DE4424923A1

DE4424923A1 - Konjugate aus Metallkomplexen und Oligonucleotiden, die spezifisch an bestimmte Zielstrukturen binden für MRI

Info

Publication number: DE4424923A1
Application number: DE4424923A
Authority: DE
Inventors: Johannes Dr Platzek; Ulrich Dr Niedballa; Bernd Dr Raduechel; Andreas Dr Muehler; Ulrich Prof Dr Speck
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1994-07-14
Filing date: 1994-07-14
Publication date: 1996-01-18
Also published as: ZA955894B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand, das heißt Oligonucleotid-Kon jugate, die einen Komplexbildner oder einen Komplex aufweisen. Diese Konjugate finden im Bereich der NMR-Diagnostik Verwendung.

Die bildgebende Diagnostik hat in den vergangenen Jahrzehnten große Fortschritte erzielt und entwickelt sich laufend weiter. Es ist heute möglich, das Blutgefäßsystem, die meisten Organe und viele Gewebe im lebenden Körper ohne größere Eingriffe sichtbar zu machen. Erkrankungen werden vielfach diagnostiziert, weil sie zu deutlichen Veränderungen der Form, Größe und Lage anatomischer Strukturen im Körper führen. Derartige anatomische Informationen aus dem Inneren des Körpers sind mittels der Röntgentechnik, der Ultraschalldiagnostik und der magnetischen Resonanztomographie zu erhalten. Jede der genannten Techniken kann durch den Einsatz pharmazeutischer Mittel zur Verstärkung der natürlichen Kontraste der Gewebe und Körperflüssigkeiten im resultierenden Bild in der Leistungsfähigkeit verbessert werden. Die betreffenden pharmazeutischen Mittel werden in Körperhöhlen eingebracht oder in Blutgefäße injiziert, mit dem Ziel, die Höhlen oder Gefäße im Kontrast zu verändern. Sie werden zusätzlich durch den Blutstrom im Organismus verteilt und können Organe und Gewebe in der Sichtbarkeit verändern. In Ausnahmefällen werden solche Substanzen an bestimmte Strukturen im Körper gebunden und/oder von diesen aktiv transportiert und/oder ausgeschieden. Auf diese Weise können im Einzelfall auch Funktionen sichtbar gemacht wer den und zur Diagnose von Erkrankungen genutzt werden.

Ein generelles Problem ist die Diagnose und Lokalisierung von krankhaften Veränderungen zu einem Zeitpunkt, zu dem keine deutlichen Veränderungen der Form, Struktur und Durchblutung der betreffenden Organe und Gewebe vorliegen. Eine solche Diagnose und Verlaufskontrolle ist z. B. bei Tumorerkrankungen einschließlich der Suche nach Metastasen, der Beurteilung einer Minderversorgung von Geweben mit Sauerstoff und bei bestimmten Infektionen sowie Stoffwechselerkrankungen von entscheidender Bedeutung.

Die heute verfügbaren bildgebenden diagnostischen Methoden sind wesentlich auf die Verfügbarkeit von pharmazeutischen Präparaten angewiesen, die sich an Orten anderweitig nicht erkennbarer pathologischer Veränderungen anreichern.

Die derzeit im Handel befindlichen Kontrastmittel sind ganz überwiegend sogenannte unspezifische Präparate. Sie verteilen sich passiv in denjenigen Räumen, in die sie z. B. durch Injektion eingebracht werden.

In der Vergangenheit sind eine Vielzahl von Substanzen und Substanzklassen identifiziert worden, die eine Spezifität im Hinblick auf ihre Verteilung im lebenden Organismus er kennen oder erwarten lassen. Beispiele dafür sind außer den Antikörpern Lectine, alle Arten rezeptorgebundener Substanzen, Zellen, Membranen und Membranbestandteile, Nucleinsäuren, natürliche Metabolite und deren Derivate, sowie zahllose Arzneistoffe. Mit besonderer Sorgfalt wurden und werden auch Peptide untersucht.

Die EP-A-0 285 057 beschreibt Nucleotid-Komplexbildner-Kon jugate, die u. a. wegen der in vivo Instabilität der verwendeten Nucleotide für die Anwendung als in vivo-Diagnostika nicht geeignet sind und auch kaum die sonstigen Anforderungen an Verträglichkeit und Pharmakokinetik erfüllen.

Eine Vielzahl von US-Patenten, wie beispielsweise das US-Patent Nr. 4 707 440, befaßt sich mit modifizierten Polymeren, die eine detektierbare chemische Gruppe enthalten. Die Polymere können Polynucleotide und Oligonucleotide sein, diese sind aber weder gegen einen Abbau durch natürlich vorkommende Nucleasen stabilisiert, noch durch ein spezielles Verfahren so ausgewählt, daß sie spezifisch mit hoher Bindungsaffinität an Zielstrukturen binden. Besondere Ausführungsformen dieser detektierbaren Moleküle werden in den US-Patenten Nr. 4 843 122 und 4 943 523 genannt. Ein auf diese Weise modifiziertes, einzelnes Nucleotid wird in US-Patent Nr. 4 952 685 beansprucht. Die Verwendung dieser Mittel in bildgebenden Verfahren wird in US-Patent Nr. 4 849 208 offenbart.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung spezifisch bindender diagnostischer Mittel für den Nachweis von Zielstrukturen, wodurch beispielsweise die Darstellung von Organen, Geweben und deren pathologischen Veränderungen in vitro und in vivo ermöglicht wird.

Es wurde nun gefunden, daß Oligonucleotid-Konjugate, die neben einem Oligonucleotid-Rest einen über eine direkte Bindung oder eine Verbindungskomponente gebundenen Komplexbildner aufweisen und deren Oligonucleotid-Rest so modifiziert ist, daß der Abbau durch natürlich vorkommende Nucleasen verhindert oder wenigstens wesentlich gehemmt wird, diese Aufgabe lösen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Oligonucleotid-Kon jugate bestehend aus einem Oligonucleotid-Rest N und n Substituenten (B-K), worin B für eine direkte Bindung oder eine Verbindungskomponente zum Oligonucleotid-Rest steht und K ein Komplexbildner oder Komplex von Elementen der Ordnungszahlen 21-29, 42, 44 oder 58-70 bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß der Oligonucleotid-Rest N eine Modifikation aufweist, die den Abbau durch natürlich vorkommende Nucleasen verhindert oder wenigstens wesentlich hemmt.

In bevorzugter Form weisen die Oligonucleotid-Konjugate der vorliegenden Erfindung die allgemeine Formel

N-(B-K)_n (I)

auf, worin n für die Ziffern 1 bis 30 steht.

Die Anzahl der mit dem Oligonucleotid-Rest verknüpften bildgebenden Substituenten B-K ist zum einen durch die Größe des Oligonucleotids begrenzt, liegt aber nie höher als 30. Erfindungsgemäß bevorzugt sind 1 bis 20 Substituenten B-K.

Die Größe des Oligonucleotid-Restes N ist im Prinzip nicht begrenzt. Für die vorliegende Erfindung praktikabel sind Oligonucleotide mit 5 bis 200 Nucleotiden, besonders bevorzugt werden Oligonucleotide mit 15 bis 100 Nucleotiden.

Erfindungsgemäß einsetzbare Oligonucleotide sind gegen den Abbau durch in vivo vorkommende Nucleasen stabilisiert.

Unmodifizierte Oligo- oder Polynucleotide werden in vivo durch Endo- und Exonucleasen gespalten. Die Abbaureaktion in der RNA-Reihe beginnt mit einer Aktivierung der 2′-Hydroxygruppe. Weitere abbauende Enzyme sind z. B. Ribozyme, die die Phosphodiesterbindung von RNS spalten (s. Science 261, 709 (1993)). Die in vivo-Stabilität von RNS-Derivaten läßt sich durch teilweisen oder völligen Austausch der 2′-Hydroxylgruppe gegen andere Substituenten steigern. Solche Substituenten sind z. B. Alkoxygruppen, insbesondere die Methoxygruppe (s. z. B. Chem. Pharm. Bull. 13, 1273 (1965), Biochemistry 10, 2581, (1971)), ein Wasserstoffatom, ein Fluoratom,(siehe z. B. Can. J. Chem. 46, 1131 (1968)) oder eine Aminogruppe (siehe z. B. J. Org. Chem. 42, 714 (1977)). Weitere Möglichkeiten zur Stabilisierung der Internucleotidbindung sind der Ersatz eines oder zweier Sauerstoffatome in der Phosphodiesterbrücke unter Bildung von Phosphorthioaten (Trends Biochem. Sci. 14, 97 (1989)) oder Phosphordithioaten (J. Chem. Soc., Chem. Commun. 591 (1983) und Nucleic Acids Res. 12, 9095 (1984)) und die Verwendung von Alkylphosphonaten an Stelle von Phosphodiestern (Ann. Rep. N. Y. Acad. Sci. 507, 220 (1988)).

Die Stabilisierung kann dadurch erreicht werden, daß die Hydroxylgruppen in 2′-Position der Riboseeinheiten modifiziert werden. Eine solche Modifikation kann mittels eines Ersatzes dieser Hydroxylgruppe durch eine OR-Gruppe, ein Halogenatom, insbesondere ein Fluoratom, ein Wasserstoffatom oder einen Aminrest, insbesondere durch ein primäres Amin, erzielt werden. Der Rest R der Alkoxy-Gruppe steht dabei für einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 20 C-Atomen wie Methyl, Ethyl, Propyl, iso-Propyl, Butyl, tert.-Butyl, Pentyl oder Hexyl oder einen cyclischen unsubstituierten oder substituierten Alkylrest mit 4 bis 20 C-Atomen wie Cyclopentyl oder Cyclohexyl.

Zusätzlich oder alternativ können bei der der Inter nucleotidbindung dienenden Phosphodiesterbrücke 1 oder 2 Sauerstoffatome durch 1 oder 2 Schwefelatome ersetzt wer den, wodurch Phosphorthioate oder Phosphordithioate gebildet werden. Eine weitere alternative oder zusätzliche Möglichkeit der Modifikation der Oligonucleotide besteht darin, die der Internucleotidbindung dienende Phosphodi esterbrücke durch Alkylphosphonate zu ersetzen. Als Alkyle kommen hierbei insbesondere niedere Alkylgruppen mit 1 bis 10 C-Atomen wie Methyl, Ethyl, Propyl, iso-Propyl, Butyl, tert.-Butyl, Pentyl oder Hexyl oder cyclische unsubstituierte oder substituierte Alkylrest mit 4 bis 14 C-Atomen wie Cyclopentyl oder Cyclohexyl in Betracht.

Erfindungsgemäß sind die verwendeten Oligonucleotid-Reste N nicht auf bestimmte Oligonucleotid-Sequenzen beschränkt.

Bevorzugt werden aber solche Oligonucleotide, die spezi fisch mit hoher Bindungsaffinität an Zielstrukturen mit Ausnahme von Nucleinsäure binden.

