HU210744B - Process to prepare novel ganglioside derivs. and pharmaceutical compns. contg. them - Google Patents

Description

A találmány eljárás a GMj-gangliozidokból vagy gangliozid-elegyekből származó új, módosított N,N'diacil-N,N'-di-lizo-, N-acil-N-lizo- vagy N'-acil-N'-lizo-gangliozidok és funkciós származékaik előállítására, amelyek a neuramin- és/vagy szfingozin-rész nitrogénatomján alifás, aliciklusos, aralifás, aromás vagy heterociklusos acilcsoporttal, de legfeljebb a két nitrogénatom egyikén alifás acilcsoporttal vannak acilezve.

Az új származékok gyógyászati készítményekben alkalmazhatók. A találmány szerinti vegyületek az idegsejtek bimbódzását és az idegi ingerek továbbítását befolyásolják, így proteinkináz-C-inhibitorok.

A leírás terjedelme: 28 oldal (ezen belül 3 lap ábra)

HU 210 744

HU 210 744 Β

A találmány tárgya eljárás módosított gangliozidoknak, közelebbről olyan, a GM_rgangliozidokból vagy gangliozid-elegyekből származó N,N'-diacil-N,N'-di-lizo-, N-acil-N-lizo- vagy N'-acil-N'-lizo-gangliozidoknak és funkciós származékainak az előállítására, amelyek a neuramin-rész nitrogénatomján (N) és/vagy a szfingozin-rész nitrogénatomján (Ν') a természetes gangliozidokban előforduló acilcsoportok helyén az alább meghatározott alifás, aralifás, aromás, aliciklusos vagy heterociklusos acilcsoportok valamelyikével, de legfeljebb az említett nitrogénatom egyikén alifás acilcsoporttal vannak acilezve.

A találmány tárgya továbbá eljárások olyan gyógyszerkészítmények előállítására és gyógyászati alkalmazására, amelyek a fent említett gangliozid-származékok vagy sóik közül egyet vagy többet tartalmaznak.

A találmány szerinti új származékok alap-gangliozidjai természetes forrásokból, elsősorban gerincesek központi és perifériás idegrendszeréből, de akár mellékveseállományból, vörösvérsejtekből, lépből vagy más szervekből extrahálható termékek lehetnek. A célszerűen tisztított gangliozidok, bár nem egységes kémiai vegyületek, jellemezhetők olyan közelítő sémával, amely az egyes gangliozidok esetén általában kémiailag jól definiálható oligoszacharid részt, egy vagy több sziálsavból felépülő sziálsavas részt és egy ceramid részt tartalmaz; ez utóbbi két rész szokásosan különböző sziálsavak és különböző N-acil-szfingozinok keverékéből áll, amelyek alifás láncai változó hosszúságúak, és különböző, magasabb zsírsavakból származó acil-csoportokat tartalmaznak. Az ilyen gangliozidok szerkezete az (I) sémával közelíthető, ahol a sziálsavak a (Π) általános képletnek felelnek meg, amelyben a primer vagy szekunder hidroxil-csoportok közül egy vagy több acilezve is lehet, és amelyben az acil-csoportok ecetsavból vagy glikol savból származnak, a ceramid csoport pedig a (III) általános képletek egyikével jellemezhető, ahol n = 6-18, az acil-csoport pedig 16-22 szénatomos, telített vagy telítetlen zsírsavból vagy egy megfelelő hidroxi-karbonsavból származik. A találmány szerinti új származékok ezen acil-csoport természetében különböznek. Ezekben ugyanis az acil-rész egységes, míg a gangliozidokban különböző, 16-22 szénatomos alifás karbonsavak keverékeiből származik. Másik eltérés, hogy az acil-csoport természetben nem előforduló karbonsavak sorozataival kapcsolatos, vagyis aromás, aliciklusos vagy heterociklusos sorozatokba tartozó savakkal, ellentétben a gangliozidokkal. Ezek tehát félig szintetikus gangliozid-származékok, amelyek nem természetes ceramidot tartalmaznak.

A gangliozidokban jelen lévő sziálsavak száma általában 1 és 5 között változik. A sziálsav részek ketóztípusú kötéssel kapcsolódnak az oligoszacharid hidroxil-csoportjához a 2-helyzetű hidroxillal.

