HU220859B1 - Conjugates of metal-komplexes with oligonucleotides, compositions containing them, their radiodiagnostical use and process for producing them - Google Patents

Description

A leírás terjedelme 36 oldal (ezen belül 5 lap ábra)

HU 220 859 Bl

A találmány tárgya olyan oligonukleotidkonjugátok, amelyek egy komplexképző ágenst vagy egy komplexet tartalmaznak. Ezek a konjugátok a diagnózis és kezelés területén használhatók. A találmány szerinti konjugátokat a diagnózis és a kezelés területén alkalmazzák.

A látható kép alapján kialakított (képalkotó) diagnózis az utóbbi néhány évtizedben nagy fejlődésen ment át, és ez a fejlődés még ma is folytatódik. Ma már az élő testben nagyobb beavatkozás nélkül láthatóvá tehető az érrendszer, a legtöbb szerv és sok szövet. A betegségeket sok esetben azért lehet diagnosztizálni, mert világosan látható elváltozásokat okoznak a test anatómiai szerkezeteinek alakjában, méretében, illetve elhelyezkedésében. Ilyen anatómiai adatokat kaphatunk a test belsejéből röntgentechnikával, ultrahangos diagnózissal vagy mágnesesrezonancia-tomográfiával. Ezen technikák mindegyikének hatásossága javítható oly módon, hogy farmakológiai reagensek alkalmazásával felerősítjük a szövetek és testfolyadékok természetes kontrasztját a kapott képen. A szóban forgó farmakológiai reagenseket bevezetjük a testüregekbe vagy beinjektáljuk a véredényekbe, hogy megváltoztassuk a testüregek vagy véredények kontrasztját. Ezeket azután a véráram szétoszlatja az egész szervezetben, így megváltoztathatják a szervek és szövetek láthatóságát. Különleges esetekben ezek az anyagok a test bizonyos struktúráihoz kötődhetnek és/vagy aktív módon odaszállíthatók és/vagy maguk a struktúrák választhatnak ki ilyen anyagokat. Ily módon egyedi esetekben funkciók is láthatóvá tehetők és felhasználhatók diagnosztikus célokra.

Ezzel szemben a nukleáris diagnózis olyan anyagokon alapul, amelyek maguk válhatnak láthatóvá. Ez esetben nagy hatótávolságú sugárzást kibocsátó radioaktív izotópokat juttatunk be a testbe. Ezen anyagok szétteqedése a testben alkalmas detektorokkal nyomon követhető. A nukleáris gyógyászati eljárás előnye, hogy a jelkibocsátó anyagok - amelyeket radiofarmakológiai ágenseknek neveznek - kis dózisainak alkalmazásával is nagyon hatásos.

Ha a- vagy β-sugarakat vagy más toxikus, a szövetekben hatásos bomlástermékeket kibocsátó izotópokat alkalmazunk, akkor a radiofarmakológiai ágensek terápiás célokra, például daganatok elroncsolására is használhatók. Ugyanez a cél úgy is elérhető, hogy a testbe ártalmatlan izotópokat vagy anyagokat juttatunk be, és ezeket csak ott alakítjuk át - például neutron- vagy röntgenbesugárzással - terápiásán hatásossá.

Általános probléma, hogy a kóros elváltozásokat akkor kell diagnosztizálni és lokalizálni, mikor a szóban forgó szervek és szövetek szerkezetében és vérkeringésében még nem ment végbe jól látható változás. Az ilyen diagnózis és követés döntően fontos például daganatok esetén - ideértve az áttelek kutatását és a szövetek hiányos oxigénellátásának felderítését -, valamint bizonyos fertőzések és anyagcsere-betegségek esetén.

A jelenleg használatos terápiás és képalkotó diagnosztikai eljárások nagymértékben függnek olyan farmakológiai készítményektől, amelyek a más módon nem kimutatható kóros elváltozások helyén felgyülemlenek.

A kereskedelmi forgalomban jelenleg kapható kontrasztanyagok főleg úgynevezett nemspecifikus készítmények: passzív módon kitöltik azokat az üregeket, amelyekbe például injekció útján bejuttatjuk őket.

Már sok anyagot vagy anyagcsoportot azonosítottak, amelyek detektálhatok vagy feltehetően bizonyos specifikussággal terjednek szét az élő szervezetben. Ilyenek például az antitesteken kívül a lektinek, a receptorokhoz kötődő anyagok mindenféle típusa, sejtek, membránok és membránkomponensek, nukleinsavak, természetes metabolitok és származékaik valamint számtalan gyógyászati anyag. Különös figyelemmel vizsgálták és vizsgálják jelenleg is a peptideket.

A 4,707,352 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás foglalkozik egy speciális eljárással komplexképző molekuláknak radioaktív izotópokkal való megjelölésére, de nem ismertet olyan komplexképző reagenseket, amelyek fémionok megkötésére különösen alkalmasak lennének.

Az EP-A-0,285,057 számon közzétett európai szabadalmi bejelentés nukleotidból és komplexképző reagensből álló konjugátokat ismertet, ezek azonban többek között azért nem alkalmasak, mert a felhasznált nukleotid in vivő stabilitása in vivő diagnosztikai reagensként vagy terápiás szerként történő alkalmazás esetén nem megfelelő, és az egyéb - kompatibilitási (összeférhetőségi) és farmakokinetikai - követelményeknek is kevéssé tesz eleget.

Sok amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, például a 4,707,440 számú foglalkozik olyan módosított polimerekkel, amelyek egy kimutatható kémiai csoportot tartalmaznak. A polimerek lehetnek polinukleotidok vagy oligonukleotidok, de a természetben előforduló nukleázokkal szemben nem stabilizáltak, és kiválasztásuk nem speciális eljárásokkal történik, ezért nem kötődnek specifikusan, nagy kötési affinitással a célstruktúrákhoz. Az ilyen kimutatható molekulák speciális megvalósításait említi a 4,843,122 és a 4,943,523 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. Egy így módosított egyedi nukleotidot ismertet a 4,952,685 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. Az ilyen reagenseknek a képalkotó eljárásokban való felhasználását ismerteti a 4,849,208 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás.

A találmány tárgyát célstruktúrák kimutatására szolgáló, specifikusan kötődő diagnosztikai reagensek képezik, amelyek segítségével például szervek, szövetek és ezek kóros elváltozásai kimutathatóvá tehetők.

Azt találtuk, hogy ez megvalósítható oligonukleotidkonjugátokkal, amelyek egy oligonukleotidcsoporthoz hozzáadva egy közvetlen kötéssel vagy valamilyen kapcsolókomponens útján kötődő komplexképző reagenst alkotnak, és amelyeknek oligonukleotidcsoportja úgy van módosítva, hogy az a természetben előforduló nukleázok lebontó hatását megszünteti vagy legalábbis erősen gátolja.

A találmány tárgya:

1. Oligonukleotidkonjugátok, amelyek egy N-oligonukleotid-csoportot és n számú B-K általános képletű szubsztituenst tartalmaznak - ahol a B közvetlen kö2

HU 220 859 Bl tést vagy egy, az oligonukleotidcsoporthoz kapcsoló komponenst, a K pedig egy komplexképző reagenst vagy az 5, 21-29, 31, 39, 42-44, 49, 57-83 vagy 85 atomszámú elemek radioaktív fémizotópjaival vagy olyan stabil izotópjaival képzett komplexet jelent, amelyeket

- külső sugárzással radioaktív izotópokká alakítunk át, vagy amelyek

- a kívülről kapott sugárzást más minőségű, eltérő energiatartalmú és/vagy eltérő hullámhosszúságú sugárzássá alakítják át -, azzal jellemezve, hogy az N-oligonukleotid-csoport egy olyan módosítást tartalmaz, amely a természetben előforduló nukleázok lebontó hatását megszünteti vagy legalábbis erősen gátolja.

A találmány tárgya közelebbről:

2. A találmány szerinti oligonukleotidkonjugátok egy előnyös megvalósításban (I) általános képletűek, amely képletben

N jelentése egy, a célstruktúrákhoz specifikusan, nagy affinitással kötődő oligonukleotid olyan módosításokkal, amelyek a természetben előforduló nukleázok lebontó hatását erőteljesen csökkentik,

B jelentése kémiai kötés vagy egy, az N és a K között kapcsolatot létesítő kapcsolókomponens,

K. egy komplexképző ligandot jelent, amely egy jeltovábbító vagy terápiásán hatásos elemet képezhet, és η 1 és 10 közötti számot jelent.

3. Egy, az 1. vagy 2. pont szerinti vegyület, amelyben N egy 5-200 nukleotidból álló oligonukleotid, amelyben

a) a cukoregység 2’-helyén egymástól függetlenül a következő csoportok szerepelhetnek:

egy OR általános képletű csoport - amelyben

R jelentése 1-20 szénatomos alkilcsoport, amely adott esetben legfeljebb 2 hidroxilcsoportot tartalmaz, és adott esetben 1-5 oxigénatommal van megszakítva -, hidrogénatom, hidroxilcsoport, fluoratom, amingyök, aminocsoport, a 3’ vagy 5’ terminális helyen jelen lévő hidroxilcsoport, amelyek egymástól függetlenül adott esetben egy R csoporttal észterezettek, és/vagy

b) az adott esetben intemukleotid kötésként használt foszfodiészterek egymástól függetlenül foszfortioátokkal, foszforditioátokkal vagy alkil-foszfonátokkal, előnyösen metil-foszfonáttal vannak helyettesítve, és/vagy

c) a 3’ és 5’ helyen lévő terminális csoportok intramolekulárisan, egy, a b) pontban leírt intemukleotid kötéssel kapcsolódnak egymáshoz, és/vagy

d) egy, a b) pontban leírt intemukleotid kötés van jelen, amely a 3’-3’- vagy az 5’—5- pozíciót összeköti, és/vagy

e) egy, a b) pontban leírt foszfodiészter-kötés van jelen, amely két timidint észterszerűen összeköt mindkettőnek a 3-as helyén egy 2-20 szénatomos hidroxilalkil-csoporttal, vagy egy analóg módon szubsztituált timidincsoportot észterszerűen összeköt egy, a 2’- vagy

3’- vagy 5’-helyen található másik cukor hidroxilcsoportjával, és/vagy

f) a 3’ és 5’ helyen lévő terminális csoportok olyan intemukleotid kötéseket tartalmaznak, amelyek adott esetben a b) pontban leírtak szerint módosítottak.

4. A 3. pont szerinti vegyület, amelyben az N oligonukleotid 15-100 nukleotidot tartalmaz.

5. Az 1-4. pontok bármelyike szerinti vegyület, amelyben N egy, más célstruktúrákhoz specifikusan, nagy affinitással kötődő oligonukleotid, amely úgy állítható elő, hogy egy random (véletlenszerű) szekvenciákat tartalmazó oligonukleotidkeveréket összehozunk a célstruktúrával, és bizonyos oligonukleotidokat, amelyek a keverékhez viszonyítva a célstruktúrákhoz nagyobb affinitást mutatnak, az oligonukleotidkeverék többi részétől elválasztunk, majd a célstruktúrákhoz nagyobb affinitást mutató oligonukleotidokat amplifikálva egy olyan oligonukleotidkeveréket kapunk, amely a célstruktúrákhoz kötődő oligonukleotidokat nagyobb arányban tartalmazza.

6. Az 1-5. pontok bármelyike szerinti vegyület, amelyben N egy, más célstruktúrákhoz specifikusan, nagy affinitással kötődő oligonukleotid, amelyet úgy állítunk elő, hogy

a) először kémiai szintézissel előállítunk egy DNSszálat, amely a 3’-végen egy meghatározott szekvenciát tartalmaz, amely az RNS-polimeráz komplementere, és ugyanakkor a polimeráz láncreakció (PCR) egyik printerjének komplementere, és ez a DNS-szál az 5’végen egy meghatározott szekvenciát tartalmaz, amely a polimeráz láncreakció egyik primer szekvenciájának komplementere, és a meghatározott szekvenciák közötti szakasz egy random szekvenciát tartalmaz, majd

b) ezt a DNS-szálat egy RNS-polimerázzal egy komplementer RNS-szállá írjuk át, és a polimeráznak a ribóz egység 2’-helyén módosított nukleotidokat ajánlunk fel, majd

c) az ily módon kapott RNS-oligonukleotidokat összehozzuk a célstruktúrával, amelyekhez az oligonukleotid specifikusan kötődik, majd

d) először a célstruktúrához kötődött oligonukleotidokat a célstruktúrával együtt elválasztjuk a nem kötődött oligonukleotidoktól, azután a megkötött oligonukleotidokat elválasztjuk a célstruktúrától, majd

e) ezeket a célstruktúra-specifikus RNS-oligonukleotidokat reverz transzkriptáz segítségével egy komplementer DNS-szállá írjuk át, majd

f) az így kapott DNS-szálakat polimeráz láncreakcióval, a meghatározott primer szekvenciák alkalmazásával amplifikáljuk, majd

g) az ily módon amplifikált DNS-oligonukleotidokat az RNS-polimeráz és módosított nukleotidok segítségével ismét RNS-oligonukleotidokká írjuk át, majd

h) a fenti c)-g) pontok szerinti elválasztási lépéseket adott esetben mindaddig ismételjük, míg a célstruktúrákhoz nagy affinitással kötődő oligonukleotidok megfelelő elválasztását el nem érjük; az így kapott oligonukleotid szekvenciája adott esetben meghatározható.

HU 220 859 Bl

7. A 6. pont szerinti vegyület, ahol a célstruktúrákat makromolekulák, magasabb rendű élőlények - például állatok vagy emberek - szövetszerkezetei, szervei vagy szervrészei, sejtek, tumorsejtek vagy tumorok közül választjuk.

8. Az 1-7. pontok bármelyike szerinti vegyület, amelyben az egy vagy több B komponens

a) a 4’-helyen a CH₂-OH csoporttal redukált Noligonukleotid-gyök 4’-végéhez és/vagy

b) a 3’-helyen egy hidrogénatommal redukált Noligonukleotid-gyök 3’-végéhez és/vagy

c) a két nukleotid közötti, egy vagy több hidroxicsoporttal redukált foszfodiészter hídhoz/hidakhoz, és/vagy

d) az 5-, illetve 8-helyen egy hidrogénatommal és/vagy a 2-, 4- vagy 6-helyen aminocsoport(ok)kal redukált 1-10 nukleobázishoz kötődik.

9. A 8a) vagy 8b) pont szerinti vegyület, ahol

B jelentése X-Y-Z¹ általános képletű csoport, amely az X végén a komplexképző reagenshez vagy komplexhez, Z végén pedig az oligonukleotidhoz kapcsolódik;

X jelentése kötés, -NH csoport vagy kénatom;

Y jelentése egyenes vagy elágazó, telített vagy telítetlen 1-20 szénatomos alkilénlánc, amely adott esetben 1-2 ciklohexilén-, 1-5 imino-, 1-3 fenilén-, 1-3 fenilén-imino-, 1-3 fenilén-oxi-, 1-3 hidroxi-fenilén-, 1-5 amido-, 1-2 hidrazido-, 1-5 karbonil-, 1-5 etilén-oxi-, egy ureido-, egy tioureido-, 1-2 karboxi-alkil-imino-, 1-2 észtercsoportot vagy 1-3 Arcsoportot - ahol Árjelentése egy telített vagy telítetlen 5- vagy 6-tagú, adott esetben 1 vagy 2 heteroatomot, éspedig nitrogén-, oxigén-, kénatomot, és/vagy 1 -2 karbonilcsoportot tartalmazó gyűrű -; 1-10 oxigén-, 1-5 nitrogén- és/vagy 1-5 kénatomot tartalmaz, és/vagy adott esetben 1-5 hidroxi-, 1-2 merkapto-, 1-5 OXO-, 1-5 tioxo-, 1-3 karboxi-, 1-5 karboxi(1-4 szénatomos alkil)-, 1-5 észter-, 1-3 amino-, 1-3 hidroxi-(l-4 szénatomos alkil)-, 1-3 1-7 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituált; és

Z' jelentése -CONH-CH₂-4’, -NH-CO-4’, -O-P(O)R¹-NH-CH₂-4’, -O-P(O)R‘-O-CH₂-4’, -O-P(S)R¹-O-3’ vagy -O-P(O)R’-O-3’ általános képletű csoport, amely csoportokban 4’ és 3’ a terminális cukorcsoport(ok)hoz való kapcsolódást jelzi, és R* jelentése O , S~, 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy NR²R³ általános képletű csoport, amelyben R² és R³ jelentése hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport.

Gyűrűs szerkezetként (Ar-csoport) alkalmasak a

3-6, előnyösen 5 vagy 6 szénatomos telített vagy telítetlen gyűrűs alkiléncsoportok, amelyek adott esetben heteroatomokat, például nitrogén-, kén- vagy oxigénatomot tartalmaznak. Ilyenek például a ciklopentilén-, pirrolilén-, furanilén-, tiofenilén-, imidazolilén-, oxazolidén-, tiazolilén-, pirazolilén-, pirrolidilén-, piridilén-, pirimidilén-, maleinimidilén- és ftálimidiléncsoport.

10. A 8c) pont szerinti vegyület, amelyben B jelentése X-Y-Z² általános képletű csoport, amely az X végén a komplexképző reagenshez vagy komplexhez, Z végén pedig az oligonukleotidhoz kapcsolódik, és a két szomszédos cukoregységet összekötő (a) és/vagy (b) általános képletű hídban Z² jelentése -NR²- általános képletű csoport, oxigén- vagy kénatom; X, Y és R² jelentése pedig a fenti 9. pontban megadott.

A 9. pont szerinti Z'-X-Y- vagy a 10. pont szerinti Z²-X-Y-általános képletű összekötő komponens Y csoportja lehet például

-(CH₂)₆-NH-CS-NH-C₆H₄-CH(CH₂CO₂H)-CH₂ -CO-NH-CH₂-CH(O)-CH₂-, -(CH₂)₆-NH-CS-NH-C₆H₄-CH₂-, -(CH₂)₆-NH-CO-CH₂-, -(CH₂)₆-NH-CO-CH₂-CH₂-, -(CH₂)₂-(CH₂)₆-, -(CH₂)₆-S-(CH₂)₂-(CH₂)₆-S-(CH₂)₆-,-(CH₂)₂-NH-CO-, -(CH₂)₆-NH-CO-, továbbá c), d), e), f), g) vagy h) képletű csoport.

11. A 8d) pont szerinti vegyület, amelyben B jelentése X-Y-Z³ általános képletű csoport, ebben Z³ jelentése -NH-csoport vagy közvetlen kötés a nukleobázishoz, X és Y jelentése pedig a fenti, 9. pontban megadott. Példaként említhetjük a

-CH₂-CO-NH-CH₂-CH(OH)-CH₂-NH-CO-CH₂-CO-NH-CH₂-CH(OH)-CH₂-,

-co-nh-ch₂-ch₂-nh-,

-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-, -CH₂-S-CH₂-CH₂-, -(CH₂)₄-S-CH₂-CH₂-NH-, -co-ch₂-s-ch₂-ch₂-nh-CO-CH₂-S-(CH₂)₆-NH-, -CH=CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH-, -CH=CH-CH₂-NH-, -C=C-CH₂-NH- vagy -CO-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH- képletű csoportot.

Kötőhelyként purinbázisoknál különösen a 8-as, pirimidinbázisoknál pedig az 5-ös pozíció alkalmas. Ez esetben a megfelelő bázis hidrogénatomját formálisan a B-K csoport helyettesíti. De a kötés helye lehet a 2-, 4vagy 6-helyen adott esetben jelen lévő aminocsoport, például a guaninban a 2-amino-, az adeninben a 6amino- vagy az adeninben a 4-aminocsoport. Ez esetben a megfelelő aminocsoport egy hidrogénatomját helyettesíti a B-K csoport.

12. Az előző pontok valamelyike szerinti vegyület, ahol a fémkomplex, mint képalkotó elem a réz, bizmut, technécium, rénium vagy indium egy radioaktív izotópját tartalmazza.

13. A találmány további tárgyát képezi egy célstruktúra kimutatására szolgáló eljárás, amelynek során egy vagy több, a fenti pontok valamelyike szerinti vegyületet in vivő vagy in vitro összehozunk a vizsgálandó mintával, és a jel alapján kimutatjuk, hogy a specifikusan, nagy affinitással kötődő N oligonukleotid jelen van-e a mintában, valamint egy

14. eljárás betegségek roncsolásmentes diagnosztizálására, amelynek során egy vagy több, a fenti 1-12. pont valamelyike szerinti vegyületet összehozunk az in vivő vizsgálandó célstruktúrával, és a jel alapján kimutatjuk, hogy a célstruktúra, amelyhez az N oligonukleotid specifikusan, nagy affinitással kötődik, jelen van-e a vizsgált szervezetben.

HU 220 859 Bl

15. Ugyancsak a találmány oltalmi körébe tartozik a fenti 1-12. pont szerinti vegyületek alkalmazása a radiodiagnózisban és/vagy radioterápiában, továbbá

16. Diagnosztikai kit (készlet) célstruktúrák in vivő és/vagy in vitro kimutatására, amely kit az 1-12. pontban felsorolt vegyületek közül legalább egyet tartalmaz.

17. Az 1-4. pontok valamelyike szerinti vegyület, amelyben N egy, a természetben nem található oligonukleotidligandum, amely specifikus affinitással kötődik a megcélzott molekulához, és ez a molekula egy háromdimenziós, nem polinukleotid kémiai szerkezet, amely főleg a Watson/Crick bázispárosításon vagy tripla helixkötésen alapuló mechanizmussal kötődik az oligonukleotidligandumhoz, amely oligonukleotidligandum nem egy nukleinsav, amelynek ismert fiziológiai funkciója, hogy a célmolekulához kötődjék.

Ha a találmány szerinti konjugátokat diagnosztikai célra akarjuk használni, akkor az egy vagy több komplexképző reagens a 21, 26-27, 29, 31, 43 vagy 49, előnyösen a 43 vagy 49 atomszámú elemeknek egy képalkotó radioaktív izotópját tartalmazza. Ha a találmány szerinti konjugátokat terápiás szerként akarjuk használni, akkor a fentieken kívül az 5, 22-25, 28, 42, 44, 57-83 atomszámú elemek radioaktív izotópjai is alkalmasak. Terápiás célra a fent említett elemek radioaktív izotópjain kívül stabil izotópok is alkalmasak, amelyeket

- külső sugárzással radioaktív izotópokká alakítunk át, vagy amelyek

- a kívülről kapott sugárzást más minőségű, eltérő energiatartalmú és/vagy eltérő hullámhosszúságú sugárzássá alakítják át.

Az oligonukleotidcsoporthoz kapcsolódó, a képalkotásban vagy terápiásán hatásos B-K szubsztituensek számát egyrészt az oligonukleotid polimerizációs foka korlátozza, másrészt ez a szám 10-nél sohasem nagyobb. A találmány szerinti egy vagy két B-K szubsztituens előnyös.

Az N oligonukleotid polimerizációs foka elvileg nem korlátozott. A találmány céljára 5-200, előnyösen 15-100 nukleotidot tartalmazó oligonukleotidot használunk.

A találmány céljára használt oligonukleotidokat az élő szervezetekben előforduló nukleázok által végzett lebontással szemben stabilizálni kell.

A módosítatlan oligonukleotidokat és polinukleotidokat endo- és exonukleázokkal in vivő hasítjuk. A lebontási reakció az RNS-szériákban a 2’-hidroxicsoport aktiválásával kezdődik. Az RNS foszfodiészter-kötéseinek hasítását más katabolikus enzimek, például ribozimek végzik [Science 261, 709 (1993)]. Az RNS-származékok stabilitását növelhetjük oly módon, hogy a 2’hidroxilcsoportot - részben vagy egészen - más szubsztituensekkel helyettesítjük. Ilyen szubsztituensek például az alkoxicsoportok, különösen a metoxicsoport [Chem. Pharm. Bull. 13, 1273 (1965) vagy Biochemistry 10, 2581 (1971)], a hidrogénatom, fluoratom, [Can. J. Chem. 46, 1131 (1968)] vagy az aminocsoport [J. Org. Chem. 42, 714 (1977)]. Néhány ilyen szubsztituenst, valamint más szubsztituenseket a 2’-helyre is bevihetünk az 1994. június 22-én 08/264,029 számon közzétett amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírtak szerint. Az intemukleotid kötés stabilizálásának további módjai, hogy a foszfodiészterhídban egy vagy két oxigénatomot helyettesítünk, miközben foszfortioátok [Trends Biochem. Sci. 14, 97 (1989)] vagy foszforditioátok [J. Chem. Soc., Chem. Commun. 591 (1983) és Nucleic Acid Rés. 12, 9095 (1984)] képződnek, vagy a foszfodiészterek helyett alkil-foszfonátokat alkalmazunk [Ann. Rep. N. Y. Acad. Sci. 507, (1988)].