Ein Verfahren zur Identifizierung geeigneter Oligonucleotide, die als Ausgangssubstanzen für die erfindungsgemäßen Konjugate benötigt werden, wird im U.S.-Patent 5,270,163 beschrieben.

Die bei den erfindungsgemäßen Konjugaten eingesetzten Oligonucleotide werden in einer bevorzugten Ausführungsform nach dem im folgenden beschriebenen Verfahren erhalten.

So sind geeignete Oligonucleotide dadurch erhältlich, daß eine Zufallssequenzen enthaltende Mischung von Oligonucleotiden mit der Zielstruktur zusammengebracht wird, wobei bestimmte Oligonucleotide eine erhöhte Affinität zu der Zielstruktur im Verhältnis zu der Mischung der Oligonucleotide aufweisen, diese von dem Rest der Oligonucleotidmischung abgetrennt werden, dann die Oligonucleotide mit erhöhter Affinität zu der Zielstruktur amplifiziert werden, um eine Mischung von Oligonucleotiden zu erhalten, die einen erhöhten Anteil an Oligonucleotiden aufweist, die an die Zielstrukturen binden.

Bei dem Verfahren wird zunächst ein DNA-Strang in bevorzugter Weise durch chemische Synthese hergestellt. Dieser DNA-Strang besitzt am 3′-Ende eine bekannte Sequenz, die als Promotor für eine RNA-Polymerase dient und zugleich komplementär zu einer Primer-Sequenz für die Polymerase-Ket tenreaktion (PCR) ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich hierbei um den Promotor für die T7 RNA-Polymerase. Anschließend an diesen Promotor wird eine Zufallssequenz an den Promotor synthetisiert. Die Zufallssequenz kann dadurch erhalten werden, daß die in Frage kommenden vier Basen im gleichen Verhältnis in die Synthesemaschine eingegeben werden. Es entstehen dadurch völlig zufällige DNA-Sequenzen. Die Länge der Zufallssequenz beträgt in bevorzugter Ausführungsform etwa 15 bis 100 Nucleotide. An dieses DNA-Stück mit der Zufallssequenz wird eine weitere DNA-Sequenz ansynthetisiert, die komplementär ist zu einer Primer-Sequenz, die für die Polymerase Kettenreaktion (PCR) verwendet werden kann.

Nach Synthese dieses DNA-Stranges wird dieser mit Hilfe einer RNA-Polymerase in einen komplementären RNA-Strang umgeschrieben. In bevorzugter Ausführungsform wird hierbei die T7 RNA-Polymerase verwendet. Bei der Transkription werden der RNA-Polymerase solche Nucleotide angeboten, die modifiziert sind. In besonders bevorzugter Ausführungsform ist die Ribose an der 2′-Position modifiziert. Hierbei kann es sich um eine Substitution des Wasserstoffatoms bzw. der Hydroxylgruppe durch eine Alkoxygruppe, bevorzugt Methoxy, Amino oder Fluor handeln. Die auf diese Art und Weise hergestellten RNA-Oligonucleotide werden dann in den Selektionsprozeß eingeführt.

Bei dem Selektionsprozeß werden die RNA-Oligonucleotide mit der Zielstruktur zusammengebracht. Unter Zielstruktur wird eine Struktur verstanden, an die das Oligonucleotid spezifisch und mit hoher Affinität binden soll.

Derartige Strukturen sind z. B. Makromoleküle, Gewebestrukturen von höheren Organismen wie Tieren oder Menschen, Organen oder Teilen von Organen, Zellen insbesondere Tumorzellen oder Tumore.

Die Zielstruktur muß dazu nicht unbedingt in reiner Form vorliegen, sie kann sich auch auf einem natürlich vorkommenden Organ oder an einer Zelloberfläche befinden.

Wenn es sich hierbei um ein isoliertes Protein handelt, kann dieses auf einer Festphase, beispielsweise einem Filter gebunden sein. Bei der Selektion wird ein Überschuß der Zielstruktur gegenüber der RNA-Mischung eingesetzt. Bei der Inkubation binden die spezifischen Oligonucleotidmoleküle an die Zielstrukturen, wohingegen die nicht gebundenen Oligonucleotide von der Mischung abgetrennt werden, beispielsweise durch Waschen.

Anschließend werden die Oligonucleotidmoleküle von den Zielmolekülen abgetrennt bzw. durch Waschen mit geeigneten Puffern oder Lösungsmitteln entfernt.

Mit Hilfe der Reversen Transkriptase wird dann das aufgefundene RNA-Oligonucleotid umgeschrieben in den komplementären DNA-Strang.

Da der zu erhaltende DNA-Strang an beiden Enden Primersequenzen (bzw. Promotorsequenzen) aufweist, kann eine Amplifizierung der gefundenen DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion einfach durchgeführt werden.

Die auf diese Art amplifizierten DNA-Oligonucleotide werden dann mit Hilfe der RNA-Polymerase wieder in RNA-Oligonucleotide umgeschrieben und die so erhaltenen RNA-Oligonucleotide können in einem weiteren Selektionsschritt (wie oben beschrieben) eingesetzt werden.

Nach Trennen der im zweiten Selektionsschritt erhaltenen bindenden RNA-Oligonucleotide von den Zielmolekülen werden diese wieder in DNA mit Hilfe der Reversen Transkriptase umgeschrieben, die so erhaltenen komplementären DNA-Oligonucleotide werden mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion amplifiziert und anschließend mit Hilfe der RNA-Polymerase wieder zu RNA-Oligonucleotiden transkribiert, die für einen weiteren Selektionsschritt zur Verfügung stehen.

Es hat sich herausgestellt, daß die gewünschten hohen Spezifitäten und hohen Bindungsaffinitäten dann erhalten werden können, wenn die Selektionsschritte mehrmals wiederholt werden. Selten wird die gewünschte Oligonucleotidsequenz bereits nach einem oder zwei Selektionsschritten erhalten werden. Sobald die gewünschte Spezifität und Bindungsaffinität zwischen Zielstruktur und Oligonucleotid erhalten ist, kann das oder die Oligonucleotid(e) sequenziert werden und dadurch kann die Sequenz der spezifisch bindenden Oligonucleotide ermittelt werden.

Besonders vorteilhaft bei dem vorliegenden Verfahren ist, daß dieses Verfahren nicht nur mit geeigneten Proteinen, sondern auch in vivo angewendet werden kann. Der oben erwähnte Selektionsprozeß kann aber auch an gereinigten Zielstrukturen durchgeführt werden. Insbesondere für die in vivo-Diagnostik ist es aber wesentlich, daß die Spezifität der Oligonucleotide gegeben ist für die Zielstruktur im lebenden Umfeld. Daher können die Selektionsprozesse auch an Zellen bzw. Zellkulturen, an Geweben oder Gewebeschnitten, an perfundierten Organen und sogar an lebenden Organismen durchgeführt werden.

Vorteilhaft hierbei ist, daß die modifizierten Oligonucleotide dem Abbau durch die nahezu allgegenwärtigen RNAsen widerstehen können. Dadurch werden selbst bei Selektionsprozessen an lebenden Organismen die gewünschten Oligonucleotidsequenzen angereichert, da entsprechende natürlich vorkommende Oligonucleotide von den RNAsen abgebaut würden.

Die Verknüpfung der Substituenten B-K mit dem Oligonucleotid-Rest N, dessen Nucleotid-Sequenz nach den zuvor beschriebenen Verfahren erhältlich ist, kann an unterschiedlichen Stellen erfolgen. So werden die Reste bevorzugt an den (die)

- am 4′-Ende um eine CH₂-OH-Gruppe oder am 5′-Ende um ein Wasserstoffatom verminderten Oligonucleotid-Rest,
- am 3′-Ende um ein Wasserstoffatom verminderten Oligonucleotid-Rest,
- um die OH-Gruppe(n) verminderte(n) Phosphordiester brücke(n) zwischen zwei Nucleotiden und/oder
- an eine oder mehrere Nucleobasen gebunden.

Die Verbindungskomponente B für die Verknüpfungen an das 4′- und 3′-Ende ist durch die allgemeine Formel X-Y-Z¹ gekennzeichnet, worin x für eine direkte Bindung, eine -NH- oder -S-Gruppe steht,
Y für eine gerad-, verzweigtkettige, gesättigte oder ungesättigte C₁-C₂₀-Alkylenkette steht, die gegebenenfalls 1-2 Cyclohexylen-, 1-5 Imino-, 1-3 Phenylen-, 1-3 Phenylenimino-, 1-3 Phenylenoxy-, 1-3 Hydroxyphenylen-, 1-5 Amido-, 1-2 Hydrazido-, 1-5 Carbonyl-, 1-5 Ethylenoxy-, eine Ureido-, eine Thioureido-, 1-2 Carboxyalkylimino-, 1-2 Estergruppen, 1-3 Gruppen Ar, worin Ar für einen gesättigten oder ungesättigten 5- oder 6-Ring steht, der gegebenenfalls 1-2 Heteroatome ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel und/oder 1-2 Carbonylgruppen enthält, 1-10 Sauerstoff-, 1-5 Stickstoff- und/oder 1-5 Schwefelatome enthält und/oder gegebenenfalls durch 1-5 Hydroxy-, 1-2 Mercapto-, 1-5 Oxo-, 1-5 Thioxo-, 1-3 Carboxy-, 1-5 Carboxy-C₁-C₄-alkyl-, 1-5 Ester-, 1-3 Amino-, 1-3 Hydroxy-C₁-C₄-alkyl-, 1-3 C₁-C₇-Alkoxygruppen substituiert ist, und Z¹ für eine Gruppe -CONH-CH₂-4′, -NH-CO-4′, -O-P(O)R¹-NH-CH₂-4′, -O-P(O)R¹-O-CH₂-4′ oder -O-P(O)R¹-3′ steht, worin 4′ bzw. 3′ die Verknüpfung an die endständige(n) Zuckereinheit(en) angibt und R¹ für O⁻, S⁻, eine C₁-C₄-Alkyl- oder NR²R³-Gruppe steht, mit R² und R³ in der Bedeutung von Wasserstoff oder C₁-C₄-Alkylresten, wobei die Verbindungskomponente B X-seitig mit dem Komplexbildner bzw. Komplex und Z-seitig mit dem Oligonucleotid verbunden ist.

Als cyclische Strukturen Ar eignen sich insbesondere cyclische gesättigte oder ungesättigte Alkylene mit 3 bis 6, insbesondere 5 oder 6 C-Atomen, die gegebenenfalls Heteroatome wie N, S, oder O enthalten können. Beispielsweise kommen Cyclopentylen-, Pyrrolylen-, Furanylen-, Thiophenylen-, Imidazolylen-, Oxazolyliden-, Thiazolylen-, Pyrazolylen-, Pyrrolidylen-, Pyridylen-, Pyrimidylen-, Maleinimidylen- und Phthalimidylen-Gruppen in Betracht.