Ha több sziálsav kapcsolódik össze, a molekulák kapcsolódása ketóz-kötéseket hoz létre a két sziálsav 2- és 8-helyzetű hidroxil-csoportjai között. A gangliozidokban lévő sziálsavak, még ha a fent leírtak szerint tisztítva is vannak, különböző, kémiailag egységes savak, például N-acetil-neuraminsav és N-glikolil-neuraminsav keverékei, főtömegében az előbbit tartalmazva, amelyekhez esetleg ezeknek egy vagy több O-acilszármazékai, például 8-O-acil-származékok is csatlakozhatnak.

Az oligoszacharid legfeljebb 5 monoszacharidból vagy acil-amino-származékából áll, elsősorban hexózokból és említett származékaiból. Azonban legalább egy glükóz vagy galaktóz molekula is szerepel az oligoszacharidban. Az említett cukrok acil-amino-származékaiként leggyakrabban az N-acetil-glukóz-amin és az Nacetil-galaktóz-amin szerkezeti részek szerepelnek.

Az (I) sémában lévő gangliozidok, egyúttal a találmány szerinti származékok lényeges részei, elsősorban pedig a szacharid rész, a sziálsavak és a ceramid közötti kötések jellege jobban szemléltethetők egy „tiszta” GM] gangliozid teljes képletének (IV) bemutatásával, amelyben egy sziálsav fordul elő (N-acetil-neuraminsav vagy N-glikolil-neuraminsav képviseletében).

A GM] gangliozid származékának (IV) képlete lényegében azonos a találmány szerinti származékával, azzal az eltéréssel, hogy a ceramid csoport helyén megfelelő „mesterséges” ceramid áll, amelynek N-acil csoportja valamely alább meghatározott aromás, aliciklusos vagy heterociklusos szerves karbonsavból származik.

A „lizogangliozid” kifejezéssel az irodalomban olyan vegyületeket jelölnek, amelyek természetes gangliozidokból úgy keletkeznek, hogy a benne lévő szfmgozin-nitrogénhez kapcsolódó acil-csoportot eliminálják. Az eliminálás végrehajtható enzimesen, például úgy, hogy a gangliozidokat glikoszfingolipid-ceramid-dezaciláz enzim hatásának teszik ki. Az ilyen típusú hidrolízis érintetlenül hagyja a neuraminsav részben szereplő acil-amino és acil-hidroxil csoportokat. Ahhoz, hogy ezeket a csoportokat is dezacilezzük, két szabad amino-csoportot tartalmazó gangliozidszármazék előállítása céljából, kémiai hidrolízist kell alkalmazni, például híg kálium-hidroxiddal, így mind a szfingozin, mind a neuramin nitrogénje szabaddá válik. A neuramin-nitrogénen a fenti módon dezacilezett gangliozid-származékokat az irodalomban általában „de-N-acetil-gangliozidok”-nak nevezik, acil-csoportként itt acetil-csoportot szerepeltetve. A szfingozin nitrogénjét N, a neuramin-nitrogént N' jelöléssel különböztetjük meg. Az „N'-lizogangliozid” kifejezés alkalmazható tehát a fent említett de-N-acetil-gangliozid helyett; ugyanígy a „lizogangliozid” lehet olyan származék is, amelyben a szfingozid részen szabad aminocsoport van, bár ez pontosabban azonosítható az ,JNÍ-lizogangliozid” kifejezéssel. Másrészt az „N,N'-di(lizogangliozid)” elnevezésű vegyület mindkét amino-csoportja szabad. A jelen találmányi leírásban végig ezeket az elnevezéseket használjuk.

A találmány szerinti származékok fent említett meghatározásai a gangliozid-származékok olyan csoportjára vonatkoznak, amelyekben a neuramin nitrogénjén egy acetil-csoport van, a szfingozin nitrogénjén pedig főként alifás, de aromás, aralifás, aliciklusos vagy heterociklusos acilcsoport is lehet.

