DE4445078A1

DE4445078A1 - Konjugate aus Metallkomplexen und Oligonucleotiden, diese enthaltende Mittel, deren Verwendung in der Radiodiagnostik sowie Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE4445078A1
Application number: DE19944445078
Authority: DE
Inventors: Ludger Dr Dinkelborg; Christoph-Stephan Dr Hilger; Ulrich Dr Niedballa; Johannes Dr Platzek; Bernd Dr Raduechel; Ulrich Prof Dr Speck
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1994-12-05
Filing date: 1994-12-05
Publication date: 1996-06-13

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand, daß heißt Oligonucleotid- Konjugate, die einen Komplexbildner oder einen Komplex enthalten. Diese Konjugate finden Verwendung im Bereich der Diagnostik und Therapie.

Die bildgebende Diagnostik hat in den vergangenen Jahrzehnten große Fortschritte erzielt und entwickelt sich laufend weiter. Es ist heute möglich, das Blutgefäßsystem, die meisten Organe und viele Gewebe im lebenden Körper ohne größere Eingriffe sichtbar zu machen. Erkrankungen werden vielfach diagnostiziert, weil sie zu deutlichen Veränderungen der Form, Größe und Lage anatomischer Strukturen im Körper führen. Derartige anatomische Informationen aus dem Inneren des Körpers sind mittels der Röntgentechnik, der Ultraschalldiagnostik und der magnetischen Resonanztomographie zu erhalten. Jede der genannten Techniken kann durch den Einsatz pharmazeutischer Mittel zur Verstärkung der natürlichen Kontraste der Gewebe und Körperflüssigkeiten im resultierenden Bild in der Leistungsfähigkeit verbessert werden. Die betreffenden pharmazeutischen Mittel werden in Körperhöhlen eingebracht oder in Blutgefäße injiziert, mit dem Ziel, die Höhlen oder Gefäße im Kontrast zu verändern. Sie werden zusätzlich durch den Blutstrom im Organismus verteilt und können Organe und Gewebe in der Sichtbarkeit verändern. In Ausnahmefällen werden solche Substanzen an bestimmte Strukturen im Körper gebunden und/oder von diesen aktiv transportiert und/oder ausgeschieden. Auf diese Weise können im Einzelfall auch Funktionen sichtbar gemacht wer den und zur Diagnose von Erkrankungen genutzt werden.

Demgegenüber basiert die Nucleardiagnostik auf Substanzen, die selbst sichtbar gemacht werden können. In diesem Falle werden radioaktive Isotope, die weitreichende Strahlung aussenden, in den Körper eingebracht. Die Verteilung dieser Substanzen im Organismus kann mittels geeigneter Detektoren verfolgt werden. Vorteil der nuclearmedizinischen Verfahren ist die hohe Wirksamkeit bei geringer Dosierung der als Radiopharmaka bezeichneten signalgebenden radioaktiven Substanzen.

Werden Isotope verwendet, die α- oder β-Strahlung oder andere im Gewebe wirksame toxische Zerfallsprodukte frei setzen, so können Radiopharmaka auch für therapeutische Zwecke, z. B. zur Zerstörung von Tumoren, eingesetzt werden. Das gleiche Ziel kann auch dadurch erreicht werden, daß nichtschädliche Isotope oder Substanzen in den Körper eingebracht und erst dort durch z. B. Neutronen- oder Röntgenstrahlung, Ultraschall oder Radiowellen in eine therapeutisch wirksame Form überführt werden.

Ein generelles Problem ist die Diagnose und Lokalisierung von krankhaften Veränderungen zu einem Zeitpunkt, zu dem keine deutlichen Veränderungen der Form, Struktur und Durchblutung der betreffenden Organe und Gewebe vorliegen. Eine solche Diagnose und Verlaufskontrolle ist z. B. bei Tumorerkrankungen einschließlich der Suche nach Metastasen, der Beurteilung einer Minderversorgung von Geweben mit Sauerstoff und bei bestimmten Infektionen sowie Stoffwechselerkrankungen von entscheidender Bedeutung.

Die heute verfügbaren therapeutischen und bildgebenden diagnostischen Methoden sind wesentlich auf die Verfügbarkeit von pharmazeutischen Präparaten angewiesen, die sich an Orten anderweitig nicht erkennbarer pathologi scher Veränderungen anreichern.

Die derzeit im Handel befindlichen Kontrastmittel sind ganz überwiegend sogenannte unspezifische Präparate. Sie verteilen sich passiv in denjenigen Räumen, in die sie z. B. durch Injektion eingebracht werden.

In der Vergangenheit sind eine Vielzahl von Substanzen und Substanzklassen identifiziert worden, die eine Spezifität im Hinblick auf ihre Verteilung im lebenden Organismus er kennen oder erwarten lassen. Beispiele dafür sind außer den Antikörpern Lectine, alle Arten rezeptorgebundener Substanzen, Zellen, Membranen- und Membranbestandteile, Nucleinsäuren, natürliche Metabolite und deren Derivate, sowie zahllose Arzneistoffe. Mit besonderer Sorgfalt wurden und werden auch Peptide untersucht.

Das US-Patent 4 707 352 befaßt sich mit einem speziellen Verfahren, komplexbildende Moleküle mit radioaktiven Isotopen zu markieren, jedoch werden keine gut geeigneten Komplexbildner für die Bindung von Metallionen beschrieben.

Die EP 0 285 057 beschreibt Nucleotid-Komplexbildner- Konjugate, die u. a. wegen der in vivo Instabilität der verwendeten Nucleotide für die Anwendung als in vivo- Diagnostika oder Therapeutika nicht geeignet sind und auch kaum die sonstigen Anforderungen an Verträglichkeit und Pharmakokinetik erfüllen.

Eine Vielzahl von US-Patenten, wie beispielsweise das US- Patent 4 707 440, befaßt sich mit modifizierten Polymeren, die eine detektierbare chemische Gruppe enthalten. Die Polymere können Polynucleotide und Oligonucleotide sein, diese sind aber weder gegen einen Abbau durch natürlich vorkommende Nucleasen stabilisiert, noch durch ein spezielles Verfahren so ausgewählt, daß sie spezifisch mit hoher Bindungsaffinität an Zielstrukturen binden. Besondere Ausführungsformen dieser detektierbaren Moleküle werden in den US-Patenten 4 843 122 und 4 943 523 genannt. Ein auf diese Weise modifiziertes, einzelnes Nucleotid wird in US- Patent 4 952 685 beansprucht. Die Verwendung dieser Mittel in bildgebenden Verfahren wird in US-Patent 4 849 208 offenbart.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung spezifisch bindender diagnostischer Mittel für den Nachweis von Zielstrukturen, wodurch beispielsweise die Darstellung von Organen, Geweben und deren pathologischen Veränderungen in vitro und in vivo ermöglicht wird.

Es wurde nun gefunden, daß Oligonucleotid-Konjugate, die neben einem Oligonucleotid-Rest einen über eine direkte Bindung oder eine Verbindungskomponente gebundenen Komplex bildner aufweisen und deren Oligonucleotid-Rest so modifiziert ist, daß der Abbau durch natürlich vorkommende Nucleasen verhindert oder wenigstens wesentlich gehemmt wird, diese Aufgabe lösen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind:

1) Oligonucleotid-Konjugate bestehend aus einem Oligonucleotid-Rest N und n Substituenten (B-K), worin B für eine direkte Bindung oder eine Verbindungskomponente zum Oligonucleotid-Rest steht und K ein Komplexbildner oder Komplex von radioaktiven Metallisotopen, oder stabilen Isotopen, die
- - durch Strahlung von außen in radioaktive Isotope umgewan delt werden,
- - Strahlung von außen in Strahlung anderer Qualität, anderen Energiegehalts und/oder anderer Wellenlänge umwandeln,
der Elemente der Ordnungszahlen 5, 21-29, 31, 39, 42-44, 49, 57-83 oder 85 bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß der Oligonucleotid-Rest N eine Modifikation aufweist, die den Abbau durch natürlich vorkommende Nucleasen verhindert oder wenigstens wesentlich hemmt.
2) In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Oligonucleotid-Konjugate der vorliegenden Erfindung die allgemeine Formel I N-(B-K)_n (I)auf, worin
N ein Oligonucleotid ist, das spezifisch mit hoher Bindungsaffinität an andere Zielstrukturen bindet und Modifikationen aufweist, die den Abbau durch natürlich vorkommende Nucleasen wesentlich vermindern,
B eine chemische Bindung oder eine Verbindungskomponente ist, die die Verbindung zwischen N und K herstellt und
K ein komplexbildender Ligand ist, der ein signalgebendes oder therapeutisch wirksames Element aufweisen kann und
n eine Zahl zwischen 1 und 10 ist.
3) Verbindung gemäß 1 oder 2, worin N ein Oligonucleotid mit 5 bis 200 Nucleotiden ist, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) die 2′-Position der Zuckereinheit unabhängig voneinander mit folgenden Gruppen besetzt ist:
  einer Gruppe OR, worin
  R ein Alkylrest mit 1-20 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls bis zu 2 Hydroxylgruppen enthält und der gegebenenfalls durch 1-5 Sauerstoffatome unterbrochen ist, bedeutet,
  einem Wasserstoffatom,
  einer Hydroxylgruppe,
  einem Fluoratom,
  einem Aminrest,
  einer Aminogruppe,
  und in den terminalen Positionen 3′ und 5′ vorhandene Hydroxylgruppen unabhängig voneinander gegebenenfalls mit dem Rest R verethert sind und/oder
- b) gegebenenfalls die als Internucleotidbindung dienenden Phosphodiester unabhängig voneinander durch Phosphothioate, Phosphodithioate oder Alkylphosphonate, bevorzugt Methylphosphonat ersetzt sind, und/oder
- c) die terminalen Reste in den Positionen 3′ und 5′ durch eine wie in b) beschriebene Internucleotidbindung intramolekularer miteinander verknüpft sind und/oder
- d) es eine wie in b) beschriebene Internucleotidbindung enthält, die die Positionen 3′-3′ oder 5′-5′ verknüpft, und/oder
- e) es eine wie in b) beschriebene Phosphodiesterbindung enthält, die zwei Thymidine über jeweils einen in der 3-Stellung befindlichen C₂-C₂₀-Hydroxyalkylrest esterartig verbindet oder einen analog substituierten Thymidinrest esterartig mit einer Hydroxylgruppe eines anderen Zuckers in den Positionen 2′ oder 3′ oder 5′ verbindet; und/oder
- f) die terminalen Reste in den Positionen 3′ und 5′ gege benenfalls wie in b) beschriebene modifizierte Internucleotidbindungen enthalten.
4) Verbindung gemäß 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonucleotid N 15 bis 100 Nucleotide umfaßt.
5) Verbindung gemäß den Punkten 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß N ein Oligonucleotid ist, das spezifisch mit hoher Bindungsaffinität an andere Zielstrukturen bindet und das dadurch erhältlich ist, daß eine Zufallssequenzen enthaltende Mischung von Oligo nucleotiden mit der Zielstruktur zusammengebracht wird, wobei bestimmte Oligonucleotide eine erhöhte Affinität zu der Zielstruktur im Verhältnis zu der Mischung der Oligonucleotide aufweisen, diese von dem Rest der Oligo nucleotidmischung abgetrennt werden, dann die Oligo nucleotide mit erhöhter Affinität zu der Zielstruktur amplifiziert werden, um eine Mischung von Oligonucleotiden zu erhalten, die einen erhöhten Anteil an Oligonucleotiden aufweist, die an die Zielstrukturen binden.
6) Verbindungen, wie in den Punkten 1 bis 5 beschrieben, dadurch gekennzeichnet, daß N ein Oligonucleotid ist, das spezifisch mit hoher Bindungsaffinität an andere Ziel strukturen bindet und das dadurch erhältlich ist, daß
- a) zunächst ein DNA-Strang durch chemische Synthese derart hergestellt wird, daß dieser DNA-Strang am 3′-Ende eine definierte Sequenz aufweist, die komplementär zu einem Promoter für eine RNA-Polymerase ist und zugleich komplementär zu einem Primer der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist und, daß dieser DNA-Strang am 5′-Ende eine definierte Sequenz aufweist, die komplementär zu einer Primersequenz für die Polymerase-Kettenreaktion ist, wobei die Sequenz zwischen den definierten Sequenzen eine Zufallssequenz enthält und, daß
- b) dieser DNA-Strang mit Hilfe einer RNA-Polymerase in einen komplementären RNA-Strang umgeschrieben wird, wobei der Polymerase Nucleotide angeboten werden, die an der 2′- Position der Riboseeinheit modifiziert sind und, daß
- c) die auf diese Weise hergestellten RNA-Oligonucleotide mit der Zielstruktur, an die das Oligonucleotid spezifisch binden soll, zusammengebracht werden und, daß
- d) diejenigen Oligonucleotide, die an die Zielstruktur gebunden haben, zuerst zusammen mit der Zielstruktur von den nicht bindenden Oligonucleotiden abgetrennt werden und dann die gebundenen Oligonucleotide von der Zielstruktur wieder abgetrennt werden und, daß
- e) diese Zielstruktur-spezifischen RNA-Oligonucleotide mit Hilfe der Reversen Transkriptase in einen komplementären DNA-Strang umgeschrieben werden und, daß
- f) diese DNA-Stränge unter Verwendung der definierten Primersequenzen mit der Polymerase Kettenreaktion amplifiziert werden und, daß
- g) die auf diese Art und Weise amplifizierten DNA- Oligonucleotide dann wieder mit Hilfe der RNA-Polymerase und mit modifizierten Nucleotiden in RNA-Oligonucleotide umgeschrieben werden und, daß
- h) die oben genannten Selektionsschritte c) bis g) gegebenenfalls so oft wiederholt werden, bis die Oligonucleotide, die durch eine hohe Bindungsaffinität zu der Zielstruktur charakterisiert sind, hinreichend selektioniert sind und anschließend die Sequenzen der so erhaltenen Oligonucleotide gegebenenfalls bestimmt werden können.
7) Verbindungen gemäß 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielstruktur ausgewählt ist unter Makromolekülen, Gewebe strukturen von höheren Organismen wie Tieren oder Menschen, Organen oder Teilen von Organen eines Tieres oder des Menschen, Zellen, Tumorzellen oder Tumoren.
8) Verbindung gemäß der Punkte 1 bis 7, dadurch gekenn zeichnet, daß die Verbindungskomponente B
- a) an das 4′-Ende des in der 4′-Position um die CH₂-OH- Gruppe verminderten Oligonucleotid-Rests N und/oder
- b) an das 3′-Ende des in der 3′-Position um ein Wasserstoffatom verminderten Oligonucleotid-Rests N und/oder
- c) an die um die OH-Gruppe(n) verminderte(n) Phosphodiesterbrücke (n) zwischen jeweils zwei Nucleotiden und/oder
- d) an 1 bis 10 Nucleobase(n), die jeweils in der/den Position(en) 5, 8 und/oder der Aminogruppe(n) der Position(en) 2, 4 und 6 um ein Wasserstoffatom vermindert ist (sind),
gebunden ist (sind).
9) Verbindung nach Punkt 8a) oder 8b), dadurch gekenn zeichnet, daß B die allgemeine Formel X-Y-Z¹ hat, die X-seitig mit dem Komplexbildner oder Komplex und Z-seitig mit dem Oligonucleotid verbunden ist, worin
X für eine direkte Bindung, eine -NH- oder -S-Gruppe steht,
Y für eine gerad-, verzweigtkettige, gesättigte oder ungesättigte C₁-C₂₀-Alkylenkette steht, die gegebe nenfalls 1-2 Cyclohexylen-, 1-5 Imino-, 1-3 Phenylen-, 1-3 Phenylenimino-, 1-3 Phenylenoxy-, 1-3 Hydroxy phenylen-, 1-5 Amido-, 1-2 Hydrazido-, 1-5 Carbonyl-, 1-5 Ethylenoxy-, eine Ureido-, eine Thioureido-, 1-2 Carboxyalkylimino-, 1-2 Estergruppen, 1-3 Gruppen Ar, worin Ar für einen gesättigten oder ungesättigten 5- oder 6-Ring steht, der gegebenenfalls 1-2 Heteroatome ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel und/oder 1-2 Carbonylgruppen enthält, 1-10 Sauer stoff-, 1-5 Stickstoff- und/oder 1-5 Schwefelatome enthält und/oder gegebenenfalls durch 1-5 Hydroxy-, 1-2 Mercapto-, 1-5 Oxo-, 1-5 Thioxo-, 1-3 Carboxy-, 1-5 Carboxy-C₁-C₄-alkyl-, 1-5 Ester-, 1-3 Amino-, 1-3 Hydroxy-C₁-C₄-alkyl-, 1-3 C₁-C₇-Alkoxygruppen substituiert ist und
Z¹ für -CONH-CH₂-4′, -NH-CO-4′, -O-P(O)R¹-NH-CH₂-4′, -O-P (O) R¹-O-CH₂-4′, -O-P (S) R¹-O-3′ oder -O-P (O) R¹-O-3′ steht, worin 4′ bzw. 3′ die Verknüpfung an die endständige(n) Zuckereinheit(en) angibt und R¹ für O⁻, S⁻, eine C₁-C₄-Alkyl- oder NR²R³-Gruppe steht, mit R² und R³ in der Bedeutung von Wasserstoff und C₁-C₄- Alkylresten.
Als cyclische Strukturen (Ar) kommen insbesondere cyclische gesättigte oder ungesättigte Alkylene mit 3 bis 6, insbesondere 5 oder 6 C-Atomen, die gegebenenfalls Heteroatome wie N, S, oder O enthalten, in Frage. Beispielhaft genannt seien Cyclopentylen-, Pyrrolylen-, Furanylen-, Thiophenylen-, Imidazolylen-, Oxazolyliden-, Thiazolylen-, Pyrazolylen-, Pyrrolidylen-, Pyridylen-, Pyrimidylen-, Maleinimidylen- und Phthalimidylen-Gruppen.
10) Verbindung gemäß 8c), dadurch gekennzeichnet, daß B die allgemeine Formel X-Y-Z² hat, die X-seitig mit dem Komplexbildner oder Komplex und Z-seitig mit dem Oligonucleotid verbunden ist, wobei
Z² in der zwei benachbarte Zuckereinheiten verknüpfenden Brücke für die Gruppe -NR²-, -O- oder -S- steht und X, Y und R² die in Punkt 9 angegebene Bedeutung haben.
Als Reste Y der Verbindungskomponente Z¹-Y-X (gemäß Punkt 9) oder Z²-Y-X (gemäß Punkt 10) seien beispielhaft die Reste -(CH₂)₆-NH-CS-NH-C₆H₄-CH(CH₂CO₂H) -CH₂- CO-NH-CH₂-CH(OH)-CH₂-, -(CH₂)₆-NH-CS-NH-C₆H₄-CH₂-, -(CH₂)₆-NH-CO-CH₂-, -(CH₂)₆-NH-CO-CH₂CH₂-, -(CH₂)₂-, -(CH₂)₆-, -(CH₂)₆-S-(CH₂)₂-, -(CH₂)₆-S-(CH₂)₆-, -(CH₂)₂-NH-CO-, -(CH₂)₆-NH-CO-, -(CH₂)₆-S-(CH₂)-NH-CO-, -(CH₂)₆-S-(CH₂)₆-NH-CO-, genannt.
11) Verbindung gemäß 8d), dadurch gekennzeichnet, daß B die allgemeine Formel X-Y-Z³ hat, wobei Z³ für eine -NH- Gruppe oder eine direkte Bindung zur Nucleobase steht und X und Y die in Anspruch 9 angegebene Bedeutung haben.
Beispielhaft genannt seien, die Reste -CH₂-CO-NH-CH₂-CH(OH) -CH₂-, -NH-CO-CH₂-CO-NH-CH₂-CH(OH)- CH₂-, -CO-NH-CH₂-CH₂-NH-, -CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-, -CH₂-S-CH₂- CH₂-, -(CH₂)₄-S-CH₂-CH₂-NH-, -CO-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-, -CO-CH₂- S- (CH₂)₆-NH-, -CH=CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH-, -CH=CH-CH₂-NH-, -C≡C-CH₂-NH- oder -CO-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH-.
Als Bindungsstellen bei den Purin Basen ist insbesondere die Position 8 und bei den Pyrimidinbasen die Position 5 geeignet. Rein formal wird dabei ein Wasserstoffatom der jeweiligen Base durch den Rest B-K substituiert. Eine Verknüpfung kann aber auch über gegebenenfalls in den Positionen 2, 4 oder 6 enthaltenen Aminogruppen erfolgen, so z. B. über die 2-Aminogruppe im Guanin, über die 6- Aminogruppe im Adenin oder über die 4-Aminogruppe in Cytosin. In diesem Fall wird jeweils ein Wasserstoffatom der jeweiligen Aminogruppe durch den Rest B-K substituiert.
12) Verbindungen nach einem der vorhergehenden Punkte dadurch gekennzeichnet, daß der Metallkomplex als bildgebendes Element ein radioaktives Isotop, ausgewählt aus den Elementen Kupfer, Wismut, Technetium, Rhenium oder Indium enthält.
13) Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zum Nachweis einer Zielstruktur dadurch gekennzeichnet, daß man eine oder mehrere der Verbindungen nach einem der vorhergehenden Punkte mit der zu untersuchenden Probe in vivo oder in vitro zusammenbringt und anhand des Signales nachweist, ob die Zielstruktur, an die das Oligonucleotid N spezifisch und mit hoher Bindungsaffinität bindet, in der Probe vorhanden ist, sowie ein
14) Verfahren zur nicht-invasiven Diagnostik von Krankheiten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine oder mehrere der Verbindungen nach einem der Punkte 1 bis 12 mit der zu untersuchenden Zielstruktur in vivo zusammenbringt und anhand des Signales nachweist, ob die Zielstruktur, an die das Oligonucleotid N spezifisch bindet, in dem zu untersuchenden Organismus vorhanden ist.
15) Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung einer Verbindung gemäß der Punkte 1 bis 12 in der Radiodiagnostik und/oder in der Radiotherapie, sowie als
16) Diagnosekit zum Nachweis von Zielstrukturen in vivo und/oder in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß das Diagnosekit wenigstens eine Verbindung nach einem der Punkte 1 bis 12 aufweist.