Im Falle der Verknüpfung an die Phosphordiesterbrücke(n) ist die Verbindungskomponente B durch die Formel X-Y-Z² gekennzeichnet wobei Z² in der zwei benachbarte Zuckereinheiten verknüpfenden Brücke

für die Gruppe -NR²-,-O- oder -S- steht und X, Y und R² die zuvor genannte Bedeutung haben.

Als Reste Y der Verbindungskomponente Z¹-Y-X oder Z²-Y-X seien beispielhaft die Reste -(CH₂)₆-NH-CS-NH-C₆H₄- CH(CH₂CO₂H) -CH₂-CO-NH-CH₂-CH(OH)-CH₂-, -(CH₂)₆-NH-CS-NH-C₆H₄-CH₂-, -(CH₂)₆-NH-CO-CH₂-, -(CH₂)₆-NH-CO-CH₂-CH₂-, -(CH₂)₂-, -(CH₂)₆-, -(CH₂)₆-S-(CH₂)₂-, -(CH₂)₆-S-(CH₂)₆-, -(CH₂)₂-NH-CO-, -(CH₂)₆-NH-CO-, -(CH₂)₆-S-(CH₂)₂-NH-CO-, -(CH₂)₆-S-(CH₂)₆-NH-CO-,

genannt.

Erfolgt die Verknüpfung über die Nucleobase(n), so ist die Verbindung B durch die Formel X-Y-Z³ gekennzeichnet, wobei Z³ für eine NH-Gruppe an der oder eine direkte Bindung zur Nucleobase steht und X und Y die angegebene Bedeutung haben.

Als Reste Y der Verbindungskomponente Z³-Y-X seien beispielhaft die Reste -CH₂-CO-NH-CH₂-CH(OH)-CH₂-, -NH-CO-CH₂-CO-NH-CH₂-CH (OH) -CH₂-, -CO-NH-CH₂-CH₂-NH-, -CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-, -CH₂-S-CH₂-CH₂-, -(CH₂)₄-S-CH₂-CH₂-NH-, -CO-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-, -CO-CH₂-S-(CH₂)₆-NH-, -CH=CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH-, -CH=CH-CH₂-NH-, -C≡C-CH₂-NH- oder -CO-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH- genannt.

Als Bindungsstellen bei den Purin Basen ist insbesondere die Position 8 und bei den Pyrimidinbasen die Position 5 geeignet. Rein formal wird dabei ein Wasserstoffatom der jeweiligen Base durch den Rest B-K substituiert. Eine Verknüpfung kann aber auch über gegebenenfalls in den Positionen 2, 4 oder 6 enthaltenen Aminogruppen erfolgen, so z. B. über die 2-Aminogruppe im Guanin, über die 6-Aminogruppe im Adenin oder über die 4-Aminogruppe im Cytosin. In diesem Fall wird jeweils ein Wasserstoffatom der jeweiligen Aminogruppe durch den Rest B-K substituiert.

Der Oligonucleotid-Rest N kann eine oder mehrere Verbindungskomponenten B, bzw. Substituenten B-K, die unabhängig voneinander ausgewählt werden können, aufweisen. Beansprucht werden Oligonucleotid-Konjugate, die 1 bis 30 gleiche oder 2 bis 30 unterschiedliche Verbindungskomponenten B enthalten. Besonders bevorzugt sind Oligonucleotid-Konjugate mit einer bis 20 Verbindungskomponenten B.

Die Verbindungskomponente B verbindet den Oligonucleotid-Rest N mit einem Komplexbildner oder Komplex K.

Vorteilhaft lassen sich mehrzähnige, offenkettige oder cyclische komplexbildende Liganden mit O, S und N Donoratomen einsetzen.

Als Beispiele für die Komplexbildner-Reste K seien die um ein Wasserstoffatom, eine Hydroxy- und/oder eine Essigsäuregruppe verminderten Polyaminopolycarbonsäuren Diamintetraessigsäure, Diethylentriaminpentaessigsäure, trans-1,2-Cyclohexandiamintetraessigsäure, 1,4,7,10-Tetra azacyclododecantetraessigsäure, 1,4,7-Triazacyclononan triessigsäure, 1,4,8,11-Tetraazatetradecantetraessigsäure, 1,5,9-Triazacyclododecantriessigsäure, 1,4,7,10-Tetraaza cyclododecantriessigsäure und 3,6,9,15-Tetraaza-bicyclo- [9,3,1]-pentadeca-1(15),11,13-trientriessigsäure genannt.

Geeignete Komplexbildner werden z. B. in den EP 0 485 045, EP 0 071 564 und EP 0 588 229, in den DE 43 10 999 und DE 43 11 023 beschrieben.

Um die vielfältigen Möglichkeiten für die Komplexbildner K gemäß der vorliegenden Erfindung zu verdeutlichen, sei auf Abb. 1 und 2 verwiesen, in denen einige vorteilhafte Strukturen zusammengestellt sind. Diese Abbildungen sind als Auswahl zu verstehen und begrenzen die vorliegende Erfindung in keiner Weise auf die dargestellten Komplexbildner.

Der Komplexbildner K kann alle in der NMR-Diagnostik gebräuchlichen paramagnetischen Metallionen enthalten.

Erfindungsgemäß geeignete Isotope werden aus den Elementen der Ordnungszahlen 21-29, 42, 44 oder 58-70 ausgewählt.

Es sind dies insbesondere die zwei- und dreiwertigen Ionen der Elemente der Ordnungszahlen 21-29, 42, 44 und 58-70. Geeignete Ionen sind beispielsweise das Chrom(III)-, Eisen(II)-, Cobalt(II)-, Nickel(II)-, Kupfer(II)-, Praseodym(III)-, Neodym(III)-, Samarium(III)- und Ytterbium(III)-Ion. Wegen ihres sehr starken magnetischen Moments sind besonderes bevorzugt das Gadolinium(III)-, Terbium(III)-, Dysprosium(III)-, Holmium(III)-, Mangan(II)-, Erbium(III)- und Eisen(III)-Ion.

Diejenigen Carbonsäuregruppen, die nicht zur Komplexierung der Metallionen der oben genannten Elemente benötigt werden, können gewünschtenfalls als Salze einer anorganischen oder organischen Base wie Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxide und -carbonate, insbesondere Natrium- und Kaliumhydroxid, oder Ammoniak und Alkylamine, oder Aminosäure oder als Ester oder Amid vorliegen.

Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate.

So können Konjugate bei denen der Substituent an das 5′-Ende des Oligonucleotids gebunden ist, durch Umsetzung des Oligonucleotids mit einem Phosphoramidit-Derivat erhalten werden (Tetrahedron 49, 1925-1963 (1993)). Dazu wird die 5′-Hydroxygruppe bzw. 3′-Hydroxygruppe des Oligonucleotids mit einem Phosphoramidit der allgemeinen Formel PR′(NR₂′′)OR′′′ umgesetzt. R′ steht dabei für eine gegebenenfalls N, NO₂, Si oder SO₂ enthaltende Alkyl-, Alkoxy- oder Arylalkoxygruppe mit 1 bis 20 C-Atomen wie Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Methoxy, Ethoxy, Propyloxy, Butyloxy, Benzyloxy oder Phenylethoxy, die gegebenenfalls substituiert sein können. Als Substituenten werden insbesondere Cyano- und Nitrogruppen verwendet. Vorteilhaft können beispielsweise Methoxy-, β-Cyanoethoxy- oder Nitrophenylethoxygruppen eingesetzt werden. Besonders bevorzugt werden β-Cyanoethoxygruppen. R′′ ist ein C₁-C₄-Alkylrest, wobei Ethyl- und Propylreste besonders geeignet sind. Bevorzugt werden Isopropylreste. R′′′ ist eine gegebenenfalls S, O, N, CN, NO₂ oder Halogen enthaltende Alkyl- oder Arylalkylgruppe mit 1 bis 20 C-Atomen. Bevorzugt werden geschützte Amino- und Thioalkylreste sowie geschützte Amino- und Thiooxaalkylreste eingesetzt. Besonders bevorzugt sind 6-Aminohexyl-, 6-Thiohexyl-, 3,6,9-Trioxa-11-amino-undecyl- und 3,6-Dioxa-8-amino-octanyl-Gruppen. Als Schutzgruppen können allgemein üblichen N- oder S-Schutzgruppen verwendet werden. Beispielsweise eignen sich Trifluoracetyl-, Phthalimido- und Monomethoxytritylgruppen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieser Er findung wird als Phosphoramidit-Derivat β-Cyanoethyl-N,N- diisopropylamino-6-(trifluoracetamido)-1-hexyl-phosphor amidit eingesetzt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird als Phosphoramidit-Derivat β-Cyanoethyl-N,N- diisopropylamino-(3,6,9-trioxa-11-phthalimido-1-undecyl) phosporamidit eingesetzt.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindungskomponente B an das 3′-Ende des Oligonucleotids N in einer zur wie oben beschriebenen analogen Weise über eine phosphorhaltige Gruppe gebunden.

Die oben beschriebene Reaktion zwischen Oligonucleotid und Phosphoramidit kann als Festphasenreaktion erfolgen, wobei sich das Oligonucleotid noch auf der Säule eines Synthese automaten befindet. Nachdem ein Oligonucleotid der gewünschten Sequenz erhalten ist und erfolgter Freilegung der 5′-Hydroxygruppe des Oligonucleotids, z. B. mit Trichloressigsäure, wird mit dem Phosphoramidit umgesetzt und das Reaktionsprodukt wird oxidiert und freigesetzt. Anschließend wird das so erhaltene Oligonucleotid-Derivat an der endständigen Amino- oder Thiolgruppe mit dem Komplexbildner oder Komplex K gegebenenfalls über eine weitere Linkergruppe gekoppelt. Der im ersten Schritt über die phosphorhaltige Gruppe an das Oligonucleotid gebundene Rest bildet dann zusammen mit der gegebenenfalls vorhandenen weiteren Linkergruppe die Verbindungskomponente B.

Die Verknüpfung des Oligonucleotid-Derivats über den Linker mit dem Komplexbildner oder Komplex K kann auch als Fest phasenreaktion auf der Säule eines Syntheseautomaten erfolgen. Die erfindungsgemäße Verbindung kann anschließend durch Ablösen vom festen Träger isoliert werden.

Die Verknüpfung des Polynucleotids mit dem Linker kann nicht nur über die 5′-OH Gruppe des Zuckers des terminalen Nucleotids erfolgen, sondern auch über andere funktionelle Gruppen, die aus der 5′-OH Gruppe generiert werden können, wie z. B. eine Amino- bzw. Carboxygruppe. Derartige Amino- bzw. Carboxygruppen tragende Nucleotide sind bekannt und leicht herstellbar. Die Synthese eines 5′-Aminouridin wird im J. Med. Chem. 22, 1273 (1979) sowie in Chem. Lett. 6, 601 (1976) beschrieben. 4′-Carboxyuridin ist wie in J. Med. Chem. 21, 1141 (1978), bzw. Nucleic Acids Symp. Ser. 9, 95 (1981) beschrieben zugänglich.