A találmány olyan típusú N-acil-lizogangliozidokra

HU 210 744 B is kiterjed, amelyek a fent említett, enzimesen nyert lizogangliozidokból származnak, amelyek tehát a sziálsav részben a természetes gangliozidokban előforduló acil-csoportokat, túlnyomórészt ecetsavból, kisebb mértékben glikolsavból származó acil-amino csoportok keverékét, esetleg a hidroxil-csoportokat észterező acil-csoportokat tartalmazza. A jelen találmányi leírásban tehát az ,,Ν-lizogangliozidok” vagy „N-acil-lizogangliozidok” kifejezések mindegyike mind a „természetes”-nek tekintett származékokra (például a természetes N-lizo GM]-re), mind pedig a neuramin-nitrogénen egységnyi acetil-csoportot tartalmazó származékokra vonatkozik, mely utóbbiakat e leírástól függetlenül, illetve célszerűen N,N'-di(lizogangliozid)-oknak neveznek, mint például az N-acetil-N'-benzoil-N,N'di(lizo) GM,-et.

Az „acil-di(lizogangliozidok)” kifejezéssel jelöljük a továbbiakban az összes, találmány szerinti, új vegyületet. Amint azt az alábbiakban részletezzük, lehet a gangliozidokat a neuramin-nitrogénen, illetve egyedül a hidroxil-csoporton szelektíven dezacilezni, például híg lúgoldattal. E vegyületek neuramin részének amino-csoportját az acetiltől (vagy glikoliltól) eltérő acillal acilezve, N,N'-diacil-N,N'-di(lizogangliozid)-okat kapunk, amelyekben a gangliozidok természetes része, szintén megőrződik, vagyis a szfingozin nitrogénjén lévő, magasabb alifás savakból származó, kevert acilcsoport. Ezeket a származékokat, amelyek a találmány szerinti új vegyületek előnyös csoportjait tartalmazzák, N'-acil-N'-lizogangliozidoknak fogjuk nevezni. Példa erre az N'-benzoil-N'-lizo GM],

Ismeretes, hogy a gangliozidok fontos szerepet játszanak az idegrendszerben, és újabban kimutatták, hogy hasznosak a perifériás idegrendszer és a központi idegrendszer betegségeinek kezelésében [Acta Psychiat. Scand., 55, 102 (1977); Eur. Medicophys., 13, 1 (1977); Ric. Sci. Educ. Perm. Suppl., 9, 115 (1978); Adv. Exp. Med. Bioi., 71, 271 (1976); Electromyogr. Clin. Neurophysiol., 19, 353 (1979); Minerva Medicy, 69, 3277 (1978); Minervy Stomat., 27, 177 (1978); Med. dél Lavoro, 68, 296 (1977); Brain Rés., 197, 236 (1980)]. A gangliozidok gyógyhatása, úgy látszik, főként abból áll, hogy serkenti a bimbódzás jelenségét az idegsejtekben, és az idegi ingerek továbbításában résztvevő enzimeket, így a (Na⁺, K⁺) ATP-áz enzimet [Brain Rés., 197, 236 (1980); J. Neurochem., 37, 350 (1981)] aktiválja. A gangliozidok neuron bimbódzást serkentő hatása növeli a károsodott vagy tönkrement idegszövetek funkcionális regenerálódását.

További vizsgálatok arra irányultak, hogy találjanak olyan vegyületeket, amelyek a gangliozidoknál hatásosabbaknak bizonyulnak az idegrendszeri károsodások gyógyításában. Ezek a kutatások vezettek például arra a felismerésre, hogy maguknál a gangliozidoknál hatásosabbak a gangliozid belső észterek, amelyekben a szacharid rész egy vagy több hidroxilja a sziálsav egy vagy több karboxil-csoportjával észterezve van (intramolekuláris reakció), ugyanannyi lakton-gyűrűt alkotva, mivel ezek növelik a neuron bimbódzást, és aktiválják azokat a membrán enzimeket, amelyek részt vesznek az idegi ingerek továbbításában, így pl. a (Na⁺, K⁺) ATP-áz enzimet (lásd például a 4 476 119, 4 593 091 és 4 716 223 sz. USA-beli szabadalmi leírásokat).

