DE69532958T2

DE69532958T2 - Konjugate aus metallkomplexen und oligonukleotiden

Info

Publication number: DE69532958T2
Application number: DE69532958T
Authority: DE
Inventors: Ludger Dinkelborg; Christoph-Stephan Hilger; Ulrich Niedballa; Johannes Platzek; Bernd Radüchel; Ulrich Speck; Larry Gold; Wolfgang Pieken
Original assignee: Bayer Schering Pharma AG; Nexstar Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Bayer Pharma AG; Nexstar Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1994-07-14
Filing date: 1995-06-30
Publication date: 2009-04-09
Anticipated expiration: 2015-07-01
Also published as: CA2194558A1; PL318147A1; CN1219551C; EP0777498B1; CN1152879A; NO970141L; NZ289831A; HUT76329A; ATE265229T1; EP0777498A1; SK2897A3; KR100366525B1; KR970704471A; JP2009197024A; HU220859B1; IL114237A; CZ295930B6; DE69532958D1; WO1996002274A1; SK284598B6

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den in den Ansprüchen charakterisierten Gegenstand, d. h. Oligonucleotid-Konjugate, die einen Komplexbildner oder einen Komplex enthalten. Diese Konjugate finden in den Gebieten der Diagnose und Behandlung Verwendung.
In den letzten Jahrzehnten hat die bildgebende Diagnostik große Fortschritte gemacht, und sie erfährt eine ständige Weiterentwicklung. Es ist mittlerweile möglich, das Gefäßsystem, die meisten Organe und viele Gewebe im lebenden Körper ohne größere Eingriffe sichtbar zu machen. In vielen Fällen werden Krankheiten diagnostiziert, da sie zu eindeutigen Veränderungen der Gestalt, der Größe und der Lage anatomischer Strukturen im Körper führen. Solche anatomischen Daten aus dem Inneren des Körpers lassen sich durch Röntgenverfahren, Ultraschalldiagnose und die magnetische Resonanztomographie erhalten. Die Effizienz dieser obenerwähnten Technologien läßt sich jeweils durch die Verwendung pharmazeutischer Mittel zur Verstärkung der natürlichen Kontraste der Gewebe und Körperflüssigkeiten in dem erhaltenen Bild verbessern. Die betreffenden pharmazeutischen Mittel werden in Körperhöhlen eingebracht oder in Blutgefäße injiziert, mit der Absicht, den Kontrast der Höhlen bzw. Gefäße zu verändern. Darüber hinaus werden sie durch den Blutstrom im Organismus verteilt und können die Sichtbarkeit von Organen und Geweben verändern. In Ausnahmefällen werden diese Substanzen an bestimmte Strukturen im Körper gebunden und/oder aktiv transportiert und/oder durch letztere ausgeschieden. Auf diese Weise lassen sich in Einzelfällen auch Funktionen sichtbar machen und zur Diagnose von Krankheiten verwenden.
Im Gegensatz dazu basiert die Nukleardiagnose auf Substanzen, die selbst sichtbar gemacht werden können. In diesem Fall werden radioaktive Isotopen, die weitreichende Strahlung emittieren, in den Körper eingebracht. Die Ausbreitung dieser Substanzen im Organismus läßt sich durch geeignete Detektoren verfolgen. Der Vorteil der nuklearmedizinischen Vorgehensweise ist die hohe Effektivität bei einer niedrigen Dosierung der als radiopharmazeutische Mittel bezeichneten signalübertragenden radioaktiven Substanzen.
Verwendet man Isotope, die α- oder β-Strahlung oder andere toxische, im Gewebe wirksame Zerfallsprodukte abgeben, so lassen sich radiopharmazeutische Mittel auch für therapeutische Zwecke, z. B. für die Zerstörung von Tumoren, einsetzen. Dasselbe Ziel läßt sich auch erreichen, indem man unschädliche Isotopen bzw. Substanzen in den Körper einbringt und erst dort beispielsweise durch Neutronen- oder Röntgenstrahlung, durch Ultraschall oder Radiowellen in eine therapeutisch wirksame Form umwandelt.
Ein allgemeines Problem ist die Diagnose und Lokalisierung von pathologischen Veränderungen zu einem Zeitpunkt, zu dem noch keine Veränderungen in der Gestalt, der Struktur und der Durchblutung der fraglichen Organe und Gewebe auszumachen sind. Eine solche Diagnose und Nachuntersuchung ist von entscheidender Wichtigkeit, beispielsweise im Fall von Tumorerkrankungen einschließlich der Suche nach Metastasen, der Untersuchung von Geweben auf eine unzureichende Sauerstoffversorgung sowie im Fall bestimmter Infektionen sowie Stoffwechselerkrankungen.
Die mittlerweile zur Verfügung stehenden therapeutischen und bildgebenden diagnostischen Verfahren beruhen in beträchtlichem Maße auf der Verfügbarkeit von pharmazeutischen Zubereitungen, die sich an Stellen anderweitig nicht nachweisbarer pathologischer Veränderungen anreichern.
Bei den heutzutage kommerziell erhältlichen Kontrastmedien handelt es sich zum größten Teil um sogenannte nichtspezifische Zubereitungen. Sie breiten sich in den Räumen, in die sie beispielsweise durch Injektion eingebracht werden, passiv aus.
In der Vergangenheit wurden viele Substanzen und Substanzklassen identifiziert, die sich nachweisen lassen bzw. von denen erwartet werden kann, daß sie hinsichtlich ihrer Ausbreitung im lebenden Organismus Spezifität zeigen. Beispiele hierfür sind neben den Antikörpern, Lectine, alle Arten von rezeptorgebundenen Substanzen, Zellen, Membranen und Membrankomponenten, Nucleinsäuren, natürliche Stoffwechselprodukte und deren Derivate sowie unzählige pharmazeutische Substanzen. Mit besonderer Aufmerksamkeit wurden und werden auch Peptide untersucht.
Das US-Patent Nr. 4,707,352 betrifft ein spezielles Verfahren zur Markierung komplexbildender Moleküle mit radioaktiven Isotopen, es werden jedoch keine gut geeigneten Komplexbildner für die Bindung von Metallionen beschrieben.
In EP-A-0 285 057 werden Konjugate aus Nucleotiden und Komplexbildnern beschrieben, die sich jedoch unter anderem aufgrund der Instabilität der verwendeten Nucleotide in vivo nicht für eine Verwendung als in-vivo-Diagnostika bzw. -Therapeutika eignen und auch die anderen Anforderungen hinsichtlich Kompatibilität und Pharmakokinetik kaum erfüllen.
Viele US-Patente wie beispielsweise das US-Patent Nr. 4,707,440 betreffen modifizierte Polymere, die eine nachweisbare chemische Gruppe enthalten. Bei den Polymeren kann es sich um Polynucleotide und Oligonucleotide handeln, sie sind jedoch weder gegen einen Abbau durch natürlich vorkommende Nucleasen stabilisiert noch durch ein spezielles Verfahren ausge wählt, mit dem sichergestellt wird, daß sie sich spezifisch mit hoher Bindungsaffinität an Zielstrukturen binden. Spezielle Ausführungsformen dieser nachweisbaren Moleküle sind in den US-Patenten Nr. 4,843,122 und 4,943,523 erwähnt. Ein auf diese Art modifiziertes individuelles Nucleotid wird im US-Patent Nr. 4,952,685 beansprucht. Die Verwendung dieser Mittel bei bildgebenden Verfahren ist im US-Patent Nr. 4,849,208 offenbart.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, spezifisch bindende diagnostische Mittel für den Nachweis von Zielstrukturen bereitzustellen, mit denen beispielsweise Organe, Gewebe und deren pathologische Veränderungen in vitro und in vivo sichtbar gemacht werden können.
Es wurde nun herausgefunden, daß diese Aufgabe durch Oligonucleotid-Konjugate gelöst wird, die zusätzlich zu einem Oligonucleotid-Rest einen Komplexbildner aufweisen, der über eine direkte Bindung oder eine Verbindungskomponente gebunden ist, wobei der Oligonucleotid-Rest so modifiziert ist, daß ein Abbau durch natürlich vorkommende Nucleasen verhindert oder wenigstens wesentlich reduziert wird.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist folgendes:
Oligonucleotid-Konjugate, bestehend aus einem Oligonucleotid-Rest N und n Substituenten (B-K), wobei die Verbindung die allgemeine Formel (I) N-(B-K)_n (I)aufweist, worin N ein Oligonucleotid mit 15 bis 100 Nucleotiden ist, das spezifisch mit hoher Bindungsaffinität an andere Zielstrukturen bindet und Modifikationen aufweist, die den Abbau durch natürlich vorkommende Nucleasen verhindern oder wenigstens wesentlich reduzieren,
B eine chemische Bindung oder eine Verbindungskomponente zum Oligonucleotid-Rest ist, die die Verbindung zwischen N und K herstellt, und K ein Komplexbildner oder ein Komplex radioaktiver Metallisotopen oder stabiler Isotopen ist, die

– durch Strahlung von außen in radioaktive Isotope umgewandelt werden,
– Strahlung von außen in Strahlung anderer Qualität, anderen Energiegehalts und/oder anderer Wellenlänge umwandeln, der Elemente der Ordnungszahlen 5, 21–29, 31, 39, 42–44, 49, 57–83 oder 85, n eine Zahl zwischen 1 und 10 ist, dadurch gekennzeichnet, daß
a) die 2'-Position der Zuckereinheit unabhängig voneinander mit folgenden Gruppen besetzt ist: einer Gruppe -OR, worin R einen Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls bis zu zwei Hydroxylgruppen enthält und gegebenenfalls durch 1 – 5 Sauerstoffatome unterbrochen ist, bedeutet, einem Wasserstoffatom, einer Hydroxylgruppe, einem Fluoratom, einem Aminrest, einer Aminogruppe, und in den terminalen Positionen 3' und 5' vorhandene Hydroxylgruppen unabhängig voneinander gegebenenfalls mit dem Rest R verethert sind und/oder
b) die gegebenenfalls als Internucleotidbindung dienenden Phosphodiester unabhängig voneinander durch Phosphorothioate, Phosphorodithioate oder Alkylphosphonate, bevorzugt Methylphosphonat, ersetzt sind, und/oder
c) die terminalen Reste in den Positionen 3' und 5' durch eine wie in b) beschriebene Internucleotidbindung intramolekular miteinander verknüpft sind und/oder
d) es eine wie in b) beschriebene Internucleotidbindung enthält, die die Positionen 3'-3' oder 5'-5' verknüpft und/oder
e) es eine wie in b) beschriebene Phosphodiesterbindung enthält, die zwei Thymidine über jeweils einen in der 3-Stellung befindlichen C₂-C₁₀-Hydroxyalkylrest esterartig verbindet oder einen analog substituierten Thymidinrest esterartig mit einer Hydroxylgruppe eines anderen Zuckers in den Positionen 2' oder 3' oder 5' verbindet und/oder
f) die terminalen Reste in den Positionen 3' und 5' gegebenenfalls wie in b) beschrieben modifizierte Internucleotidbindungen enthalten.

Bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Verbindungen, in denen N für ein Oligonucleotid steht, das spezifisch mit hoher Bindungsaffinität an andere Zielstrukturen bindet und dadurch erhältlich ist, daß eine Zufallssequenzen enthaltende Mischung von Oligonucleotiden mit der Zielstruktur zusammengebracht wird, wobei bestimmte Oligonucleotide eine erhöhte Affinität zu der Zielstruktur im Verhältnis zu der Mischung der Oligonucleotide aufweisen, diese von dem Rest der Oligonucleotidmischung abgetrennt werden, dann die Oligonucleotide mit erhöhter Affinität zu der Zielstruktur amplifiziert werden, wodurch man eine Mischung von Oligonucleotiden erhält, die einen erhöhten Anteil an Oligonucleotiden aufweist, die an die Zielstrukturen binden.
Besonders bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Verbindungen, in denen N für ein Oligonucleotid steht, das spezifisch mit hoher Bindungsaffinität an andere Zielstrukturen bindet und das dadurch erhältlich ist, daß

a) zunächst ein DNA-Strang durch chemische Synthese derart hergestellt wird, daß dieser DNA-Strang am 3'-Ende eine definierte Sequenz aufweist, die komplementär zu einem Promoter für eine RNA-Polymerase ist und zugleich komplementär zu einem Primer der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist, und daß dieser DNA-Strang am 5'-Ende eine definierte DNA-Sequenz aufweist, die komplementär zu einer Primersequenz für die Polymerase-Kettenreaktion ist, wobei die Sequenz zwischen den definierten Sequenzen eine Zufallssequenz enthält, und daß
b) dieser DNA-Strang mit Hilfe einer RNA-Polymerase in einem komplementären RNA-Strang umgeschrieben wird, wobei der Polymerase Nucleotide angeboten werden, die an der 2'-Position der Riboseeinheit modifiziert sind, und daß
c) die auf diese Weise hergestellten RNA-Oligonucleotide mit der Zielstruktur, an die das Oligonucleotid spezifisch binden soll, zusammengebracht werden, und daß
d) diejenigen Oligonucleotide, die an die Zielstruktur gebunden haben, zuerst zusammen mit der Zielstruktur von den nichtbindenden Oligonucleotiden abgetrennt werden und dann die gebundenen Oligonucleotide von der Zielstruktur wieder abgetrennt werden, und daß
e) diese zielstrukturspezifischen RNA-Oligonucleotide mit Hilfe der reversen Transkriptase in einem komplementären DNA-Strang umgeschrieben werden, und daß
f) diese DNA-Stränge unter Verwendung der hier definierten Primersequenzen mit der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert werden, und daß
g) die auf diese Art und Weise amplifizierten DNA-Oligonucleotide dann wieder mit Hilfe der RNA-Polymerase und mit modifizierten Nucleotiden in RNA-Oligonucleotide umgeschrieben werden, und daß
h) die obengenannten Selektionsschritte c) bis g) gegebenenfalls so oft wiederholt werden, bis die Oligonucleotide, die durch eine hohe Bindungsaffinität zu der Zielstruktur charakterisiert sind, hinreichend selektioniert sind und anschließend die Sequenzen der so erhaltenen Oligonucleotide gegebenenfalls bestimmt werden können.

Besonders bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Verbindungen, bei denen die Zielstruktur ausgewählt ist unter Makromolekülen, Gewebestrukturen von höheren Organismen, wie Tieren oder Menschen, Organen oder Teilen von Organen eines Tieres oder eines Menschen, Zellen, Tumorzellen oder Tumoren.
Substanzen, in denen die Verbindungskomponente(n) B

*a) an das 4'-Ende des in der 4'-Position um die CH₂-OH-Gruppe verminderten Oligonucleotid-Restes N und/oder
*b) an das 3'-Ende des in der 3'-Position um ein Wasserstoffatom verminderten Oligonucleotid-Restes N und/oder
*c) an die um die OH-Gruppe(n) verminderte(n) Phosphodiesterbrücke(n) zwischen jeweils zwei Nucleotiden und/oder
*d) an 1 bis 10 Nucleobase(n), die jeweils in der/den Position(en) 5, 8 und/oder der/den Aminogruppe(n) der Position(en) 2, 4 und 6 um ein Wasserstoffatom vermindert ist (sind),

Besonders bevorzugt sind die oben unter *a) oder *b) beschriebenen erfindungsgemäßen Verbindungen, in denen B die allgemeine Formel X-Y-Z¹ hat, die X-seitig mit dem Komplexbildner oder Komplex und Z-seitig mit dem Oligonucleotid verbunden ist, worin
X für eine direkte Bindung, eine -NH- oder -S-Gruppe steht,
Y für eine geradkettige, verzweigte, gesättigte oder ungesättigte C₁-C₂₀-Alkylenkette steht, die gegebenenfalls 1-2 Cyclohexylen-, 1-5 Imino-, 1-3 Phenylen-, 1-3 Phenylenimino-, 1-3 Phenylenoxy-, 1-3 Hydroxyphenylen-, 1-5 Amido-, 1-2 Hydrazido-, 1-5 Carbonyl-, 1-5 Ethylenoxy-, eine Ureido-, eine Thioureido-, 1-2 Carboxyalkylimino-, 1-2 Estergruppen, 1-3 Gruppen Ar, worin Ar für einen gesättigten oder ungesättigten 5- oder 6gliedrigen Ring steht, der gegebenenfalls 1-2 Heteroatome ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel und/oder 1-2 Carbonylgruppen enthält, 1-10 Sauerstoff-, 1-5 Stickstoff- und/oder 1-5 Schwefelatome enthält und/oder gegebenenfalls durch 1-5 Hydroxy-, 1-2 Mercapto-, 1-5 Oxo-, 1-5 Thioxo-, 1-3 Carboxy-, 1-5 Carboxy-C₁-C₄-alkyl-, 1-5 Ester-, 1-3 Amino-, 1-3 Hydroxy-C₁-C₄-alkyl-, 1-3 C₁-C₇-Alkoxygruppen substituiert ist, und
Z¹ für -CONH-CH₂-4', -NH-CO-4', -O-P(O)R¹-NH-CH₂-4', -O-P(O)R¹-O-CH₂-4', -O-P(S)R¹-O-3' oder -O-P(O)R¹-O-3' steht, worin 4' bzw. 3' die Verknüpfung an die endständige (n) Zuckereinheit(en) angibt und R¹ für O^–, S^–, eine C₁-C₄-Alkyl- oder NR²R³-Gruppe steht, mit R² und R³ in der Bedeutung von Wasserstoff und C₁-C₄-Alkylresten.
Als cyclische Strukturen (Ar) eignen sich insbesondere cyclische gesättigte oder ungesättigte Alkylene mit 3 bis 6, insbesondere 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls Heteroatome wie N, S oder O enthalten. Als Beispiele können Cyclopentylen-, Pyrrolylen-, Furanylen-, Thiophenylen-, Imidazolylen-, Oxazolyliden-, Thiazolylen-, Pyrazolylen-, Pyrrolidylen-, Pyridylen-, Pyrimidylen-, Maleinimidylen- und Phthalimidylengruppen angeführt werden.
Weiterhin sind oben unter *c) beschriebene Verbindungen gemeint, in denen B die allgemeine Formel X-Y-Z² hat, die X-seitig mit dem Komplexbildner oder Komplex und 2-seitig mit dem Oligonucleotid verbunden ist, wobei
Z² in der zwei benachbarte Zuckereinheiten verknüpfenden Brücke
für die Gruppe -NR²-, -O- oder -S- steht,
X für eine direkte Bindung, eine -NH- oder -S-Gruppe steht,
Y für eine geradkettige, verzweigte, gesättigte oder ungesättigte C₁-C₂₀-Alkylenkette steht, die gegebenenfalls 1-2 Cyclohexylen-, 1-5 Imino-, 1-3 Phenylen-, 1-3 Phenylenimino-, 1-3 Phenylenoxy-, 1-3 Hydroxyphenylen-, 1-5 Amido-, 1-2 Hydrazido-, 1-5 Carbonyl-, 1-5 Ethylenoxy-, eine Ureido-, eine Thioureido-, 1-2 Carboxyalkylimino-, 1-2 Estergruppen, 1-3 Gruppen Ar, worin Ar für einen gesättigten oder ungesättigten 5- oder 6gliedrigen Ring steht, der gegebenenfalls 1-2 Heteroatome ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel und/oder 1-2 Carbonylgruppen enthält, 1-10 Sauerstoff-, 1-5 Stickstoff- und/oder 1-5 Schwefelatome enthält und/oder gegebenenfalls durch 1-5 Hydroxy-, 1-2 Mercapto-, 1-5 Oxo-, 1-5 Thioxo-, 1-3 Carboxy-, 1-5 Carboxy-C₁-C₄-alkyl-, 1-5 Ester-, 1-3 Amino-, 1-3 Hydroxy-C₁-C₄-alkyl-, 1-3 C₁-C₇-Alkoxygruppen substituiert ist und
R² für Wasserstoff oder C₁-C₄-Alkylreste steht.
Als Reste Y der Verbindungskomponente Z¹-Y-X (gemäß Punkt 6) bzw. Z²-Y-X (gemäß Punkt 7) können beispielsweise die Reste -(CH₂)₆-NH-CS-NH-C₆H₄-CH(CH₂CO₂H)-CH₂-CO-NH-CH₂-CH(OH)-CH₂-, -(CH₂)₆-NH-CS-NH-C₆H₄-CH₂-, -(CH₂)₆-NH-CO-CH₂-, -(CH₂)₆-NH-CO-CH₂-CH₂-, -(CH₂)₂-, -(CH₂)₆-, -(CH₂)₆-S-(CH₂)₂-, -(CH₂)₆-S-(CH₂)₆-, -(CH₂)₂-NH-CO-, -(CH₂)₆-NH-CO-, -(CH₂)₆-S-(CH₂)-NH-CO, -(CH₂)₆-S-(CH₂)₆-NH-CO,
erwähnt werden.
Besonders bevorzugt sind die oben unter *d) beschriebenen erfindungsgemäßen Verbindungen, in denen B die allgemeine Formel X-Y-Z³ hat, wobei Z³ für eine -NH-Gruppe oder eine direkte Bindung zur Nucleobase und X für eine direkte Bindung, eine -NH- oder -S-Gruppe steht,
Y für eine geradkettige, verzweigte, gesättigte oder ungesättigte C₁-C₂₀-Alkylenkette steht, die gegebenenfalls 1-2 Cyclohexylen-, 1-5 Imino-, 1-3 Phenylen-, 1-3 Phenylenimino-, 1-3 Phenylenoxy-, 1-3 Hydroxyphenylen-, 1-5 Amido-, 1-2 Hydrazido-, 1-5 Carbonyl-, 1-5 Ethylenoxy-, eine Ureido-, eine Thioureido-, 1-2 Carboxyalkylimino-, 1-2 Estergruppen, 1-3 Gruppen Ar, worin Ar für einen gesättigten oder ungesättigten 5- oder 6gliedrigen Ring steht, der gegebenenfalls 1-2 Heteroatome ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel und/oder 1-2 Carbonylgruppen enthält, 1-10 Sauerstoff-, 1-5 Stickstoff- und/oder 1-5 Schwefelatome enthält und/oder gegebenenfalls durch 1-5 Hydroxy-, 1-2 Mercapto-, 1-5 Oxo-, 1-5 Thioxo-, 1-3 Carboxy-, 1-5 Carboxy-C₁-C₄-alkyl-, 1-5 Ester-, 1-3 Amino-, 1-3 Hydroxy-C₁-C₄-alkyl-, 1-3 C₁-C₇-Alkoxygruppen substituiert ist.
Als Beispiele können die Reste -CH₂-CO-NH-CH₂-CH(OH)-CH₂-, -NH-CO-CH₂-CO-NH-CH₂-CH(OH)-CH₂, -CO-NH-CH₂-CH₂-NH-, -CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-, -CH₂-S-CH₂-CH₂-, -(CH₂)₄-S-CH₂-CH₂-NH-, -CO-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH, -CO-CH₂-S-(CH₂)₆-NH-, -CH=CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH-, -CH=CH-CH₂-NH-, -C=C-CH₂-NH oder -CO-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH- Erwähnung finden.
Als Bindungsstellen eignen sich bei den Purinbasen insbesondere die 8-Stellung und bei den Pyrimidinbasen die 5-Stellung. Rein formell wird in diesem Fall ein Wasserstoffatom der betreffenden Base durch den Rest B-K substituiert. Die Bindung kann jedoch auch über gegebenenfalls in der 2-, 4- oder 6-Stellung befindliche Aminogruppen erfolgen, also beispielsweise über die 2-Aminogruppe in Guanin, über die 6-Aminogruppe in Adenin oder über die 4-Aminogruppe in Cytosin. In diesem Fall wird ein Wasserstoffatom der betreffenden Aminogruppe durch den Rest B-K substituiert.
Verbindungen gemäß einem der vorhergehenden Punkte, in denen der Metallkomplex als bildgebendes Element ein radioaktives Isotop enthält, ausgewählt aus den Elementen Kupfer, Wismut, Technetium, Rhenium oder Indium, werden in der vorliegenden Anmeldung in Betracht gezogen.
Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zum Nachweis einer Zielstruktur, dadurch gekennzeichnet, daß man eine oder mehrere der Verbindungen nach einem der vorhergehenden Punkte mit der zur untersuchenden Probe in vivo oder in vitro zusammenbringt und anhand des Signals nachweist, ob die Zielstruktur, an die das Oligonucleotid N spezifisch und mit hoher Bindungsaffinität bindet, in der Probe vorhanden ist.
Zur Erfindung gehört ein Verfahren zur nichtinvasiven Diagnose von Krankheiten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine oder mehrere der erwähnten erfindungsgemäßen Verbindungen mit der zu untersuchenden Zielstruktur in vivo zusammenbringt und anhand des Signals nachweist, ob die Zielstruktur, an die das Oligonucleotid N spezifisch bindet, in dem zu untersuchenden Organismus vorhanden ist.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung von oben beschriebenen Verbindungen zur Herstellung eines für die Radiodiagnostik und/oder Radiotherapie geeigneten Medikaments.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Diagnosekits zum Nachweis von Ziel strukturen in vivo und/oder in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß das Diagnosekit wenigstens eine Verbindung gemäß der Beschreibung enthält.
Besonders bevorzugt sind Verbindungen, wobei es sich bei N um einen nicht natürlich vorkommenden Oligonucleotidliganden mit spezifischer Bindungsaffinität für ein Zielmolekül handelt, wobei solch ein Zielmolekül eine dreidimensionale chemische Struktur ist, bei der es sich nicht um ein Polynucleotid handelt, das sich über einen Mechanismus, der hauptsächlich auf Watson/Crick-Basenpaarung oder Triplehelixbindung beruht, an den Oligonucleotidliganden bindet, wobei es sich bei dem Oligonucleotidliganden nicht um eine Nucleinsäure handelt, von der bekannt ist, daß eine ihrer physiologischen Funktionen die Bindung durch das Zielmolekül ist.
Sind die erfindungsgemäßen Konjugate als diagnostische Mittel zu verwenden, so enthält/enthalten der/die Komplexbildner ein bildgebendes radioaktives Isotop der Elemente der Ordnungszahl 21, 26–27, 29, 31, 43 oder 49, vorzugsweise 43 oder 49. Sind die erfindungsgemäßen Konjugate für eine Verwendung als Therapeutika bestimmt, so eignen sich neben den obenerwähnten Isotopen weiterhin die Isotope der Elemente der Ordnungszahlen 5, 22–25, 28, 42, 44, 57–83 und 85. Neben den radioaktiven Isotopen der obenerwähnten Elemente eignen sich insbesondere auch stabile Isotopen, die

a) durch Strahlung von außen in radioaktive Isotopen umgewandelt werden,
b) Strahlung von außen in Strahlung einer anderen Qualität, eines anderen Energiegehalts und/oder einer anderen Wellenlänge umwandeln,