Die Verknüpfung mit dem Komplexbildner erfolgt dann über einen eine Carbonsäure bzw. Aminogruppe tragenden Linker in dem Fachmann bekannter Weise. Der Linker bildet dann gemeinsam mit der -NH-CH₂-4¹ bzw. der -CO-4′ Gruppe die Verbindungskomponente B.

Es sei darauf hingewiesen, daß die Aufteilung der erfindungsgemäßen Konjugate in einen Nucleotidrest, eine Verbindungskomponente und einen Komplexbildner bzw. Komplex rein formal und damit unabhängig vom tatsächlichen synthetischen Aufbau erfolgt. So wird z. B. im oben genannten Fall die Gruppe -NH-CH₂-4′ bzw. -CO-4′ als zur Verbindungskomponente B gehörig angesehen, wohingegen das in der 4′-Position um eine CH₂-OH-Gruppe verminderte Oligonucleotid als Oligonucleotidrest N bezeichnet wird.

Ein Verfahren zur Herstellung von Konjugaten, bei denen die Verbindungskomponente an die um die OH-Gruppen verminderten Phosphodiester-Brücken erfolgt, besteht darin, daß zunächst zwei Zuckereinheiten zu einem Dinucleotid verknüpft werden (s. z. B. Chem. Lett. 1305 (1993)). Dabei entsteht zunächst ein Triester der Formel

worin U für einen entsprechenden Alkylenrest und V für eine geschützte Amino- bzw. Schwefelgruppe steht. Nach Abspaltung der Aminoschutzgruppe kann in dem Fachmann bekannter Weise der Komplexbildner gegebenenfalls über einen Linker mit der Aminogruppe - z. B. in Form einer Amidbindung - verknüpft werden. Der Linker bildet dann gemeinsam mit der Gruppe O-U-V′ (worin V′ für eine Gruppe -NH-steht) die Verbindungskomponente B.

Ein alternatives Verfahren besteht darin, daß der intermediär durchlaufene Phosphotriester (z. B. durch Umsetzung mit 1,5-Diaminopentan) einer Aminolyse unterzogen wird (siehe Biochemistry 27, 7237 (1988) oder J. Am. Chem. Soc. 110, 4470 (1988)).

Die so erhaltenen Verbindungen der Formel

können wie oben beschrieben mit dem Komplexbildner gegebenenfalls über einen Linker verknüpft werden.

Für Kopplungzwecke geeignet sind auch Dinucleosid-phosphat monothiotriester (siehe J. Am. Chem. Soc. 111, 9117 (1983) und Nucl. Acids Res. 20, 5205 (1992)).

Eine besonders große Vielfalt zur Verknüpfung der Komplexbildner mit den Nucleotiden bieten die Nucleobasen. Eine Verknüpfung in den Positionen 2 bei den Purinen und 4 bei den Pyrimidinen kann direkt erfolgen. Es ist allerdings häufig günstiger die Purine bzw. Pyrimidine zunächst zu modifizieren und diese derivatisierten Basen mit den Komplexbildnern (gegebenenfalls über weiter Linker) zu verknüpfen. Geeignete derivatisierte Nucleobasen werden z. B. in Biochemie 71, 319 (1989), Nucl. Acids Res. 16, 4937 (1988) oder Nucleosides Nucleotides 10, 633 (1991) beschrieben.

Ein alternatives Verfahren zur Verknüpfung über die Nucleobasen besteht in der Palladium katalysierten Kupplung von Brom- oder Iodnucleobasen mit funktionalsierten Resten (Biogenic and Medical Chemistry Letter V, 361 (1994)). Über diese funktionalisierten Reste kann dann nach bekannten Methoden der Komplexbildner gegebenenfalls über einen weiteren Linker mit der Nucleobase verknüpft werden. Als funktionalisierte Reste seien beispielhaft ein 5-Acrylester oder ein 5-Allylamin genannt (siehe Nucl. Acids Res. 14, 6115 (1986) und Nucl. Acids Res. 16, 4077 (1988)). Die als Vorstufe eingesetzten Halogenderivate sind wie z. B. in Biophys. J. 44, 201 (1983), J. Am. Chem. Soc. 86, 1242 (1964) oder Chem. Commun. 17 (1967) beschrieben, erhältlich.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Metallkomplexe aus den metallfreien Oligonucleotid-Konjugaten erfolgt wie in der DE 34 01 052 offenbart, indem man das Metalloxid oder ein Metallsalz (beispielsweise das Nitrat, Acetat, Carbonat, Chlorid oder Sulfat) des gewünschten Metallisotops in Wasser und/oder einem niederen Alkohol (wie Methanol, Ethanol oder Isopropanol) löst oder suspendiert und mit der Lösung oder Suspension der äquivalenten Menge des den Komplexbildner enthaltenden Oligonucleotid-Konjugats umsetzt und anschließend, falls gewünscht, vorhandene acide Wasserstoffatome durch Kationen von anorganischen und/oder organischen Basen oder Aminosäuren substituiert oder freie Carbonsäuregruppen in Aminosäureamide umwandelt.

Die Neutralisation eventuell noch vorhandener freier Säuregruppen erfolgt mit Hilfe anorganischer Basen (zum Beispiel Hydroxiden, Carbonaten oder Bicarbonaten) von zum Beispiel Natrium, Kalium, Lithium, Magnesium oder Calcium und/oder organischer Basen wie unter anderem primärer, sekundärer und tertiärer Amine, wie zum Beispiel Ethanolamin, Morpholin, Glucamin, N-Methyl- und N,N-Dimethyl-glucamin, sowie basischer Aminosäuren, wie zum Beispiel Lysin, Arginin und Ornithin, oder von Amiden ursprünglich neutraler oder saurer Aminosäuren.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel erfolgt ebenfalls in an sich bekannter Weise, indem man die erfindungsgemäßen Oligonucleotid-Konjugate - gegebenenfalls unter Zugabe der in der Galenik üblichen Zusätze - in wäßrigem Medium suspendiert oder löst und anschließend die Suspension oder Lösung gegebenenfalls sterilisiert oder sterilfiltriert. Geeignete Zusätze sind beispielsweise physiologisch unbedenkliche Puffer (wie zum Beispiel Tromethamin), Zusätze von Komplexbildnern (wie zum Beispiel Diethylentriaminpentaessigsäure) oder - falls erforderlich - Elektrolyten wie zum Beispiel Natriumchlorid oder - falls erforderlich - Antioxidantien wie zum Beispiel Ascorbinsäure oder, insbesondere für orale Darreichungs formen, Mannit oder andere osmotisch aktive Substanzen.

Sind für die enterale Verabreichung oder andere Zwecke Suspensionen oder Lösungen der erfindungsgemäßen Mittel in Wasser oder physiologischer Salzlösung erwünscht, können sie mit einem oder mehreren in der Galenik üblichen Hilfsstoff(en) (zum Beispiel Methylcellulose, Lactose, Mannit) und/oder Tensid(en) (zum Beispiel Lecithine, Tween^TR, Myrj^TR) gemischt werden.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel enthalten vorzugsweise 0,1 µmol/l bis 3 mmol/l der erfindungsgemäßen Oligonucleotid-Konjugate und werden in der Regel in Mengen von 0,1 µmol/kg-1 mmol/kg (bezogen auf das enthaltene paramagnetische Metall) dosiert. Sie sind zur enteralen und parenteralen Applikation bestimmt.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Nachweis von Zielstrukturen. Dabei werden eine oder mehrere der oben beschriebenen Verbindungen mit der zu un tersuchenden Probe in vivo oder in vitro zusammengebracht. Der Oligonucleotid-Rest N bindet dabei spezifisch und mit hoher Bindungsaffinität an die nachzuweisende Zielstruktur.

Ist die Zielstruktur in der Probe vorhanden, so kann sie dort anhand des Signals nachgewiesen werden. Insbesondere eignet sich das Verfahren für eine nicht-invasive Diagnostik von Krankheiten. Dabei werden eine oder mehrere der oben beschriebenen Verbindungen in vivo verabreicht und anhand des Signals kann nachgewiesen werden, ob die Zielstruktur, an die der Oligonucleotid-Rest N spezifisch und mit hoher Affinität bindet, in dem zu untersuchenden Organismus vorhanden ist.

Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt ein Diagnosekit zum in vivo Nachweis von Zielstrukturen, das eine oder mehrere der oben genannten Verbindungen als gefriergetrocknetes Material sowie die zum Bereiten des Mittels erforderliche physiologisch verträgliche Flüssigkeit enthält.

Die erfindungsgemäßen Konjugate und Mittel erfüllen die vielfältigen Voraussetzungen, die an ein Pharmazeutikum für die NMR-Diagnostik zu stellen sind. Sie zeichnen sich insbesondere durch eine hohe Spezifität bzw. Affinität gegenüber der betreffenden Zielstruktur aus. Gegenüber bekannten Oligonucleotid-Konjugaten weisen die erfindungsgemäßen Konjugate eine besonders hohe in vivo Stabilität auf. Dieses wurde durch eine Substitution der 2′-Hydroxylgruppe erreicht. Überraschenderweise wird die Spezifität des Oligonucleotids weder durch diese Modifikation, noch durch die Kopplung mit dem Komplexbildner nennenswert beeinträchtigt. Weitere Vorteile sind die steuerbare Pharmakokinetik sowie die notwendige Verträglichkeit.

Abb. 1 zeigt eine Auswahl von cyclischen Komplexbildnern K, die für die vorliegende Erfindung vorteilhaft eingesetzt werden können.

Abb. 2 zeigt eine Auswahl von offenkettigen Komplexbildnern K, die für die vorliegende Erfindung vorteilhaft eingesetzt werden können.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegenden Erfindungen näher illustrieren.

Beispiel 1 a) 5′-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 30mer-Oligonucleotids 5′-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3′ (Ligand für Nerve Growth Factor NGF, Seq. Nr. 21) (im US-Patent Nr. 5,270,163 beschrieben)

Das nach dem SELEX-Verfahren identifizierte 30mer-Oligonucleotid 5′-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3′ wird in üblicher Weise in einem Syntheseautomaten der Fa. Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid noch auf der Säule des festen Trägers befindet. Durch Reaktion mit Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan wird die 5′-Hydroxygruppe freigelegt. Die Beladung der Säule beträgt ca. 10 mg des 30mer-Oligonucleotids. Zum Anknüpfen des Linkers wird die Säule mit einer Lösung von 50 µmol β-Cyanoethyl-N,N-diisopropylamino-6-(trifluoracetamido)-1- hexyl-phosphoramidit (hergestellt nach Nucl. Acids. Res. 16, 2659-2669 (1988)) in Gegenwart von Tetrazol umgesetzt. Die Oxidation des gebildeten Phosphits zum voll geschützten Phosphotriester erfolgt mit Jod in Tetrahydrofuran. Anschließend wird die Säule nacheinander mit Methanol und Wasser gewaschen. Zur Ablösung des modifizierten Oligonucleotids vom festen Träger, überführt man den Inhalt der Säule in ein Multivial, versetzt mit 5 ml 30%iger Ammoniaklösung, verschließt das Gefäß und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt dann auf 0°C, zentrifugiert, wäscht den Träger mit 5 ml Wasser und unterwirft die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung.