A gangliozidok „külső” észterei, vagyis a sziálsav karboxil-csoportjának észterei különböző alifás, aralifás, aliciklusos vagy heterociklusos alkoholokkal, szintén nagyobb hatást mutatnak az idegsejtek bimbódzására és az idegi ingerek továbbítására. A gangliozidok amidjainak is ugyanilyen tulajdonságai vannak, akárcsak az amidok, az észterek és az egyszerű gangliozidok peracilezett származékainak. Mindezek a származékok szerepelnek a 4 713 374 sz. USA-beli szabadalmi leírásban.

A találmány szerinti új vegyületek félszintetikus gangliozid analógok, és a korábban ismert molekuláktól abban különböznek, hogy mind a szfingozin nitrogénjén, mind a neuramin-nitrogénen N-acil-csoportokat tartalmaznak. Nem „természetes” gangliozidok, mivel legalább egy olyan acil-csoport van bennük, amely az alább meghatározott aromás, aralifás, aliciklusos vagy heterociklusos savak valamelyikéből származik. Sőt abban is különböznek a természetes gangliozidoktól (a fent említett két kivételtől, a „természetes” N-acil-N-lizogangliozidoktól és az N'-acil-N'-lizogangliozidoktól eltekintve), hogy az acil-csoport egységes és jól definiált. Azokban a származékokban, amelyek a neuramin-nitrogénen az acetiltől eltérő acilcsoportot tartalmaznak, a természetes gangliozidokban szereplő acil-csoportok is jelen lehetnek, így nagyobb szénatomszámú zsírsavak, pl. sztearinsav vagy palmitinsav keverékei.

A találmány alapja az a felismerés, hogy az új, „félszintetikus” gangliozidok lényegében ugyanazt a farmakológiai hatást fejtik ki, mint a természetes gangliozidok, ezek észterei, amidjai, belső észterei és mindezek peracilezett származékai, de a hatásspektruma számos paraméter, így az idegsejtek bimbódzására gyakorolt hatás „kezdete”, időtartama és erőssége tekintetében változtatható a nagyobb vagy kisebb lipofilitású, illetve hidrofilitású acil-komponensek bevitelével, avagy a mellékhatások típusa és mértéke tekintetében, amelyek előnyösnek vagy hátrányosnak egyaránt bizonyulhatnak az adott gyógyítási problémától függően. Példa erre a protein-kináz-C-re gyakorolt gátló hatás, amely nemkívánatos, negatív hatás lehet az idegingerület átviteli funkciók normális mechanizmusának bizonyos kiegyensúlyozatlansági körülményei között. Az aktiválás megindítható izgató aminosavak, így glutaminsav és/vagy aszparaginsav megnövelt koncentrációjával. A fent említett, rendellenes állapotban ezeknek a savaknak közvetlen toxikus hatásuk van az idegsejtekre. A találmány szerinti termékek egyik nagy előnye más protein-kináz-C inhibitorokhoz, így magukhoz a gangliozidokhoz vagy a szfingozinhoz képest, hogy képesek elejét venni és leküzdeni az említett neurotoxikus hatást.

Fontos annak hangsúlyozása, hogy a találmány szerinti termékek, ellentétben a kalcium-antagonistákkal és a glutamát receptor antagonistákkal (különösen az NMDA-val), csak rendellenes állapot esetén

HU 210 744 Β hatnak, ezért korlátozzák a lokalizált neurotoxikusságot és fenntartják az idegsejtek plaszticitását; ezáltal lehetővé teszik a károsodott fiziológiai funkciók könnyebb regenerálódását. A találmány szerinti származékok sok esetben alkalmazhatók az adott acilcsoportnak megfelelő savak saját hatásainak kifejtésére is, elkerülve a gangliozid rész speciális hatását, amikor is ez utóbbi csupán hordozóanyagként funkcionál. Ilyen eset például az újtípusú ganglioziddal az, amelyben az N-acil csoport a központi vagy a perifériás idegrendszerre ható savból származik, így lizerginsavból vagy analógjaiból, nikotinsavból vagy izonikotinsavból. Ezeknek a savaknak van bizonyos in vitro hatásuk, de in vivő alig vagy egyáltalán nem hatnak. Ha azonban a találmány szerint gangliozid molekulába visszük be őket, a teljes mértékű hatásuk megjelenik in vivő is.