Die Anzahl der bildgebenden bzw. therapeutisch wirksamen Substituenten B-K, die mit dem Oligonucleotid-Rest verbunden ist, ist einerseits durch den Wert des Oligonucleotids begrenzt, liegt jedoch niemals über 10. Erfindungsgemäß werden ein oder zwei Substituenten B-K bevorzugt.
Der Wert des Oligonucleotid-Rests N ist in der vorliegenden Erfindung auf 15 bis 100 Nucleotide beschränkt.
Erfindungsgemäß verwendbare Oligonucleotide sind gegen einen Abbau durch in vivo vorkommende Nucleasen stabilisiert.
Nichtmodifizierte Oligonucleotide bzw. Polynucleotide werden in vivo durch Endonucleasen und Exonucleasen gespalten. Die Abbaureaktion in der RNA-Reihe beginnt mit einer Aktivierung der 2'-Hydroxylgruppe. Andere katabole Enzyme sind beispielsweise Ribozyme, die die Phosphodiesterbindung der RNA spalten (siehe Science 261, 709 (1993)). Die in-vivo-Stabilität von RNA-Derivaten läßt sich durch teilweise oder vollständige Substitution der 2'-Hydroxylgruppe durch andere Substituenten erhöhen. Solche Substituenten sind beispielsweise Alkoxygruppen, insbesondere die Methoxygruppe (siehe z. B. Chem. Pharm. Bull. 13, 1273 (1965), Biochemistry 10, 2581, (1971)), ein Wasserstoffatom, ein Fluoratom (siehe z. B. Can. J. Chem. 46, 1131 (1968)) oder eine Aminogruppe (siehe z. B. J. Org. Chem. 42, 714 (1977)). Unter Anwendung der in der US-Anmeldung Ser. Nr. 08/264,029, die am 22. Juni 1994 eingereicht wurde, offenbarten Verfahren können mehrere dieser Substituenten sowie auch andere in die 2'-Stellung eingeführt werden. Andere Möglichkeiten zur Stabilisierung der Internucleotidbindung sind der Austausch eines oder zweier Sauerstoffatome in der Phosphodiesterbrücke unter Ausbildung von Phosphorothioaten (Trends Biochem. Sci. 14, 97 (1989)) bzw. Phosphorodithioaten (J. Chem. Soc., Chem. Commun. 591 (1983) und Nucleic Acids Res. 12, 9095 (1984)) und die Verwendung von Alkylphosphonaten anstelle von Phosphodiestern (Ann. Rep. N. Y. Acad. Sci. 507, 220 (1988)).
Die Stabilisierung läßt sich erreichen, indem man die Hydroxylgruppen in der 2'-Stellung der Riboseeinheiten unabhängig voneinander modifiziert. Eine solche Modifikation läßt sich durch einen Austausch dieser Hydroxylgruppe gegen eine OR-Gruppe, ein Halogenatom, insbesondere ein Fluoratom, ein Wasserstoffatom oder einen Aminrest, insbesondere gegen eine Aminogruppe, erzielen. Der Rest R der Alkoxygruppe steht in diesem Fall für einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen wie z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, tert.-Butyl, Pentyl oder Hexyl, oder einen cyclischen unsubstituierten oder substituierten Alkylrest mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Cyclopentyl oder Cyclohexyl, der gegebenenfalls 1-2 Hydroxylgruppen enthält und gegebenenfalls durch 1-5 Sauerstoffatome unterbrochen ist. Die Stabilisierung wird auch dadurch erhöht, daß man die in den 3'- und 5'-Stellungen vorhandenen Hydroxylgruppen gegebenenfalls verethert.
Eine andersartige Stabilisierung des Polynucleotids findet statt, wenn man die als Internucleotidbindung verwendeten Phosphodiester teilweise oder vollständig und unabhängig voneinander durch Phosphorothioate, Phosphorodithioate oder Alkylphosphonate, besonders bevorzugt durch niedere Alkylphosphonate wie beispielsweise Methylphosphonat, ersetzt. Diese Internucleotidbindungen können auch in den 3'- und 5'-Stellungen mit den endständigen Resten verbunden sein oder auch die 3'-3'- bzw. 5'-5'-Stellungen verbinden. Die Phosphodiesterbindung ermöglicht weitere Verbindungen über Hydroxyalkylreste, die an den Stickstoff- oder Kohlenstoffatomen der Nucleobasen vorhanden sind; so können beispielsweise zwei Thymidine über die in der 3- Stellung vorhandenen Hydroxyalkylketten oder zwei Purinbasen über die in den 8-Stellungen vorhandenen Reste verbunden sein. Die Bindung kann auch zu Hydroxylgruppen in der 2'-, 3'- oder 5'-Stellung erfolgen.
Die modifizierten Internucleotidbindungen können gegebenenfalls vorzugsweise an den Enden des Polynucleotids vorliegen, und sie sind besonders bevorzugt an das Thymidin gebunden.
Die verwendeten Oligonucleotid-Reste N sind erfindungsgemäß nicht auf spezifische Oligonucleotidsequenzen beschränkt. Bevorzugt sind jedoch die Oligonucleotide, die sich mit hoher Bindungsaffinität an Zielstrukturen mit Ausnahme von Nucleinsäure binden.
Ein Verfahren zur Identifikation geeigneter Oligonucleotide, die als Ausgangssubstanzen für die erfindungsgemäßen Konjugate erforderlich sind, ist im US-Patent 5,270,163 beschrieben. Dieses als SELEX bezeichnete Verfahren läßt sich zur Herstellung eines Nucleinsäureliganden für jedes gewünschte Zielmolekül anwenden.
Bei dem SELEX-Verfahren erfolgt eine Auswahl aus einer Mischung von Oligonucleotid-Kandidaten und eine schrittweise Durchführung von Bindung, Abtrennung und Amplifikation unter Anwendung des gleichen allgemeinen Auswahlverfahrens, wodurch sich praktisch jedes gewünschte Kriterium hinsichtlich Bindungsaffinität und Selektivität erzielen läßt. Ausgehend von einer Mischung von Nucleinsäuren, die vorzugsweise ein Segment einer randomisierten Sequenz enthält, umfaßt das SELEX-Verfahren die Schritte des In-Kontakt-Bringens der Mischung mit dem Target unter für eine Bindung günstigen Bedingungen, des Abtrennens der nichtgebundenen Nucleinsäuren von den Nucleinsäuren, die sich spezifisch an die Zielmoleküle gebunden haben, der Dissoziation der Nucleinsäure-Target-Komplexe, der Amplifikation der von den Nucleinsäure-Target-Komplexen dissoziierten Nucleinsäuren, wodurch man eine mit Liganden angereicherte Mischung von Nucleinsäuren erhält, und dann dem Wiederholen der Bindungs-, Abtrennungs-, Dissoziations- und Amplifikationsschritte über eine gewünschte Anzahl von Zyklen, wodurch man hochspezifische Nucleinsäureliganden mit hoher Affinität für das Zielmolekül erhält.
Das SELEX-Grundverfahren wurde zum Erreichen spezifischer Ziele modifiziert. Die US-Patentanmeldung Ser. Nr. 07/960,093, eingereicht am 14. Oktober 1992, beispielsweise beschreibt die Anwendung von SELEX zusammen mit Gelelektrophorese zur Auswahl von Nucleinsäuremolekülen mit spezifischen Struktureigenschaften, wie z. B. gekrümmter DNA. In der am 17. September 1993 eingereichten US-Patentanmeldung Ser. Nr. 08/123,935 wird ein auf SELEX basierendes Verfahren zur Auswahl von Nucleinsäureliganden mit photoreaktiven Gruppen, die dazu in der Lage sind, sich an ein Zielmolekül zu binden und/oder mit einem Zielmolekül querzuvernetzen und/oder ein Zielmolekül zu photoinaktivieren, beschrieben. In der US-Patentanmeldung Ser. Nr. 08/134,028, eingereicht am 7. Oktober 1993, wird ein Verfahren zur Identifikation hochspezifischer Nucleinsäureliganden beschrieben, die dazu fähig sind, zwischen eng miteinander verwandten Molekülen zu unterscheiden; dieses Verfahren wird als Counter-SELEX bezeichnet. In der am 25. Oktober 1993 eingereichten US-Patentanmeldung Ser. Nr. 08/143,564 wird ein auf SELEX basierendes Verfahren beschrieben, mit dem sich eine hocheffiziente Trennung von Oligonucleotiden mit großer und geringer Affinität für ein Zielmolekül erreichen läßt. In der am 21. Oktober 1992 eingereichten US-Patentanmeldung Ser. Nr. 07/964,624 werden Verfahren beschrieben, mit denen sich nach der Durchführung von SELEX verbesserte Nucleinsäureliganden erhalten lassen. In der US-Patentanmeldung Ser. Nr. 08/400,440, eingereicht am 8. März 1995, sind Verfahren zur kovalenten Bindung eines Liganden an sein Target beschrieben.
Bei den SELEX-Verfahren identifiziert man Nucleinsäureliganden mit hoher Affinität, die modifizierte Nucleotide enthalten, die dem Liganden verbesserte Eigenschaften verleihen, wie z. B. eine bessere in-vivo-Stabilität oder bessere Verabreichungseigenschaften. Zu diesen Modifikationen gehören beispielsweise chemische Substitutionen an der Ribose und/oder dem Phosphat und/oder Basenaustausche. Durch SELEX identifizierte Nucleinsäureliganden, die modifizierte Nucleotide enthalten, sind in der am 8. September 1993 eingereichten US-Patentanmeldung Ser. Nr. 08/117,991 beschrieben, in der Oligonucleotide beschrieben sind, die Nucleotidderivate enthalten, die an den 5- und 2'-Stellungen der Pyrimidine chemisch modifiziert sind. In der US-Patentanmeldung Ser. Nr. 08/134,028, siehe oben, sind hochspezifische Nucleinsäureliganden beschrieben, die ein oder mehrere Nucleotide enthalten, die mit 2'-Amino (2'-NH₂), 2'-Fluor (2'-F) und/oder 2'-O-Methyl (2'-OMe) modifiziert sind. In der US-Patentanmeldung Ser. Nr. 08/264,029, eingereicht am 22. Juni 1994, sind Oligonucleotide beschrieben, die verschiedene 2'-modifizierte Pyrimidine enthalten.
Bei dem SELEX-Verfahren kombiniert man ausgewählte Oligonucleotide mit anderen ausgewählten Oligonucleotiden und funktionellen Nicht-Oligonucleotideinheiten, wie in der am 2. August 1994 eingereichten US-Patentanmeldung Ser. Nr. 08/284,063 bzw. der am 28. April 1994 eingereichten Ser. Nr. 08/234,997 beschrieben. Diese Anwendungen ermöglichen es, ein breites Spektrum von Formen und anderen Eigenschaften sowie die effizienten Amplifikations- und Replikationseigenschaften von Oligonucleotiden mit den wünschenswerten Eigenschaften anderer Moleküle zu kombinieren.
In seiner grundlegendsten Form läßt sich das SELEX-Verfahren durch die folgende Reihe von Schritten definieren:

1) Man stellt eine Kandidatenmischung von Nucleinsäuren verschiedener Sequenzen her. Die Kandidatenmischung enthält im allgemeinen Regionen festgelegter Sequenzen (d. h. jedes Element der Kandidatenmischung enthält die gleichen Sequenzen an den gleichen Stellen) und Regionen randomisierter Sequenzen. Die festgelegten Sequenzregionen werden so ausgewählt, daß sie entweder (a) die unten beschriebenen Amplifikationsschritte erleichtern, (b) einer Sequenz ähneln, von der bekannt ist, daß sie sich an das Target bindet, oder c) die Konzentration einer vorgegebenen Strukturanordnung der Nucleinsäuren in der Kandidatenmischung erfüllen. Die randomisierten Sequenzen können vollständig randomisiert sein (d. h. die Wahrscheinlichkeit, eine Base in einer bestimmten Position zu finden, beträgt eins zu vier) oder lediglich teilweise randomisiert sein (die Wahrscheinlichkeit, eine Base an einer bestimmten Stelle zu finden, kann beispielsweise ein beliebiger Wert zwischen 0 und 100 Prozent sein).
2) Die Kandidatenmischung wird unter Bedingungen, die für eine Bindung zwischen dem Target und den Elementen der Kandidatenmischung günstig sind, in Kontakt mit dem ausgewählten Target gebracht. Unter diesen Umständen kann man die Wechselwirkung zwischen dem Target und den Nucleinsäuren der Kandidatenmischung so betrachten, daß sich zwischen dem Target und den Aminosäuren mit der größten Affinität für das Target ein Nucleinsäure-Target-Paar bildet.
3) Die Nucleinsäuren mit der größten Affinität für das Target werden von den Nucleinsäuren mit einer geringeren Affinität für das Target getrennt. Da in der Kandidatenmischung lediglich eine extrem kleine Anzahl von Sequenzen (und möglicherweise lediglich ein Nucleinsäuremolekül) den Nucleinsäuren mit der höchsten Affinität entspricht, ist es allgemein wünschenswert, die Trennkriterien so festzulegen, daß während des Trennvorgangs eine beträchtliche Menge der Nucleinsäuren (ungefähr 5–50%) in der Kandidatenmischung verbleiben.
4) Die während des Trennvorgangs ausgewählten Nucleinsäuren mit relativ großer Affinität für das Target werden dann amplifiziert, so daß man eine neue Kandidatenmischung erhält, die mit Nucleinsäuren mit einer relativ großen Affinität für das Target angereichert ist.
5) Durch Wiederholung der obigen Trenn- und Amplifikationsschritte enthält die neugebildete Kandidatenmischung immer weniger einzigartige Sequenzen, und das durchschnittliche Ausmaß der Affinität der Nucleinsäuren für das Target wird im allgemeinen zunehmen. Im Extremfall liefert das SELEX-Verfahren eine Kandidatenmischung, die eine oder eine geringe Anzahl an einzigartigen Nucleinsäuren enthält, bei denen es sich um die Nucleinsäuren aus der ursprünglichen Kandidatenmischung mit der größten Affinität für das Zielmolekül handelt.

