VIII Éster Metílico de Carbobenzoxi Seril-Seril Bacterioclorofilida a EX Éster Metílico de N-tert Butoxicarbonil Tirosil Bacterioclorofilida a
Exemplo 7 : Preparação de éster metílico de carbobenzoxiserilseril clorofiíida a por esterifícacão catalítica de Chlidea com Z-Sen-OMe
Chlidea Seca (3 mg), DCC (5,1 mg), DMAP (1,2 mg) e Z-Serç-OMe (excesso de 5 vezes) foram dissolvidos em 1 ml de diclorometano seco, secos sob Ar e agitados durante 36 horas à temperatura ambiente no escuro. O produto do título (V) foi isolado sobre placa de TLC de gel de sílica preparativa -27- sendo em seguida purificado sobre uma coluna DEAE-Sephaiose. O espectro de RMN do produto final é apresentado no Quadro 1. Rendimento de 18%.
Exemplo 8 : Preparação de éster metilico de N-tert-butoxicarbonil tirosil clorofilida a nor esterifícacão catalítica de Chlidea com éster metflico de N-tert-butoxicarbonil tirosilo fN-tBOC-Tir-Ome)
Chlidea Seca (3,4 mg), DCC (58 mg), SMAP (1,38 mg) e N-tBOC-Tir-OMe (Sigma) (excesso de 15 vezes) foram dissolvidos em 1 ml de dicloro-metano seco, selados sob Ar e agitados durante 40 horas à temperatura ambiente no escuro. O produto foi isolado sobre placas de TLC de gel de sílica preparativas e foi purificado posteriormente sobre coluna de DEAD-Sefarose. Rendimento de 25%.
Exemplo 9 : Preparação de conjugados Bchla-serina e de Bchla-tirosina por esterifícacão catalítica de Bchlidea com Z-Sere-OMe e de N-tBOC-Tir-OMe
Esterificação (condensação) de Bchlidea com cada um dos compostos acima referidos foi realizada tal como foi descrito para Chlidea nos exemplos 7-8, respectivamente. O Quadro 1 apresenta os desvios de RMN de éster metilico de tert butoxicarbonil tirosilo bacterioclorofilida a (Bchla-N-tBOC-Tir-OMe:composto IX) e de éster metilico de carbobenzoxiserilseril bacterioclorofilida a (Bchla-Z-Ser2~OMe : composto VIII).
Exemplo 10 : Substituição do Mg central em Chis e Bchls com Zn e Cu A inserção de Zn ou de Cu em Chlidea-L-Ser-OMe ocorre facilmente à temperatura ambiente sob várias condições suaves -28-
Ester L-seril inetílico feoforbida a (Feo-Ser-OMe - composto X) foi obtido por desmetilação de Chla-L-Ser-OMe numa reacção com ácido acético glacial. Uma pequena porção de Chla-L-Ser-Ome foi dissolvida nalguma gotas de ácido acético e a seguir a 10-15 segundos, o ácido foi evaporado sob N2. O resíduo acastanhado de Feo-Ser-OMe foi dissolvido em 2 ml de solução de acetato de Zn 0,1 M (ou acetato de CuH) em etanol e foi mantido durante 20 minutos no escuro sob uma atmosfera de Ar à temperatura ambiente com agitação. As modificações no estado de coordenação do macrociclo foram acompanhadas por modificações dos espectros de absorção na gama visível e foi possível seguir a evolução da reacção espectroscapicamente. Espectros de absorção visíveis dos produtos são indicados na Fig. 7. Nestas condições, e reacção de metalação foi quase quantitativa e deu origem a derivados puros de Zn e de Cu de Chla-L-Ser-OMe.