A stabilizációt megoldhatjuk úgy is, hogy ribózegységek 2’-hidroxilcsoportjait egymástól függetlenül módosítjuk. Ilyen módosítás például, hogy a hidroxilcsoportot egy OR általános képletű csoporttal, egy halogén-, előnyösen fluoratommal, hidrogénatommal vagy valamilyen amin-, előnyösen aminocsoporttal helyettesítjük. Az alkoxicsoport R csoportja ez esetben egyenes vagy elágazó láncú 1 -20 szénatomos alkil-, például metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-, tere-butil-, pentilvagy hexilcsoport; vagy egy szubsztituált vagy szubsztituálatlan 4-20 szénatomos gyűrűs alkil-, például ciklopentil vagy ciklohexilcsoport, amely adott esetben 1-2 hidroxilcsoportot tartalmaz, és adott esetben 1-5 oxigénatommal van megszakítva. A stabilitást az is növeli, hogy a 3’- és 5’-helyen a hidroxilcsoportok adott esetben éterezettek.

A polinukleotidok stabilizálásának egy további módja, hogy a nukleotidok összekötésére alkalmazott foszfodiésztereket részben vagy egészen és egymástól függetlenül foszfortioátokkal, foszforditioátokkal vagy alkil-foszfonátokkal, különösen előnyös módon kis szénatomszámú alkil-foszfonátokkal, például metil-foszfonáttal helyettesítjük. Ezeket az intemukleotid kötőanyagokat kapcsolhatjuk a 3’- vagy 5’-helyen lévő terminális csoportokhoz vagy 3’-3’- vagy 5’-5’-helyekhez is. A foszfodiészter-kötőanyag további kötéseket tesz lehetővé a nukleobázisok nitrogén- vagy szénatomján jelen lévő hidroxilcsoportokkal, így például két timidin összekötődhet a 3-helyen lévő hidroxi-alkil-láncok vagy két purinbázis a 8-helyen lévő csoportok révén. A kötés a 2’-, 3’- vagy 5’-helyen is létrejöhet.

A módosított intemukleotid kötések adott esetben létrejöhetnek a polinukleotid végein is, különösen előnyös, ha a timidinhez kapcsolódnak.

A találmány szerint az N-oligonukleotid-csoportok nem korlátozódnak speciális oligonukleotidszekvenciákra, de előnyösek azok az oligonukleotidok, amelyek specifikusan, nagy affinitással kötődnek a célstruktúrákhoz, a nukleinsavak kivételével.

Az 5,270,163 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismertet egy eljárást olyan oligonukleotidok azonosítására, amelyek a találmány szerinti konjugátok kiindulási anyagaiként használhatók. Ez a SELEX nevű eljárás felhasználható nukleinsavligandum előállítására bármely kívánt célmolekulához.

A SELEX módszer révén a felhasználandó oligonukleotidok keverékéből lépésenkénti megkötéssel, megosztással és amplifikálással, egyazon általános szelektálási séma alkalmazásával lényegében bármilyen kötésaffinitási és szelektivitási követelmény teljesíthető.

HU 220 859 Bl

A SELEX eljárás során nukleinsavak olyan keverékéből indulunk ki, amely előnyösen tartalmaz egy randomizált szekvenciájú szakaszt, a keveréket a kötés számára kedvező körülmények között érintkezésbe hozzuk a célvegyülettel, a megkötetlenül maradt nukleinsavakat megosztással elválasztjuk a célmolekulákon specifikusan megkötőitektől, a nukleinsav-célmolekula komplexeket disszociáltatjuk, a komplexből disszociált nukleinsavakat ampliflkáljuk, így a nukleinsavaknak egy ligandumban feldúsult keverékét kapjuk, majd ezután a megkötési, megosztási, disszociációs és amplifikációs lépéseket annyi cikluson át ismételjük, amennyi szükséges ahhoz, a célmolekulához nagyon specifikusan, nagy affinitással kötődő nukleinsavligandumokat kapjunk.

Egy sor speciális cél elérésére a SELEX alapmódszert módosítottuk. Például a WO 94/09158 számú szabadalmi leírás ismerteti a SELEX módszernek gélelektroforézissel együtt történő alkalmazását speciális szerkezeti tulajdonságokat mutató nukleinsavmolekulák, például hajlított DNS kiválasztására. A WO 95/08003 számú bejelentett szabadalmi leírás egy SELEX-alapú módszert ír le egy célmolekulához kötődni és/vagy azt fényhatással térhálósítani és/vagy fotoinaktiválni képes fotoreaktív csoportokat tartalmazó nukleinsavligandumok kiválasztására. A WO 95/07364 számú szabadalmi leírás ismerteti a Counter-SELEX nevű módszert erősen specifikus nukleinsavligandumok azonosítására, amelyek képesek megkülönböztetni közeli rokonságban álló molekulákat. A WO 95/08003 számú bejelentett szabadalmi leírás egy SELEX-alapú módszert ír le, amellyel a célmolekulához kis és nagy affinitást mutató oligonukleotidok között igen hatásos megosztás érhető el. A WO 94/08050 számú bejelentett szabadalmi leírás egy olyan módszert ismertet, amellyel a SELEX végrehajtása után javított nukleinsav-ligandumokat kapunk. Az US 5 705 337 számú bejelentett amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás egy olyan módszert ír le, amelynek alkalmazásával a ligandum és célmolekulája között kovalens kötés létesíthető.

A SELEX módszer magában foglalja olyan nagy affinitású nukleinsavligandumok azonosítását, amelyek a ligandumnak jobb tulajdonságokat - például jobb in vivő stabilitást vagy jobb szállítási jellemzőket - adó módosított nukleotidokat tartalmaznak. Ilyen módosítások például a kémiai helyettesítések a ribózon és/vagy foszfát- és/vagy bázisszubsztitúciók. Módosított nukleinsavakat tartalmazó, SELEX-szel azonosított nukleinsavligandumokat ír le a 08/117,991 bejelentési számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, amely a pirimidingyűrű 5- és a 2'-pozíciójában kémiailag módosított nukleotidszármazékokat tartalmazó oligonukleotidokat ismertet. A fent említett WO 95/07364 számú szabadalmi leírás erősen specifikus nukleinsav-ligandumokat ír le, amelyek egy vagy több - a 2’-helyen aminocsoporttal (2-NH₂), fluoratommal (2’-F) és/vagy metoxicsoporttal (2’-OMe) módosított - nukleotidot tartalmaznak. A WO 95/35102 számú szabadalmi leírás különböző, a 2’-helyen módosított pirimidineket tartalmazó oligonukleotidokat ismertet.

A SELEX módszer magában foglalja a kiválasztott oligonukleotidok egyesítését más kiválasztott oligonukleotid vagy nem oligonukleotid jellegű funkcionális egységekkel, amint azt a WO 96/04403 számú és a WO 95/07364 számú bejelentett szabadalmi leírás ismerteti. Ezek az alkalmazások a formák és tulajdonságok széles körű kombinációit teszik lehetővé, továbbá azt, hogy megfelelő amplifikációs és replikációs jellemzőkkel bíró, más molekulákkal szemben a kívánt tulajdonságokat mutató oligonukleotidokat kapjunk.

Legalapvetőbb formájában a SELEX eljárást a következő lépéssorozattal definiálhatjuk:

1) Elkészítjük a különböző szekvenciájú nukleinsavak kiindulási keverékét. Ez a keverék általában tartalmaz rögzített szekvenciájú szakaszokat (ami azt jelenti, hogy a keverék minden egyes tagja az adott helyen ugyanazon szekvenciákat tartalmazza) és randomizált szekvenciájú szakaszokat. A rögzített szekvenciájú szakaszok alkalmazásával a következő célok valamelyikét kívánjuk elérni: (a) az alábbi amplifikációs lépések elősegítése, (b) egy, a célhoz kötődő ismert szekvencia utánzása vagy (c) az adott szerkezetű nukleinsavak koncentrációjának növelése a kiindulási keverékben. A randomizált szekvenciák lehetnek teljesen randomizáltak (vagyis annak valószínűsége, hogy bármely pozícióban egy adott bázist találjunk 1/4) vagy csak részben randomizáltak (vagyis annak valószínűsége, hogy bármely helyen egy adott bázist találjunk 0 és 100 százalék között bármely választott érték lehet).

2) A kiindulási keveréket a választott cél és a keverék tagjai közötti kötés létrejöttéhez kedvező körülmények között érintkezésbe hozzuk a céllal. Ilyen körülmények között a cél és a kiindulási keverék nukleinsavai között olyan kölcsönhatás jön létre, hogy a cél és a hozzá legnagyobb affinitású nukleinsavak nukleinsavcél párokat képeznek.

3) A célhoz a legnagyobb affinitással kötődő nukleinsavakat megosztással elválasztjuk a célhoz kisebb affinitással kötődő nukleinsavaktól. Minthogy a kiindulási keverékben rendkívül kevés olyan szekvencia van jelen, amely a legnagyobb affinitású nukleinsavnak felel meg (esetleg csak egy nukleinsavmolekula), a megosztási körülményeket általában célszerű úgy beállítani, hogy a megosztás során a kiindulási keverékben jelentős mennyiségű (körülbelül 5-50%) nukleinsav maradjon vissza.

4) A megosztás folyamán a célhoz viszonylag nagy affinitásúként kiválasztott nukleinsavakat azután egy új, a célhoz viszonylag nagy affinitású nukleinsavakban feldúsított kiindulási keverék előállítására ampliflkáljuk.

5) A fenti megosztási és amplifikálási lépések ismétlésével az újonnan képzett kiindulási keverék egyre kevesebb egyedi szekvenciát tartalmaz, és a nukleinsavaknak a célhoz mutatott átlagos affinitása általában növekszik. A SELEX eljárás végül olyan kiindulási keveréket fog adni, amely csak egy vagy néhány, a célhoz a legnagyobb affinitást mutató nukleinsavat tartalmaz az eredeti kiindulási keverékből.

A SELEX-szel kapcsolatos szabadalmi leírások és bejelentések igen részletesen kidolgozták ezt a módszert. Ezekben megtalálhatók az eljáráshoz alkalmazha6

HU 220 859 Bl tó célok; eljárások egy adott kiindulási keverékben jelenlevő nukleinsavak megosztására; valamint a megosztott nukleinsavak amplifikálására szolgáló módszerek a dúsított kiindulási keverék előállítására. A SELEX-szel kapcsolatos szabadalmi leírások és bejelentések leírnak továbbá egy sor célfajhoz - például nukleinsavat megkötő, illetve nem megkötő protein célokhoz - előállított ligandumot. Tehát a SELEX módszer felhasználható arra, hogy egy célmolekulához nagy affinitású ligandumokat állítsunk elő.

A célmolekulák előnyösen proteinek, de lehetnek többek között szénhidrátok, peptido-glikánok és egy sor kis molekula is. Éppúgy, mint általában a hagyományos proteinszerű antitestek, a nukleinsav-antitestek (oligonukleotidligandumok) is felhasználhatók biológiai célstruktúrákhoz, például sejtfelületekhez vagy vírusokhoz egy, az adott biológiai struktúra szerves részét képező molekulával való kölcsönhatás révén. Az oligonukleotidligandumok azért előnyösek, mert ezeket nem korlátozza az autotolerancia, mint a hagyományos antitesteket. Továbbá a nukleinsav-antitestek szintéziséhez vagy szaporításához nem szükségesek állatok vagy sejttenyészetek, mert a SELEX teljes mértékben in vitro eljárás. Mint ismert, a nukleinsavak komplementer nukleinsavszekvenciákhoz köthetők. A nukleinsavaknak ezt a tulajdonságát már eddig is rendkívül jól hasznosították a nukleinsavmolekulák kimutatására, mennyiségi meghatározására és elkülönítésére. Ezért a találmány szerinti eljárások nem foglalkoznak a nukleinsavak jól ismert kapcsolódási készségével. Közelebbről: a találmány szerinti, nukleinsav-antitestek alkalmazásával kapcsolatos eljárások nem foglalkoznak a nukleinsavak ismert kötési affinitásával. Sokféle, nukleinsavszekvenciákat összekötő protein ismert, így például a szabályozó fehérjék, amelyek nukleinsav operátor szekvenciákat kötnek össze. Például bizonyos nukleinsavhoz kötődő proteineknek azt az ismert képességét, hogy természetes helyeikhez képesek kötődni, felhasználják az ilyen proteinek kimutatására, elkülönítésére és tisztítására. A találmány szerinti, oligonukleotidligandumok alkalmazásával kapcsolatos eljárások nem foglalkoznak a nukleinsavakat megkötő proteinek és azon nukleinsavszekvenciák közötti ismert kötési affinitással, amelyekhez a proteinek ismert módon kötődnek. Viszont a SELEX eljárással új, a természetben nem található szekvenciák állíthatók elő, amelyek ugyanazon nukleinsavkötő proteinekhez kötődnek. Közelebbről: a találmány szerinti oligonukleotidligandumok főleg a Watson/Crick bázispárosításon vagy tripla helixkötésen alapuló mechanizmussal kötődnek ezekhez a háromdimenziós - az ilyen oligonukleotidligandumokhoz kötődő polinukleotidoktól eltérő kémiai szerkezetű - célmolekulákhoz, és ezek az oligonukleotidligandumok nem nukleinsavak, amelyeknek ismert fiziológiai funkciójuk, hogy a célmolekulához kötődjenek.

Megjegyezzük, hogy a SELEX-szel igen gyorsan meghatározhatók egy proteinhez kötődő nukleinsavszekvenciák, így az eljárás könnyen alkalmazható ismeretlen operátorszerkezetek és kötőhely-szekvenciák meghatározására, amely szekvenciák azután az itt leírt módon alkalmazhatók. Ezenkívül bizonyos, a SELEXszel izolálható nukleinsav-antitestek ugyancsak felhasználhatók specifikus célmolekulák vagy -struktúrák funkciójának befolyásolására, például gátlására, erősítésére vagy aktiválására. így nukleinsav-antitestek fehérjefunkciók gátlására, erősítésére vagy aktiválására használhatók.

A találmány szerinti konjugátokban használt oligonukleotidokat egy előnyös megvalósításban az alábbiakban leírt eljárással állítjuk elő.

Alkalmas oligonukleotidokat kapunk például, ha egy random szekvenciákat tartalmazó oligonukleotidkeveréket összehozunk a célstruktúrával, és bizonyos oligonukleotidokkal, amelyek nagyobb affinitást mutatnak a célstruktúrához, mint az oligonukleotidok keveréke, az utóbbit elválasztjuk az oligonukleotidkeverék maradékától, majd a célstruktúrához nagyobb affinitást mutató oligonukleotidokat amplifikáljuk, így oligonukleotidoknak egy olyan keverékét kapjuk, amely a célstruktúrákhoz kötődő oligonukleotidokat nagyobb arányban tartalmazza.

Az eljárás során először egy DNS-szálat állítunk elő, előnyösen kémiai szintézissel. A 3’-végen ez a DNS-szál ismert szekvenciájú, ezt promoterként használjuk egy RNS-polimerázhoz, ugyanakkor a polimeráz láncreakció (PCR) egyik primerjének komplementere. Egy különösen előnyös megvalósításban a T7 RNSpolimeráz promoterét használjuk. Ezután a promoteren egy random szekvenciát szintetizálunk. A random szekvenciát úgy állítjuk elő, hogy a megfelelő négy bázist azonos arányban adagoljuk be a szintetizátorba, így egy teljesen véletlenszerű DNS-szekvencia jön létre. Egy előnyös megvalósításban a random szekvencia hossza körülbelül 15-100 nukleotid. Egy másik, a polimeráz láncreakcióhoz (PCR) használható DNSszekvenciát ezen a random szekvenciájú DNS-darabon szintetizálunk.

Ezen DNS-szálat a szintetizálás után RNS-polimerázzal egy komplementer RNS-szállá írjuk át. Ehhez egy előnyös megvalósításban a T7 RNS-polimerázt használjuk. Az átírás során módosított nukleotidokat kínálunk fel az RNS-polimeráznak. Egy különösen előnyös megvalósításban a ribóz a 2’-pozícióban módosított. Ez esetben a hidrogénatomot vagy hidroxilcsoportot egy alkoxi-, előnyösen metoxicsoporttal, aminocsoporttal vagy fluoratommal helyettesíthetjük. Az így kapott RNS-oligonukleotidokat azután bevisszük a szelekciós eljárásba.

A szelekciós eljárásban az RNS-oligonukleotidokat összehozzuk a célstruktúrával. A célstruktúra egy olyan szerkezet, amelyen az oligonukleotid specifikusan, nagy affinitással kötődik meg.

Ilyen szerkezetek például a makromolekulák, magasabb rendű élőlények szövetszerkezetei, szervei vagy szervrészei, továbbá sejtek, különösen daganatsejtek vagy daganatok.

Egyáltalán nem fontos, hogy a célstruktúra tiszta állapotban legyen, jelen lehet egy természetes állapotú szerven vagy egy sejt felületén. A pontosságot a szelekciós eljárásban alkalmazhatjuk, amikor a poliamint 7

HU 220 859 Β1 (tRNS, heparin), plazma vagy teljes vér - bevezetjük a SELEX reakcióba.

Ha itt egy izolált proteint alkalmazunk, az meg lehet kötve egy szilárd fázison, például egy szűrőn. A szelekció során a célstruktúrát a felhasznált RNS-keverékhez képest feleslegben alkalmazzuk. Az inkubálás folyamán a specifikus oligonukleotidmolekulák megkötődnek a célstruktúrákon, míg a kötetlenül maradt oligonukleotidokat például mosással elválasztjuk a keverékből.

Ezután az oligonukleotidmolekulákat elválasztjuk a célmolekuláktól vagy alkalmas pufferekkel vagy oldószerekkel végzett mosással eltávolítjuk őket.

A megtalált RNS-oligonukleotidot reverz transzkriptázzal a komplementer DNS-szállá írjuk át.

Minthogy az így kapott DNS-szálnak mindkét végén primer szekvenciák (vagyis promoter szekvenciák) vannak, a megtalált DNS-szekvenciákat egyszerűen polimeráz láncreakcióval állíthatjuk elő.

Az ily módon amplifikált DNS-oligonukleotidokat azután RNS-polimerázzal ismét RNS-oligonukleotidokká írjuk át, és az így kapott RNS-oligonukleotidokat felhasználhatjuk egy további (a fent leírtak szerinti) szelekciós lépésben.

A második szelekciós lépésben kapott kötődő RNSoligonukleotidokat a célmolekuláktól való elválasztás után reverz transzkriptázzal ismét DNS-sé írjuk át, az így kapott komplementer DNS-oligonukleotidokat polimeráz láncreakcióval amplifikáljuk, majd RNS-polimerázzal ismét RNS-oligonukleotidokká írjuk át, amelyek egy további szelekciós lépésben felhasználhatók.

Kiderült, hogy a szelekciós lépéseket néhányszor megismételve elérhető a kívánt nagy specifikusság és nagy kötődési affinitás. Ritkán fordul elő, hogy a kívánt oligonukleotidszekvenciát már egy vagy két szelekciós lépés után megkapjuk. Amint a kívánt specifikusságot, valamint a célstruktúra és az oligonukleotid közötti kötődési affinitást elértük, az oligonukleotido(ka)t szekvenálhatjuk, és így a specifikusan kötődő oligonukleotidok szekvenciáját meghatározhatjuk.

Ebben a módszerben különösen előnyös, hogy nemcsak alkalmas proteinekkel, hanem in vivő is alkalmazható. De a fenti szelekciós eljárást tisztított célstruktúrákon is végrehajthatjuk. Az azonban - különösen in vivő diagnózisnál - alapvetően fontos, hogy az oligonukleotidok élő környezetben kötődnek specifikusan a célstruktúrákhoz. Ezért a szelekciós eljárást sejteken vagy sejttenyészeteken, szöveteken vagy szövetdarabokon, vérkeringéssel ellátott szerveken, sőt, élő szervezetekben is végezhetjük.

Ez esetben a módosított oligonukleotidok előnyösen ellenállóak a csaknem mindenütt jelenlevő RNS-ek lebontó hatásával szemben. Ennek eredményeként a kívánt oligonukleotidszekvenciák az élő szervezetben végrehajtott szelekciós eljárás során felgyülemlenek, míg a megfelelő, természetben előforduló oligonukleotidokat az RNS-ek lebontják.

Az N-oligonukleotid-csoport egymástól függetlenül egy vagy több B kapcsolókomponenst vagy B-K szubsztituenst tartalmaz. Az igénypontokban olyan oligonukleotidkonjugátok szerepelnek, amelyek 1-10 azonos vagy 2-10 különböző B kapcsolókomponenst tartalmaznak. Különösen előnyösek az egy vagy két B kapcsolókomponenst tartalmazó oligonukleotidok.

A B kapcsolókomponens összeköti az N-oligonukleotid-csoportot egy K komplexképző reagenssel vagy komplexszel.

Donoratomként előnyösen polidentátot, vagy oxigén-, kén- vagy nitrogénatomot tartalmazó nyílt láncú vagy ciklikus komplexképző ligandumokat alkalmazunk.

A K komplexképző reagensre példaként említhetők az egy hidrogénatommal, egy hidroxilcsoporttal és/vagy egy ecetsavcsoporttal redukált poliamino-polikarbonsavak, az etilén-diamin-tetraecetsav, a dietiléntriamin-pentaecetsav, a transz-1,2-ciklohexán-diamintetraecetsav, az 1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-tetraecetsav, az 1,4,7-triaza-ciklononán-triecetsav, az 1,4,8,11-tetraaza-tetradekán-tetraecetsav, az 1,5,9-triazaciklododekán-triecetsav, az 1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-triecetsav és a 3,6,9,15-tetraaza-biciklo[9.3.1]pentadeka-1(15)11,13-trién-triecetsav.

Alkalmas komplexképző reagenst ismertet például az EP 0,485,045, az EP 0,071,546, az EP 0,58,229 számú európai, a DE 43,10,999 és DE 43,11,023 számú német valamint az US 4,965,392 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás.

A találmány szerinti K komplexképző reagens különböző lehetőségei láthatók az 1-3. ábrán, amelyeken néhány előnyös szerkezetet mutatunk be. Ezek azonban csak egy válogatást jelentenek, a találmány oltalmi köre nem korlátozódik az itt bemutatott komplexképző reagensekre.

A K komplexképző reagens bármely olyan radioaktív izotópot tartalmazhat, amelyet a nukleáris gyógyászatban diagnosztikus vagy terápiás célokra szoktak alkalmazni fémionjaik alakjában. Használhatunk stabil izotópokat is, amelyeket diagnosztikus vagy terápiás sugárzásra külső sugárzással gerjesztettek, vagy olyanokat, amelyek külső sugárzás hatására radioaktív izotópokká alakulnak át.

A találmány céljára alkalmas izotópokat az 5, 21-29, 31, 39, 42-44, 49, 57-83 vagy 85 atomszámú elemek közül választjuk.

Ha a találmány szerinti vegyületet radiofarmakológiai reagensként használjuk, akkor a komplexképző reagens egy radioaktív elemet tartalmaz. Erre a célra alkalmas minden olyan radioaktív elem, amely in vivő vagy in vitro terápiás hatást fejt ki. Előnyösen alkalmazhatók a réz, a bizmut, a technécium, a rénium és indium izotópjai. Különösen előnyösek a ^99mTc-komplexek.

A találmány szerinti (I) általános képletű vegyületek közül azok, amelyek pozitront kibocsátó izotópokat tartalmaznak - így például az Sc-43, Sc-44, Fe-52, Co-55, Ga-68 vagy Cu-61 - felhasználhatók a pozitronemissziós tomográfiában (PÉT).

A találmány szerinti (II) általános képletű vegyületek közül azok, amelyek gamma-sugárzást kibocsátó izotópokat - mint például Tc-99m vagy In— 111 - tartal1

HU 220 859 Bl maznak, felhasználhatók az egyszeres fotonemissziós (single photon emission) tomográfiában (SPET).

A találmány szerinti vegyületek a radioterápiában radioaktív izotópokkal, például ír-192-vel képzett komplexeik alakjában is felhasználhatók.

A találmány szerinti vegyületek a radioimmunterápiában vagy sugárzásos terápiában is használhatók. Az utóbbi csak a felhasznált izotóp fajtájában és mennyiségében különbözik a megfelelő diagnózistól. Ez esetben a cél a tumorsejtek megsemmisítése nagy energiájú, rövid hullámhosszú, és a lehető legszűkebb tartományon belüli sugárzással. Alkalmas β-sugárzáskibocsátó ionok például az Sc-46, Sc-47, Ga-72, Ga-73, Y-80, Re-186 és a Re-188. Alkalmas asugárzás-kibocsátó, rövid felezési idejű ionok például az At-209, At-211, Bi-211, Bi-212, Bi-213 és a Bi-214, közülük előnyös a Bi-212. Alkalmas fotonés elektronkibocsátó ion például a ¹⁵⁸Gd, amely ¹⁵⁷Gdból neutronbefogással állítható elő.