In den SELEX-Patenten und -Anmeldungen wird dieses Verfahren ausführlich beschrieben und ausgeführt. Inbegriffen sind Targets, die in dem Verfahren verwendet werden können, Verfahren zur Abtrennung von Nucleinsäuren aus einer Kandidatenmischung und Verfahren zum Amplifizieren abgetrennter Nucleinsäuren zum Herstellen einer angereicherten Kandidatenmischung. In den SELEX-Patenten und -Anmeldungen werden auch Liganden beschrieben, die für eine Reihe von Targetspezies erhalten wurden, einschließlich Proteintargets, bei denen es sich bei dem Protein um ein Nucleinsäure bindendes Protein handelt oder auch nicht. Das SELEX-Verfahren läßt sich somit für die Bereit stellung von Liganden mit hoher Affinität für ein Zielmolekül anwenden.
Zielmoleküle sind vorzugsweise Proteine, können jedoch unter anderem auch Kohlenhydrate, Peptidoglycane und eine Vielzahl verschiedener kleiner Moleküle umfassen. Wie bei herkömmlichen proteinartigen Antikörpern können Nucleinsäureantikörper (Oligonucleotidliganden) aufgrund von spezifischen Wechselwirkungen mit einem Molekül, bei dem es sich um einen integralen Bestandteil dieser biologischen Struktur handelt, zum Targeting von biologischen Strukturen wie Zelloberflächen oder Viren eingesetzt werden. Oligonucleotidliganden sind vorteilhaft, da sie nicht durch Selbst-Toleranz eingeschränkt sind, wie das bei herkömmlichen Antikörpern der Fall ist. Weiterhin sind bei Nucleinsäureantikörpern keine Tiere oder Zellkulturen für die Synthese bzw. Produktion erforderlich, da SELEX ein Verfahren ist, das ausschließlich in vitro durchgeführt wird. Wie allgemein bekannt ist, können sich Nucleinsäuren an komplementäre Nucleinsäuresequenzen binden. Diese Eigenschaft der Nucleinsäuren wurde ausgiebig für den Nachweis, die Quantifizierung und die Isolierung von Nucleinsäuremolekülen ausgenutzt. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sollen daher diese allgemein bekannten Bindungsmöglichkeiten zwischen Nucleinsäuren nicht umfassen. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung, die die Verwendung von Nucleinsäureantikörpern betreffen, sollen ausdrücklich nicht die bekannten Bindungsaffinitäten zwischen Nucleinsäuremolekülen umfassen. Es gibt eine Reihe von Proteinen, von denen bekannt ist, daß sie ihre Funktion über die Bindung an Nucleinsäuresequenzen ausüben, wie z. B. regulatorische Proteine, die sich an Nucleinsäureoperatorsequenzen binden. Daß bestimmte Nucleinsäure bindende Proteine dazu in der Lage sind, sich an ihre natürlichen Bindungsstellen zu binden, wurde beispielsweise zur Detektion, Quantifizierung, Isolierung und Aufreinigung solcher Proteine ausgenutzt. Die die Verwendung von Oligonucleotidliganden betreffenden Verfahren der vorliegenden Erfindung sollen die bekannte Bindungsaffinität zwischen Nucleinsäure bindenden Proteinen und Nucleinsäuresequenzen, von denen bekannt ist, daß sich die Nucleinsäure bindenden Proteine daran binden, nicht umfassen. Es ist jedoch möglich, mit SELEX neue, nicht natürlich vorkommende Sequenzen, die sich an die gleichen Nucleinsäure bindenden Proteine binden, zu entwickeln. Die Oligonucleotidliganden der vorliegenden Erfindung binden sich insbesondere an Zielmoleküle, die eine dreidimensionale chemische Struktur aufweisen, wobei es sich jedoch nicht um ein Polynucleotid handelt, das sich über einen Mechanismus, der hauptsächlich auf Watson/Crick-Basenpaarung oder Triplehelixbindung beruht, an den Oligonucleotidliganden bindet, wobei es sich bei dem Oligonucleotidliganden nicht um eine Nucleinsäure handelt, von der bekannt ist, daß eine ihrer physiologischen Funktionen die Bindung durch das Zielmolekül ist.
Es sollte angemerkt werden, daß es mit SELEX möglich ist, Nucleinsäuresequenzen, die sich an ein Protein binden und sich somit einfach zur Bestimmung der Struktur eines unbekannten Operators und von Bindungsstellensequenzen einsetzen lassen, die dann für die hier beschriebenen Anwendungen eingesetzt werden können, sehr schnell zu bestimmen. Bei SELEX handelt es sich somit um ein allgemeines Verfahren für die Verwendung von Nucleinsäuremolekülen zum Nachweis, zur Quantifizierung, zur Isolierung und zur Aufreinigung von Proteinen, die nicht dafür bekannt sind, daß sie sich an Nucleinsäuren binden. Darüber hinaus können bestimmte, durch SELEX isolierbare Nucleinsäureantikörper auch zur Manipulation, beispielsweise zur Inhibierung, Verstärkung oder Aktivierung, der Funktion spezifischer Zielmoleküle bzw. -strukturen eingesetzt werden. Nucleinsäureantikörper lassen sich spezifisch zur Inhibierung, Verstärkung oder Aktivierung der Funktion von Proteinen anwenden.
Die bei den erfindungsgemäßen Konjugaten eingesetzten Oligonucleotide werden in einer bevorzugten Ausführungsform nach dem im folgenden beschriebenen Verfahren erhalten.
So sind geeignete Oligonucleotide dadurch erhältlich, daß eine Zufallssequenzen enthaltende Mischung von Oligonucleotiden mit der Zielstruktur zusammengebracht wird, wobei bestimmte Oligonucleotide eine erhöhte Affinität zu der Zielstruktur im Verhältnis zu der Mischung der Oligonucleotide aufweisen, diese von dem Rest der Oligonucleotidmischung abgetrennt werden, dann die Oligonucleotide mit erhöhter Affinität zu der Zielstruktur amplifiziert werden, um eine Mischung von Oligonucleotiden zu erhalten, die einen erhöhten Anteil an Oligonucleotiden aufweist, die an die Zielstrukturen binden.
Bei dem Verfahren wird zunächst ein DNA-Strang hergestellt, in bevorzugter Weise durch chemische Synthese. Dieser DNA-Strang besitzt am 3'-Ende eine bekannte Sequenz, die als Promotor für eine RNA-Polymerase dient und zugleich komplementär zu einer Primer-Sequenz für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich hierbei um den Promotor für die T7-RNA-Polymerase. Anschließend wird eine Zufallssequenz an den Promotor synthetisiert. Die Zufallssequenz kann dadurch erhalten werden, daß die in Frage kommenden vier Basen im gleichen Verhältnis in die Synthesemaschine eingegeben werden. Es entstehen dadurch völlig zufällige DNA-Sequenzen. Die Länge der Zufallssequenz beträgt bei einer bevorzugten Ausführungsform etwa 15 bis 100 Nucleotide. An dieses DNA-Stück mit der Zufallssequenz wird eine weitere DNA- Sequenz ansynthetisiert, die für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden kann.
Nach Synthese dieses DNA-Stranges wird dieser mit Hilfe einer RNA-Polymerase in einen komplementären RNA-Strang umgeschrieben. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird hierbei die T7-RNA-Polymerase verwendet. Bei der Transkription werden der RNA-Polymerase solche Nucleotide angeboten, die modifiziert sind. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Ribose an der 2'-Position modifiziert. Hierbei kann es sich um eine Substitution des Wasserstoffatoms bzw. der Hydroxylgruppe durch eine Alkoxygruppe, bevorzugt Methoxy, Amino oder Fluor handeln. Die auf diese Art und Weise hergestellten RNA-Oligonucleotide werden dann in den Selektionsprozeß eingeführt.
Bei dem Selektionsprozeß werden die RNA-Oligonucleotide mit der Zielstruktur zusammengebracht. Unter Zielstruktur wird eine Struktur verstanden, an die das Oligonucleotid spezifisch und mit hoher Affinität binden soll.
Derartige Strukturen sind z. B. Makromoleküle, Gewebestrukturen von höheren Organismen, wie Tieren oder Menschen, Organen oder Teilen von Organen, Zellen, insbesondere Tumorzellen oder Tumore.
Die Zielstruktur muß dazu nicht unbedingt in reiner Form vorliegen, sie kann sich auch auf einem natürlich vorkommenden Organ oder an einer Zelloberfläche befinden. Durch Zusatz von Polyamino (tRNA, Heparin), Plasma oder Vollblut zur SELEX-Reaktion läßt sich das Auswahlverfahren mit strengeren Kriterien durchführen.
Wenn es sich hierbei um ein isoliertes Protein handelt, kann dieses auf einer Festphase, beispielsweise einem Filter, gebunden sein. Bei der Selektion wird ein Überschuß der Zielstruktur gegenüber der RNA-Mischung eingesetzt. Bei der Inkubation binden die spezifischen Oligonucleotidmoleküle an die Zielstrukturen, wohingegen die nicht gebundenen Oligonucleotide von der Mischung abgetrennt werden, beispielsweise durch Waschen.
Anschließend werden die Oligonucleotidmoleküle von den Zielmolekülen abgetrennt bzw. durch Waschen mit geeigneten Puffern oder Lösungsmitteln entfernt.
Mit Hilfe der Reversen Transkriptase wird dann das aufgefundene RNA-Oligonucleotid umgeschrieben in den komplementären DNA-Strang.
Da der erhaltene DNA-Strang an beiden Enden Primersequenzen (bzw. Promotorsequenzen) aufweist, kann eine Amplifizierung der gefundenen DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion einfach durchgeführt werden.
Die auf diese Art amplifizierten DNA-Oligonucleotide werden dann mit Hilfe der RNA-Polymerase wieder in RNA-Oligonucleotide umgeschrieben, und die so erhaltenen RNA-Oligonucleotide können in einem weiteren Selektionsschritt (wie oben beschrieben) eingesetzt werden.
Nach Trennen der im zweiten Selektionsschritt erhaltenen bindenden RNA-Oligonucleotide von den Zielmolekülen werden diese mit Hilfe der Reversen Transkriptase wieder in DNA umgeschrieben, die so erhaltenen komplementären DNA-Oligonucleotide werden mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert und anschließend mit Hilfe der RNA-Polymerase wieder zu RNA-Oligonucleotiden transkribiert, die für einen weiteren Selektionsschritt zur Verfügung stehen.
Es hat sich herausgestellt, daß die gewünschten hohen Spezifitäten und hohen Bindungsaffinitäten dann erhalten werden können, wenn die Selektionsschritte mehrmals wiederholt werden. Selten wird die gewünschte Oligonucleotidsequenz bereits nach einem oder zwei Selektionsschritten erhalten werden. Sobald die gewünschte Spezifität und Bindungsaffinität zwischen Zielstruktur und Oligonucleotid erhalten wird, kann das oder die Oligonucleotid(e) sequenziert werden und dadurch die Sequenz der spezifisch bindenden Oligonucleotide ermittelt werden.
Besonders vorteilhaft bei dem vorliegenden Verfahren ist, daß dieses Verfahren nicht nur mit geeigneten Proteinen, sondern auch in vivo angewendet werden kann. Der oben erwähnte Selektionsprozeß kann aber auch an gereinigten Zielstrukturen durchgeführt werden. Insbesondere für die in-vivo-Diagnostik ist es aber wesentlich, daß die Spezifität der Oligonucleotide für die Zielstruktur im lebenden Umfeld gegeben ist. Daher können die Selektionsprozesse auch an Zellen bzw. Zellkulturen, an Geweben oder Gewebeschnitten, an perfundierten Organen und sogar an lebenden Organismen durchgeführt werden.
Vorteilhaft hierbei ist, daß die modifizierten Oligonucleotide dem Abbau durch die nahezu allgegenwärtigen RN-asen widerstehen können. Dadurch werden bei Selektionsprozessen an lebenden Organismen die gewünschten Oligonucleotidsequenzen selbst angereichert, da entsprechende natürlich vorkommende Oligonucleotide von den RN-asen abgebaut würden.
Der Oligonucleotid-Rest N kann eine oder mehrere Verbindungskomponenten B bzw. Substituenten B-K, die unabhängig voneinander ausgewählt werden können, aufweisen. Beansprucht werden Oligonucleotid-Konjugate, die 1 bis 10 gleiche oder 2 bis 10 unterschiedliche Verbindungskomponenten B enthalten. Besonders bevorzugt sind Oligonucleotid-Konjugate mit einer oder zwei Verbindungskomponenten B.
Die Verbindungskomponente B verbindet den Oligonucleotid-Rest N mit einem Komplexbildner oder Komplex K.
Vorteilhaft lassen sich mehrzähnige, offenkettige oder cyclische komplexbildende Liganden mit O, S und N als Donoratomen einsetzen.
Als Beispiele für die Komplexbildner-Reste K seien die um ein Wasserstoffatom, eine Hydroxy- und/oder eine Essigsäuregruppe verminderten Polyaminopolycarbonsäuren Ethylendiamintetraessigsäure, Diethylentriaminpentaessigsäure, trans-1,2-Cyclohexandiamintetraessigsäure, 1,4,7,10-Tetraazacyclododecantetraessigsäure, 1,4,7-Triazacyclononantriessigsäure, 1,4,8,11-Tetraazatetradecantetraessigsäure, 1,5,9-Triazacyclododecantriessigsäure, 1,4,7,10-Tetraazacyclododecantriessigsäure und 3,6,9,15-Tetraaza-bicyclo-[9,3,1]-pentadeca-1(15),11,13-trientriessigsäure genannt.
Geeignete Komplexbildner werden z. B. in den EP 0 485 045 , EP 0 071 564 und EP 0 588 229 , in den DE 43 10 999 und DE 43 11 023 sowie dem US 4,965,392 beschrieben.
Um die vielfältigen Möglichkeiten für die Komplexbildner K gemäß der vorliegenden Erfindung zu verdeutlichen, sei auf 1 bis 3 verwiesen, in denen einige vorteilhafte Strukturen zusammengestellt sind. Diese Abbildungen sind als Auswahl zu verstehen und begrenzen die vorliegende Erfindung in keiner Weise auf die dargestellten Komplexbildner.
Der Komplexbildner K kann alle in der Nuclearmedizin gebräuchlichen, für diagnostische und therapeutische Zwecke eingesetzten radioaktiven Isotope in Form ihrer Metallionen enthalten. Auch können stabile Isotope, die durch externe Strahlung zur Abgabe diagnostischer oder therapeutischer Strahlung angeregt, bzw. Isotope, die durch Strahlung von außen in radioaktive Isotope umgewandelt werden, eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß geeignete Isotope werden aus den Elementen der Ordnungszahlen 5, 21–29, 31, 39, 42–44, 49, 57–83 oder 85 ausgewählt.
Zur Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung als Radiopharmakon enthält der Komplexbildner ein radioaktives Element. Alle radioaktiven Elemente, die in der Lage sind, einen therapeutischen oder diagnostischen Effekt in vivo oder in vitro zu erzielen, sind hierfür geeignet. Bevorzugt werden radioaktive Isotope der Elemente Kupfer, Wismut, Technetium, Rhenium oder Indium. Besonders bevorzugt werden ^99mTc-Komplexe.
Enthalten die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I positronenemittierende Isotope wie z. B. Sc-43, Sc-44, Fe-52, Co-55, Ga-68 oder Cu-61, so können diese bei der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) eingesetzt werden.
Enthalten die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I Gammastrahlung emittierende Isotope wie z. B. Tc-99m oder In-111, so können diese bei der Single-Photon-Emissions-Tomographie (SPECT) eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Form ihrer Komplexe mit Radioisotopen, wie z. B. Ir-192, auch in der Radiotherapie eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in der Radioimmuno- oder Strahlentherapie verwendet werden. Diese unterscheiden sich von der entsprechenden Diagnostik nur durch die Menge und Art des verwendeten Isotops. Ziel ist dabei die Zerstörung von Tumorzellen durch energiereiche kurzwellige Strahlung mit einer möglichst geringen Reichweite. Geeignete β-emittierende Ionen sind zum Beispiel Sc-46, Sc-47, Sc-48, Ga-72, Ga-73, Y-90, Re-186 oder Re-188. Geeignete, geringe Halbwertszeiten aufweisende α-emittierende Ionen sind zum Beispiel At-209, At-211, Bi-211, Bi-212, Bi-213 und Bi-214, wobei Bi-212 bevorzugt wird. Ein geeignetes, Photonen und Elektronen emittierendes Ion ist ¹⁵⁸Gd, das aus ¹⁵⁷Gd durch Neutroneneinfang erhalten werden kann.
Ist das erfindungsgemäße Mittel zur Anwendung in der von R. L. Mills et al. (Nature 336, 787 (1988)) vorgeschlagenen Variante der Strahlentherapie bestimmt, so muß sich das Zentralion von einem Mössbauer-Isotop wie beispielsweise ⁵⁷Fe oder ¹⁵¹Eu ableiten.
Diejenigen Carbonsäuregruppen, die nicht zur Komplexierung der Metallionen der Elemente der Ordnungszahlen 21 bis 29, 31, 39, 42 bis 44, 49, 57 bis 83 oder 85 benötigt werden, können gewünschtenfalls als Salze von einer anorganischen oder organischen Base wie z. B. von einem Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxid oder -carbonat, insbesondere von Natrium- oder Kaliumhydroxid, oder von Ammoniak oder einem Alkylamin oder einer Aminosäure, oder als Ester oder Amid vorliegen.
Weiterhin können Verbindungen, die mittels Neutronen zur Aussendung von Partikeln und/oder Strahlung angeregt werden, eingesetzt werden. Besonders effektiv ist dabei Gadolinium. Vorteilhaft lassen sich auch solche Verbindungen verwenden, die das Isotop Bor-10 enthalten. In solchen Fällen kann K die Struktur
haben, wobei x
für eine ganze Zahl von 1 bis 10 steht.
Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate.
So können Konjugate, bei denen die Verbindungskomponente B an das 5'-Ende des Oligonucleotids gebunden ist, durch Umsetzung des Oligonucleotids mit einem Phosphoramidit-Derivat erhalten werden (Tetrahedron 49, 1925–1963 (1993)). Dazu wird die 5'-Hydroxygruppe des Oligonucleotids mit einem Phosphoramidit der allgemeinen Formel PR'(NR₂'')OR''' umgesetzt. R' steht dabei für eine gegebenenfalls N, NO₂, Si oder SO₂ enthaltende Alkyl-, Alkoxy- oder Arylalkoxygruppe mit 1 bis 20 C-Atomen wie Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Methoxy-, Ethoxy-, Propyloxy-, Butyloxy-, Benzyloxy- oder Phenylethoxy-, die gegebenenfalls substituiert sein können. Als Substituenten werden insbesondere Cyano- und Nitrogruppen verwendet. Vorteilhaft können beispielsweise Methoxy-, β-Cyanoethoxy- oder Nitrophenylethoxygruppen eingesetzt werden. Besonders bevorzugt werden β-Cyanoethoxygruppen. R'' ist ein C₁-C₄-Alkylrest, wobei Ethyl- und Propylreste besonders geeignet sind. Bevorzugt werden Isopropylreste. R''' ist eine gegebenenfalls S, O, N, CN, NO₂ oder Halogen enthaltende Alkyl- oder Arylalkylgruppe mit 1 bis 20 C-Atomen. Bevorzugt werden geschützte Amino- und Thioalkylreste sowie geschützte Amino- und Thiooxaalkylreste eingesetzt. Besonders bevorzugt sind 6-Aminohexyl-, 6-Thiohexyl-, 3,6,9-Trioxa-11-aminoundecyl- und 3,6-Dioxa-8-aminooctanyl-Gruppen. Als Schutzgruppen können allgemein übliche N- oder S-Schutzgruppen verwendet werden. Beispielsweise eignen sich Trifluoracetyl-, Phthalimido- und Monomethoxytritylgruppen.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird als Phosphoramidit-Derivat β-Cyanoethyl- N,N-diisopropylamino-6-(trifluoracetamido)-1-hexylphosphoramidit eingesetzt.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird als Phosphoramidit-Derivat β-Cyanoethyl-N,N-diisopropylamino-(3,6,9-trioxa-11-phthalimido-1-undecyl)phosphoramidit eingesetzt.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindungskomponente B an das 3'-Ende des Oligonucleotids N in einer zur oben beschriebenen analogen Weise über eine phosphorhaltige Gruppe gebunden.
Die oben beschriebene Reaktion zwischen Oligonucleotid und Phosphoramidit kann als Festphasenreaktion erfolgen, wobei sich das Oligonucleotid noch auf der Säule eines Syntheseautomaten befindet. Wenn man ein Oligonucleotid der gewünschten Sequenz erhalten hat und die Freilegung der 5'-Hydroxygruppe des Oligonucleotids, z. B. mit Trichloressigsäure, erfolgt ist, wird es mit dem Phosphoramidit umgesetzt und das Reaktionsprodukt oxidiert und freigesetzt. Anschließend wird das so erhaltene Oligonucleotid-Derivat an der endständigen Amino- oder Thiolgruppe mit dem Komplexbildner oder Komplex K gegebenenfalls über eine weitere Linkergruppe gekoppelt. Der im ersten Schritt über die phosphorhaltige Gruppe an das Oligonucleotid gebundene Rest bildet dann zusammen mit der gegebenenfalls vorhandenen weiteren Linkergruppe die Verbindungskomponente B.
Die Verknüpfung zwischen Oligonucleotid und dem Komplexbildner kann auch in der Weise erfolgen, daß man die freie 5'-Hydroxylgruppe des Oligonucleotids mit einem Komplexbildner bzw. Komplex umsetzt, der endständig einen bindungsfähigen Phosphorrest trägt. Ein solcher kann durch die Formel

a)
worin R^a für einen C₁-C₆-Alkylrest steht, der gegebenenfalls in der β-Position einen Cyan-Rest trägt, R^b für eine sekundäre Aminogruppe steht und K und B die angegebene Bedeutung haben, oder die Formel
b)
worin R^c für ein Trialkylammoniumkation steht und K und B die genannte Bedeutung haben, oder die Formel
c)
worin R^d für einen gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) und/oder einer oder mehreren Nitrogruppe(n) substituierten Arylrest oder einen C₁-C₆-Alkylrest steht, der gegebenenfalls in der β-Position mit einem Cyanrest substituiert ist, und K, B und R^c die genannte Bedeutung haben, beschrieben werden, wobei bei Verwendung eines Restes der Formel a) nach erfolgter Kopplungsreaktion ein Oxidationsschritt zum Phosphat erfolgt. Gegebenenfalls kann in beiden Fällen der Rest -OR^a oder -OR^c in einer Hydrolyse abgespalten werden.

Die Verknüpfung des Oligonucleotid-Derivats über den Linker mit dem Komplexbildner oder Komplex K kann auch als Festphasenreaktion auf der Säule eines Syntheseautomaten erfolgen. Die erfindungsgemäße Verbindung kann anschließend durch Ablösen vom festen Träger isoliert werden.
Die Verknüpfung des Polynucleotids mit dem Linker kann nicht nur über die 5'-OH-Gruppe des Zuckers des terminalen Nucleotids erfolgen, sondern auch über andere funktionelle Gruppen, die aus der 5'-OH-Gruppe generiert werden können, wie z. B. eine Amino- bzw. Carboxygruppe. Derartige Amino- bzw. Carboxygruppen tragende Nucleotide sind bekannt und leicht herstellbar. Die Synthese eines 5'-Desoxy-5'-aminouridins wird in J. Med. Chem. 22, 1273 (1979), sowie in Chem. Lett. 6, 601 (1976), beschrieben. 4'-Carboxy-5'-desoxyuridin ist wie in J. Med. Chem. 21, 1141 (1978), bzw. Nucleic Acids Symp. Ser. 9, 95 (1981) beschrieben, erhältlich.
Die Verknüpfung mit dem Komplexbildner erfolgt dann über einen eine Carbonsäure bzw. Aminogruppe tragenden Linker in dem Fachmann bekannter Weise. Der Linker bildet dann gemeinsam mit der -NH-CH₂-4' bzw. der -CO-4'-Gruppe die Verbindungskomponente B.
Es sei darauf hingewiesen, daß die Aufteilung der erfindungsgemäßen Konjugate in einen Nucleotidrest, eine Verbindungskomponente und einen Komplexbildner bzw. Komplex rein formal und damit unabhängig vom tatsächlichen synthetischen Aufbau erfolgt. So wird z. B. im oben genannten Fall die Gruppe -NH-CH₂-4' bzw. -CO-4' als zur Verbindungskomponente B gehörig angesehen, wohingegen das in der 4'-Position um eine CH₂-OH- Gruppe verminderte Oligonucleotid als Oligonucleotidrest N bezeichnet wird.
Ein Verfahren zur Herstellung von Konjugaten, bei denen die Verbindungskomponente an die um die OH-Gruppen verminderten Phosphodiester- oder Phosphorothioat-Brücken erfolgt, besteht darin, daß zunächst zwei Zuckereinheiten zu einem Dinucleotid verknüpft werden (siehe z. B. Chem. Lett. 1305 (1993)). Dabei entsteht zunächst ein Triester der Formel
worin U für einen entsprechenden Alkylenrest und V für eine geschützte Amino- bzw. Schwefelgruppe steht. Nach Abspaltung z. B. der Aminoschutzgruppe kann in dem Fachmann bekannter Weise der Komplexbildner gegebenenfalls über einen Linker mit der Aminogruppe – z. B. in Form einer Amidbindung – verknüpft werden. Der Linker bildet dann gemeinsam mit der Gruppe O-U-V' (worin V' für eine Gruppe -NH steht) die Verbindungskomponente B.
Ein alternatives Verfahren besteht darin, daß der intermediär gebildete Phosphotriester (z. B. durch Umsetzung mit 1,5-Diaminopentan) einer Aminolyse unterzogen wird (siehe Biochemistry 27, 7237 (1988) oder J. Am. Chem. Soc. 110, 4470 (1988)).
Die so erhaltenen Verbindungen der Formel
können wie oben beschrieben mit dem Komplexbildner gegebenenfalls über einen Linker verknüpft werden.
Für Kopplungzwecke geeignet sind auch Dinucleosidphosphatmonothiotriester (siehe J. Am. Chem. Soc. 111, 9117 (1983) und Nucl. Acids Res. 20, 5205 (1992)).
Eine besonders große Vielfalt zur Verknüpfung der Komplexbildner mit den Nucleotiden bieten die Nucleobasen. Eine Verknüpfung über Aminogruppen in den Positionen 2 bei den Purinen und 4 bei den Pyrimidinen kann direkt erfolgen. Es ist allerdings häufig günstiger, die Purine bzw. Pyrimidine zunächst zu modifizieren und diese derivatisierten Basen mit den Komplexbildnern (gegebenenfalls über weitere Linker) zu verknüpfen. Geeignete derivatisierte Nucleobasen werden z. B. in Biochemie 21, 319 (1989), Nucl. Acids Res. 16, 4937 (1988), oder Nucleosides Nucleotides 10, 633 (1991), beschrieben.
Ein alternatives Verfahren zur Verknüpfung über die Nucleobasen besteht in der palladiumkatalysierten Kopplung von Brom- oder Iodnucleobasen mit funktionalisierten Resten (Biogenic and Medical Chemistry Letter V, 361 (1994)). Über diese funktionalisierten Reste kann dann nach bekannten Methoden der Komplexbildner gegebenenfalls über einen weiteren Linker mit der Nucleobase verknüpft werden. Als funktionalisierte Reste in der Position 5 des Pyrimidins und in der Position 8 des Purins seien beispielhaft ein Acrylester oder ein Allylamin genannt (siehe Nucl. Acids Res. 14, 6115 (1986) und Nucl. Acids Res. 16, 4077 (1988)). Ein weiteres alternatives Verfahren zur Herstellung von in der 5-Stellung modifizierten Pyrimidinen, insbesondere zur Einführung funktioneller Gruppen wie Carbonyl-, Alkenyl- oder Arylgruppen in der 5-Stellung, und ein verbesserter Palladiumkatalysator, mit dem sich modifizierende Gruppen in der 5-Stellung von Pyrimidinen ankoppeln lassen, sind in der US-Patentanmeldung Ser. Nr. 08/076735, eingereicht am 14. Juni 1993, beschrieben. Die als Vorstufe eingesetzten Halogenderivate sind wie z. B. in Biophys. J. 44, 201 (1983), J. Am. Chem. Soc. 86, 1242 (1964), oder Chem. Commun. 17 (1967) beschrieben, erhältlich.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Metallkomplexe aus den metallfreien Oligonucleotid-Konjugaten erfolgt wie in der DE 34 01 052 offenbart, indem man das Metalloxid oder ein Metallsalz (beispielsweise das Nitrat, Acetat, Carbonat, Chlorid oder Sulfat) des gewünschten Metallisotops in Wasser und/oder einem niederen Alkohol (wie Methanol, Ethanol oder Isopropanol) löst oder suspendiert und mit der Lösung oder Suspension der äquivalenten Menge des den Komplexbildner enthaltenden Oligonucleotid-Konjugats umsetzt und anschließend, falls gewünscht, vorhandene acide Wasserstoffatome durch Kationen von anorganischen und/oder organischen Basen oder Aminosäuren substituiert oder freie Carbonsäuregruppen in Aminosäureamide umwandelt.
Die Neutralisation eventuell noch vorhandener freier Säuregruppen erfolgt mit Hilfe anorganischer Basen (zum Beispiel Hydroxiden, Carbonaten oder Bicarbonaten) von zum Beispiel Natrium, Kalium, Lithium, Magnesium oder Calcium und/oder organischer Basen wie unter anderem primärer, sekundärer und tertiärer Amine, wie zum Beispiel Ethanolamin, Morpholin, Glucamin, N-Methyl- und N,N-Dimethylglucamin, sowie basischer Aminosäuren, wie zum Beispiel Lysin, Arginin und Ornithin, oder von Amiden ursprünglich neutraler oder saurer Aminosäuren.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel erfolgt ebenfalls in an sich bekannter Weise, indem man die erfindungsgemäßen Oligonucleotid-Konjugate – gegebenenfalls unter Zugabe der in der Galenik üblichen Zusätze – im wäßrigen Medium suspendiert oder löst und anschließend die Suspension oder Lösung gegebenenfalls sterilisiert oder sterilfiltriert. Geeignete Zusätze sind beispielsweise physiologisch unbedenkliche Puffer (wie zum Beispiel Tromethamin), Zusätze von Komplexbildnern (wie zum, Beispiel Diethylentriaminpentaessigsäure) oder – falls erforderlich – Elektrolyten wie zum Beispiel Natriumchlorid oder – falls erforderlich – Antioxidationsmittel wie zum Beispiel Ascorbinsäure oder, insbesondere für orale Darreichungsformen, Mannit oder anderen osmotisch aktiven Substanzen.
Sind für die enterale Verabreichung oder andere Zwecke Suspensionen oder Lösungen der erfindungsgemäßen Mittel in Wasser oder physiologischer Salzlösung erwünscht, können sie mit einem oder mehreren in der Galenik üblichen Hilfsstoff(en) (zum Beispiel Methylcellulose, Lactose, Mannit) und/oder Tensid(en) (zum Beispiel Lecithine, Tween^TR, Myrj^TR) gemischt werden.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel enthalten vorzugsweise 0,1 μmol/l bis 3 mmol/l der erfindungsgemäßen Oligonucleotid-Konjugate und werden in der Regel in Mengen von 0,01 nmol/kg – 60 μmol/kg dosiert. Sie sind zur enteralen und parenteralen Applikation bestimmt.
Bei der nuklearmedizinischen in-vivo-Anwendung werden die markierten Verbindungen in der Regel in Mengen kleiner als 10^–10 mol/kg Körpergewicht dosiert, wobei die genaue Dosis in Abhängigkeit von der untersuchten Körperregion, aber insbesondere auch der jeweils gewählten Untersuchungsmethode, stark variieren kann.
Ausgehend von einem mittleren Körpergewicht von 70 kg beträgt die Radioaktivitätsmenge für diagnostische Anwendungen zwischen 40 und 1100 MBq, vorzugsweise 200–800 MBq, für therapeutische Anwendungen 1–500 MBq, vorzugsweise 10–100 MBq pro Applikation. Die Applikation erfolgt normalerweise intravenös, intraarteriell, interstitiell, peritoneal oder intratumoral, wobei die intravenöse Applikation bevorzugt ist. Pro Untersuchung werden im allgemeinen 0,1 bis 20 ml des betreffenden Mittels verabreicht.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Nachweis von Zielstrukturen. Dabei werden eine oder mehrere der oben beschriebenen Verbindungen mit der zu untersuchenden Probe in vivo oder in vitro zusammengebracht. Der Oligonucleotid-Rest N bindet dabei spezifisch und mit hoher Bindungsaffinität an die nachzuweisende Zielstruktur.
Ist die Zielstruktur in der Probe vorhanden, so kann sie dort anhand des Signals nachgewiesen werden. Insbesondere eignet sich das Verfahren für eine nichtinvasive Diagnostik von Krankheiten. Dabei werden eine oder mehrere der oben beschriebenen Verbindungen in vivo verabreicht, und anhand des Signals kann nachgewiesen werden, ob die Zielstruktur, an die der Oligonucleotid-Rest N spezifisch und mit hoher Affinität bindet, in dem zu untersuchenden Organismus vorhanden ist.
Neben dem bloßen Nachweis von Zielstrukturen in zu untersuchenden Proben können diese aber auch gezielt zerstört werden. Dazu eignen sich die Verbindungen der vorliegenden Erfindung besonders in der Radiotherapie, z. B. in der Krebstherapie.
Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt ein Diagnosekit zum Nachweis von Zielstrukturen in vivo, das eine oder mehrere der oben genannten Verbindungen enthält.
Die erfindungsgemäßen Konjugate und Mittel erfüllen die vielfältigen Anforderungen, die an ein Pharmazeutikum für die Radiotherapie und Diagnostik zu stellen sind. Sie zeichnen sich insbesondere durch eine hohe Spezifität bzw. Affinität gegenüber der betreffenden Zielstruktur aus. Gegenüber bekannten Oligonucleotid-Konjugaten weisen die erfindungsgemäßen Konjugate eine besonders hohe in-vivo-Stabilität auf. Dies wurde durch eine Substitution der 2'-Hydroxylgruppe und den Einbau von modifizierten Thymidinsequenzen an den terminalen Hydroxylgruppen der Nucleotide erreicht. Überraschenderweise wird die Spezifität des Oligonucleotids weder durch diese Modifikation noch durch die Kopplung mit dem Komplexbildner nennenswert beeinträchtigt. Weitere Vorteile sind die steuerbare Pharmakokinetik sowie die notwendige Verträglichkeit.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Verschiedene weitere Gegenstände, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden, wenn man die Erfindung in Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen betrachtet, besser einleuchten.
1 zeigt eine Auswahl von cyclischen Komplexbildnern K, die für die vorliegende Erfindung vorteilhaft eingesetzt werden können. "b" markiert die Bindungsstelle an der Verbindungskomponente B.
2 und 3 zeigen eine Auswahl von offenkettigen Komplexbildnern K die für die vorliegende Erfindung vorteilhaft eingesetzt werden können.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegenden Erfindungen näher erläutern.
Die in den Beispielen beschriebenen Polynucleotide enthalten modifizierte Verbindungen.
Sie haben folgende Bedeutung:

A, U, C, G:: die Nucleotide enthalten eine 2'-OCH₃-Gruppe
*:: die Internucleotidbindung ist ein Methylphosphonat
**:: die Internucleotidbindung ist ein Thiophosphonat
***:: die Internucleotidbindung ist ein Dithiophosphonat.

Es wird angenommen, daß es einem Fachmann ohne nähere Angaben unter Anwendung der vorhergehenden Beschreibung möglich ist, die Erfindung in vollem Ausmaße zu nutzen. Die folgenden bevorzugten Ausführungsbeispiele dienen daher lediglich zur Erläuterung und schränken den Rest der Offenbarung in keinerlei Weise ein.
Im oben Gesagten und in den folgenden Beispielen sind alle Temperaturen unkorrigiert in Grad Celsius angegeben und, wenn nicht anders angegeben, alle Teile und Prozentangaben auf das Gewicht bezogen.
BEISPIELE
Beispiel 1
a) 5'-(6-Amino-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3'
Das nach dem SELEX-Verfahren identifizierte 30mer-Oligonucleotid 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3' mit der Modifikation einer vorgeschalteten Sequenz T*T*T*T*T-3' wird in üblicher Weise in einem Syntheseautomaten der Fa. Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Hrsg. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid auch auf der Säule des festen Trägers befindet. Durch Reaktion mit Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan wird die 5'-Hydroxygruppe freigelegt. Die Beladung der Säule beträgt ca. 10 mg des 35mer-Oligonucleotids. Zum Anknüpfen des Linkers wird die Säule mit einer Acetonitrillösung von 50 μmol β-Cyanoethyl-N,N-diisopropylamino-6-(trifluoracetamido)-1-hexylphosphoramidit (hergestellt nach Nucl. Acids Res. 16, 2659–2669 (1988)) in Gegenwart von Tetrazol umgesetzt. Die Oxidation des gebildeten Phosphits zum voll geschützten Phosphotriester erfolgt mit Iod in Tetrahydrofuran. Anschließend wird die Säule nacheinander mit Methanol und Wasser gewaschen. Zur Ablösung des modifizierten Oligonucleotids vom festen Träger überführt man den Inhalt der Säule in ein Multivial, versetzt mit 5 ml 30%iger Ammoniaklösung, verschließt das Gefäß und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt dann auf 0°C, zentrifugiert, wäscht den Träger mit 5 ml Wasser und unterzieht die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung.
Zur Reinigung nimmt man das feste Material in 2 ml Wasser auf, versetzt mit 2 ml 0,5 M Ammoniumacetatlösung und mit 10 ml Ethanol, man läßt über Nacht bei –20°C stehen, zentrifugiert, wäscht den Rückstand mit 1 ml Ethanol (–20°C) und trocknet schließlich im Vakuum bei Raumtemperatur. Man erhält 8 mg der Titelverbindung als farbloses Pulver.
b) 10-[5-(2-Carboxyphenyl)-2-hydroxy-5-oxo-4-aza-pentyl]-1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan
50 g (144,3 mmol) 1,4,7-Tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan (D03A) werden in 250 ml Wasser gelöst, und der pH-Wert wird mit 5 N Natronlauge auf pH 13 eingestellt. Dann wird innerhalb einer Stunde eine Lösung aus 38,12 g (187,6 mmol) N-(2,3-Epoxypropyl)phthalimid in 100 ml Dioxan zugetropft, 24 Stunden bei 50°C gerührt und der pH-Wert durch Zugabe von 5 N Natronlauge bei pH 13 gehalten. Die Lösung wird mit 10%iger Salzsäure auf pH 2 eingestellt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in etwas Wasser gelöst und an einer Ionenaustauschersäule (Reillex^TM = Poly-(4-vinyl)-pyridin, man eluiert mit Wasser) gereinigt. Die Hauptfraktionen werden im Vakuum eingedampft, und der Rückstand wird durch Chromatographie an RP-18 (LiChroPrep^TM/Laufmittel: Gradient aus Tetrahydrofuran/Methanol/Wasser) endgereinigt. Nach Eindampfen der Hauptfraktionen erhält man 63,57 g (71% der Theorie) eines amorphen Feststoffes.
Wassergehalt: 8,5%
Elementaranalyse (bezogen auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 52,90; H 6,57; N 12,34;
gef.: C 52,65; H 6,68; N 12,15.
c) 10-(3-Amino-2-hydroxy-propyl)-1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan
50 g (88,1 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 1b werden in 300 ml konz. Salzsäure 24 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in etwas Wasser und reinigt an einer Ionenaustauschersäule (Reillex^TM = Poly(4-vinyl)pyridin (man eluiert mit Wasser)). Die Hauptfraktionen werden zur Trockne eingedampft.
Ausbeute: 39 g (95% der Theorie) eines glasigen Feststoffes
Wassergehalt: 10,3%
Elementaranalyse (bezogen auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 48,68; H 7,93; N 16,70;
gef.: C 48,47; H 8,09; N 16,55.
d) 10-[7-(4-Nitrophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl)-1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan
Zu 14,62 g (34,86 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 1c) in 200 ml Dimethylformamid/20 ml Triethylamin gibt man 9,84 g (41,8 mmol) 3-(4-Nitrophenyl)glutarsäureanhydrid (J. Org. Chem. 26, 3856 (1961) und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Man dampft im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird aus Isopropanol/Essigsäure 95:5 umkristallisiert.
Ausbeute: 21,68 g (95% der Theorie) eines gelblichen Feststoffes
Wassergehalt: 0,9%
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 51,37; H 6,47; N 12,84;
gef.: C 51,18; H 6,58; N 12,67.
e) 10-[7-(4-Aminophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan
21,0 g (32,07 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 1d) werden in 250 ml Methanol gelöst und mit 5 g Palladium-Katalysator (10% Pd auf C) versetzt. Man hydriert über Nacht bei Raumtemperatur. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Ausbeute: 19,63 g (98% der Theorie) eines cremefarbenen Feststoffes
Wassergehalt: 0,8%
Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 53,84; H 6,35; N 12,60;
gef.: C 53,73; F 6,45; N 12,51.
f) 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl)-1,4,7-tris-(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan
12,4 g (19,27 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 1e) werden in 200 ml Wasser gelöst und mit 6,64 g (57,8 mmol) Thiophosgen in 50 ml Chloroform versetzt. Man rührt 1 Stunde bei 50°C. Man kühlt auf Raumtemperatur, trennt die organische Phase ab und schüttelt die wäßrige Phase 2 mal mit 100 ml Chloroform aus. Die wäßrige Phase wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 100 ml Isopropanol bei Raumtemperatur ausgerührt. Der Feststoff wird abfiltriert und mit Ether gewaschen. Nach Trocknen über Nacht im Vakuum (40°C) erhält man 12,74 g (97% der Theorie) eines cremefarbenen Feststoffes.
Wassergehalt: 3,1%
Elementaranalyse (bezogen auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 52,24; H 6,35; N 12,60; S 4,81;
gef.: C 52,37; H 6,44; N 12,48; S 4,83.
g) Konjugat aus 5-(6-Amino-hexyl-phosphorsäureester des 35mer-Oligonucleotids 5'CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' und 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan
8 mg des in Beispiel 1a) erhaltenen Oligonucleotids werden in 2,5 ml von 1 M NaHCO₃/Na₂CO₃-Puffer (pH 8,0) gelöst und mit 1 mg 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris-(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan (Titelverbindung aus Beispiel 1f) versetzt. Man rührt 5 Stunden bei Raumtemperatur, stellt den pH-Wert durch Zugabe von 0,01 M Salzsäure auf 7,2 ein und unterzieht die Lösung einer Ultrafiltration durch eine Membran mit der Ausschlußgrenze 3000 (Amicon YM3) und anschließend einer Gefriertrocknung. Man erhält 7 mg des gewünschten Konjugats.
h) ¹¹¹Indium-Komplex des Thioharnstoff-Konjugats aus 5-(6-Amino-hexyl-phosphorsäureester des 35mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' und 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan
15 μl einer ¹¹¹Indium(III)-acetatlösung (350 μCi), (hergestellt aus ¹¹¹Indium(III)-Chlorid in 2 M Natriumacetatlösung und durch Einstellen des pH-Wertes mit 0,1 M Salzsäure auf pH 4,0) werden in 135 μl einer Lösung aus 1 mg der Titelverbindung aus Beispiel 1g) in MES-Puffer, pH 6,2, gegeben (MES = 2-(N-Morpholino)ethylsulfonsäure). Der pH-Wert wird durch Zugabe von 0,01 M Salzsäure auf pH 4,2 gebracht. Man rührt 1 Stunde bei 37°C bei pH 4,2. Es wird mit 2 M Natriumacetatlösung auf pH 6 gebracht, und es werden 10 μl einer 0,1 M Na₂EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz zugegeben, um überschüssiges ¹¹¹Indium zu komplexieren. Die Endreinigung des so erhaltenen markierten Konjugates (1h) erfolgt durch HPLC (Ausschlußchromatographie: TSK-400/MES-Puffer). Die das markierte Konjugat enthaltenden Fraktionen werden mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt und filtriert. Eine so hergestellte Lösung stellt dann ein geeignetes Präparat für die Radiodiagnostik dar.
Beispiel 2
a) Konjugat aus 5'(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' und N-[2-Amino-3-(4-isothiocyanatophenyl)-propyl]-trans-cyclohexan-1,2-diamin-N,N'-N',N'',N''-pentaessigsäure
8 mg des in Beispiel 1a) erhaltenen Oligonucleotids werden in 2,5 ml NaHCO₃/Na₂CO₃-Puffer (pH 8,0) gelöst und mit 1 mg N-[2-Amino-3-(p-isothiocyanatophenyl)propyl]-trans-cyclohexan-1,2-diamin-N,N',N',N'',N''-pentaessigsäure (hergestellt nach Bioconjugate Chem. 1, 59 (1990)) versetzt. Man rührt 5 Stunden bei Raumtemperatur, stellt dann mit 0,1 M Salzsäure auf pH 7,2 ein und unterzieht die Lösung einer Ultrafiltration durch eine Membran mit der Ausschlußgrenze 3000 (Amicon YM3). Nach Gefriertrocknung erhält man 6 mg des Thioharnstoffkonjugats 2a).
b) Wismut-212-Komplex des Konjugates aus 5'(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' und N-[2-Amino-3-(4-isothiocyanatophenyl)-propyl]-trans-cyclohexan-1,2-diamin-N,N'-N',N'',N''-pentaessigsäure
Eine ²¹²Wismuttetraiodidlösung in 0,1 M Iodwasserstoffsäure wird mit 2 M Essigsäure auf pH 4 gebracht. Ein Aliquot dieser Lösung mit der Aktivität von ca. 3 mCi wird zu 1 mg der Titelverbindung aus Beispiel 2a), gelöst in 0,5 ml 0,02 M MES-Puffer, gegeben und mit 0,5 ml 0,15 M Natriumchloridlösung versetzt. Man rührt 20 Minuten bei Raumtemperatur. Es wird mit 2 M Natriumacetatlösung auf pH 6 gebracht, und 20 μl einer 0,01 M Na₂EDTA-Lösung werden zugegeben. Man rührt 20 Minuten. Die Reinigung des Komplexes erfolgt durch HPLC (Ausschlußchromatographie: TSK-400/MES-Puffer). Die radioaktiven Konjugat-Fraktionen werden vereinigt, mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, und mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt. Nach Filtration erhält man ein für die Radiotherapie geeignetes Präparat.
Beispiel 3
a) Indium-111-Komplex des Konjugats aus 5'(6-Amino-1-hexylphosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' und N-[2-Amino-3-(4-isothiocyanatophenyl)-propyl]-trans-cyclohexan-1,2-diamin-N,N'-N',N'',N''-pentaessigsäure
15 ml einer 15 μl einer ¹¹¹Indium(III)-acetatlösung (350 μCi) (hergestellt aus ¹¹¹Indium(III)-chlorid in 2 M Natriumacetatlösung und durch Einstellen des pH-Wertes mit 0,1 M Salzsäure auf pH 4,0) werden in 0,5 ml einer Lösung aus 1 mg der Titelverbindung aus Beispiel 2a) in MES-Puffer, pH 6,2, gegeben (MES = 2-(N-Morpholino)ethylsulfonsäure). Der pH-Wert wird durch Zugabe von 0,01 M Salzsäure auf pH 5,0 gebracht. Man rührt 1 Stunde bei 37°C bei pH 5,0. Es wird mit 2 M Natriumacetatlösung auf pH 6 gebracht, und 10 μl einer 0,1 M Na₂EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz werden zugegeben, um überschüssiges ¹¹¹Indium zu komplexieren. Die Endreinigung des so erhaltenen markierten Konjugates (1h) erfolgt durch HPLC (Ausschlußchromatographie: TSK-400/MES-Puffer). Die das markierte Konjugat enthaltenden Fraktionen werden mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt und filtriert. Eine so hergestellte Lösung stellt dann ein geeignetes Präparat für die Radiodiagnostik dar.
Beispiel 4
a) Konjugat aus 5'-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGCAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' und 2-(4-Isothiocyanato-benzyl)-diethylentriamin-N,N,N',N'',N''-pentaessigsäure
8 mg des in Beispiel 1a) erhaltenen Oligonucleotids werden in 2,5 ml einer Mischung aus NaHCO₃/Na₂CO₃-Puffer (pH 8,0) gelöst und mit 1 mg 2-(4-Isothiocyanatobenzyl)diethylentriamin-N,N',N',N'',N''pentaessigsäure (hergestellt nach Bioconjugate Chem. 2, 187 (1991)) versetzt. Man rührt 5 Stunden bei Raumtemperatur, stellt dann mit 0,01 M Salzsäure auf pH 7,2 ein und unterzieht die Lösung einer Ultrafiltration durch eine Membran mit der Ausschlußgrenze 3000 (Amicon YM3). Nach Gefriertrocknung erhält man 6 mg des Thioharnstoffkonjugats.
b) Yttrium-90-Komplex des Konjugates aus 5'-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGCAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' und 2-(4-Isothiocyanato-benzyl)-diethylentriamin-N,N,N',N'',N''-pentaessigsäure
Zu 1 mg des Thioharnstoffderivates aus Beispiel 4a) in 0,5 ml 0,05 M Ammoniumacetatlösung mit pH 6 gibt man eine Lösung von ⁹⁰Yttrium, gelöst in 0,05 M Ammoniumacetatlösung (ca. 380 mCi), zu, stellt mit 3 M Essigsäure auf pH 5,2 ein und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Man stellt mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,0 und reinigt das Konjugat durch HPLC auf (TSK-400/MES-Puffer). Die Hauptfraktionen werden vereinigt, mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,2 gebracht. Nach Filtration erhält man ein für die Radiotherapie geeignetes Präparat.
Beispiel 5
a) 5'-(6-Mercapto-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' (modifizierter Ligand für Serinprotease)
Das nach dem SELEX-Verfahren identifizierte 30mer-Oligonucleotid 5'-AGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' (Seq. Nr. 13 aus dem US-Patent Nr. 5,270,163 ), modifiziert in den Zuckereinheiten und durch eine an 5' geknüpfte Sequenz von 5 Tymidinen, wird in üblicher Weise in einem Syntheseautomaten der Fa. Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Hrsg. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid auch auf der Säule des festen Trägers befindet. Durch Reaktion mit Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan wird die 5'-Hydroxygruppe freigelegt. Die Beladung der Säule beträgt ca. 10 mg des 35mer-Oligonucleotids. Zum Anknüpfen des Linkers wird die Säule mit einer Lösung von 50 μmol β-Cyanoethyl-N,N-diisopropylamino-S-trityl-6-mercapto)phosphoramidit in Acetonitril in Gegenwart von Tetrazol umgesetzt. Die Oxidation des gebildeten Phosphits zum voll geschützten Phosphotriester erfolgt mit Iod in Tetrahydrofuran. Anschließend wird die Säule nacheinander mit Methanol und Wasser gewaschen. Zur Ablösung des modifizierten Oligonucleotids vom festen Träger überführt man den Inhalt der Säule in ein Multivial, versetzt mit 5 ml 30%iger Ammoniaklösung, verschließt das Gefäß und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt dann auf 0°C, zentrifugiert, wäscht den Träger mit 5 ml Wasser und unterzieht die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung.
Zur Reinigung nimmt man das feste Material in 2 ml Wasser auf, versetzt mit 2 ml 0,5 M Ammoniumacetatlösung und mit 10 ml Ethanol, man läßt über Nacht bei –20°C stehen, zentrifugiert, wäscht den Rückstand mit 1 ml Ethanol (–20°C) und trocknet schließlich im Vakuum bei Raumtemperatur.
Man erhält 9 mg der S-tritylierten Titelverbindung. Zur Abspaltung der Tritylschutzgruppe löst man das Produkt in 0,5 ml Wasser, versetzt mit 0,1 ml 1 M Silbernitratlösung und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Anschließend versetzt man mit 0,1 ml 1 M Dithiothreitollösung. Nach 15 Minuten zentrifugiert man und extrahiert die überstehende Lösung mehrmals mit Ethylacetat. Aus der wäßrigen Lösung erhält man nach dem Gefriertrocknen 8 mg der gewünschten Titelverbindung.
b) 4-Benzyloxy-N-methansulfonyl-phenylalanin-methylester
Zu 50 g 4-Benzyloxy-phenylalanin-methylester-hydrochlorid in 300 ml Pyridin tropft man bei 0°C 19,58 g Methansulfonsäurechlorid und rührt 3 Stunden bei 0°C. Es wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 500 ml Dichlormethan gelöst. Man schüttelt zweimal mit je 300 ml 5 N Salzsäure aus, trocknet über Magnesiumsulfat und dampft im Vakuum ein. Der Rückstand wird aus 150 ml Methanol umkristallisiert.
Ausbeute: 53,64 g eines farblosen kristallinen Pulvers
c) 2-(4-Benzyloxybenzyl)-1-methansulfonyl-1,4,7-triaza-heptan-3-on
37,2 g 4-Benzyloxy-N-methansulfonyl-phenylalaninmethylester und 1,2 l 1,2-Diaminoethan werden 3 Stunden bei 80°C gerührt. Man dampft den Rückstand zur Trockne ein und rührt mit 200 ml Wasser aus, saugt den Niederschlag ab, wäscht mit Wasser neutral und trocknet über Nacht bei 60°C.
Ausbeute: 37,68 g eines cremefarbigen, amorphen Pulvers
d) 2-(4-Benzyloxybenzyl)-1-methansulfonyl-7-(tert.-butyloxycarbonyl)-1,4,7-triazaheptan-3-on
Eine Lösung von 16,23 g 2-(4-Benzyloxybenzyl)-1-methansulfonyl-1,4,7-triazaheptan-3-on und 4,76 g Triethylamin in 200 ml Chloroform wird bei 0°C mit einer Lösung von 10,27 g Di-tert.-butyl-dicarbonat in 50 ml Chloroform versetzt. Man rührt 5 Stunden bei Raumtemperatur, schüttelt mit 5%iger Natriumcarbonatlösung und Wasser, trocknet über Magnesiumsulfat und dampft im Vakuum ein. Der Rückstand wird aus 100 ml Methanol umkristallisiert.
Ausbeute: 20,19 g eines schaumigen Feststoffes
e) 2-(4-Hydroxybenzyl)-1-methansulfonyl-7-(tert.-butyloxycarbonyl)-1,4,7-triazaheptan-3-on
20 g 2-(4-Benzyloxybenzyl)-1-methansulfonyl-7-(tert.-butyloxycarbonyl)-1,4,7-triazaheptan-3-on, gelöst in 300 ml Dichlormethan, werden mit 4 g Palladium-Kohle (10%ig) über Nacht unter einer Wasserstoffatmosphäre gerührt. Man filtriert und dampft die Lösung im Vakuum ein.
Ausbeute: 16,17 g eines glasigen Schaumes, der nach wenigen Minuten erstarrt
f) 2-[4-(3-Oxapropionsäure-benzylester)-benzyl]-1-methansulfonyl-7-(tert.-butyloxycarbonyl)-1,4,7-triazaheptan-3-on
15 g 2-(4-Hydroxybenzyl)-1-methansulfonyl-7-(tert.-butyloxycarbonyl)-1,4,7-triazaheptan-3-on, 8,56 g Bromessigsäure-benzylester und 13,18 g Kaliumcarbonat werden in 300 ml Acetonitril 24 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Man filtriert und dampft im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird in 200 ml Dichlormethan gelöst, zweimal mit je 50 ml Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Dichlormethan-Hexan-Aceton (20/10/1) als Elutionsmittel chromatographiert.
Ausbeute: 10,06 g eines schaumigen Feststoffs
g) 2-[4-(3-Oxapropionsäure-benzylester)-benzyl]-1-methansulfonyl-1,4,7-triazaheptan-3-on
10 g 2-[4-(3-Oxapropionsäure-benzylester)-benzyl]-1-methansulfonyl-7-(tert.-butyloxycarbonyl)-1,4,7-triazaheptan-3-on werden 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 100 ml Trifluoressigsäure gerührt. Man dampft im Vakuum zur Trockne ein.
Ausbeute: 9,2 g eines glasigen Schaums, der beim Stehen erstarrt
h) 9-Chlor-1-methansulfonyl-2-[4-(3-oxapropionsäure-benzylester)-benzyl]-1,4,7-triaza-3,8-dion
9 g 2-[4-(3-Oxapropionsäure-benzylester)-benzyl]-1-methansulfonyl-1,4,7-triazaheptan-3-on und 1,78 g Triethylamin werden in 200 ml Chloroform gelöst. Bei 0°C werden 1,98 g Chloracetylchlorid, gelöst in 20 ml Chloroform, innerhalb von 30 Minuten zugetropft, und anschließend wird 2 Stunden bei 0°C gerührt. Man wäscht mit 100 ml 5%iger Salzsäure und zweimal mit je 50 ml Wasser, trocknet über Magnesiumsulfat und dampft im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird mit Dichlormethan-Ethylacetat (20/1) als Elutionsmittel an Kieselgel chromatographiert.
Ausbeute: 6,97 g eines wachsartigen Feststoffs
i) 9-Chlor-1-methansulfonyl-2-[4-(3-oxapropionsäurebenzylester)-benzyl]-1,4,7-triaza-3,8-dion
6,5 g 9-Chlor-1-methansulfonyl-2-[4-(3-oxapropionsäure-benzylester)-benzyl]-1,4,7-triaza-3,8-dion, gelöst in 150 ml Dichlormethan, werden mit 2 g Palladium-Kohle (10%ig) über Nacht unter einer Wasserstoffatmosphäre gerührt. Man filtriert und dampft die Lösung im Vakuum ein.
Ausbeute: 5,33 g eines glasigen Feststoffs
j) 10-Acetyl-2-[4-(3-oxapropionsäure)-benzyl]-1-(methansulfonyl)-10-thia-1,4,7-triazadecan-3,8-dion
5 g 9-Chlor-l-methansulfonyl-2-[4-(3-oxapropionsäure-benzylester)-benzyl]-1,4,7-triaza-3,8-dion, gelöst in 80 ml Chloroform, werden mit 1,98 g Triethylamin und 0,74 g Thioessigsäure 10 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Man gießt die Lösung in 200 ml eiskalte 5%ige Salzsäure, trennt die organische Phase ab, trocknet über Magnesiumsulfat und dampft im Vakuum ein. Nach Chromatographie an Kieselgel mit Hexan-Ethylacetat (3/1) erhält man 4,64 g der gewünschten Verbindung als glasigen Feststoff.
k) 10-Acetyl-2-[4-(3-oxapropionsäure-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)-ester)-benzyl]-1-(methansulfonyl)-10-thia-1,4,7-triazadecan-3,8-dion
4 g 10-Acetyl-2-[4-(3-oxapropionsäure)-benzyl]-1-(methansulfonyl)-10-thia-1,4,7-triazadecan-3,8-dion, 1,91 g Dicyclohexylcarbodiimid, 4 g N-Hydroxysuccinimid und 30 mg 4-Dimethylaminopyridin werden 24 Stunden in 20 ml Chloroform bei Raumtemperatur gerührt. Man versetzt dann mit 20 ml Diethylether, filtriert und dampft den Rückstand im Vakuum ein. Der Rückstand wird an Kieselgel mit Dichlormethan-Dioxan (10/1) als Elutionsmittel chromatographiert.
Ausbeute: 3,47 g eines cremefarbigen Feststoffs
Elementaranalyse:
ber.: C 46,15; H 4,93; N 9,78; S 11,20;
gef.: C 46,03; H 4,83; N 9,64; S 11,05.
l) 10-Acetyl-2-{4-[3-oxapropionsäure-(6-maleimidohexanoyl)-hydrazid]-benzyl}-1-methansulfonyl-10-thia-1,4,7-triazadecan-3,8-dion
3 g 10-Acetyl-2-[4-(3-oxapropionsäure-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)-ester)-benzyl]-1-(methansulfonyl)-10-thia-1,4,7-triazadecan-3,8-dion und 1,17 g 6-Maleimidocapronsäurehydrazid (Science 261, 212 (1993)) werden in 40 ml Dimethylformamid 5 Stunden bei 60°C gerührt. Unter starkem Rühren tropft man 100 ml Wasser zu und filtriert vom ausgefallenen Niederschlag ab. Man trocknet im Vakuum und reinigt den Rückstand durch eine FLASH-Chromatographie an einer Kieselgelsäule mit Dichlormethan/Dioxan (10/1) als Elutionsmittel. Man erhält 2,8 g der Titelverbindung als weißen Feststoff.
Elementaranalyse (bezogen auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 49,25; H 5,61; N 12,30; S 9,39;
gef.: C 49,33; H 5,95; N 12,43; S 9,11.
m) Konjugat aus 5'-(6-Mercapto-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' und 10-Acetyl-2-{4-[3-oxapropionsäure-(6-maleimido-)hexanoyl)hydrazid]-benzyl}-1-methansulfonyl-10-thia-1,4,7-triazadecan-3,8-dion
5 mg des nach Beispiel 5a) hergestellten thiolhaltigen Oligonucleotids werden in 2 ml Phosphatpuffer (pH 7,4) mit 1 mg des nach Beispiel 51) hergestellten Maleimidderivates, gelöst in 0,2 ml Dimethylformamid, versetzt. Man läßt 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen und unterzieht die Lösung einer Ultrafiltration durch eine Membran mit der Ausschlußgrenze 3000 (Amicon YM3) und anschließend einer Gefriertrocknung. Man erhält 5 mg des gewünschten Konjugats.
n) Technetium-99m-Komplex des Konjugates aus 5'-(6-Mercapto-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' und 10-Acetyl-2-{4-[3-oxapropionsäure-(6-maleimido-)hexanoyl)hydrazid]-benzyl}-1-methansulfonyl-10-thia-1,4,7-triazadecan-3,8-dion
1 ml einer Lösung von Kalium-D-glucarat (12 mg/ml) und Zinn(II)-chlorid (100 μg/ml) in 0,2 M NaHCO₃ werden in einem Vial gefriergetrocknet und anschließend mit [Tc-99m]-Natriumpertechnetatlösung (1 ml, 1 mCi) aus einem Mo-99/Tc-99m-Generator versetzt. Nach Stehen bei Raumtemperatur für 15 Minuten entnimmt man ein Aliquot und versetzt mit dem gleichen Volumen des in 0,2 M NaHCO₃-Lösung gelösten Konjugats aus Beispiel 5m) (1 mg/ml). Nach 15 Minuten zeigten sowohl Dünnschichtchromatographie als auch HPLC, daß > 98% der Radioaktivität von dem Konjugat aufgenommen worden waren.
Beispiel 6
a) Konjugat aus 5'-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' und S-Benzoyl-MAG3-2,3,5,6-tetrafluorphenylester
Zu 8 mg der Titelverbindung aus Beispiel 1a), gelöst in 0,5 ml 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 7), gibt man 3 mg S-Benzoyl-MAG₃-2,3,5,6-tetrafluorphenylester (hergestellt nach US 4,965,392 ), gelöst in 0,2 ml Dimethylformamid, und rührt 3 Stunden bei Raumtemperatur. Man verdünnt mit Wasser und unterzieht die Lösung einer Ultrafiltration (Amicon YM3, Ausschlußgrenze 3000). Nach Gefriertrocknung erhält man 5 mg des Konjugates 6a).
b) ^99mTechnetium-Komplex des Konjugates aus 5'-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' und S-Benzoyl-MAG₃-2,3,5,6-tetrafluorphenylester
1 mg der Titelverbindung aus Beispiel 6a) wird in 200 μl Wasser gelöst und mit 1 ml 0,1 M Phosphat-Puffer mit pH 8,5 versetzt. Zu dieser Mischung gibt man 200 μl ^99mTechnetium(V)-gluconatlösung (ca. 15 mCi) und läßt 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Die Markierungsausbeute (bestimmt mittels HPLC) beträgt ca. 95%.
Beispiel 7
a) Konjugat aus dem 5'-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' und dem ^99mTechnetium-Komplex des 2,3,5,6-Tetrafluorphenyl-4,5-bis(mercaptoacetamido)-pentansäureesters
Zum ^99mTechnetium-Komplex von 2,3,5, 6-Tetrafluorphenyl-4,5-bis(mercaptoacetamido)-pentansäureester (hergestellt nach: J. Nucl. Med. 32, 1445 (1991)), ca. 100 mCi, gelöst in 2 ml Phosphat-Puffer, pH 7,2, gibt man 3 mg der Titelverbindung aus Beispiel 1a), gelöst in 0,6 ml Phosphat-Puffer. Man stellt mit 1.0 M Kaliumcarbonat-Puffer auf einen pH-Wert von 10 ein und rührt 20 min bei Raumtemperatur. Zur Endreinigung gibt man die Lösung auf eine Sephadex-Säule (Pharmacia) und eluiert mit 75 mmol Natriumchloridlösung. Die Hauptfraktionen werden vereinigt, mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und filtriert. Die so erhaltene Lösung kann für radiodiagnostische Untersuchungen eingesetzt werden.
Beispiel 8
a) Konjugat aus 5'-(6-Mercapto-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' und 5'-(N-Maleimido)-3-oxapentyl-{2-[3-carboxybenzoyl)-thio]-acetyl}-glycylglycylglycinat
5 mg des nach Beispiel 5a) hergestellten thiohaltigen Oligonucleotids werden unter N₂ in 2 ml Phosphatpuffer (pH 7,4) mit 1 mg 5-(N-Maleimido)-3-oxapentyl-{2-[3-carboxybenzoyl)-thio]-acetyl}-glycylglycylglycinat (hergestellt nach Bioconj. Chem. 1, 431 (1990)), gelöst in 0,2 ml Dimethylformamid, versetzt. Man läßt 2 Stunden bei Raumtemperatur rühren und unterzieht die Lösung einer Ultrafiltration durch eine Membran (Amicon YM3) und anschließend einer Gefriertrocknung. Man erhält 5,5 mg des gewünschten Konjugats.
b) Technetium-99m-Komplex des Konjugats 5'-(6-Mercapto-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' und 5'-(N-Maleimido)-3-oxapentyl-{2-[3-carboxybenzoyl)-thio]-acetyl}-glycylglycylglycinat
1 ml einer Lösung von Kalium-D-glucarat (12 mg/ml) und Zinn(II)chlorid (100 μg/ml) in 0,2 M NaHCO₃ werden in einem Vial gefriergetrocknet und anschließend mit [Tc-99m]-Natriumpertechnetatlösung (1 ml, 1 mCi) aus einem Mo-99/Tc-99m-Generator versetzt. Nach Stehen bei Raumtemperatur für 15 Minuten entnimmt man ein Aliquot und versetzt mit dem gleichen Volumen des in 0,2 M NaHCO₃-Lösung gelösten Konjugats aus Beispiel 8a) (1 mg/ml). Die Substanz kann durch Gefriertrocknung isoliert werden. Die durch HPLC bestimmte Markierungsausbeute beträgt > 96%.
Beispiel 9
a) Konjugat aus 5'-(6-Mercapto-1-hexyl-phosphonsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' und 1-[6-(2-Vinyl-6-hexyloxymethyl)-pyridin]-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan
Man versetzt unter N₂ eine Lösung von 4 mg des nach Beispiel 5a) hergestellten thiohaltigen Oligonucleotids in 2 ml Phosphatpuffer (pH 7,4) mit 1 mg 1-[6-(2-Vinyl-6-hexyloxymethyl)-pyridin]-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan (hergestellt nach EP 0 588 229 ), gelöst in 0,5 ml Dimethylformamid. Man lässt 4 Stunden bei 35°C rühren, versetzt mit 10 ml Ethanol und isoliert das Produkt durch Zentrifugieren. Die Reinigung erfolgt durch Reversed-Phase-Chromatographie an einer 1 × 25cm-Säule mit einem 50 mmol Triethylammoniumacetat (pH 7)/Acetonitril-Gradienten. Die zusammengefaßten Fraktionen werden gefriergetrocknet, in 1 ml Wasser gelöst und an einer Sephadex-G-10-Säule entsalzt. Die Titelverbindung (ca. 4 mg) wird durch Gefriertrocknen isoliert.
b) Tc-99m-Komplex des Konjugats aus 5'-(6-Mercapto-1-hexylphosphonsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' und 1-[6-(2-Vinyl-6-hexyloxymethyl)-pyridin]-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan
Man verfährt wie in Beispiel 8b) beschrieben. Die durch HPLC bestimmte Markierungsausbeute beträgt 92%.
Beispiel 10
a) Konjugat aus 5'-(6-Mercapto-1-hexyl-phosphonsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' und N-[4-Hydroxy-3-(1,4,8,11-tetraaza-cyclotetradec-5-yl)-benzyl]-2-(6-vinylpyridin-2-ylmethoxy)-acetamid
Man versetzt eine Lösung von 6,5 mg des nach Beispiel 5a) hergestellten thiolhaltigen Oligonucleotids in 2 ml Phosphatpuffer (pH 8,0) mit 1,2 mg N-[4-Hydroxy-3-(1,4,8,11-tetraaza-cyclotetradec-5-yl)-benzyl-2-(6-vinylpyridin-2-ylmethoxy)-acetamid (hergestellt nach J. Chem. Soc., Chem. Commun. 156 (1988)), gelöst in 0,1 ml Dimethylformamid. Man rührt 4 Stunden unter N₂ bei 35°C, versetzt mit 10 ml Ethanol und isoliert das Produkt durch Zentrifugieren. Die Reinigung erfolgt durch Reversed-Phase-Chromatographie an einer 1 × 25cm-Säule mit einem 50 mmol Triethylammoniumacetat (pH 7)/Acetonitril-Gradienten. Die vereinigten Fraktionen werden an einer Sephadex-G-10-Säule entsalzt. Durch Gefriertrocknung erhält man 5 mg der Titelverbindung als weißes Pulver.
b) Kupfer-64-Komplex des Konjugates aus 5'-(6-Mercapto-1-hexyl-phosphonsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' und N-[4-Hydroxy-3-(1,4,8,11-tetraaza-cyclotetradec-5-yl)-benzyl-2-(6-vinyl-pyridin-2-ylmethoxy)-acetamid
1 mg des nach 10a) erhaltenen Konjugats werden in 1 ml Phosphatpuffer (pH 8) mit ⁶⁴CuCl₂ (0,2 mCi) inkubiert. Die Markierungsausbeute, nach 1 Stunde durch HPLC bestimmt, beträgt > 98%. Das Produkt wird durch Gefriertrocknung isoliert.
Beispiel 11
a) Konjugat aus 5'-(6-Mercapto-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' und 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-octan]-1,4,7,10-tetraessigsäure
Zu einer Lösung von 5 mg des nach Beispiel 5a) hergestellten thiolhaltigen Oligonucleotids in 2 ml Phosphatpuffer (pH 8) gibt man unter N₂ 1 mg 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-octan]-1,4,7,10-tetraessigsäure (hergestellt nach J. Chem. Soc., Chem. Commun. 796, (1989)). Man rührt 3 Stunden bei 35°C, versetzt mit 10 ml Isopropylalkohol und isoliert das Produkt durch Zentrifugieren. Die Reinigung erfolgt durch Reversed-Phase-Chromatographie an einer 1 × 25cm-Säule mit einem 25 mmol Triethylammoniumacetat (pH 7)/Acetonitril-Gradienten. Die vereinigten Fraktionen werden im Vakuum schonend eingedampft, in wenig Wasser gelöst und mit Hilfe einer Sephadex-G-10-Säule entsalzt. Durch Gefriertrocknung erhält man 4 mg der Titelverbindung als weißes Pulver.
b) Yttrium-90-Komplex des Konjugats aus 5'-(6-Mercapto-1-hexyl-phosphonsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' und 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-octan]-1,4,7,10-tetraessigsäure
⁹⁰Y-acetat (1 mCi), gelöst in 1 ml 0,05 M Ammoniumacetatlösung, wird mit 1 mg des nach Beispiel 11a) hergestellten Konjugats versetzt und 1 Stunde auf 85°C erhitzt. Die durch HPLC bestimmte Markierungsausbeute beträgt > 95%. Das Produkt wird durch Gefriertrocknung isoliert.
Beispiel 12
a) Konjugat aus 5'-(6-Mercapto-1-hexyl-phosphonsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' und 1,4,7-Triazacyclononan-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-octan]-1,4,7-triessigsäure
Zu einer Lösung von 5 mg des nach Beispiel 5a) hergestellten thiolhaltigen Oligonucleotids in 2 ml Phosphatpuffer (pH 8) gibt man unter N₂ 1 mg 1,4,7,10-Triazacyclononan-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-octan]-1,4,7-triessigsäure (hergestellt nach J. Chem. Soc., Chem. Commun. 794, (1989)). Man rührt 6 Stunden bei 35°C, versetzt mit 10 ml Isopropanol und isoliert das Produkt durch Zentrifugieren. Die Reinigung erfolgt durch Reversed-Phase-Chromatographie an einer 1 × 25cm-Säule mit einem 25 mmol Triethylammoniumacetat (pH 7)/Acetonitril-Gradienten. Die vereinigten Fraktionen werden schonend im Vakuum eingedampft, in wenig Wasser gelöst und mit Hilfe einer Sephadex-G-10-Säule entsalzt. Durch Gefriertrocknung erhält man 3 mg der Titelverbindung als weißes Pulver.
b) Gallium-67-Komplex des Konjugats aus 5'-(6-Mercapto-1-hexyl-phosphonsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' und 1,4,7-Triazacyclononan-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-octan]-1,4,7-triessigsäure
20 mg des nach Beispiel 12a) hergestellten Konjugats werden in 0,5 ml 0,1 M Citratpuffer mit pH 4,5 gelöst und mit 0,1 ml einer Gallium-67-citratlösung (0,2 mCi) versetzt. Man läßt 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen und entsalzt das Produkt an einer Sephadex-G-10-Säule. Nach Gefriertrocknung erhält man 17 mg der Titelverbindung als weißes Pulver.
Beispiel 13
a) Phosphitylierung von 5'-0-(4,4'-Dimethoxytrityl)-5-(prop-2-en-1-on)-2'-desoxyuridin
Zu einer gerührten Lösung von 2,1 g (3,59 mmol) 5'-0-(4,4'-Dimethoxytrityl)-5-(prop-2-en-1-on)-2'-desoxyuridin (hergestellt nach Nucleosides & Nucleotides 13, 939–944, (1994)) in 50 ml Tetrahydrofuran gibt man nacheinander 50 mg 4-Dimethylaminopyridin, 3 ml Diisopropylethylamin und 962 μl (4,31 mmol) 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit. Nach ca. 30 Minuten bildet sich ein weißer Niederschlag. Man filtriert, engt die Lösung im Vakuum ein und verteilt den Rückstand zwischen Dichlormethan und 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung. Die Dichlormethanphase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Den Rückstand reinigt man durch rasche Chromatographie an Kieselgel, wobei man mit Dichlormethan/Hexan/Diisopropylethylamin (80:18:2) eluiert. Man erhält 1,8 g der gewünschten Verbindung als weißen Schaum.
Elementaranalyse:
ber.: C 64,28; H 6,29; N 7,14; P 3,95;
gef.: C 64,02; H 6,60; N 7,21; P 4,09.
b) Konjugat aus dem 36mer-Oligonucleotid U^*T*T*T*T*TCUCAUGGAGCCAAGACGAAUAGCUACAUA-3' und 10-(4-Aza-2-hydroxy-5-imino-8-mercapto-octan-1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan

U^*: 5-(Prop-2-en-1-on)-2'-desoxyuridin

Das nach dem SELEX-Verfahren identifizierte 30mer-Oligonucleotid wird mit der Modifikation einer an 5'angeknüpften Sequenz 5'-T*T*T*T*T in üblicher Weise in einem Syntheseautomaten der Fa. Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Hrsg. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid auch auf der Säule des festen Trägers befindet. Durch Reaktion mit Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan wird die 5'-Hydroxygruppe freigelegt. Die Beladung der Säule beträgt ca. 10 mg des 35mer-Oligonucleotids. Die 5'-Hydroxygruppe wird in Gegenwart von Tetrazol mit dem nach Beispiel 13a) erhaltenen Phosphoramidit umgesetzt.
Anschließend wird durch Behandlung mit Iodlösung das Phosphit in den Phosphotriester überführt und durch Reaktion mit Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan der terminale DMT-Rest abgespalten. Zur Addition einer Thiolgruppe an das am terminalen 2'-Desoxyuridin befindliche α,β-ungesättigte Carbonylsystem setzt man mit einer Lösung von 10-(4-Aza-2-hydroxy-5-imino-8-mercaptooctan)-1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan^*) in Tetrahydrofuran um und wäscht nacheinander mit Methanol und Wasser. Zur Ablösung des modifizierten Oligonucleotids vom festen Träger überführt man den Inhalt der Säule in ein Multivial, versetzt mit 5 ml 30%iger Ammoniaklösung, verschließt das Gefäß und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt dann auf 0°C, zentrifugiert, wäscht den Träger mit 5 ml Wasser und unterzieht die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung.
Zur Reinigung nimmt man das feste Material in 2 ml Wasser auf, versetzt mit 2 ml 0,5 M Ammoniumacetatlösung und mit 10 ml Ethanol, läßt über Nacht bei –20°C stehen, zentrifugiert, wäscht den Rückstand mit 1 ml Ethanol (–20°C) und trocknet schließlich im Vakuum bei Raumtemperatur.
Man erhält 6 mg der Titelverbindung als farbloses Pulver.