Sollen die erfindungsgemäßen Konjugate als Diagnostikum verwendet werden, enthält (enthalten) der (die) Komplexbildner ein bildgebendes radioaktives Isotop der Elemente der Ordnungszahlen 21, 26-27, 29, 31, 43, oder 49, bevorzugt 43 oder 49. Sollen die erfindungsgemäßen Konjugate als Therapeutikum verwendet werden, kommen neben den zuvor genannten - zusätzlich auch Isotope der Elemente der Ordnungszahlen 5, 22-25, 28, 42, 44, 57-83 und 85 in Frage. Über die radioaktiven Isotope der genannten Elemente hinaus, eignen sich im Bereich der Therapie insbesondere auch stabile Isotope, die

a) durch Strahlung von außen in radioaktive Isotope umgewandelt werden,
b) Strahlung von außen in Strahlung anderer Qualität, anderen Energiegehalts und/oder anderer Wellenlänge umwandeln.

Die Anzahl der mit dem Oligonucleotid-Rest verknüpften bildgebenden oder therapeutisch wirksamen Substituenten B-K ist zum einen durch die Größe des Oligonucleotids begrenzt, liegt aber nie höher als 10. Erfindungsgemäß bevorzugt sind ein oder zwei Substituenten B-K.

Die Größe des Oligonucleotid-Restes N, ist im Prinzip nicht begrenzt. Für die vorliegende Erfindung praktikabel sind Oligonucleotide mit 5 bis 200 Nucleotiden, besonders bevorzugt werden Oligonucleotide mit 15 bis 100 Nucleotiden.

Erfindungsgemäß einsetzbare Oligonucleotide sind gegen den Abbau durch in vivo vorkommende Nucleasen stabilisiert.

Unmodifizierte Oligo- oder Polynucleotide werden in vivo durch Endo- und Exonucleasen gespalten. Die Abbaureaktion in der RNA-Reihe beginnt mit einer Aktivierung der 2′- Hydroxygruppe. Weitere abbauende Enzyme sind z. B. Ribozyme, die die Phosphodiesterbindung von RNS spalten (s. Science 261, 709 (1993). Die in vivo-Stabilität von RNS-Derivaten läßt sich durch teilweisen oder völligen Austausch der 2′- Hydroxylgruppe gegen andere Substituenten steigern. Solche Substituenten sind z. B. Alkoxygruppen, insbesondere die Methoxygruppe (s. z. B. Chem. Pharm. Bull. 13, 1273 (1965), Biochemistry 10, 2581, (1971)), ein Wasserstoffatom, ein Fluoratom, (siehe z. B. Can. J. Chem. 46, 1131 (1968)) oder eine Aminogruppe (siehe z. B. J. Org. Chem. 42, 714 (1977)). Weitere Möglichkeiten zur Stabilisierung der Internucleotidbindung sind der Ersatz eines oder zweier Sauerstoffatome in der Phosphodiesterbrücke unter Bildung von Phosphorthioaten (Trends Biochem. Sci. 14, 97 (1989)) oder Phosphordithioaten (J. Chem. Soc., Chem. Commun. 591 (1983) und Nucleic Acids Res. 12, 9095 (1984) und die Verwendung von Alkylphosphonaten an Stelle von Phosphodiestern (Ann. Rep. N. Y. Acad. Sci. 507, 220 (1988)).

Die Stabilisierung kann dadurch erreicht werden, daß die Hydroxylgruppen in 2′-Position der Riboseeinheiten, unabhängig voneinander, modifiziert werden. Eine solche Modifikation kann mittels eines Ersatzes dieser Hydroxylgruppe durch eine OR-Gruppe, ein Halogenatom, insbesondere ein Fluoratom, ein Wasserstoffatom oder einen Aminrest, insbesondere durch eine Aminogruppe, erzielt werden. Der Rest R der Alkoxy-Gruppe steht dabei für einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 20 C- Atomen wie Methyl, Ethyl, Propyl, iso-Propyl, Butyl, tert.- Butyl, Pentyl oder Hexyl oder einen cyclischen unsubstituierten oder substituierten Alkylrest mit 4 bis 20 C-Atomen wie Cyclopentyl oder Cyclohexyl, die gegebenenfalls 1-2 Hydroxygruppen enthalten und gegebenenfalls durch 1-5 Sauerstoffatome unterbrochen ist. Die Stabilisierung wird auch dadurch erhöht, das vorhandene Hydroxylgruppen in den Positionen 3′ und 5′ gegebenenfalls verethert sind.

Eine weitere Stabilisierung des Polynucleotids erfolgt dadurch, daß die als Internucleotidbindung dienenden Phosphodiester teilweise oder vollständig und unabhängig voneinander durch Phosphothioate, Phosphodithioate oder Alkylphosphonate, besonders bevorzugt durch Niederalkylphosphonate wie z. B. Methylphosphonat, ersetzt sind. Diese Internucleotidbindungen können auch an die terminalen Reste in den Positionen 3′ und 5′ geknüpft sein oder aber auch die Positionen 3′-3′ oder 5′-5′ verbinden. Die Phosphodiesterbindung ermöglicht weiterhin Verknüpfungen über Hydroxyalkylreste, die sich an Stickstoff- oder Kohlenstoffatomen der Nucleobasen befinden, so können beispielsweise zwei Thymidine über die in der Position 3 befindlichen Hydroxyalkylketten oder zwei Purinbasen über die in den 8-Positionen befindlichen Hydroxyalkylreste verknüpft werden. Die Verknüpfung kann auch zu Hydroxylgruppen in den Positionen 2′ oder 3′ oder 5′ erfolgen.

Die modifizierten Internucleotidbindungen können gegebenen falls bevorzugt an den Enden des Polynucleotids vorkommen, wobei sie besonders bevorzugt an das Thymidin gebunden sind.

Erfindungsgemäß sind die verwendeten Oligonucleotid-Reste N nicht auf bestimmte Oligonucleotid-Sequenzen beschränkt. Bevorzugt werden aber solche Oligonucleotide, die spezifisch mit hoher Bindungsaffinität an Zielstrukturen mit Ausnahme von Nucleinsäure binden.

Ein Verfahren zur Identifizierung geeigneter Oligonucleotide, die als Ausgangssubstanzen für die erfindungsgemäßen Konjugate benötigt werden, wird im U.S. Patent 5,270,163 beschrieben.

Die bei den erfindungsgemäßen Konjugaten eingesetzten Oligonucleotide werden in einer bevorzugten Ausführungsform nach dem im folgenden beschriebenen Verfahren erhalten.

So sind geeignete Oligonucleotide dadurch erhältlich, daß eine Zufallssequenzen enthaltende Mischung von Oligonucleotiden mit der Zielstruktur zusammengebracht wird, wobei bestimmte Oligonucleotide eine erhöhte Affinität zu der Zielstruktur im Verhältnis zu der Mischung der Oligonucleotide aufweisen, diese von dem Rest der Oligonucleotidmischung abgetrennt werden, dann die Oligonucleotide mit erhöhter Affinität zu der Zielstruktur amplifiziert werden, um eine Mischung von Oligonucleotiden zu erhalten, die einen erhöhten Anteil an Oligonucleotiden aufweist, die an die Zielstrukturen binden.

Bei dem Verfahren wird zunächst ein DNA-Strang hergestellt, in bevorzugter Weise durch chemische Synthese. Dieser DNA- Strang besitzt am 3′-Ende eine bekannte Sequenz, die als Promotor für eine RNA-Polymerase dient und zugleich komplementär zu einer Primer-Sequenz für die Polymerase- Kettenreaktion (PCR) ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich hierbei um den Promotor für die T7 RNA-Polymerase. Anschließend wird eine Zufallssequenz an den Promotor synthetisiert. Die Zufallssequenz kann dadurch erhalten werden, daß die in Frage kommenden vier Basen im gleichen Verhältnis in die Synthesemaschine eingegeben werden. Es entstehen dadurch völlig zufällige DNA-Sequenzen. Die Länge der Zufallssequenz beträgt in bevorzugter Ausführungsform etwa 15 bis 100 Nucleotide. An dieses DNA-Stück mit der Zufallssequenz wird eine weitere DNA-Sequenz ansyntheti siert, die für die Polymerase Kettenreaktion (PCR) verwendet werden kann.

Nach Synthese dieses DNA-Stranges wird dieser mit Hilfe einer RNA-Polymerase in einen komplementären RNA-Strang umgeschrieben. In bevorzugter Ausführungsform wird hierbei die T7 RNA-Polymerase verwendet. Bei der Transkription werden der RNA-Polymerase solche Nucleotide angeboten, die modifiziert sind. In besonders bevorzugter Ausführungsform ist die Ribose an der 2′-Position modifiziert. Hierbei kann es sich um eine Substitution des Wasserstoffatoms bzw. der Hydroxylgruppe durch eine Alkoxygruppe, bevorzugt Methoxy, Amino oder Fluor handeln. Die auf diese Art und Weise hergestellten RNA-Oligonucleotide werden dann in den Selektionsprozeß eingeführt.

Bei dem Selektionsprozeß werden die RNA-Oligonucleotide mit der Zielstruktur zusammengebracht. Unter Zielstruktur wird eine Struktur verstanden, an die das Oligonucleotid spezifisch und mit hoher Affinität binden soll.

Derartige Strukturen sind z. B. Makromoleküle, Gewebestrukturen von höheren Organismen wie Tieren oder Menschen, Organen oder Teilen von Organen, Zellen, insbe sondere Tumorzellen oder Tumore.

Die Zielstruktur muß dazu nicht unbedingt in reiner Form vorliegen, sie kann sich auch auf einem natürlich vorkommenden Organ oder an einer Zelloberfläche befinden.

Wenn es sich hierbei um ein isoliertes Protein handelt, kann dieses auf einer Festphase, beispielsweise einem Filter gebunden sein. Bei der Selektion wird ein Überschuß der Zielstruktur gegenüber der RNA-Mischung eingesetzt. Bei der Inkubation binden die spezifischen Oligonucleotidmoleküle an die Zielstrukturen, wohingegen die nicht gebundenen Oligonucleotide von der Mischung abgetrennt werden, beispielsweise durch Waschen.

Anschließend werden die Oligonucleotidmoleküle von den Zielmolekülen abgetrennt bzw. durch Waschen mit geeigneten Puffern oder Lösungsmitteln entfernt.

Mit Hilfe der Reversen Transkriptase wird dann das aufgefundene RNA-Oligonucleotid umgeschrieben in den komplementären DNA-Strang.

Da der erhaltene DNA-Strang an beiden Enden Primersequenzen (bzw. Promotorsequenzen) aufweist, kann eine Amplifizierung der gefundenen DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion einfach durchgeführt werden.

Die auf diese Art amplifizierten DNA-Oligonucleotide werden dann mit Hilfe der RNA-Polymerase wieder in RNA- Oligonucleotide umgeschrieben und die so erhaltenen RNA- Oligonucleotide können in einem weiteren Selektionsschritt (wie oben beschrieben) eingesetzt werden.

Nach Trennen der im zweiten Selektionsschritt erhaltenen bindenden RNA-Oligonucleotide von den Zielmolekülen werden diese wieder in DNA mit Hilfe der Reversen Transkriptase umgeschrieben, die so erhaltenen komplementären DNA- Oligonucleotide werden mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion amplifiziert und anschließend mit Hilfe der RNA-Polymerase wieder zu RNA-Oligonucleotiden transkribiert, die für einen weiteren Selektionsschritt zur Verfügung stehen.

Es hat sich herausgestellt, daß die gewünschten hohen Spezifitäten und hohen Bindungsaffinitäten dann erhalten werden können, wenn die Selektionsschritte mehrmals wieder holt werden. Selten wird die gewünschte Oligonucleotidsequenz bereits nach einem oder zwei Selektionsschritten erhalten werden. Sobald die gewünschte Spezifität und Bindungsaffinität zwischen Zielstruktur und Oligonucleotid erhalten ist, kann das oder die Oligonucle otid(e) sequenziert werden und dadurch kann die Sequenz der spezifisch bindenden Oligonucleotide ermittelt werden.

Besonders vorteilhaft bei dem vorliegenden Verfahren ist, daß dieses Verfahren nicht nur mit geeigneten Proteinen, sondern auch in vivo angewendet werden kann. Der oben er wähnte Selektionsprozeß kann aber auch an gereinigten Zielstrukturen durchgeführt werden. Insbesondere für die in vivo Diagnostik ist es aber wesentlich, daß die Spezifität der Oligonucleotide gegeben ist für die Zielstruktur im lebenden Umfeld. Daher können die Selektionsprozesse auch an Zellen bzw. Zellkulturen, an Geweben oder Gewebeschnit ten, an perfundierten Organen und sogar an lebenden Organismen durchgeführt werden.

Vorteilhaft hierbei ist, daß die modifizierten Oligonucleotide dem Abbau durch die nahezu allgegenwärtigen RNA-sen widerstehen können. Dadurch werden selbst bei Selektionsprozessen an lebenden Organismen die gewünschten Oligonucleotidsequenzen angereichert, da entsprechende natürlich vorkommende Oligonucleotide von den RNA-sen abge baut würden.

Der Oligonucleotid-Rest N kann eine oder mehrere Verbindungskomponenten B, bzw. Substituenten B-K, die unabhängig voneinander ausgewählt werden können, aufweisen. Beansprucht werden Oligonucleotid-Konjugate, die 1 bis 10 gleiche oder 2 bis 10 unterschiedliche Verbindungskomponenten B enthalten. Besonders bevorzugt sind Oligonucleotid-Konjugate mit einer oder zwei Verbindungskomponenten B.

Die Verbindungskomponente B verbindet den Oligonucleotid- Rest N mit einem Komplexbildner oder Komplex K.

Vorteilhaft lassen sich mehrzähnige, offenkettige oder cyclische komplexbildende Liganden mit O, S und N als Donoratomen einsetzen.

Als Beispiele für die Komplexbildner-Reste K seien die um ein Wasserstoffatom, eine Hydroxy- und/oder eine Essigsäuregruppe verminderten Polyaminopolycarbonsäuren Ethylendiamintetraessigsäure, Diethylentriaminpentaessigsäure, trans-1,2- Cyclohexandiamintetraessigsäure, 1,4,7,10-Tetra azacyclododecantetraessigsäure, 1,4,7-Triazacyclononan triessigsäure, 1,4,8,11-Tetraazatetradecantetraessigsäure, 1,5,9-Triazacyclododecantriessigsäure, 1,4,7,10-Tetraaza cyclododecantriessigsäure und 3,6,9,15-Tetraaza-bicyclo- [9,3,1]-pentadeca-1(15),11,13-trientriessigsäure genannt.

Geeignete Komplexbildner werden z. B. in den EP 0 485 045, EP 0 071 564 und EP 0 588 229, in den DE 43 10 999 und DE 43 11 023 sowie dem US 4,965,392 beschrieben.

Um die vielfältigen Möglichkeiten für die Komplexbildner K gemäß der vorliegenden Erfindung zu verdeutlichen, sei auf Abb. 1 bis 3 verwiesen, in denen einige vorteilhafte Strukturen zusammengestellt sind. Diese Abbildungen sind als Auswahl zu verstehen und begrenzen die vorliegende Erfindung in keiner Weise auf die dargestellten Komplexbildner.

Der Komplexbildner K kann alle in der Nuclearmedizin gebräuchlichen für diagnostische und therapeutische Zwecke eingesetzten radioaktiven Isotope in Form ihrer Metallionen enthalten. Auch können stabile Isotope, die durch externe Strahlung zur Abgabe diagnostischer oder therapeutischer Strahlung angeregt, bzw. Isotope, die durch Strahlung von außen in radioaktive Isotope umgewandelt werden, eingesetzt werden.

Erfindungsgemäß geeignete Isotope werden aus den Elementen der Ordnungszahlen 5, 21-29, 31, 39, 42-44, 49, 57-83 oder 85 ausgewählt.

Zur Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung als Radiopharmakon enthält der Komplexbildner ein radioaktives Element. Alle radioaktiven Elemente, die in der Lage sind, einen therapeutischen oder diagnostischen Effekt in vivo oder in vitro zu erzielen, sind hierfür geeignet. Bevorzugt werden radioaktive Isotope der Elemente Kupfer, Wismut, Technetium, Rhenium oder Indium. Besonders bevorzugt werden ^99mTc-Komplexe.

Enthalten die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I positronenemittierende Isotope wie z. B. Sc-43, Sc-44, Fe-52, Co-55, Ga-68 oder Cu-61, so können diese bei der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) eingesetzt werden.

Enthalten die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I gamma-Strahlung emittierende Isotope wie z. B. Tc-99m oder In-111, so können diese bei der Single-Photon-Emissions-Tomographie (SPECT) eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Form ihrer Komplexe mit Radioisotopen, wie z. B. Ir-192, auch in der Radio-Therapie eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in der Radioimmuno- oder Strahlentherapie verwendet werden. Diese unterscheidet sich von der entsprechenden Diagnostik nur durch die Menge und Art des verwendeten Isotops. Ziel ist dabei die Zerstörung von Tumorzellen durch energiereiche kurzwellige Strahlung mit einer möglichst geringen Reichweite. Geeignete β-emittierende Ionen sind zum Beispiel Sc-46, Sc-47, Sc-48, Ga-72, Ga-73, Y-90, Re-186 oder Re-188. Geeignete geringe Halbwertszeiten aufweisende α-emittierende Ionen sind zum Beispiel At-209, At-211, Bi- 211, Bi-212, Bi-213 und Bi-214, wobei Bi-212 bevorzugt ist. Ein geeignetes Photonen und Elektronen emittierendes Ion ist ¹⁵⁸Gd, das aus ¹⁵⁷Gd durch Neutroneneinfang erhalten werden kann.

Ist das erfindungsgemäße Mittel zur Anwendung in der von R.L. Mills et al (Nature 336, 787 (1988) vorgeschlagenen Variante der Strahlentherapie bestimmt, so muß sich das Zentralion von einem Mößbauer-Isotop wie beispielsweise ⁵⁷Fe oder ¹⁵¹Eu ableiten.

Diejenigen Carbonsäuregruppen, die nicht zur Komplexierung der Metallionen der Elemente der Ordnungszahlen 21 bis 29, 31, 39, 42 bis 44, 49, 57 bis 83 oder 85 benötigt werden, können gewünschtenfalls als Salze einer anorganischen oder organischen Base wie Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxide und -carbonate, insbesondere Natrium- und Kaliumhydroxid, oder Ammoniak und Alkylamine, oder Aminosäure oder als Ester oder Amid vorliegen.

Weiterhin können Verbindungen, die mittels Neutronen zur Aussendung von Partikeln und/oder Strahlung angeregt werden, eingesetzt werden. Besonders effektiv ist dabei Gadolinium. Vorteilhaft lassen sich auch solche Verbindungen verwenden, die das Isotop Bor-10 enthalten. In solchen Fällen kann K die Struktur

haben wobei
x für eine ganze Zahl von 1 bis 10 steht.

Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate.

So können Konjugate bei denen die Verbindungskomponente B an das 5′-Ende des Oligonucleotids gebunden ist, durch Umsetzung des Oligonucleotids mit einem Phosphoramidit- Derivat erhalten werden (Tetrahedron 49, 1925-1963 (1993). Dazu wird die 5′-Hydroxygruppe des Oligonucleotids mit einem Phosphoramidit der allgemeinen Formel PR′ (NR₂′′)OR′′′ umgesetzt. R′ steht dabei für eine gegebenenfalls N, NO₂, Si oder SO₂ enthaltende Alkyl-, Alkoxy- oder Arylalkoxygruppe mit 1 bis 20 C-Atomen wie Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Methoxy-, Ethoxy-, Propyloxy-, Butyloxy-, Benzyloxy- oder Phenylethoxy-, die gegebenenfalls substituiert sein können. Als Substituenten werden insbesondere Cyano- und Nitrogruppen verwendet. Vorteilhaft können beispielsweise Methoxy-, β-Cyanoethoxy- oder Nitrophenylethoxygruppen eingesetzt werden. Besonders bevorzugt werden β-Cyanoethoxygruppen. R′′ ist ein C₁-C₄- Alkylrest, wobei Ethyl- und Propylreste besonders geeignet sind. Bevorzugt werden Isopropylreste. R′′′ ist eine gegebenenfalls S, O, N, CN, NO₂ oder Halogen enthaltende Alkyl- oder Arylalkylgruppe mit 1 bis 20 C-Atomen. Bevorzugt werden geschützte Amino- und Thioalkylreste sowie geschützte Amino- und Thiooxaalkylreste eingesetzt. Besonders bevorzugt sind 6-Aminohexyl-, 6-Thiohexyl-, 3,6,9-Trioxa-11-amino-undecyl- und 3,6-Dioxa-8-amino octanyl-Gruppen. Als Schutzgruppen können allgemein übliche N- oder S-Schutzgruppen verwendet werden. Beispielsweise eignen sich Trifluoracetyl-, Phthalimido- und Monomethoxytritylgruppen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieser Er findung wird als Phosphoramidit-Derivat β-Cyanoethyl-N,N- diisopropylamino-6-(trifluoracetamido)-1-hexyl-phosphor amidit eingesetzt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird als Phosphoramidit-Derivat β-Cyanoethyl-N,N- diisopropylamino-(3,6,9-trioxa-11-phthalimido-1-undecyl) phosphoramidit eingesetzt.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindungskomponente B, an das 3′-Ende des Oligonucleotids N in einer, zur oben beschrieben analogen, Weise über eine phosphorhaltige Gruppe gebunden.