Exemplo 11 : Adsorcão de Chlidea. Bchlidea e Chia e de conjugados Bchla-serina por células de melanoma em cultura fal Ensaio in vitro A monitorização da avidez de derivados de Chi e de Bchl para células de melanoma foi realizada como se segue: células de melanoma de ratinho M2R (Gerst et al., 1986) foram cultivadas como monocamadas (até confluência a 100%) em DMEM/F12 contendo soro de cavalo a 10% a 37° C numa atmosfera húmida de CO2 a 8%. 48 horas mais tarde, as células foram tratadas com diferentes concentrações (1-100 μΜ) de Chlidea, Bchlidea, conjugados de Chia- e Bchla - serina e HPD (Photoffin II) durante 3 horas. A fim de determinar o grau da adsorção dos derivados de Chi ou de Bchl às células, o meio de cultura foi aspirado, as células foram lavadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e os pigmentos foram extraídos com acetona. A concentração dos derivados de Chi e de Bchl na solução foi determinada comparando as suas absorção óptica e fluorescência com as de concentrações de pigmento conhecidos em acetona. O número de moléculas de Chlidea e de Chla-L-Ser-OMe e os derivados de Bchla correspondentes adsorvidos para as células M2R a seguir a 3 horas de incubação na presença de soro de cavalo são ilustrados nas Figs. 10 e 11. Como pode ser observado, Chlidea e Chla-L-Ser-OMe adsorvem melhor para células de melanoma M2R do que Photofrin II (HDP). Bclidea e Bchla-L-Ser-OMe são adsorvidos para células de melanoma no mesmo grau e num grau cerca de 5 vezes mais baixo do que Photofrin II, respectivamente. O número de moléculas adsorvidas depende linearmente da sua concentração inicial no meio de cultura e a adsorção de pigmento atinge o equilíbrio durante a primeira hora de incubação (Quadro 2). Na ausência de soro, Chla-L-Ser-OMe foi adsorvido aproximadamente 15 vezes melhor do que Chia (dados não apresentados). QUADRO 2 Adsorção Celular
Dependência do Tempo de Chla-L-Ser-OMe (2,7 x 10'^M)
Tempo, h_Chla-L-Ser-OMe moléculas/célula 1,0 2,7x107 1,5 1,3 x 108 2,0 1,3 x 108 (b) Ensaio in vivo
Chi ou Bchl dissolvidos em 10% de etanol/PBS são injectados a ratinhos por via intraperitoneal (i.p.). Como grupos de controlo, são usados -30-
At C—. («-à ratinhos não injectados ou injectados com veículo. Cortes do tecido do animal ou de orgãos intactos (por exemplo baço, fígado, cérebro, etc.) são dissecados, homogeneizados em acetona sendo então centrifugados. O produto flutuante contem os pigmentos. A concentração de pigmento no produto flutuante é determinada por espectroscopia de fluorescência.
Exemplo 12 : Toxicidade de derivados de Chi e de Bchl em relação a células de melanoma em cultura O efeito fotodinâmico de Chlidea ou de conjugado Chla-L-Ser-OMe sobre células de melanoma em cultura foi testado como se segue: células de melanoma de ratinho M2R sob a forma de monocamadas (até confluência a 100%) foram tratadas com os pigmentos de Chia, Chlidea e Chla-L-Ser-OMe durante 30 minutos. Subsequentemente as culturas foram irradiadas durante 10 minutos a partir do topo com um laser de diodo GaAs 5mW a 670 nm (fonte de radiação A), uma lampada Xenon 150W a 5.000 pEinstein/cm^ (fonte de radiação B), ou uma lampada de halogénio 90W a 1.500 pEinstein (fonte de radiação C). Os grupos de controlo incluem células não tratadas, células tratadas com pigmento que são mantidas no escuro e células não tratadas irradiadas. Três horas após irradiação, as modificações na morfologia da célula devidas a irradiação foram examinadas por microscopia de contraste de fase. A avaliação da actividade citolítica dos vários derivados de Chi e de Bchl foi realizada avaliando a morte celular na área tratada fotodinâmicamente da monocamada por coloração das células, e monitorização da fluorescência vermelha de, Iodeto de Propidium ([met-iodeto iodeto de 2,7-diamino-9-fenil-10-(dietilaminopropil)-fenatridinio]) (PID) que é excluido das células intactas/vivas e que se acumula de um modo selectivo nos núcleos de células lesionadas. O exame de núcleos fluorescentes na cultura corada foi feito por microscopia de fluorescência (Yeh, 1981). Os resultados são apresentados nas Figs. 14 e 15.
At u -31 -
Contudo, estando baseado em exame microscópico de culturas de células tratadas, este método não é o mais apropriado para avaliação quantitativa sistemática e avaliação da actividade citolítica das dogas PDT aplicadas a um grande número de culturas de células.