^*) 10-(4-Aza-2-hydroxy-5-imino-8-mercapto-octan)-1,4,7-tris-(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan erhält man wie nachfolgend beschrieben:

Zu einer Lösung von 1,46 g (3,49 mmol) 10-(3-Amino-2-hydroxy-propyl)-1,4,7-tris-(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan (siehe Beispiel 1c) in einer Mischung aus 50 ml Wasser und 50 ml Methanol gibt man 15,7 ml 1 N Natronlauge und 480 mg (3,49 mmol) 2-Iminotetrahydrothiophenhydrochlorid und rührt 3 Stunden bei Raumtemperatur, engt im Vakuum auf ca. 1/4 des anfäng lichen Volumens ein und versetzt unter Rühren mit einem Anionenaustauscher (IRA 410), bis ein pH von 11 erreicht ist. Man filtriert und versetzt die Lösung unter Rühren in kleinen Portionen mit Kationenaustauscher IRC 50, bis ein pH von 3,5 erreicht ist. Nach Filtrieren wird die Lösung gefriergetrocknet. Man erhält 1,39 g der gewünschten Substanz als weißes Pulver mit einem Wassergehalt von 4,9%.
Elementaranalyse (bezogen auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 48,45; H 7,74; N 16,14; S 6,16;
gef.: C 48,30; H 7,98; N 16,05; S 6,44.
c) Yttrium-90-Komplex des Konjugates aus dem 36mer-Oligonucleotid U^*T*T*T*T*TCUCAUGGAGCCAAGACGAAUAGCUACAUA-3' und 10-(4-Aza-2-hydroxy-5-imino-8-mercapto-octan)-1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan

U^*: 5-(Prop-2-en-1-on)-2'-desoxyuridin

Zu 1 mg des Thioderivates aus Beispiel 13b) in 0,5 ml 0,05 M Ammoniumacetatlösung mit pH 6 gibt man eine Lösung von ⁹⁰Yttrium, gelöst in 0,05 M Ammoniumacetatlösung (ca. 380 mCi), zu, stellt mit 3 M Essigsäure auf pH 5,2 ein und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Man stellt mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,0 ein und reinigt das Konjugat durch HPLC auf (TSK-400/MES-Puffer). Die Hauptfraktionen werden vereinigt, mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,2 gebracht. Nach Filtration erhält man ein für die Radiotherapie geeignetes Präparat.
Beispiel 14
a) S-(Triphenylmethyl-mercaptoacetyl)-glycylglycinmethylester
3,34 g (10 mmol) S-Triphenylmethylmercaptoessigsäure und 1,83 g (10 mmol) Glycylglycinmethylesterhydro chlorid werden in 250 ml absolutem Dichlormethan suspendiert. Nach Zugabe von 1,01 g (10 mmol) Triethylamin tropft man unter Eiskühlung 2,06 g (10 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 50 ml absolutem Dichlormethan, hinzu. Es wird 1 Stunde bei 0°C und 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Man filtriert, engt ein und chromatographiert an Kieselgel (Laufmittel: CH₂Cl₂/MeOH: 10%–30%).
Ausbeute: 3,56 g (77,0% der Theorie), weißes Pulver
Elementaranalyse:
ber.: C 67,51; H 5,67; N 6,06; 0 13,84; S 11,20;
gef.: C 67,37; H 6,02; N 5,91; S 6,73.
b) [S-(Triphenylmethyl-mercaptoacetyl)-glycylglycinamidyl]-6-hexanol
4,63 g (10 mmol) des unter Beispiel 14a) hergestellten S-(Triphenylmethyl-mercaptoacetyl)-glycylglycinmethylesters werden in 11,72 g (100 mmol) 6-Aminohexanol/50 ml 1,4-Dioxan unter Argonatmosphäre 2 Stunden auf 100°C erhitzt. Anschließend gießt man den Reaktionsansatz auf ein Gemisch aus 100 ml Dichlormethan und 100 ml Wasser. Unter Rühren und Eiskühlung wird mittels 10 M Salzsäure ein pH-Wert von 6 eingestellt, die organische Phase abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wird das Rohprodukt an Kieselgel gereinigt (Laufmittel: CH₂Cl₂/MeOH: 10%–50%).
Ausbeute: 2,97 g (54,2% der Theorie), weißes Pulver
Elementaranalyse:
ber.: C 67,98; H 6,81; N 7,67; O 11,68; S 5,85;
gef.: C 67,72; H 6,93; N 7,93; S 5,64.
c) O-{[S-(Triphenylmethyl-mercaptoacetyl)-glycylglycinamidyl]-6-hex-1-yl}-diisopropylamid-O'-methylphosphorigsäurediester
5,48 g (10 mmol) des unter Beispiel 14b) hergestellten [S-(Triphenylmethyl-mercaptoacetyl)-glycylglycin amidyl]-6-hexanols werden in 100 ml absolutem Dichiormethan gelöst. Man setzt unter Argonatmosphäre 5,17 g (40 mmol) Diisopropylethylamin hinzu und tropft bei 0°C 3,95 g (20 mmol) Phosphorigsäuremonomethylesterdiisopropylamidchlorid, gelöst in 50 ml absolutem Dichlormethan, hinzu. Es wird 0,5 Stunden bei 0°C und abschließend 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wird unter Eiskühlung mit 320 mg (10 mmol) absolutem Methanol versetzt und nach Aufkonzentrieren an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: CH₂Cl₂/MeOH: 95%:5/5% Triethylamin).
Ausbeute: 1,98 g (27,9% der Theorie), farbloses Öl
d) 5'-[(Mercaptoacetyl-glycyl-glycyl-amidyi)-6-hex-1-yl]-phosphorsäureester des 35mer-Oligonucleotids 5'-T*T*T*T*TCUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3'
Ein nach dem SELEX-Verfahren identifiziertes 30mer-Oligonucleotid mit der Modifikation einer an 5'angeknüpften Sequenz 5'-T*T*T*T*T wird mit Hilfe eines Syntheseautomaten der Firma Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Hrsg. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid in geschützter Form auch auf der Säule des festen Trägers befindet. Die Beladung der Säule beträgt ca. 15 mg 35mer-Oligonucleotid. Nach Abspaltung der 5'-DMT-Schutzgruppe (Trichloressigsäure/Dichlormethan) wird nach den Standardmethoden mit dem unter Beispiel 14c) beschriebenen Phosphoramidit gekoppelt. Nach Oxidation mit Iod in Tetrahydrofuran wird das Konjugat vom Träger abgespalten. Hierzu versetzt man das Material mit 10 ml 30%iger Ammoniaklösung, verschließt das Gefäß und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt auf 0°C, zentrifugiert, wäscht den Träger mit 10 ml Wasser und unterzieht die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung.
Zur Reinigung nimmt man das Material in 5 ml Wasser auf, versetzt mit 4 ml 0,5 M Ammoniumacetatlösung und mit 20 ml Ethanol. Zur Vervollständigung der Fällung stellt man über Nacht kalt (–20°C), zentrifugiert, wäscht den Rückstand mit 1 ml Ethanol (–20°C) und trocknet im Vakuum. Man erhält 9 mg eines weißen Pulvers.
Zur Abspaltung der S-Tritylschutzgruppe wird das Material in 5 ml 50 mmol Triethylammoniumacetatlösung (pH 7,0) aufgenommen und mit 500 μl 0,1 M Silbernitratlösung 30 min inkubiert. Anschließend setzt man 500 μl 0,14 M Dithiothreitollösung hinzu und inkubiert weitere 30 min. Nach Zentrifugieren wird der klare Überstand an Sephadex G 10 entsalzt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden lyphilisiert. Man erhält 4 mg des Konjugats als weißes Pulver.
e) Technetium-99m-Komplex des Konjugats 5'-[(Mercaptoacetyl-glycyl-glycyl-amidyl)-6-hex-1-yl]phosphorsäureester des 35mer-Oligonucleotids 5'-T*T*T*T*TCUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3'
1 mg des Konjugates 14d) werden in 1 ml 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphatpuffer (pH 9,5) gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatriumtartrat versetzt man mit Natriumpertechnetatlösung (1 mCi) und anschließend mit 10 ml Zinn(II)-chloridlösung (5 mg SnCl₂/1 ml 0,01 M HCl). Die Markierungsausbeute (ca. 93%) wird durch HPLC bestimmt.
Beispiel 15
a) O-{[S-(Triphenylmethyl-mercaptoacetyl)-glycyl-glycinamidyl]-6-hex-1-yl}-toluolsulfonsäureester
5,48 g (10 mmol) des unter Beispiel 14b) hergestellten [S-(Triphenylmethyl-mercaptoacetyl)-glycyl-glycinamidyl]-6-hexanols werden in 100 ml absolutem Dichlor methan gelöst. Man setzt 1,01 g (10 mmol) Triethylamin und 1,91 g (10 mmol) p-Toluolsulfonsäurechlorid hinzu und rührt 24 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird aufkonzentriert und an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: CH₂Cl₂/MeOH: 95:5).
Ausbeute: 4,32 g (61,5% der Theorie), farbloses Öl
Elementaranalyse:
ber.: C 65,03; H 6,18; N 5,99; O 13,68; S 9,14;
gef.: C 64,93; H 6,32; N 5,78; S 8,87.
b) 5'-[(Mercaptoacetyl-glycyl-glycin-amidyl)-6-hex-1-yl]phosphorsäureester des 35mer-Oligonucleotids 5'-T*T*T*T*TCUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3'
Ein nach dem SELEX-Verfahren identifiziertes 30mer-Oligonucleotid mit der Modifikation einer an 5'angeknüpften Sequenz 5'-T*T*T*T*T wird mit Hilfe eines Syntheseautomaten der Firma Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Hrsg. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid in geschützter Form auch auf der Säule des festen Trägers befindet. Die Beladung der Säule beträgt ca. 15 mg 35mer-Oligonucleotid. Nach Abspaltung der 5'-DMT-Schutzgruppe (Trichloressigsäure/Dichlormethan) wird nach den Standardmethoden mit S-Trityl-6-mercaptohexylphosphoramidit gekoppelt. Nach Oxidation mit Iod in Tetrahydrofuran wird die tritylgeschützte Verbindung vom Träger abgespalten, isoliert und gereinigt (siehe Beispiel 14d).
Die Abspaltung der S-Tritylschutzgruppe, die Isolation des SH-gruppentragenden Oligonucleotids und die Reinigung geschehen wie unter Beispiel 14d) beschrieben (6 mg).
Zur Kopplung wird das SH-gruppentragende 35mer-Oligonucleotid (6 mg) in 500 μl 0,1 M Natriumcarbonat lösung unter Argonatmosphäre mit 100 mg Toluolsulfonsäureester 15a), gelöst in 500 μl Dimethylformamid, versetzt. Nach 30 min wird neutralisiert und mit Wasser auf ein Volumen von 5 ml verdünnt. Nach dem Zentrifugieren wird der klare Überstand lyophilisiert.
Zur Abspaltung der S-Tritylgruppen wird wie unter 14d) beschrieben verfahren. Man erhält nach Reinigung 4 mg Konjugat.
c) Technetium-99m-Komplex des Konjugats 5'-[(Mercaptoacetyl-glycyl-glycin-amidyl)-6-hex-1-yl]phosphorsäureester des 35mer-Oligonucleotids 5'-T*T*T*T*TCUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3'
1 mg des unter Beispiel 15b) beschriebenen Konjugates wird in 1 ml 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphatpuffer (pH = 9,5) gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatriumtartrat versetzt man mit Natriumpertechnetatlösung (1 mCi) und anschließend mit 10 μl Zinn(II)-chloridlösung (5 mg SnCl₂/1 ml 0,01 M HCl). Die Markierungsausbeute (ca. 95%) wird durch HPLC bestimmt.
Beispiel 16
a) N-[3-Thia-5-(triphenylmethylmercapto)-1-oxo-pent-1-yl]-S-triphenylmethyl-cysteinmethylester
2,69 g (10 mmol) N-[3-Thia-5-(triphenylmethylmercapto)-1-oxo-pent-1-yl]-S-triphenylmethyl-cysteinmethylester (Herstellung nach DE 43 10 999 ) werden zusammen mit 5,58 g (20 mmol) Triphenylmethylchlorid in 100 ml absolutem Dichlormethan gelöst. Nach Zugabe von 2,02 g (20 mmol) Triethylamin läßt man über Nacht unter Argonatmosphäre bei Raumtemperatur rühren. Zur Aufarbeitung wird die organische Phase jeweils dreimal mit 1%iger Citronensäurelösung, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und mit Wasser gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat wird eingeengt und an Kieselgel gereinigt (Laufmittel: CH₂Cl₂/MeOH: 95:5).
Ausbeute: 4,53 g (60,1% der Theorie) farbloses Öl
Elementaranalyse:
ber.: C 73,27; H 5,75; N 1,86; O 6,37; S 12,76;
gef.: C 73,31; H 5,48; N 1,63; S 12,49.
b) N-[3-Thia-5-(triphenylmethylmercapto)-1-oxo-pent-1-yl]-S-triphenylmethyl-N'-(6-hydroxy-hex-1-yl)cysteinamid
7,54 g (10 mmol) des unter Beispiel 16a) beschriebenen N-[3-Thia-5-(triphenylmethylmercapto)-1-oxo-pent-1-yl]-S-cysteinmethylesters werden in 11,72 g (100 mmol) 6-Aminohexanol/50 ml 1,4-Dioxan unter Argonatmosphäre 2 Stunden auf 100°C erhitzt. Anschließend gießt man den Reaktionsansatz auf ein Gemisch aus 100 ml Dichlormethan und 100 ml Wasser. Unter Rühren und Eiskühlung wird mittels 10 M Salzsäure ein pH-Wert von 6 eingestellt, die organische Phase abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird das Rohprodukt an Kieselgel gereinigt (Laufmittel: CH₂Cl₂/MeOH: 5%–50%).
Elementaranalyse:
ber.: C 72,99; H 6,49; N 3,34; O 5,72; S 11,46;
gef.: C 72,73; H 6,62; N 3,11; S 11,17.
c) O-{{[N-[3-Thia-5-(triphenylmethylmercapto)-1-oxo-pent-1-yl]-S-triphenylmethyl-cysteinyl}-2-amino-eth-1-yl}diisopropylamid-O'-methylphosphorigsäurediester
8,39 g (10 mmol) des unter Beispiel 16b) hergestellten N-[3-Thia-5-(triphenylmethylmercapto)-1-oxo-pent-1-yl]-S-triphenylmethyl-N'-(6-hydroxy-hex-1-yl)cysteinamids werden in 200 ml absolutem Dichlormethan gelöst. Man setzt unter Argonatmosphäre 5,17 g (40 mmol) Diisopropylethylamin hinzu und tropft bei 0°C 3,95 g (20 mmol) Phosphorigsäuremonomethylesterdiisopropylamidchlorid, gelöst in 50 ml absolutem Dichlormethan, hinzu. Es wird 0,5 Stunden bei 0°C und anschließend 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wird unter Eiskühlung mit 320 mg (10 mmol) absolutem Methanol versetzt und nach Aufkonzentrieren an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: CH₂Cl₂/MeoH: 95:5/5% (Triethylamin).
Ausbeute: 5,37 g (53,7% der Theorie) gelbliches Öl
d) 5'-[N-(3-Thia-5-mercapto-1-oxo-pent-1-yl)-cystein-N'-(6-hydroxy-hex-1-yl)-amid]-phosphorsäureester des 35mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3'
Ein nach dem SELEX-Verfahren identifiziertes 30mer-Oligonucleotid wird mit der Modifikation einer vorgeschalteten Sequenz T*T*T*T*T-3' mit Hilfe eines Syntheseautomaten der Firma Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Herausgeber F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid in geschützter Form auch auf der Säule des festen Trägers befindet. Die Beladung der Säule beträgt ca. 15 mg 35mer-Oligonucleotid. Nach Abspaltung der 5'-DMT-Schutzgruppe (Trichloressigsäure/Dichlormethan) wird nach den Standardmethoden mit Phosphoramidit (16c) gekoppelt und anschließend oxidiert.
Die Abspaltung vom Träger der Basen-Schutzgruppen und die Aufreinigung des bis-S-tritylgeschützten Konjugates geschieht wie unter 14d) beschrieben (ca. 12 mg).
Zur Abspaltung der S-Tritylschutzgruppen wird das Material in 5 ml 50 mmol Triethylammoniumacetatlösung (pH = 7,0) aufgenommen und mit 500 μl 0,1 M Silbernitratlösung 30 min inkubiert. Anschließend setzt man 500 μl 0,14 M Dithiothreitollösung hinzu und inkubiert weitere 30 min. Nach Zentrifugieren wird der klare Überstand an Sephadex G 10 entsalzt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden lyophilisiert. Man erhält 5 mg weißes Pulver.
e) Technetium-99m-Komplex des Konjugats 5'-[N-(3-Thia-5-mercapto-1-oxo-pent-1-yl)-cystein-N'-(6-hydroxy-hex-1-yl)-amid]-phosphorsäureester des 35mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3'
1 mg des unter Beispiel 16d) beschriebenen Konjugates wird in 1 ml 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphatpuffer (pH = 9,5) gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatriumtartrat versetzt man mit Natriumpertechnetatlösung (1 mCi) und anschließend mit 10 ml Zinn(II)-chloridlösung (5 mg SnCl₂/1 ml 0,01 M HCl). Die Markierungsausbeute (ca. 96%) wird durch HPLC bestimmt.
Beispiel 17
a) O-{N-[3-Thia-5-(triphenylmethylmercapto)-1-oxo-pent-1-yl]-S-triphenylmethyl-N'-(6-hydroxy-hex-1-yl)cysteinimidyl}-p-toluolsulfonsäureester
8,39 g (10 mmol) des unter Beispiel 16b) hergestellten N-[3-Thia-5-(triphenylmethylmercapto)-1-oxo-pent-1-yl]-S-triphenylmethyl-N'-(6-hydroxy-hex-1-yl)cysteinamids werden in 200 ml absolutem Dichlormethan gelöst. Man setzt 1,01 g (10 mmol) Triethylamin, 1,91 g (10 mmol) p-Toluolsulfonsäurechlorid hinzu und rührt 20 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird aufkonzentriert und an Kieselgel chromatographiert. (Laufmittel: CH₂Cl₂/MeOH: 97:3).
Ausbeute: 6,44 g (67,0% der Theorie) gelbliches Öl
Elementaranalyse:
ber.: C 72,47; H 6,29; N 2,91; O 8,32; S 10,01;
gef.: C 72,19; H 6,47; N 2,68; S 9,83.
b) 5'-[(Mercaptoacetyl-glycyl-glycin-amidyl)-13-tridec-7-thio-1-yl]-phosphorsäureester des 35mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3'
Ein nach dem SELEX-Verfahren identifiziertes 30mer-Oligonucleotid wird mit der Modifikation einer vorgeschalteten Sequenz T*T*T*T*T-3' mit Hilfe eines Syntheseautomaten der Firma Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Herausgeber F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid in geschützter Form auch auf der Säule des festen Trägers befindet. Die Beladung der Säule beträgt ca. 15 mg 35mer-Oligonucleotid. Nach Abspaltung der 5'-DMT-Schutzgruppe (Trichloressigsäure/Dichlormethan) wird nach den Standardmethoden mit S-Trityl-6-mercaptohexyl-phosphoramidit gekoppelt.
Nach Oxidation mit Iod in Tetrahydrofuran wird die tritylgeschützte Verbindung vom Träger abgespalten, isoliert und gereinigt (siehe Beispiel 14d).
Die Abspaltung der S-Tritylschutzgruppe, die Isolierung des SH-gruppentragenden Oligonucleotids und die Reinigung geschehen wie unter Beispiel 14d) beschrieben (7,5 mg).
Zur Kopplung wird das SH-gruppentragende 30mer-Oligonucleotid (7 mg) in 550 μl 0,1 M Natriumcarbonatlösung unter Argonatmosphäre mit 180 mg Toluolsulfonsäureester 17a), gelöst in 500 μl Dimethylformamid, versetzt. Nach 30 min wird neutralisiert und mit Wasser auf ein Volumen von 5 ml verdünnt. Nach dem Zentrifugieren wird der klare Überstand lyophilisiert. Zur Abspaltung der S-Tritylgruppen wird wie unter 14d) beschrieben verfahren. Man erhält nach Reinigung 4,3 mg Konjugat.
c) Technetium-99m-Komplex des Konjugats 5'-[(Mercaptoacetyl-glycyl-glycin-amidyl)-13-tridec-7-thio-1-yl]-phosphorsäureester des 35mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3'
1 mg des unter Beispiel 17b) beschriebenen Konjugates wird in 1 ml 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphatpuffer (pH = 9,5) gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatriumtartrat versetzt man mit Natriumpertechnetatlösung (1 mCi) und anschließend mit 10 μl Zinn(II)-chloridlösung (5 mg SnCl₂/1 ml 0,01 M HCl). Die Markierungsausbeute (ca. 93%) wird durch HPLC bestimmt.
Beispiel 18
a) Konjugat aus 5'-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' und N-(Tetrahydro-2-oxo-thiophen-3-yl)-thiodiglycolsäuremonoamid
Ein nach dem SELEX-Verfahren identifiziertes 30mer-Oligonucleotid wird mit der Modifikation einer vorgeschalteten Sequenz T*T*T*T*T-3' mit Hilfe eines Syntheseautomaten der Firma Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Herausgeber F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid in geschützter Form auch auf der Säule des festen Trägers befindet. Die Beladung der Säule beträgt ca. 15 mg 35mer-Oligonucleotid. Nach Abspaltung der 5'-DMT-Schutzgruppe (Trichloressigsäure/Dichlormethan) wird nach den Standardmethoden mit N-Trifluoracetylaminohexylphosphoramidit gekoppelt.
Nach Oxidation mit Iod in Tetrahydrofuran wird das aminogruppentragende Oligonucleotid vom Träger abgespalten und wie unter 1b) beschrieben isoliert und gereinigt (9,3 mg).
Zur Kopplung mit dem N-(Tetrahydro-2-oxo-thiophen-3-yl)-thiodiglycolsäuremonoamid ( DE 43 11 023 ) löst man 5 mg aminogruppentragendes Oligonucleotid in 1 ml 2 M Natriumcarbonatlösung. Nach Zugabe von 100 mg des Thiolactonderivates wird 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird neutralisiert und die Entsalzung durch Ultrafiltration durch eine Membran mit einer Ausschlußgrenze von 3000 (Amicon YM3) erreicht. Nach Lyophilisieren wird gefriergetrocknet. Man erhält 6,3 mg gewünschtes Konjugat.
b) Technetium-99m-Komplex des Konjugats 5'-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' und N-(Tetrahydro-2-oxo-thiophen-3-yl)-thiodiglycolsäuremonoamid
1 mg des unter Beispiel 18a) beschriebenen SH-gruppentragenden Konjugates wird in 1 ml 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphatpuffer (pH = 9,5) gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatriumtartrat versetzt man mit Natriumpertechnetatlösung (1 mCi) und anschließend mit 10 μl Zinn(II)-chloridlösung (5 mg SnCl₂/1 ml 0,01 M HCl). Die Markierungsausbeute (94%) wird durch HPLC bestimmt.
Beispiel 19
a) 5'-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 32mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT-^3'-3'T-5'
Das nach dem SELEX-Verfahren identifizierte 30mer-Oligonucleotid 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3', mit der Modifikation einer vorgeschalteten Thymidinsequenz-T³'^-3'T-5', die über die Position 5' an den Träger gebunden ist, wird in üblicherweise in einem Syntheseautomaten der Firma Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Herausgeber F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid auch auf der Säule des festen Trägers befindet. Durch Reaktion mit Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan wird die 5'-Hydroxygruppe freigelegt. Die Beladung der Säule beträgt ca. 10 mg des 32mer Oligonucleotids. Zum Anknüpfen des Linkers wird die Säule mit einer Acetonitrillösung von 50 μmol β-Cyanoethyl-N,N-diisopropylamino-6-(trifluoracetamido)-1-hexylphosphoramidit (hergestellt nach Nucl. Acids. Res. 16, 2659–2669 (1988)) in Gegenwart von Tetrazol umgesetzt. Die Oxidation des gebildeten Phosphits zum voll geschützten Phosphotriester erfolgt mit Iod in Tetrahydrofuran. Anschließend wird die Säule nacheinander mit Methanol und Wasser gewaschen. Zur Ablösung des modifizierten Oligonucleotids vom festen Träger überführt man den Inhalt der Säule in ein Multivial, versetzt mit 5 ml 30%iger Ammoniaklösung, verschließt das Gefäß und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt dann auf 0°C, zentrifugiert, wäscht den Träger mit 5 ml Wasser und unterzieht die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung.
Zur Reinigung nimmt man das feste Material in 2 ml Wasser auf, versetzt mit 2 ml 0,5 M Ammoniumacetatlösung und mit 10 ml Ethanol, man läßt über Nacht bei –20°C stehen, zentrifugiert, wäscht den Rückstand mit 1 ml Ethanol (–20°C) und trocknet schließlich im Vakuum bei Raumtemperatur.
Man erhält 8 mg der Titelverbindung als farbloses Pulver.
b) Konjugat aus 5'-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 32mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT-^3'-3'T-5' und 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris-(carboxymethyl)-1,4,7,l0-tetraazacyclododecan
8 mg des in Beispiel 19a) erhaltenen Oligonucleotids werden in 2,5 ml eines NaHCO₃/Na₂CO₃-Puffers (pH 8,0) gelöst und mit 1 mg 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris-(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan (Titelverbindung aus Beispiel 1f) versetzt. Man rührt 5 Stunden bei Raumtemperatur, stellt den pH-Wert durch Zugabe von 0,01 M Salzsäure auf 7,2 ein und unterzieht die Lösung einer Ultrafiltration durch eine Membran mit der Ausschlußgrenze 3000 (Amicon YM3) und anschließend einer Gefriertrocknung. Man erhält 7 mg des gewünschten Konjugats.
c) ¹¹¹Indium-Komplex des Konjugats aus 5'-(6-Amino-1-hexylphosphorsäureester) des 32mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT-^3'-3'T-5' und 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris-(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan
15 μl einer ¹¹¹Indium(III)-acetatlösung (350 μCi), (hergestellt aus ¹¹¹Indium(III)-chlorid in 2 M Natriumacetatlösung und durch Einstellen des pH-Wertes mit 0,1 M Salzsäure auf pH 4,0) werden in 135 μl einer Lösung aus 1 mg der Titelverbindung aus Beispiel 19b) in MES-Puffer, pH 6,2, gegeben (MES = 2-(N-Morpholino)ethylsulfonsäure). Der pH-Wert wird durch Zugabe von 0,01 M Salzsäure auf pH 4,2 gebracht. Man rührt 1 Stunde bei 37°C bei pH 4,2. Es wird mit 2 M Natriumacetatlösung auf pH 6 gebracht, und 10 μl einer 0,1 M Na₂EDTA-Lösung (Na₂EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz) werden zugegeben, um überschüssiges ¹¹¹Indium zu komplexieren. Die Endreinigung des so erhaltenen markierten Konjugates (1h) erfolgt durch HPLC (Ausschlußchromatographie: TSK-400/MES-Puffer). Die das markierte Konjugat enthaltenden Fraktionen werden mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt und filtriert. Eine so hergestellte Lösung stellt dann ein geeignetes Präparat für die Radiodiagnostik dar.
Beispiel 20
a) 5'-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-T***T***T***T***TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3'
Das nach dem SELEX-Verfahren identifizierte 30mer-Oligonucleotid 5'-TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' (Seq. Nr. 13 aus dem US-Patent Nr. 5,270,163 ) wird in üblicher Weise in einem Syntheseautomaten der Firma Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Hrsg. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid auch auf der Säule des festen Trägers befindet. Die letzten vier Thymidine werden nach der von G. Blaton et al. in „Oligonucleotides and Analogues", S. 109–135, beschriebenen Technik durch Phosphorodithioate an das am 5'-Ende befindliche Thymidin gebunden. Zu diesem Zweck wird zunächst die 5'-Hydroxygruppe durch Behandeln mit Trichloressigsäure freigelegt. Dann wird mit Trispyrrolidinophosphin und Tetrazol die 3'-Hydroxygruppe eines 5'-DMTO-Thyridins in das Diamidit überführt, das durch Zugabe von 2,4-Dichlorbenzylmercaptan in das Phosphorothioamidit umgewandelt wird. Diese Verbindung wird mit Tetrazol aktiviert und mit der 5'-Hydroxygruppe des Oligonucleotids zum Thiophosphatriester umgesetzt. Die Oxidation zum Phosphorodithioat erfolgt mit elementarem Schwefel in einer Lösung aus Schwefelkohlenstoff, Pyridin, Triethylamin 95:95:10. Die Benzylgruppen werden noch nicht abgelöst. In analoger Weise werden noch 3 weitere Thymidine angebunden. Die Beladung der Säule beträgt ca. 10 mg des 35mer-Oligonucleotids. Dann wird erneut eine 5'-Hydroxygruppe freigelegt.
Zum Anknüpfen des Linkers wird die Säule mit einer Acetonitrillösung von 50 μmol 2-Cyanoethyl-N,N'-diisopropylamino-6-(trifluoracetamido)-1-hexyl-phosphoramidit (Lit. in Beispiel in Gegenwart von Tetrazol umgesetzt. Die Oxidation des gebildeten Phosphits zum Phosphotriester erfolgt mit Iod in Tetrahydrofuran. Anschließend wird die Säule nacheinander mit Methanol und Wasser gewaschen. Dann werden die Schutzgruppen der Dithionatbindungen durch eine Lösung von Thiophenol/Triethylamin/Dioxan 1:2:2 entfernt, was innerhalb von 2 Stunden erfolgt. Die Säule wird daraufhin jeweils mit ihrem 3fachen Volumen Methanol, dann mit Ether gewaschen und getrocknet. Zur Ablösung des modifizierten Oligonucleotids vom festen Träger überführt man den Inhalt der Säule in ein Multivial, versetzt mit 5 ml 30%iger Ammoniaklösung, verschließt das Gefäß und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt dann auf 0°C, zentrifugiert, wäscht den Träger mit 5 ml Wasser und unterzieht die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung.