Die oben beschriebene Reaktion zwischen Oligonucleotid und Phosphoramidit kann als Festphasenreaktion erfolgen, wobei sich das Oligonucleotid noch auf der Säule eines Synthese automaten befindet. Nachdem ein Oligonucleotid der gewünschten Sequenz erhalten ist und erfolgter Freilegung der 5′-Hydroxygruppe des Oligonucleotids, z. B. mit Trichloressigsäure, wird mit dem Phosphoramidit umgesetzt und das Reaktionsprodukt wird oxydiert und freigesetzt. Anschließend wird das so erhaltene Oligonucleotid-Derivat an der endständigen Amino- oder Thiolgruppe mit dem Komplexbildner oder Komplex K gegebenenfalls über eine weitere Linkergruppe gekoppelt. Der im ersten Schritt über die phosphorhaltige Gruppe an das Oligonucleotid gebundene Rest bildet dann zusammen mit der gegebenenfalls vorhandenen weiteren Linkergruppe die Verbindungskomponente B.

Die Verknüpfung zwischen Oligonucleotid und dem Komplexbildner kann auch in der Weise erfolgen, daß man die freie 5′-Hydroxylgruppe des Oligonucleotids mit einem Komplexbildner bzw. Komplex umsetzt, der endständig einen bindungsfähigen Phosphorrest trägt. Ein solcher kann durch die Formel

worin
Ra für einen C₁-C₆-Alkylrest steht, der gegebenenfalls in in der β-Position einen Cyan-Rest trägt,
R^b für eine sekundäre Aminogruppe steht und
K und B die angegebene Bedeutung haben
oder die Formel

worin
R^c für ein Trialkylammoniumkation steht und K und B die genannte Bedeutung haben,
oder die Formel

worin
R^d für einen gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) und/oder einer oder mehreren Nitrogruppe (n) substituierten Arylrest oder einen C₁-C₆-Alkylrest steht, der gegebenenfalls in der β-Position mit einem Cyanrest substituiert ist, und K, B und R^c die genannte Bedeutung haben,
beschrieben werden, wobei bei Verwendung eines Restes der Formel a) nach erfolgter Kopplungsreaktion ein Oxidationsschritt zum Phosphat erfolgt. Gegebenenfalls kann in beiden Fällen der Rest -ORa oder -OR^c in einer Hydrolyse abgespalten werden.

Die Verknüpfung des Oligonucleotid-Derivats über den Linker mit dem Komplexbildner oder Komplex K kann auch als Festphasenreaktion auf der Säule eines Syntheseautomaten erfolgen. Die erfindungsgemäße Verbindung kann anschließend durch Ablösen vom festen Träger isoliert werden.

Die Verknüpfung des Polynucleotids mit dem Linker kann nicht nur über die 5′-OH Gruppe des Zuckers des terminalen Nucleotids erfolgen, sondern auch über andere funktionelle Gruppen, die aus der 5′-OH Gruppe generiert werden können, wie z. B. eine Amino- bzw. Carboxygruppe. Derartige Amino- bzw. Carboxygruppen tragende Nucleotide sind bekannt und leicht herstellbar. Die Synthese eines 5′-Desoxy-5′- aminouridin wird im J. Med. Chem. 22, 1273 (1979) sowie in Chem. Lett. 6, 601 (1976) beschrieben. 4′-Carboxy-5′- desoxyuridin ist wie in J. Med. Chem. 21, 1141 (1978), bzw. Nucleic Acids Symp. Ser. 9, 95 (1981) beschrieben, zugänglich.

Die Verknüpfung mit dem Komplexbildner erfolgt dann über einen eine Carbonsäure bzw. Aminogruppe tragenden Linker in dem Fachmann bekannter Weise. Der Linker bildet dann gemeinsam mit der -NH-CH₂-4′ bzw. der -CO-4′ Gruppe die Verbindungskomponente B.

Es sei darauf hingewiesen, daß die Aufteilung der erfindungsgemäßen Konjugate in einen Nucleotidrest-, eine Verbindungskomponente und einen Komplexbildner bzw. Komplex rein formal und damit unabhängig vom tatsächlichen synthetischen Aufbau erfolgt. So wird z. B. im oben genannten Fall die Gruppe -NH-CH₂-4′ bzw. -CO-4′ als zur Verbindungskomponente B gehörig angesehen, wohingegen das in der 4′-Position um eine CH₂-OH-Gruppe verminderte Oligonucleotid als Oligonucleotidrest N bezeichnet wird.

Ein Verfahren zur Herstellung von Konjugaten, bei denen die Verbindungskomponente an die um die OH-Gruppen verminderten Phosphodiester-Brücken erfolgt, besteht darin, daß zunächst zwei Zuckereinheiten zu einem Dinucleotid verknüpft werden (siehe z. B. Chem. Lett. 1305 (1993). Dabei entsteht zunächst ein Triester der Formel

worin U für einen entsprechenden Alkylenrest und V für eine geschützte Amino- bzw. Schwefelgruppe steht. Nach Abspaltung z. B. der Aminoschutzgruppe kann in dem Fachmann bekannter Weise der Komplexbildner gegebenenfalls über einen Linker mit der Aminogruppe - z. B. in Form, einer Amidbindung - verknüpft werden. Der Linker bildet dann gemeinsam mit der Gruppe O-U-V′ (worin V′ für eine Gruppe -NH- steht) die Verbindungskomponente B.

Ein alternatives Verfahren besteht darin, daß der intermediär durchlaufene Phosphotriester (z. B. durch Umsetzung mit 1,5-Diaminopentan) einer Aminolyse unterzogen wird (siehe Biochemistry 27, 7237 (1988) oder J. Am. Chem. Soc. 110, 4470 (1988))
Die so erhaltenen Verbindungen der Formel

können wie oben beschrieben mit dem Komplexbildner gegebenenfalls über einen Linker verknüpft werden.

Für Kopplungzwecke geeignet sind auch Dinucleosid-phosphat monothiotriester (siehe J. Am. Chem. Soc. 111, 9117 (1983) und Nucl. Acids Res. 20, 5205 (1992)).

Eine besonders große Vielfalt zur Verknüpfung der Komplexbildner mit den Nucleotiden bieten die Nucleobasen. Eine Verknüpfung über Aminogruppen in den Positionen 2 bei den Purinen und 4 bei den Pyrimidinen kann direkt erfolgen. Es ist allerdings häufig günstiger die Purine bzw. Pyrimidine zunächst zu modifizieren und diese derivatisierten Basen mit den Komplexbildnern (gegebenenfalls über weitere Linker) zu verknüpfen. Geeignete derivatisierte Nucleobasen werden z. B. in Biochemie 21, 319 (1989), Nucl. Acids Res. 16, 4937 (1988) oder Nucleosides Nucleotides 10, 633 (1991) beschrieben.

Ein alternatives Verfahren zur Verknüpfung über die Nucleobasen besteht in der Palladium katalysierten Kupplung von Brom- oder Iodnucleobasen mit funktionalsierten Resten (Biogenic and Medical Chemistry Letter V, 361 (1994)). Über diese funktionalsierten Reste kann dann nach bekannten Methoden der Komplexbildner gegebenenfalls über einen weiteren Linker mit der Nucleobase verknüpft werden. Als funktionalisierte Reste in der Position 5 des Pyrimidins und in der Position 8 des Purins seien beispielhaft ein Acrylester oder ein Allylamin genannt (siehe Nucl. Acids Res. 14, 6115 (1986) und Nucl. Acids Res. 16, 4077 (198)). Die als Vorstufe eingesetzten Halogenderivate sind wie z. B. in Biophys. J. 44, 201 (1983), J. Am. Chem. Soc. 86, 1242 (1964) oder Chem. Commun. 17 (1967) beschrieben, erhältlich.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Metallkomplexe aus den metallfreien Oliconucleotid-Konjugaten erfolgt wie in der DE 34 01 052 offenbart, indem, man das Metalloxid oder ein Metallsalz (beispielsweise das Nitrat, Acetat, Carbonat, Chlorid oder Sulfat) des gewünschten Metallisotops in Wasser und/oder einem niederen Alkohol (wie Methanol, Ethanol oder Isopropanol) löst oder suspendiert und mit der Lösung oder Suspension der äquivalenten Menge des den Komplexbildner enthaltenden Oligonucleotid-Konjugats umsetzt und anschließend, falls gewünscht, vorhandene acide Wasserstoffatome durch Kationen von anorganischen und/oder -organischen Basen oder Aminosäuren substituiert oder freie Carbonsäuregruppen in Aminosäureamide umwandelt.

Die Neutralisation eventuell noch vorhandener freier Säuregruppen erfolgt mit Hilfe anorganischer Basen (zum Beispiel Hydroxiden, Carbonaten oder Bicarbonaten) von zum Beispiel Natrium, Kalium, Lithium, Magnesium oder Calcium und/oder organischer Basen wie unter anderem primärer, sekundärer und tertärer Amine, wie zum Beispiel Ethanolamin, Morpholin, Glucamin, N-Methyl- und N,N- Dimethyl-glucamin, sowie basischer Aminosäuren, wie zum Beispiel Lysin, Arginin und Ornithin, oder von Amiden ursprünglich neutraler oder saurer Aminosäuren.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel erfolgt ebenfalls in an sich bekannter Weise, indem man die erfindungsgemäßen Oligonucleotid-Konjugate - gegebenenfalls unter Zugabe der in der Galenik üblichen Zusätze - im wäßrigen Medium suspendiert oder löst und anschließend die Suspension oder Lösung gegebenenfalls sterilisiert oder sterilfiltriert. Geeignete Zusätze sind beispielsweise physiologisch unbedenkliche Puffer (wie zum Beispiel Tromethamin), Zusätze von Komplexbildnern (wie zum, Beispiel Diethylentriaminpentaessigsäure) oder - falls erforderlich - Elektrolyten wie zum Beispiel Natriumchlorid oder - falls erforderlich - Antioxidantien wie zum Beispiel Ascorbinsäure oder, insbesondere für orale Darreichungs formen, Mannit oder andere osmotisch aktive Substanzen.

Sind für die enterale Verabreichung oder andere Zwecke Suspensionen oder Lösungen der erfindungsgemäßen Mittel in Wasser oder physiologischer Salzlösung erwünscht, können sie mit einem, oder mehreren in der Galenik üblichen Hilfsstoff(en) (zum Beispiel Methylcellulose, Lactose, Mannit) und/oder Tensid(en) (zum, Beispiel Lecithine, Tween®, Myrj®) gemischt werden.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel enthalten vorzugsweise 0,1 µmol/1 bis 3 mmol/l der erfindungsgemäßen Oligonucleotid-Konjugate und werden in der Regel in Mengen von 0,01 nmol/kg-60 µmol/kg dosiert. Sie sind zur enteralen und parenteralen Applikation bestimmt.

Bei der nuklearmedizinischen in vivo Anwendung werden die markierten Verbindungen in der Regel in Mengen kleiner als 10^-10 mol/kg Körpergewicht dosiert, wobei die genaue Dosis in Abhängigkeit der untersuchten Körperregion aber insbe sondere auch der jeweils gewählten Untersuchungsmethode stark variieren kann. Ausgehend von einem mittleren Körpergewicht von 70 kg beträgt die Radioaktivitätsmenge für diagnostische Anwendungen zwischen 40 und 1100 MBq, vorzugsweise 200-800 MBq, für therapeutische Anwendungen 1-500 MBq, vorzugsweise 10-100 MBq pro Applikation. Die Applikation erfolgt normalerweise intravenös, intraarteriell, interstitiell, peritoneal oder intra tumoral, wobei die intravenöse Applikation bevorzugt ist. Pro Untersuchung werden im allgemeinen 0,1 bis 20 ml des betreffenden Mittels verabreicht.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Nachweis von Zielstrukturen. Dabei werden eine oder mehrere der oben beschriebenen Verbindungen mit der zu un tersuchenden Probe in vivo oder in vitro zusammengebracht. Der Oligonucleotid-Rest N bindet dabei spezifisch und mit hoher Bindungsaffinität an die nachzuweisende Zielstruktur.

Ist die Zielstruktur in der Probe vorhanden, so kann sie dort anhand des Signals nachgewiesen werden. Insbesondere eignet sich das Verfahren für eine nicht-invasive Diagnostik von Krankheiten. Dabei werden eine oder mehrere der oben beschriebenen Verbindungen in vivo verabreicht und anhand des Signals kann nachgewiesen werden, ob die Zielstruktur, an die der Oligonucleotid-Rest N spezifisch und mit hoher Affinität bindet, in dem zu untersuchenden Organismus vorhanden ist.

Neben dem bloßen Nachweis von Zielstrukturen in zu untersuchenden Proben können diese aber auch gezielt zerstört werden. Dazu eignen sich die Verbindungen der vorliegenden Erfindung besonders in der Radiotherapie, z. B. in der Krebstherapie.

Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt ein Diagnosekit zum Nachweis von Zielstrukturen in vivo, das eine oder mehrere der oben genannten Verbindungen enthält.

Die erfindungsgemäßen Konjugate und Mittel erfüllen die vielfältigen Voraussetzungen, die an ein Pharmazeutikum für die Radiotherapie und Diagnostik zu stellen sind. Sie zeichnen sich insbesondere durch eine hohe Spezifität bzw. Affinität gegenüber der betreffenden Zielstruktur aus. Gegenüber bekannten Oligonucleotid-Konjugaten weisen die erfindungsgemäßen Konjugate eine besonders hohe in vivo Stabilität auf. Dieses wurde durch eine Substitution der 2′-Hydroxylgruppe und den Einbau von modifizierten Thymidinsequenzen an den terminalen Hydroxylgruppen der Nucleotide erreicht. Überraschenderweise wird die Spezifität des Oligonucleotids weder durch diese Modifikation, noch durch die Kopplung mit dem Komplexbildner nennenswert beeinträchtigt. Weitere Vorteile sind die steuerbare Pharmakokinetik sowie die notwendige Verträglichkeit.

Abb. 1 zeigt eine Auswahl von cyclischen Komplexbildnern K, die für die vorliegende Erfindung vorteilhaft eingesetzt werden können. "b" markiert die Bindungsstelle zur Verbindungskomponente B.

Abb. 2 und 3 zeigen eine Auswahl von offenkettigen Komplexbildnern K die für die vorliegende Erfindung vorteilhaft eingesetzt werden können.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegenden Erfindungen näher illustrieren.

Die in den Beispielen beschriebenen Polynucleotide enthalten modifizierte Verbindungen.

Es bedeuten:
A, U, C, G: die Nucleotide enthalten eine 2′-OCH₃ Gruppe
*: die Internucleotidbindung ist ein Methylphosphonat
**: die Internucleotidbindung ist ein Thiophosphonat
***: die Internucleotidbindung ist ein Dithiophosphonat.

Beispiel 1 a) 5′-(6-Amino-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligo nucleotids 5′-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3′

Das nach dem SELEX-Verfahren identifizierte 30mer-Oligo nucleotid 5′-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3′ mit der Modifikation einer vorgeschalteten Sequenz T*T*T*T*T-3′, wird in üblicher Weise in einem Syntheseautomaten der Fa. Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991) wobei sich das Oligonucleotid noch auf der Säule des festen Trägers befindet. Durch Reaktion mit Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan wird die 5′-Hydroxygruppe freigelegt. Die Beladung der Säule beträgt ca. 10 mg des 35mer- Oligonucleotids. Zum Anknüpfen des Linkers wird die Säule mit einer Acetonitrillösung von 50 µmol β-Cyanoethyl-N,N- diisopropylamino-6-(trifluoracetamido)-1-hexyl phosphoramidit (hergestellt nach Nucl. Acids. Res. 16, 2659-2669 (1988)) in Gegenwart von Tetrazol umgesetzt. Die Oxidation des gebildeten Phosphits zum voll geschützten Phosphotriester erfolgt mit Iod in Tetrahydrofuran. Anschließend wird die Säule nacheinander mit Methanol und Wasser gewaschen. Zur Ablösung des modifizierten Oligonucleotids vom festen Träger überführt man den Inhalt der Säule in ein Multivial, versetzt mit 5 ml 30%iger Ammoniaklösung, verschließt das Gefäß und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt dann auf 0°C, zentrifugiert, wäscht den Träger mit 5 ml Wasser und unterwirft die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung.

Zur Reinigung nimmt man das feste Material in 2 ml Wasser auf, versetzt mit 2 ml 0,5 M Ammoniumacetatlösung und versetzt mit 10 ml Ethanol, man läßt über Nacht bei -20°C stehen, zentrifugiert, wäscht den Rückstand mit 1 ml Ethanol (-20°C) und trocknet schließlich im Vakuum bei Raumtemperatur. Man erhält 8 mg der Titelverbindung als farbloses Pulver.

b) 10-[5-(2-Carboxyphenyl)-2-hydroxy-5-oxo-4-aza-pentyl)- 1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclo-dodecan

50 g (14,4,3 mmol) 1,4,7-Tris(carboxymethyl)-1,4,7,10- tetraazacyclododecan (D03A) werden in 250 ml Wasser gelöst und der pH-Wert mit 5 N Natronlauge auf pH 13 eingestellt. Dann wird innerhalb einer Stunde eine Lösung aus 38,12 g (187,6 mmol) N-(2,3-Epoxypropyl)-phthalimid in 100 ml Dioxan zugetropft, 24 Stunden bei 50°C gerührt und der pH- Wert durch Zugabe von 5 N Natronlauge bei pH 13 gehalten. Die Lösung wird mit 10%iger Salzsäure auf pH 2 eingestellt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in etwas Wasser gelöst und an einer Ionenaustauschersäule - (Reillex® = Poly-(4-vinyl)-pyridin, man eluiert mit Wasser) gereinigt. Die Hauptfraktionen werden im Vakuum, eingedampft und der Rückstand durch Chromatographie an RP-18 (LiChroPrep®/Laufmittel: Gradient aus Tetrahydrofuran/ Methanol/Wasser) endgereinigt. Nach Eindampfen der Hauptfraktionen erhält man 63,57 g (71 d. Th. eines amorphen Feststoffes.
Wassergehalt: 8,5%.

Elementaranalyse (bezogen auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 52,90; H 6,57; N 12,34;
gef.: C 52,65; H 6,68; N 12,15.

c) 10-(3-Amino-2-hydroxy-propyl)-1,4,7-tris(carboxy methyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan

50 g (88,1 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 1b werden in 300 ml konz. Salzsäure 24 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in etwas Wasser und reinigt an einer Ionenaustauschersäule (Reillex® = Poly(4-vinyl)pyridin (man eluiert mit Wasser). Die Hauptfraktionen werden zur Trockne eingedampft.
Ausbeute: 39 g (95% d. Th.) eines glasigen Feststoffes.
Wassergehalt 10,3%.

Elementaranalyse (bezogen auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 48,68; H 7,93; N 16,70;
gef.: C 48,47; H 8,09; N 16,55.

d) 10-[7-(4-Nitrophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxy methyl)-4-aza-heptyl)-1,4,7-tris(carboxymethyl)- 1,4,7,10-tetraazacyclododecan

Zu 14,62 g (34,86 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 1c) in 200 ml Dimethylformamid/ 20 m, 1 Triethylamin gibt man 9,84 g (41,8 mmol) 3-(4-Nitrophenyl) glutarsäureanhydrid (J. Org. Chem. 26, 3856 (196)) und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Man dampft im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird aus Isopropanol/Essigsäure 95 : 5 umkristallisiert.
Ausbeute: 21,68 g (95% d. Th.) eines gelblichen Feststoffes.
Wassergehalt: 0,9%.

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 51,37; H 6,47; N 12,84;
gef.: C 51,18; H 6,58; N 12,67.

e) 10-[7-(4-Aminophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxy methyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris(carboxymethyl)- 1,4,7,10-tetraazacyclododecan

21,0 g (32,07 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 1d) werden in 250 ml Methanol gelöst und 5 g Palladium- Katalysator (10% Pd auf C) zugegeben. Man hydriert über Nacht bei Raumtemperatur. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Ausbeute: 19,63 g (98% d. Th.) eines cremefarbenen Feststoffes.
Wassergehalt: 0,8%.

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 53,84; H 6,35; N 12,60;
gef.: C 53,73; F 6,45; N 12,51.

f) 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7- (carboxymethyl)-4-aza-heptyl)-1,4,7-tris-(carboxy methyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan

12,4 g (19,27 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 1e) werden in 200 ml Wasser gelöst und 6,64 g (57,8 mmol) Thiophosgen in 50 ml Chloroform zugegeben. Man rührt 1 Stunde bei 50°C. Man kühlt auf Raumtemperatur, trennt die organische Phase ab und schüttelt die wäßrige Phase 2mal mit 100 ml Chloroform aus. Die wäßrige Phase wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 100 ml Isopropanol bei Raumtemperatur ausgerührt. Der Feststoff wird abfiltriert und mit Ether gewaschen. Nach Trocknen über Nacht im Vakuum (40°C) erhält man 12,74 g (97% d. Th.) eines cremefarbenen Feststoffes.
Wassergehalt: 3,1%.