Ha a találmány szerinti reagenst a sugárzásos terápiának az R. L. Mills és munkatársai [Natúré, 336, 787 (1998)] által ajánlott változatában akarjuk felhasználni, akkor a középponti ionnak egy mössbauer-izotópból, például ⁵⁷Fe-ból vagy ¹⁵¹Eu-ból kell származnia.

Azok a karboxilcsoportok, amelyek nem szükségesek ahhoz, hogy a 21-29, 31, 39, 42-44, 49, 57-83 vagy 85 atomszámú elemek fémionjait komplexbe vigyék, adott esetben szervetlen vagy szerves bázisok, például alkálifém- vagy alkáliföldfém-hidroxidok vagy -karbonátok - különösen nátrium- vagy kálium-hidroxid - ammónia, alkil-aminok vagy aminosavak sóiként vagy egy észter vagy amid alakjában lehetnek jelen.

Használhatunk továbbá olyan vegyületeket, amelyeket részecskék és/vagy sugárzás kibocsátására neutronokkal gerjesztettünk. Különösen hatásos erre a célra a gadolínium. Előnyösen használhatók a bór-10 izotópot tartalmazó vegyületek is. Ilyen esetekben K

-(CH₂)_X-C — B₁₀H|₀ szerkezetű lehet, \O/

CH ahol χ 1 és 10 közötti egész számot jelent.

A találmány további tárgyát képezik a találmány szerinti konjugátok előállítására szolgáló eljárások.

így például olyan konjugátokat, amelyekben a B kapcsolókomponens az oligonukleotid 5’-végéhez kapcsolódik, úgy állíthatunk elő, hogy az oligonukleotidot egy foszfor-amidit-származékkal reagáltatjuk ([Tetrahedron 49, 1925-1963 (1993)]. Ezen a végen az oligonukleotid 5’-hidroxilcsoportját egy PR’(NH₂”)OR”’ általános képletű foszfor-amidittel reagáltatjuk. Ez esetben R’ jelentése alkil-, alkoxi- vagy aralkilcsoport, amely 1-20 szénatomot és adott esetben nitrogénatomot, nitrocsoportot, szilíciumatomot vagy SO₂-csoportot - például adott esetben szubsztituált metil-, etil-, propil-, butil-, pentil-, hexil-, metoxi-, etoxi-, propiloxi-, butil-oxi-, benzil-oxi- vagy fenil-etoxi-csoportot - tartalmaz. Szubsztituensként előnyösen ciano- vagy nitrocsoportot alkalmazhatunk. Előnyösen alkalmazható például a metoxi-, β-ciano-etoxi- vagy nitro-feniletoxi-, különösen előnyösen a β-ciano-etoxi-csoport.

R” jelentése 1-4 szénatomos alkil-, előnyösen etilvagy propilcsoport. R’” jelentése alkil- vagy aralkilcsoport, amely 1-20 szénatomot és adott esetben kén-, oxigén-, nitrogénatomot, ciano-, nitrocsoportot, vagy halogénatomot tartalmaz. Előnyösen védett amino- és tioalkilcsoportot vagy védett amino- és tio-oxi-alkilcsoportot, különösen előnyösen 6-amino-hexil-, 6-tiohexil-, 3,6,9-trioxa-ll-amino-undecil- vagy 3,6-dioxa8-amino-oktanil-csoportot alkalmazunk. Védőcsoportként a szokásos N- vagy S-védőcsoportok alkalmazhatók, így például trifluor-acetil-, ftálimido- vagy monometoxi-tritil-csoport.

A találmány egyik különösen előnyös megvalósításban foszfor-amidit-származékként 3-(ciano-etil)-N,Ndiizopropil-amino-6-(trifluor-acetamido)-l-hexil-foszfor-amiditet alkalmazunk.

A találmány egy másik előnyös megvalósításban foszfor-amidit-származékként β-(ώ3ηο-εη1)-Ν,Ν^πζοpropil-amino-(3,6,9-tritrioxa-ll-ftálimido-l-undecil)foszfor-amiditet alkalmazunk.

A találmány egy másik megvalósításban a B kapcsolókomponens az N oligonukleotid 3’-helyéhez kötődik, hasonló módon, mint amit a fentiekben a foszfortartalmú csoportra vonatkozóan leírtunk.

Az oligonukleotid és a foszfor-amidit közötti fenti reakció végbemehet szilárd fázisú reakcióként, az oligonukleotid egy automatikus szintetizátor oszlopán megkötve az álló fázist képezi. Miután megkaptuk a kívánt szekvenciájú oligonukleotidot, és annak 5’-hidroxilcsoportját például triklór-ecetsavval szabaddá tettük, az oligonukleotidot reagáltatjuk a foszfor-amidittel, és a reakcióterméket oxidáljuk, majd felszabadítjuk. Azután az így kapott oligonukleotidszármazékot a terminális amino- vagy tiolcsoportnál - adott esetben egy másik kötőcsoport segítségével - a K komplexképző reagenshez vagy komplexhez kapcsoljuk. Ekkor az oligonukleotidon az első lépésben a foszfortartalmú csoporttal létrehozott gyökös kötés az adott esetben jelen lévő további kötőcsoporttal együtt képezi a B kapcsolókomponenst.

Az oligonukleotid és a komplexképző reagens közötti kapcsolódás úgy is végbemehet, hogy az oligonukleotid szabad 5’-hidroxilcsoportját egy komplexképző reagenssel vagy komplexszel reagáltatjuk, amely terminálisán egy kötésre képes foszfortartalmú csoportot hordoz. Ilyen például az (i) általános képletű csoport, amelyben

R^a jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport, amely βhelyzetben adott esetben egy cianocsoportot hordoz,

R^b jelentése egy szekunder aminocsoport, és K és B jelentése a fenti;

vagy a (j) általános képletű csoport, amelyben

R^c jelentése egy trialkil-ammónium-kation, és K és B jelentése a fenti;

vagy a (k) vagy (1) általános képletű csoport, amelyben

R^d jelentése egy arilcsoport, amely adott esetben egy vagy több halogénatommal és/vagy egy vagy több nitrocsoporttal szubsztituált, vagy egy 1-6 szénatomos alkilcsoport, amely β9

HU 220 859 Bl helyzetben adott esetben egy cianocsoporttal szubsztituált, és

K,B és R^c jelentése a fenti;

ha egy a) általános képletű csoportot használunk, akkor a kapcsolási reakció után egy foszfáttá való oxidálási lépés következik. Mindkét esetben az -OR^a, illetve -OR^C csoport adott esetben hidrolízissel lehasítható.

Az oligonukleotidszármazéknak a kötőcsoporttal a K komplexképző reagenshez vagy komplexhez történő kapcsolását szilárd fázisú reakcióként is végrehajthatjuk egy automatikus szintetizátoroszlopon. Ezután a találmány szerinti vegyületet a szilárd hordozóról leoldással izolálhatjuk.

A kötőcsoport nemcsak a terminális nukleotid cukorrészének 5’-hidroxilcsoportja révén kapcsolódhat az oligonukleotidhoz, hanem más, az 5’-hidroxilcsoportból származtatott csoportok - például egy amino-karboxi-csoport - révén is. Az ilyen, amino- vagy karboxicsoportot hordozó nukleotidok ismertek és könnyen előállíthatók. Egy 5’-dezoxi-5’-amino-uridin előállításának leírása megtalálható az alábbi szakirodalmi helyeken: [J. Med. Chem. 22, 1273 (1979)], valamint [Chem. Lett. 6, 601, (1976)]. A 4’-karboxi-5’-dezoxiuridint az alábbi szakirodalmi helyeken: [J. Med. Chem. 21, 1141 (1978)] vagy [Nucleic Acids Symp. Ser. 9, 95 (1981)] leírt módon állítjuk elő.

Ezután a komplexképző reagenshez való kötődés egy karboxil- vagy aminocsoportot tartalmazó kötőcsoport segítségével a szakember számára ismert módon megy végbe. Ezután a kötőcsoport a B kapcsolókomponenssel egy -NH-CH₂-4’ vagy -CO-4’ csoportot képez.

Kimutatható, hogy a találmány szerinti konjugátoknak egy nukleotid gyökre, egy kapcsolókomponensre és egy komplexképző reagensre vagy komplexre történő felosztása teljesen formális, így a tényleges szintetikus szerkezettől független. így például a fenti esetben az -NH-CH₂-4’ vagy -CO-4’ csoportot a B kapcsolókomponenshez, míg az oligonukleotidot, amely 4helyen egy CH₂-OH csoporttal redukált, az N-oligonukleotid-gyökhöz tartozónak tekintjük.

A konjugátok előállítására szolgáló eljárások közül az, amelyben a hidroxilcsoporttal redukált foszfodiészter- vagy foszfotioáthidakhoz kapcsolódó komponens szerepel, abból áll, hogy először két cukoregység összekapcsolódik egy dinukleotiddá [Chem. Lett. 1305 (1933)]. Ez esetben először egy (II) általános képletű triészter képződik, amelyben U jelentése egy megfelelő alkiléncsoport, V jelentése pedig védett aminocsoport vagy kénatom. A védőcsoport, például amino védőcsoport lehasítása után, a komplexképző reagenst ismert módon, egy kapcsolócsoport segítségével - például amidkötés kialakításával - az aminocsoporthoz kapcsolhatjuk. A kapcsolócsoport ezután az O-U-V’ általános képletű csoporttal együtt - amelyben V’ jelentése -NH csoport - a B kapcsolókomponenst képezi.

Egy másik eljárásban a foszfotriésztert közvetlenül (például 1,5-diamino-pentánnal reagáltatva) aminolizáljuk [Biochemistry 27, 7237 (1988)] vagy [J. Am. Chem. Soc., 110, 4470 (1988)].

Az így kapott (III) általános képletű vegyületet a fenti módon, adott esetben egy kötőcsoporttal kapcsolhatjuk a komplexképző reagenshez.

A kapcsoláshoz dinukleozid-foszfát-monotioésztereket is alkalmazhatunk [J. Am. Chem. Soc., 111, 9117 (1983) és Nucl. Acids Rés. 20, 5205 (1992)].

A nukleobázisok rendkívül széles körű lehetőségeket nyújtanak a komplexképző reagenseknek a nukleotidokhoz történő kapcsolására. A purinok és a pirimidinek 2-es helyzetű aminocsoportjaihoz a kapcsolódás közvetlenül is végbemehet. De sok esetben előnyösebb, ha a purinokat vagy pirimidineket először módosítjuk, majd ezeket a származtatott bázisokat kötjük (adott esetben további kötőcsoportokkal) a komplexképző reagenshez. Alkalmas származtatott bázisok leírása megtalálható például az alábbi szakirodalmi helyeken: [Biochemie (Biochemistry) 71, 319 (1989)], [Nucl. Acids Rés. 16, 4937 (1988)] vagy [Nucleosides Nucleotides 10, 633 (1991)].

A nukleobázisokhoz történő kötés egy másik módszere bróm- vagy jódnukleobázisok és funkciós csoportokkal ellátott gyökök palládiummal katalizált összekapcsolásából áll [Biogenic and Medical Chemistry Letter V, 361 (1994)]. Az ilyen funkciós csoportok révén a komplexképző reagenst azután adott esetben egy másik kötőcsoport segítségével, ismert módszerrel kapcsolhatjuk a nukleobázishoz. A pirimidin 5-ös és a purin 8-as helyén funkciós csoportként használhatunk például egy akril-észtert vagy egy allil-amint [Nucl. Acids Rés. 14, 6115 (1986)] és [Nucl. Acids Rés. 16, 4077 (1988)]. Egy további lehetséges módszer az 5-ös helyen módosított pirimidinek előállítására abból áll, hogy az 5-ös helyre például karbonil-, alkenil- vagy arilcsoportot viszünk be; egy javított palládiumkatalizátort - amely képes módosított csoportokat az 5-ös helyhez kapcsolni - ír le a WO 94/29279 számú bejelentett szabadalmi leírás. A prekurzorként használt halogénezett származékokat az alábbi szakirodalmi helyeken: [Biophys. J. 44, 201 (1983)], [J. Am. Chem. Soc., 86, 1242 (1964)] és [Chem. Commun. 17 (1967)] leírt módon állíthatjuk elő.

A találmány szerinti fémkomplexeket fémmentes oligonukleotidkonjugátokból a DE 34,01,052 számú német szabadalmi leírás szerint úgy állítjuk elő, hogy a kívánt fémizotóp oxidját vagy valamilyen sóját (mint például nitrát, acetát, karbonát, klorid vagy szulfát) vízben és/vagy egy kis szénatomszámú alkoholban (mint metanol, etanol vagy izopropil-alkohol) oldjuk vagy szuszpendáljuk, az oldatot vagy szuszpenziót a komplexképző reagenst tartalmazó oligonukleotidkonjugát egyenértékű mennyiségével reagáltatjuk, majd kívánt esetben a jelen lévő savas hidrogénatomokat szervetlen és/vagy szerves bázisok kationjaival helyettesítjük, vagy az aminosav- vagy szabad karbonsavcsoportokat aminosavamidokká alakítjuk át.

Az esetleg még mindig jelen lévő szabad savas csoportokat szervetlen bázisokkal, például nátrium-, kálium-, lítium-, magnézium- vagy kalcium-hidroxiddal, -karbonáttal vagy -hidrogén-karbonáttal és/vagy szerves bázisokkal, például primer, szekunder vagy tercier

HU 220 859 BI aminokkal - mint etanol-amin, morfolin, glukamin, Nmetil- vagy Ν,Ν-dimetil-glukamin -, bázisos aminosavakkal - mint például lizin, arginin vagy omitin vagy eredetileg semleges vagy savas aminosavak amidjaival semlegesítjük.

A találmány szerinti gyógyszerkészítményeket szintén a szakmában ismert módon úgy állítjuk elő, hogy a találmány szerinti oligonukleotidkonjugátokat - adott esetben a galenusi készítményeknél szokásosan használt adalékanyagok hozzáadásával - vizes közegben oldjuk vagy szuszpendáljuk, majd a szuszpenziót vagy oldatot adott esetben sterilizáljuk vagy sterilizálva szűrjük. Alkalmas adalékanyagok például a fiziológiailag ártalmatlan pufferek - például a trometamin komplexképző adalékok - például dietilén-triamin-pentaecetsav - vagy kívánt esetben elektrolitok, például nátrium-klorid vagy - kívánt esetben - antioxidánsok, például aszkorbinsav, vagy - különösen orális beadás esetén - mannit vagy más ozmotikus hatású anyagok.

Ha enterális beadáshoz vagy más célra a találmány szerinti hatóanyagok vízzel vagy fiziológiás sóoldattal képzett szuszpenzióit vagy oldatait akarjuk előállítani, akkor ezeket az anyagokat egy vagy több, a galenusi készítményeknél szokásosan használt segédanyaggal (mint például metil-cellulóz, laktóz, mannit) és/vagy felületaktív anyaggal (például lecitinek, Tween^TR, Myrj^TR) keverjük össze.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmények a találmány szerinti oligonukleotidkonjugátokból 0,1-3 μιη/1-t tartalmaznak, dózisuk általában 0,01 nmol/kg és 60 μιηοΐ/kg közötti. A készítményeket enterálisan vagy parenterálisan adjuk be.

A nukleáris gyógyászatban in vivő felhasználás esetén a megjelölt vegyületeket 10^-10 mol/testtömeg-kgnál kisebb dózisokban adjuk; a pontos dózis nagymértékben fiigg a vizsgálandó testrésztől, és különösen nagymértékben függ a választott vizsgálati módszertől. Egy átlagos 70 kg-os testtömegből kiindulva a diagnózis céljára használandó radioaktivitás mértéke 40 és 1100 MBq, előnyösen 200 és 800 MBq közötti, terápiás célra pedig alkalmanként 1-500, előnyösen 10-100 MBq. A készítményt általában intravénásán, intraarteriálisan, interstitiálisan (szövetek közé), peritoneálisan vagy intratumorálisan, előnyösen intravénásán adjuk be. Egy vizsgálathoz általában 0,1-20 ml készítményt adunk be.

A találmány további tárgyát képezi egy eljárás célstruktúrák kimutatására. Ez esetben az in vivő vagy in vitro vizsgálandó mintát egy vagy több fenti vegyülettel hozzuk össze. Itt az N-oligonukleotid-gyök specifikusan és nagy affinitással kötődik a kimutatandó célstruktúrához.

Ha a célstruktúra egy mintában van jelen, akkor a jel alapján kimutatható. Az eljárás kiválóan alkalmas betegségek noninvazív (roncsolásmentes) diagnosztizálására. Ehhez a fenti vegyületek közül egyet vagy többet beadunk in vivő, és a jel alapján kimutatható, hogy a célstruktúra - amelyhez az N-oligonukleotid-gyök specifikusan és nagy affinitással kötődik - jelen van-e a vizsgált szervezetben.

Azonban amellett, hogy a vizsgált mintában a célstruktúrát kimutatjuk, az utóbbit specifikusan el is roncsolhatjuk. Ebben a tekintetben a találmány szerinti vegyületek különösen alkalmasak a radioterápiában, például a rák kezelésében.

A találmány további tárgyát képezi egy diagnosztikai kit célstruktúrák in vivő kimutatására, amely a fenti vegyületek közül egyet vagy többet tartalmaz.

A találmány szerinti konjugátok és hatóanyagok sok - a radioterápiában és -diagnózisban használt gyógyszerkészítményekkel szemben támasztott - követelménynek tesznek eleget. Megkülönböztető jellemzőjük a szóban forgó célstruktúrákkal szemben mutatott nagy specifikusság, vagyis nagy relatív affinitás. Az ismert oligonukleotidkonjugátokhoz viszonyítva a találmány szerinti oligonukleotidkonjugátoknak igen nagy az in vivő stabilitása. Ezt egyrészt a 2’-hidroxilcsoport helyettesítésével, másrészt azáltal értük el, hogy a nukleotidok terminális hidroxilcsoportjaihoz módosított timidinszekvenciákat csatoltunk. Meglepő módon az oligonukleotid specifikusságát sem ez a módosítás, sem pedig a komplexképző reagenssel történő kapcsolás nem rontotta. További előnyt jelent, hogy a vegyületek a szükséges mértékben kompatibilisek (összeférhetők) és farmakokinetikai tulajdonságaik szabályozhatók.

A találmány további tárgyai, jellemzői és azokkal összefüggő előnyei világosabbá válnak az alábbi rajzok alapján, amelyek közül az 1. ábra a találmány céljára előnyösen alkalmazható K gyűrűs komplexképző reagenseket mutatja; „b”vel jelöltük a B kapcsolókomponens kötési helyét;

a 2. és 3. ábrán a találmány céljára előnyösen alkalmazható nyílt láncú K komplexképző reagensek láthatók.

Az alábbi példák a találmány részletesebb ismertetésére szolgálnak.

A példákban bemutatott polinukleotidok módosított vegyületeket tartalmaznak.

A nukleotidoknál alkalmazott rövidítések jelentése: A, U, C, G a nukleotid egy 2’-OCH₃ csoportot tartalmaz, *: az intemukleotid kötés metil-foszfonát, **: az intemukleotid kötés tiofoszfonát, ***: az intemukleotid kötés ditiofoszfonát.

További magyarázatok nélkül feltételezzük, hogy az átlagosan művelt szakember teljes mértékben használni tudja a fenti leírást és a találmányt. Az itt következő egyedi megvalósítások tehát csak a találmány illusztrálására szolgálnak, annak oltalmi körét semmiféle tekintetben nem korlátozzák.

1. példa

a) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 35-mer oligonukleotid 5 ’-(6-amino-hexil-foszforsav-észtere)

A felülre helyezett, egy t*t*T*T*T-3’ szekvenciával módosított 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3’ 30-mer oligonukleotidot a Pharmacia company automatikus szintetizátorával állítjuk elő [Oligonucleotides and Analogues, A Practical

HU 220 859 Bl roljuk, a maradékot kevés vízben oldva ReillexW ioncserélő oszlopon, vízzel leoldva tisztítjuk. A főfrakciót vákuumban szárazra bepároljuk.

Kihozatal: 39 g üvegszerű szilárd anyag, az elméletinek 10,3%-a.

Víztartalom: 10,3 tömeg%.

Az elemanalízis eredményei (a vízmentes anyagra vonatkoztatva):

Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991]; az oligonukleotid az oszlop szilárd töltetén is jelen van. Az 5’-hidroxicsoportot metilén-dikloridban oldott triklór-ecetsavval megnyitjuk. Az oszlop körülbelül 10 mg 35-mer oligonukleotidot tartalmaz. A kötőcsoport kapcsolására az oszlopot acetonitrilben oldott 50 pmol, az alábbi szakirodalmi helyen: [Nucl. Acids Rés. 16, 2659-2669 (1988)] leírt módon előállított P-(ciano-etil)-N,N-(diizopropil-amino)-6-(trifluor-acetamido)-1 -hexil-foszforamidittel reagáltatjuk. A képződött foszfitot tetrahidrofuránban jóddal teljes mértékben védett foszfotriészterré oxidáljuk. Ezután az oszlopot metanollal, majd vízzel mossuk. A módosított oligonukleotidnak a szilárd hordozóról történő eltávolítására az oszlop tartalmát rázólombikba áttöltjük, 5 ml 30 tömeg%-os ammóniumhidroxid-oldattal keverjük, az edényt lezárjuk, és egy éjszakán át 55 °C-on rázzuk. Ezután a reakcióelegyet 0 °C-ra hűtjük, lecentrifugáljuk, a hordozót 5 ml vízzel mossuk, és az egyesített vizes fázisokat fagyasztva szárítjuk.

Tisztítás céljából a szilárd anyagot 2 ml vízzel felvesszük, 2 ml 0,5M ammónium-acetát-oldattal, majd 10 ml etanollal keverjük, egy éjszakán át -20 °C-on állni hagyjuk, azután lecentrifugáljuk, a maradékot 1 ml -20 °C-os etanollal mossuk, végül vákuumban, szobahőmérsékleten szárítjuk. Ily módon 8 mg színtelen por alakjában megkapjuk a cím szerinti vegyületet.

b) 10-[5-(2-Karboxi-fenil)-2-hidroxi-5-oxo-4-azapentil]-l,4,7-trisz(karboxi-metil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán g (144,3 mmol) l,4,7-trisz(karboxi-metil)1,4,7,10-tetraaza-ciklododekánt (D03A) 250 ml vízben oldunk, és az oldat pH-ját 5M nátrium-hidroxidoldattal 13-ra állítjuk. Ezután 1 óra alatt hozzácsepegtetjük 38,12 g (187,6 mmol) N-(2,3-epoxi-propil)ftálimidnek 100 ml dioxánnal készített oldatát, a reakcióelegyet 24 órán át 50 °C-on keverjük, és a pH-t 5M nátrium-hidroxid-oldat adagolásával 13-on tartjuk. Ezután az oldat pH-ját 10 tömeg%-os sósavoldattal 2-re állítjuk, majd vákuumban szárazra bepároljuk. A maradékot kevés vízben oldva ReillexW [=poli-(4-vinil)-piridin] ioncserélő oszlopon, vízzel leoldva tisztítjuk. A főfrakciót vákuumbepárlással töményítjük, a maradékot végül RP-18-οη [LiChroPrepW/mozgófázis: tetrahidrofürán/metanol/víz gradiens] végzett kromatográfiával tisztítjuk. A főfrakció bepárlásával 63,57 g amorf szilárd anyagot kapunk, ez az elméleti kihozatalnak 71%-a.

Víztartalom: 8,5 tömeg%.

Az elemanalízis eredményei (a vízmentes anyagra

vonatkoztatva):	C%	H%	N%
számított:	52,90	6,57	12,34
mért:	52,65	6,68	12,15.

c) 10-(3-Amino-2-hidroxi-propil)-l,4,7-trisz(karboxi-metil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán

Az lb) példa címe szerinti vegyületből 50 g-ot (88,1 mmol) 300 ml tömény sósavoldatban 24 órán át visszafolyató hűtő alatt forralunk. Ezután szárazra bepá-

	C%	H%	N%
számított:	48,68	7,93	16,70
mért:	48,47	8,09	16,55,

d) 10-[7-(4-Nitro-fenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(karboxi-metil)-4-azaheptil]-l,4,7-trisz(karboximetil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán

14,62 g (34,86 mmol) le) példa szerinti vegyülethez 200 ml dimetil-formamid és 20 ml trietil-amin elegyében 9,84 g (41,8 mmol) 3-(4-nitro-fenil)-glutársavanhidridet adunk, majd vákuumban szárazra bepároljuk. A maradékot izopropil-alkohol és ecetsav 95:5 arányú elegyéből átkristályosítjuk.

Kihozatal: 21,68 g sárgás szilárd anyag, az elméletinek 95%-a.

Víztartalom: 0,9 tömeg%.