De um modo alternativo, a toxicidade fotodinâmica foi determinada por incorporação de timidina [-¾]. Neste caso, modificações nas taxas de incorporação de timidina [^H] a seguir a PDT foram realizadas como se segue: Culturas de células (4-5x10^ células/recipiente em confluência de cerca de 40-50% feitas crescer em soro bovino fetal a 10%) foram feitas pulsar com 1μ Ci/ml de timidina [metil- ^H] durante 2 horas a 37° C. Culturas foram então lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), tratadas com ácido tricloroacético (TCA) arrefecido em gelo a 7,5% durante 30 minutos a 4o C, lavadas duas vezes com etanol. Células foram então dissolvidas em 0,3 ml de NaOH 1 M a 37° C durante 15 minutos. Amostras de 100 μΐ foram neutralizadas com 100 μΐ de HC1 IN e 4 ml de imidazol 0,1 M e foram contadas numa mistura de cintilador xileno /mistura Lumax 20:8 (vol/vol). Na experimentação ilustrada na Fig. 12 A, células M2R foram tratadas com concentrações de Chla-L-Ser-OMe crescentes durante 60 minutos e foram subsequentemente irradiadas com fonte de radiação B. Como pode ser observado a lesão fotodinâmica é expressa por redução dependente da dose na capacidade das células para incorporarem [^Η] timidina 24 horas mais tarde. O efeito é absolutamente dependente da radiação e não foi observado nos controlos no escuro e nos controlos irradiados não tratados. Resultados semelhantes foram obtidos com fibroblastos de prepúcio humano FS11 (Fig. 12B) e células de cancro da mama T47D humano (Fig. 12C) (usando fonte de radiação B). Os resultados são dados como médias ± DP de determinações em triplicado. O efeito de PDT foi também determinado pelo ensaio clonogénico : 24 horas após tratamento de células com várias concentrações de Chla-L-Ser- -32-
I C—~— OMe e terminação do passo de irradiação, tal como foi acima descrito (Fig. 12A), as culturas foram tripsinizadas e os números de células viáveis foram determinados por exclusão de azul tripano. Foram realizadas diluições apropriadas e 250 células/recipiente foram semeadas em placas Costar com 6 recipientes. Após 11-12 dias em cultura, o meio foi aspirado e as colónias foram fixadas e coradas com violeta cristal em metanol e o número de colónias (mais de 40 células por colónia) foi contado sob um microscópio de dissecção. Como se pode observar na Fig. 13 o tratamento fotodinâmico reduziu o número de células sobreviventes de um modo dependente da dose no que se refere a Cha-L-Ser-OMe, mas não no escuro, ou controlos irradiados não tratados. A comparação dos resultados nas Figs. 12 A e 13 revela uma boa correlação entre as duas metodologias. Os resultados são dados como médias ± DP de determinações em triplicado.
Outros métodos que podem ser usados a fim de demonstrar citólise celular incluem: (1) determinação de actividade citolítica a seguir a carga com [3H] adenina de células tratadas, (2) determinação de actividade citolítica por carga com 51 Cr, e (3) detecção de áreas necróticas por meio de uma técnica de microvisualização em video. Enquanto que a utilização de PID se baseia na fixação selectiva da matéria corante fluorescente apenas pelas células lesadas,os métodos 1 e 2 baseiam-se na fixação de marcador radioactivo durante um passo de préincubação e libertação de radioactividade induzida pela droga no segundo passo. Os dois últimos métodos são apropriados para ensaios múltiplos requeridos para titulações detalhadas de dezenas a centenas de amostras em replicados adequados. A Fig. 14 apresenta duas áreas numa monocamada de células de melanoma incubada durante 30 minutos com Chla-L-Ser-OMe 4x10"6m. A área A (Fig. 14, à esquerda) foi irradiada (fonte de radiação A) enquanto que a área B foi mantida no escuro. As células irradiadas (área A) parecem significativamente encolhidas, parecem ter perdido algum contacto com a placa e a sua membrana celular parece estar fragmentada e irregular. Microscopia de fluorescência de PID da mesma cultura (Fig. 14, à direita) revela que a lesão celular foi confinada à área tratada fotodinâmicamente e que existe uma correlação 1:1 entre modificações morfológicas e morte celular, enquanto que os núcleos de células vivas não revelaram qualquer fluorescência a partir de PID (cf. áreas A e B na Fig. 14, à direira e à esquerda). Uma maior ampliação da margem da zona irradiada revela células tratadas com PID com núcleos fluorescentes que foram irradiados e células de controlo não irradiadas adjacentes com morfologia normal e núcleos não corados (Fig. 15). Não foi possível identificar qualquer lesão em células não tratadas de controlo que foram igualmente irradiadas (Fig. 16). Modificações semelhantes na morfologia foram observadas após 10 minutos de irradiação de células de melanoma incubadas com Chlidea 4x10"6 M (não apresentadas).