Elementaranalyse (bezogen auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 52,24; H 6,35; N 12,60; S 4,81;
gef.: C 52,37; H 6,44; N 12,48; S 4,83.

g) Konjugat aus 5-(6-Amino-hexyl-phosphorsäureester des 35mer Oligonucleotids 5′-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3′ und 10- [7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxy methyl)-4-aza-heyptyl]-1,4,7-tris(carboxymethyl)- 1,4,7,10-tetraazacyclododecan

8 mg des in Beispiel 1a) erhaltenen Oligonucleotids werden in 2,5 ml einer Mischung von 1 M NaHCO₃/Na₂CO₃ (pH 9,0) gelöst und mit 1 mg 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2- hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris- (carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan (Titelverbindung aus Beispiel 1f) versetzt. Man rührt 5 Stunden bei Raumtemperatur, stellt den pH durch Zugabe von 0,01 M Salzsäure auf 7,2 ein und unterwirft die Lösung einer Ultrafiltration durch eine Membran mit der Ausschlußgrenze 3000 (Amicon YM3) und anschließend einer Gefriertrocknung. Man erhält 7 mg des gewünschten Konjugats.

h) ¹¹¹Indium-Komplex des Thioharnstoff-Konjugats aus 5-(6- Amino-hexyl-phosphorsäureester des 35mer Oligonucleotids 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3′ und 10- [7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxy methyl)-4-aza-heyptyl]-1,4,7-tris(carboxymethyl)- 1,4,7,10-tetraazacyclododecan

15 µl einer ¹¹¹Indium(III)acetat-Lösung (350 µCi), (her gestellt aus ¹¹¹Indium(III)chlorid in 2 M Natriumacetat- Lösung und einstellen des pH-Wertes mit 0,1 M Salzsäure auf pH 4,0) werden in 135 µl einer Lösung aus 1 mg der Titelverbindung aus Beispiel 1g) in MES-Puffer, pH 6,2 gegeben (MES = 2-(N-Morpholino)ethylsulfonsäure). Der pH- Wert wird durch Zugabe von 0,01 M Salzsäure auf pH 4,2 gebracht. Man rührt 1 Stunde bei 37°C bei pH 4,2. Es wird mit 2 M Natriumacetat-Lösung auf pH 6 gebracht und 10 µl einer 0,1 M Na₂EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure- Dinatriumsalz) zugegeben, um überschüssiges ¹¹¹Indium zu komplexieren. Die Endreinigung des so erhaltenen markierten Konjugates (1h) erfolgt durch HPLC (Ausschlußchro matographie: TSK-400/MES-Puffer). Die das markierte Konjugat enthaltenen Fraktionen werden mit physiologischer Kochsalz-Lösung verdünnt, mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt und filtriert. Eine so hergestellte Lösung stellt dann ein geeignetes Präparat für die Radiodiagnostik dar.

Beispiel 2 a) Konjugat aus 5′(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3′ und N-[2- Amino-3-(4-isothiocyanatophenyl)-propyl]-trans-cyclo hexan-1,2-diamin-N,N′-N′,N′′,N′′-pentaessigsäure

8 mg des in Beispiel 1a) erhaltenen Oligonucleotids werden in 2,5 ml einer Mischung aus 1 M NaHCO₃/Na₂CO₃ (pH 9,0) gelöst und 1 mg N-[2-Amino-3-(p- isothiocyanatophenyl)propyl]-trans-cyclohexan-1,2-diamin- N,N′,N′,N′′,N′′-pentaessigsäure zugegeben (hergestellt nach Bioconjugate Chem. 1, 59 (1990)). Man rührt 5 Stunden bei Raumtemperatur, stellt dann mit 0,1 M Salzsäure auf pH 7,2 und unterwirft die Lösung einer Ultrafiltration durch eine Membran mit der Ausschlußgrenze 3000 (Amicon YM3). Nach Gefriertrocknung erhält man 6 mg des Thioharnstoffkonjugats 2a).

b) Wismut-212-Komplex des Konjugates aus 5′(6-Amino-1- hexyl-phosphorsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3′ und N-[2- Amino-3-(4-isothiocyanatophenyl)-propyl]-trans-cyclo hexan-1,2-diamin-N,N′-N′,N′′,N′′-pentaessigsäure

Eine ²¹²Wismut-Tetraiodid-Lösung in 0,1 N Iodwasserstoff säure wird mit 2 M Essigsäure auf pH 4 gebracht. Ein Aliquot dieser Lösung der Aktivität von ca. 3 mCi wird zu 1 mg der Titelverbindung aus Beispiel 2a) gelöst in 0,5 ml 0,02 M MES-Puffer gegeben und 0,5 ml 0,15 M Natriumchlorid- Lösung zugesetzt. Man rührt 20 Minuten bei Raumtemperatur. Es wird mit 2 M Natriumacetat-Lösung auf pH 6 gebracht und 20 µl einer 0,01 M Na₂EDTA-Lösung zugegeben. Man rührt 20 Minuten. Die Reinigung des Komplexes erfolgt durch HPLC (Ausschluß-Chromatographie: TSK-400/MES-Puffer). Die radioaktiven Konjugat-Fraktionen werden vereinigt, mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, und mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt. Nach Filtration erhält man ein für die Radiotherapie geeignetes Präparat.

Beispiel 3 a) Indium-111-Komplex des Konjugats aus 5′(6-Amino-1-hexyl phosphorsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3′ und N-[2- Amino-3-(4-isothiocyanatophenyl)-propyl)-trans-cyclo hexan-1,2-diamin-N,N′-N′,N′′,N′′-pentaessigsäure

15 ml einer 15 µl einer ¹¹¹Indium(III)acetat-Lösung (350 µCi), (hergestellt aus ¹¹¹Indium(III)chlorid in 2 N Natriumacetat-Lösung und einstellen des pH-Wertes mit 0,1 M Salzsäure auf pH 4,0) werden in 0,5 ml einer Lösung aus 1 mg der Titelverbindung aus Beispiel 2a) in MES-Puffer, pH 6,2 gegeben (MES = 2-(N-Morpholino)ethylsulfonsäure). Der pH-Wert wird durch Zugabe von 0,01 M Salzsäure auf pH 5,0 gebracht. Man rührt 1 Stunde bei 37°C bei pH 5,0. Es wird mit 2 M Natriumacetat-Lösung auf pH 6 gebracht und 10 µl einer 0,1 M Na₂EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure- Dinatriumsalz) zugegeben, um überschüssiges ¹¹¹Indium zu komplexieren. Die Endreinigung des so erhaltenen markierten Konjugates (1h) erfolgt durch HPLC (Ausschlußchro matographie: TSK-400/MES-Puffer). Die das markierte Konjugat enthaltenen Fraktionen werden mit physiologischer Kochsalz-Lösung verdünnt, mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt und filtriert. Eine so hergestellte Lösung stellt dann ein geeignetes Präparat für die Radiodiagnostik dar.

Beispiel 4 a) Konjugat aus 5′-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- CUCAUGCAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3′ und 2-(4- Isothiocyanato-benzyl)-diethylentriamin-N,N,N′,N′′,N′′- pentaessigsäure

8 mg des in Beispiel 1a) erhaltenen Oligonucleotids werden in 2,5 ml einer Mischung aus 1 M NaHCO₃/Na₂CO₃ (pH 9,0) gelöst und 1 mg 2-(4-Isothiocyanato-benzyl) diethylentriamin-N,N′,N′,N′′,N′′-pentaessigsäure zugegeben (hergestellt nach Bioconjugate Chem. 2, 187 (1991)). Man rührt 5 Stunden bei Raumtemperatur, stellt dann mit 0,01 M Salzsäure auf pH 7,2 und unterwirft die Lösung einer Ultrafiltration durch eine Membran mit der Ausschlußgrenze 3000 (Amicon YM3). Nach Gefriertrocknung erhält man 6 mg des Thioharnstoffkonjugats.

b) Yttrium-90-Komplex des Konjugates aus 5′-(6-Amino-1- hexyl-phosphorsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- CUCAUGCAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3′ und 2-(4- Isothiocyanato-benzyl)-diethylentriamin-N,N,N′,N′′,N′′- pentaessigsäure

Zu 1 mg des Thioharnstoffderivates aus Beispiel 4a) in 0,5 ml 0,05 M Ammoniumacetat-Lösung von pH 6 gibt man einer Lösung von ⁹⁰Yttrium, gelöst in 0,05 M Ammoniumacetat- Lösung (ca. 380 mCi) zu, stellt mit 3 M Essigsäure auf pH 5,2 und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Man stellt mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,0 und reinigt das Konjugat durch HPLC auf (TSK-400/MES-Puffer). Die Hauptfraktionen werden vereinigt, mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,2 gebracht. Nach Filtration erhält man ein für die Radiotherapie geeignetes Präparat.

Beispiel 5 a) 5′-(6-Mercapto-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- T*T*T*T*AGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3′ (modifizierter Ligand für Serin Protease)

Das nach dem SELEX-Verfahren identifizierte 30mer-Oligo nucleotid 5′-AGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3′ (Seq. Nr. 13 aus dem US-Patent Nr. 5,270,163) modifiziert in den Zuckereinheiten und durch eine an 5′-geknüpfte Sequenz von 5 Tymidinen wird in üblicher Weise in einem Syntheseautomaten der Fa. Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid noch auf der Säule des festen Trägers befindet. Durch Reaktion mit Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan wird die 5′- Hydroxygruppe freigelegt. Die Beladung der Säule beträgt ca. 10 mg des 35mer-Oligonucleotids. Zum Anknüpfen des Linkers wird die Säule mit einer Lösung von 50 µmol β-Cyanoethyl-N,N-diisopropylamino-S-trityl-6-mercapto) phosphoramidit in Acetonitril in Gegenwart von Tetrazol umgesetzt. Die Oxidation des gebildeten Phosphits zum voll geschützten Phosphotriester erfolgt mit Iod in Tetrahydrofuran. Anschließend wird die Säule nacheinander mit Methanol und Wasser gewaschen. Zur Ablösung des modifi zierten Oligonucleotids vom festen Träger, überführt man den Inhalt der Säule in ein Multivial, versetzt mit 5 ml 30%iger Ammoniaklösung, verschließt das Gefäß und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt dann auf 0°C zentrifugiert, wäscht den Träger mit 5 ml Wasser und unterwirft die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung.

Zur Reinigung nimmt man das feste Material in 2 ml Wasser auf, versetzt mit 2 ml 0,5 M Ammoniumacetatlösung und versetzt mit 10 ml Ethanol, man läßt über Nacht bei -20°C stehen, zentrifugiert, wäscht den Rückstand mit 1 ml Ethanol (-20°C) und trocknet schließlich im Vakuum bei Raumtemperatur.

Man erhält 9 mg der S-tritylierten Titelverbindung. Zur Abspaltung der Trityl-Schutzgruppe löst man das Produkt in 0,5 ml Wasser, versetzt mit 0,1 ml 1 M Silbernitratlösung und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Anschließend versetzt man mit 0,1 ml 1 M Dithiothreitol-Lösung. Nach 15 Minuten zentrifugiert man und extrahiert die überstehende Lösung mehrmals mit Ethylacetat. Aus der wäßrigen Lösung erhält man nach dem Gefriertrocknen 8 mg der gewünschten Titelverbindung.

b) 4-Benzyloxy-N-methansulfonyl-phenylalanin-methylester

Zu 50 g 4-Benzyloxy-phenylalanin-methylester-hydrochlorid in 300 ml Pyridin tropft man bei 0°C 19,58 g Methansulfonsäurechlorid und rührt 3 Stunden bei 0°C. Es wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 500 ml Dichlormethan gelöst. Man schüttelt zweimal mit je 300 ml 5 N Salzsäure aus, trocknet über Magnesiumsulfat und dampft im Vakuum ein. Der Rückstand wird aus 150 ml Methanol umkristallisiert.
Ausbeute: 53,64 g eines farblosen kristallinen Pulvers.

c) 2-(4-Benzyloxybenzyl)-1-methansulfonyl-1,4,7- triazaheptan-3-on

37,2 g 4-Benzyloxy-N-methansulfonyl-phenylalanin methylester und 1,2 l 1,2-Diaminoethan werden 3 Stunden bei 80°C gerührt. Man dampft den Rückstand zur Trockne ein und rührt mit 200 ml Wasser aus, saugt den Niederschlag ab, wäscht mit Wasser neutral und trocknet über Nacht bei 60°C.
Ausbeute: 37,68 g eines cremefarbigen, amorphen Pulvers.

d) 2-(4-Benzyloxybenzyl)-1-methansulfonyl-7-(tert. butyloxycarbonyl)-1,4,7-triazaheptan-3-on

Eine Lösung von 16,23 g 2-(4-Benzyloxybenzyl)-1- omethansulfonyl-1,4,7-triazaheptan-3-on und 4,76 g Triethylamin in 200 ml Chloroform werden bei 0°C mit einer Lösung von 10,27 g Di-tert.-butyl-dicarbonat in 50 ml Chloroform versetzt. Man rührt 5 Stunden bei Raumtempertur, schüttelt mit 5%iger Natriumcarbonatlösung und Wasser, trocknet über Magnesiumsulfat und dampft im Vakuum ein. Der Rückstand wird aus 100 ml Methanol umkristallisiert.
Ausbeute: 20,19 g eines schaumigen Feststoffes.

e) 2-(4-Hydroxybenzyl)-1-methansulfonyl-7-(tert. butyloxycarbonyl)-1,4,7-triazaheptan-3-on

20 g 2-(4-Benzyloxybenzyl)-1-methansulfonyl-7-(tert. butyloxycarbonyl)-1,4,7-triazaheptan-3-on gelöst in 300 ml Dichlormethan werden mit 4 g Palladium-Kohle (10%ig) über Nacht unter einer Wasserstoffatmosphäre gerührt. Man filtriert und dampft die Lösung im Vakuum ein.
Ausbeute: 16,17 g eines glasigen Schaumes, der nach wenigen Minuten erstarrt.

f) 2-[4-(3-Oxapropionsäure-benzylester)-benzyl)-1- methansulfonyl-7-(tert.-butyloxycarbonyl)-1,4,7- triazaheptan-3-on

15 g 2-(4-Hydroxybenzyl)-1-methansulfonyl-7-(tert.- butyloxycarbonyl)-1,4,7-triazaheptan-3-on, 8,56 g Bromessigsäure-benzylester und 13,18 g Kaliumcarbonat werden in 300 ml Acetonitril 24 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Man filtriert und dampft im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird in 200 ml Dichlormethan gelöst, zweimal mit je 50 ml Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Magensiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Dichlormethan-Hexan- Aceton (20/10/1) als Elutionsmittel chromatographiert.
Ausbeute: 10,06 g schaumiger Feststoff.

g) 2-[4-(3-Oxapropionsäure-benzylester)-benzyl]-1- methansulfonyl-1,4,7-triazaheptan-3-on

10 g 2-[4-(3-Oxapropionsäure-benzylester)-benzyl]-1- methansulfonyl-7-(tert.-butyloxycarbonyl)-1,4,7- triazaheptan-3-on werden 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 100 ml Trifluoressigsäure gerührt. Man dampft im Vakuum zur Trockne ein.
Ausbeute: 9,2 g glasiger Schaum, der beim Stehen erstarrt.

h) 9-Chlor-1-methansulfonyl-2-[4-(3-oxapropionsäure benzylester)-benzyl]-1,4,7-triaza-3,8-dion

9 g 2-[4-(3-Oxapropionsäure-benzylester)-benzyl)-1- methansulfonyl-1,4,7-triazaheptan-3-on und 1,78 g Triethylamin werden in 200 ml Chloroform gelöst. Bei 0°C werden 1,98 g Chloracetylchlorid gelöst in 20 ml Chloroform innerhalb von 30 Minuten zugetropft und anschließend 2 Stunden bei 0°C gerührt. Man wäscht mit 100 ml 5%iger Salzsäure, zweimal mit je 50 ml Wasser, getrocknet über Magnesiumsulfat und dampft im Vakuum zur Trockne. Der Rückstand wird mit Dichlormethan-Ethylacetat (20/1) als Elutionsmittel an Kieselgel chromatographiert.
Ausbeute: 6,97 g wachsartiger Feststoff.

i) 9-Chlor-1-methansulfonyl-2-[4-(3-oxapropionsäure benzylester)-benzyl]-1,4,7-triaza-3,8-dion

6,5 g 9-Chlor-1-methansulfonyl-2-[4-(3-oxapropionsäure benzylester)-benzyl]-1,4,7-triaza-3,8-dion gelöst in 150 ml Dichlormethan werden mit 2 g Palladium-Kohle (10%ig) über Nacht unter einer Wasserstoffatmosphäre gerührt. Man filtriert und dampft die Lösung im Vakuum ein.
Ausbeute: 5,33 glasiger Feststoff.

j) 10-Acetyl-2-[4-(3-oxapropionsäure)-benzyl]-1- (methansulfonyl)-10-thia-1,4,7-triazadecan-3,8-dion

5 g 9-Chlor-1-methansulfonyl-2-[4-(3-oxapropionsäure benzylester)-benzyl]-1,4,7-triaza-3,8-dion gelöst in 80 ml Chloroform werden mit 1,98 g Triethylamin und 0,74 g Thioessigsäure 10 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Man gießt die Lösung in 200 ml eiskalte 5%ige Salzsäure, trennt die organische Phase ab, trocknet über Magnesiumsulfat und dampft im Vakuum ein. Nach Chromatographie an Kieselgel mit Hexan-Ethylacetat (3/1) erhält man 4,64 g der gewünschten Verbindung als glasigen Feststoff.

k) 10-Acetyl-2-[4-(3-oxapropionsäure-2,5-dioxo pyrrolidin-1-yl)-ester))-benzyl]-1-(methansulfonyl)- 10-thia-1,4,7-triazadecan-3,8-dion

4 g 10-Acetyl-2-[4-(3-oxapropionsäure)-benzyl]-1- (methansulfonyl)-10-thia-1,4,7-triazadecan-3,8-dion, 1,91 g Dicyclohexylcarbodiimid, 4 g N-Hydroxysuccinimid und 30 mg 4-Dimethlaminopyridin werden 24 Stunden in 20 ml Chloroform bei Raumtemperatur gerührt. Man versetzt dann mit 20 ml Diethylether, filtriert und dampft den Rückstand im Vakuum ein. Der Rückstand wird an Kieselgel mit Dichlormethan- Dioxan (10/1) als Elutionsmittel chromatographiert.
Ausbeute: 3,47 g eines cremefarbigen Feststoffs.

Elementaranalyse:
ber.: C 46,15; H 4,93; N 9,78; S 11,20;
gef.: C 46,03; H 4,83; N 9,64; S 11,05.

l) 10-Acetyl-2-{4-[3-oxapropionsäure-(6-maleimido hexanoyl)-hydrazid]-benzyl]-1-methansulfonyl-10-thia- 1,4,7-triazadecan-3,8-dion

3 g 10-Acetyl-2-[4-(3-oxapropionsäure-(2,5-dioxo pyrrolidin-1-yl)-ester)-benzyl]-1-(methansulfonyl)-10-thia- 1,4,7-triazadecan-3,8-dion und 1,17 g 6- Maleimidocapronsäurehydrazid (Science 261, 212 (1993)) werden in 40 ml Dimethylformamid 5 Stunden bei 60°C gerührt. Unter starkem Rühren tropft man 100 ml Wasser zu und filtriert vom ausgefallenen Niederschlag ab. Man trocknet im Vakuum und reinigt den Rückstand durch eine FLASH-Chromatographie an einer Kieselgelsäule mit Di chlormethan/Dioxan (10/1) als Elutionsmittel. Man erhält 2,8 g der Titelverbindung als weißen Feststoff.

Elementaranalyse (bezogen auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 49,25; H 5,61; N 12,30; S 9,39;
gef.: C 49,33; H 5,95; N 12,43; S 9,11.

m) Konjugat aus 5′-(6-Mercapto-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3′ und 10- Acetyl-2-{4-[3-oxapropionsäure-(6-maleimido-)hexanoyl) hydrazid]-benzyl}-1-methansulfonyl-10-thia-1,4,7- triazadecan-3,8-dion

5 mg des nach Beispiel 5a) hergestellten thiolhaltigen Oligonucleotids werden in 2 ml Phosphatpuffer (pH 7,4 ) mit 1 mg des nach Beispiel 51) hergestellten Maleimidderivates gelöst in 0,2 ml Dimethylformamid versetzt. Man läßt 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen und unterwirft die Lösung einer Ultrafiltration durch eine Membran mit der Ausschlußgrenze 3000 (Amicon YM3) und anschließend einer Gefriertrocknung. Man erhält 5 mg des gewünschten Konjugats.

n) Technetium-99m-Komplex des Konjugats aus 5′-(6-Mercapto- 1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3′ und 10- Acetyl-2-{4-[3-oxapropionsäure-(6-maleimido-)hexanoyl) hydrazid]-benzyl}-1-methansulfonyl-10-thia-1,4,7-triaza decan-3,8-dion

1 ml einer Lösung von Kalium-D-glucarat (12 mg/ml) und Zinn(II)chlorid (100 µg/ml) in 0,2 M NaHCO₃ werden in einem Vial gefriergetrocknet und anschließend mit [Tc-99m]- Natriumpertechnetatlösung (1 ml, 1 mCi) aus einem Mo-99/ Tc-99m-Generator versetzt. Nach Stehen bei Raumtemperatur für 15 Minuten entnimmt man ein Aliquot und versetzt mit dem gleichen Volumen des in 0,2 M NaHCO₃-Lösung gelösten Konjugats aus Beispiel 5m) (1 mg/ml). Nach 15 Minuten zeigten sowohl Dünnschichtchromatographie als auch HPLC, daß < 98% der Radioaktivität von dem Konjugat aufgenommen waren.