Zur Reinigung nimmt man das feste Material in 2 ml Wasser auf, versetzt mit 2 ml 0,5 M Ammoniumacetatlösung und versetzt mit 10 ml Ethanol, man läßt über Nacht bei -20°C stehen, zentrifugiert, wäscht den Rückstand mit 1 ml Ethanol (-20°C) und trocknet schließlich im Vakuum bei Raumtemperatur.

Man erhält 8 mg der Titelverbindung als farbloses Pulver.

b) 10-[5-(2-Carboxyphenyl)-2-hydroxy-5-oxo-4-aza-pentyl]- 1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclo dodecan

50 g (144,3 mmol) 1,4,7-Tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetra azacyclododecan (DO3A) werden in 250 ml Wasser gelöst und der pH-Wert mit 5 N Natronlauge auf pH 13 eingestellt. Dann wird innerhalb einer Stunde eine Lösung aus 38,12 g (187,6 mmol) N-(2,3-Epoxypropyl)-phthalimid in 100 ml Dioxan zugetropft, 24 Stunden bei 50°C gerührt und der pH-Wert durch Zugabe von 5 N Natronlauge bei pH 13 gehalten. Die Lösung wird mit 10%iger Salzsäure auf pH 2 eingestellt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in etwas Wasser gelöst und an einer Ionenaustauschersäule (Reillex^TR = Poly-(4-vinyl)-pyridin, man eluiert mit Wasser) gereinigt. Die Hauptfraktionen werden im Vakuum eingedampft und der Rückstand durch Chromatographie an RP-18 (LiChroPrep^TR/Laufmittel: Gradient aus Tetrahydro furan/Methanol/Wasser) endgereinigt. Nach Eindampfen der Hauptfraktionen erhält man 63,57 g (71% d. Th.) eines amorphen Feststoffes.
Wassergehalt: 8,5%
Elementaranalyse (bezogen auf wasserfreie Substanz):
ber.:
C 52,90; H 6,57; N 12,34;
gef.:
C 52,65; H 6,68; N 12,15.

c) 10-(3-Amino-2-hydroxy-propyl)-1,4,7-tris(carboxy methyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan

50 g (88,1 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 1b werden in 300 ml konz. Salzsäure 24 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in etwas Wasser und reinigt an einer Ionenaustauschersäule (Reillex^TR = Poly-(4-vinyl)pyridin (man eluiert mit Wasser)). Die Hauptfraktionen werden zur Trockne eingedampft.
Ausbeute: 39,0 g (95% d. Th.) eines glasigen Feststoffes.
Wassergehalt: 10,3%
Elementaranalyse (bezogen auf wasserfreie Substanz):
ber.:
C 48,68; H 7,93; N 16,70;
gef.:
C 48,47; H 8,09%; N 16,55.

d) 10-[7-(4-Nitrophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxy methyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris(carboxymethyl)- 1,4,7,10-tetraazacyclododecan

Zu 14,62 g (34,86 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 1c) in 200 ml Dimethylformamid/20 ml Triethylamin gibt man 9,84 g (41,8 mmol) 3-(4-Nitrophenyl)-glutarsäureanhydrid (J. Org. Chem. 26, 3856 (1961)) und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Man dampft im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird aus Isopropanol/Essigsäure 95 : 5 umkristallisiert.
Ausbeute: 21,68 g (95% d. Th.) eines gelblichen Feststoffes
Wassergehalt: 0,9%
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.:
C 51,37; H 6,47; N 12,84;
gef.:
C 51,18; H 6,58; N 12,67.

e) 10-[7-(4-Aminophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxy methyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris(carboxymethyl)- 1,4,7,10-tetraazacyclododecan

21,0 g (32,07 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 1d) werden in 250 ml Methanol gelöst und 5 g Palladium-Kata lysator (10% Pd auf C) zugegeben. Man hydriert über Nacht bei Raumtemperatur. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Ausbeute: 19,63 g (98% d. Th.) eines cremefarbenen Feststoffes
Wassergehalt: 0,8%
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.:
C 53,84; H 6,35; N 12,60;
gef.:
C 53,73; H 6,45; N 12,51.

f) 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7- (carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris(carboxy methyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan

12,4 g (19,27 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 1e) werden in 200 ml Wasser gelöst und 6,64 g (57,8 mmol) Thiophosgen in 50 ml Chloroform zugegeben. Man rührt 1 Stunde bei 50°C. Man kühlt auf Raumtemperatur, trennt die organische Phase ab und schüttelt die wäßrige Phase 2 mal mit 100 ml Chloroform aus. Die wäßrige Phase wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 100 ml Isopropanol bei Raumtemperatur ausgerührt. Der Feststoff wird abfiltriert und mit Ether gewaschen. Nach Trocknen über Nacht im Vakuum (40°C) erhält man 12,74 g (97% d. Th.) eines cremefarbenen Feststoffes.
Wassergehalt: 3,1%
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.:
C 52,24; H 6,35; N 12,60; S 4,81;
gef.:
C 52,37; H 6,44; N 12,48; S 4,83.

g) Konjugation des Oligonucleotids 1a) mit dem Thioisocyanat-Liganden 1f)

8 mg des in Beispiel 1a) erhaltenen Oligonucleotids werden in 2,5 ml einer Mischung von 1 M NaHCO₃/Na₂CO₃ (pH 9,0) gelöst und mit 1 mg 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2- hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris- (carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan (Titel verbindung aus Beispiel 1f) versetzt. Man rührt 5 Stunden bei Raumtemperatur, stellt den pH durch Zugabe von 0,01 M Salzsäure auf 7,2 ein und unterwirft die Lösung einer Ultrafiltration durch eine Membran mit der Ausschlußgrenze 3000 (Amicon YM3) und anschließend einer Gefriertrocknung. Man erhält 7 mg des gewünschten Konjugats.

h) Gadolinium-Komplex des Thioharnstoff-Konjugats 1 g)

10 mg der Titelverbindung aus Beispiel 1 g) werden in MES-Puffer, pH 6,2 gegeben (MES = 2-(N-Morpholino)ethylsulfonsäure). Der pH-Wert wird durch Zugabe von 0,01 M Salzsäure auf pH 4,2 gebracht. Zu dieser Lösung gibt man 2 mg Gadoliniumacetat und rührt 1 Stunde bei 37°C bei pH 4,2. Es wird mit 2 M Natriumacetat-Lösung auf pH 6 gebracht und 0,1 ml einer 0,1 M Na₂EDTA-Lösung (Na₂EDTA = Ethylendiamin-tetraessigsäuredi-Natriumsalz) werden zugegeben. Die Endreinigung des so erhaltenen Konjugates (1h) erfolgt durch HPLC (Ausschlußchromatographie: TSK-400/MES-Puffer). Die das markierte Konjugat enthaltenen Fraktionen werden mit physiologischer Kochsalz-Lösung verdünnt, mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt und filtriert.

Beispiel 2 a) Konjugation des Oligonucleotids (1a) mit N-[2-Amino-3- (p-isothiocyanatophenyl)propyl]-trans-cyclohexan-1,2- diamin-N,N′,N′,N′′,N′′-pentaessigsäure

8 mg des in Beispiel 1a) erhaltenen Oligonucleotids werden in 2,5 ml einer Mischung aus 1 M NaHCO₃/Na₂CO₃ (pH 9,0) gelöst und 1 mg N-[2-Amino-3-(p-isothiocyanatophenyl) propyl]-trans-cyclohexan-1,2-diamin-N,N′,N′,N′′,N′′-penta essigsäure zugegeben (hergestellt nach Bioconjugate Chem. 1, 59 (1990)). Man rührt 5 Stunden bei Raumtemperatur, stellt dann mit 0,1 M Salzsäure auf pH 7,2 und unterwirft die Lösung einer Ultrafiltration durch eine Membran mit der Ausschlußgrenze 3000 (Amicon YM3). Nach Gefriertrocknung erhält man 6 mg des Thioharnstoffkonjugats 2a).

b) Gadolinium-Komplex des Thioharnstoffkonjugates aus Beispiel 2a)

Der gewünschte Gadolinium-Komplex wird nach der unter Beispiel 1h) angegebenen Vorschrift durch Umsetzung der Titelverbindung aus Beispiel 2a) und Gadoliniumacetat erhalten.

Beispiel 3 Mangan-Komplex des Thioharnstoff-Konjugats 2a)

Der gewünschte Mangan-Komplex wird nach der unter Beispiel 1h) angegebenen Vorschrift durch Umsetzung der Titelverbindung aus Beispiel 2a) und Mangan-(II)-acetat erhalten.

Beispiel 4 a) Konjugation der Titelverbindung 1a) mit 2-(p-Isothiocyanato-benzyl)-diethylentriamin- N,N,N′,N′′,N′′-pentaessigsäure

8 mg des in Beispiel 1a) erhaltenen Oligonucleotids werden in 2,5 ml einer Mischung aus 1 M NaHCO₃/Na₂CO₃ (pH 9,0) gelöst und 1 mg 2-(p-Isothiocyanato-benzyl)- diethylentriamin-N,N,N′,N′′,N′′-pentaessigsäure zugegeben (hergestellt nach: Bioconjugate Chem. 2, 187 (1991)). Man rührt 5 Stunden bei Raumtemperatur, stellt dann mit 0,01 M Salzsäure auf pH 7,2 und unterwirft die Lösung eine Ultrafiltration durch eine Membran mit der Ausschlußgrenze 3000 (Amicon YM3). Nach Gefriertrocknung erhält man 6 mg des Thioharnstoffkonjugates.

b) Europium-Komplex des Thioharnstoff-Konjugates aus Beispiel 4a)

Der gewünschte Europium-Komplex wird nach der unter Beispiel 1h) angegebenen Vorschrift durch Umsetzung der Titelverbindung aus Beispiel 4a) und Europiumacetat erhalten.

Beispiel 5 a) 5′-(6-Mercapto-1-hexyl-phosphorsäureester) des 30mer-Oligonucleotids 5′-AGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3′ (Ligand für Serin Protease)

Das nach dem SELEX-Verfahren identifizierte 30mer-Oligonucleotid 5′-AGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3′ (Seq. Nr. 13 aus dem US-Patent Nr. 5,270,163) wird in üblicher Weise in einem Syntheseautomaten der Fa. Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid noch auf der Säule des festen Trägers befindet. Durch Reaktion mit Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan wird die 5′-Hydroxygruppe freigelegt. Die Beladung der Säule beträgt ca. 10 mg des 30mer-Oligonucleotids. Zum Anknüpfen des Linkers wird die Säule mit einer Lösung von 50 µmol β-Cyanoethyl-N,N-diisopropylamino-S-trityl-6-mercapto)- phosphoramidit in Acetonitril in Gegenwart von Tetrazol umgesetzt. Die Oxidation des gebildeten Phosphits zum voll geschützten Phosphotriester erfolgt mit Jod in Tetrahydrofuran. Anschließend wird die Säule nacheinander mit Methanol und Wasser gewaschen. Zur Ablösung des modifi zierten Oligonucleotids vom festen Träger, überführt man den Inhalt der Säule in ein Multivial, versetzt mit 5 ml 30%iger Ammoniaklösung, verschließt das Gefäß und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt dann auf 0°C, zentrifugiert, wäscht den Träger mit 5 ml Wasser und unterwirft die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung.