Exemplo 13 : Tratamento de ratinhos com conjugados Chi e Bchl (a) Implantação de tumor : Células M2R são mantidas de um modo rotineiro como monocamadas. As células são raspadas com a ajuda de um raspador de borracha e são suspensas em solução salina normal. 1x10^ células (0,1 ml são injectados subcutâneamente no flanco ou lote de C57B1 ou de ratinhos nus machos CD1. Em aproximadamente três a cinco semanas, o tumor toma-se visível. Estes tumores crescem sob a forma de estruturas confinadas (presas) sólidas e podem atingir uma massa de aproximadamente 10 g, 7-8 semanas após implantação. Um processo semelhante é usado em ratinhos nus em que tumores de melanoma quer de ratinho M2R quer humano (FO/1, MRI/H/221, melanoma amelanotico HS695T ou SK/MEL/28) são implantados. (b) Inieccão e irradiação : Ratinhos foram injectados i.p. com 20 mg/kg dos derivados de Chi ou de Bshl Chla-L-Ser-OMe e Bchla-L-Ser-OMe em solução de etanol a 10%-PBs. Após 5 horas, o tumor foi irradiado durante 1 hora. Ratinhos de controlo foram (i) injectados com a solução de etanol-PBS e foram irradiados durante 1 hora; (ii) injectados com o derivado de Chi e de Bchl e mantidos no escuro. (c) 24 horas após irradiação, os ratinhos foram sacrificados por luxação cervical. Como fosse necessário a orientação dos tumores foi preservada com a ajuda de colorações de tecidos e os tumores foram ainda processados por meio de vias de cortes histológicos padronizados. (d) A toxicidade de CM e de conjugados de Bchl-serina CMa-L-Ser-OMe e Bchla-L-Ser-OMe em ratinhos C57B1 em condições de alojamento normais na ausência de irradiação foi avaliada por injecção do composto dissolvido em etanol a 10%/PBS. Ratinhos de controlo foram injectados apenas com o veículo. Verificou-se que injecções de até 40 mg/kg do peso corporal não apresentavam qualquer efeito perceptivel sobre o comportamento e bem estar dos ratinhos durante até 14 dias. Esta dose de droga foi assim de longe a dose mais elevada usada e DL50 vs. CE50 de tratamento (margens de índice terapêutico) não foram ainda determinados. (e) Foi testada a citotoxicidade da pele em ratinhos nus tratados com Chla-L-Ser-OMe devido a irradiação focal (laser diodo Ga/As 5mW 670 nm). Conjugados Chl/Bchl (20 mg/kg) em etanol PBS a 10% foram injectados (i.v.) a ratinhos nus e 24 horas mais tarde a pele do ratinho foi irradiada durante 4 horas. Ratinhos de controlo foram (i) injectados com a solução de etanol/PBS e mantidos no escuro; (ii) não tratados e irradiados (fonte de radiação A) durante 4 horas. 24 horas após a irradiação, os ratinhos foram sacrificados por luxação cervical. Como necessário a orientação da zona irradiada foi preservada com a ajuda de corantes de tecidos e amostras de pele foram ainda processadas por processos histológicos padronizados. Verificou-se (Fig. 15) que a irradiação da -35- pele em animal experimental produzia uma lesão no sítio irradiado com necrose do tecido (NC) através da derme, epiderme e camada de gordura subcutânea (SF). Uma resposta imune clara foi indicada por infiltração de leucócitos (LU) na região directamente por baixo da área necrótica. A pele não irradiada adjacente à área necrótica parece normal. Não se verificaram sinais de irritação da pele no grupo de controlo (dados não indicados). (f) Tratamento fotodinâmico de tumores de melanoma MR2 com Bchla-L-Ser-OMe : 50-150 pg de Bchla-L-Ser-OMe em 0,05 ml de etanol:solução salina 1:1 foram injectados sob anestesia (Nembutal, 6,0 mg/kg) em e à volta do tumor com 5-6 mm de diâmetro previamente implantado num ratinho nu CD1. A injecção foi realizada inserindo a agulha através da pele 10-15 mm a partir do tumor e a administração da droga no próprio