Beispiel 6 a) Konjugat aus 5′-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- CUCAUGCAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3′ und S-Benzoyl MAG₃-2,3,5,6-tetrafluorophenylester

Zu 8 mg der Titelverbindung aus Beispiel 1a) gelöst in 0,5 ml 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 7) gibt man 3 mg S-Benzoyl- MAG₃-2,3,5,6-tetrafluorophenylester (hergestellt nach US 4,965,392) gelöst in 0,2 ml Dimethylformamid und rührt 3 Stunden bei Raumtemperatur. Man verdünnt mit Wasser und unterwirft die Lösung einer Ultrafiltration (Amicon YM3, Ausschlußgrenze 3000). Nach Gefriertrocknung erhält man 5 mg des Konjugates 6a).

b) ^99mTechnetium-Komplex des Konjugates aus 5′-(6-Amino-1- hexyl-phosphorsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- CUCAUGCAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3′ und S-Benzoyl MAG₃-2,3,5,6-tetrafluorophenylester

1 mg der Titelverbindung aus Beispiel 6a) werden in 200 µl Wasser gelöst und mit 1 ml 0,1 M Phosphat-Puffer pH 8,5 versetzt. Zu dieser Mischung gibt man 200 µl ^99mTechnetium- (V)-Gluconatlösung (ca. 15 mCi) und läßt 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Die Markierungsausbeute (bestimmt mittels HPLC) beträgt ca. 95%.

Beispiel 7 a) Konjugat aus dem 5′-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3′ und dem ^99mTechnetium-Komplex des 2,3,5,6-Tetrafluorphenyl-4,5- bis(mercaptoacetamido)-pentansäureesters

Zum ^99mTechnetium-Komplex von 2,3,5,6-Tetrafluorphenyl-4,5- bis(mercaptoacetamido)-pentansäureester (hergestellt nach: J. Nucl. Med. 32, 1445 (1991) ca. 100 mCi, gelöst in 2 ml Phosphat-Puffer, pH 7,2 gibt man 3 mg der Titelverbindung aus Beispiel 1a), gelöst in 0,6 ml Phosphat-Puffer. Man stellt mit 1.0 M Kaliumcarbonat-Puffer auf pH 10 und rührt 20 min. bei Raumtemperatur. Zur Endreinigung gibt man die Lösung auf eine Sephadex-Säule (Pharmacia) und eluiert mit 75 mM Natriumchlorid-Lösung. Die Hauptfraktionen werden vereinigt, mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und filtriert. Die so erhaltene Lösung kann für radiodiagnostische Untersuchungen eingesetzt werden.

Beispiel 8 a) Konjugat aus 5′-(6-Mercapto-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3′ und 5′-(N- Maleimido)-3-oxapentyl-{2-[3-carboxybenzoyl)-thio] acetyl}-glycylglycylglycinat

5 mg des nach Beispiel 5a) hergestellten thiohaltigen Oligonucleotids werden unter N₂ in 2 ml Phosphatpuffer (pH 7,4) mit 1 mg 5-(N-Maleimido)-3-oxapentyl-{2-[3- carboxybenzoyl)-thio]-acetyl}-glycylglycylglycinat (hergestellt nach Bioconj. Chem. 1, 431 (1990)) gelöst in 0,2 ml Dimethylformamid versetzt. Man läßt 2 Stunden bei Raumtemperatur rühren und unterwirft die Lösung einer Ultrafiltration durch eine Membran (Amicon YM3) und anschließend einer Gefriertrocknung. Man erhält 5,5 mg des gewünschten Konjugats.

b) Technetium-99m-Komplex des Konjugats 5′-(6-Mercapto-1- hexyl-phosphorsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3′ und 5′-(N- Maleimido)-3-oxapentyl-{2-[3-carboxybenzoyl)-thio] acetyl}-glycylglycylglycinat

1 ml einer Lösung von Kalium-D-glucarat (12 mg/ml) und Zinn(II)chlorid (100 µg/ml) in 0,2 M NaHCO₃ werden in einem Vial gefriergetrocknet und anschließend mit [Tc-99m]- Natriumpertechnetatlösung (1 ml, 1 mCi) aus einem Mo-99/Tc- 99m-Generator versetzt. Nach Stehen bei Raumtemperatur für 15 Minuten entnimmt man ein Aliquot und versetzt mit dem gleichen Volumen des in 0,2 M NaHCO₃-Lösung gelösten Konjugats aus Beispiel 8a) (1 mg/ml). Die Substanz kann durch Gefriertrocknung isoliert werden. Die durch HPLC bestimmte Markierungsausbeute beträgt < 96%.

Beispiel 9 a) Konjugat aus 5′-6-Mercapto-1-hexyl-phosphonsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3′ und 1-[6-(2- Vinyl-6-hexyloxymethyl)-pyridin]-1,4,8,11-tetraazacyclo tetradecan

Man versetzt unter N₂ eine Lösung von 4 mg des nach Beispiel 5a) hergestellten thiohaltigen Oligonucleotids in 2 ml Phosphatpuffer (pH 7,4) mit 1 mg 1-[6-(2-Vinyl-6- hexyloxymethyl)-pyridin]-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan (hergestellt nach EP 0 588 229) gelöst in 0,5 ml Dimethylformamid. Man läßt 4 Stunden bei 35°C rühren, versetzt mit 10 ml Ethanol und isoliert das Produkt durch Zentrifugieren. Die Reinigung erfolgt durch Reversed-Phase- Chromatographie an einer 1 × 25 cm Säule mit einem 50 mM Triethylammoniumacetat (pH 7) Acetronitril-Gradienten. Die zusammengefaßten Fraktionen werden gefriergetrocknet, in 1 ml Wasser gelöst und an einer Sephadex G-10 Säule entsalzt. Die Titelverbindung (ca. 4 mg) wird durch Gefriertrocknen isoliert.

b) Tc-99m-Komplex des Konjugats aus 5′-(6-Mercapto-1-hexyl phosphonsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3′ und 1-[6-(2- Vinyl-6-hexyloxymethyl)-pyridin]-1,4,8,11-tetraazacyclo tetradecan

Man verfährt wie in Beispiel 8b) beschrieben. Die durch HPLC bestimmte Markierungsausbeute beträgt 92%.

Beispiel 10 a) Konjugat aus 5′-(6-Mercapto-1-hexyl-phosphonsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3′ und N-[4- Hydroxy-3-(1,4,8,11-tetraaza-cyclotetradec-5-yl)-benzyl- 2-(6-vinyl-pyridin-2-ylmethoxy)-acetamid

Man versetzt eine Lösung von 6,5 mg des nach Beispiel 5a) hergestellten thiolhaltigen Oligonucleotids in 2 ml Phosphatpuffer (pH 8,0) mit 1,2 mg N-[4-Hydroxy-3- (1,4,8,11-tetraaza-cyclotetradec-5-yl)-benzyl-2-(6-vinyl pyridin-2-ylmethoxy)-acetamid (hergestellt nach J. Chem. Soc., Chem. Commun. 156 (1988)) gelöst in 0,1 ml Dimethylformamid. Man rührt 4 Stunden unter N₂ bei 35°C, versetzt mit 10 ml Ethanol und isoliert das Produkt durch Zentrifugieren. Die Reinigung erfolgt durch Reversed-Phase- Chromatographie an einer 1 × 25 cm Säule mit einem 50 mM Triethylammoniumacetat (pH 7) /Acetonitril-Gradienten. Die vereinigten Fraktionen werden an einer Sephadex-G-10-Säule entsalzt. Durch Gefriertrocknung erhält man 5 mg der Titelverbindung als weißes Pulver.

b) Kupfer-64-Komplex des Konjugats aus 5′-(6-Mercapto-1- hexyl-phosphonsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3′ und N-[4- Hydroxy-3-(1,4,8,11-tetraaza-cyclotetradec-5-yl)-benzyl- 2-(6-vinyl-pyridin-2-ylmethoxy)-acetamid

1 mg des nach 10a) erhaltenen Konjugats werden in 1 ml Phosphatpuffer (pH 8) mit ⁶⁴CuCl₂ (0,2 mCi) inkubiert. Die Markierungsausbeute nach 1 Stunde durch HPLC bestimmt, beträgt < 98%. Das Produkt wird durch Gefriertrocknung isoliert.

Beispiel 11 a) Konjugat aus 5′-(6-Mercapto-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3′ und 1,4,7,10- tetraazacyclododecan-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-octan]- 1,4,7,10-tetraessigsäure

Zu einer Lösung von 5 mg des nach Beispiel 5a) hergestellten thiolhaltigen Oligonucleotids in 2 ml Phosphatpuffer (pH 8) gibt man unter N₂ 1 mg 1,4,7,10- tetraazacyclododecan-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-octan]- 1,4,7,10-tetraessigsäure (hergestellt nach J. Chem. Soc., Chem. Commun. 796, (1989)). Man rührt 3 Stunden bei 35°C, versetzt mit 10 ml Isopropylalkohol und isoliert das Produkt durch Zentrifugieren. Die Reinigung erfolgt durch Reversed-Phase-Chromatographie an einer 1 × 25 cm Säule mit einem 25 mM Triethylammoniumacetat (pH 7) /Acetonitril- Gradienten. Die vereinigten Fraktionen werden im Vakuum schonend eingedampft, in wenig Wasser gelöst und mit Hilfe einer Sephadex-G-10-Säule entsalzt. Durch Gefriertrocknung erhält man 4 mg der Titelverbindung als weißes Pulver.

b) Yttrium-90-Komplex des Konjugats aus 5′-(6-Mercapto-1- hexyl-phosphonsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3′ und 1,4,7,10- tetraazacyclododecan-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-octan]- 1,4,7,10-tetraessigsäure

⁹⁰Y-acetat (1 mCi), gelöst in 1 ml 0,05 M Ammoniumacetat- Lösung wird mit 1 mg des nach Beispiel 11a) hergestellten Konjugats versetzt und 1 Stunde auf 85°C erhitzt. Die durch HPLC bestimmte Markierungsausbeute beträgt < 95%. Das Produkt wird durch Gefriertrocknung isoliert.

Beispiel 12 a) Konjugat aus 5′-(6-Mercapto-1-hexyl-phosphonsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3′ und 1,4,7- Triazacyclononan-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-octan]- 1,4,7-triessigsäure

Zu einer Lösung von 5 mg des nach Beispiel 5a) hergestellten thiolhaltigen Oligonucleotids in 2 ml Phosphatpuffer (pH 8) gibt man unter N₂ 1 mg 1,4,7,10-Tri azacyclononan-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-octan]-1,4,7- triessigsäure (hergestellt nach J. Chem. Soc., Chem. Commun. 794, (1989)). Man rührt 6 Stunden bei 35°C, versetzt mit 10 ml Isopropanol und isoliert das Produkt durch Zentrifugieren. Die Reinigung erfolgt durch Reversed- Phase-Chromatographie an einer 1 × 25 cm Säule mit einem 25 mM Triethylammoniumacetat (pH 7) /Acetonitril-Gradienten. Die vereinigten Fraktionen werden schonend im Vakuum eingedampft, in wenig Wasser gelöst und mit Hilfe einer Sephadex-G-10-Säule entsalzt. Durch Gefriertrocknung erhält man 3 mg der Titelverbindung als weißes Pulver.

b) Gallium-67-Komplex des Konjugats aus 5′-(6-Mercapto-1- hexyl-phosphonsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3′ und 1,4,7- Triazacyclononan-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-octan]- 1,4,7-triessigsäure

20 mg des nach Beispiel 12a) hergestellten Konjugats werden in 0,5 ml 0,1 M Citratpuffer pH 4,5 gelöst und mit 0,1 ml einer Gallium-67-citratlösung (0,2 mCi) versetzt. Man läßt 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen und entsalzt das Produkt an einer Sephadex-G-10-Säule. Nach Gefriertrocknung erhält man 17 mg der Titelverbindung als weißes Pulver.

Beispiel 13 a) Phosphitylierung von 5′-O-(4,4′-Dimethoxytr 58334 00070 552 001000280000000200012000285915822300040 0002004445078 00004 58215ityl)-5- (prop-2-en-1-on)-2′-desoxyuridin

Zu einer gerührten Lösung von 2,1 g (3,59 mmol) 5′-O-(4,4′- Dimethoxytrityl)-5-(prop-2-en-1-on)-2′-desoxyuridin (her gestellt nach Nucleosides & Nucleotides 13, 939-944, (1994)) in 50 ml Tetrahydrofuran gibt man nacheinander 50 mg 4-Dimethylaminopyridin, 3 ml Diisopropylethylamin und 962 µl (4,31 mmol) 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchloro phosphoramidit. Nach ca. 30 Minuten bildet sich ein weißer Niederschlag. Man filtriert, engt die Lösung im Vakuum ein und verteilt den Rückstand zwischen Dichlormethan und 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung. Die Dichlormethanphase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Den Rückstand reinigt man durch rasche Chromatographie an Kieselgel, wobei man mit Dichlormethan/Hexan/Diisopropylethylamin (80 : 18 : 2) eluiert.

Man erhält 1,8 g der gewünschten Verbindung als einen weißen Schaum.

Elementaranalyse:
ber.: C 64,28; H 6,29; N 7,14; P 3,95;
gef.: C 64,02; H 6,60; N 7,21; P 4,09.

b) Konjugat aus dem 36mer Oligonucleotid U^*T*T*T*T*TCUCAUGGAGCCAAGACGAAUAGCUACAUA-3′ und 10-(4- aza-2-hydroxy-5-imino-8-mercapto-octan)-1,4,7- tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan; U*: 5-(Prop-2-en-1-on)-2′-desoxyuridin

Das nach dem SELEX-Verfahren identifizierte 30mer-Oligo nucleotid wird mit der Modifikation einer an 5′- angeknüpften Sequenz 5′-T*T*T*T*T in üblicher Weise in einem Syntheseautomaten der Fa. Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid noch auf der Säule des festen Trägers befindet. Durch Reaktion mit Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan wird die 5′- Hydroxygruppe freigelegt. Die Beladung der Säule beträgt ca. 10 mg des 35mer-Oligonucleotids. Die 5′-Hydroxygruppe wird in Gegenwart von Tetrazol mit dem nach Beispiel 13a) erhaltenen Phosphoramidit umgesetzt. Anschließend wird durch Behandlung mit Iodlösung das Phosphit in den Phosphotriester überführt und durch Reaktion mit Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan wird der terminale DMT-Rest abgespalten. Zur Addition einer Thiolgruppe an das am terminalen 2′-Desoxyuridin befindliche α,β-ungesättigte Carbonylsystem setzt man mit einer Lösung von 10-(4-Aza-2-hydroxy-5-imino-8- mercaptooctan)-1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10- tetraazacyclododecan*) in Tetrahydrofuran um und wäscht nacheinander mit Methanol und Wasser. Zur Ablösung des modifizierten Oligonucleotids vom festen Träger, überführt man den Inhalt der Säule in ein Multivial, versetzt mit 5 ml 30%iger Ammoniaklösung, verschließt das Gefäß und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt dann auf 0°C, zentrifugiert, wäscht den Träger mit 5 ml Wasser und unterwirft die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung.

Man erhält 6 mg der Titelverbindung als farbloses Pulver.

*) 10-(4-Aza-2-hydroxy-5-imino-8-mercapto-octan)-1,4,7- tris-(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan erhält man wie nachfolgend beschrieben:
Zu einer Lösung von 1,46 g (3,49 mmol) 10-(3-Amino-2- hydroxy-propyl)-1,4,7-tris-(carboxymethyl)-1,4,7,10- tetraazacyclododecan (siehe Beispiel 1c) in einer Mischung aus 50 ml Wasser und 50 ml Methanol gibt man 15,7 ml 1 N Natronlauge und 480 mg (3,49 mmol) 2-Iminotetrahydrothio phenhydrochlorid und rührt 3 Stunden bei Raumtemperatur, engt im Vakuum auf ca. 1/4 des anfänglichen Volumens ein und versetzt unter Rühren mit einem Anionenaustauscher (IRA 410) bis ein pH von 11 erreicht ist. Man filtriert und versetzt die Lösung unter Rühren in kleinen Portionen mit soviel Kationenaustauscher IRC 50 bis ein pH von 3,5 erreicht ist. Nach Filtrieren wird die Lösung gefriergetrocknet. Man erhält 1,39 g der gewünschten Substanz als weißes Pulver mit einem Wassergehalt von 4,9%. Elementaranalyse (bezogen auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 48,45; H 7,74; N 16,14; S 6,16;
gef.: C 48,30; H 7,98; N 16,05; S 6,44.

c) Yttrium-90-Komplex des Konjugats aus dem 36mer Oligonucleotid U^*T*T*T*T*TCUCAUGGAGCCAAGACGAAUAGCUACAUA- 3′ und 10-(4-aza-2-hydroxy-5-imino-8-mercapto-octan)- 1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan; U*: 5-(Prop-2-en-1-on)-2′-desoxyuridin

Zu 1 mg des Thioderivates aus Beispiel 13b) in 0,5 ml 0,05 M Ammoniumacetat-Lösung von pH 6 gibt man eine Lösung von ⁹⁰Yttrium, gelöst in 0,05 M Ammoniumacetat-Lösung (ca. 380 mCi) zu, stellt mit 3 M Essigsäure auf pH 5,2 und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Man stellt mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,0 und reinigt das Konjugat durch HPLC auf (TSK-400/MES-Puffer). Die Hauptfraktionen werden vereinigt, mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,2 gebracht. Nach Filtration erhält man ein für die Radiotherapie geeignetes Präparat.

Beispiel 14 a) S-(Triphenylmethyl-mercaptoacetyl)-glycyl glycinmethylester

3,34 g (10 mmol) S-Triphenylmethylmercaptoessigsäure und 1,83 g (10 mmol) Glycylglycinmethylesterhydrochlorid werden in 250 ml absolutem Dichlormethan suspendiert. Nach Zugabe von 1,01 g (10 mmol) Triethylamin tropft man unter Eiskühlung 2,06 g (10 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 50 ml absolutem Dichlormethan, hinzu. Es wird 1 Stunde bei 0°C und 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Man filtriert, engt ein und chromatographiert an Kieselgel (Eluent: OH₂Cl₂/MeOH: 10%-30%).
Ausbeute: 3,56 g (77,0% d. Th.), weißes Pulver.

Elementaranalyse:
ber.: C 67,51; H 5,67; N 6,06; O 13,84; S 11,20;
gef.: C 67,37; H 6,02; N 5,91; S 6,73.

b) [S-(Triphenylmethyl-mercaptoacetyl)-glycyl glycinamidyl]-6-hexanol

4,63 g (10 mmol) des unter Beispiel 14a) hergestellten S- (Triphenylmethyl-mercaptoacetyl)-glycyl-glycinmethylesters werden in 11,72 g (100 mmol) 6-Aminohexanol/50 ml 1,4- Dioxan unter Argonatmosphäre 2 Stunden auf 100°C erhitzt. Anschließend gießt man den Reaktionsansatz auf ein Gemisch aus 100 ml Dichlormethan und 100 ml Wasser. Unter Rühren und Eiskühlung wird mittels 10 molarer Salzsäure ein pH- Wert von 6 eingestellt, die organische Phase abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird das Rohprodukt an Kieselgel gereinigt (Eluent: CH₂Cl₂/MeOH: 10%-50%).
Ausbeute: 2,97 g (54,2 d. Th.), weißes Pulver.

Elementaranalyse:
ber.: C 67,98; H 6,81; N 7,67; O 11,68; S 5,85;
gef.: C 67,72; H 6,93; N 7,93; S 5,64.

c) O-{[S-(Triphenylmethyl-mercaptoacetyl)-glycyl glycinamidyl]-6-hex-1-yl}-diisopropylamid-O′-methyl phosphorigsäurediester

5,48 g (10 mmol) des unter Beispiel 14b) hergestellten [S- (Triphenylmethyl-mercaptoacetyl)-glycyl-glycinamidyl]-6- hexanols werden in 100 ml absolutem Dichlormethan gelöst. Man setzt unter Argonatmosphäre 5,17 g (40 mmol) Diisopropylethylamin hinzu und tropft bei 0°C 3,95 g (20 mmol) Phosphorigsäuremonomethylesterdiisopropylamidchlorid, gelöst in 50 ml absolutem Dichlormethan, hinzu. Es wird 0,5 Stunden bei 0°C und abschließend 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wird unter Eiskühlung mit 320 mg (10 mmol) absolutem Methanol versetzt und nach Aufkonzentrieren an Kieselgel chromatographiert (Eluent: CH₂Cl₂/MeOH: 95%:5/5% Triethylamin).
Ausbeute: 1,98 g (27,9% d. Th.), farbloses Öl.

d) 5′-[(Mercaptoacetyl-glycyl-glycyl-amidyl)-6-hex-1-yl] phosphorsäureester des 35mer Oligonucleotids 5′-T*T*T*T*TCUGAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3′

Ein nach dem Selex-Verfahren identifiziertes 30mer-Oligo nucleotid mit der Modifikation einer an 5′-angeknüpften Sequenz 5′-T*T*T*T*T wird mit Hilfe eines Syntheseautomaten der Firma Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides an Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid in geschützter Form noch auf der Säule des festen Trägers befindet. Die Beladung der Säule beträgt ca. 15 mg an 35mer-Oligonucleotid. Nach Abspaltung der 5′-DMT-Schutzgruppe (Trichloressigsäure/Dichlormethan) wird nach den Standardmethoden mit dem unter Beispiel 14c beschriebenen Phosphoramidit gekoppelt. Nach Oxidation mit Iod in Tetrahydrofuran wird das Konjugat vom Träger abgespalten. Hierzu versetzt man das Material mit 10 ml 30%iger Ammoniaklösung, verschließt das Gefäß und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt auf 0°C, zentrifugiert, wäscht den Träger mit 10 ml Wasser und unterwirft die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung.