Man erhält 9 mg der S-tritylierten Titelverbindung. Zur Abspaltung der Trityl-Schutzgruppe löst man das Produkt in 0,5 ml Wasser, versetzt mit 0,1 ml 1 M Silbernitratlösung und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Anschließend versetzt man mit 0,1 ml 1 M Dithiothreitol-Lösung. Nach 15 Minuten zentrifugiert man und extrahiert die überstehende Lösung mehrmals mit Ethylacetat. Aus der wäßrigen Lösung erhält man nach dem Gefriertrocknen 8 mg der gewünschten Titelverbindung.

b) Konjugation des Oligonucleotids aus Beispiel 5a) mit 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-2-(5-aza-8-maleimido-6- oxo)-octan]-1,4,7,10-tetraessigsäure

Zu einer Lösung von 5 mg des nach Beispiel 5a) hergestellten thiolhaltigen Oligonucleotids in 2 ml Phosphatpuffer (pH 8) gibt man unter N₂ 1 mg 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-octan]- 1,4,7,10-tetraessigsäure (hergestellt nach J. Chem. Soc., Chem. Commun. 796, (1989)). Man rührt 3 Stunden bei 35°C, versetzt mit 10 ml Isopropylalkohol und isoliert das Produkt durch Zentrifugieren. Die Reinigung erfolgt durch Reversed-Phase-Chromatographie an einer 1×25 cm Säule mit einem 25 mM Triethylammoniumacetat (pH 7)/Acetonitril- Gradienten. Die vereinigten Fraktionen werden im Vakuum schonend eingedampft, in wenig Wasser gelöst und mit Hilfe einer Sephadex-G-10-Säule entsalzt. Durch Gefriertrocknung erhält man 4 mg der Titelverbindung als weißes Pulver.

c) Gadolinium-Komplex des nach Beispiel 5b) hergestellten Konjugats

Der gewünschte Gadolinium-Komplex wird nach der unter Beispiel 1h) angegebenen Vorschrift durch Umsetzung der Titelverbindung aus Beispiel 5b) und Gadoliniumacetat erhalten.

Beispiel 6 a) Konjugation des Oligonucleotids aus Beispiel 5a mit 1,4,7-Triazacyclononan-2-(5-aza-8-maleimido-6-oxo) octan]-1,4,7-triessigsäure

Zu einer Lösung von 5 mg des nach Beispiel 5a) hergestellten thiolhaltigen Oligonucleotids in 2 ml Phosphatpuffer (pH 8) gibt man unter N₂ 1 mg 1,4,7-Triazacyclononan-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-octan]-1,4,7- triessigsäure (hergestellt nach J. Chem. Soc., Chem. Commun. 794, (1989)). Man rührt 6 Stunden bei 35°C, versetzt mit 10 ml Isopropanol und isoliert das Produkt durch Zentrifugieren. Die Reinigung erfolgt durch Reversed- Phase-Chromatographie an einer 1×25 cm Säule mit einem 25 mM Triethylammoniumacetat (pH 7)/Acetonitril-Gradienten. Die vereinigten Fraktionen werden schonend im Vakuum eingedampft, in wenig Wasser gelöst und mit Hilfe eine Sephadex G-10-Säule entsalzt. Durch Gefriertrocknung erhält man 3 mg der Titelverbindung als weißes Pulver.

b) Eisen-(III)-Komplex des nach Beispiel 6a) hergestellten Konjugats

Der gewünschte Eisen-Komplex wird nach der unter Beispiel 1h) angegebenen Vorschrift durch Umsetzung der Titelverbindung aus Beispiel 6a) und Eisen-(III)-chlorid erhalten.

Beispiel 7 a) Phosphitylierung von 5′-O-(4,4′-Dimethoxytrityl)-5- (prop-2-en-1-on)-2′-desoxyuridin

Zu einer gerührten Lösung von 2,1 g (3,59 mmol) 5′-O-(4,4′- Dimethoxytrityl)-5-(prop-2-en-1-on)-2′-desoxyuridin (hergestellt nach Nucleosides & Nucleotides 13, 939-944, (1994)) in 50 ml Tetrahydrofuran gibt man nacheinander 50 mg 4-Dimethylaminopyridin, 3 ml Diisopropylethylamin und 962 µl (4,31 mmol) 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchloro phosphoramidit. Nach ca. 30 Minuten bildet sich ein weißer Niederschlag. Man filtriert, engt die Lösung im Vakuum ein und verteilt den Rückstand zwischen Dichlormethan und 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung. Die Dichlormethan phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Den Rückstand reinigt man durch rasche Chromatographie an Kieselgel, wobei man mit Dichlormethan/Hexan/Di isopropylethylamin (80 : 18 : 2) eluiert. Man erhält 1,8 g der gewünschten Verbindung als einen weißen Schaum.
Elementaranalyse:
ber.:
C 64,28; H 6,29; N 7,14; P 3,95;
gef.:
C 64,02; H 6,60; N 7,21; P 4,09.

b) Umsetzung des Phosphoramidits aus Beispiel 7a) mit der Oligonucleotidsequence Nr. 21 aus Beispiel 1a)

Das nach dem SELEX-Verfahren identifizierte 30mer-Oligonucleotid wird in üblicher Weise in einem Syntheseautomaten der Fa. Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid noch auf der Säule des festen Trägers befindet. Durch Reaktion mit Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan wird die 5′-Hydroxygruppe freigelegt. Die Beladung der Säule beträgt ca. 10 mg des 30mer-Oligonucleotids. Die 5′-Hydroxygruppe wird in Gegenwart von Tetrazol mit dem nach Beispiel 13a) erhaltenen Phosphoramidit umgesetzt. Anschließend wird durch Behandlung mit Jodlösung das Phosphit in den Phosphotriester überführt und durch Reaktion mit Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan wird der terminale DMT-Rest abgespalten. Zur Addition einer Thiolgruppe an das am terminalen 2′-Desoxyuridin befindliche α,β-ungesättigte Carbonylsystem setzt man mit einer Lösung von 10-(4-Aza-2-hydroxy-5-imino-8-mercapto octan)-1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraaza cyclododecan* in Tetrahydrofuran um und wäscht nacheinander mit Methanol und Wasser. Zur Ablösung des modifizierten Oligonucleotids vom festen Träger, überführt man den Inhalt der Säule in ein Multivial, versetzt mit 5 ml 30%iger Ammoniaklösung, verschließt das Gefäß und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt dann auf 0°C, zentrifugiert, wäscht den Träger mit 5 ml Wasser und unterwirft die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung.

Man erhält 6 mg der Titelverbindung als farbloses Pulver.

* 10-(4-Aza-2-hydroxy-5-imino-8-mercapto-octan)-1,4,7-tris- (carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan erhält man wie nachfolgend beschrieben:
Zu einer Lösung von 1,46 g (3,49 mmol) 10-(3-Amino-2- hydroxy-propyl)-1,4,7-tris-(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetra azacyclododecan (siehe Beispiel 1c) in einer Mischung aus 50 ml Wasser und 50 ml Methanol gibt man 15,7 ml 1 N Natronlauge und 480 mg (3,49 mmol) 2-Iminotetrahydrothiophenhydrochlorid und rührt 3 Stunden bei Raumtemperatur, engt im Vakuum auf ca. 1/4 des anfänglichen Volumens ein und versetzt unter Rühren mit einem Anionenaustauscher (IRA 410) bis ein pH von 11 erreicht ist. Man filtriert und versetzt die Lösung unter Rühren in kleinen Portionen mit soviel Kationenaustauscher IRC 50 bis ein pH von 3,5 erreicht ist. Nach Filtrieren wird die Lösung gefriergetrocknet. Man erhält 1,39 g der gewünschten Substanz als weißes Pulver mit einem Wassergehalt von 4,9%.
Elementaranalyse (bezogen auf wasserfreie Substanz):
ber.:
C 48,45; H 7,74; N 16,14; S 6,16;
gef.:
C 48,30; H 7,98; N 16,05; S 6,44.

c) Gadolinium-Komplex des nach Beispiel 7b) hergestellten Konjugats

Der gewünschte Gadolinium-Komplex wird nach der unter Beispiel 1h) angegebenen Vorschrift durch Umsetzung der Titelverbindung aus Beispiel 7b) und Gadoliniumacetat erhalten.

Beispiel 8 a) 5-(11-Amino-3,6,9-trioxo-undecyl-1-phosphorsäure ester) des 30mer-Oligonucleotids 5′-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3′ (Ligand für Nerve Growth Factor NGF, Seq. Nr. 21) (im US-Patent Nr. 5,270,163 beschrieben)

Das nach dem SELEX-Verfahren identifizierte 30mer-Oligonucleotid 5′-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3′ wird in üblicher Weise in einem Syntheseautomaten der Fa. Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid noch auf der Säule des festen Trägers befindet. Durch Reaktion mit Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan wird die 5′-Hydroxygruppe freigelegt. Die Beladung der Säule beträgt ca. 10 mg des 30mer-Oligonucleotids.

Zum Anknüpfen der Verbindungskomponente wird die Säule mit einer Lösung von 50 µmol β-Cyanoethyl-N,N-diisopropylamino- (3,6,9-trioxa-11-phthalimido-1-undecyl)-phosphoramidit (hergestellt nach: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6230-6234 (1989)) in Gegenwart von Tetrazol umgesetzt. Die Oxidation des gebildeten Phosphits zum voll geschützten Phosphotriester erfolgt mit Jod in Tetrahydrofuran. Anschließend wird die Säule nacheinander mit Methanol und Wasser gewaschen. Zur Ablösung des modifizierten Oligonucleotids vom festen Träger überführt man den Inhalt der Säule in ein Multivial, versetzt mit 5 ml 30%iger Ammoniaklösung, verschließt das Gefäß und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt dann auf 0°C, zentrifugiert, wäscht den Träger mit 5 ml Wasser und unterwirft die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung.

Zur Reinigung nimmt man das feste Material in 2 ml Wasser auf, versetzt mit 2 ml 0,5 M Ammoniumacetatlösung und versetzt mit 10 ml Ethanol; man läßt über Nacht bei -20°C stehen, zentrifugiert, wäscht den Rückstand mit 1 ml Ethanol (-20°C) und trocknet schließlich im Vakuum bei Raumtemperatur.