Az elemanalízis eredményei (a vízmentes anyagra vonatkoztatva):

	C%	H%	N%
számított:	51,37	6,47	12,84
mért:	51,18	6,58	12,67

e) 10-[7-(4-Amino-fenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(karboxi-metil)-4-azaheptil]-l,4,7-trisz(karboximetil)-l ,4,7,10-tetraaza-ciklododekán

Az ld) példa címe szerinti vegyületből 21,0 g-ot (32,07 mmol) 250 ml metanolban oldunk, és 5 g palládiumkatalizátort (10%-os, aktív szénen megkötött palládium) adunk hozzá. A reakcióelegyet egy éjszakán át hidrogénezzük. A katalizátort leszűrjük, a szűrletet vákuumban szárazra bepároljuk.

Kihozatal: 19,63 g krémszínű szilárd anyag, az elméletinek 98%-a.

Víztartalom: 0,8 tömeg%

Az elemanalízis eredményei (a vízmentes anyagra vonatkoztatva):

	C%	H%	N%
számított:	53,84	6,35	12,60
mért:	53,73	6,45	12,51,

f) 10-[7-(4-Amino-fenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(karboxi-metil)-4-azaheptil]-1,4,7-trisz(karboximetil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán

Az le) példa címe szerinti vegyületből 12,4 g-ot (19,27 mmol) 200 ml vízben oldunk, és 6,64 g (57,8 mmol) tiofoszgént és 50 ml kloroformot adunk hozzá. A reakcióelegyet 1 órán át 50 °C-on keveijük, majd szobahőmérsékletre hűtjük, a szerves fázist elválasztjuk, a vizes fázist 100 ml kloroformmal kétszer kirázzuk. A vizes fázist vákuumban szárazra bepároljuk, a maradékot abszorptív kicsapással 100 ml izopropil-alkoholban kicsapjuk. A szilárd anyagot leszűqük, dietil-éterrel mossuk, és egy éjszakán át vákuumban 40 °C-on szárítjuk. Ily módon 12,74 g (az elméleti kihozatalhoz képest 97%) krémszínű szilárd anyagot kapunk.

HU 220 859 Β1

Víztartalom: 3,1 tömeg%

Az elemanalízis eredményei (a vízmentes anyagra vonatkoztatva):

	C%	H%	N%	S%
számított:	52,24	6,35	12,60	4,81
mért:	52,37	6,44	12,48	4,83

g) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 35-mer oligonukleotid 5’-(6-amino-hexil-foszforsav-észter)-ének a (4-izotiocianáto-fenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(karboxi-metil)-4-azaheptil)-l,4,7-trisz(karboximetil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekánnal képzett konjugátja

Az la) példában kapott oligonukleotidból 8 mg-ot

2,5 ml pH=8-as nátrium-hidrogén-karbonát/nátriumkarbonát pufferben oldunk, és elkeverjük 1 mg 10-[7(4-amino-fenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(karboxi-metil)-4aza-heptil]-1,4,7-trisz(karboxi-metil)-l ,4,7,10-tetraaza-ciklododekánnal [az le) példa címében szereplő vegyület]. A reakcióelegyet 5 órán át szobahőmérsékleten keverjük, pH-ját 0,01M sósavoldat hozzáadásával 7,2re állítjuk, az oldatot egy 3000 kizárási határú (Amicon YM3) membránon ultraszűréssel leszűrjük, majd fagyasztva szárítjuk. 7 mg-ot kapunk a kívánt konjugátból.

h) Az (5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 35-mer oligonukleotid)-5’-(6-amino-hexil-foszforsav-észter) és a 10-[7-(4-izotiocianáto-fenil)-2-hidroxi-5-oxo-7(karboxi-metil)-4-aza-heptil]-l,4,7-trisz(karboxi-metil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán tiokarbamát-konjugátjának ¹¹ 'indiumkomplexe ^1HIndium(llI)-kloridot 2M nátrium-acetát-oldatban oldunk, a pH-ját O,1M sósavoldattal 4,0-re állítjuk, és az így kapott indium(III)-acetát-oldatból 15 μΐ-t (350 pCi) hozzáadunk 135 pl oldathoz, amelyet 1 mg, az lg) példa címe szerinti vegyületből pH=6,2-es MES-pufferrel készítettünk. [MES=2-(N-morfolino)-etil-szulfonsav], Az oldat pH-ját 0,01M sósavoldattal 4,2-re állítjuk, majd 1 órán át 37 °C-on pH=4,2-n keverjük. Ezután a pH-t 2M nátrium-acetát-oldattal 6-ra állítjuk, és 10 μΐ 0,1Μ dinátrium-etilén-diamin-tetraecetsavat adunk hozzá, hogy a 'indium feleslegét komplexbe vigyük. Az így kapott jelzett konjugát (lh vegyület) végső tisztítását HPLC-vel (kizárásos kromatográfia TSK-400/MES pufferben) végezzük. A jelzett konjugátot tartalmazó frakciókat közönséges fiziológiás sóoldattal hígítjuk, a pH-t 0,01M nátrium-hidroxid-oldattal 7,2-re állítjuk, majd az oldatot leszűrjük. Az így kapott oldat radiodiagnózishoz használható készítmény.

2. példa

a) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 5’-(6-amino-l-hexil-foszforsav-észterének) az N-[2-amino-3-(4izotiocianáto-fenil)-propil]-transz-ciklohexánl,2-diamin-N,N’-N’,N”,N”-pentaecetsavvaI képzett konjugátja

Az la) példában kapott oligonukleotidból 8 mg-ot

2,5 ml pH = 8-as nátrium-hidrogén-karbonát/nátriumkarbonát pufferben oldunk, és 1 mg - az alábbi szakirodalmi helyen: [Bioconjugate Chem. 1, 59 (1990)] leírt módon előállított - N-[2-amino-3-(p-izotiocianáto-fenil)-propil]-transz-ciklohexán-1,1-diamin-Ν,Ν’Ν’,Ν’’,Ν’’-pentaecetsavat adunk hozzá. A reakcióelegyet 5 órán át szobahőmérsékleten keverjük, pH-ját 0,lM sósavoldat hozzáadásával 7,2-re állítjuk, az oldatot egy 3000 kizárási határú (Amicon YM3) membránon ultraszűréssel leszűijük, majd fagyasztva szárítjuk. 6 mg-ot kapunk a tiokarbamátkonjugátból [2a) vegyület].

b) Az(5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 35-mer oligonukle otid)-5 ’ -(6-amino-1 -hexil-foszforsav-észter) és az N-[2-amino-3-(4-izotiocianáto-fenil)propil]-transz-ciklohexán-1,1 -diamin-Ν,Ν ’ Ν’,Ν’’,Ν’’-pentaecetsav konjugátjának 212-bizmutkomplexe

Bizmut-tetrajodid 0,lM hidrogén-jodidos oldatának pH-ját 2M ecetsavoldattal 4-re állítjuk. Ennek az oldatnak egy körülbelül 3 mCi-s aliquot részét hozzáadjuk 1 mg, a 2a) példa címe szerinti vegyülethez, amelyet 0,5 ml MES-pufferben oldottunk, és 0,5 ml 0,15M nátrium-klorid-oldatot adunk hozzá. A reakcióelegyet 20 percig szobahőmérsékleten keverjük, majd a pH-t 2M nátrium-acetát-oldattal 6-ra állítjuk, 20 μΐ 0,1Μ dinátrium-etilén-diamin-tetraecetsavat adunk hozzá, és 20 percig keverjük. A komplex végső tisztítását HPLCvel (kizárásos kromatográfia TSK.-400/MES pufferben) végezzük. A radioaktív konjugátot tartalmazó frakciókat egyesítjük, közönséges fiziológiás sóoldattal hígítjuk, a pH-t 0,01M nátrium-hidroxid-oldattal 7,2-re állítjuk, majd az oldatot leszűijük. Az így kapott oldat radiodiagnózishoz használható készítmény.

3. példa

a) Az (5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 35-mer oligonukleotid)-5’-(6-amino-l-hexil-foszforsav-észter) és az N-[2-amino-3-(4-izotiocianáto-fenil)propil]-transz-ciklohexán-l, 1 -diamin-Ν,Ν Ν’,Ν’’,Ν’’-pentaecetsav konjugátjának ¹¹ indiumkomplexe ^lllIndium(lII)-kloridot 2M nátrium-acetát-oldatban oldunk, a pH-ját 0,lM sósavoldattal 4,0-re állítjuk, és az így kapott indium(IIl)-acetát-oldatból 15 μΐ-t (350 pCi) hozzáadunk 0,5 ml oldathoz, amely pH=6,2es MES-pufferben 1 mg, a 2a) példa címe szerinti vegyületet tartalmaz. Az oldat pH-ját 0,01M sósavoldat hozzáadásával 5,0-re állítjuk, majd 1 órán át 37 °C-on pH = 5,0-on keverjük. Ezután a pH-t 2M nátriumacetát-oldattal 6-ra állítjuk, és 10 μΐ 0,1Μ dinátriumetilén-diamin-tetraecetsavat adunk hozzá, hogy a indium feleslegét komplexbe vigyük. Az így kapott jelzett konjugát (lh vegyület) végső tisztítását HPLCvel (kizárásos kromatográfia TSK-400/MES pufferben) végezzük. A jelzett konjugátot tartalmazó frakciókat közönséges fiziológiás sóoldattal hígítjuk, a pHt 0,01M nátrium-hidroxid-oldattal 7,2-re állítjuk, majd az oldatot leszűrjük. Az így kapott oldat radiodiagnózishoz használható készítmény.

HU 220 859 BI

4. példa

a) Az (5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 35-mer oligonukleotid)-5 ’-(6-amino-1 -hexil-foszforsav-észter és a 2-(4-izotiocianáto-benzil)-dietilén-triamin-N,N-N’,N”,N”-pentaecetsav konjugátja

Az la) példában kapott oligonukleotidból 8 mg-ot

2,5 ml pH=8-as nátrium-hidrogén-karbonát/nátriumkarbonát pufferben oldunk, és 1 mg - az alábbi szakirodalmi helyen: [Bioconjugate Chem. 2, 187 (1991)] leírt módon előállított - 2-(4-izotiocianáto-benzil)-dietilén-triamin-N,N-N’,N”,N”-pentaecetsavat adunk hozzá. A reakcióelegyet 5 órán át szobahőmérsékleten keverjük, pH-ját 0,01M sósavoldat hozzáadásával 7,2-re állítjuk, az oldatot egy 3000 kizárási határú (Amicon YM3) membránon ultraszűréssel leszűrjük, majd fagyasztva szárítjuk. Ily módon 6 mg-ot kapunk a tiokarbamátkonj ugátból.

b) Az (5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 35-mer oligonukleotid)- 5 ’-(6-amino-1 -hexil-foszforsav-észter) és a 2-(4-izotiocianáto-benzil)-dietilén-triaminN,N-N’,N”,N”-pentaecetsav konjugátjának yttrium-90 komplexe

A 4a) példa szerinti tiokarbamátszármazékból 1 mg-ot 0,5 ml pH=6-os ammónium-acetát-oldatban oldunk, hozzáadunk körülbelül 380 mCi, 0,05M ammónium-acetát-oldatban oldott yttriumot, az oldat pH-ját 3M ecetsavoldattal 5,2-re állítjuk, 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd a pH-t 0,01M nátriumacetát-oldattal 7,0-re állítjuk. A konjugátot HPLC-vel (TSK-400/MES pufferben) tisztítjuk. A főfrakciókat egyesítjük, közönséges fiziológiás sóoldattal hígítjuk, a pH-t 0,01M nátrium-hidroxid-oldattal 7,2-re állítjuk, majd az oldatot leszűrjük. Ily módon radiodiagnózishoz használható készítményt kapunk.

5. példa

a) Az 5’-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGAAAUGAGAUU-3’ 35-mer oligonukleotid (módosított ligandum szerin proteázhoz) 5 ’ -(6-merkapto-1 -hexil-foszforsav-észtere)

Az 5,270,163 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban 13. szekvenciaazonosító számon szereplő, SELEX eljárással azonosított, a cukoregységeken és egy 5 timidinből álló, az 5’-helyhez kötött szekvenciával módosított 5’-AGGAGGAGGAGGGAGAGCGAAAUGAGAUU-3’ 30-mer oligonukleotidot állítunk elő a szokásos módon, a Pharmacia Company automatikus szintetizátorával [Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991]; az oligonukleotid az oszlop szilárd töltetén is jelen van. Az 5’-hidroxicsoportot metilén-dikloridban oldott triklór-ecetsavval megnyitjuk. Az oszlopba körülbelül 10 mg 35-mer oligonukleotidot töltünk be. A kötőcsoport kapcsolására az oszlopot acetonitrilben, tetrazol jelenlétében 50 pmol P-(ciano-etil)-N,N-(diizopropil-amino)-S-tritil-6-merkapto-foszfor-amiditet tartalmazó oldattal reagáltatjuk. A képződött foszfitot tetrahidrofuránban jóddal teljes mértékben védett foszfotriészterré oxidáljuk. Ezután az oszlopot metanollal, majd vízzel mossuk. A módosított oligonukleotidnak a szilárd hordozóról történő eltávolítására az oszlop tartalmát rázólombikba áttöltjük, 5 ml 30 tömeg%os ammónium-hidroxid-oldattal keverjük, az edényt lezárjuk, és egy éjszakán át 55 °C-on rázzuk. Ezután 0 °C-ra hűtjük, lecentrifugáljuk, a hordozót 5 ml vízzel mossuk, és az egyesített vizes fázisokat fagyasztva szárítjuk.

Tisztítás céljából a szilárd anyagot 2 ml vízzel felvesszük, 2 ml 0,5M ammónium-acetát-oldattal, majd 10 ml etanollal keverjük, egy éjszakán át -20 °C-on állni hagyjuk, azután lecentrifugáljuk. A maradékot 1 ml -20 °C-os etanollal mossuk, végül vákuumban, szobahőmérsékleten szárítjuk.

mg-ot kapunk a cím szerinti S-tritilezett vegyületből. A tritil védőcsoport lehasítására a vegyületet 0,5 ml vízben oldva 0,1 ml 1M ezüst-nitrát-oldattal 1 órán át szobahőmérsékleten keveijük, majd 0,1 ml 1M ditio-treitol-oldatot adunk hozzá. 15 perc elteltével lecentrifugáljuk, és a felülúszót néhányszor etil-acetáttal extraháljuk. A vizes oldatból fagyasztó szárítás után 8 mg kívánt vegyületet kapunk.

b) 4-benzoil-oxi-N-metánszulfonil-fenil-alaninmetil-észter g 4-benzoil-oxi-fenil-alanin-metil-észter-hidrokloridot 300 ml piridinben oldunk, 0 °C-on belecsepegtetünk 19,58 g metánszulfonsav-kloridot, és 3 órán át 0 °C-on keverjük. Ezután a reakcióelegyet vákuumban szárazra bepároljuk, a maradékot 500 ml metiléndikloridban oldjuk, kétszer 300 ml 5M sósavoldattal kirázzuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, és vákuumbepáTolással töményítjük. A maradékot 150 ml metanolból átkristályosítjuk.

Kihozatal: 53,64 g színtelen kristályos por.

c) 2-(4-Benzil-oxi-benzil)-1 -metánszulfonil-1,4,7triaza-heptan-3-on

37,2 g 4-benzil-oxi-N-metánszulfonil-fenil-alaninmetil-észtert 1,2 liter 1,2-diamino-etánban 3 órán át 80 °C-on keverünk. A kapott anyagot vákuumban szárazra bepároljuk, és abszorptív kicsapással 200 ml vízzel kicsapjuk. A csapadékot vákuum alatt leszűrjük, vízzel semlegesre mossuk, és egy éjszakán át 60 °C-on szárítjuk.

Kihozatal: 37,68 g krémszínű amorf por.

d) 2-(4-Benzil-oxi-benzil)-l-metánszulfonil-7-(tercbutoxi-karbonil)-1,4,7-triaza-heptan-3-on

16,23 g 2-(4-benzil-oxi-benzil)-l-metánszulfonill,4,7-triaza-heptan-3-ont és 4,76 g trietil-amint 200 ml kloroformban oldunk, és 0 °C-on összekeverjük 10,27 g diterc-butil-dikarbonátnak 50 ml kloroformmal készített oldatával. A reakcióelegyet 5 órán át szobahőmérsékleten keverjük, azután 5 tömeg%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és vízzel kirázzuk, magnéziumszulfáton szárítjuk, és vákuumban szárazra bepároljuk. A maradékot 100 ml metanolból átkristályosítjuk.

Kihozatal: 20,19 g habos szilárd anyag.

e) 2-(4-Hidroxi-benzil)-1 -metánszulfonil-7-(tercbutoxi-karbonil)-l,4,7-triaza-heptan-3-on

HU 220 859 Bl g 2-(4-benzil-oxi-benzil)-l-metánszulfonil-7(terc-butoxi-karbonil)-l,4,7-triaza-heptan-3-ont 300 ml metilén-dikloridban oldva 4 g 10%-os, aktív szénen megkötött palládiummal egy éjszakán át hidrogénatmoszférában keverünk. Ezután a reakcióelegyet leszűrjük, és az oldatot vákuumban bepároljuk.

Kihozatal: 16,17 g üvegszerű hab, amely pár perc alatt megszilárdul.

f) 2-[4-(3-Oxa-propionsav-benzil-észter)-benzil]l-metánszulfonil-7-(terc-butoxi-karbonil)1,4,7-triaza-heptan-3-on g 2-(4-hidroxi-benzil)-l-metánszulfonil-7-(tercbutoxi-karbonil)-l,4,7-triaza-heptan-3-on, 8,56 g (bróm-ecetsav)-benzil-észter és 13,18 g káliumkarbonát keverékét 300 ml acetonitrilben 24 órán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk, majd leszűrjük, és vákuumban szárazra bepároljuk. A maradékot 200 ml metilén-dikloridban oldva kétszer 50 ml vízzel kirázzuk. A szerves fázist magnézium-szulfáton szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. A maradékot kromatográfiával tisztítjuk, ehhez eluensként metilén-diklorid, hexán és aceton 20:10:1 arányú elegyét alkalmazzuk.

Kihozatal: 10,06 g habos szilárd anyag.

g) 2-[4-(3-Oxa-propionsav-benzil-észter)-benzil]1 -metánszulfonil-1,4,7-triaza-heptan-3 -on g 2-[4-(3-oxa-propionsav-benzil-észter)-benzil]1 -metánszulfonil-7-(terc-butoxi-karbonil)-1,4,7-triazaheptan-3-ont szobahőmérsékleten 1 órán át 100 ml trifluor-ecetsavval keverünk, majd vákuumban szárazra bepároljuk.

Kihozatal: 9,2 g üvegszerű hab, amely állás közben megszilárdul.

h) 9-Klór-1 -metánszulfonil-2-[4-(3-oxa-propionsav-benzil-észter)-benzilj-1,4,7-triaza-3,8-dion g 2-[4-(3-oxa-propionsav-benzil-észter)-benziljl-metánszulfonil-l,4,7-triaza-heptan-3-ont és 1,78 g trietil-amint 200 ml kloroformban oldunk, 30 perc alatt 0 °C-on belecsepegtetünk 20 ml kloroformban oldott 1,98 g klór-acetil-kloridot, majd 2 órán át 0 °C-on keverjük. Ezután 100 ml 5%-os sósavoldattal, majd kétszer 50 ml vízzel mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, és vákuumban szárazra bepároljuk. A maradékot szilikagél oszlopon, eluensként metilén-diklorid és etilacetát 20:1 arányú elegyét alkalmazva kromatográfiával tisztítjuk.

Kihozatal: 6,97 g viasszerű szilárd anyag.

i) 9-Klór-l-metánszulfonil-2-[4-(3-oxa-propionsav-benzil-észter)-benzil]-l,4,7-triaza-3,8-dion

6,5 g 9-klór-l-metánszulfonil-2-[4-(3-oxa-propionsav-benzil-észter)-benzil]-l,4,7-triaza-3,8-diont 150 ml metilén-dikloridban oldva 2 g 10%-os, aktív szénen megkötött palládiummal egy éjszakán át hidrogénatmoszférában keverünk. Ezután a reakcióelegyet leszűrjük, és az oldatot vákuumban bepároljuk.

Kihozatal: 5,33 g üvegszerű szilárd anyag.

j) 10-Acetil-2-[4-(3-oxa-propionsav-benzil)]-lmetánszulfonil-10-tia-l,4,7-triaza-dekán-3,8dion g 9-klór-l-metánszulfonil-2-[4-(3-oxa-propionsav-benzil-észter)-benzil]-l,4,7-triaza-3,8-diont 80 ml kloroformban oldva 1,98 g trietil-aminnal és 0,74 g tioecetsavval 10 percig visszafolyató hűtő alatt forralunk. Ezután az oldatot 200 ml jéghideg 5%-os sósavoldatba öntjük, a szerves fázist elválasztjuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, és vákuumban szárazra bepároljuk. Szilikagélen, hexán és etil-acetát 3:1 arányú elegyével végzett kromatográfia után 4,64 g üvegszerű szilárd anyag alakjában megkapjuk a kívánt vegyületet.

k) 10-Acetil-2- {4-[3-oxa-propionsav-(2,5-dioxopirrolidin-1 - i 1)-és zter ]-benzi 1} -1 -metánszulfonil-1 0-tia-1,4,7-triaza-dekán-3,8-dion ml kloroformban 4 g 10-acetil-2-[4-(3-oxa-propionsav-benzil)]-1-metánszulfonil-l 0-tia-1,4,7-triaza-dekán-3,8-diont, 1,91 g N,N’-diciklohexil-karbodiimidet, 4 g N-hidroxi-szukcinimidet és 30 mg 4-(dimetil-amino)-pirrolidint szobahőmérsékleten 24 órán át keverünk. Ezután 20 ml dietil-éterrel keverjük, leszűrjük, és a maradékot vákuumban szárazra bepároljuk. A maradékot szilikagélen, eluensként metiléndiklorid és dioxán 10:1 arányú elegyét alkalmazva tisztítjuk.

Kihozatal: 3,47 g krémszínű szilárd anyag.

Az elemanalízis eredményei:

	C%	H%	N%	S%
számított:	46,15	4,93	9,78	11,20
mért:	46,03	4,83	9,64	11,05

1) 10-Acetil-2- {4-[3-oxa-propionsav-(6-maleimido-hexanoil)-hidrazid]-benzil} -1 -metánszulfonil- 10-tia-1,4,7-triaza-dekán-3,8-dion g 10-acetil-2-{4-[3-oxa-propionsav-(2,5-dioxopirrolidin-l-il)-észter]-benzil}-l-metánszulfonil-10tia-l,4,7-triaza-dekán-3,8-diont és 1,17 g 6-maleimidokapronsav-hidrazidot [Science, 261, 212 (1993)] 40 ml dimetil-formamidban 5 órán át 60 °C-on keverünk. Erőteljes keverés közben 100 ml vizet csepegtetünk bele, majd a kivált csapadékot leszűrjük, vákuumban szárítjuk, és a maradékot szilikagél oszlopon végzett gyorskromatográfiával, eluensként metilén-diklorid és dioxán 10:1 arányú elegyét alkalmazva tisztítjuk, így

2,8 g fehér szilárd anyag alakjában megkapjuk a cím szerinti vegyületet.

Az elemanalízis eredményei:

	C%	H%	N%	S%
számított:	49,25	5,61	12,30	9,39
mért:	49,33	5,95	12,43	9,11

m) Az (5’-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGAAAUGAGAUU-3’ 35-mer oligonukleotid)-5’-(6-merkapto-l-hexil-foszforsavészter) és a 10-acetil-2-{4-[3-oxa-propionsav(6-maleimido-hexanoil)-hidrazid]-benzil}-lmetánszulfonil-10-tia-l,4,7-triaza-dekán-3,8dion konjugátja ml pH=7,4-es foszfátpufferben 5 mg, az 5a) példa szerinti módon előállított kéntartalmú oligonukleotidot 0,2 ml dimetil-formamidban oldott 1 mg, az 51) példa szerinti módon előállított maleimid-származékkal keverünk nitrogénatmoszférában. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 2 órán át állni hagyjuk, ultraszűréssel 3000-es kizárási határú Amicon YM3 membránon le15

HU 220 859 Bl szüljük, majd fagyasztva szárítjuk. Ily módon 5 mg-ot kapunk a kívánt konjugátból.

n) Az (5’-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGAAAUGAGAUU-3’ 35-mer oligonukleotid)-5’-(6-merkapto-l-hexil-foszforsavészter) és a 10-acetil-2-{4-[3-oxa-propionsav(6-maleimido-hexanoil)-hidrazid]-benzil} -1 -metánszulfonil-10-tia-1,4,7-triaza-dekán-3,8-dion konjugátjának ^99mtechnéciumkomplexe mg/1 kálium-D-glukarátot és 100 pg/ml ón(II)kloridot tartalmazó 0,2M nátrium-hidrogén-karbonátoldatból 1 ml-t fagyasztva szárítunk egy lombikban, majd elkeverjük 1 ml (1 mCi), Mo-99/Tc99 generátorból származó [Tc-99m]-nátrium-pertechnatát-oldattal. A keveréket szobahőmérsékleten 15 percig állni hagyjuk, majd egy aliquot részt kiveszünk, és azonos térfogatú 0,2M nátrium-hidrogén-karbonát-oldatban 1 mg/ml 5m) példa szerinti konjugátot tartalmazó oldattal elkeverjük. 15 perc múlva mind a vékonyréteg-kromatográfia, mind pedig a HPLC (nagynyomású folyadékkromatográfia) azt mutatja, hogy a konjugát 98%nál több radioaktivitást vett fel.