A találmány szerinti gangliozid-származékok tehát természetes termékek vagy a fent említett, már ismert, félszintetikus származékok helyett alkalmazhatók. Igen előnyösek olyan betegek esetén, akik nem megfelelően reagálnak a szokásos termékekre, vagy akiknek egyedi irtózásuk vagy allergiájuk van azokkal szemben. Sőt még vivőanyagként is alkalmazhatók, mivel az N-acil csoportját alkotó savnak is lehet speciális farmakológiai hatása.

A találmány szerinti, új acil-di(lizogangliozid)ok előállításának alapjául szolgáló lizogangliozidok mindenekelőtt azok, amelyek természetes forrásokban található gangliozidok dezacilezésével nyerhetők, különösen a gerincesek központi és perifériás idegrendszerének szöveteiből, továbbá a mellékveseállományból, vörösvérsejtekből, lépből vagy más szervekből. Lehetnek továbbá tisztított gangliozidok, mégpedig olyanok, amelyeket ezzel a kifejezéssel jelölnek az irodalomban, és amelyeknek egységes szerkezetük van a szacharid részben; de lehetnek gangliozidok keverékei is. A találmány szerinti származékok kiindulási bázisaiként használt, legfontosabb gangliozidok közül például azok említhetők, amelyekben az oligoszacharidot legfeljebb 4 hexóz tag alkotja, és amelyekben ez a szacharid rész egységes kémiailag. A hexózokat előnyösen az N-acetilglukózamin és az N-acetil-galaktózamin által alkotott csoportból (gangliozidok A-csoportja) választjuk. A gangliozidok ezen csoportjába tartoznak például azok, amelyek a gerincesek agyvelejéből extrahálhatók, így azok, amelyek Lloyd A. ír le a „Glycolipid Methodology” (Glikolipidek módszertana) című könyv (szerk. Witting, American Oil Chemists Society, Champaign, 1976) „Gangliosides of the Nervous System” (Az idegrendszer gangliozidjai) című fejezetében (III. kötet, 187-214. oldal), például a θΜ4> Gm3, Gm2. Gm]-G1cNAc, G^j, Goi_a-GalNAc, G_Tlc, Gq és G_T1 gangliozidok (lásd az 1. táblázatot), különösen pedig azok, amelyekben az oligoszacharid legalább egy glukóz vagy galaktóz tagot és vagy N-acetil-glukózamint vagy N-acetil-galaktózamint tartalmaz, előnyösen azonban a következők (gangliozidok B-csoportja):

Gmi

Gal( 1 —>3)GalNAc( 1 —>4)Gal(l —>4)Glc( 1 —> 1) ceramid

NANA ^Dla

Gal( 1 —>3)GalNAc(l —>4)Gal(l ->4)Glc( 1 -> 1) ceramid

NANA NANA

Gülb

Gal( 1 —>3)GalNAc( 1 ->4)Gal( 1 —»4)Glc( 1 —»1) ceramid

NANA ^Tlb

Gal(l-^3)GalNAc(l-+4)Gal(l—>4)Glc(l—>l) ceramid

NANA NANA

NANA ahol Glc glukózt, GalNAc N-acetil-galaktózamint, Gál galaktózt, NANA pedig N-acetil-neuraminsavat jelent.

A találmány az új N-acil-lizogangliozidok keverékeinek előállítására is vonatkozik, különösen azokéra, amelyek különböző állati szövetek kivonataiban lévő gangliozid keverékekből származnak, így „teljes” kivonatokból vagy különböző frakciókból, például az irodalomban leírtakból. Ilyen irodalomra példák az előzőekben említett cikkek vagy a fenti könyv „Extraction and Analysis of Materials Containing Lipid Bound Sialic Acid” (Lipidhez kötött sziálsavat tartalmazó anyagok extrakciója és analízise) című fejezete [159-186 (1976)] és a fent említett fejezet is, továbbá a 2 549 680 sz. német szabadalmi leírás. Ezekben az új keverékekben a gangliozid keverékek N-acil részét a fent említett acil-csoportok egyike alkotja. Előállíthatók a találmány szerinti eljárással, az alábbi leírás szerint, a gangliozid keverék dezacilezésével, majd újra acilezésével, adott esetben a gangliozid sziálsav részében lévő másik dezacilezett csoport újra acilezése után. Akiindulási anyagként használt, legfontosabb gangliozid keverékek közül az idegrendszerből, különösen az agyvelőből extrahált gangliozidokat, amelyek a GM), G_Dla, G_Dlb és G_Tlb gangliozidokat tartalmazzák, már említettük.