Man erhält 8 mg der Titelverbindung 8a) als weißes Pulver.

b) Gadolinium-Komplex von 10-(3-Amino-2-hydroxy-propyl)- 1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclo dodecan

38 g (90,6 mmol) der nach Beispiel 1c) erhaltenen Verbindung werden in 300 ml Wasser gelöst und 16,42 g (45,3 mmol) Gadoliniumoxid zugesetzt. Man erwärmt 3 Stunden auf 90°C. Die abgekühlte Lösung wird mit je 5 ml saurem Ionenaustauscher (IR-120/H⁺-Form) und 5 ml basischem Austauscher (IRA-410/OH⁻-Form) 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Man filtriert vom Austauscher ab. Gefriertrocknung des Filtrats liefert 57,23 g (98% d. Th.) eines amorphen Feststoffes.
Wassergehalt: 11,3%.
Analyse (bezogen auf wasserfreie Substanz):
ber.:
C 35,59%; H 5,27%; N 12,21%; Gd 27,41%;
gef.:
C 35,32%; H 5,38%; N 12,31%; Gd 27,20%.

c) Gadolinium-Komplex von 10-[7-(4-Nitrophenyl)-2- (benzylcarboxy)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)-4- aza-heptyl]-1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10- tetraazacyclododecan

Zu 20 g (34,86 mmol) der nach Beispiel 8b) erhaltenen Verbindung in 200 ml Dimethylformamid / 20 ml Triethylamin gibt man 9,84 g (41,8 mmol) 3-(4-Nitro-phenyl)- glutarsäureanhydrid (J. Org. Chem. 26, 3856 (1961)) und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Man dampft im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird aus Isopropanol/Essigsäure 95 : 5 umkristallisiert.
Ausbeute: 27,46 g (94% d. Th.) eines gelblichen Feststoffes
Wassergehalt: 3,4%
Analyse (bezogen auf wasserfreie Substanz):
ber.:
C 41,58%; H 4,86%; N 10,39%; Gd 19,44%;
gef.:
C 41,38%; H 4,97%; N 10,17%; Gd 19,28%.

d) Gadolinium-Komplex von 10-[7-(4-Aminophenyl)-2- hydroxy-5-oxa-7-(carboxy-methyl)-4-aza-heptyl)-1,4,7- tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan

25 g (30,9 mmol) der nach Beispiel 8c) erhaltenen Verbindung werden in 250 ml Methanol gelöst und 5 g Palladium-Katalysator (10% Pd auf C) zugegeben. Man hydriert über Nacht bei Raumtemperatur. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Ausbeute: 24,07 g (97% d. Th.) eines cremefarbenen Feststoffes
Wassergehalt: 3,0%
Analyse (bezogen auf wasserfreie Substanz):
ber.:
C 43,18%; H 5,31%; N 10,79%; Gd 20,19%.
gef.:
C 43,27%; H 5,48%; N 10,61%; Gd 20,02%.

e) Gadolinium-Komplex von 10-[7-(4-Isothiocyanato phenyl)-2-hydroxy-5-oxa-7-(carboxymethyl)-4- aza-heptyl]-1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10- tetraazacyclododecan

15 g (19,26 mmol) der nach Beispiel 8d) erhaltenen Verbindung werden in 100 ml Wasser gelöst und 6,64 g (57,8 mmol) Thiophosgen in 50 ml Chloroform zugegeben. Man rührt 1 Stunde bei 50°C. Man kühlt auf Raumtemperatur, trennt die organische Phase ab und schüttelt die wäßrige Phase zweimal mit 100 ml Chloroform aus. Die wäßrige Phase wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 100 ml Isopro panol bei Raumtemperatur ausgerührt. Der Feststoff wird abfiltriert und mit Ether gewaschen. Nach Trocknen über Nacht im Vakuum (40°C) erhält man 15,9 g (98% d. Th.) eines cremefarbenen Feststoffes.
Wassergehalt: 3,5%
Analyse (bezogen auf wasserfreie Substanz):
ber.:
C 42,43%; H 4,79%; N 10,24%; Gd 19,15%; S 3,91%;
gef.:
C 42,23%; H 4,90%; N 10,05%; Gd 19,01%; S 3,96%.

f) Konjugation des Oligonucleotids 8a) mit dem Gadolinium-Isothiocyanatkomplex aus Beispiel 8e) zum Thioharnstoffkonjugat 8f)

8 mg des wie oben beschrieben erhaltenen Oligonucleotids 8a) werden in 2,5 ml einer Mischung von 1 M NaHCO₃/Na₂CO₃ (pH 9,0) gelöst und mit 1 mg des Gadolinium-Komplexes von 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxy methyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10- tetraazacyclododecan 8e) versetzt. Man rührt 20 Stunden bei Raumtemperatur, stellt den pH durch Zugabe von 0,01 M Salzsäure auf 7,2 ein und unterwirft die Lösung einer Ultrafiltration durch eine Membran mit der Ausschlußgrenze 3000 (Amicon YM3) und anschließend einer Gefriertrocknung. Man erhält 7 mg des gewünschten Konjugats 8f).

Beispiel 9 a) 35mer-Oligonucleotid 5′-(U′)₅CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3′, U′=5-[N- (6-Aminohexyl)-3-(E)-acrylamido]-2′-desoxyuridin

Das nach dem SELEX-Verfahren identifizierte 30mer-Oligonucleotid 5′-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3′ wird in üblicher Weise in einem Syntheseautomaten der Fa. Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, (1991)), wobei sich das Oligonucleotid noch auf der Säule des festen Trägers befindet. Durch Reaktion mit Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan wird die 5′-Hydroxygruppe freigelegt. Die Beladung der Säule beträgt ca. 10 mg des 30mer-Oligonucleotids.

Entsprechend den Standardmethoden der Synthese von Oligonucleotiden (siehe F. Eckstein) wird 5′-O-Dimethoxytrityl-5-[N-(6-trifluoracetylaminohexyl)- 3(E)-acrylamido]-2′-deoxyuridin-3′-β-cyanoethyl-N,N- diisopropyl-phosphoramidit (siehe F. Eckstein, Seite 264) fünfmal nacheinander an das auf dem Träger befindliche 30mer-Oligonucleotid angeknüpft. Die Oxidation des gebildeten Phosphits zum voll geschützten Phosphotriester erfolgt mit Jod in Tetrahydrofuran. Anschließend wird die Säule nacheinander mit Methanol und Wasser gewaschen; durch Reaktion mit Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan wird die 5′-Hydroxylgruppe freigelegt. Zur Ablösung des modifizierten Oligonucleotids vom festen Träger überführt man den Inhalt der Säule in ein Multivial, versetzt mit 5 ml 30%iger Ammoniaklösung, verschließt das Gefäß und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt dann auf 0°C, zentrifugiert, wäscht den Träger mit 5 ml Wasser und unterwirft die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung.

Man erhält 8 mg des modifizierten Oligonucleotids 9a) als weißes Pulver.

b) Konjugation des Oligonucleotids 9a) mit dem Gadolinium-Isothiocyanatkomplex aus Beispiel 8e) zum Pentagadoliniumkomplex-Thioharnstoffkonjugat

8 mg des wie oben beschrieben erhaltenen Oligonucleotids 9a) werden in 2,5 ml einer Mischung von 1 M NaHCO₃/Na₂CO₃ (pH 9,0) gelöst und mit 3 mg des Gadoliniumkomplexes von 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxy methyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10- tetraazacyclododecan 8e) versetzt. Man rührt 20 Stunden bei Raumtemperatur, stellt den pH durch Zugabe von 0,01 M Salzsäure auf 7,2 ein und unterwirft die Lösung einer Ultrafiltration durch eine Membran mit der Ausschlußgrenze 3000 (Amicon YM3) und anschließend einer Gefriertrocknung. Man erhält 7 mg des gewünschten Konjugats 9b).

Beispiel 10 a) 5′-(8-Amino-3,6-dioxa-octyl-1-phosphorsäureester) des 30mer-Oligonucleotids 5′-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3′

Man verfährt wie in Beispiel 8a) beschrieben, verwendet aber anstelle von β-Cyano-ethyl-N,N-diisopropylamino- (3,6,9-trioxa-11-phthalimido-1-undecyl)-phosphoramidit das β-Cyano-ethyl-N,N-diisopropylamino-(3,6-dioxa-8-trifluor acetylamido-1-octyl-phosphoramidit und erhält das modifizierte Oligonucleotid 10a).

b) Konjugation des Oligonucleotids 10a) mit Gadolinium-DTPA

5 mg der Verbindung 10a) werden in 0,5 ml wäßriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gelöst und im Eisbad mit 10 mg Diethylentriamin-pentaessigsäure-bis-anhydrid 2 Stunden gerührt. Durch Zugabe von 0,01 M Salzsäurelösung wird auf pH 7 eingestellt. Man unterwirft die Lösung einer Ultrafiltration durch eine Membran mit der Ausschlußgrenze 3 000 (Amicon YM3) und anschließend einer Gefriertrocknung. Die weitere Reinigung erfolgt durch Gel-Elektrophorese an einem 20%-Polyacrylamid-Gel. Zur Komplexierung versetzt man die gereinigte Lösung mit 1 mg Gadoliniumacetat, rührt 10 Minuten bei Raumtemperatur und führt eine weitere Ultrafiltration durch. Die Isolierung der Substanz erfolgt durch Gefriertrocknung. Man erhält 3 mg der Verbindung 10b).

Beispiel 11 a) 31mer-Oligonucleotid 5′-U′′-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3′, U′′=5-[N-(3,6- Dioxa-8-amino-1-octyl)-3(E)-acrylamido]-2′- desoxyuridin

Entsprechend den Standardmethoden der Synthese von Oligonucleotiden (siehe F. Eckstein) wird 5′-O-Dimethoxytrityl-5-[-(3,6-dioxa-8-trifluoracetylamido- 1-octyl)-3(E)-acrylamido]-2′-deoxyuridin-3′-β-cyanoethyl- N,N-diisopropyl-phosphoramidit (hergestellt in Analogie zu Nucl. Acids. Res. 16, 6115-6128 (1986)) an das auf dem Träger befindliche 30mer-Oligonucleotid angeknüpft. Die Oxidation des gebildeten Phosphits zum voll geschützten Phosphotriester erfolgt mit Jod in Tetrahydrofuran. Anschließend wird die Säule nacheinander mit Methanol und Wasser gewaschen. Durch Reaktion mit Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan wird die 5′-Hydroxygruppe freigelegt.

Zur Ablösung des modifizierten Oligonucleotids vom festen Träger überführt man den Inhalt der Säule in ein Multivial, versetzt mit 5 ml 30%iger Ammoniaklösung, verschließt das Gefäß und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt dann auf 0°C, zentrifugiert, wäscht den Träger mit 5 ml Wasser und unterwirft die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung.