tumor foi realizada a partir da sua face interna, de modo tal que a pele acima do tumor e a face exterior do tumor permaneceram intactas. O ratinho anestesiado foi então colocado num leito e o sítio do tumor foi irradiado com radiação de halogénio com uma intensidade de 19.000 pEinstein/cm^ durante 60 minutos. O diâmetro do sítio irradiado era de 9 mm cobrindo apenas a área do tumor. Um seguimento das modificações na estrutura e dimensão do tumor foi realizado durante várias semanas usando imagem por ressonância magnética (MRI). As diferenças no formato do tumor antes e depois do tratamento são apresentadas na Fig. 18. O tumor implantado na porção superior do torax próximo da omoplata poderá ser claramente observado na Fig. 18A antes do tratamento sob a forma de uma estrura brilhante (T) com um sinal MRI elevado, e foi essencialmente eliminado 84 horas mais tarde. Duas semanas mais tarde, verificou-se uma pequena recorrência (Fig. 18B). Um segundo tratamento (irradiação de Bchl-L-Ser-OMe) não originou qualquer recorrência 3 semanas mais tarde (Fig. 18C). (g) Foi avaliada a retenção de Chla-L-Ser-OMe em diferentes tecidos, orgãos e no tumor de ratinhos nus e pretos tratados. Chla-L-Ser-OMe em -1
ί -36-etanol/PBS a 10% foi injectado em ratinhos machos C57B1 c ratinhos nus machos e fêmeas i.p. (20 mg/kg, numa média de 5-10 ratinhos). Amostras de tecidos (gordura, músculos, pulmões, coração, etc.) e tumor foram removidos, homogeneizados em acetona e em seguida centrifugados. A concentração de pigmento no produto flutuante foi determinada por espectroscopia de fluorescência. A distribuição de Chla-L-Ser-OMe no tumor e em diferentes tecidos e orgãos após 12 horas é apresentado na Fig. 19.
Exemplo 14 : Preparação de clorofílida e de becterioclorofílida de éster etílico de tirosilo (a) Activacão de Chlidea ou Bchlidea com N-hidroxi-succinimida (NKS)
Uma mistura de Chlidea ou de Bchlidea seca sobre vácuo (5 mg) e NHS seco (9,6 mg) e DCC (5 mg) foi dissolvida em 2 ml de tetrahidrofurano (THF) seco sobre alumina. A mistura da reacção foi selada sob Ar e foi agitada durante 48 horas à temperatura ambiente e sendo então mantida à temperatura ambiente durante 48 horas adicionais a 5o C. Cada passo foi realizado no escuro. Depois da reacção ficar completa, o solvente foi evaporado sob N2 e 0 resíduo verde foi dissolvido de novo em acetona e foi submetido a uma pequena coluna de CM-Sepharose (Pharmacia); 0,5 x 5,0 cm), equilibrado em acetona. A coluna foi lavada com 15-20 ml de acetona e 0 Chlide activado (NHS-Chlidea ou NHS-Bchlidea) foi eluido com 3-5% de metanol em acetona. O NHS-Chlidea ou NHS-Bchlidea eluido foi ainda purificado do mesmo modo. Rendimentoo: 2,95-4,15 mg (50-80%). íb) Conjugação catalítica de NHS-Chlidea e de NHS-Bchlidea com éster etílico de tirosina (Tir-OEf) NHS-Chlidea purificado ou NHS-Bchlidea do passo (a) acima -37- £}Λ. γ ίΠ ( C.J, referido (2 mg) foi dissolvido em 1 ml de THF seco e 5 mg de éster etílico de tirosina (Sigma) foram adicionados à solução. A mistura da reacção foi selada
sob Ar e foi agitada durante 48 horas à temperatura ambiente sendo então mantida durante 48 horas a 5o C no escuroo. A composição da mistura da reacção foi analisada usando uma coluna Vydac C-18 HPLC (Alltech Associates, Inc., Deerfield, 111., USA). As condições da separação foram as seguintes: coluna -250 mm x 4,6 mm; embalagem - Vydac 218TP, tamanho de partícula 10 μ, tamanho de poro 300 A°; fase móvel - acetonitrilo/água (7:3); taxa de fluxo - 1 ml/min. O conjugado Chlidea-Tir-OEt ou Bchlidea-Tir-OEt foi eluido com tempo de retenção de 9,5 min. Os produtos da reacção foram purificados usando CM-Sepharose tal como no Exemplo 4.