Zur Reinigung nimmt man das Material in 5 ml Wasser auf, versetzt mit 4 ml 0,5 molarer Ammoniumacetatlösung und versetzt mit 20 ml Ethanol. Zur Vervollständigung der Fällung stellt man über Nacht kalt (-20°C), zentrifugiert, wäscht den Rückstand mit 1 ml Ethanol (-20°C) und trocknet im Vakuum. Man erhält 9 mg eines weißen Pulvers.

Zur Abspaltung der S-Tritylschutzgruppe wird das Material in 5 ml 50 molarer Triethylammoniumacetatlösung (pH = 7,0) aufgenommen und mit 500 µl 0,1 molarer Silbernitratlösung 30 min inkubiert. Anschließend setzt man 500 µl 0,14 molare Dithiothreitol-Lösung hinzu und inkubiert weitere 30 min. Nach Zentrifugieren wird der klare Überstand an Sephadex G 10 entsalzt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden lyphilisiert. Man erhält 4 mg des Konjugats als weißes Pulver.

e) Technetium-99m-Komplex des Konjugats 5′- [(Mercaptoacetyl-glycyl-glycyl-amidyl)-6-hex-1-yl]-phos phorsäureester des 35mer Oligonucleotids 5′-T*T*T*T*TCUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3′

1 mg des Konjugates 14d) werden in 1 ml 0,1 molarem Dinatriumhydrogenphosphatpuffer (pH 9,5) gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatriumtartrat versetzt man mit Natriumpertechnetat-Lösung (1 mCi) und anschließend mit 10 ml Zinn-II-chloridlösung (5 mg SnCl₂/1 ml 0,01 molarer HCl). Die Markierungsausbeute (ca. 93%) wird durch HPLC bestimmt.

Beispiel 15 a) O-{[S-(Triphenylmethyl-mercaptoacetyl)-glycyl-glycin amidyl]-6-hex-1-yl)-toluolsulfonsäureester

5,48 g (10 mmol) des unter Beispiel 14b) hergestellten [S- (Triphenylmethyl-mercaptoacetyl)-glycyl-glycin-amidyl]-6- hexanols werden in 100 ml absolutem Dichlormethan gelöst. Man setzt 1,01 g (10 mmol) Triethylamin und 1,91 g (10 mmol) p-Toluolsulfonsäurechlorid hinzu und rührt 24 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird aufkonzentriert und an Kieselgel chromatographiert (Eluent: CH₂Cl₂/MeOH: 95 : 5).
Ausbeute: 4,32 g (61,5% d. Th.), farbloses Öl.

Elementaranalyse:
ber.: C 65,03; H 6,18; N 5,99; O 13,68; S 9,14;
gef.: C 64,93; H 6,32; N 5,78; S 8,87.

b) 5′-[(Mercaptoacetyl-glycyl-glycin-amidyl)-6-hex-1-yl] phosphorsäureester des 35mer Oligonucleotids 5′- T*T*T*T*TCUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3′

Ein nach dem Selex-Verfahren identifiziertes 30mer-Oligo nucleotids mit der Modifikation einer an 5′-angeknüpften Sequenz 5′-T*T*T*T*T wird mit Hilfe eines Syntheseautomaten der Firma Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid in geschützter Form noch auf der Säule des festen Trägers befindet. Die Beladung der Säule beträgt ca. 15 mg an 35mer-Oligonucleotid. Nach Abspaltung der 5′-DMT-Schutzgruppe (Trichloressigsäure/Dichlormethan) wird nach den Standardmethoden mit S-Trityl-6-mercapto hexyl-phosphoramidit gekoppelt. Nach Oxidation mit Iod in Tetrahydrofuran wird die Trityl-geschützte Verbindung vom Träger abgespalten, isoliert und gereinigt (siehe Beispiel 14d).

Die Abspaltung der S-Tritylschutzgruppe, die Isolation des SH-gruppentragenden Oligonucleotids und die Reinigung geschieht wie unter Beispiel 14d) beschrieben (6 mg).

Zur Kopplung wird das SH-gruppentragende 35mer- Oligonucleotid (6 mg) in 500 µl 0,1 molarer Natriumcarbonatlösung unter Argonatmosphäre mit 100 mg Toluolsulfonsäureester 15a), gelöst in 500 µl Dimethylformamid, versetzt. Nach 30 min wird neutralisiert und mit Wasser auf ein Volumen von 5 ml verdünnt. Nach dem Zentrifugieren wird der klare Überstand lyophilisiert.

Zur Abspaltung der S-Tritylgruppen wird wie unter 14d) beschrieben verfahren. Man erhält nach Reinigung 4 mg Konjugat.

c) Technetium-99m-Komplex des Konjugats 5′- [(Mercaptoacetyl-glycyl-glycin-amidyl)-6-hex-1-yl] phosphorsäureester des 35mer Oligonucleotids 5′- T*T*T*T*TCUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3′

1 mg des unter Beispiel 15b) beschriebenen Konjugates wird in 1 ml 0,1 molarem Dinatrium-hydrogenphosphatpuffer (pH = 9,5) gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatriumtartrat versetzt man mit Natriumpertechnetat-Lösung (1 mCi) und anschließend mit 10 µl Zinn-II-chlorid-lösung (5 mg SnCl₂/l ml 0,01 molarer HCl). Die Markierungsausbeute (ca. 95%) wird durch HPLC bestimmt.

Beispiel 16 a) N-[3-Thia-5-(triphenylmethylmercapto)-1-oxo-pent-1-yl]- S-triphenylmethyl-cysteinmethylester

2,69 g (10 mmol) N-[3-Thia-5-(triphenylmethylmercapto)-1- oxo-pent-1-yl]-S-triphenylmethyl-cysteinmethylesters (Herstellung nach DE 43 10 999) werden zusammen mit 5,58 g (20 mmol) Triphenylmethylchlorid in 100 ml absolutem Dichlormethan gelöst. Nach Zugabe von 2,02 g (20 mmol) Triethylamin läßt man über Nacht unter Argonatmosphäre bei Raumtemperatur rühren. Zur Aufarbeitung wird die organische Phase jeweils dreimal mit 1%iger Citronensäurelösung, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und mit Wasser gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat wird eingeengt und an Kieselgel gereinigt (Eluent: CH₂Cl₂/MeOH: 95 : 5).
Ausbeute: 4,53 g (60,1% d. Th.) farbloses Öl.

Elementaranalyse:
ber.: C 73,27; H 5,75; N 1,86; O 6,37; S 12,76;
gef.: C 73,31; H 5,48; N 1,63; S 12,49.

b) N-[3-Thia-5-(triphenylmethylmercapto)-1-oxo-pent- 1-yl]-S-triphenylmethyl-N′-(6-hydroxy-hex-1-yl) cysteinamid

7,54 g (10 mmol) des unter Beispiel 16a) beschriebenen N- [3-Thia-5-(triphenylmethylmercapto)-1-oxo-pent-1-yl]-S- cysteinmethylesters werden in 11,72 g (100 mmol) 6-Aminohexanol/50 ml 1,4-Dioxan unter Argonatmosphäre 2 Stunden auf 100°C erhitzt. Anschließend gießt man den Reaktionsansatz auf ein Gemisch aus 100 ml Dichlormethan und 100 ml Wasser. Unter Rühren und Eiskühlung wird mittels 10 molarer Salzsäue ein pH-Wert von 6 eingestellt, die organische Phase abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird das Rohprodukt an Kieselgel gereinigt (Eluent: OH₂Cl₂/MeOH: 5% -50%).

Elementaranalyse:
ber.: C 72,99; H 6,49; N 3,34; O 5,72; S 11,46;
gef.: C 72,73; H 6,62; N 3,11; S 11,17.

c) O-{{[N-[3-Thia-5-(triphenylmethylmercapto)-1-oxo-pent- 1-yl]-S-triphenylmethyl-cysteinyl}-2-amino-eth-1-yl} diisopropylamid-O′-methylphosphorigsäurediester

8,39 g (10 mmol) des unter Beispiel 16b) hergestellten N- [3-Thia-5-(triphenylmethylmercapto)-1-oxo-pent-1-yl]-S- triphenylmethyl-N′-(6-hydroxy-hex-1-yl)cysteinamids werden in 200 ml absolutem Dichlormethan gelöst. Man setzt unter Argonatmosphäre 5,17 g (40 mmol) Diisopropylethylamin hinzu und tropft bei 0°C 3,95 g (20 mmol) Phosphorigsäuremono methylester-diisopropylamid-chlorid, gelöst in 50 ml absolutem Dichlormethan, hinzu. Es wird 0,5 Stunden bei 0°C und abschließend 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wird unter Eiskühlung mit 320 mg (10 mmol) absolutem Methanol versetzt und nach Aufkonzentrieren an Kieselgel chromatographiert (Eluent: CH₂Cl₂/MeoH: 95 : 5/5% (Triethylamin).
Ausbeute: 5,37 g (53,7% d. Th.) gelbliches Öl.

d) 5′-[N-(3-Thia-5-mercapto-1-oxo-pent-1-yl)-cystein-N′-(6- hydroxy-hex-1-yl)-amid]-phosphorsäureester des 35mer Oligonucleotids 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3′

Ein nach dem Selex-Verfahren identifiziertes 30mer-Oligo nucleotid wird mit der Modifikation einer vorgeschalteten Sequenz T*T*T*T*T-3′ mit Hilfe eines Syntheseautomaten der Firma Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Editor F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid in geschützter Form noch auf der Säule des festen Trägers befindet. Die Beladung der Säule beträgt ca. 15 mg an 35mer-Oligonucleotid. Nach Abspaltung der 5′-DMT-Schutzgruppe (Trichloressigsäure/Dichlormethan wird nach den Standardmethoden mit Phosphoramidit (16c) gekoppelt und anschließend oxidiert.

Die Abspaltung vom Träger, der Basen-Schutzgruppen und die Aufreinigung des Bis-S-Trityl-geschützten Konjugates geschieht wie unter 14d) beschrieben (ca. 12 mg) Zur Abspaltung der S-Tritylschutzgruppen wird das Material in 5 ml 50 molarer Triethylamoniumacetat-Lösung (pH = 7,0) aufgenommen und mit 500 µl 0,1 molarer Silbernitratlösung 30 min inkubiert. Anschließend setzt man 500 µl 0,14 molare Dithiothreitol-Lösung hinzu und inkubiert weitere 30 min. Nach Zentrifugieren wird der klare Überstand an Sephadex G 10 entsalzt. Die das Produkt enthaltenen Fraktionen werden lyophilisiert. Man erhält 5 mg weißes Pulver.

e) Technetium-99m-Komplex des Konjugats 5′-[N-(3-Thia-5- mercapto-1-oxo-pent-1-yl)-cystein-N′-(6-hydroxy-hex-1- yl)-amid]-phosphorsäureester des 35mer Oligonucleotids 5′-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3′

1 mg des unter Beispiel 16d) beschriebenen Konjugates wird in 1 ml 0,1 molarem Dinatrium-hydrogenphosphatpuffer (pH = 9,5) gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatriumtartrat versetzt man mit Natriumpertechnetat-Lösung (1 mCi) und anschließend mit 10 ml Zinn-II-chlorid-Lösung (5 mg SnCl₂/ml 0,01 molarer HCl). Die Markierungsausbeute (ca. 96%) wird durch HPLC bestimmt.

Beispiel 17 a) O-{N-[3-Thia-5-(triphenylmethylmercapto)-1-oxo-pent-1- yl]-S-triphenylmethyl-N′-(6-hydroxy-hex-1-yl)cystein imidyl}-p-toluolsulfonsäureester

8,39 g (10 mmol) des unter Beispiel 16b) hergestellten N- [3-Thia-5-(triphenylmethylmercapto)-1-oxo-pent-1-yl]-S- triphenylmethyl-N′-(6-hydroxy-hex-1-yl)cysteinamids werden in 200 ml absolutem Dichlormethan gelöst. Man setzt 1,01 g (10 mmol) Triethylamin, 1,91 g (10 mmol) p-Toluolsulfonsäurechlorid hinzu und rührt 20 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird aufkonzentriert und an Kieselgel chromatographiert. (Eluent: CH₂Cl₂/MeOH: 97 : 3).
Ausbeute: 6,44 g (67,0% d. Th.) gelbliches Öl.

Elementaranalyse:
ber.: C 72,47; H 6,29; N 2,91; O 8,32; S 10,01;
gef.: C 72,19; H 6,47; N 2,68; S 9,83.

b) 5′-[(Mercaptoacetyl-glycyl-glycin-amidyl)-13-tridec-7- thio-1-yl]-phosphorsäureester des 35mer Oligonucleotids 5′-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3′

Ein nach dem Selex-Verfahren identifiziertes 30mer-Oligo nucleotid wird mit der Modifikation einer vorgeschalteten Sequenz T*T*T*T*T-3′ mit Hilfe eines Syntheseautomaten der Firma Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Editor F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid in geschützter Form noch auf der Säule des festen Trägers befindet. Die Beladung der Säule beträgt ca. 15 mg an 35mer-Oligonucleotid. Nach Abspaltung der 5′-DMT-Schutzgruppe (Trichloressigsäure/Dichlormethan wird nach den Standardmethoden mit S-Trityl- 6-mercaptohexyl-phosphoramidit gekoppelt.

Nach Oxidation mit Iod in Tetrahydrofuran wird die tritylgeschützte Verbindung vom Träger abgespalten, isoliert und gereinigt (siehe Beispiel 14d).

Die Abspaltung der S-Tritylschutzgruppe, die Isolierung des SH-gruppentragenden Oligonucleotids und die Reinigung geschieht wie unter Beispiel 14d) beschrieben (7,5 mg).

Zur Kopplung wird das SH-gruppentragende 30mer- Oligonucleotid (7 mg) in 550 µl 0,1 molarer Natriumcarbonatlösung unter Argonatmosphäre mit 180 mg Toluolsulfonsäureester 17a), gelöst in 500 µl Dimethylformamid, versetzt. Nach 30 min wird neutralisiert und mit Wasser auf ein Volumen von 5 ml verdünnt. Nach dem Zentrifugieren wird der klare Überstand lyophilisiert. Zur Abspaltung der S-Tritylgruppen wird wie unter 14d) beschrieben verfahren. Man erhält nach Reinigung 4,3 mg Konjugat.

c) Technetium-99m-Komplex des Konjugats 5′- [(Mercaptoacetyl-glycyl-glycin-amidyl)-13-tridec-7-thio- 1-yl]-phosphorsäureester des 35mer Oligonucleotids 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3′

1 mg des unter Beispiel 17b) beschriebenen Konjugates wird in 1 ml 0,1 molarem Dinatrium-hydrogenphosphatpuffer (pH = 9,5) gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatriumtartrat versetzt man mit Natriumpertechnetat-Lösung (1 mCi) und anschließend mit 10 µl Zinn-II-chlorid-Lösung (5 mg SnCl₂/l ml 0,01 molarer HCl). Die Markierungsausbeute (ca. 93%) wird durch HPLC bestimmt.

Beispiel 18 a) Konjugat aus 5′-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3′ und N- (Tetrahydro-2-oxo-thiophen-3-yl)-thiodiglycolsäure monoamid

Ein nach dem Selex-Verfahren identifiziertes 30mer-Oligo nucleotid wird mit der Modifikation einer vorgeschalteten Sequenz T*T*T*T*T-3′ mit Hilfe eines Syntheseautomaten der Firma Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Editor F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid in geschützter Form noch auf der Säule des festen Trägers befindet. Die Beladung der Säule beträgt ca. 15 mg an 35mer-Oligonucleotid. Nach Abspaltung der 5′-DMT-Schutzgruppe (Trichloressigsäure/Dichlormethan wird nach den Standardmethoden mit N- Trifluoracetylaminohexylphophoramidit gekoppelt.

Nach Oxidation mit Iod in Tetrahydrofuran wird das aminogruppentragende Oligonucleotid vom Träger abgespalten und wie unter 1b) beschrieben, isoliert und gereinigt (9,3 mg). Zur Kopplung mit dem N-(Tetrahydro-2-oxo-thiophen-3- yl)-thiodiglycolsäuremonoamid (DE 43 11 023) löst man 5 mg aminogruppentragendes Oligonucleotid in 1 ml 2 molarer Natriumcarbonatlösung. Nach Zugabe von 100 mg des Thiolactonderivates wird 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird neutralisiert und die Entsalzung durch Ultrafiltration durch eine Membran mit einer Ausschlußgrenze von 3000 (Amicon YM3) erreicht. Nach Lyophilisieren unterwirft man einer Gefriertrocknung. Man erhält 6,3 mg gewünschtes Konjugat.

b) Technetium-99m-Komplex des Konjugats 5′-(6-Amino-1- hexyl-phosphorsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3′ und N-(Tetra hydro-2-oxo-thiophen-3-yl)-thiodiglycolsäure-monoamid

1 mg des unter Beispiel 18a) beschriebenen SH- gruppentragenden Konjugates wird in 1 ml 0,1 molarem Dinatriumhydrogenphosphatpuffer (pH = 9,5) gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatriumtartrat versetzt man mit Natriumpertechnetat-Lösung (1 mCi) und anschließend mit 10 µl Zinn-II-chlorid-Lösung (5 mg SnCl₂/1 ml 0,01 molarer HCl). Die Markierungsausbeute (94%) wird durch HPLC bestimmt.

Beispiel 19 a) 5′-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 32mer-Oligo nucleotids 5′-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT-^3′-3′T-5′

Das nach dem Selex-Verfahren identifizierte 30mer-Oligo nucleotid 5′-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3′, mit der Modifikation einer vorgeschalteten Thymidinsequenz-T^3′-3′T- 5′, die über die Position 5′ an den Träger gebunden ist, wird in üblicherweise in einem Syntheseautomaten der Firma Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Editor F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid noch auf der Säule des festen Trägers befindet. Durch Reaktion mit Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan wird die 5′-Hydroxygruppe freigelegt. Die Beladung der Säule beträgt ca. 10 mg des 32mer Oligonucleotids. Zum Anknüpfen des Linkers wird die Säule mit einer Acetonitrillösung von 50 µmol β-Cyanoethyl-N,N- diisopropylamino-6-(trifluoracetamido)-1-hexyl phosphoramidit (hergestellt nach Nucl. Acids. Res. 16, 2659-2669 (1988)) in Gegenwart von Tetrazol umgesetzt. Die Oxidation des gebildeten Phosphits zum voll geschützten Phosphotriester erfolgt mit Iod in Tetrahydrofuran. Anschließend wird die Säule nacheinander mit Methanol und Wasser gewaschen. Zur Ablösung des modifizierten Oligonucleotids vom festen Träger, überführt man den Inhalt der Säule in ein Multivial, versetzt mit 5 ml 30%iger Ammoniaklösung, verschließt das Gefäß und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt dann auf 0°C, zentrifugiert, wäscht den Träger mit 5 ml Wasser und unterwirft die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung.

Zur Reinigung nimmt man das feste Material in 2 ml Wasser auf, versetzt mit 2 ml 0,5 M Ammoniumacetatlösung und versetzt mit 10 ml Ethanol, man läßt über Nacht bei -20°C stehen, zentrifugiert, wäscht den Rückstand mit 1 ml Ethanol (-20°C) und trocknet schließlich im Vakuum bei Raum temperatur. Man erhält 8 mg der Titelverbindung als farbloses Pulver.

b) Konjugat aus 5′-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 32mer-Oligonucleotids 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT-^3′-3′T-5′ und 10-[7-(4- Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)- 4-aza-heptyl]-1,4,7-tris-(carboxymethyl)-1,4,7,10- tetraazacyclododecan

8 mg des in Beispiel 19a) erhaltenen Oligonucleotids werden in 2,5 ml einer Mischung von 1 M NaHCO₃/Na₂CO₃ (pH = 9,0) gelöst und mit 1 mg 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2- hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris- (carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan (Titelverbindung aus Beispiel 1f) versetzt. Man rührt 5 Stunden bei Raumtemperatur, stellt den pH durch Zugabe von 0,01 M Salzsäure auf 7,2 ein und unterwirft die Lösung einer Ultrafiltration durch eine Membran mit der Ausschlußgrenze 3000 (Amicon YM3) und anschließend einer Gefriertrocknung. Man erhält 7 mg des gewünschten Konjugats.

c) ¹¹¹Indium-Komplex des Konjugats 5′-(6-Amino-1-hexyl phosphorsäureester) des 32mer-Oligonucleotids 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT-^3′-3′T-5′ und 10-[7-(4- Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)- 4-aza-heptyl]-1,4,7-tris-(carboxymethyl)-1,4,7,10- tetraazacyclododecan

15 µl einer ¹¹¹Indium(III)acetat-Lösung (350 µCi), (her gestellt aus ¹¹¹Indium(III)chlorid in 2 M Natriumacetat- Lösung und einstellen des pH-Wertes mit 0,1 M Salzsäure auf pH 4,0) werden in 135 µl einer Lösung aus 1 mg der Titelverbindung aus Beispiel 19b) in MES-Puffer, pH 6,2 gegeben (MES = 2-(N-Morpholino)ethylsulfonsäure). Der pH- Wert wird durch Zugabe von 0,01 M Salzsäure auf pH 4,2 gebracht. Man rührt 1 Stunde bei 37°C bei pH 4,2. Es wird mit 2 M Natriumacetat-Lösung auf pH 6 gebracht und 10 µl einer 0,1 M Na₂EDTA-Lösung (Na₂EDTA = Ethylendiamin tetraessigsäure-Dinatriumsalz) zugegeben, um überschüssiges ¹¹¹Indium zu komplexieren. Die Endreinigung des so erhaltenen markierten Konjugates (1h) erfolgt durch HPLC (Ausschlußchromatographie: TSK-400/MES-Puffer). Die das markierte Konjugat enthaltenen Fraktionen werden mit physiologischer Kochsalz-Lösung verdünnt, mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt und filtriert. Eine so hergestellte Lösung stellt dann ein geeignetes Präparat für die Radiodiagnostik dar.