Zur Reinigung nimmt man das feste Material in 2 ml Wasser auf, versetzt mit 2 ml 0,5 M Ammoniumacetatlösung und mit 10 ml Ethanol, läßt über Nacht bei –20°C stehen, zentrifugiert, wäscht den Rückstand mit 1 ml Ethanol (–20°C) und trocknet schließlich im Vakuum bei Raumtemperatur.
Man erhält 8 mg der Titelverbindung als farbloses Pulver.
b) Konjugat aus 5'-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-T***T***T***T***TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' und 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris-(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan
8 mg des in Beispiel 20a) erhaltenen Oligonucleotids werden in 2,5 ml eines NaHCO₃/Na₂CO₃-Puffers (pH 8,0) gelöst und mit 1 mg 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris-(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan (Titelverbindung aus Beispiel 1f) versetzt. Man rührt 5 Stunden bei Raumtemperatur, stellt den pH durch Zugabe von 0,01 M Salzsäure auf 7,2 ein und unterzieht die Lösung einer Ultrafiltration durch eine Membran mit der Ausschlußgrenze 3000 (Amicon YM3) und anschließend einer Gefriertrocknung.
Man erhält 7 mg des gewünschten Konjugats.
c) ¹¹¹Indium-Komplex des Konjugats 5'-(6-amino-1-hexylphosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-T***T***T***T***TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' und 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris-(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan
15 μl einer ¹¹¹Indium(III)-acetatlösung (350 μCi), (hergestellt aus ¹¹¹Indium(III)-chlorid in 2 M Natriumacetatlösung und durch Einstellen des pH-Wertes mit 0,1 M Salzsäure auf pH 4,0) werden in 135 μl einer Lösung aus 1 mg der Titelverbindung aus Beispiel 20b) in MES-Puffer, pH 6,2, gegeben (MES = 2-(N-Morpholino)-ethylsulfonsäure). Der pH-Wert wird durch Zugabe von 0,01 M Salzsäure auf pH 4,2 gebracht. Man rührt 1 Stunde bei 37°C bei pH 4,2. Es wird mit 2 M Natriumacetatlösung auf pH 6 gebracht, und es werden 10 μl einer 0,1 M Na₂EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz zugegeben, um überschüssiges ¹¹¹Indium zu komplexieren. Die Endreinigung des so erhaltenen markierten Konjugates (1h) erfolgt durch HPLC (Ausschlußchromatographie: TSK-400/MES-Puffer). Die das markierte Konjugat enthaltenden Fraktionen werden mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt und filtriert. Eine so hergestellte Lösung stellt dann ein geeignetes Präparat für die Radiodiagnostik dar.
Beispiel 21
a) 5'-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT**T**T**T**T-3'
Das nach dem SELEX-Verfahren identifizierte 30mer-Oligonucleotid 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3', mit der Modifikation einer vorgeschalteten Sequenz T**T**T**T**T-3', wird erhalten, indem zunächst am Träger über 3' eine Sequenz aus 5 über Cyanoethylphosphatgruppen verbundenen Thymidinen erzeugt wird. Durch Umsetzen dieser Verbindung mit einer 0,5 M Lösung von Tetraethylthiuramdisulfid in Acetonitril erfolgt innerhalb von 15 Minuten die Sulfonierung zum Phosphonothioat, das dann mit freier 5'-Hydroxylgruppe Startmaterial für das 35mer-Oligonucleotid ist. Die gesamte Synthese verläuft in üblicher Weise in einem Syntheseautomaten der Fa. Pharmacia (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Herausgeber F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), wobei sich das Oligonucleotid noch auf der Säule des festen Trägers befindet. Durch Reaktion mit Trichloressigsäurelösung in Dichlormethan wird die 5'-Hydroxygruppe freigelegt. Die Beladung der Säule beträgt ca. 10 mg des 35mer-Oligonucleotids. Zum Anknüpfen des Linkers wird die Säule mit einer Acetonitrillösung von 50 μmol β-Cyanoethyl-N,N-diisopropylamino-6-(trifluoracetamido)-1-hexyl-phosphoramidit (hergestellt nach Nucl. Acids. Res. 16, 2659–2669 (1988)) in Gegenwart von Tetrazol umgesetzt. Die Oxidation des derart gebildeten Phosphits zum voll geschützten Phosphotriester erfolgt mit Iod in Tetrahydrofuran. Anschließend wird die Säule nacheinander mit Methanol und Wasser gewaschen. Zur Ablösung des modifizierten Oligonucleotids vom festen Träger und zur Abspaltung der Cyanoethylgruppen überführt man den Inhalt der Säule in ein Multivial, versetzt mit 5 ml 30%iger Ammoniaklösung, verschließt das Gefäß und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt dann auf 0°C, zentrifugiert, wäscht den Träger mit 5 ml Wasser und unterzieht die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung.
Zur Reinigung nimmt man das feste Material in 2 ml Wasser auf, versetzt mit 2 ml 0,5 M Ammoniumacetatlösung und mit 10 ml Ethanol, man läßt über Nacht bei –20°C stehen, zentrifugiert, wäscht den Rückstand mit 1 ml Ethanol (–20°C) und trocknet schließlich im Vakuum bei Raumtemperatur.
Man erhält 8 mg der Titelverbindung als farbloses Pulver.
b) Konjugat aus 5'-(6-Amino-1-hexyl-phosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT**T**T**T**T-3' und 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris-(carboxymethyl)-1,4,7,l0-tetraazacyclododecan
8 mg des in Beispiel 20a) erhaltenen Oligonucleotids werden in 2,5 ml eines NaHCO₃/Na₂CO₃-Puffers (pH 8,0) gelöst und mit 1 mg 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris-(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan (Titelverbindung aus Beispiel 1f) versetzt. Man rührt 5 Stunden bei Raumtemperatur, stellt den pH durch Zugabe von 0,01 M Salzsäure auf 7,2 ein und unterzieht die Lösung einer Ultrafiltration durch eine Membran mit der Ausschlußgrenze 3000 (Amicon YM3) und anschließend einer Gefriertrocknung.
Man erhält 7 mg des gewünschten Konjugats.
c) ¹¹¹Indium-Komplex des Konjugats 5'-(6-Amino-1-hexylphosphorsäureester) des 35mer-Oligonucleotids 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT**T**T**T**T-3' und 10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris-(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan
15 μl einer ¹¹¹Indium(III)-acetatlösung (350 μCi), (hergestellt aus ¹¹¹Indium(III)-chlorid in 2 M Natriumacetatlösung und durch Einstellen des pH-Wertes mit 0,1 M Salzsäure auf pH 4,0) werden in 135 μl einer Lösung aus 1 mg der Titelverbindung aus Beispiel 21b) in MES-Puffer, pH 6,2, gegeben (MES = 2-(N-Morpholino)-ethylsulfonsäure). Der pH-Wert wird durch Zugabe von 0,01 M Salzsäure auf pH 4,2 gebracht. Man rührt 1 Stunde bei 37°C bei pH 4,2. Es wird mit 2 M Natriumacetatlösung auf pH 6 gebracht, und es werden 10 μl einer 0,1 M Na₂EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz zugegeben, um überschüssiges ¹¹¹Indium zu komplexieren. Die Endreinigung des so erhaltenden markierten Konjugates (1h) erfolgt durch HPLC (Ausschlußchromatographie: TSK-400/MES-Puffer). Die das markierte Konjugat enthaltenen Fraktionen werden mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, mit 0,01 M Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt und filtriert. Eine so hergestellte Lösung stellt dann ein geeignetes Präparat für die Radiodiagnostik dar.
Beispiel 22
a) N-(5-Mercapto-3-thia-1-oxo-pent-1-yl)glycinmethylester
12,56 g (0.1 mol) Glycinmethylesterhydrochlorid, 13,42 g (0,1 mol) 2,5-Dithia-cyclohexanon und 10,12 g (0,1 mol) Triethylamin werden unter Argonatmosphäre in 500 ml absolutem Dichlormethan gelöst. Man rührt 24 Stunden bei Raumtemperatur und gießt den Ansatz anschließend auf 250 ml 5%ige wäßrige Citronensäure. Es wird gut durchgerührt, die organische Phase abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum wird der ölige Rückstand an Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol, Methanol 0–10%) chromatographiert.
Ausbeute: 18,9 g (84,6%), farbloses Öl
Elementaranalyse:
ber.: C 37,65; H 5,87; N 6,27; O 21,49; S 28,71;
gef.: C 37,43; H 6,02; N 6,12; S 28,48.
b) N-[5-(Triphenylmethylmercapto)-3-thia-1-oxo-pent-1-yl]-glycinmethylester
11,17 g (50 mmol) N-(5-Mercapto-3-thia-1-oxo-pent-1-yl)glycinmethylester (Beispiel 22a), 13,94 g (50 mmol) Triphenylmethylchlorid und 5,06 g (50 mmol) Triethylamin werden unter Argonatmosphäre in 500 ml absolutem Dichlormethan gelöst. Man rührt 16 Stunden bei Raumtemperatur und gießt den Ansatz anschließend auf 150 ml 5%ige wäßrige Citronensäure. Es wird gut durchgerührt, die organische Phase abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum wird der ölige Rückstand an Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol, 95:5) chromatographiert.
Ausbeute: 15,7 g (67,4%), farbloses Öl
Elementaranalyse:
ber.: C 67,07; H 5,85; N 3,01; O 10,31; S 13,77;
gef.: C 67,01; H 6,11; N 2,93; S 13,49.
c) N-[5-(Triphenylmethylmercapto)-3-thia-1-oxo-pent-1-yl]-glycin-N'-(6-hydroxyhexyl)-amid
11,64 g (25 mmol) N-[5-Triphenylmethylmercapto)-3-thia-1-oxo-pent-1-yl]-glycinmethylester (Beispiel 22b) und 29,3 g (250 mmol) 6-Aminohexanol werden unter Argonatmosphäre für 16 Stunden bei 100°C zusammengeschmolzen. Nach Erkalten des Reaktionsansatzes wird dieser in 500 ml Dichlormethan aufgenommen und auf 250 ml 5%ige wäßrige Citronensäure gegossen. Unter Eiskühlung und Rühren stellt man mit konzentrierter Salzsäure einen pH-Wert von 6,5 ein. Die organische Phase wird abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum wird der ölige Rückstand an Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol, 0–10% Methanol) chromatographiert.
Ausbeute: 7,7 g (56,0%), farbloses Öl
Elementaranalyse:
ber.: C 67,60; H 6,96; N 5,09; O 8,72; S 11,64;
gef.: C 67,48; H 7,03; N 4,92; S 11,43.
d) N-Diisopropyl-O-cyanethyl-0'-[7,10-diaza-8,11-dioxo-13-thia-15-(triphenylmethyl-mercapto)-pentadec-1-yl]phosphorigsäureamid
5,51 g (10 mmol) N-[5-(Triphenylmethylmercapto)-3-thia-1-oxo-pent-1-yl]-glycin-N'-(6-hydroxyhexyl)-amid (Beispiel 22c) werden in 50 ml absolutem Dichlormethan und 50 ml absolutem Pyridin gelöst. Man tropft bei Raumtemperatur 4,73 g (20 mmol) Diisopropylamino-O-cyanethylphosphorigsäurechlorid, gelöst in 50 ml absolutem Dichlormethan, zum Ansatz. Nach 4 Stunden wird auf 250 ml gesättigte, wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung gegossen, durchgerührt und die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels chromatographiert man den öligen Rückstand an Kieselgel (Dichlormethan/Methanol/Triethylamin 98:1:1).
Ausbeute: 4,32 g (57,5%), farbloses, schaumiges Öl
Elementaranalyse:
ber.: C 63,97; H 7,38; N 7,46; O8,52; P 4,12; S 8,54;
gef.: C 63,81; H 7,41; N 7,22; P 3,97; S 8,31.
e) 5'-[N-(3'-Aza-8'-mercapto-1',4'-dioxo-6'-thia-oct-1'-yl)-6-aminohexyl-phosphorsäureester] des 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'
Ein nach dem SELEX-Verfahren identifiziertes 30mer-Oligonucleotid 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3' mit der Modifikation einer vorgeschalteten Sequenz T*T*T*T*T*-3' wird mit Hilfe eines Syntheseautomaten der Fa. Pharmacia hergestellt (s. Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Hrsg. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1931), wobei sich das Oligonucleotid noch in geschützter Form auf der Säule des festen Trägers befindet. Die Beladung der Säule beträgt ca. 15 mg 35mer-Oligonucleotid. Nach Abspaltung der 5'-DMT-Schutzgruppe wird es nach den Standardmethoden mit dem unter Beispiel 22d beschriebenen Phosphoramidit gekoppelt. Nach Oxidation mit Iod in Tetrahydrofuran wird das Konjugat vom Träger abgespalten. Hierzu versetzt man das Material mit 10 ml 30%iger Ammoniaklösung und schüttelt über Nacht bei 55°C. Man kühlt auf 0°C, zentrifugiert, wäscht den Träger mit 10 ml Wasser und unterzieht die vereinigten wäßrigen Phasen einer Gefriertrocknung. Zur Reinigung nimmt man das Material in 5 ml Wasser auf, setzt 4 ml 0,5 mol Ammoniumacetat zu und versetzt mit 20 ml Ethanol. Zur Vervollständigung der Fällung stellt man über Nacht kalt (–20°C), zentrifugiert, wäscht den Rückstand mit 1 ml Ethanol (–20°C) und trocknet im Vakuum. Man erhält 9,5 mg weißes Pulver. Zur Abspaltung der S-Tritylschutzgruppe wird das Material in 5 ml 50 mmol Triethylammoniumacetatlösung (pH = 7) aufgenommen und mit 500 μl 0,1 M Silbernitratlösung 30 min inkubiert. Anschließend setzt man 500 μl 0,14 M Dithiothreitollösung hinzu und inkubiert weitere 30 min. Nach Zentrifugieren wird der klare Überstand an Sephadex G 10 entsalzt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden lyophilisiert. Man enthält 3,5 mg weißes Pulver.
f) Tc-99m-Komplex des 5'-[N-(3'-Aza-8'-mercapto-1',4'-dioxo-6'-thia-oct-1'yl)-6-aminohexyl-phosphorsäureester] von 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'
1 mg des unter Beispiel 22e) beschriebenen Konjugates wird in 1 ml 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphatpuffer (pH = 8,5) gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatriumtartrat versetzt man mit Natriumpertechnetatlösung (1 mCi) und anschließend mit 10 μl Zinn(II)-chloridlösung (5 mg/1 ml 0,01 M HCl). Die Markierungsausbeute (ca. 95%) wird durch HPLC bestimmt.
Beispiel 23
a) 5'-[N-(6'-Aza-7'-hydroxycarboxy-9'-mercapto-1',5'-dioxo-3'thia-non-1'-yl)-6-aminohexylphosphorsäureester] des 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*TT*-3'
Zunächst wird eine Lösung des N-Hydroxysuccinimidesters des N-(2-Oxo-tetrahydrothiophen-3-yl)thiodiglycolsäuremonoamids ( DE 43 11 023 ) in 500 μl absolutem DMF hergestellt. Hierzu löst man 24,9 mg (0,1 mmol) N-(2-Oxo-tetrahydrothyophen-3-yl)thiodiglycolsäuremonoamid und 11,5 mg (0,1 mmol) N-Hydroxysuccinimid in 500 μl absolutem DMF. Bei 0°C gibt man 19,2 mg (0,1 mmol) EDC zum Ansatz. Man rührt 30 min bei 0°C.
10 mg des unter Beispiel 1 hergestellten 5'-(6-Aminohexylphosphorsäureesters) von 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3' werden in 1 ml eines Natriumhydrogencarbonat/Natriumcarbonat-Puffers (pH = 8,0) gelöst. Man setzt die vorab präparierte DMF-Lösung des NHS-Esters hinzu und inkubiert 16 Stunden bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre. Anschließend wird zentrifugiert, auf ein Volumen von 500 μl aufkonzentriert und an Sephadex G-25 chromatographiert. Nach Lyophilisieren erhält man 2 mg Konjugat als weißes Pulver.
b) Tc-99m-Komplex von 5'-[N-(6'-Aza-7'-hydroxy-9'-mercapto-1',5'-dioxo-3'-thia-non-1'-yl)-6-aminohexylphosphorsäureester] des 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'
1 mg des unter Beispiel 23a) beschriebenen Konjugates wird in 1 ml 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphatpuffer gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatriumtartrat versetzt man mit Natriumpertechnetatlösung (1 mCi) und anschließend mit 10 μl Zinn(II)-chloridlösung (5 mg/1 ml 0,01 M HCl). Die Markierungsausbeute wird durch HPLC bestimmt (ca. 92%).
Beispiel 24
a) 5'-[N-(Mercaptoacetyl)-6-aminohexylphosphorsäureester] von 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'
10 mg des unter Bespiel 1 hergestellten 5'-(6-Aminohexylphosphorsäureesters) des 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3' werden in 1 ml eines Natriumhydrogencarbonat/Natriumcarbonat-Puffers (pH = 8,0) gelöst. Anschließend setzt man 23,1 mg (0,1 mmol) S-Acetylmercaptoessigsäure-NHS-Ester, gelöst in 500 μl absolutem DMF, zum Ansatz hinzu und inkubiert 17 Stunden bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre. Anschließend wird zentrifugiert, auf ein Volumen von 500 μl aufkonzentriert und an Sephadex G-25 chromatographiert. Nach Lyophilisieren erhält man 3 mg Konjugat als weißes Pulver.
b) Tc-99m-Komplex vom 5'-[N-(Mercaptoacetyl)-6-aminohexylphosphorsäureester] von 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'
1 mg des unter Beispiel 24a) beschriebenen Konjugates wird in 1 ml 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphatpuffer (pH = 8,5) gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatrium tartrat versetzt man mit Natriumpertechnetatlösung (1 mCi) und anschließend mit 10 μl Zinn(II)-chloridlösung (5 mg/1 ml 0,01 M HCl). Die Markierungsausbeute (ca. 97%) wird durch HPLC bestimmt.
Beispiel 25
a) N-[2-(Triphenylmethylmercapto)-eth-1-yl]thiodiglycolsäuremonoamid
31,9 g (0,1 mol) 2-(Triphenylmethylmercapto)-ethylamin und 10,1 g (0,1 mol) Triethylamin werden in 500 ml absolutem Dichlormethan vorgelegt. Bei 0°C tropft man eine Lösung von 13,2 g (0,1 mol) Thiodiglycolsäureanhydrid hinzu, rührt 1 Stunde bei 0°C und 16 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird auf 250 ml 5%ige wäßrige Citronensäure gegossen, gut durchgerührt, die organische Phase abgetrennt und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum wird der Rückstand an Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol, 0–20% Methanol) chromatographiert.
Ausbeute: 20,32 g (45,0%), farbloses Öl.
Elementaranalyse:
ber.: C 66,49; H 5,58; N 3,10; O 10,63; S 14,20;
gef.: C 66,21; H 5,73; N 2,98; S 14,02.
b) 5'-[N-(1',5'-Dioxo-6'-aza-3'-thia-8'-mercapto-oct-1-yl)aminohexylphosphorsäureester] des 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'
Zunächst wird der NHS-Ester von N-[2-(Triphenylmethylmercapto)-eth-1-yl)-thiodiglycolsäuremonoamid (Beispiel 25a) hergestellt. Hierzu löst man 45,2 mg (0,1 mmol) der vorhergenannten Säure in 500 μl absolutem DMF (0,1 mmol) und versetzt mit 11,5 mg (0,1 mmol) NHS. Nach Abkühlen auf 0°C werden 19,2 mg (0,1 mmol) EDC zugesetzt und 30 min bei 0°C inkubiert.
Eine Lösung von 10 mg des unter Beispiel 1 beschriebenen 5-(6-Aminohexyl-phosphorsäureesters) von 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3' in 1 ml eines Natriumhydrogencarbonat/Natriumcarbonat-Puffers (pH = 8,0) wird mit 500 μl der vorab hergestellten NHS-Esterlösung versetzt. Man inkubiert 16 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird auf 500 μl eingeengt und an Sephadex G-25 chromatographiert. Man erhält 6 mg der S-tritylgeschützten Verbindung. Die Abspaltung der S-Tritylschutzgruppe, die Isolierung des SH-gruppentragenden Oligonukleotids und die Reinigung geschehen wie unter Beispiel 22e beschrieben. Man erhält 4 mg weißes Lyophilisat.
c) Tc-99m-Komplex von 5'-[N-(1',5'-Dioxo-6'-aza-3'-thia-8'-mercapto-oct-1-yl)-aminohexylphosphorsäureester] von 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'
1 mg des unter Beispiel 25b hergestellten Konjugates wird in 1 ml 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphatpuffer (pH = 8,5) gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatriumtartrat versetzt man mit Natriumpertechnetatlösung (1 mCi) und anschließend mit 10 μl Zinn(II)-chloridlösung (5 mg/1 ml 0,01 M HCl). Die Markierungsausbeute wird durch HPLC bestimmt (91%).
Beispiel 26
a) N,N'-Bis-[2-(Triphenylmethylmercapto)-1-oxo-eth-1-yl]-3,4-diaminobenzoesäure-methylester
3,32 g (20 mmol) 3,4-Diaminobenzoesäuremethylester und 13,38 g (40 mmol) S-Triphenylmethyl-mercaptoessigsäure werden in 200 ml absolutem Dichlormethan gelöst. Bei 0°C tropft man 8,25 g (40 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 100 ml absolutem Dichlormethan, zum Ansatz. Es wird 1 Stunde bei 0°C und abschließend 16 Stunden bei Raumtemperatur nachgerührt. Man filtriert, schüttelt gegen 1%ige wäßrige Citronensäure, trocknet die organische Phase über Natriumsulfat und verdampft das Lösungsmittel im Vakuum. Der Rückstand wird an Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol, 0–10% Methanol) chromatographiert.
Ausbeute: 10,2 g (63,8%), farbloses Öl
Elementaranalyse:
ber.: C 75,16; H 5,30; N 3,51; O 8,01; S 8,02;
gef.: C 75,01; H 5,58; N 3,30; S 7,89.
b) N,N'-Bis-[2-(triphenylmethylmercapto)-1-oxo-eth-1-yl]-3,4-diaminobenzoesäure
7,99 g (10 mmol) N,N'-Bis-[2-triphenylmethylmercapto)-1-oxo-eth-1-yl]-3,4-diaminobenzoesäuremethylester (Beispiel 26a) werden in 200 ml Dioxan, 20 ml Wasser und 20 ml Methanol mit 4 g (100 mmol) Natriumhydroxid versetzt. Man rührt 5 Stunden bei Raumtemperatur und gießt den Ansatz auf 300 ml 5%ige wäßrige Citronensäure. Es wird erschöpfend mit Dichlormethan extrahiert und die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand an Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol, Methanol 0–40%) chromatographiert.
Ausbeute: 3,56 g (45,4%), farbloses Öl
Elementaranalyse:
ber.: C 74,97; H 5,14; N 3,57; O 8,15; S 8,17;
gef.: C 74,71; H 5,32; N 3,31; S 7,88.
c) 5'-{N-[3',4'-Bis-(2''-mercaptoacetylamino)-benzoyl]-6-aminohexylphophorsäureester} von 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'
Zunächst wird der NHS-Ester der N,N'-Bis-[2-(triphenylmethylmercapto)-1-oxo-eth-l-yl]-3,4-diaminobenzoesäure (Beispiel 26b) hergestellt. Hierzu löst man 78,5 mg (0,1 mmol) der Säure in 500 μl absolutem DMF und versetzt mit 11,5 mg (0,1 mmol) NHS. Nach Abkühlen auf 0°C werden 19,2 mg (0,1 mmol) EDC zugesetzt und 30 min bei 0°C inkubiert. Eine Lösung von 10 mg des unter Beispiel 1 beschriebenen 5'-(6-Aminohexylphosphorsäureesters) von 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3' in 1 ml eines Natriumhydogencarbonat/Natriumcarbonat-Puffers (pH = 8,0) wird mit 500 μl der vorab hergestellten NHS-Esterlösung versetzt. Man inkubiert 17 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird auf 500 μl eingeengt und an Sephadex G-25 chromatographiert. Man erhält 7 mg der S-tritylgeschützten Verbindung.
Die Abspaltung der S-Tritylschutzgruppe, die Isolierung des SH-gruppentragenden Oligonukleotids und die Reinigung geschehen wie unter Beispiel 22e beschrieben. Man erhält 3 mg weißes Lyophilisat.
d) Tc-99m-Komplex von 5'-{N-[3',4'-Bis-(2''-mercaptoacetylamino)-benzoyl]-6-aminohexylphosphorigsäureester} von 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'
1 mg des unter Beispiel 26c) beschriebenen Konjugates wird in 1 ml 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphatpuffer (pH = 9.5) gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatriumtartrat versetzt man mit Natriumpertechnetatlösung (1 mCi) und anschließend mit 10 μl Zinn(II)-chloridlösung (5 mg/1 ml 0,01 M HCl). Die Markierungsausbeute (ca. 91%) wurde durch HPLC bestimmt.
Beispiel 27
a) N-[O-Acetylhydroxyacetyl]-glycyl-glycyl-glycin-tert.-butylester
24,5 g (0,1 mol) Glycyl-glycyl-glycin-tert.-butylester und 11,8 g (0,1 mol) O-Acetyl-glycolsäure werden bei 0°C in 500 ml absolutem Dimethylformamid zusammengegeben. Man tropft zum Ansatz eine Lösung von 20,6 g (0,1 mol) Dicyclohexylcarbodiimid in 500 ml absolutem Dimethylformamid, rührt 1 Stunde bei 0°C und abschließend über Nacht bei Raumtemperatur. Es wird filtriert und das Filtrat an der Ölpumpe eingedampft. Man kristallisiert wiederholt aus Essigsäureethylester/n-Pentan.
Ausbeute: 12,5 g (36,2%), weißes Pulver
Elementaranalyse:
ber.: C 48,69; H 6,71; N 12,17; O 32,43;
gef.: C 48,43; H 7,01; N 11,93.
b) N-[O-Acetyl-hydroxyacetyl]-glycyl-glycyl-glycin
3,45 g (10 mmol) N-[O-Acetyl-hydroxyacetyl]-glycyl-glycyl-glycin-tert.-butylester werden in 50 ml Trifluoressigsäure 15 min gerührt. Anschließend gießt man auf 500 ml absoluten Diethylester und filtriert das Produkt ab. Es wird wiederholt aus Essigsäureethylester/n-Pentan umkristallisiert.
Ausbeute: 1,23 g (42,5%), weißes Pulver
Elementaranalyse:
ber.: C 41,53; H 5,23; N 14,53; O 38,72;
gef.: C 41,31; H 5,51; N 14,32.
c) 5-{N-[N'-(Hydroxyacetyl)-glycyl-glycyl-glycyl]-6-aminohexylphosphorsäureester} von 5'-CUCAUGGAGCCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'
Zunächst wird der NHS-Ester von N-(O-Acetylhydroxyacetyl)glycyl-glycyl-glycins (Beispiel 27b) hergestellt. Hierzu löst man 28,9 mg (0,1 mmol) der Säure in 500 μl absolutem DMF und versetzt mit 11,5 mg (0,1 mmol) NHS. Nach Abkühlen auf 0°C werden 19,2 mg (0,1 mmol) EDC zugesetzt und 30 min bei 0°C inkubiert. Eine Lösung von 10 mg des unter Beispiel 1 beschriebenen (6-Aminohexylphosphorsäureesters) von 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*-3' in 1 ml 1 M Natriumcarbonatlösung wird mit 500 μl der vorab hergestellten NHS-Esterlösung versetzt. Man inkubiert 18 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird auf 500 μl eingedampft und an Sephadex G-25 chromatographiert. Man erhält nach Lyophilisieren 3 mg der Titelverbindung.
d) Tc-99m-Komplex von 5'-{N-[N'-(Hydroxyacetyl)-glycyl-glycyl-glycyl]-6-aminohexylphosphorsäureester von 5'-CUCAUGGAGCCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'
1 mg des unter Beispiel 27c beschriebenen Konjugates wird in 1 ml 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphatpuffer (pH = 10,5) gelöst. Nach Zugabe von 10 mg Dinatriumtartrat versetzt man mit Natriumpertechnetat lösung (1 mCi) und anschließend mit 10 μl Zinn(II)-chloridlösung (5 mg/1 ml 0,01 M HCl). Die Markierungsausbeute wird mittels HPLC bestimmt (95%).
Die obigen Beispiele können mit ähnlich guten Ergebnissen wiederholt werden, indem man anstelle der in den obigen Beispielen eingesetzten Reaktionspartner bzw. Umsetzungsbedingungen die in der vorliegenden Erfindung allgemein bzw. speziell beschriebenen einsetzt.