6. példa

a) Az (5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 35-mer oligonukleotid)-5 ’-(6-amino-1 -hexil-foszforsav-észter) és az S-benzoil-MAG₃-2,3,5,6-tetrafluor-fenilészter konjugátja

Az la) példa címe szerinti vegyületből 8 mg-ot 0,5 ml 0,1 M pH=7-es foszfátpufferben oldunk, hozzáadunk 3 mg, az US 4,965,392 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerinti módon előállított S-benzoil-MAG₃-2,3,5,6-tetrafluor-fenil-észtert 0,2 ml dimetil-formamidban oldva, és 3 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután az oldatot vízzel hígítjuk, ultraszűréssel (Amicon YM3, kizárási határa 3000) leszűrjük, majd fagyasztva szárítjuk. Ily módon 5 mg 6a) konjugátot kapunk.

b) Az (5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 35-mer oligonukleotid)-5’-(6-amino-l-hexil-foszforsav-észter) és az S-benzoil-MAG₃-2,3,5,6-tetrafluorfenil-észter konjugátjának ^99mtechnéciumkomplexe

A 6a) példa címe szerinti vegyületből 1 mg-ot 200 pl vízben oldunk, és 1 ml 0,lM pH=8,5-ös foszfátpufferrel keverjük. Ehhez a keverékhez 200 pl (körülbelül 15 mCi) ^99mtechnécium(V)-glukonát-oldatot adunk, és szobahőmérsékleten 15 percig állni hagyjuk. A nyomjelző izotóp HPLC-vel meghatározott kihozatala körülbelül 95%.

7. példa

a) Az (5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 35-mer oligonukleotid)-5 ’ -(6-amino-1 -hexil-foszforsav-észter)nek a 2,3,5,6-(tetrafluor-fenil)-4,5-bisz(merkapto-acetamido)-pentasav-észter ^99mtechnéciumkomplexével képzett konjugátja

Az la) példa címe szerinti vegyületből 3 mg-ot 0,6 ml foszfátpufferben oldunk, hozzáadunk körülbelül 100 mCi, az alábbi szakirodalmi helyen: [J. Nucl. Med. 32, 1445 (1991)] leírt módon előállított, 2 ml pH=7,2 -es foszfátpufferben oldott 2,3,5,6-(tetrafluorfenil)-4,5-bisz(merkapto-acetamido)-pentásav-észter^99mtechnécium-komplexet. Az oldat pH-ját l,0M kálium-karbonát-pufferrel 10-re állítjuk, majd szobahőmérsékleten 20 percig keverjük. Végső tisztítás céljából az oldatot Sephadex (Pharmacia) oszlopra töltjük, és 75 mmol nátrium-klorid-oldattal eluáljuk. A főfrakciókat egyesítjük, közönséges fiziológiás sóoldattal hígítjuk, majd leszűrjük. Ily módon radiodiagnosztikai vizsgálatokhoz használható készítményt kapunk.

8. példa

a) Az (5’-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGG AGAGCGCAAAUGAGAUU-3’ 35-mer oligonukleotid)-5 ’ -(6-amino-1 -hexil-foszforsav-észter)-nek az 5’-(N-maleimido)-3-oxa-pentil-{2[3-(karboxi-benzoil)-tio]-acetil}-glicil-glicil-glicináttal képzett konjugátja ml pH=7,4-es foszfátpufferben 5 mg, az 5a) példa szerinti kéntartalmú oligonukleotidot 0,2 ml dimetilformamidban oldott 1 mg, az alábbi szakirodalmi helyen: [Bioconj. Chem. 1., 431 (1990)] leírt módon előállított 5-(N-maleimido)-3-oxa-pentil-[2-(3-karboxibenzoil)-tio]-acetil} -glici 1 -glicil-glicináttal keverünk nitrogénatmoszférában. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 2 órán át állni hagyjuk, ultraszűréssel 3000-es kizárási határú Amicon YM3 membránon leszűrjük, majd fagyasztva szárítjuk. Ily módon 5 mg-ot kapunk a kívánt konjugátból.

b) Az (5’-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3’ 35-mer oligonukleotid)-5 ’-(6-amino-1 -hexil-foszforsav-észter) 5’-(N-maleimido)-3-oxa-pentil-{2-[3-(karboxibenzoil)-tio]-acetil}-glicil-glicil-glicináttal képzett konjugátjának ^99mtechnéciumkomplexe mg/1 kálium-D-glukarátot és 100 pg/ml ón(ll)kloridot tartalmazó 0,2M nátrium-hidrogén-karbonátoldatból 1 ml-t fagyasztva szárítunk egy lombikban, majd elkeveijük 1 ml (1 mCi), Mo-99/Tc99 generátorból származó [Tc 99m]-nátrium-pertechnatát-oldattal. A keveréket szobahőmérsékleten 15 percig állni hagyjuk, majd egy aliquot részt kiveszünk, és azonos térfogatú 0,2M nátrium-hidrogén-karbonát-oldatban 1 mg/ml, a 8a) példa szerinti konjugátot tartalmazó oldattal elkeverjük. A termék fagyasztva szárítással izolálható. A nyomjelző izotóp HPLC-vel meghatározott kihozatala >96%.

9. példa

a) Az (5’-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3’ 35-mer oligonukleotid)-5’-(6-amino-l-hexil-foszforsav-észter)nek az l-{6-[2-vinil-6-(hexil-oxi-metil)]-piridin}-1,4,8,11-tetraaza-ciklotetradekánnal képzett konjugátja

HU 220 859 Β1 ml pH=7,4-es foszfátpufferben oldott 4 mg, az 5a) példa szerinti kéntartalmú oligonukleotidot 0,5 ml dimetil-formamidban oldott 1 mg, az EP 0,588,229 számú európai szabadalmi leírás szerinti módon előállított 1 - {6-[2-vinil-6-(hexil-oxi-metil)]-piridin} -1,4,8,11tetraaza-ciklotetradekánnal keverünk nitrogénatmoszférában. A reakcióelegyet 35 °C-on 4 órán át keveijük, majd 10 ml etanollal kezeljük, és centrifugálással elválasztjuk. A tisztítást fordított fázisú kromatográfíával 1 χ 25 cm-es oszlopon, 50 mmol pH=7-es trietil-ammónium-acetát/acetonitril gradienssel végezzük. Az egyesített frakciókat fagyasztva szárítjuk, 1 ml vízben oldjuk, majd Sephadex G-10 oszlopon sómentesítjük. A cím szerinti vegyületet fagyasztva szárítással izoláljuk.

b) Az (5’-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3’ 35-mer oligonukleotid)-5’-(6-amino-l-hexil-foszforsav-észter) és az l-{6-[2-vinil-6-(hexil-oxi-metil)]-piridin}-l,4,8,l 1-tetraaza-ciklotetradekán konjugátjának ^99mtechnéciumkomplexe

Az eljárást a 8b) példában leírt módon hajtjuk végre. A nyomjelző izotóp HPLC-vel meghatározott kihozatala 92%.

10. példa

a) Az (5’-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3’) 35-mer oligonukleotid)-5’-(6-amino-l-hexil-foszforsav-észter) és az N-[4-hidroxi-3-(l,4,8,ll-tetraaza-ciklotetradec-5-il)-benzil]-2-(6-vinil-piridin-2-il-metoxi)-acetamid konjugátja ml pH = 8,0-as foszfátpufferben oldott 6,5 mg, az 5a) példa szerinti kéntartalmú oligonukleotidot nitrogénatmoszférában összekeverünk 0,1 ml dimetilformamidban oldott 1,2 mg, az az alábbi szakirodalmi helyen: [J. Chem. Soc., Chem. Commun. 156 (1988)] leírt módon előállított N-[4-hidroxi-3-(l,4,8,ll-tetraaza-ciklotetradec-5-il)-benzil]-2-(6-vinil-piridin-2-ilmetoxi)-acetamiddal. A reakcióelegyet nitrogénatmoszférában 35 °C-on 4 órán át keverjük, majd 10 ml etanollal keverjük, és centrifügálással elválasztjuk. A tisztítást fordított fázisú kromatográfíával 1 χ 25 cm-es oszlopon, 50 mmol pH=7-es trietil-ammónium-acetát/acetonitril gradienssel végezzük. Az egyesített frakciókat Sephadex G-10 oszlopon sómentesítjük, majd fagyasztva szárítjuk, így 5 mg fehér por alakjában megkapjuk a cím szerinti vegyületet.

b) Az (5’-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3’) 35-mer oligonukleotid)-5’-(6-amino-l-hexil-foszforsavészter) és az N-[4-hidroxi-3-(l,4,8,ll-tetraazaciklotetradec-5-il)-benzil]-2-(6-vinil-piridin-2il-metoxi)-acetamid konjugátjának réz-64komplexe

A 10a) példában kapott konjugátból 1 mg-ot 1 ml pH = 8-as foszfátpufferben ⁶⁴CuCl₂-vel (0,2 mCi) inkubálunk. A nyomjelző izotóp HPLC-vel 1 óra múlva meghatározott kihozatala >98%. A terméket fagyasztva szárítással izoláljuk.

11. példa

a) Az (5’-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3’) 35-mer oligonukle o tid)-5 ’ -(6-amino-1 -hexil-foszforsav-észter) és az l,4,7,10-tetraaza-ciklotetradekán-2-[(5aza-8-maleimido-6-oxo)-oktán-1,4,7,10-tetraecetsav konjugátja mg 5a) példa szerinti kéntartalmú oligonukleotidot 2 ml pH = 8-as foszfátpufferben oldunk, és nitrogénatmoszférában hozzáadunk 1 mg, az az alábbi szakirodalmi helyen: [J. Chem. Soc., Chem. Commun. 796 (1989)] leírt módon előállított 1,4,7,10-tetraazaciklotetradekán-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-oktán1,4,7,10-tetraecetsavat. A reakcióelegyet 35 °C-on 3 órán át keverjük, majd 10 ml izopropil-alkohollal keverjük, és centrifugálással elválasztjuk. A tisztítást fordított fázisú kromatográfíával 1x25 cm-es oszlopon, 25 mmol pH=7-es trietil-ammónium-acetát/acetonitril gradienssel végezzük. Az egyesített frakciókat vákuumban enyhén bepároljuk, kevés vízben feloldjuk, Sephadex G-10 oszlopon sómentesítjük, majd fagyasztva szárítjuk, igy 4 mg fehér por alakjában megkapjuk a cím szerinti vegyületet.

b) Az (5’-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGAAAUGAGAUU-3’) 35-mer oligonukleotid)-5’-(6-amino-l-hexil-foszforsav-észter) és az l,4,7,10-tetraaza-ciklotetradekán-2-[(5aza-8-maleimido-6-oxo)-oktán-1,4,7,10-tetraecetsav konjugátjának yttrium-90-komplexe mCi ⁹⁰Y-acetátot 1 ml 0,05M ammónium-acetátban oldva összekeverünk 1 mg, a 11a) példában előállított konjugáttal, és egy órán át 85 °C-on melegítjük. A nyomjelző izotóp HPLC-vel meghatározott kihozatala >95%. A terméket fagyasztva szárítással izoláljuk.

12. példa

a) Az (5’-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3’) 35-mer oligonukleotid)-5 ’ -(6-amino-1 -hexil-foszfonsav-észter) és az 1,4,7-triaza-ciklononán-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-oktán-l,4,7-triecetsav konjugátja mg 5a) példa szerinti kéntartalmú oligonukleotidot 2 ml pH=8-as foszfátpufferben oldunk, és nitrogénatmoszférában hozzáadunk 1 mg, az alábbi szakirodalmi helyen: [J. Chem. Soc., Chem. Commun. 794 (1989)] leírt módon előállított 1,4,7-triaza-ciklononán-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-oktán-1,4,7triecetsavat. A reakcióelegyet 35 °C-on 6 órán át keverjük, majd 10 ml izopropil-alkohollal keverjük, és centrifügálással elválasztjuk. A tisztítást fordított fázisú kromatográfiával 1 x25 cm-es oszlopon, 25 mmol pH=7es trietil-ammónium-acetát/acetonitril gradienssel végezzük. Az egyesített frakciókat vákuumban enyhén bepároljuk, kevés vízben feloldjuk, Sephadex G-10 oszlopon sómentesítjük, majd fagyasztva szárítjuk, így 3 mg fehér por alakjában megkapjuk a cím szerinti vegyületet.

b) Az (5’-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3’ 35-mer oligonukleotid)-5 ’-(6-amino-1-hexil-foszfonsav17

HU 220 859 Bl észter) és az l,4,7-triaza-ciklononán-2-[(5-aza8-maleimido-6-oxo)-oktán-1,4,7-triecetsav konjugátjának gallium-67-komplexe

A 12a) példa szerinti módon előállított konjugátból 20 mg-ot 0,5 ml O,1M pH=4,5-os citrátpufferben oldunk, elkeverjük 0,1 ml (0,2 mCi) gallium-67citrát-oldattal, és szobahőmérsékleten 2 órán át állni hagyjuk. Az így kapott terméket Sephadex G-10 oszlopon sómentesítjük, majd fagyasztva szárítjuk, így 17 mg fehér por alakjában megkapjuk a cím szerinti vegyületet.

13. példa

a) Az 5’-O-(4,4’-dimetoxi-tritil)-5-(prop-2-en-lon)-2 ’ -dezoxi-uridin foszfitilezése

2,1 g (3,59 mmol), az alábbi szakirodalmi helyen: [Nucleosides Nucleotides 13, 939-944 (1994)] leírt módon előállított 5’-O-(4,4’-dimetoxi-tritil)-5-(prop-2en-l-on)-2’-dezoxi-uridint 50 ml tetrahidrofuránban oldunk, és keverés közben egymás után hozzáadunk 50 mg dimetil-amino-piridint, 3 ml diizopropil-etilamint és 962 pl (4,31 mmol) 2-ciano-etil-N,N-(diizopropil-klór-foszfor-amidit)-et. Körülbelül 30 perc múlva fehér csapadék válik ki. Ezt leszűijük, az oldatot vákuumban bepároljuk, a maradékot metilén-diklorid és 5 tömeg%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldat között megosztjuk. A metilén-dikloridos fázist magnéziumszulfáton szárítjuk, és vákuumbepárlással töményítjük. Az így kapott maradékot szilikagélen gyorskromatográftával tisztítjuk, eluensként metilén-diklorid, hexán és diizopropil-etil-amin 80:18:2 arányú elegyét alkalmazzuk, így 1,8 g fehér hab alakjában megkapjuk a cím szerinti vegyületet.

Az elemanalízis eredményei:

	C%	H%	N%	P%
számított:	64,28	6,29	7,14	3,95
mért:	64,02	6,60	7,21	4,09

b) Az UT*T*T*TCUCAUGGAGCCAAGGACGAAUAGGUACAUA-3’) 36-mer oligonukleotid és a 10-[4-aza-2-hidroxi-5-imino-8-merkapto-oktán-1,4,7-trisz(karboxi-metil)-1,4,7,10tetraaza-ciklododekán konjugátja

U: 5-(prop-2-en-l-on)-2’-dezoxi-uridin A SELEX eljárással azonosított, az 5’-helyhez kötött 5’-T*T*T* T szekvenciával módosított 30-mer oligonukleotidot a szokásos módon, a Pharmacia company automatikus szintetizátorával [Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991] állítjuk elő; az oligonukleotid az oszlop szilárd töltetén is jelen van. Az 5’-hidroxicsoportot metiléndikloridban oldott triklór-ecetsavval megnyitjuk. Az oszlopba körülbelül 10 mg 35-mer oligonukleotidot töltünk be. Az 5’-hidroxicsoportot tetrazol jelenlétében a 13a) példában kapott foszfor-amidittel reagáltatjuk. Ezután a foszfitot jódoldatos kezeléssel foszfotriészterré alakítjuk át, és a terminális DMT csoportot metiléndikloridban triklór-ecetsav-oldattal végrehajtott reakcióval lehasítjuk. Hogy a terminális 2’-dezoxi-uridincsoporton található α,β-telítetlen karbonil-rendszerhez egy tiolcsoportot adjunk hozzá, a terméket 10-[4-aza-2hidroxi-5-imino-8-merkapto-oktán-l,4,7-trisz(karboximetil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán - előállítását a későbbiekben ismertetjük - tetrahidrofurános oldatával reagáltatjuk, és metanollal, majd vízzel mossuk. A módosított oligonukleotidnak a szilárd hordozóról történő eltávolítására az oszlop tartalmát rázólombikba áttöltjük, 5 ml 30 tömeg%-os ammónium-hidroxidoldattal keveijük, az edényt lezárjuk, és egy éjszakán át 55 °C-on rázzuk. Ezután 0 °C-ra hűtjük, lecentrifugáljuk, a hordozót 5 ml vízzel mossuk, és az egyesített vizes fázisokat fagyasztva szárítjuk.

Tisztítás céljából a szilárd anyagot 2 ml vízzel felvesszük, 2 ml 0,5M ammónium-acetát-oldattal, majd 10 ml etanollal keverjük, egy éjszakán át -20 °C-on állni hagyjuk, azután lecentrifugáljuk. A maradékot 1 ml -20 °C-os etanollal mossuk, végül vákuumban, szobahőmérsékleten szárítjuk.

mg-ot kapunk a cím szerinti vegyületből színtelen por alakjában.

A 10-[4-aza-2-hidroxi-5-imino-8-merkapto-oktán1,4,7-trisz(karboxi-metil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekánt a következőképpen állítjuk elő:

1,46 g (3,49 mmol) 10-(3-amino-2-hidroxipropil)-l,4,7-trisz(karboxi-metil)-l,4,7,10-tetraazaciklododekánt [az le) példa szerinti vegyület] 50 ml víz és 50 ml metanol elegyében oldunk, hozzáadunk 15,7 ml 1M nátrium-hidroxid-oldatot és 480 mg (3,49 mmol) 2-imino-tetrahidrotiofén-hidrokloridot, 3 órán át szobahőmérsékleten keverjük, vákuumban eredeti térfogatának körülbelül 1/4-ére bepároljuk, majd IRA 410 anioncserélő gyantával addig keverjük, míg a pH = ll-et el nem éri. Ekkor az oldatot leszűrjük, és keverés közben kis részletekben pH = 3,5 eléréséig adunk hozzá IRC 50 kationcserélőt. Leszűrés után az oldatot fagyasztva szárítjuk, így 1,39 g fehér por alakjában megkapjuk a kívánt anyagot; víztartalma 4,9 tömeg%.

Az elemanalízis eredményei:

	C%	H%	N%	S%
számított:	48,45	7,74	16,14	6,16
mért:	48,30	7,98	16,05	6,44

c) Az UT*T*T*TCUCAUGGAGCCAAGGACGAAUAGCUACAUA-3’) 36-mer oligonukleotid és a 10-[4-aza-2-hidroxi-5-imino-8-merkapto-oktán-1,4,7-trisz(karboxi-metil)-1,4,7,10tetraaza-ciklododekán konjugátjának yttrium90-komplexe

0,5 ml 0,05M, pH=6-os ammónium-acetátban 1 mg 13b) példa szerinti tioszármazékhoz 0,05M ammónium-acetátban oldott ⁹⁰yttriumot adunk (körülbelül 380 mCi), a pH-t 3M ecetsavval 5,2-re állítjuk, és a reakcióelegyet 1 órán át szobahőmérsékleten keveijük. Ezután a pH-t 0,01M nátrium-hidroxid-oldattal 7,0-ra állítjuk, és a konjugátot HPLC-vel (TSK-400/MES pufferben) tisztítjuk. A főfrakciókat egyesítjük, közönséges fiziológiás sóoldattal hígítjuk, és a pH-t 0,01M nátrium-hidroxid-oldattal 7,2-re állítjuk, majd az oldatot leszűrjük. Az így kapott készítmény radioterápiához használható.

HU 220 859 Bl

14. példa

a) [S-[(Trifenil-metiI)-(merkapto-acetil)]-glicilglicin-metil-észter

3,34 g (10 mmol) S-(trifenil-metil)-merkaptoecetsavat és 1,83 g (10 mmol) glicil-glicin-metil-észtert 250 ml abszolút metilén-dikloridban szuszpendálunk, 101 g (10 mmol) trietil-amint adunk hozzá, majd jéghűtés közben 50 ml abszolút metilén-dikloridban oldott 2,06 g (10 mmol) diciklohexil-karbodiimidet csepegtetünk bele. A reakcióelegyet 1 órán át 0 °C-on, majd 18 órán át szobahőmérsékleten keverjük, azután leszűrjük, bepároljuk, és szilikagélen kromatográfiával tisztítjuk (eluens: metilén-diklorid/metanol: 10%: 30%).

Kihozatal: 3,56 g fehér por, az elméletinek 77,0%-a.

Az elemanalízis eredményei:

	C%	H%	N%	0%	S%
számított:	67,51	5,67	6,06	13,84	11,20
mért:	67,37	6,02	5,91		6,73

b) {S-[(Trifenil-metil)-(merkapto-acetil)]-glicilglicin-amidil} -6-hexanol

4,63 g (10 mmol), a 14a) példa szerinti módon előállított S- [(trifenil-metil)-(merkapto-acetil)]-glicil-glicinmetil-észtert 11,72 g (100 mmol) 6-amino-hexanol és 50 ml 1,4-dioxán elegyében argonatmoszférában 2 órán át 100 °C-on melegítünk. Ezután a reakcióelegyet 100 ml metilén-diklorid és 100 ml víz elegy éré öntjük. Keverés és jéggel történő hűtés közben a pH-t 10M sósavoldattal 6-ra állítjuk, a szerves fázist elválasztjuk, és nátrium-szulfáton szárítjuk. Az oldószer elpárologtatósával kapott nyersterméket szilikagélen (eluens: metilén-diklorid/metanol 10 tömeg%-50 tömeg%) tisztítjuk.

Kihozatal: 2,97 g fehér por, az elméletinek 54,2%-a.

c) O- {[S-(/Trifenil-metil/-/merkapto-acetil/)-glicil-glicin-amidil]-6-hex-l-il}-diizopropilamidO ’ -metil-foszforsav-észter

5,48 g (10 mmol), a 14b) példa szerinti módon előállított [S-(/trifenil-metil/-/merkapto-acetil/)-glicil-glicin-amidil]-6-hexanolt 100 ml abszolút metilén-dikloridban oldunk, argonatmoszférában hozzáadunk 5,17 g (40 mmol) diizopropil-etil-amint, majd 50 ml abszolút metilén-dikloridban oldott 3,95 g (20 mmol) foszforsav-monometil-észter-(diizopropil-amid)-kloridot csepegtetünk bele 0 °C-on. A reakcióelegyet 0,5 órán át 0 °C-on, majd 2 órán át szobahőmérsékleten keveijük. Feldolgozás céljából jeges hűtés közben 320 mg (10 mmol) abszolút metanollal keverjük, majd bepárlás után szilikagélen kromatográfiával tisztítjuk (eluens: metilén-diklorid és metanol 95:5 arányú elegyének 5%-os trietil-aminos oldata).

Kihozatal: 1,98 g színtelen olaj, az elméletinek 27,9%-a.

d) Az 5’-T*T*T*TCUCAUGGAGCGAAGACGAAUAGCUACAUA-3’ 35-mer oligonukleotid 5 ’- {[(merkapto-acetil)-glicil-glicil-amidil]-6hex-1 -il} -foszforsav-észtere

A SELEX eljárással azonosított, az 5’-helyhez kötött 5’-T*T*T*T szekvenciával módosított 30-mer oligonukleotidot a szokásos módon, a Pharmacia company automatikus szintetizátorával [Oligonucleotides and

Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991] állítjuk elő; az oligonukleotid védett alakban az oszlop szilárd töltetén is jelen van. Az oszlopba körülbelül 15 mg 35-mer oligonukleotidot töltünk be. Az 5’-DMTvédőcsoportot metilén-dikloridban oldott triklór-ecetsavval lehasítjuk, majd ismert módon kapcsoljuk a 14a) példában előállított foszfor-amidittel. Tetrahidrofurános jódoldattal végzett oxidálás után a konjugátot leszakítjuk a hordozóról. Ez esetben ezt úgy végezzük, hogy az anyagot 10 ml 30 tömeg%-os ammónium-hidroxidoldattal keveijük, a lombikot lezáijuk, és egy éjszakán át 55 °C-on rázzuk. Ezután 0 °C-ra hűtjük, lecentrifugáljuk, a hordozót 10 ml vízzel mossuk, és az egyesített vizes fázisokat fagyasztva szárítjuk.