Mint fentebb megjegyeztük, a találmány alapja az a felismerés, hogy az itt ismertetett, új, félszintetikus gangliozid analógok és fent említett funkciós származékaik vagy mindezek sói lényegében ugyanolyan farmakoló4

HU 210 744 Β giai hatásokat mutatnak, mint a természetes gangliozidok vagy analóg funkciós származékaik, hatásspektrumuk azonban sok vonatkozásban különbözik.

Ezek a módosított gangliozidok továbbá gátolják a proteinkináz-C aktivitást.

A találmány szerinti módosított gangliozidok fent említett farmakológiai tulajdonságai a következő kísérletekkel szemléltethetők:

Primer idegsejttenyészetekben az ingerlő aminosav (EAA) receptorok fokozzák a Ca²⁺ beáramlás növekedését és a proteinkináz-C (PKC) transzlokációját a citoszólból a membránba, aminek következménye az enzimaktivitás növekedése. Glutamát hozzáadása, vagy a magvas sejtek primer kultúrájának anoxiás körülmények közé való helyezése sejtkárosodást okoz, amely a neuronok elhalását eredményezi. Az akut agyi iszkémiát a glutaminerg jelátvitel zavara követi, ami az események olyan egymásutánját váltja ki amely in vitro sejthalálhoz vezet.

Ismert, hogy a primer neuron-kultúrák preexpozíciója triszialozil-N-tetraglikozil-ceramidnak (GT_lb), vagy monoszialozil-N-tetraglikozil-ceramidnak (GM,) gátolja a PKC-transzlokációt és véd a glutamát okozta sejthalál ellen.

Kötődési kísérletek szerint a gangliozidok hatásmechanizmusa nincs összefüggésben a receptor-antagonizmussal.

Itt azokat a kísérleteket ismertetjük, amelyek az N'-3,4,5-trimetoxi-benzoil-N'-lizo-GM, (5. ligád), N(2-furoil)-N-lizo-GM, (34. ligád), N-(l-metil-2-pirrolkarbonil)-N-lizo-GM, (38. ligád), N-(2-tiofén-acetil)N-lizo-GM, (45. ligád), N,N'-difenil-acetil-di(lizoGM,) (82. ligád), N,N'-di(2-piridil-acetil)-di(lizoGM,) (84. ligád) és N,N'-di(5-metil-2-tiofén-karboxil)di(lizo-GM,) (85. ligád) gangliozid-származékokkal végeztünk, amelyek alkalmasak a glutamát okozta szelektív neuronpusztulással szembeni antagonista képesség becslésére.

ESZKÖZÖK ÉS MÓDSZEREK

A sejtkultúrák napos Sprague Dawley patkányok kisagyi szemcsesejtjeinek primer tenyészetével dolgoztunk, amely >90% szemcsesejtet, kb. 5% GABAerg neuront és <5% gliasejtet tartalmazott. E kísérletekben a sejteket a tenyésztés 12. napján használtuk fel.

Neurotoxicitás indukálása glutamáttal

A glutamátot (100 μπιοΐ-t Mg²⁺-mentes Locke-oldatban) a sejtekhez adtuk, és szobahőmérsékleten 15 percig állni hagytuk (a kontrolihoz nem adtunk glutamátot); a tenyészeteket háromszor átmostuk Locke-oldattal, hogy a glutamát-felesleget eltávolítsuk, majd visszahelyeztük eredeti közegükbe.

A vegyület oldhatóvá tétele, inkubációja és az értékelés módja

Az 5., 34., 38., 45., 82., 84. és 85. ligádot kloroform és metanol 2:1 arányú elegyében oldottuk fel, N₂-ben szárítottuk, 5X10^-6 M végső koncentrációban újra szuszpendáltuk Mg²⁺-t is tartalmazó Locke-oldatban, és 15 perccel a neurotoxicitás előidézése előtt 37 °C-on a tenyészetekhez adtuk, a GM,-et, amelyet lxl Ο^-4 M végső koncentrációban hasonlóképpen tettünk oldhatóvá, az LGlu-expozíció előtt 120 perccel adtuk a sejtekhez. A sejtek túlélését 24 órával később kolorimetriás módszerrel (D. O. 570-630) vizsgáltuk MTT [3-(4,5-dimetil-tiazol2-il)-2,5-difenil-tetrazolium] alkalmazásával.