Beispiel 20 a) 5′-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer Oligo nucleotids 5′- T***T***T***T***TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3′

Das nach dem SELEX-Verfahren identifizierte 30mer-Oligo nucleotid 5′-TAGGAGGAGGAGGGAGAGOGCAAAUGAGAUU-3′ (Seq. Nr. 13 aus dem US-Patent Nr. 5,270,163) wird in üblicher Weise in einem Syntheseautomaten der Firma Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid noch auf der Säule des festen Trägers befindet. Die vier abschließenden Thymidine werden nach der von G. Blaton et al in "Oligonucleotides and Analogues" S. 109-135 beschriebenen Technik durch Phosphodithioate an das am 5′-Ende befindliche Thymidin gebunden. Zu diesem Zweck wird zunächst die 5′-Hydroxygruppe durch Behandeln mit Trichloressigsäure freigelegt. Dann wird mit Trispyrrolidinophospin und Tetrazol die 3′-Hydroxygruppe eines 5′-DMTO-thyridins in das Diamidit überführt, das durch Zugabe von 2,4-Dichlorbenzylmercaptan in das Phosphorothioamidit umgewandelt wird. Diese Verbindung wird mit Tetrazol aktiviert und mit der 5′-Hydroxygruppe des Oligonucleotids zum Thiophosphatriester umgesetzt. Die Oxidation zum Phosphoradithioat erfolgt mit elementarem Schwefel in einer Lösung aus Schwefelkohlenstoff, Pyridin, Triethylamin 95 : 95 : 10. Die Benzylgruppen werden noch nicht abgelöst. In analoger Weise werden noch 3 weitere Thymidine angebunden. Die Beladung der Säule beträgt ca. 10 mg des 35mer Oligonucleotides. Dann wird erneut eine 5′- Hydroxygruppe freigelegt.

Zum Anknüpfen des Linkers wird die Säule mit einer Acetonitrillösung von 50 µmol 2-Cyanoethyl-N,N′-diisopropyl amino-6-(trifluoracetamido)-1-hexyl-phosphoramidit (Lit. in Beispiel in Gegenwart von Tetrazol umgesetzt. Die Oxidation des gebildeten Phosphits zum Phosphotriester erfolgt mit Iod in Tetrahydrofuran. Anschließend wird die Säule nacheinander mit Methanol und Wasser gewaschen. Dann werden die Schutzgruppen der Dithionatbindungen durch eine Lösung von Thiophenol/Trithylamin/Dioxan 1 : 2 : 2 entfernt, was in 2 Stunden erfolgt. Die Säule wird daraufhin jeweils mit 3 mal ihr Volumen mit Methanol, dann mit Ether gewaschen und getrocknet. Zur Ablösung des modifizierten Oligonucleotids vom festen Träger überführt man den Inhalt der Säule in ein Multivial, versetzt mit 5 ml 30%iger Ammoniaklösung, verschließt das Gefäß und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt dann auf 0°C, zentrifugiert, wäscht den Träger mit 5 ml Wasser und unterwirft die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung.

b) Konjugat aus 5′-(6-amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- T***T***T***T***TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3′ und 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7- (carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris- (carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan

8 mg des in Beispiel 20a) erhaltenen Oligonucleotids werden in 2,5 ml einer Mischung von 1 M NaHCO₃/Na₂CO₃ (pH 9,0) gelöst und mit 1 mg 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2- hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris- (carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan (Titelverbindung aus Beispiel 1f) versetzt. Man rührt 5 Stunden bei Raumtemperatur, stellt den pH durch Zugabe von 0,01 M Salzsäure auf 7,2 ein und unterwirft die Lösung einer Ultrafiltration durch eine Membran mit der Ausschlußgrenze 3000 (Amicon YM3) und anschließend einer Gefriertrocknung. Man erhält 7 mg des gewünschten Konjugats.

c) ¹¹¹Indium-Komplex des Konjugats 5′-(6-amino-1-hexyl phosphorsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- T***T***T***T***TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3′ und 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7- (carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris- (carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan

15 µl einer ¹¹¹Indium(III)acetat-Lösung (350 µCi), (herge stellt aus ¹¹¹Indium(III)chlorid in 2 M Natriumacetat- Lösung und einstellen des pH-Wertes mit 0,1 M Salzsäure auf pH 4,0) werden in 135 µl einer Lösung aus 1 mg der Titelverbindung aus Beispiel 20b) in MES-Puffer, pH 6,2 gegeben (MES= 2-(N-Morpholino)ethylsulfonsäure). Der pH- Wert wird durch Zugabe von 0,01 m Salzsäure auf pH 4,2 gebracht. Man rührt 1 Stunde bei 37°C bei pH 4,2. Es wird mit 2 M Natriumacetat-Lösung auf pH 6 gebracht und 10 µl einer 0,1 M Na2EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure- Dinatriumsalz) zugegeben, um überschüssiges ¹¹¹Indium zu komplexieren. Die Endreinigung des so erhaltenen markierten Konjugates (1h) erfolgt durch HPLC (Ausschlußchromatographie: TSK-400/MES-Puffer). Die das markierte Konjugat enthaltenen Fraktionen werden mit physiologischer Kochsalz-Lösung verdünnt, mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt und filtriert. Eine so hergestellte Lösung stellt dann ein geeignetes Präparat für die Radiodiagnostik dar.

Beispiel 21 a) 5′-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligo nucleotids 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT**T**T**T**T-3′

Das nach dem Selex-Verfahren identifizierte 30mer-Oligo nucleotid 5′-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3′, mit der Modifikation einer vorgeschalteten Sequenz T**T**T**T**T- 3′, wird erhalten, indem zunächst am Träger über 3′ eine Sequenz aus 5 über Cyanoethylphosphatgruppen verbundenen Thymidinen erzeugt wird. Durch Umsetzen dieser Verbindung mit einer 0,5 M Lösung von Tetraethylthiuramdisulfid in Acetonitril erfolgt innerhalb 15 Minuten die Sulfurierung zum Phosphonothioat, das dann mit freier 5′-Hydroxylgruppe Startmaterial für das 35mer Oligonucleotid ist. Die gesamte Synthese verläuft in üblicher Weise in einem Syntheseautomaten der Fa. Pharmacia (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Editor F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid noch auf der Säule des festen Trägers befindet. Durch Reaktion mit Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan wird die 5′- Hydroxygruppe freigelegt. Die Beladung der Säule beträgt ca. 10 mg des 35mer Oligonucleotids. Zum Anknüpfen des Linkers wird die Säule mit einer Acetonitrillösung von 50 µmol β-Cyanoethyl-N,N-diisopropylamino-6 (trifluoracetamido)-1-hexyl-phosphoramidit (hergestellt nach Nucl. Acids. Res. A, 2659-2669 (1988)) in Gegenwart von Tetrazol umgesetzt. Die Oxidation des derart gebildeten Phosphits zum voll geschützten Phosphotriester erfolgt mit Iod in Tetrahydrofuran. Anschließend wird die Säule nacheinander mit Methanol und Wasser gewaschen. Zur Ab lösung des modifizierten Oligonucleotids vom festen Träger und zur Abspaltung der Cyanoethylgruppen, überführt man den Inhalt der Säule in ein Multivial, versetzt mit 5 ml 30%iger Ammoniaklösung, verschließt das Gefäß und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt dann auf 0°C, zentrifugiert, wäscht den Träger mit 5 ml Wasser und unterwirft die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung.

b) Konjugat aus 5′-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT**T**T**T**T-3′ und 10- [7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7- (carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris- (carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan

c) ¹¹¹Indium-Komplex des Konjugats 5′-(6-Amino-1-hexyl phosphorsäureester) des 35mer Oligonucleotids 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT**T**T**T**T-3′ und 10- [7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7- (carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris- (carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan

15 µl einer ¹¹¹Indium(III)acetat-Lösung (350 µCi), (herge stellt aus ¹¹¹Indium(III)chlorid in 2 M Natriumacetat- Lösung und einstellen des pH-Wertes mit 0,1 M Salzsäure auf pH 4,0) werden in 135 µl einer Lösung aus 1 mg der Titelverbindung aus Beispiel 21b) in MES-Puffer, pH 6,2 gegeben (MES = 2-(N-Morpholino)ethylsulfonsäure). Der pH- Wert wird durch Zugabe von 0,01 m Salzsäure auf pH 4,2 gebracht. Man rührt 1 Stunde bei 37°C bei pH 4,2. Es wird mit 2 M Natriumacetat-Lösung auf pH 6 gebracht und 10 µl einer 0,1 M Na₂EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure- Dinatriumsalz) zugegeben, um überschüssiges ¹¹¹Indium zu komplexieren. Die Endreinigung des so erhaltenen markierten Konjugates (1h) erfolgt durch HPLC (Ausschluß chromatographie: TSK-400/MES-Puffer). Die das markierte Konjugat enthaltenen Fraktionen werden mit physiologischer Kochsalz-Lösung verdünnt, mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt und filtriert. Eine so hergestellte Lösung stellt dann ein geeignetes Präparat für die Radiodiagnostik dar.

Beispiel 22 a) N-(5-Mercapto-3-thia-1-oxo-pent-1-yl) glycinmethylester 12.56 g (0.1 mol) Glycinmethylesterhydrochlorid

13.42 g (0.1 mol) 2,5-Dithia-cyclohexanon und 10.12 g (0.1 mol) Triethylamin werden unter Argonatmosphäre in 500 ml absolutem Dichlormethan gelöst. Man rührt 24 Stunden bei Raumtemperatur und gießt den Ansatz anschließend auf 250 ml 5%ige, wäßrige Citronensäure. Es wird gut durchgerührt, die organische Phase abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum wird der ölige Rückstand an Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol, Methanol 0-10%) chromatographiert.
Ausbeute: 18.9 g (84.6%), farbloses Öl.

Elementaranalyse:
Ber.: C 37.65; H 5.87; N 6.27; O 21.49; S 28.71;
Gef.: C 37.43; H 6.02; N 6.12; S 28.48.

b) N-[5-(Triphenylmethylmercapto)-3-thia-1-oxo-pent-1- yl]-glycinmethylester

11.17 g (50 mmol) N-(5-Mercapto-3-thia-1-oxo-pent-1-yl) glycinmethylester (Beispiel 22a), 13.94 g (50 mmol) Triphenylmethylchlorid und 5.06 g (50 mmol) Triethylamin werden unter Argonatmosphäre in 500 ml absolutem Dichlormethan gelöst. Man rührt 16 Stunden bei Raumtemperatur und gießt den Ansatz anschließend auf 150 ml 5%ige, wäßrige Citronensäure. Es wird gut durchgerührt, die organische Phase abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum wird der ölige Rückstand an Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol, 95 : 5) chromatographiert.
Ausbeute: 15.7 g (67.4%), farbloses Öl.

Elementaranalyse:
Ber.: C 67.07; H 5.85; N 3.01; O 10.31; S 13.77;
Gef.: C 67.01; H 6.11; N 2.93; S 13.49.

c) N-[5-(Triphenylmethylmercapto)-3-thia-1-oxo-pent-1- yl]-glycin-N′-(6-hydroxyhexyl)-amid

11.64 g (25 mmol) N-[5-Triphenylmethylmercapto)-3-thia-1- oxo-pent-1-yl]-glycinmethylester (Beispiel 22b) und 29.3 g (250 mmol) 6-Aminohexanol werden unter Argonatmosphäre für 16 Stunden bei 100°C zusammengeschmolzen. Nach Erkalten des Reaktionsansatzes wird in 500 ml Dichlormethan aufgenommen und auf 250 ml 5%ige, wäßrige Citronensäure gegossen. Unter Eiskühlung und Rühren stellt man mit konzentrierter Salzsäure einen pH-Wert von 6.5 ein. Die organische Phase wird abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum wird der ölige Rückstand an Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol, 0-10% Methanol) chromatographiert.
Ausbeute: 7.7 g (56.0%), farbloses Öl.

Elementaranalyse:
Ber.: C 67.60; H 6.96; N 5.09; O 8.72; S 11.64;
Gef.: C 67.48; H 7.03; N 4.92; S 11.43.

d) N-Diisopropyl-O-cyanethyl-O′-[7,10-diaza-8,11-dioxo- 13-thia-15-(triphenylmethyl-mercapto)-pentadec-1-yl] phosphorigsäureamid

5.51 g (10 mmol) N-[5-(Triphenylmethylmercapto)-3-thia-1- oxo-pent-1-yl]-glycin-N′-(6-hydroxyhexyl)-amid (Beispiel 22c) werden in 50 ml absolutem Dichlormethan und 50 ml absolutem Pyridin gelöst. Man tropft bei Raumtemperatur 4.73 g (20 mmol) Diisopropylamino-O-cyanethyl phosphorigsäurechlorid, gelöst in 50 ml absolutem Dichlormethan, zum Ansatz. Nach 4 Stunden wird auf 250 ml gesättigte, wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung gegossen, durchgerührt und die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels chromotographiert man den öligen Rückstand an Kieselgel (Dichlormethan/Methanol/Triethylamin 98 : 1 : 1).
Ausbeute: 4.32 g (57.5%), farbloses, schaumiges Öl.

Elementaranalyse:
Ber.: C 63.97; H 7.38; N 7.46; O 8.52; P 4.12; S 8.54;
Gef.: C 63.81; H 7,41; N 7.22; P 3.97; S 8.31.

e) 5′-[N-(3′-Aza-8′-mercapto-1′,4′-dioxo-6′-thia-oct-1′- yl)-6-aminohexyl-phosphor-säureester] des 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*-3′

Ein nach dem Selexverfahren identifiziertes 30mer- Oligonucleotid 5′-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA 3′ mit der Modifikation einer vorgeschalteten Sequenz T*T*T*T*-3′ wird mit Hilfe eines Syntheseautomaten der Fa. Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1931), wobei sich das Oligonucleotid noch in geschützter Form auf der Säule des festen Trägers befindet. Die Beladung der Säule beträgt ca. 15 mg an 35mer-Oligonucleotid. Nach Abspaltung der 5′-DMT- Schutzgruppe wird nach den Standardmethoden mit dem unter Beispiel 22 d beschriebenen Phosphoramidit gekoppelt. Nach Oxidation mit Iod in Tetrahydrofuran, wird das Konjugat vom Träger abgespalten. Hierzu versetzt man das Material mit 10 ml 30%iger Ammoniaklösung und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt auf 0°C, zentrifugiert, wäscht den Träger mit 10 ml Wasser und unterwirft die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung. Zur Reinigung nimmt man das Material in 5 ml Wasser auf, setzt 4 ml 0.5 mol Ammoniumacetat zu und versetzt mit 20 ml Ethanol. Zur Vervollständigung der Fällung stellt man über Nacht kalt (-20°C), zentrifugiert, wäscht den Rückstand mit 1 ml Ethanol (-20°C) und trocknet im Vakuum. Man erhält 9.5 mg weißes Pulver. Zur Abspaltung der S-Tritylschutzgruppe wird das Material in 5 ml 50 molarer Triethylammoniumacetat- Lösung (pH = 7) aufgenommen und mit 500 µl 0.1 molarer Silbernitratlösung 30 min inkubiert. Anschließend setzt man 500 µl 0.14 molare Dithiothreitollösung hinzu und inkubiert weitere 30 min. Nach Zentrifugieren wird der klare Überstand an Sephadex G 10 entsalzt. Die das Produkt enthaltenen Fraktionen werden lyophilisiert. Man enthält 3.5 mg weißes Pulver.

f) Tc-99m-Komplex des 5′-[N-(3′-Aza-8′-mercapto-1′,4′- dioxo-6′-thia-oct-1′yl)-6-aminohexyl-phosphorsäureester] vom 5′-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAG CUACAUAT*T*T*T*-3′

1 mg des unter Beispiel 22 e beschriebenen Konjugates wird in 1 ml 0.1 molarem Dinatrium-hydrogenphosphatpuffer (pH = 8.5) gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatriumtartrat versetzt man mit Natriumpertechnetat-Lösung (1 mCi) und anschließend mit 10 µl Zinn-II-Chloridlösung (5 mg/1 ml 0.01 molarer HCl). Die Markierungsausbeute (ca. 95%) wird durch HPLC bestimmt.

Beispiel 23 a) 5′-[N-(6′-Aza-7′-hydroxycarboxy-9′-mercapto-1′,5′-dioxo- 3′thia-non-1′-yl)-6-aminohexylphosphorsäureester] des 5′-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T-3′

Zunächst wird eine Lösung des N-Hydroxysuccinimidesters des N-(2-oxo-tetrahydrothiophen-3-yl) thiodiglycolsäuremonoamids (DE 43 11 023) in 500 µl absolutem DMF hergestellt. Hierzu löst man 24.9 mg (0.1 mmol) N-(2-oxo-tetrahydrothyophen-3-yl) thiodiglycolsäuremonoamid und 11.5 mg (0.1 mmol) N- Hydroxysuccinimid in 500 µl absolutem DMF. Bei 0°C gibt man 19.2 mg (0.1 mmol) EDC zum Ansatz. Man rührt 30 min bei 0°C.

10 mg des unter Beispiel 1 hergestellten 5′-(6-Amino-hexyl phosphorsäureesters) des 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*-3′ werden in 1 ml 1 molarem Natriumhydrogencarbonat/Natriumcarbonat- Puffer (pH = 9) gelöst. Man setzt die vorab präparierte DMF-Lösung des NHS-Esters hinzu und inkubiert 16 Stunden bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre. Anschließen wird zentrifugiert, auf ein Volumen von 500 µl aufkonzentriert und an Sephadex G-25 chromatographiert. Nach Lyophilisieren erhält man 2 mg Konjugat als weißes Pulver.

b) Tc-99m-Komplex vom 5′-[N-(6′-Aza-7′-hydroxy-9′-mercapto- 1′,5′-dioxo-3′-thia-non-1′-yl)-6 aminohexylphosphorsäureester] des 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*-3′

1 mg des unter Beispiel 23a beschriebenen Konjugates wird in 1 ml 0.1 molarem Dinatriumhydrogenphosphatpuffer gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatriumtartrat versetzt man mit Natriumpertechnetat-Lösung (1 mCi) und anschließend mit 10 µl Zinn-II-chloridlösung (5 mg/1 ml 0.01 molarer HCl). Die Markierungsausbeute wird durch HPLC bestimmt (ca. 92%).

Beispiel 24 a) 5′-[N-(Mercaptoacetyl)-6-aminohexylphosphorsäureester] des 5′-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*-3′

10 mg des unter Bespiel 1 hergestellten 5′-(6-Aminohexyl phosphorsäureesters) des 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*-3′ werden in 1 ml 1 molarem Natriumhydrogencarbonat/Natriumcarbonat-Puffer (pH = 9) gelöst. Anschließend setzt man 23.1 mg (0.1 mmol) S- Acetylmercaptoessigsaure-NHS-Ester, gelöst in 500 µl absolutem DMF, zum Ansatz hinzu und inkubiert 17 Stunden bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre. Anschließend wird zentrifugiert, auf ein Volumen von 500 µl aufkonzentriert und an Sephadex G-25 chromatographiert. Nach Lyophilisieren erhält man 3 mg Konjugat als weißes Pulver.

b) Tc-99m-Komplex vom 5′-[N-(Mercaptoacetyl)-6- aminohexylphosphorsäureester] des 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*-3′

1 mg aus unter Beispiel 24a) beschriebenen Konjugates wird in 1 ml 0.1 molarem Dinatriumhydrogenphosphatpuffer (pH = 8.5) gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatriumtartrat versetzt man mit Natriumpertechnetat-Lösung (1 mCi) und anschließend mit 10 µl Zinn-II-chloridlösung (5 mg/ 1 ml 0.01 molarer HCl). Die Markierungsausbeute (ca. 97%) wird durch HPLC bestimmt.

Beispiel 25 a) N-[2-(Triphenylmethylmercapto)-eth-1-yl] thiodiglycolsäuremonoamid

31.9 g (0.1 mol) 2-(Triphenylmethylmercapto)-ethylamin und 10.1 g (0.1 mol) Triethylamin werden in 500 ml absolutem Dichlormethan vorgelegt. Bei 0°C tropft man eine Lösung von 13.2 g (0.1 mol) Thiodiglycolsäureanhydrid hinzu, rührt 1 Stunden bei 0°C und 16 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird auf 250 ml 5%ige, wäßrige Citronensäure gegossen, gut durchgerührt, die organische Phase abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum wird der Rückstand an Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol, 0-20% Methanol) chromatographiert.
Ausbeute: 20.32 g (45.0%), farbloses Öl.

Elementaranalyse:
Ber.: C 66.49; H 5.58; N 3.10; O 10.63; S 14.20;
Gef.: C 66.21; H 5.73; N 2.98; S 14.02.

b) 5′-[N-(1′,5′-Dioxo-6′-aza-3′-thia-8′-mercapto-oct-1-yl) aminohexylphosphorsäureester] des 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*-3′

Zunächst wird der NHS-Ester des N-[2-(Triphenylmethyl mercapto)-eth-1-yl)-thiodiglycolsäuremonoamids (Beispiel 25a) hergestellt. Hierzu löst man 45.2 mg (0.1 mmol) der vorhergenannten Säure in 500 µl absolutem DMF (0.1 mmol) der und versetzt mit 11.5 mg (0.1 mmol) NHS. Nach Abkühlen auf 0°C werden 19.2 mg (0.1 mmol) EDC zugesetzt und 30 min bei 0°C inkubiert.