Tisztítás céljából az anyagot 5 ml vízzel felvesszük, 4 ml 0,5M ammónium-acetát-oldattal, majd 20 ml etanollal keverjük. Hogy a csapadékkiválást teljessé tegyük, az anyagot egy éjszakán át -20 °C-on hűtve tároljuk, azután lecentrifiigáljuk. A maradékot 1 ml -20 °Cos etanollal mossuk, végül vákuumban szárítjuk. 9 mg fehér port kapunk.

A tritil védőcsoport lehasítására a vegyületet 5 ml 50 mmol pH = 7-es trietil-ammónium-acetát-oldattal felvesszük, és 500 μΐ 0,lM ezüst-nitrát-oldattal 30 percig inkubáljuk. Ezután 500 μΐ 0,14M ditiotreitololdatot adunk hozzá, és további 30 percig inkubáljuk. Centrifugálás után a tiszta felülúszót Sephadex G-10 oszlopon sómentesítjük, majd fagyasztva szárítjuk, így 4 mg fehér por alakjában megkapjuk a kívánt konjugátot.

e) Az 5’-T*T*T*TCUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3’ 35-mer oligonukleotid 5’-{[(merkapto-acetil)-glicil-glicil-amidil]6-hex-1 -il} -foszforsav-észterének technécium99m komplexe mg, a 14d) példa szerinti módon előállított konjugátot 1 ml 0,lM pH=9,5-es dinátrium-hidrogénfoszfát-pufferben oldunk, hozzáadunk 10 mg dinátrium-tartarátot, összekeverjük 1 mCi nátrium-pertecnatát-oldattal, majd 10 ml ón(II)-klorid-oldattal (1 ml 0,01M sósavoldatban 5 mg ón-klorid). A nyomjelző izotóp kihozatalát HPLC-vel határozzuk meg (körülbelül 93%).

75. példa

a) O-{[S-(/Trifenil-metil/-/merkapto-acetil/)-glicil-glicin-amidil]-6-hex-l-il}-toluolszulfonsavészter

5,48 g (10 mmol), a 14b) példa szerinti módon előállított [S-(/trifenil-metil/-/merkapto-acetil/)-glicil-glicin-amidil]-6-hexanolt 100 ml abszolút metilén-dikloridban oldunk. Hozzáadunk 1,01 g (10 mmol) trietilamint és 1,91 g (10 mmol) p-toluolszulfonsavkloridot, 24 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd bepároljuk, és szilikagélen, eluensként metilén-diklorid és metanol 95:5 arányú elegyét alkalmazva kromatográfiával tisztítjuk.

Kihozatal: 4,32 g színtelen olaj, az elméletinek 61,5%-a.

HU 220 859 Bl

Az elemanalízis eredményei:

	C%	H%	N%	O%	S%
számított:	65,03	6,18	5,99	13,68	9,14
mért:	64,93	6,32	5,78		8,87

b) Az 5’-T*T*T*TCUCAUGGAGCGAAGACGAAUAGCUACAUA-3’ 35-mer oligonukleotid 5 ’- {[(merkapto-acetil)-glicil-glicin-amidil]-6hex-1 -il} -foszforsav-észtere

A SELEX eljárással azonosított, az 5’-helyhez kötött 5’-Τ*τ*τ*^γγ szekvenciával módosított 30-mer oligonukleotidot a szokásos módon, a Pharmacia company automatikus szintetizátorával [Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991] állítjuk elő; az oligonukleotid védett alakban az oszlop szilárd töltetén is jelen van. Az oszlopba körülbelül 15 mg 35-mer oligonukleotidot töltünk be. Az 5’DMT-védőcsoportot metilén-dikloridban oldott triklórecetsavval lehasítjuk, majd ismert módon kapcsoljuk az S-tritil-6-merkapto-hexil-foszfor-amidittel. Tetrahidrofurános jódoldattal végzett oxidálás után a tritilcsoporttal védett vegyületet leszakítjuk a hordozóról, majd a 14d) példában leírt módon izoláljuk és tisztítjuk.

Az S-tritil védőcsoport lehasítását, az SH-csoportot hordozó oligonukleotid izolálását és tisztítását szintén a 14d) példa szerinti módon végezzük, így 6 mg anyagot kapunk.

A kapcsoláshoz az SH-csoportot hordozó 6 mg 35mer oligonukleotidot 500 μΐ O,1M nátrium-karbonátoldatban oldva argonatmoszférában összekeverjük 100 mg, a 15a) példa szerinti, 500 pl dimetil-formamidban oldott tohiolszulfonsav-észterrel. 20 perc múlva a reakcióelegyet semlegesítjük, és vízzel 5 ml-re hígítjuk. Centrifugálás után a tiszta felülúszót fagyasztva szárítjuk.

Az S-tritil-csoportokat a 14d) példában leírt módon hasítjuk le. Tisztítás után 4 mg konjugátot kapunk.

c) Az 5’-T*T*T*TCUCAUGGAGCGAAGACGAAUAGCUACAUA-3’ 35-mer oligonukleotid 5’-{[(merkapto-acetil)-glicil-glicin-amidil]-6hex-l-il}-foszforsav-észter-konjugátjának technécium-99m-komplexe mg, a 15b) példa szerinti módon előállított konjugátot 1 ml 0,1 M pH=9,5-es dinátrium-hidrogén-foszfát-pufferben oldunk, hozzáadunk 10 mg dinátriumtartarátot, összekeverjük 1 mCi nátrium-pertecnatátoldattal, majd 10 μΐ ón(II)-klorid-oldattal (1 ml 0,01M sósavoldatban 5 mg ón-klorid). A nyomjelző izotóp kihozatalát HPLC-vel határozzuk meg (körülbelül 95%).

16. példa

a) N-[3-Tia-5-(trifenil-metil-merkapto)-l-oxopent-l-il]-S-cisztein-metil-észter

2,69 g (10 mmol), a DE 43,10,999 számú német szabadalmi leírás szerinti módon előállított N-[3-tia-5-(trifenil-metil-merkapto)-1 -oxo-pent-1 -il]-S-trifenil-metilcisztein-metil-észtert 5,58 g (20 mmol) trifenil-metilkloriddal együtt 100 ml abszolút metilén-dikloridban oldunk. Hozzáadunk 2,02 g (20 mmol) trietil-amint, és argonatmoszférában egy éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük. Feldolgozás céljából a szerves fázist háromszor átmossuk, ehhez mindhárom esetben 1 tömeg%-os citromsavoldatot, telített nátrium-hidrogén-karbonátoldatot, majd vizet alkalmazunk. Az oldatot nátriumszulfáton szárítjuk, majd bepárlás után szilikagélen kromatográfiával, eluensként metilén-diklorid és metanol 95:5 arányú elegyét alkalmazva tisztítjuk.

Kihozatali 4,53 g színtelen olaj, az elméletinek 60,1%-a.

Az elemanalízis eredményei:

	C%	H%	N%	0%	S%
számított:	73,27	5,75	1,86	6,37	12,76
mért:	73,31	5,48	1,63		12,49

b) N-[3-Tia-5-(trifenil-metil-merkapto)-1-oxopent-l-il]-S-trifenil-metil-N’-(6-hidroxi-hex-lil)-cisztein-amid

7,54 g (10 mmol) 16a) példa szerinti N-[3-tia-5(trifenil-metil-merkapto)-1 -oxo-pent-1 -il]-S-ciszteinmetil-észtert 11,72 g (100 mmol) 6-amino-hexanol és 50 ml 1,4 dioxán elegyében argonatmoszférában 2 órán át 100 °C-on melegítünk. Ezután a reakcióelegyet 100 ml metilén-diklorid és 100 ml víz elegyére öntjük. Keverés és jéggel történő hűtés közben a pH-t 10M sósavoldattal 6-ra állítjuk, a szerves fázist elválasztjuk, és nátrium-szulfáton szárítjuk. Az oldószer elpárologtatósával kapott nyersterméket szilikagélen (eluens: metilén-diklorid/metanol 10 tömeg%-50 tömeg%) tisztítjuk.

Az elemanalízis eredményei:

	C%	H%	N%	0%	S%
számított:	72,99	6,49	3,34	5,72	11,46
mért:	72,73	6,62	3,11		11,17

c) Ο- {[N-(3-Tia-5-/trifenil-metil-merkapto/-1 oxo-pent-l-il)-S-trifenil-metil-ciszteinil]-2amino-et-l-ilJ-diizopropil-amid-O’-metil-foszforsav-diészter

8,39 g (10 mmol), a 16b) példa szerinti módon előállított N-[3-tia-5-(trifenil-metil-merkapto)-l-oxo-pent1 -il]-S-trifenil-metil-N ’-(6-hidroxi-hex-1 -il)-ciszteinamidot 200 ml abszolút metilén-dikloridban oldunk, argonatmoszférában hozzáadunk 5,17 g (40 mmol) diizopropil-etil-amint, majd 50 ml abszolút metilén-dikloridban oldott 3,95 g (20 mmol) foszforsav-monometilészter-(diizopropil-amid)-kloridot csepegtetünk bele 0 °C-on. A reakcióelegyet 0,5 órán át 0 °C-on, majd

1,5 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Feldolgozás céljából jeges hűtés közben 320 mg (10 mmol) abszolút metanollal keverjük, majd bepárlás után szilikagélen kromatográfiával tisztítjuk (eluens: metilén-diklorid és metanol 95:5 arányú elegyének 5%-os trietil-aminos oldata).

Kihozatal: 5,37 g sárgás olaj, az elméletinek 53,7%-a.

d) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 35-mer oligonukleotid 5’-[N-(3-tia-5-merkapto-l-oxo-pent-l-il)cisztein-N ’-(6-hidroxi-hex-1 -il)-amid]-foszforsav-észtere

Egy SELEX eljárással azonosított 30-mer oligonukleotidot állítunk elő egy, a Pharmacia company automa20

HU 220 859 Bl tikus szintetizátorával [Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991] felvitt T*T*T*T*T-3’szekvencia módosításával; az oligonukleotid védett alakban az oszlop szilárd töltetén is jelen van. Az oszlopba körülbelül 15 mg 35-mer oligonukleotidot töltünk be. Az 5’-DMT-védőcsoportot metilén-dikloridban oldott triklór-ecetsavval lehasítjuk, ismert módon kapcsoljuk a 16c) példában előállított foszfor-amidittel, majd oxidáljuk.

A bázisvédó csoportoknak a hordozóról történő lehasítását és a bisz(S-tritil)-védett konjugát tisztítását a 14d) példa szerinti módon végezzük, így körülbelül 12 mg anyagot kapunk.

A tritil védőcsoportok lehasítására a vegyületet 5 ml 50 mmol pH = 7-es trietil-ammónium-acetátoldattal felvesszük, és 500 pl O,1M ezüst-nitrát-oldattal 30 percig inkubáljuk. Ezután 500 μΐ 0,14M ditiotreitololdatot adunk hozzá, és további 30 percig inkubáljuk. Centrifugálás után a tiszta felülúszót Sephadex G-10 oszlopon sómentesítjük, majd fagyasztva szárítjuk, így 5 mg fehér port kapunk.

e) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 35-mer oligonukleotid 5’-[N-(3-tia-5-merkapto-l-oxo-pent-l-il)cisztein-N’-(6-hidroxi-hex-l-il)-amid]-foszforsav-észterének technécium-99m-komplexe mg, a lód) példa szerinti módon előállított konjugátot 1 ml 0,lM pH=9,5-es dinátrium-hidrogén-foszfát-pufferben oldunk, hozzáadunk 10 mg dinátriumtartarátot, összekeverjük 1 mCi nátrium-pertecnatát-oldattal, majd 10 ml ón(II)-klorid-oldattal (1 ml 0,01 M sósavoldatban 5 mg ón-klorid). A nyomjelző izotóp kihozatalát HPLC-vei határozzuk meg (körülbelül 96%).

17. példa

a) O-{N-[3-Tia-5-(trifenil-meti]-merkapto)-l-oxopent-1 -il)-S-trifenil-metil-N ’-(6-hidroxi-hex-1 il)-cisztein-imidil]-p-toluolszulfonsav-észter

8,39 g (10 mmol), a 16b) példa szerinti módon előállított N-[3-tia-5-(trifenil-metil-merkapto)-l-oxo-pent1 -il]-S-trifenil-metil-N ’ -(6-hidroxi-hex-1 -il)-ciszteinamidot 200 ml abszolút metilén-dikloridban oldunk, hozzáadunk 1,01 g trietil-amint és 1,19 g p-toluolszulfonsav-kloridot, és 20 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután bepároljuk, és szilikagélen kromatográfiával tisztítjuk (eluens: metilén-diklorid és metanol 97:3 arányú elegye).

Kihozatal: 6,44 g sárgás olaj, az elméletinek 67,0%-a.

Az elemanalízis eredményei:

	C%	H%	N%	0%	S%
számított:	72,42	6,29	2,91	8,32	10,01
mért:	72,19	6,47	2,68		9,83.

b) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 35-mer oligonukleotid 5’-[(merkapto-acetil)-glicil-glicin-amidil]-13-tridec-7-tio-l-il]-foszforsav-észtere

Egy SELEX eljárással azonosított 30-mer oligonukleotidot állítunk elő egy, a Pharmacia company automatikus szintetizátorával [Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991] felvitt T*T*T*T*T-3’szekvencia módosításával; az oligonukleotid védett alakban az oszlop szilárd töltetén is jelen van. Az oszlopba körülbelül 15 mg 35-mer oligonukleotidot töltünk be. Az 5’-DMT-védőcsoportot metilén-dikloridban oldott triklór-ecetsavval lehasítjuk, és ismert módon kapcsoljuk az S-tritil-6-merkaptohexil-foszfor-amidittel.

Tetrahidrofürános jódoldattal végzett oxidálás után a tritilcsoporttal védett vegyületet leszakítjuk a hordozóról, majd a 14d) példában leírt módon izoláljuk és tisztítjuk.

Az S-tritil védőcsoport lehasitását, az SH-csoportot hordozó oligonukleotid izolálását és tisztítását szintén a 14d) példa szerinti módon végezzük, így 7,5 mg anyagot kapunk.

A kapcsoláshoz az SH-csoportot hordozó 7 mg 30mer oligonukleotidot 550 μΐ 0,1Μ nátrium-karbonátoldatban oldva argonatmoszférában összekeverjük 180 mg, a 17a) példa szerinti, 500 μΐ dimetilformamidban oldott toluolszulfonsav-észterrel. 30 perc múlva a reakcióelegyet semlegesítjük, és vízzel 5 ml-re hígítjuk. Centrifugálás után a tiszta felülúszót fagyasztva szárítjuk. Az S-tritil-csoportokat a 14d) példában leírt módon hasítjuk le. Tisztítás után 4,3 mg konjugátot kapunk.

c) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 35-mer oligonukleotid és az 5’-[(merkapto-acetil)-glicil-glicinamidil]-13-tridec-7-tio-l-il]-foszforsav-észter konjugátjának technécium-99m-komplexe mg, a 17b) példa szerinti módon előállított konjugátot 1 ml 0,lM pH=9,5-es dinátrium-hidrogénfoszfát-pufferben oldunk, hozzáadunk 10 mg dinátrium-tartarátot, összekeverjük 1 mCi nátrium-pertecnatát-oldattal, majd 10 μΐ ón(II)-klorid-oldattal (1 ml 0,01M sósavoldatban 5 mg ón-klorid). A nyomjelző izotóp kihozatalát HPLC-vel határozzuk meg (körülbelül 93%).

18. példa

a) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 35-mer oligonukleotid 5 ’-(6-amino-1 -hexil-foszforsav-észter)-ének N-(tetrahidro-2-oxo-tiofen-3-il)-tiodiglikolsav-monoamiddal képzett konjugátja

Egy SELEX eljárással azonosított 30-mer oligonukleotidot állítunk elő egy, a Pharmacia company automatikus szintetizátorával [Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991] felvitt τ*τ*τ*·γ*Τ-3’ szekvencia módosításával; az oligonukleotid védett alakban az oszlop szilárd töltetén is jelen van. Az oszlopba körülbelül 15 mg 35mer oligonukleotidot töltünk be. Az 5’-DMT-védőcsoportot metilén-dikloridban oldott triklór-ecetsavval lehasítjuk, és ismert módon kapcsoljuk az N-trifluoracetil-amino-hexil-foszfor-amidittel.

HU 220 859 Bl

Tetrahidrofúrános jódoldattal végzett oxidálás után az aminocsoportot hordozó oligonukleotidot leszakítjuk a hordozóról, majd az lb) példában leírt módon izoláljuk és tisztítjuk, így 9,3 mg anyagot kapunk.

A DE 43,11,023 számú szabadalmi leírásban ismertetett N-(tetrahidro-2-oxo-tiofen-3-il)-tiodiglikolsavmonoamiddal történő kapcsoláshoz az aminocsoportot hordozó oligonukleotidból 5 mg-ot 1 ml 1M nátriumkarbonát-oldatban oldunk, 100 mg tiolaktonátszármazékot adunk hozzá, és 4 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután semlegesítjük, és egy 3000-es kizárási határú Amicon YM3 membránon ultraszűréssel leszűrjük. Liofilizálás után fagyasztva szárítjuk, ily módon 6,3 mg-ot kapunk a kívánt konjugátból.

b) Az (5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 35-mer oligonukleotid)-5’-(6-amino-l-hexil-foszforsav-észter) N-(tetrahidro-2-oxo-tiofen-3-il)-tiodiglikolsav-monoamiddal képzett konjugátjának technécium-99m-komplexe

A 18a) példa szerinti módon előállított, SH-csoportot hordozó konjugátból 1 mg-ot 1 ml 0,1 M pH=9,5-es dinátrium-hidrogén-foszfát-pufferben oldunk, hozzáadunk 10 mg dinátrium-tartarátot, összekeverjük 1 mCi nátrium-pertecnatát-oldattal, majd 10 μΐ ón(II)-kloridoldattal (1 ml 0,01M sósavoldatban 5 mg ón-klorid). A nyomjelző izotóp kihozatalát HPLC-vel határozzuk meg (körülbelül 94%).

19. példa

a) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT-³’-³’T-5’ 32-mer oligonukleotid 5’-(6-amino- 1-hexil-foszforsav-észtere)

A SELEX eljárással azonosított 30-mer oligonukleotidot, amely egy, a hordozóhoz az 5’-helyen kötődő -T-³’-³’T-5’ timidinszekvenciával módosított, a szokásos módon állítjuk elő a Pharmacia company automatikus szintetizátorával [Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991]; az oligonukleotid az oszlop szilárd töltetén is jelen van. Az 5’-hidroxicsoportot metilén-dikloridban oldott triklór-ecetsavval megnyitjuk. Az oszlopba körülbelül 10 mg 32-mer oligonukleotidot töltünk be. A kötőcsoport kapcsolására az oszlopot acetonitrilben, tetrazol jelenlétében 50 pmol, az alábbi irodalmi helyen: [Nucl. Acid. Rés. 16, 2659-2669 (1998)] leírt módon előállított p-(ciano-etil)-N,N-(diizopropilamino)-(6-trifluor-acetamido)-1 -hexil-foszfor-amiditet tartalmazó oldattal reagáltatjuk. A képződött foszfitot tetrahidrofúránban jóddal teljes mértékben védett foszfotriészterré oxidáljuk. Ezután az oszlopot metanollal, majd vízzel mossuk. A módosított oligonukleotidnak a szilárd hordozóról történő eltávolítására az oszlop tartalmát rázólombikba áttöltjük, 5 ml 30 tömeg%os ammónium-hidroxid-oldattal keverjük, az edényt lezárjuk, és egy éjszakán át 55 °C-on rázzuk. Ezután 0 °C-ra hűtjük, lecentrifugáljuk, a hordozót 5 ml vízzel mossuk, és az egyesített vizes fázisokat fagyasztva szárítjuk.

Tisztítás céljából a szilárd anyagot 2 ml vízzel felvesszük, 2 ml 0,5M ammónium-acetát-oldattal, majd 10 ml etanollal keverjük, egy éjszakán át -20 °C-on állni hagyjuk, azután lecentrifugáljuk. A maradékot 1 ml -20 °C-os etanollal mossuk, végül vákuumban, szobahőmérsékleten szárítjuk.

mg-ot kapunk a cím szerinti vegyületből színtelen por alakjában.

b) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT-³’-³’T-5’ 32-mer oligonukleotid 5 ’-(6-amino-1 -hexil-foszforsav-észter)-ének 10[7-(4-izocianáto-fenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(karboxi-metil)-4-aza-heptil]-1,4,7-trisz(karboximetil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekánnal képzett konjugátja

A 19a) példában kapott oligonukleotidból 8 mg-ot

2,5 ml pH = 8-as nátrium-hidrogén-karbonát/nátriumkarbonát pufferben oldunk, és elkeverjük 1 mg 10-[7(4-izocianáto-fenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(karboxi-metil)4-aza-heptil]-l ,4,7-trisz(karboxi-metil)-l,4,7,10tetraaza-ciklododekánnal [az lf) példa címében szereplő vegyület]. A reakcióelegyet 5 órán át szobahőmérsékleten keverjük, pH-ját 0,01M sósavoldat hozzáadásával

7,2-re állítjuk, az oldatot egy 3000 kizárási határú (Amicon YM3) membránon ultraszűréssel leszűrjük, majd fagyasztva szárítjuk. 7 mg-ot kapunk a kívánt konjugátból.

c) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT-³’-³’T-5’ 32-mer oligonukleotid5’-(6-amino-l-hexil-foszforsav-észter) és a 10[7-(4-izocianáto-fenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(karboxi-metil)-4-aza-heptil]-1,4,7-trisz(karboxi-metil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán konjugátjának ^lllindiumkomplexe ^H1Indium(III)-kloridot 2M nátrium-acetát-oldatban oldunk, az oldat a pH-ját 0,lM sósavoldattal 4,0-re állítjuk, és az így kapott indium(III)-acetát-oldatból 15 μΙ-t (350 pCi) hozzáadunk 135 pl oldathoz, amelyet 1 mg, a 19b) példa címe szerinti vegyületből pH=6,2-es MESpufferrel készítettünk. [MES=2-(N-morfolino)-etilszulfonsav]. Az oldat pH-ját 0,01M sósavoldattal 4,2-re állítjuk, majd 1 órán át 37 °C-on pH=4,2-n keverjük. Ezután a pH-t 2M nátrium-acetát-oldattal 6-ra állítjuk, és 10 μΐ 0,1Μ dinátrium-etilén-diamin-tetraecetsavat adunk hozzá, hogy a ¹¹ ‘indium feleslegét komplexbe vigyük. Az így kapott jelzett konjugát (lh vegyület) végső tisztítását HPLC-vel (kizárásos kromatográfia TSK-400/MES pufferben) végezzük. A jelzett konjugátot tartalmazó frakciókat közönséges fiziológiás sóoldattal hígítjuk, a pH-t 0,01 M nátrium-hidroxid-oldattal

7,2-re állítjuk, majd az oldatot leszűrjük. Az így kapott oldat radiodiagnózishoz használható készítmény.

20. példa

a) Az 5’-T***T***T***T***TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3’ 35mer oligonukleotid 5 ’-(6-amino- 1-hexil-foszforsav-észtere)

Az 5,270,163 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban 13. szekvenciaazonositó számon

HU 220 859 Bl szereplő, SELEX eljárással azonosított 5’-TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3’ 30mer oligonukleotidot állítunk elő a szokásos módon, a Pharmacia company automatikus szintetizátorával [Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991]; az oligonukleotid az oszlop szilárd töltetén is jelen van. A láncvégi négy timidint a G. Blaton és munkatársai [Oligonucleotides and Analogues, 109-135] által leírt módon foszfor-ditioátokkal kapcsoljuk az 5’-helyen jelen lévő timidinhez. E célból az 5’-helyen található hidroxicsoportot triklór-ecetsavas kezeléssel megnyitjuk. Ezután egy 5’-DMTOtiridin 3’-hidroxicsoportját trisz(pirrolidin-foszfm)-nel és tetrazollal diamiditté, azt pedig 2,4-diklór-benzilmerkaptén hozzáadásával foszfor-tioamiditté alakítjuk át. Ezt a vegyületet tetrazollal aktiváljuk, az oligonukleotid 5’-hidroxicsoportjával reagáltatva tiofoszfát-triészterré alakítjuk, majd szén-diszulfid, piridin és trietilamin 95:95:10 arányú elegyében oldva elemi kénnel foszfor-ditioáttá oxidáljuk. A benzilcsoportokat még nem távolítjuk el. Hasonlóképpen három további timidint kötünk meg. Az oszlop körülbelül 10 mg 35-mer oligonukleotidot tartalmaz. Ezután ismét megnyitunk egy 5’-hidroxicsoportot.