EREDMÉNYEK

A kísérletek azt mutatták, hogy az 5., 34., 38., 45.,

82., 84. és 85. ligád 5X10⁶ M koncentrációban és a kontrollként használt GM, lxlO⁴ M koncentrációban hatékonynak bizonyult (p<0,05) a glutamáttal kiváltott neurotoxicitással szembeni védelemben (1. táblázat).

Megjegyzendő, hogy a ligád-származékok 10-szer kisebb dózisban és sokkal rövidebb előzetes inkubáció után is hatékonyak, mint a GM,.

ÉRTÉKELÉS

A kapott eredmények világosan mutatják, hogy az

5., 34., 38., 45., 82., 84. és 85. ligádnak nevezett új gangliozid-származékok antagonista hatásúak a kisagyi szemcsesejtek primer tenyészetében glutamát által indukált neurotoxicitással szemben.

Az új származékok hatása azért különösen érdekes, mert a megfelelő hatékonyságú GM,-nél több, mint 10-szer kisebb koncentrációban és rövidebb előzetes inkubáció után is megfigyelhető.

Tekintettel arra a hatásukra, a találmány szerinti származékok olyan, glutaminerg típusú károsodáson alapuló akut és krónikus kórképek esetében javasolhatók, mint az agyi iszkémia, trauma, epilepszia, chorea, Parkinson-kór, időskori demencia csakúgy, mint az agyi rendellenességek, hipoglikémia és hipoxia. Az agyi károsodások, különösen a neurotoxicitás néhány mechanizmusa ugyanakkor megegyezik más rendszerekével, például a neurokardiovaszkuláris rendszerével is.

1. táblázat

Az 5., 34., 38., 45., 82., 84. és 85. ligád, továbbá a

GM\ védőhatása a kisagyi szemcsesejtek primer kultúrájában exogén glutamát által kiváltott neurotoxicitás modelljében.

Vegyület	A sejtek túlélése MTT (D. 0.570-630)
Kontroll (Locke-oldat Mg2+)	0,156±0,021
L-Glutamát	0,103±0,004
L-Glu+ 5. ligád	0,147±0,014
L-Glu+34. ligád	0,126±0,003
L-Glu+38. ligád	0,131 ±0,003
L-Glu+45. ligád	0,138±0,006
L-Glu+82, ligád	0,165±0,006
L-Glu+84. ligád	0,151±0,007
L-Glu+85. ligád	0,126±0,008
L-Glu+GM,	0,133±0,018

HU 210 744 B

A szemcsesejteket a tenyésztés 12. napján, szobahőmérsékleten, 15 percen keresztül 100 μΜ L-glutamátnak (L-Glu) tettük ki. A ligád-származékokat, amelyeket Locke-oldatban oldottunk fel 5X10⁶ M végső koncentrációban, 15 perccel a neurotoxicitás kiváltása előtt adtuk a sejtekhez, míg az 1x10^* M koncentrációjú GM] előzetes inkubációja 120 perc volt. A ligádszármazékok és a GM] L-Glutamáttal szembeni hatására p<0,05 adódott.

A fent ismertetett farmakológiai tulajdonságaik alapján a találmány szerinti félszintetikus gangliozidanalóg vegyületek gyógyszerként alkalmazhatók a következő kórképek esetében: agyi iszkémia, metabolikus enkefalopátiák pl. hipoglikémia és hipoxia, méregeredetű enkefalopátiák, trauma, időskori rendellenességek, epilepszia, neurodegeneratív betegségek pl. Parkinson-kór és Huntington-féle chorea, továbbá elmebetegségek.