Eine Lösung von 10 mg des unter Beispiel 1 beschriebenen 5- (6-Aminohexyl-phosphorsäureesters) des 5′-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*-3′ in 1 ml 1 molarem Natriumhydrogencarbonat/Natriumcarbonat-Puffer (pH = 9) wird mit 500 µl der vorab hergestellten NHS-Ester- Lösung versetzt. Man inkubiert 16 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird auf 500 µl eingeengt und an Sephadex G-25 chromatographiert. Man erhält 6 mg der S- Tritylgeschützten Verbindung. Die Abspaltung der S- Tritylschutzgruppe, die Isolierung des SH-Gruppen tragenden Oligonukleotids und die Reinigung geschieht wie unter Beispiel 22e beschrieben. Man erhält 4 mg weißes Lyophilisat.

c) Tc-99m-Komplex vom 5′-[N-(1′,5′-Dioxo-6′-aza-3′-thia-8′- mercapto-oct-1-yl)-aminohexylphosphorsäureester] des 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAG-CUACAUAT*T*T*T*-3′

1 mg des unter Beispiel 25b hergestellten Konjugates wird in 1 ml 0.1 molarem Di-natrium-hydrogenphosphatpuffer (pH = 8.5) gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatriumtartrat versetzt man mit Natriumpertechnetatlösung (1 mCi) und anschließend mit 10 µl Zinn-II-chloridlösung (5 mg/1 ml 0.01 molarem HCl). Die Markierungsausbeute wird durch HPLC bestimmt (91%)

Beispiel 26 a) N,N′-Bis-[2-(Triphenylmethylmercapto)-1-oxo-eth-1-yl]- 3,4-diaminobenzoesäure-methylester

3.32 g (20 mmol) 3,4-Diaminobenzoesäuremethylester und 13.38 g (40 mmol) S-Triphenylmethyl-mercaptoessigsäure werden in 200 ml absolutem Dichlormethan gelöst. Bei 0°C tropft man 8.25 g (40 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 100 ml absolutem Dichlormethan, zum Ansatz. Es wird 1 Stunden bei 0°C und abschließend 16 Stunden bei Raumtemperatur nachgerührt. Man filtriert, schüttelt gegen 1%ige, wäßrige Citronensäure, trocknet die organische Phase über Natriumsulfat und verdampft das Lösungsmittel im Vakuum. Der Rückstand wird an Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol, 0-10% Methanol) chromatographiert.
Ausbeute: 10.2 g (63.8%), farbloses Öl.

Elementaranalyse:
Ber.: C 75.16; H 5.30; N 3.51; O 8.01; S 8.02;
Gef.: C 75.01; H 5.58; N 3.30; S 7.89.

b) N,N′-Bis-[2-(Triphenylmethylmercato)-1-oxo-eth-1-yl]- 3.4-diaminobenzoesäure

7.99 g (10 mmol) N,N′-Bis-[2-Triphenylmethylmercapto)- 1-oxo-eth-1-yl]-3,4-diaminobenzoesäuremethylester (Beispiel 26a) werden in 200 ml Dioxan, 20 ml Wasser und 20 ml Methanol mit 4 g (100 mmol) Natriumhydroxid versetzt. Man rührt 5 Stunden bei Raumtemperatur und gießt den Ansatz auf 300 ml 5%ige, wäßrige Citronensäure. Es wird erschöpfend mit Dichlormethan extrahiert, die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittel wird der Rückstand an Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol, Methanol 0-40%) chromatographiert.
Ausbeute: 3.56 g (45.4%), farbloses Öl.

Elementaranalyse:
Ber.: C 74.97; H 5.14; N 3.57; O 8.15; S 8.17;
Gef.: C 74.71; H 5.32; N 3.31; S 7.88.

c) 5′-{N-[3′,4′-bis-(2′′-mercaptoacetylamino)-benzoyl]-6- aminohexylphophorsäureester} des 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*-3′

Zunächst wird der NHS-Ester der N,N′-Bis-[2- (Triphenylmethylmercapto)-1-oxo-eth-1-yl]-3,4- diaminobenzoesäure (Beispiel 26b) hergestellt. Hierzu löst man 78.5 mg (0.1 mmol) der Säure in 500 µl absolutem DMF und versetzt mit 11.5 mg (0.1 mmol) NHS. Nach Abkühlen auf 0°C werden 19.2 mg (0.1 mmol) EDC zugesetzt und 30 min bei 0°C inkubiert. Eine Lösung von 10 mg des unter Beispiel 1 beschriebenen 5′-(6-Aminohexyl-phosphorsäuresters) des 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*-3′ in 1 ml 1 molarem Natriumhydogencarbonat/Natriumcarbonat-Puffer (pH = 9) wird mit 500 µl der vorab hergestellten NHS-Ester- Lösung versetzt. Man inkubiert 17 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird auf 500 µl eingeengt und an Sephadex G-25 chromatographiert. Man erhält 7 mg der S-Tritylgeschützten Verbindung.

Die Abspaltung der S-Tritylschutzgruppe, die Isolierung des SH-Gruppen tragenden Oligonukleotids und die Reinigung geschieht wie unter Beispiel 22e beschrieben. Man erhält 3 mg weißes Lyophilisat.

d) Tc-99m-Komplex von 5′-{N-[3′,4′-bis-(2′′- mercaptacetylamino)-benzoyl]-6- aminohexylphosphorigsäureester} des 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAG-CUACAUAT*T*T*T*-3′

1 mg des unter Beispiel 26c) beschriebenen Konjugates wird in 1 ml 0.1 molarem Dinatrium-hydrogenphosphatpuffer (pH = 9.5) gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatriumtartrat versetzt man mit Natriumpertechnetatlösung (1 mCi) und anschließend mit 10 µl Zinn-II-chloridlösung (5 mg/1 ml 0.01 molarer HCl). Die Markierungsausbeute (ca. 91%) wurde durch HPLC bestimmt. Beispiel 27a) N-[O-Acetyl hydroxyacetyl]-glycyl-glycyl-glycin-tert-butylester 24.5 g (0.1 mol) Glycyl-glycyl-glycin-tert-butylester und 11,8 g (0.1 mol) O-Acetyl-glycolsäure werden bei 0°C in 500 ml absolutem Dimethylformamid zusammengegeben. Man tropft zum Ansatz eine Lösung von 20.6 g (0.1 mol) Dicyclohexylcarbodiimid in 500 ml absolutem Dimethylformamid, rührt 1 Stunden bei 0°C und abschließend über Nacht bei Raumtemperatur. Es wird filtriert und das Filtrat an der Ölpumpe eingedämpft. Man kristallisiert wiederholt aus Essigsäureethylester/n-Pentan.
Ausbeute: 12.5 g (36.2%), weißes Pulver.

Elementaranalyse:
Ber.: C 48.69; H 6.71; N 12.17; O 32.43;
Gef.: C 48.43; H 7.01; N 11.93.

Beispiel 27 a) N-[O-Acetyl-hydroxyacetyl]-glycyl-glycyl-glycin-tert- butylester

24.5 g (0.1 mol) Glycyl-glycyl-glycin-tert-butylester und 11,8 g (0.1 mol) O-Acetyl-glycolsäure werden bei 0°C in 500 ml absolutem Dimethylformamid zusammengegeben. Man tropft zum Ansatz eine Lösung von 20.6 g (0.1 mol) Dicyclohexylcarbodiimid in 500 ml absolutem Dimethylformamid, rührt 1 h bei 0°C und abschließend über Nacht bei Raumtemperatur. Es wird filtriert und das Filtrat an der Ölpumpe eingedämpft. Man kristallisiert wiederholt aus Essigsäureethylester/n-Pentan.
Ausbeute: 12.5 g (36.2%), weißes Pulver.

b) N-[O-Acetyl-hydroxyacetyl]-glycyl-glycyl-glycin

3.45 g (10 mmol) N-[O-Acetyl-hydroxyacetyl]-glycyl-glycyl glycin-tert.-butylester werden in 50 ml Trifluoressigsäure 15 min gerührt. Anschließend gießt man auf 500 ml absoluten Diethylester und filtriert das Produkt ab. Es wird wiederholt aus Essigsäureethylester/n-Pentan umkristallisiert.
Ausbeute: 1.23 g (42.5%), weißes Pulver.

Elementaranalyse:
Ber.: C 41.53; H 5.23; N 14.53; O 38.72;
Gef.: C 41.31; H 5.51; N 14.32.

c) 5-{N-[N′-(Hydroxyacetyl)-glycyl-glycyl-glycyl]-6- aminohexylphosphorsäureester} des 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*-3′

Zunächst wird NHS-Ester des N-(O-Acetylhydroxyacetyl) glycyl-glycyl-glycins (Beispiel 27 b) hergestellt. Hierzu löst man 28.9 mg (0.1 mmol) der Säure in 500 µl absolutem DMF und versetzt mit 11.5 mg (0.1 mmol) NHS. Nach Abkühlen auf 0°C werden 19.2 mg (0.1 mmol) EDC zugesetzt und 30 min bei 0°C inkubiert. Eine Lösung von 10 mg des unter Beispiel 1 beschriebenen (6-Aminohexylphosphorsäureesters) des 5′- CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*-3′ in 1 ml 1 molarer Natriumcarbonatlösung wird mit 500 µl der vorab hergestellten NHS-Ester-Lösung versetzt. Man inkubiert 18 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird auf 500 µl eingeengt und an Sephadex G-25 chromatographiert. Man erhält nach Lyophilisieren 3 mg der Titelverbindung.

d) Tc-99m-Komplex vom 5′-{N-[N′-(hydroxyacetyl)-glycyl glycyl-glycyl]-6-aminohexylphosphorsäureesters} des 5′-CUCAUGGAGCGCAAGA-CGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*-3′

1 mg des unter Beispiel 27c beschriebenen Konjugates wird in 1 ml 0.1 molarem Dinatriumhydrogenphosphatpuffer (pH = 10.5) gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatriumtartrat versetzt man mit Natriumpertechnetat Lösung (1 mCi) und anschließend mit 10 µl Zinn-II-chloridlösung (5 mg/1 ml 0.01 molarer HCl). Die Markierungsausbeute wird mittels HPLC bestimmt (95%).

Claims

1. Oligonucleotid-Konjugate bestehend aus einem Oligonucleotid-Rest N und n Substituenten (B-K), worin B für eine direkte Bindung oder eine Verbindungskomponente zum Oligonucleotid-Rest steht und K ein Komplexbildner oder Komplex von radioaktiven Metallisotopen, oder stabilen Isotopen, die

- durch Strahlung von außen in radioaktive Isotope umgewandelt werden,
- Strahlung von außen in Strahlung anderer Qualität, anderen Energiegehalts und/oder anderer Wellenlänge umwandeln,

der Elemente der Ordnungszahlen 5, 21-29, 31, 39, 42-44 49, 57-83 oder 85 bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß der Oligonucleotid-Rest N eine Modifikation aufweist, die den Abbau durch natürlich vorkommende Nucleasen verhindert oder wenigstens wesentlich hemmt.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung die allgemeine Formel N-(B-K)_n (I)aufweist, worin
N ein Oligonucleotid ist, das spezifisch mit hoher Bindungsaffinität an andere Zielstrukturen bindet und Modifikationen aufweist, die den Abbau durch natürlich vorkommende Nucleasen wesentlich vermindern,
B eine chemische Bindung oder eine Verbindungskomponente ist, die die Verbindung zwischen N und K herstellt und
K ein komplexbildender Ligand ist, der ein signalgebendes oder therapeutisch wirksames Element aufweisen kann und n eine Zahl zwischen 1 und 10 ist.

3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin N ein Oligonucleotid mit 5 bis 200 Nucleotiden ist, dadurch gekennzeichnet, daß

a) die 2′-Position der Zuckereinheit unabhängig voneinander mit folgenden Gruppen besetzt ist:
einer Gruppe OR, worin R ein Alkylrest mit 1-20 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls bis zu 2 Hydroxylgruppen enthält und der gegebenenfalls durch 1-5 Sauerstoffatome unterbrochen ist, bedeutet,
einem Wasserstoffatom,
einer Hydroxylgruppe
einem Fluoratom,
einem Aminrest,
einer Aminogruppe,
und in den terminalen Positionen 3′ und 5′ vorhandene Hydroxylgruppen unabhängig voneinander gegebenenfalls mit dem Rest R verethert sind und/oder
b) gegebenenfalls die als Internucleotidbindung dienenden Phosphodiester unabhängig voneinander durch Phosphothioate, Phosphodithioate oder Alkylphosphonate, bevorzugt Methylphosphonat ersetzt sind, und/oder
c) die terminalen Reste in den Positionen 3′ und 5′ durch eine wie in b) beschriebene Internucleotidbindung intramolekularer miteinander verknüpft sind und/oder
d) es eine wie in b) beschriebene Internucleotidbindung enthält, die die Positionen 3′-3′ oder 5′-5′ verknüpft und/oder
e) es eine wie in b) beschriebene Phosphodiesterbindung enthält, die zwei Thymidine über jeweils einen in der 3-Stellung befindlichen C₂-C₂₀-Hydroxyalkylrest esterartig verbindet oder einen analog substituierten Thymidinrest esterartig mit einer Hydroxylgruppe eines anderen Zuckers in den Positionen 2′ oder 3′ oder 5′ verbindet und/oder
f) die terminalen Reste in den Positionen 3′ und 5′ gege benenfalls wie in b) beschriebene modifizierte Internucleotidbindungen enthalten.

4. Verbindung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonucleotid N 15 bis 100 Nucleotide umfaßt.

5. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß N ein Oligonucleotid ist, das spezifisch mit hoher Bindungsaffinität an andere Zielstrukturen bindet und das dadurch erhältlich ist, daß eine Zufallssequenzen enthaltende Mischung von Oligo nucleotiden mit der Zielstruktur zusammengebracht wird, wobei bestimmte Oligonucleotide eine erhöhte Affinität zu der Zielstruktur im Verhältnis zu der Mischung der Oligonucleotide aufweisen, diese von dem Rest der Oligo nucleotidmischung abgetrennt werden, dann die Oligo nucleotide mit erhöhter Affinität zu der Zielstruktur amplifiziert werden, um eine Mischung von Oligonucleotiden zu erhalten, die einen erhöhten Anteil an Oligonucleotiden aufweist, die an die Zielstrukturen binden.

6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß N ein Oligonucleotid ist, das spezifisch mit hoher Bindungsaffinität an andere Zielstrukturen bindet und das dadurch erhältlich ist, daß

a) zunächst ein DNA-Strang durch chemische Synthese derart hergestellt wird, daß dieser DNA-Strang am 3′-Ende eine definierte Sequenz aufweist, die komplementär zu einen Promoter für eine RNA-Polymerase ist und zugleich komplementär zu einen Primer der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist und, daß dieser DNA-Strang am 5′-Ende eine definierte Sequenz aufweist, die komplementär zu einer Primersequenz für die Polymerase-Kettenreaktion ist, wobei die Sequenz zwischen den definierten Sequenzen eine Zufallssequenz enthält und, daß
b) dieser DNA-Strang mit Hilfe einer RNA-Polymerase in einen komplementären RNA-Strang umgeschrieben wird, wobei der Polymerase Nucleotide angeboten werden, die an der 2′- Position der Riboseeinheit modifiziert sind und, daß
c) die auf diese Weise hergestellten RNA-Oligonucleotide mit der Zielstruktur, an die das Oligonucleotid spezifisch binden soll, zusammengebracht werden und, daß
d) diejenigen Oligonucleotide, die an die Zielstruktur gebunden haben, zuerst zusammen mit der Zielstruktur von den nicht bindenden Oligonucleotiden abgetrennt werden und dann die gebundenen Oligonucleotide von der Zielstruktur wieder abgetrennt werden und, daß
e) diese Zielstruktur-spezifischen RNA-Oligonucleotide mit Hilfe der Reversen Transkriptase in einen komplementären DNA-Strang umgeschrieben werden und, daß
f) diese DNA-Stränge unter Verwendung der definierten Primersequenzen mit der Polymerase Kettenreaktion amplifiziert werden und, daß
g) die auf diese Art und Weise amplifizierten DNA- Oligonucleotide dann wieder Hilfe der RNA-Polymerase und mit modifizierten Nucleotiden in RNA-Oligonuclectide umgeschrieben werden und, daß
h) die oben genannten Selektionsschritte c) bis g) gegebenenfalls so oft wiederholt werden, bis die Oligonucleotide, die durch eine hohe Bindungsaffinität zu der Zielstruktur charakterisiert sind, hinreichend selektioniert sind und anschließend die Sequenzen der so erhaltenen Oligonucleotide gegebenenfalls bestimmt werden können.

7. Verbindung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielstruktur ausgewählt ist unter Makromolekülen, Gewebestrukturen von höheren Organismen wie Tieren oder Menschen, Organen oder Teilen von Organen eines Tieres oder des Menschen, Zellen, Tumorzellen oder Tumoren.

8. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungskomponente B

a) an das 4′-Ende des in der 4′-Position um die CH₂-OH- Gruppe verminderten Oligonucleotid- Restes N und/oder
b) an das 3′-Ende des in der 3′-Position um ein Wasserstoffatom verminderten Oligonucleotid-Rests N und/oder
c) an die um die OH-Gruppe(n) verminderte(n) Phosphodiesterbrücke (n) zwischen jeweils zwei Nucleotiden und/oder
d) an 1 bis 10 Nucleobase(n), die jeweils in der/den Position(en) 5, 8 und/oder der Aninogruppe(n) der Position(en) 2, 4 und 6 um ein Wasserstoffatom vermindert ist (sind),

gebunden ist (sind).

9. Verbindung nach Anspruch 8a) oder 8b), dadurch gekennzeichnet, daß B die allgemeine Formel X-Y-Z¹ hat, die X-seitig mit dem Komplexbildner oder Komplex und Z-seitig mit dem Oligonucleotid verbunden ist, worin
X für eine direkte Bindung, eine -NH- oder -S-Gruppe steht,
Y für eine gerad-, verzweigtkettige, gesättigte oder ungesättigte C₁-C₂₀-Alkylenkette steht, die gegebe nenfalls 1-2 Cyclohexylen-, 1-5 Imino-, 1-3 Phenylen-, 1-3 Phenylenimino-, 1-3 Phenylenoxy-, 1-3 Hydroxyphe nylen-, 1-5 Amido-, 1-2 Hydrazido-, 1-5 Carbonyl-, 1-5 Ethylenoxy-, eine Ureido-, eine Thioureido-, 1-2 Carboyalkylimino-, 1-2 Estergruppen, 1-3 Gruppen Ar, worin Ar für einen gesättigten oder ungesättigten 5- oder 6-Ring steht, der gegebenenfalls 1-2 Heteroatome ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel und/oder 1-2 Carbonylgruppen enthält, 1-10 Sauerstoff-, 1-5 Stickstoff- und/oder 1-5 Schwefelatome enthält und/oder gegebenenfalls durch 1-5 Hydroxy-, 1-2 Mercapto-, 1-5 Oxo-, 1-5 Thioxo-, 1-3 Carboxy-, 1-5 Carboxy-C₁-C₄-alkyl-, 1-5 Ester-, 1-3 Amino-, 1-3 Hydroxy-C₁-C₄-alkyl-, 1-3 C₁-C₇-Alkoxygruppen substituiert ist und
Z¹ für -CONH-CH₂-4′, -NH-CO-4′, -O-P(O)R¹-NH-CH₂-4′, -O-P (O) R¹-O-CH₂-4′, -O-P (S) R¹-O-3′ oder -O-P (O)R¹-O-3′ steht, worin 4′ bzw. 3′ die Verknüpfung an die endständige(n) Zuckereinheit(en) angibt und R¹ für O⁻, S⁻, eine C₁-C₄-Alkyl- oder NR²R³-Gruppe steht, mit R² und R³ in der Bedeutung von Wasserstoff und C₁-C₄- Alkylresten.

10. Verbindung nach Anspruch 8c), dadurch gekennzeichnet, daß B die allgemeine Formel X-Y-Z² hat, die X-seitig mit dem Komplexbildner oder Komplex und Z-seitig mit dem Oligonucleotid verbunden ist, wobei
Z² in der zwei benachbarte Zuckereinheiten verknüpfenden Brücke für die Gruppe -NR²-, -O- oder -S- steht und X, Y und R² die in Anspruch 9 angegebene Bedeutung haben.

11. Verbindung nach Anspruch 8d), dadurch gekennzeichnet, daß B die allgemeine Formel X-Y-Z³ hat, wobei Z³ für eine -NH-Gruppe oder eine direkte Bindung zur Nucleobase steht und X und Y die in Anspruch 9 angegebene Bedeutung haben.

12. Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß der Metallkomplex als bildgebendes Element ein radioaktives Isotop, ausgewählt aus den Elementen Kupfer, Wismut, Technetium, Rhenium oder Indium enthält.

13. Verfahren zum Nachweis einer Zielstruktur dadurch gekennzeichnet, daß man eine oder mehrere der Verbindungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit der zu untersuchenden Probe in vivo oder in vitro zusammenbringt und anhand des Signales nachweist, ob die Zielstruktur, an die das Oligonucleotid N spezifisch und mit hoher Bindungsaffinität bindet, in der Probe vorhanden ist.

14. Verfahren zur nicht-invasiven Diagnostik von Krankheiten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine oder mehrere der Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 12 mit der zu untersuchenden Zielstruktur in vivo zusammenbringt und anhand des Signales nachweist, ob die Zielstruktur, an die das Oligonucleotid N spezifisch bindet, in dem zu untersuchenden Organismus vorhanden ist.

15. Verwendung einer Verbindung nach einen, der Ansprüche 1 bis 12 in der Radiodiagnostik und/oder in der Radiotherapie.

16. Diagnosekit zum Nachweis von Zielstrukturen in vivo und/oder in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß das Diagnosekit wenigstens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 aufweist.