Claims

Oligonucleotid-Konjugate, bestehend aus einem Oligonucleotid-Rest N und n Substituenten (B-K), wobei die Verbindung die allgemeine Formel I) N-(B-K)_n (I)aufweist, worin N ein Oligonucleotid mit 15 bis 100 Nucleotiden ist, das spezifisch mit hoher Bindungsaffinität an Zielstrukturen bindet und Modifikationen aufweist, die den Abbau durch natürlich vorkommende Nucleasen verhindern oder wenigstens wesentlich reduzieren, B eine chemische Bindung oder eine Verbindungskomponente ist, die die Verbindung zwischen N und K herstellt, und K ein Komplexbildner oder ein Komplex radioaktiver Metallisotopen oder stabiler Isotopen ist, die – durch Strahlung von außen in radioaktive Isotope umgewandelt werden, – Strahlung von außen in Strahlung anderer Qualität, anderen Energiegehalts und/oder anderer Wellenlänge umwandeln, der Elemente der Ordnungszahlen 5, 21–29, 31, 39, 42–44, 49, 57–83 oder 85, n eine Zahl zwischen 1 und 10 ist, dadurch gekennzeichnet, daß a) die 2'-Position der Zuckereinheit unabhängig voneinander mit folgenden Gruppen besetzt ist: einer Gruppe -OR, worin R einen Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls bis zu zwei Hydroxylgruppen enthält und gegebenenfalls durch 1 – 5 Sauerstoffatome unterbrochen ist, bedeutet, einem Wasserstoffatom, einer Hydroxylgruppe, einem Fluoratom, einem Aminrest, einer Aminogruppe, und in den terminalen Positionen 3' und 5' vorhandene Hydroxylgruppen unabhängig voneinander gegebenenfalls mit dem Rest R verethert sind und/oder b) die gegebenenfalls als Internucleotidbindung dienenden Phosphodiester unabhängig voneinander durch Phosphorothioate, Phosphorodithioate oder Alkylphosphonate, bevorzugt Methylphosphonat, ersetzt sind, und/oder c) die terminalen Reste in den Positionen 3' und 5' durch eine wie in b) beschriebene Internucleotidbindung intramolekular miteinander verknüpft sind und/oder d) es eine wie in b) beschriebene Internucleotidbindung enthält, die die Positionen 3'-3' oder 5'-5' verknüpft und/oder e) es eine wie in b) beschriebene Phosphodiesterbindung enthält, die zwei Thymidine über jeweils einen in der 3-Stellung befindlichen C₂-C₁₀-Hydroxyalkylrest esterartig verbindet oder einen analog substituierten Thymidinrest esterartig mit einer Hydroxylgruppe eines anderen Zuckers in den Positionen 2' oder 3' oder 5' verbindet und/oder f) die terminalen Reste in den Positionen 3' und 5' gegebenenfalls wie in b) beschrieben modifizierte Internucleotidbindungen enthalten.
Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß N ein Oligonucleotid ist, das spezifisch mit hoher Bindungsaffinität an andere Zielstrukturen bindet und das dadurch erhältlich ist, daß eine Zufallssequenzen enthaltende Mischung von Oligonucleotiden mit der Zielstruktur zusammengebracht wird, wobei bestimmte Oligonucleotide eine erhöhte Affinität zu der Zielstruktur im Verhältnis zu der Mischung der Oligonucleotide aufweisen, diese von dem Rest der Oligonucleotidmischung abgetrennt werden, dann die Oligonucleotide mit erhöhter Affinität zu der Zielstruktur amplifiziert werden, wodurch man eine Mischung von Oligonucleotiden erhält, die einen erhöhten Anteil an Oligonucleotiden aufweist, die an die Zielstrukturen binden.
Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß N ein Oligonucleotid ist, das spezifisch mit hoher Bindungsaffinität an andere Zielstrukturen bindet und das dadurch erhältlich ist, daß a) zunächst ein DNA-Strang durch chemische Synthese derart hergestellt wird, daß dieser DNA-Strang am 3'-Ende eine definierte Sequenz aufweist, die komplementär zu einem Promoter für eine RNA-Polymerase ist und zugleich komplementär zu einem Primer der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist, und daß dieser DNA-Strang am 5'-Ende eine definierte DNA-Sequenz aufweist, die komplementär zu einer Primersequenz für die Polymerase-Kettenreaktion ist, wobei die Sequenz zwischen den definierten Sequenzen eine Zufallssequenz enthält, und daß b) dieser DNA-Strang mit Hilfe einer RNA-Polymerase in einem komplementären RNA-Strang umgeschrieben wird, wobei der Polymerase Nucleotide angeboten werden, die an der 2'-Position der Riboseeinheit modifiziert sind, und daß c) die auf diese Weise hergestellten RNA-Oligonucleotide mit der Zielstruktur, an die das Oligonucleotid spezifisch binden soll, zusammengebracht werden, und daß d) diejenigen Oligonucleotide, die an die Zielstruktur gebunden haben, zuerst zusammen mit der Zielstruktur von den nichtbindenden Oligonucleotiden abgetrennt werden und dann die gebundenen Oligonucleotide von der Zielstruktur wieder abgetrennt werden, und daß e) diese zielstrukturspezifischen RNA-Oligonucleotide mit Hilfe der reversen Transkriptase in einem komplementären DNA-Strang umgeschrieben werden, und daß f) diese DNA-Stränge unter Verwendung der hier definierten Primersequenzen mit der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert werden, und daß g) die auf diese Art und Weise amplifizierten DNA-Oligonucleotide dann wieder mit Hilfe der RNA-Polymerase und mit modifizierten Nucleotiden in RNA-Oligonucleotide umgeschrieben werden, und daß h) die obengenannten Selektionsschritte c) bis g) gegebenenfalls so oft wiederholt werden, bis die Oligonucleotide, die durch eine hohe Bindungsaffinität zu der Zielstruktur charakterisiert sind, hinreichend selektioniert sind und anschließend die Sequenzen der so erhaltenen Oligonucleotide gegebenenfalls bestimmt werden können.
Verbindungen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielstruktur ausgewählt ist unter Makromolekülen, Gewebestrukturen von höheren Organismen wie Tieren oder Menschen, Organen oder Teilen von Organen eines Tieres oder eines Menschen, Zellen, Tumorzellen oder Tumoren.
Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungskomponente(n) B a) an das 4'-Ende des in der 4'-Position um die CH₂-OH-Gruppe verminderten Oligonucleotid-Restes N und/oder b) an das 3'-Ende des in der 3'-Position um ein Wasserstoffatom verminderten Oligonucleotid-Restes N und/oder c) an die um die OH-Gruppe(n) verminderte(n) Phosphodiesterbrücke(n) zwischen jeweils zwei Nucleotiden und/oder d) an 1 bis 10 Nucleobase(n), die jeweils in der/den Position(en) 5, 8 und/oder der/den Aminogruppe(n) der Position(en) 2, 4 und 6 um ein Wasserstoffatom vermindert ist (sind), gebunden ist (sind).
Verbindungen nach Anspruch 5, Absatz a) oder b), dadurch gekennzeichnet, daß B die allgemeine Formel X-Y-Z¹ hat, die X-seitig mit dem Komplexbildner oder Komplex und Z-seitig mit dem Oligonucleotid verbunden ist, worin X für eine direkte Bindung, eine -NH- oder -S-Gruppe steht, Y für eine geradkettige, verzweigte, gesättigte oder ungesättigte C₁-C₂₀-Alkylenkette steht, die gegebenenfalls 1-2 Cyclohexylen-, 1-5 Imino-, 1-3 Phenylen-, 1-3 Phenylenimino-, 1-3 Phenylenoxy-, 1-3 Hydroxyphenylen-, 1-5 Amido-, 1-2 Hydrazido-, 1-5 Carbonyl-, 1-5 Ethylenoxy-, eine Ureido-, eine Thioureido-, 1-2 Carboxyalkylimino-, 1-2 Estergruppen, 1-3 Gruppen Ar, worin Ar für einen gesättigten oder ungesättigten 5- oder 6gliedrigen Ring steht, der gegebenenfalls 1-2 Heteroatome ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel und/oder 1-2 Carbonylgruppen enthält, 1-10 Sauerstoff-, 1-5 Stickstoff- und/oder 1-5 Schwefelatome enthält und/oder gegebenenfalls durch 1-5 Hydroxy-, 1-2 Mercapto-, 1-5 Oxo-, 1-5 Thioxo-, 1-3 Carboxy-, 1-5 Carboxy-C₁-C₄-alkyl-, 1-5 Ester-, 1-3 Amino-, 1-3 Hydroxy-C₁-C₄-alkyl-, 1-3 C₁-C₇-Alkoxygruppen substituiert ist und Z¹ für -CONH-CH₂-4', -NH-CO-4', -O-P(O)R¹-NH-CH₂-4', -O-P(O)R¹-O-CH₂-4', -O-P(S)R¹-O-3' oder -O-P(O)R¹-O-3' steht, worin 4' bzw. 3' die Verknüpfung an die endständige (n) Zuckereinheit(en) angibt und R¹ für O^–, S^–, eine C₁-C₄-Alkyl- oder NR²R³-Gruppe steht, mit R² und R³ in der Bedeutung von Wasserstoff und C₁-C₄-Alkylresten.
Verbindungen nach Anspruch 5, Absatz c), dadurch gekennzeichnet, daß B die allgemeine Formel X-Y-Z² hat, die X-seitig mit dem Komplexbildner oder Komplex und 2-seitig mit dem Oligonucleotid verbunden ist, wobei Z², in der zwei benachbarte Zuckereinheiten verknüpfenden Brücke
für die Gruppe -NR²-, -O- oder -S- steht, X für eine direkte Bindung, eine -NH- oder -S-Gruppe steht, Y für eine geradkettige, verzweigte, gesättigte oder ungesättigte C₁-C₂₀-Alkylenkette steht, die gegebenenfalls 1-2 Cyclohexylen-, 1-5 Imino-, 1-3 Phenylen-, 1-3 Phenylenimino-, 1-3 Phenylenoxy-, 1-3 Hydroxyphenylen-, 1-5 Amido-, 1-2 Hydrazido-, 1-5 Carbonyl-, 1-5 Ethylenoxy-, eine Ureido-, eine Thioureido-, 1-2 Carboxyalkylimino-, 1-2 Estergruppen, 1-3 Gruppen Ar, worin Ar für einen gesättigten oder ungesättigten 5- oder 6gliedrigen Ring steht, der gegebenenfalls 1-2 Heteroatome ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel und/oder 1-2 Carbonylgruppen enthält, 1-10 Sauerstoff-, 1-5 Stickstoff- und/oder 1-5 Schwefelatome enthält und/oder gegebenenfalls durch 1-5 Hydroxy-, 1-2 Mercapto-, 1-5 Oxo-, 1-5 Thioxo-, 1-3 Carboxy-, 1-5 Carboxy-C₁-C₄-alkyl-, 1-5 Ester-, 1-3 Amino-, 1-3 Hydroxy-C₁-C₄-alkyl-, 1-3 C₁-C₇-Alkoxygruppen substituiert ist und R² für Wasserstoff oder C₁-C₄-Alkylreste steht.
Verbindung nach Anspruch 5d), dadurch gekennzeichnet, daß B die allgemeine Formel X-Y-Z³ hat, wobei Z³ für eine -NH-Gruppe oder eine direkte Bindung zur Nucleobase steht, X für eine direkte Bindung, eine -NH- oder -S-Gruppe steht und Y für eine geradkettige, verzweigte, gesättigte oder ungesättigte C₁-C₂₀-Alkylenkette steht, die gegebenenfalls 1-2 Cyclohexylen-, 1-5 Imino-, 1-3 Phenylen-, 1-3 Phenylenimino-, 1-3 Phenylenoxy-, 1-3 Hydroxyphenylen-, 1-5 Amido-, 1-2 Hydrazido-, 1-5 Carbonyl-, 1-5 Ethylenoxy-, eine Ureido-, eine Thioureido-, 1-2 Carboxyalkylimino-, 1-2 Estergruppen, 1-3 Gruppen Ar, worin Ar für einen gesättigten oder ungesättigten 5- oder 6gliedrigen Ring steht, der gegebenenfalls 1-2 Heteroatome ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel und/oder 1-2 Carbonylgruppen enthält, 1-10 Sauerstoff-, 1-5 Stickstoff- und/oder 1-5 Schwefelatome enthält und/oder gegebenenfalls durch 1-5 Hydroxy-, 1-2 Mercapto-, 1-5 Oxo-, 1-5 Thioxo-, 1-3 Carboxy-, 1-5 Carboxy-C₁-C₄-alkyl-, 1-5 Ester-, 1-3 Amino-, 1-3 Hydroxy-C₁-C₄-alkyl-, 1-3 C₁-C₇-Alkoxygruppen substituiert ist.
Verbindungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Metallkomplex als bildgebendes Element ein radioaktives Isotop ausgewählt aus den Elementen Kupfer, Wismut, Technetium, Rhenium oder Indium enthält.
Verfahren zum Nachweis einer Zielstruktur, dadurch gekennzeichnet, daß man eine oder mehrere der Verbindungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit der zu untersuchenden Probe in vivo oder in vitro zusammenbringt und anhand des Signales nachweist, ob die Zielstruktur, an die das Oligonucleotid N spezifisch und mit hoher Bindungsaffinität bindet, in der Probe vorhanden ist.
Verbindungen nach einem der Ansprüche 1–9 zur nicht invasiven Diagnose von Krankheiten.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines für die Radiodiagnostik und/oder Radiotherapie geeigneten Medikaments.
Diagnosekit zum Nachweis von Zielstrukturen in vivo und/oder in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß das Diagnosekit wenigstens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 enthält.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei es sich bei N um einen nicht natürlich vorkommenden Oligonucleotidliganden mit spezifischer Bindungsaffinität für ein Zielmolekül handelt, wobei solch ein Zielmolekül eine dreidimensionale chemische Struktur ist, bei der es sich nicht um ein Polynucleotid handelt, das sich über einen Mechanismus, der hauptsächlich auf Watson/Crick-Basenpaarung oder Triplehelixbindung beruht, an den Oligonucleotidliganden bindet, wobei es sich bei dem Oligonucleotidliganden nicht um eine Nucleinsäure handelt, von der bekannt ist, daß eine ihrer physiologischen Funktionen die Bindung durch das Zielmolekül ist.