A kötőcsoport kapcsolására az oszlopot acetonitrilben, tetrazol jelenlétében 50 pmol, az alábbi irodalmi helyen: [Nucl. Acid. Rés. 16, 2659-2669 (1998)] leírt módon előállított 2-(ciano-etil)-N,N-(diizopropilamino)-(6-trifluor-acetamido)-1 -hexil-foszfor-amiditet tartalmazó oldattal reagáltatjuk. A képződött foszfitot tetrahidrofuránban jóddal foszfotriészterré oxidáljuk. Ezután az oszlopot metanollal, majd vízzel mossuk. A ditionátkötések védőcsoportjait tiofenol, trietil-amin és dioxán 1:2:2 arányú elegyével távolítjuk el, ez 2 órát vesz igénybe. Ezután az oszlopot a térfogata háromszorosának megfelelő mennyiségű metanollal, majd dietil-éterrel mossuk és szárítjuk. A módosított oligonukleotidnak a szilárd hordozóról történő eltávolítására az oszlop tartalmát rázólombikba áttöltjük, 5 ml 30 tömeg%-os ammónium-hidroxid-oldattal keveijük, az edényt lezáijuk, és egy éjszakán át 55 °C-on rázzuk. Ezután 0 °C-ra hűtjük, lecentrifugáljuk, a hordozót 5 ml vízzel mossuk, és az egyesített vizes fázisokat fagyasztva szárítjuk.

Tisztítás céljából a szilárd anyagot 2 ml vízzel felvesszük, 2 ml 0,5M ammónium-acetát-oldattal, majd 10 ml etanollal keverjük, egy éjszakán át -20 °C-on állni hagyjuk, azután lecentrifugáljuk. A maradékot 1 ml -20 °C-os etanollal mossuk, végül vákuumban, szobahőmérsékleten szárítjuk.

mg-ot kapunk a cím szerinti vegyületből színtelen por alakjában.

b) Az (5’-T***T***T***T***TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3’ 35mer oligonukleotid)-5’-(6-amino-l-hexil-foszforsav-észter) és a 10-[7-(4-izocianáto-fenil)-2hidroxi-5-oxo-7-(karboxi-metil)-4-aza-heptil]1,4,7-trisz(karboxi-metil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán konjugátja

A 20a) példában kapott oligonukleotidból 8 mg-ot

2,5 ml pH = 8-as nátrium-hidrogén-karbonát/nátriumkarbonát pufferben oldunk, és elkeveijük 1 mg 10-[7(4-izocianáto-fenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(karboxi-metil)4-aza-heptil]-1,4,7-trisz(karboxi-metil)-1,4,7,10tetraaza-ciklododekánnal [az lf) példa címében szereplő vegyület], A reakcióelegyet 5 órán át szobahőmérsékleten keverjük, pH-ját 0,01M sósavoldat hozzáadásával

7.2- re állítjuk, az oldatot egy 3000 kizárási határú (Amicon YM3) membránon ultraszűréssel leszűrjük, majd fagyasztva szárítjuk.

mg-ot kapunk a kívánt konjugátból.

c) Az (5’-T***T***T***T***TAGGAGGAG

GAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3’ 35mer oligonukleotid)-5’-(6-amino-l-hexil-foszforsav-észter) és a 10-[7-(4-izocianáto-fenil)-2hidroxi-5-oxo-7-(karboxi-metil)-4-aza-heptil]1,4,7-trisz(karboxi-metil)-l ,4,7,10-tetraaza-ciklododekán konjugátjának ¹ indiumkomplexe ^H1lndium(ni)-kloridot 2M nátrium-acetát-oldatban oldunk, az oldat pH-ját 0,lM sósavoldattal 4,0-re állítjuk, és az így kapott indium(III)-acetát-oldatból 15 μΐ-t (350 pCi) hozzáadunk 135 μΐ oldathoz, amelyet 1 mg, a 19b) példa címe szerinti vegyületből pH = 6,2-es MES-pufferrel készítettünk. [MES=2-(N-morfolino)etilszulfonsav]. Az oldat pH-ját 0,01M sósavoldattal

4.2- re állítjuk, majd 1 órán át 37 °C-on pH=4,2-n keverjük. Ezután a pH-t 2M nátrium-acetát-oldattal 6-ra állítjuk, és 10 μΐ 0,1 M dinátrium-etilén-diamin-tetraecetsavat adunk hozzá, hogy a ^l,1indium feleslegét komplexbe vigyük. Az így kapott jelzett konjugát (lh vegyület) végső tisztítását HPLC-vel (kizárásos kromatográfia TSK.-400/MES pufferben) végezzük. A jelzett konjugátot tartalmazó frakciókat közönséges fiziológiás sóoldattal hígítjuk, a pH-t 0,01M nátriumhidroxid-oldattal 7,2-re állítjuk, majd az oldatot leszűrjük. Az így kapott oldat radiodiagnózishoz használható készítmény.

21. példa

a) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3 ’ 35-mer oligonukleotid 5 ’-(6-amino-1 -hexi 1-foszforsav-észtere)

A ψ*-Γ*'Γ*'μ*τ_3’ szekvenciával módosított, SELEX eljárással azonosított 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3’ 30-mer oligonukleotidot úgy állítjuk elő, hogy a hordozón a 3’-helyen először egy ciano-etil-foszfát-csoportokkal kötődő, 5 timidinből álló szekvenciát alakítunk ki. Ha ezt a vegyületet acetonitrilben 0,5M tetraetil-tiurám-diszulfidoldattal reagáltatjuk, akkor a foszfono-tioát szulfonálása 15 perc alatt lejátszódik, és az így kapott, szabad 5’-hidroxilcsoportot tartalmazó vegyület a 35-mer oligonukleotid kiindulási anyaga. A teljes szintézist a szokásos módon, a Pharmacia company automatikus szintetizátorával [Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991] hajtjuk végre; az oligonukleotid az oszlop szilárd töltetén is jelen van. Az 5’-hidroxicsoportot triklór-ecetsavas keze23

HU 220 859 Bl léssel megnyitjuk. Az oszlop körülbelül 10 mg 35-mer oligonukleotidot tartalmaz. A kötőcsoport kapcsolására az oszlopot acetonitrilben, tetrazol jelenlétében 50 pmol, az alábbi irodalmi helyen: [Nucl. Acid. Rés. 16, 2659-2669 (1998)] leírt módon előállított 2(ciano-etil)-N,N-(diizopropil-amino)-(6-trifluor-acetamido)-l-hexil-foszfor-amiditet tartalmazó oldattal reagáltatjuk. A képződött foszfitot tetrahidrofuránban jóddal teljes mértékben védett foszfotriészterré oxidáljuk. Ezután az oszlopot metanollal, majd vízzel mossuk. A módosított oligonukleotidnak a szilárd hordozóról történő eltávolítására és a ciano-etil-csoportok lehasítására az oszlop tartalmát rázólombikba áttöltjük, 5 ml 30 tömeg%-os ammónium-hidroxid-oldattal keveijük, az edényt lezárjuk, és egy éjszakán át 55 °C-on rázzuk. Ezután 0 °C-ra hűtjük, lecentrifugáljuk, a hordozót 5 ml vízzel mossuk, és az egyesített vizes fázisokat fagyasztva szárítjuk.

Tisztítás céljából a szilárd anyagot 2 ml vízzel felvesszük, 2 ml 0,5M ammónium-acetát-oldattal, majd 10 ml etanollal keverjük, egy éjszakán át -20 °C-on állni hagyjuk, azután lecentrifugáljuk. A maradékot 1 ml -20 °C-os etanollal mossuk, végül vákuumban, szobahőmérsékleten szárítjuk.

mg-ot kapunk a cím szerinti vegyületből színtelen por alakjában.

b) Az 5’-(CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 35-mer oligonukleotid)-5 ’-(6-amino- 1-hexil-foszforsav-észter) és a 10-[7-(4-izocianáto-fenil)-2-hidroxi-5-oxo7-(karboxi-metil)-4-aza-heptil]-l,4,7-trisz(karboxi-metil)-l,4,7,10-tetraaza-ciklododekán konjugátja

A 20a) példában kapott oligonukleotidból 8 mg-ot

2,5 ml pH = 8-as nátrium-hidrogén-karbonát/nátriumkarbonát pufferben oldunk, és elkeverjük 1 mg 10-[7(4-izocianáto-fenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(karboxi-metil)4-aza-heptil]-l,4,7-trisz(karboxi-metil)-l ,4,7,10tetraaza-ciklododekánnal [az lf) példa címében szereplő vegyület], A reakcióelegyet 5 órán át szobahőmérsékleten keverjük, pH-ját 0,0IM sósavoldat hozzáadásával

7,2-re állítjuk, az oldatot egy 3000 kizárási határú (Amicon YM3) membránon ultraszűréssel leszűrjük, majd fagyasztva szárítjuk.

mg-ot kapunk a kívánt konjugátból.

c) Az 5’-(CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 35-mer oligonukleotid)-5 ’-(6-amino-1 -hexil-foszforsav-észter) és a 10-[7-(4-izocianáto-fenil)-2-hidroxi-5-oxo7-(karboxi-metil)-4-aza-heptil]-l,4,7-trisz(karboxi-metil)-1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán konjugátjának ¹¹'irídium komplexe ^ulIndium(III)-kloridot 2M nátrium-acetát-oldatban oldunk, az oldat pH-ját 0,lM sósavoldattal 4,0-re állítjuk, és az így kapott indium(III)-acetát-oldatból 15 μΐ-t (350 pCi) hozzáadunk 135 pl oldathoz, amelyet 1 mg, a 21b) példa címe szerinti vegyületből pH = 6,2-es MES-pufferrel készítettünk. Az oldat pH-ját 0,0IM sósavoldattal 4,2-re állítjuk, majd 1 órán át 37 °C-on pH=4,2-n keverjük. Ezután a pH-t 2M nátrium-acetátoldattal 6-ra állítjuk, és 10 μΐ 0,1Μ dinátrium-etiléndiamin-tetraecetsavat adunk hozzá, hogy a ¹¹ 'indium feleslegét komplexbe vigyük. Az így kapott jelzett konjugát (lh vegyület) végső tisztítását HPLC-vei (kizárásos kromatográfia TSK-400/MES pufferben) végezzük. A jelzett konjugátot tartalmazó frakciókat közönséges fiziológiás sóoldattal hígítjuk, a pH-t 0,0IM nátrium-hidroxid-oldattal 7,2-re állítjuk, majd az oldatot leszűrjük. Az így kapott oldat radiodiagnózlshoz használható készítmény.

22. példa

a) N-(5-Merkapto-3-tia-1 -oxo-pent-1 -il)-glicinmetil-észter

12,56 g (0,1 mmol) glicin-metil-észter-hidrokloridot, 13,42 g (0,1 mmol) 2,5-ditia-ciklohexanont és 10,12 g (0,1 mmol) trietil-amint argonatmoszférában 500 ml abszolút metilén-dikloridban oldunk, az oldatot 24 órán át szobahőmérsékleten keveijük, majd 250 ml 5 tömeg%-os vizes citromsavoldatra öntjük, és jól elkeverjük. A szerves fázist elválasztjuk, és nátriumszulfáton szárítjuk. Az oldószert vákuumban elpárologtatjuk, az olajos maradékot szilikagélen (mozgó fázis: metilén-diklorid/metanol 10 tömeg%-0 tömeg%) tisztítjuk.

Kihozatal: 18,9 g színtelen olaj, az elméletinek 84,6%-a.

Az elemanalízis eredményei:

	C%	H%	N%	O%	S%
számított:	37,65	5,87	6,27	21,49	28,71
mért:	37,43	6,02	6,12		28,48

b) N-[5-(Trifenil-metil-merkapto)-3-tia-1-oxopent-l-il]-glicin-metil-észter

11,17 g (50 mmol) N-(5-merkapto-3-tia-l-oxopent-l-il)-glicin-metil-észtert (22a példa), 13,94 g (50 mmol) trifenil-metil-kloridot és 5,06 g (50 mmol) trietil-amint argonatmoszférában 500 ml abszolút metilén-dikloridban oldunk, az oldatot 16 órán át szobahőmérsékleten keveijük, majd 150 ml 5 tömeg%-os vizes citromsavoldatra öntjük, és jól elkeverjük. A szerves fázist elválasztjuk, és nátrium-szulfáton szárítjuk. Az oldószert vákuumban elpárologtatjuk, az olajos maradékot szilikagélen (mozgó fázis: metilén-diklorid és metanol 95:5 arányú elegye) tisztítjuk.

Kihozatal: 15,7 g színtelen olaj, az elméletinek 67,4%-a.

Az elemanalízis eredményei:

C%	H%	N%	O%	S%
számított: 67,07	5,85	3,01	10,31	13,77
mért: 67,01	6,11	2,93		13,49

c) N-[5-(Trifenil-metil-merkapto)-3-tia-1-oxopent-l-il]-glicin-N’-(6-hidroxi-hexil)-amid

11,64 g (25 mmol) N-[5-(trifenil-metil-merkapto)-3tia-l-oxo-pent-l-il]-glicin-metil-észtert (22b példa) argonatmoszférában összeolvasztunk 29,3 g (250 mmol) 6-amino-hexanollal, és 16 órán argonatmoszférában 100 °C-on tartjuk. A reakciókeveréket lehűlés után 500 ml metilén-dikloriddal felvesszük, és 250 ml 5 tömeg%-os vizes citromsavoldatra öntjük. Jeges hűtés és keverés közben az oldat pH-ját tömény sósavoldattal

HU 220 859 Bl

6,5-re állítjuk. A szerves fázist elválasztjuk, és nátriumszulfáton szárítjuk. Az oldószert vákuumban elpárologtatjuk, az olajos maradékot szilikagélen (mozgó fázis: metilén-diklorid/metanol 0-10 tömeg%) tisztítjuk.

Kihozatal: 7,7 g színtelen olaj, az elméletinek 56,0%-a.

Az elemanalízis eredményei:

	C%	H%	N%	O%	S%
számított:	67,60	6,96	5,09	8,72	11,64
mért:	67,48	7,03	2,93		11,43

d) N-Diizopropil-O-ciano-etil-[7,10-diaza-8,lldioxo-13-tia-15-(trifenil-metil-merkapto)pentadec-1 -il]-foszforsavamid

5,51 g (10 mmol) N-[5-(trifenil-metil-merkapto)-3tia-l-oxo-pent-l-il]-glicin-N’-(6-hidroxi-hexil)-amidot 50 ml abszolút metilén-diklorid és 50 ml abszolút piridin elegyében oldunk, majd szobahőmérsékleten belecsepegtetjük 4,73 g (20 mmol) diizopropil-O-cianoetil-foszforsav-kloridnak 50 ml abszolút metilén-dikloriddal készített oldatát. 4 óra múlva a reakcióelegyet 250 ml telített, vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldatra öntjük, összekeverjük, és a szerves fázist magnézium-szulfáton szárítjuk. Az oldószert vákuumban elpárologtatjuk, az olajos maradékot szilikagélen kromatográfiával, metilén-diklorid, metanol és trietil-amin 98:1:1 arányú elegyét alkalmazva tisztítjuk.

Kihozatal: 4,32 g színtelen, habos olaj, az elméletinek 57,5%-a.

Az elemanalízis eredményei:

C%	H%	N%	0%	P%	S%
számított: 63,97	7,38	7,46	8,52	4,12	8,54
mért: 63,81	7,41	7,22		3,97	8,31

e) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3 ’ 5 ’-[N-3’-aza-8 merkapto-1 ’,4’-dioxo-6’-tia-okt-l ’-il)-6-aminohexil-foszforsav-észtere

Egy T*T*y*T*T-3’ szekvenciával módosított, SELEX eljárással azonosított 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3’ 30-mer oligonukleotidot állítunk elő a Pharmacia company automatikus szintetizátorával [Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991]; az oligonukleotid az oszlop szilárd töltetén is jelen van. Az oszlop körülbelül 10 mg 35-mer oligonukleotidot tartalmaz. Ezt az 5’-DMT-védőcsoport lehasítása után ismert módon kapcsoljuk a 22d) példában leírt foszforamidittel. Tetrahidrofurános jódoldattal végzett oxidálás után a konjugátot leszakítjuk a hordozóról. E célból az anyagot 30 tömeg%-os ammónium-hidroxid-oldattal keverjük, és egy éjszakán át 55 °C-on rázzuk. Ezután a reakcióelegyet 0 °C-ra hűtjük, lecentrifugáljuk, a hordozót 10 ml vízzel mossuk, és az egyesített vizes fázisokat fagyasztva szárítjuk. Tisztítás céljából az anyagot 5 ml vízzel felvesszük, 4 ml 0,5M ammónium-acetátoldattal keverjük, majd 10 ml etanolt adunk hozzá. Hogy a csapadékkiválást teljessé tegyük, egy éjszakán át -20 °C-on hűtve tároljuk, azután lecentrifugáljuk, a maradékot 1 ml -20 °C-os etanollal mossuk, végül vákuumban szárítjuk. Ily módon 9,5 mg fehér port kapunk. Az S-tritil-védőcsoport lehasítására az anyagot 5 ml 50 Mmol pH=7-es ammónium-acetát-oldattal felvesszük, és 500 μΐ 0,lM ezüst-nitrát-oldattal 30 percig inkubáljuk. Ezután 500 μΐ 1M ditio-treitol-oldatot adunk hozzá, további 30 percig inkubáljuk, majd lecentrifugáljuk, és a tiszta felülúszót Sephadex G-10 oszlopon sómentesítjük. A terméket tartalmazó frakciókat fagyasztva szárítjuk, így 3,5 mg fehér port kapunk.

f) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 5’-[N-3’-aza-8’ merkapto-1 ’,4’-dioxo-6’-tia-okt-l ’-il)-6-aminohexil-foszforsav-észterének technécium-99mkomplexe

A 22e) példa szerinti módon előállított konjugátból 1 mg-ot 1 ml 0,lM pH = 8,5-es dinátrium-hidrogénfoszfát-pufferben oldunk, hozzáadunk 10 mg dinátriumtartarátot, összekeverjük 1 mCi nátrium-pertecnatátoldattal, majd 10 μΐ ón(II)-klorid-oldattal (1 ml 0,01 M sósavoldatban 5 mg ón-klorid). A nyomjelző izotóp kihozatalát HPLC-vel határozzuk meg (körülbelül 95%).

23. példa

a) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 5’-{N-[6’-aza-7’-(hidroxi-karboxi)-9 ’ -merkapto-1 ’ ,5 ’ -dioxo-3 ’ -t i anon-1 ’-il]-6-amino-hexil-foszforsav-észtere}

Első lépésként 500 μΐ abszolút dimetil-formamidban elkészítjük az N-(2-oxo-tetrahidro-tiofen-3-il)· tioglikolsav-monoamidnak a DE 43,11,023 számú szabadalmi leírásban ismertetett N-(hidroxi-szukcinimid)észterének oldatát. E célból 24,9 mg (0,1 mmol) N-(2oxo-tetrahidro-tiofen-3-il)-tioglikolsav-monoamidot és

11,5 mg (0,1 mmol) N-hidroxi-szukcinimidet oldunk 500 μΐ abszolút dimetil-formamidban. Az oldathoz 0 °C-on 19,2 mg (0,1 mmol) EDC-t adunk, és 30 percig 0 °C-on keverjük.

Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’-nek az 1. példában előállított 5’-(6-amino-hexil-foszforsav-észter)-éből 10 mg-ot 1 ml 0,lM pH=8,0-as nátrium-hidrogén-karbonát/nátrium-karbonát pufferben oldunk, hozzáadjuk az N(hidroxi-szukcinimid)-észter előzetesen elkészített dimetil-formamidos oldatát, és 16 órán át szobahőmérsékleten, argonatmoszférában inkubáljuk. Ezután lecentrifugáljuk, 500 μΐ-re bepároljuk, és Sephadex G-25 oszlopon kromatografáljuk. Fagyasztó szárítás után 2 mg konjugátot kapunk fehér por alakjában.

b) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 5’-{N-[6’-aza-7’(hidroxi-karboxi)-9’ -merkapto-1 ’ ,5 ’ -dioxo-3 ’ tia-non-1 ’-il]- 6-amino-hexil-foszforsav-észter} -ének technécium-99m-komplexe

A 23a) példa szerinti módon előállított konjugátból 1 mg-ot 1 ml 0,lM pH = 8,5-es dinátrium-hidrogénfoszfát-pufferben oldunk, hozzáadunk 10 mg dinátrium-tartarátot, összekeveijük 1 mCi nátrium-pertechnatát-oldattal, majd 10 μΐ ón(II)-klorid-oldattal (1 ml 0,01M sósavoldatban 5 mg ón-klorid). A nyomjelző izotóp kihozatalát HPLC-vel határozzuk meg (körülbelül 92%).

HU 220 859 Β1

24. példa

a) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3 ’ 5 ’-[N-(merkaptoacetil)-6-amino-hexil-foszforsav-észtere]

Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’-nek az 1. példában előállított 5’-(6-amino-hexil-foszforsav-észter)-éből 10 mg-ot 1 ml O,1M pH=8,0-as nátrium-hidrogén-karbonát/nátrium-karbonát pufferben oldunk, hozzáadunk 23,1 mg (0,1 mmol), 500 pl abszolút dimetil-formamidban oldott S-acetil-merkapto-ecetsav-N-(hidroxi-szukcinimid)-észtert, és 17 órán át szobahőmérsékleten, argonatmoszférában inkubáljuk. Ezután lecentrifugáljuk, 500 μΐ-re bepároljuk, és Sephadex G-25 oszlopon kromatografáljuk. Fagyasztó szárítás után 3 mg konjugátot kapunk fehér por alakjában.

b) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 5’-[N-(merkapto-acetil)-6-amino-hexil-foszforsav-észter]ének technécium-99m-komplexe

A 24a) példa szerinti módon előállított konjugátból 1 mg-ot 1 ml 0,lM pH = 8,5-es dinátrium-hidrogénfoszfát-pufferben oldunk, hozzáadunk 10 mg dinátriumtartarátot, összekeverjük 1 mCi nátrium-pertecnatátoldattal, majd 10 μΐ ón(II)-klorid-oldattal (1 ml 0,01M sósavoldatban 5 mg ón-klorid). A nyomjelző izotóp kihozatalát HPLC-vel határozzuk meg (körülbelül 97%).

25. példa

a) N-[2-(trifenil-metil-merkapto)-et-l-il]-tiodiglikolsav-monoamid

31,9 g (0,1 mmol) 2-(trifenil-metil-merkapto)-etilamint és 10,1 g (0,1 mmol) trietil-amint bemérünk 500 ml abszolút metilén-dikloridba, 0 °C-on 13,2 g (0,1 mmol) tioglikolsavanhidridet csepegtetünk bele, és 1 órán át 0 °C-on, majd 16 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután 250 ml 5 tömeg%-os vizes citromsavoldatra öntjük, és jól elkeverjük. A szerves fázist elválasztjuk, és nátrium-szulfáton szárítjuk. Az oldószert vákuumban elpárologtatjuk, a maradékot szilikagélen kromatográfiával (mozgó fázis: metilén-diklorid/metanol, 0-20% metanol) tisztítjuk.

Kihozatal: 20,32 g színtelen olaj, az elméletinek 45,0%-a.

Az elemanalízis eredményei:

	C%	H%	N%	0%	S%
számított:	66,49	5,58	3,10	10,63	14,20
mért:	66,21	5,73	2,98		14,02

b) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3 ’ 5 ’-[N-(l ’,5 ’-dioxo6’-aza-3 ’-tia-8 ’-merkapto-okt-1 ’-il)-6-aminohexil-foszforsav-észtere]

Első lépésként előállítjuk a 25a) példa szerinti N[2-(trifenil-metil-merkapto)-et-1 -il]-tiodiglikolsavmonoamid N-(hidroxi-szukcinimid)-észterét. E célból

45,2 mg (0,1 mmol) fent említett savat 500 μΐ abszolút dimetil-formamidban oldunk, és összekeverjük

11,5 mg (0,1 mmol) N-hidroxi-szukcinimiddel. A 0 °Cra hűtött oldathoz 19,2 mg (0,1 mmol) EDC-t adunk, és 30 percig 0 °C-on inkubáljuk.

Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’-nek az 1. példában előállított 5’-(6-amino-hexil-foszforsav-észter)-éből 10 mg-ot 1 ml 0,lM pH = 8,0-as nátrium-hidrogén-karbonát/nátrium-karbonát pufferben oldunk, hozzáadunk 500 μΐ-t az N-(hidroxi-szukcinimid)-észter előzetesen elkészített oldatából, és 16 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 500 μΐ-re bepároljuk, és Sephadex G-25 oszlopon kromatografáljuk, így 6 mg S-tritilvédett vegyületet kapunk. Az S-tritil-védőcsoport lehasítását, az SH-csoportot hordozó oligonukleotid izolálását és tisztítását a 22e) példa szerinti módon végezzük, így 4 mg fehér, liofilizált anyagot kapunk.

c) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 5’-[N-(l’,5’-dioxo6’-aza-3’-tia-8’-merkapto-okt-l’-il)-6-aminohexil-foszforsav-észter]-ének technécium-99mkomplexe

A 25b) példa szerinti módon előállított konjugátból 1 mg-ot 1 ml 0,lM pH = 8,5-es dinátrium-hidrogén-foszfát-pufferben oldunk, hozzáadunk 10 mg dinátrium-tartarátot, összekeverjük 1 mCi nátrium-pertecnatát-oldattal, majd 10 μΐ ón(ll)-klorid-oldattal (1 ml 0,01M sósavoldatban 5 mg ón-klorid). A nyomjelző izotóp kihozatalát HPLC-vel határozzuk meg (körülbelül 91%).