Exemplo 15 : Preparação de conjugados Chia- e Bchla-q-MSH
Hormona estimulante de α-melanócito (MSH) tem a fórmula : Ser-
Tir-Ser-Met-Glu-His-Fe-Arg-Tir-Gli-Lis-Pro-Val-NH2- A 1 ml de solução agitada de 1 mg de α-MSH numa mistura de acetonitrilo e água 8:2 colocada num tubo de teste de polietileno sob Ar e contendo 0,07 mg de trietilamina (TEA), 2,15 mg de NHS-Chlidea (preparada no Exemplo 14a) num pequeno volume (cerca de 0,2 ml) de acetonitrilo foram adicionados e sonicados durante um curto período de tempo. A mistura da reacção, selada sob Ar, foi agitada à temperatura ambiente no escuro durante 66 horas. No decurso da reacção, porções alíquotas de 15 μΐ foram retiradas da mistura da reacção, após 0, 3, 19, 45 e 66 horas a partir do início da reacção, e foram submetidas a análise por HPLC.
Cada porção alíquota (15 μΐ) da mistura da reacção foi seca sob N2 e dissolvida de novo em 50-100 μΐ de acetonitrilo a 20% em água contendo TFA a 0,1% (todos v/v). A solução foi injectada na coluna de C-18 HPLC. As fracções -38- Ar
*-JL recolhidas apresentavam os tempos de reacção que se seguem: 24 min - a-MSH não reagido; 36 min - conjugado Chla-a-MSH; 76 min - Chlidea. As condições da separação foram as que se seguem: coluna - 250 mm x 4,6 mm; embalagem -Vydac 218TP, tamanho de partícula 10 μ, tamanho do poro 300 A°; fase móvel A - 0,1% de TFA em água; fase móvel B - 0,1% de TFA em acetonitrilo; gradiente -20% de B de 0 a 5 minutos, em seguida de 20 a 55% de B durante 10 minutos e de 55 a 80% de B durante 25 minutos, em seguida lavando com 80% de B; taxa de fluxo - 1 ml/min. O conjugado de Bchla-a-MSH foi preparado de um modo semelhante mas começando com Bchlidea. Após purificação, foram recolhidas fracções apresentando características espectrais de um peptídeo e de Bchla. A actividade biológica do conjugado de Chla-a-MSH foi avaliado determinando a sua capacidade para estimular AMP cíclico em culturas de células M2R de ratinho em comparação com [Nle^, D-Fe^ja-MSH, um potente análogo de α-MSH. Acumulação de cAMP foi realizada tal como foi descrito por Gerst et al, 1986. Tal como é indicado na Fig. 20, o conjugado Chla-a-MSH retem potência idêntica quando comparado com a actividade do análogo de a-MSH.
Exemplo 16: Preparação de conjugado de Chia- e de Bchla-proteina A 1 ml de solução agitada de alguns miligramas de uma proteína, seleccionada de entre albumina do soro bovino (BSA), gama-imunoglobulina G (IgG) e aglutinina de amendoim (PNA), em PBS tamponado (tampão fosfato 0,1 M, pH = 7,6) colocado num tubo de teste de polietileno sob N2 e contendo 0,1 mg de trietilamina (TEA), um excesso de NHS-Chlidea ou de NHS-Bchlidea -39- h^yfr CL~-—cit-i preparado no Exemplo 14a foi adicionado durante 30 minutos em várias porções de solução de acetona concentrada, seguindo-se uma sonicação curta.
As quantidades dos reagentes em cada caso foram as que se seguem: - 2,5 mg de BSA - 0,045 mg de NHS-Chlide - 3 mg de IgG - 0,041 mg de NHS-Chlide - 1 mg de PNA - 0,070 mg de NHS-Chlide A mistura da reacção, selada sob Ar, foi agitada à temperatura ambiente no escuro durante 24 horas. O conjugado de Chia- e de Bchla-proteina foi purificado numa mini-coluna (0,5 cm x 5 cm) de Bio-Gel P-10 (Bio-Rad, Hercules, Ca., USA). A coluna foi preparada a partir de gel pré-intumescido em PBS, como se segue: após equilíbrio em PBS, a coluna foi lavada com alguns milímetros de solução de BSA (1-2 mg) em PBS, e o excesso de BSA foi eluido com PBS. Uma pequena amostra da mistura da reacção (50-60 μΐ) foi carregada sobre a coluna e eluida com PBS. NHS-Chlidea ou NHS-Bchlidea foi retido no topo e a banda verde do conjugado, que se moveu ao longo da coluna, foi recolhido.