Man erhält 12 mg des modifizierten Oligonucleotids 11a) als weißes Pulver.

b) Konjugation des Oligonucleotids 11a) mit dem Gadolinium-Isothiocyanatkomplex 8e) zum Thioharnstoffkonjugat 11b)

10 mg des so erhaltenen Oligonucleotids 11a) werden in 2,5 ml einer Mischung von 1 M NaHCO₃/Na₂CO₃ (pH 9,0) gelöst und mit 1 mg des Gadoliniumkomplexes von 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7- (carboxymethyl)-4-azaheptyl]-1,4,7-tris(carboxymethyl)- 1,4,7,10-tetraazacyclododecan 8e) versetzt. Man rührt 20 Stunden bei Raumtemperatur, stellt den pH durch Zugabe von 0,01 M Salzsäure auf 7,2 ein und unterwirft die Lösung einer Ultrafiltration durch eine Membran mit der Ausschlußgrenze 3000 (Amicon YM3) und anschließend einer Gefriertrocknung.

Man erhält 8 mg des gewünschten Konjugats 11b).

Claims

1. Oligonucleotid-Konjugate bestehend aus einem Oligonucleotid-Rest N und n Substituenten (B-K), worin B für eine direkte Bindung oder eine Verbindungskomponente zum Oligonucleotid-Rest steht und K ein Komplexbildner oder Komplex von Elementen der Ordnungszahlen 21-29, 42, 44 oder 58-70 bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß der Oligonucleotid-Rest N eine Modifikation aufweist, die den Abbau durch natürlich vorkommende Nucleasen verhindert oder wenigstens wesentlich hemmt.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung die allgemeine Formel N-(B-K)_n (I)aufweist, worin N ein Oligonucleotid ist, das spezifisch mit hoher Bindungsaffinität an Zielstrukturen mit Ausnahme von Nucleinsäuren bindet und Modifikationen aufweist, die den Abbau durch natürlich vorkommende Nucleasen wesentlich vermindern,
B eine chemische Bindung oder eine Verbindungskomponente ist, die die Verbindung zwischen N und K herstellt und K ein komplexbildender Ligand ist, der mindestens ein Element der in Anspruch 1 genannten Ordnungszahl aufweist und n eine Zahl zwischen 1 und 30 ist.

3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin N ein Oligonucleotid mit 5 bis 200 Nucleotiden ist, das dadurch gegen Abbau stabilisiert ist, daß

a) die Hydroxylgruppe an der 2′-Position der Ribose einheit ersetzt ist durch eine Gruppe -OR, worin R ein Alkylrest mit 1 bis 20 C-Atomen ist, oder durch einen Halogenrest, ein Wasserstoffatom oder einen Amin-Rest und/oder
b) bei der der Internucleotidbindung dienenden Phospho diesterbrücke 1 oder 2 Sauerstoffatome durch 1 oder 2 Schwefelatome ersetzt sind, wodurch Phosphorthioate bzw. Phosphordithioate gebildet werden und/oder
c) die der Internucleotidbindung dienende Phosphodiester brücke durch Alkylphosphonate ersetzt ist.

4. Verbindung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Olignucleotid N 15 bis 100 Nucleotide umfaßt.

5. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß N ein Oligonucleotid ist, das spezifisch mit hoher Bindungsaffinität an andere Zielstrukturen bindet und das dadurch erhältlich ist, daß eine Zufallssequenzen enthaltende Mischung von Oligonucleotiden mit der Zielstruktur zusammengebracht wird, wobei bestimmte Oligonucleotide eine erhöhte Affinität zu der Zielstruktur im Verhältnis zu der Mischung der Oligonucleotide aufweisen, diese von dem Rest der Oligonucleotidmischung abgetrennt werden, dann die Oligonucleotide mit erhöhter Affinität zu der Zielstruktur amplifiziert werden, um eine Mischung von Oligonucleotiden zu erhalten, die einen erhöhten Anteil an Oligonucleotiden aufweist, die an die Zielstrukturen binden.

6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß N ein Oligonucleotid ist, das spezifisch mit hoher Bindungsaffinität an andere Zielstrukturen mit Ausnahme von Nucleinsäuren bindet und das dadurch erhältlich ist, daß

a) zunächst ein DNA-Strang durch chemische Synthese derart hergestellt wird, daß dieser DNA-Strang am 3′-Ende eine definierte Sequenz aufweist, die komplementär zu einem Promoter für eine RNA-Polymerase ist und zugleich komplementär zu einem Primer der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist und, daß dieser DNA-Strang am 5′-Ende eine definierte DNA-Sequenz aufweist, die komplementär zu einer Primersequenz für die Polymerase-Kettenreaktion ist, wobei die Sequenz zwischen den definierten Sequenzen eine Zufallssequenz enthält und, daß
b) dieser DNA-Strang mit Hilfe einer RNA-Polymerase in einen komplementären RNA-Strang umgeschrieben wird, wobei der Polymerase Nucleotide angeboten werden, die an der 2′-Position der Riboseeinheit modifiziert sind und, daß
c) die auf diese Weise hergestellten RNA-Oligonucleotide mit der Zielstruktur, an die das Oligonucleotid spezifisch binden soll, zusammengebracht werden und, daß
d) diejenigen Oligonucleotide, die an die Zielstruktur gebunden haben, zuerst zusammen mit der Zielstruktur von den nicht bindenden Oligonucleotiden abgetrennt werden und dann die gebundenen Oligonucleotide von der Zielstruktur wieder abgetrennt werden und, daß
e) diese Zielstruktur-spezifischen RNA-Oligonucleotide mit Hilfe der Reversen Transkriptase in einen komplementären DNA-Strang umgeschrieben werden und, daß
f) diese DNA-Stränge unter Verwendung der definierten Primersequenzen mit der Polymerase Kettenreaktion amplifiziert werden und, daß
g) die auf diese Art und Weise amplifizierten DNA-Oligonucleotide dann wieder mit Hilfe der RNA-Polymerase und mit modifizierten Nucleotiden in RNA-Oligonucleotide umgeschrieben werden und, daß
h) die oben genannten Selektionsschritte c) bis g) gegebenenfalls so oft wiederholt werden, bis die Oligonucleotide, die durch eine hohe Bindungsaffinität zu der Zielstruktur charakterisiert sind, hinreichend selektioniert sind und anschließend die Sequenzen der so erhaltenen Oligonucleotide gegebenenfalls bestimmt werden können.

7. Verbindung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielstruktur ausgewählt ist unter Makromolekülen, Gewebestrukturen von höheren Organismen wie Tieren oder Menschen, Organen oder Teilen von Organen eines Tieres oder des Menschen, Zellen, Tumorzellen oder Tumoren.

8. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungskomponente B

a) an das 4′-Ende des in der 4′-Position um die CH₂-OH-Gruppe verminderten Oligonucleotid-Rests N,
b) an das 3′-Ende des in der 3′-Position um ein Wasser stoffatom verminderten Oligonucleotid-Rests N,
c) an die um die OH-Gruppe(n) verminderte(n) Phospho diesterbrücke(n) zwischen jeweils zwei Nucleotiden und/oder
d) an 1 bis 30 Nucleobase(n), die jeweils in der/den Position(en) 5, 8 und/oder der Aminogruppe(n) der Position(en) 2, 4 und 6 um ein Wasserstoffatom ver mindert ist (sind),

gebunden ist (sind).

9. Verbindung nach Anspruch 8a) oder 8b), dadurch gekennzeichnet, daß B die allgemeine Formel X-Y-Z¹ hat, die X-seitig mit dem Komplexbildner oder Komplex und Z-seitig mit dem Nucleotid verbunden ist, worin X für eine direkte Bindung, eine -NH- oder -S-Gruppe steht,
Y für eine gerad-, verzweigtkettige, gesättigte oder ungesättigte C₁-C₂₀-Alkylenkette steht, die gegebe nenfalls 1-2 Cyclohexylen-, 1-5 Imino-, 1-3 Phenylen-, 1-3 Phenylenimino-, 1-3 Phenylenoxy-, 1-3 Hydroxyphe nylen-, 1-5 Amido-, 1-2 Hydrazido-, 1-5 Carbonyl-, 1-5 Ethylenoxy-, eine Ureido-, eine Thioureido-, 1-2 Carboxyalkylimino-, 1-2 Estergruppen, 1-3 Gruppen Ar, worin Ar für einen gesättigten oder ungesättigten 5- oder 6-Ring steht, der gegebenenfalls 1-2 Heteroatome ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel und/oder 1-2 Carbonylgruppen enthält, 1-10 Sauer stoff-, 1-5 Stickstoff- und/oder 1-5 Schwefelatome enthält und/oder gegebenenfalls durch 1-5 Hydroxy-, 1-2 Mercapto-, 1-5 Oxo-, 1-5 Thioxo-, 1-3 Carboxy-, 1-5 Carboxy-C₁-C₄-alkyl-, 1-5 Ester-, 1-3 Amino-, 1-3 Hydroxy-C₁-C₄-alkyl-, 1-3 C₁-C₇-Alkoxygruppen substituiert ist und
Z¹ für -CONH-CH₂-4′, -NH-CO-4′, -O-P(O)R¹-NH-CH₂-4′, -O-P(O)R¹-O-CH₂-4′ oder -O-P(O)R¹-3′ worin 4′ bzw. 3′ die Verknüpfung an die endständige(n) Zuckereinheit(en) angibt und R¹ für O⁻, S⁻, eine C₁-C₄-Alkyl- oder NR²R³-Gruppe mit R² und R³ in der Bedeutung von Wasserstoff und C₁-C₄-Alkylresten stehen.

10. Verbindung nach Anspruch 8c), dadurch gekennzeichnet, daß B die allgemeine Formel X-Y-Z² hat, wobei
Z² in der zwei benachbarte Zuckereinheiten verknüpfenden Brücke für die Gruppe -NR²-, -O- oder -S- steht und X, Y und R² die in Anspruch 9 angegebene Bedeutung haben.

11. Verbindung nach Anspruch 8d), dadurch gekennzeichnet, daß B die allgemeine Formel X-Y-Z³ hat, wobei Z³ für eine -NH-Gruppe an der oder eine direkte Bindung zur Nucleobase steht und X und Y die in Anspruch 9 angegebene Bedeutung haben.

12. Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß der Metallkomplex als bildgebendes Element Gadolinium, Mangan oder Eisen enthält.

13. Verfahren zum Nachweis einer Zielstruktur dadurch gekennzeichnet, daß man eine oder mehrere der Verbindungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit der zu untersuchenden Probe in vivo oder in vitro zusammenbringt und anhand des Signales nachweist, ob die Zielstruktur, an die das Oligonucleotid N spezifisch und mit hoher Bindungsaffinität bindet, in der Probe vorhanden ist.

14. Verfahren zur nicht-invasiven Diagnostik von Krankheiten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine oder mehrere der Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 12 mit der zu untersuchenden Zielstruktur in vivo zusammenbringt und anhand des Signales nachweist, ob die Zielstruktur, an die das Oligonucleotid N spezifisch bindet, in dem zu untersuchenden Organismus vorhanden ist.