26. példa

a) N,N’-bisz[2-(Trifenil-metil-merkapto)-1 -oxoet-1 -il]-3,4-diamino-benzoesav-metil-észter

3,32 g (20 mmol) 3,4-diamino-benzoesav-metilésztert és 13,38 g (40 mmol) S-trifenil-metil-merkaptoecetsavat 500 ml abszolút metilén-dikloridban oldunk, és 0 °C-on belecsepegtetjük 8,25 g (40 mmol) diciklohexil-karbodiimidnek 100 ml abszolút metilén-dikloriddal készített oldatát. A reakcióelegyet 1 órán át 0 °C-on, majd 16 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután leszűrjük, 1 tömeg%-os vizes citromsavoldattal kirázzuk, a szerves fázist nátrium-szulfáton szárítjuk, és az oldószert vákuumban elpárologtatjuk. A maradékot szilikagélen kromatográfiával (mozgó fázis: metilén-diklorid/metanol, 0-10% metanol) tisztítjuk.

Kihozatal: 10,2 g színtelen olaj, az elméletinek 63,8%-a.

Az elemanalízis eredményei:

	C%	H%	N%	0%	S%
számított:	75,16	5,30	3,51	8,01	8,02
mért:	75,01	5,58	3,30		7,89

b) N,N’-bisz[2-(Trifenil-metil-merkapto)-1-oxoet-1 -il]-3,4-diamino-benzoesav

200 ml dioxán, 20 ml víz és 20 ml metanol elegyében 7,99 g (10 mmol) N,N’-bisz[2-(trifenil-metil-merkapto)-1 -oxo-et-1 -il]-3,4-diamino-benzoesav-metil-észtert [(26a) példa] 4 g (100 mmol) nátrium-hidroxiddal keverünk. A reakcióelegyet 5 órán át szobahőmérsékleten keveijük, majd 300 ml 5 tömeg%-os vizes citromsavoldatra öntjük, és metilén-dikloriddal teljes mértékben extraháljuk. A szerves fázist nátrium-szulfáton szárítjuk. Az oldószert vákuumban elpárologtatjuk, a maradékot szilikagélen kromatográfiával (mozgó fázis: metiléndiklorid/metanol, 0-40% metanol) tisztítjuk.

HU 220 859 Bl

Kihozatali 3,56 g színtelen olaj, az elméletinek 45,4%-a.

Az elemanalízis eredményei:

	C%	H%	N%	0%	S%
számított:	74,97	5,14	3,57	8,15	8,17
mért:	74,71	5,32	3,31		7,88

c) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 5’-{N-[3’,4’bisz(2”-merkapto-acetil-amino)-benzoil]-6-amino-hexil-foszforsav-észtere}

Első lépésként előállítjuk a 26b) példa szerinti

N, N’-bisz[2-(trifenil-metil-merkapto)-l-oxo-et-l-il]3,4-diamino-benzoesav N-(hidroxi-szukcinimid)-észterét. Ecélból a savból 78,5 mg-ot (0,1 mmol) 500 pl abszolút dimetil-formamidban oldunk, és összekeverjük 11,5 mg (0,1 mmol) N-hidroxi-szukcinimiddel. A 0 °C-ra hűtött oldathoz 19,2 mg (0,1 mmol) EDC-t adunk, és 30 percig 0 °C-on inkubáljuk. Az 5’CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’-nek az 1. példában előállított 5’(6-amino-hexil-foszforsav-észter)-éből 10 mg-ot 1 ml

O, lM pH = 8,0-as nátrium-hidrogén-karbonát/nátriumkarbonát pufferben oldunk, hozzáadunk 500 μΐ-t az N(hidroxi-szukcinimid)-észter előzetesen elkészített oldatából, és 17 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 500 μΐ-re bepároljuk, és Sephadex G-25 oszlopon kromatografáljuk, így 7 mg S-triti 1-védett vegyületet kapunk.

Az S-tritil-védőcsoport lehasítását, az SH-csoportot hordozó oligonukleotid izolálását és tisztítását a 22e) példa szerinti módon végezzük, így 3 mg fehér, liofilizált anyagot kapunk.

c) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 5’-{N-[3’,4’bisz(2”-merkapto-acetil-amino)-benzoil]-6-amino-hexil-foszforsav-észter} -ének technécium99m-komplexe

A 26c) példa szerinti módon előállított konjugátból 1 mg-ot 1 ml 0,lM pH=9,5-es dinátrium-hidrogénfoszfát-pufferben oldunk, hozzáadunk 10 mg dinátrium-tartarátot, összekeverjük 1 mCi nátrium-pertecnatát-oldattal, majd 10 μΐ ón(II)-klorid-oldattal (1 ml 0,01M sósavoldatban 5 mg ón-klorid). A nyomjelző izotóp kihozatalát HPLC-vel határozzuk meg (körülbelül 91%).

7. példa

a) N-[O-Acetil-(hidroxí-acetil)]-glicil-glicil-glicin-terc-butil-észter

500 ml abszolút dimetil-formamidban 0 °C-on

24,5 g (0,1 mól) glicil-glicil-glicin-terc-butil-észtert

11,8 g (0,1 mól) O-acetil-glikolsavval keverünk. A reakcióelegybe belecsepegtetjük 20,6 g (0,1 mól) diciklohexil-karbodiimidnek 500 ml abszolút dimetilformamiddal készített oldatát, majd 1 órán át 0 °C-on, azután egy éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután leszűrjük, a szűrletet olajszivattyúval létesített vákuumban bepároljuk, majd etil-acetát és pentán elegyéből többször átkristályosítjuk.

Kihozatal: 12,5 g fehér por, az elméletinek 36,2%-a.

Az elemanalízis eredményei:

	C%	H%	N%	0%
számított:	48,69	6,71	12,17	32,43
mért:	48,43	7,01	11,93

b) N-[O-Acetil-(hidroxi-acetil)]-glicil-glicil-glicin 3,45 g (10 mmol) N-[O-acetil-(hidroxi-acetil)]-glicil-glicil-glicin-terc-butil-észtert 50 ml trifluor-ecetsavval 15 percig keverünk, azután 500 ml abszolút dietilészterre öntjük, és a terméket leszűrjük. Etil-acetát és pentán elegyéből többször átkristályosítjuk.

Kihozatal: 1,23 g fehér por, az elméletinek 42,5%-a. Az elemanalízis eredményei:

	C%	H%	N%	0%
számított:	41,53	5,23	14,53	38,72
mért:	41,31	5,51	14,32

c) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 5’-{N-[N’-(hidroxi-acetil)]-glicil-glicil-glicil]-6-amino-hexilfoszforsav-észtere}

Első lépésként előállítjuk a 27b) példa szerinti N[O-acetil-(hidroxi-acetil)]-glicil-glicil-glicin N-(hidroxi-szukcinimid)-észterét. E célból a savból 28,9 mgot (0,1 mmol) 500 μΐ abszolút dimetil-formamidban oldunk, és összekeverjük 11,5 mg (0,1 mmol) N-hidroxiszukcinimiddel. A 0 °C-ra hűtött oldathoz 19,2 mg (0,1 mmol) EDC-t adunk, és 30 percig 0 °C-on inkubáljuk. Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’-nek az 1. példában előállított 5’-(6-amino-hexil-foszforsav-észter)-éből 10 mg-ot 1 ml 0,lM nátrium-karbonát-oldatban oldunk, hozzáadunk 500 μΐ-t az N-(hidroxi-szukcinimid)-észter előzetesen elkészített oldatából, és 18 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 500 μΐ-re bepároljuk, és Sephadex G-25 oszlopon kromatografáljuk. Fagyasztva szárítás után 3 mg-ot kapunk a cím szerinti vegyületből.

d) Az 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ 5’-{N-[N’-(hidroxi-acetil)]-glicil-glicil-glicil]-6-amino-hexilfoszforsav-észter} -ének technécium-99m-komplexe

A 27c) példa szerinti módon előállított konjugátból 1 mg-ot 1 ml 0,lM pH=10,5-es dinátrium-hidrogénfoszfát-pufferben oldunk, hozzáadunk 10 mg dinátrium-tartarátot, összekeverjük 1 mCi nátrium-pertecnatát-oldattal, majd 10 μΐ ón(II)-klorid-oldattal (1 ml 0,01M sósavoldatban 5 mg ón-klorid). A nyomjelző izotóp kihozatalát HPLC-vel határozzuk meg (körülbelül 95%).

A fenti példákat hasonló eredményekkel ismételhetjük meg oly módon, hogy a találmány szerinti, általánosan vagy speciálisan leírt reagenseket és/vagy reakciókörülményeket a példákban szereplőkkel helyettesítjük.

A fenti leírás alapján az átlagosan művelt szakember számára a találmány alapvető jellemzői nyilvánvalóvá válnak, és képes lesz arra, hogy a találmánynak különböző felhasználási területekhez és körülményekhez való adaptálására különböző változtatásokat és módosításokat hajtson végre anélkül, hogy annak szellemétől vagy oltalmi körétől eltérne.

Claims (17)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. (I) általános képletű oligonukleotidkonjugátok, amelyek egy N-oligonukleotid-csoportot és n számú B-K általános képletű szubsztituenst tartalmaznak ahol a B közvetlen kötést vagy egy, az oligonukleotidcsoporthoz kapcsoló komponenst, a K pedig egy komplexképző reagenst vagy az 5, 21-29, 31, 39, 42-44, 49, 57-83 vagy 85 atomszámú elemek radioaktív fémizotópjaival vagy olyan stabil izotópjaival képzett komplexet jelent, amelyeket

   - külső sugárzással radioaktív izotópokká alakítunk át, vagy amelyek

   - a kívülről kapott sugárzást más minőségű, eltérő energiatartalmú és/vagy eltérő hullámhosszúságú sugárzássá alakítják át -, azzal jellemezve, hogy az N-oligonukleotid-csoport egy olyan módosítást tartalmaz, amely a természetben előforduló nukleázok hatására bekövetkező lebomlást megakadályozza vagy legalábbis erősen gátolja, mimellett az oligonukleotid nagy kötéserősséggel, specifikusan kötődik egy célstruktúrához, azzal a feltétellel, hogy az N-oligonukleotid-csoport SELEX eljárással előállított.
2. 2. Egy 1. igénypont szerinti (I) általános képletű vegyület, amely képletben

   N jelentése egy, a célstruktúrákhoz specifikusan, nagy affinitással kötődő oligonukleotid olyan módosításokkal, amelyek a természetben előforduló nukleázok hatására bekövetkező lebomlást erőteljesen csökkentik,

   B jelentése kémiai kötés vagy egy, az N és a K között kapcsolatot létesítő kapcsolókomponens,

   K egy komplexképző ligandot jelent, amely egy jeltovábbító vagy terápiásán hatásos elemet képezhet, és η 1 és 10 közötti számot jelent, azzal a feltétellel, hogy az N-oligonukleotid-csoport SELEX eljárással előállított.
3. 3. Egy, az 1. vagy 2. igénypont szerinti vegyület, amelyben N egy 5-200 nukleotidból álló oligonukleotid, amelyben

   a) a cukoregység 2’-helyén egymástól függetlenül a következő csoportok szerepelhetnek:

   egy OR általános képletű csoport - amelyben

   R jelentése 1 -20 szénatomos alkilcsoport, amely adott esetben legfeljebb 2 hidroxilcsoportot tartalmaz, és adott esetben 1-5 oxigénatommal van megszakítva -, hidrogénatom, hidroxilcsoport, fluoratom, amingyök, aminocsoport, a 3’ vagy 5’ terminális helyen jelen lévő hidroxilcsoport, amelyek egymástól függetlenül adott esetben egy R csoporttal észterezettek, és/vagy

   b) az adott esetben intemukleotid kötésként használt foszfodiészterek egymástól függetlenül foszfor-tioátokkal, foszfor-ditioátokkal vagy alkil-foszfonátokkal, előnyösen metil-foszfonáttal vannak helyettesítve, és/vagy

   c) a 3’ és 5’ helyen lévő terminális csoportok intramolekulárisan egy, a b) pontban leírt intemukleotid kötéssel kapcsolódnak egymáshoz, és/vagy

   d) az oligonukleotid egy, a b) pontban leírt internukleotid kötést tartalmaz, amely a 3’-3’- vagy az 5’-5’- pozíciót összeköti, és/vagy

   e) az oligonukleotid egy, a b) pontban leírt foszfodiészter-kötést tartalmaz, amely két timidint észterszerűen összeköt mindkettőnek a 3-as helyén egy 2-10 szénatomos hidroxil-alkil-csoporttal, vagy egy analóg módon szubsztituált timidincsoportot észterszerűen összeköt egy, a 2’- vagy 3’- vagy 5’-helyen található másik cukor hidroxilcsoportjával, és/vagy

   f) a 3’ és 5’ helyen lévő terminális csoportok olyan intemukleotid kötéseket tartalmaznak, amelyek adott esetben a b) pontban leírtak szerint módosítottak.
4. 4. A 3. igénypont szerinti vegyület, amelyben az N oligonukleotid 15-100 nukleotidot tartalmaz.
5. 5. Az 1 -4. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, amelyben N egy, más célstruktúrákhoz specifikusan, nagy affinitással kötődő oligonukleotid, amely úgy állítható elő, hogy egy random szekvenciákat tartalmazó oligonukleotidkeveréket összehozunk a célstruktúrával, és az oligonukleotidokat, amelyek az oligonukleotidkeverékhez viszonyítva a célstruktúrákhoz nagyobb affinitást mutatnak, az oligonukleotidkeverék többi részétől elválasztjuk, majd a célstruktúrákhoz nagyobb affinitást mutató oligonukleotidokat amplifikálva egy olyan oligonukleotidkeveréket kapunk, amely a célstruktúrákhoz kötődő oligonukleotidokat nagyobb arányban tartalmazza.
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, amelyben N egy, más célstruktúrákhoz specifikusan, nagy affinitással kötődő oligonukleotid, amely úgy állítható elő, hogy

   a) először kémiai szintézissel előállítunk egy DNSszálat, amely a 3’-végen egy meghatározott szekvenciát tartalmaz, amely az RNS-polimeráz promoterének komplementere, és ugyanakkor a polimeráz láncreakció (PCR) egyik primeijének komplementere, és ez a DNS-szál az 5’-végen egy meghatározott DNS-szekvenciát tartalmaz, amely a polimeráz láncreakció egyik primer szekvenciájának komplementere, és a meghatározott szekvenciák közötti szakasz egy random szekvenciát tartalmaz, majd

   b) ezt a DNS-szálat egy RNS-polimerázzal egy komplementer RNS-szállá írjuk át, és a polimeráznak a ribóz egység 2’-helyén módosított nukleotidokat ajánlunk fel, majd

   c) az ily módon kapott RNS-oligonukleotidokat összehozzuk a célstruktúrával, amelyhez az oligonukleotid specifikusan kötődik, majd

   d) először a célstruktúrához kötődött oligonukleotidokat a célstruktúrával együtt elválasztjuk a nem kötődött oligonukleotidoktól, azután a megkötött oligonukleotidokat elválasztjuk a célstruktúrától, majd

   e) ezeket a célstruktúra-specifikus RNS-oligonukleotidokat reverz transzkriptáz segítségével egy komplementer DNS-szállá írjuk át, majd

   f) az így kapott DNS-szálakat polimeráz láncreakcióval, a meghatározott primer szekvenciák alkalmazásával amplifikáljuk, majd

   HU 220 859 BI

   g) az ily módon amplifikált DNS-oligonukleotidokat az RNS-polimeráz és módosított nukleotidok segítségével ismét RNS-oligonukleotidokká írjuk át, majd

   h) a fenti c)-g) pontok szerinti elválasztási lépéseket adott esetben mindaddig ismételjük, míg a célstruktúrákhoz nagy affinitással kötődő oligonukleotidok megfelelő elválasztását el nem érjük; és adott esetben az így kapott oligonukleotid szekvenciáját meghatározzuk.
7. 7. A 6. igénypont szerinti vegyület, ahol a célstruktúrát makromolekulák, magasabb rendű élőlények - például állatok vagy emberek - szövetszerkezetei, állatok vagy emberek szervei vagy szervrészei, sejtek, tumorsejtek vagy tumorok közül választjuk.
8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti vegyület, amelyben az egy vagy több B komponens

   a) a 4’-helyen a CH₂-OH csoporttal redukált Noligonukleotid-gyök 4’-végéhez és/vagy

   b) a 3’-helyen egy hidrogénatommal redukált Noligonukleotid-gyök 3’-végéhez és/vagy

   c) a két nukleotid közötti, egy vagy több hidroxicsoporttal redukált foszfodiészter hídhoz/hidakhoz, és/vagy

   d) az 5-, illetve 8-helyen egy hidrogénatommal és/vagy a 2-, 4- vagy 6-helyen aminocsoport(ok)kal redukált 1-10 nukleobázishoz kötődik.
9. 9. A 8. igénypont a) vagy b) pontja szerinti vegyület, ahol

   B jelentése X-Y-Z¹ általános képletű csoport, amely az X végén a komplexképző reagenshez vagy komplexhez, Z végén pedig az oligonukleotidhoz kapcsolódik, és amelyben

   X jelentése kötés, -NH csoport vagy kénatom;

   Y jelentése egyenes vagy elágazó, telített vagy telítetlen 1-20 szénatomos alkilénlánc, amely adott esetben 1-2 ciklohexilén-, 1-5 imino-, 1-3 fenilén-, 1-3 fenilén-imino-, 1-3 fenilén-oxi-, 1-3 hidroxi-fenilén-, 1-5 amido-, 1-2 hidrazido-, 1-5 karbonil-, 1-5 etilénoxi-, ureido-, tioureido-, 1-2 karboxi-alkil-imino-, 1-2 észtercsoportot vagy 1-3 Ar-csoportot - ahol Árjelentése egy telített vagy telítetlen 5- vagy 6-tagú, adott esetben 1 vagy 2 heteroatomot, éspedig nitrogén-, oxigén-, kénatomot és/vagy 1-2 karbonilcsoportot tartalmazó gyűrű -; 1-10 oxigén-, 1-5 nitrogén- és/vagy 1-5 kénatomot tartalmaz, és/vagy adott esetben 1-5 hidroxi-, 1-2 merkapto-, 1-5 oxo-, 1-5 tioxo-, 1-3 karboxi-, 1-5 karboxi-(l-4 szénatomos alkil)-, 1-5 észter-, 1-3 amino-, 1-3 hidroxi-(l-4 szénatomos alkil)-, 1-3 1-7 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituált; és

   Z¹ jelentése -CONH-CH₂-4’, -NH-CO-4’, -O-P(O)R'-NH-CH₂-4’, -O-P(O)R'-O-CH₂-4’, -O-P(S)R*-O-3’ vagy -O-P(O)R’-O-3’ általános képletű csoport, amely csoportokban 4’ és 3’ a terminális cukorcsoport(ok)hoz való kapcsolódást jelzi, és R¹ jelentése O , S1-4 szénatomos alkilcsoport vagy NR²R³ általános képletű csoport, amelyben R² és R³ jelentése hidrogénatom vagy 1 -4 szénatomos alkilcsoport.
10. 10. A 8. igénypont c) pontja szerinti vegyület, amelyben B jelentése X-Y-Z² általános képletű csoport, amely az X végén a komplexképző reagenshez vagy komplexhez, Z végén pedig az oligonukleotidhoz kapcsolódik, és a két szomszédos cukoregységet összekötő (a) és/vagy (b) általános képletű hídban

    Z² jelentése -NR²- általános képletű csoport, oxigén- vagy kénatom;

    X jelentése kötés, -NH csoport vagy kénatom;

    Y jelentése egyenes vagy elágazó, telített vagy telítetlen 1-20 szénatomos alkilénlánc, amely adott esetben 1-2 ciklohexilén-, 1-5 imino-, 1-3 fenilén-, 1-3 fenilén-imino-, 1-3 fenilén-oxi-, 1-3 hidroxi-fenilén-, 1-5 amido-, 1-2 hidrazido-, 1-5 karbonil-, 1-5 etilén-oxi-, ureido-, tioureido-, 1-2 karboxi-alkilimino-, 1-2 észtercsoportot vagy 1-3 Ar-csoportot ahol Ar jelentése egy telített vagy telítetlen 5- vagy 6tagú, adott esetben 1 vagy 2 heteroatomot, éspedig nitrogén-, oxigén-, kénatomot és/vagy 1-2 karbonilcsoportot tartalmazó gyűrű -; 1-10 oxigén-, 1-5 nitrogén- és/vagy 1-5 kénatomot tartalmaz, és/vagy adott esetben 1-5 hidroxi-, 1-2 merkapto-, 1-5 oxo-, 1-5 tioxo-, 1-3 karboxi-, 1-5 karboxi-(l-4 szénatomos alkil)-, 1-5 észter-, 1-3 amino-, 1-3 hidroxi(1-4 szénatomos alkil)-, 1-3 1-7 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituált; és

    R² jelentése hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport.
11. 11. A 8. igénypont d) pontja szerinti vegyület, amelyben

    B jelentése X-Y-Z³ általános képletű csoport, ebben

    Z³ jelentése -NH csoport vagy közvetlen kötés a nukleobázishoz,

    X jelentése kötés, -NH csoport vagy kénatom;

    Y jelentése egyenes vagy elágazó, telített vagy telítetlen 1-20 szénatomos alkilénlánc, amely adott esetben 1-2 ciklohexilén-, 1-5 imino-, 1-3 fenilén-, 1-3 fenilén-imino-, 1-3 fenilén-oxi-, 1-3 hidroxifenilén-, 1-5 amido-, 1-2 hidrazido-, 1-5 karbonil-, 1-5 etilén-oxi-, ureido-, tioureido-, 1-2 karboxi-alkilimino-, 1-2 észtercsoportot vagy 1-3 Ar-csoportot ahol Ar jelentése egy telített vagy telítetlen 5- vagy 6tagú, adott esetben 1 vagy 2 heteroatomot, éspedig nitrogén-, oxigén-, kénatomot és/vagy 1-2 karbonilcsoportot tartalmazó gyűrű - ; 1-10 oxigén-, 1-5 nitrogén- és/vagy 1-5 kénatomot tartalmaz, és/vagy adott esetben 1-5 hidroxi-, 1-2 merkapto-, 1-5 oxo-, 1-5 tioxo-, 1-3 karboxi-, 1-5 karboxi-(l-4 szénatomos alkil)-, 1-5 észter-, 1-3 amino-, 1-3 hídroxi(1-4 szénatomos alkil)-, 1-3 1-7 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituált.
12. 12. Az előző igénypontok valamelyike szerinti vegyület, ahol a fémkomplex, mint képalkotó elem a réz, bizmut, technécium, rénium vagy indium egy radioaktív izotópját tartalmazza.
13. 13. Egy célstruktúra kimutatására szolgáló eljárás, azzal jellemezve, hogy egy vagy több, a fenti igénypontok valamelyike szerinti vegyületet összehozunk az in vitro vizsgálandó mintával, és a jel alapján kimutatjuk, hogy a specifikusan, nagy affinitással kötődő N-oligonukleotid jelen van-e a mintában.
14. 14. Eljárás betegségek roncsolásmentes diagnosztizálására, azzal jellemezve, hogy egy vagy több, a fenti

    HU 220 859 Bl

    1-12. igénypontok valamelyike szerinti vegyületet összehozunk a vizsgálandó célstruktúrával, és a jel alapján kimutatjuk, hogy a célstruktúra, amelyhez az N-oligonukleotid specifikusan kötődik, jelen van-e a vizsgált szervezetben.
15. 15. Egy, a fenti 1-12. igénypontok valamelyike szerinti vegyület alkalmazása a radiodiagnózisban és/vagy radioterápiában.
16. 16. Diagnosztikai kit célstruktúrák in vitro kimutatására, azzal jellemezve, hogy az 1-12. igénypontban fel- 10 sorolt vegyületek közül legalább egyet tartalmaz.
17. 17. Az 1-4. igénypontok valamelyike szerinti vegyület, amelyben N egy, a természetben nem található, SELEX eljárással előállított oligonukleotidligandum, amely specifikus affinitással kötődik a megcélzott mole5 kulához, és ez a molekula egy háromdimenziós, nem polinukleotid kémiai szerkezet, amely főleg a Watson/Crick bázispárosításon vagy tripla helixkötésen alapuló mechanizmussal kötődik az oligonukleotidligandumhoz, amely oligonukleotidligandum nem egy nukleinsav, amelynek ismert fiziológiai funkciója, hogy a célmolekulához kötődjék.