Os conjugados de Chia- e de Bchla-proteina formam precipitados de cor verde em solução aquosa, que podem ser recolhidos após ultracentrifugação. Os precipitados podem ser dissolvidos de novo por sonicação com um detergente, por exemplo Triton-X 100 a 1%. Os conjugados apresentam aspectos espectrais tanto de Chia (ou Bchla) como de proteína. Esses precipitados absorvem luz fortemente na gama UV e apresentam bandas de Chia ou de Bchla monoméricas e agregadas (dados não apresentados).
Lisboa, 10 de Janeiro de 2001
ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA 41 -
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Claims (17)

  1. -1 - C—^Ui REIVINDICAÇÕES 1. Um composto da fórmula geral I X-CO-Y-A-R I em que X-CO- representa um resíduo C17-propionilo de clorofila (Chi) ou bacterioclorofila (Bchl); Y é O, S ou NH; A é uma ligação covalente ou uma cadeia hidrocarboneto linear ou ramificada, saturada ou não saturada, substituída ou não substituída tendo 2 a 20 átomos de carbono sendo facultativamente interrompida por heteroátomos e/ou porções carbocíclicas ou heterocíclicas, e R é um aminoácido, um peptídeo ou um resíduo proteico, ou um seu derivado.
  2. 2. Um composto de acordo com a reivindicação 1 em que A é uma cadeia alifática C5-C20 interrompida facultativamente por heteroátomos seleccionados de entre O, N ou S e/ou substituída por grupos funcionais seleccionados de entre OH, NH2, COOH e CONH2.
  3. 3. O composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o resíduo de Chi ou de Bchl é derivado de um derivado natural ou sintético de Chi ou Bchl, incluindo compostos em que 0 átomo Mg central tenha sido eliminado) ou substituído por outros metais divalentes.
  4. 4. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em que R é serina ou tirosina. t-i -2-
  5. 5. Um composto de acordo com a reivindicação 4, nomeada-mente éster metílico de L-serilo clorofilida a, éster metílico de L-serilo bacterioclorofílida a, éster metílico de N-tert-butoxicarbonil tirosil clorofilida a ou éster metílico de N-tert-butoxicarbonil tirosilo bacterioclorofílida a.
  6. 6. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em que o resíduo peptidico R é o resíduo éster metílico de carbobenzoxi seril serina.
  7. 7. Um composto de acordo com a reivindicação 3, em que o átomo Mg central tenha sido eliminado, nomeadamente L-seril feoforbida a.
  8. 8. Um composto de acordo com a reivindicação 3, em que o átomo Mg central tenha sido substituído pelos metais divalentes Zn ou Cu.
  9. 9. Um composto de acordo com a reivindicação 8, nomeadamente éster L-seril metílico Zn-clorofilida ou éster L-seril-metílico Cu-clorofilida a.
  10. 10. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o derivado de um resíduo peptidico R é o resíduo de uma hormona peptidica.
  11. 11. Um composto de acordo com a reivindicação 10, em que R é o resíduo de hormona estimuladora de a-melanócito.
  12. 12. Um composto de acordo com a reivindicação 11, nomeadamente Chla-a-MSH ou Bchla-a-MSH.
  13. 13. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em que o resíduo de proteína R é um resíduo de anticorpo.
  14. 14. Um processo para a preparação de composto de acordo com a reivindicação 1 em que Y é O e A é uma ligação covalente que compreende transesterificação de Chi ou de Bchl natural com o composto R-OH apropriado na presença de clorofilase.
  15. 15. Um processo para a preparação de um composto da fórmula I em que A é uma ligação covalente compreendendo condensação catalítica de um derivado de Chlide ou de Bchlide com um composto R-OH, R-SH ou R-NH2 na presença de dimetilaminopiridina ou de N-hidroxisuccinimida e DCC.
  16. 16- Composição farmacêutica compreendendo como ingrediente activo um composto da fórmula (I) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
  17. 17. Utilização de um composto da fórmula (I) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 para a preparação de uma composição farmacêutica para terapêutica farmacodinâmica de tumores e de metástases tumorais. Lisboa, 10 de Janeiro de 2001 Cwmm ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA
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