Beadásuk általában injekció formájában intramuszkuláris, szubkután, intravénás, transzdermális vagy pulmonáris úton történhet, lehetőleg megfelelő hígítású vizes oldatban. A gyógyszer biztonságos tárolását a származék oldatainak fiolákba való kiszerelése biztosíthatja tetszés szerint más, kiegészítő anyagokkal együtt, amint azt a későbbiekben, a jelen találmány gyógyszerként való kiszerelésével kapcsolatban tárgyaljuk. A fent említett parenterális úton való terápiás esetleg megelőző - alkalmazás esetén a dózis 0,Οδό mg hatóanyag/testtömeg kg/nap között, de különösen 0,05-2 mg/testtömeg kg/nap között változhat.

Bár a találmány szerinti új terápiás alkalmazások általában jól használhatók a központi és a perifériás idegrendszer idegi ingerületvezetésének károsodásával kapcsolatos összes kórkép esetében, a következők különösképpen kiemelendők: retrobulbáris látóideg-gyulladás, a szemmozgató idegek bénulása és a Bell-féle hűdés, Garcin-szindróma, perifériás idegek baleseti eredetű léziója, diabetikus és alkoholos polineuritisz, szülési paralízis, bénulásos isiász, mozgatóneuron-betegség, amiotróf laterális szklerózis, mielopátiás izomsorvadás, előrehaladott bulbáris paralízis, myasthenia gravis és Lambert Eaton-szindróma, izomdisztrófia, a központi és perifériás szinaptikus ingerületátvitel károsodásai, továbbá tudatzavarok pl. fogalomzavar, agyrázkódás, trombózis és embólia.

A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás olyan a természetes GM] gangliozidból vagy gangliozid-elegyekből származó félszintetikus gangliozid-száimazékok előállítására, amelyek a neuramin-rész nitrogénatomján (N) és/vagy a szfingozin-rész nitrogénatomján (Ν') az alább felsorolt alifás, aralifás, aliciklusos vagy heterociklusos acilcsoportok valamelyikével, de legfeljebb az említett két nitrogénatom egyikén alifás acilcsoporttal vannak acilezve. Ezek a félszintetikus gangliozid-származékok tehát olyan N,N'diacil-N,N'-di-lizo-, N-acil-N-lizo- vagy N'-acil-N'-lizo-gangliozid lehetnek, amelyek az N,N'-di-lizo-gangliozidok esetében mind az N-, mind az N'-nitrogénatomon, az N-lizo- és N'-lizo-gangliozidok esetében pedig csak az N-, illetőleg N'-nitrogénatomon az alább felsorolt acilcsoportok valamelyikével vannak acilezve, de minden esetben legfeljebb csak a két nitrogénatom egyikén tartalmaznak alifás acilcsoportot. Az acilező csoportok a következők lehetnek: alifás acilcsoportok:

(i) adott esetben halogénatommal helyettesített 2-16 szénatomos alkanoilcsoport;

aralifás, aromás, aliciklusos vagy heterociklusos acilcsoportok:

(ii) adott esetben egy vagy két 1-7 szénatomos alkoxicsoporttal helyettesített benzoil- vagy naftil-karbonil-csoport;

(iii) fenil-, naftil- vagy l-indanon-2- vagy -3-il-csoporttal helyettesített 2-8 szénatomos alkanoilcsoport, amelyek az aromás gyűrűkön 1-7 szénatomos alkoxicsoporttal lehetnek helyettesítve;

(iv) 3—8 szénatomos cikloalkil-karbonil-csoport, norbornil-2-8-szénatomos-alkanoil-csoport;

(v) 1-7 szénatomos alkil-karbonil- vagy 1-7 szénatomos alkil-tiokarbonil-csoport, amelyek imidazolil-, tetrazolil-, tienil-, furil-, piridil- vagy 7-teofillinilcsoporttal vannak helyettesítve;

(vi) furoil-, tienil-karbonil-, 4-6 szénatomos, adott esetben valamely metiléncsoport helyett -O-, -S- vagy -NH-csoportot tartalmazó alkilén-imino-karbonilcsoport, amelyben az alkilén-imino-csoport valamely szénatomján keresztül kapcsolódik a karbonil-csoporthoz; pirrolil-karbonil-, piridil-karbonilvagy kinolil-karbonil-csoport, mimellett a fenti heterociklusos csoportok adott esetben 1-7 szénatomos alkilcsoporttal lehetnek helyettesítve valamint az ilyen gangliozid-származékok szialsavkarboxilcsoporton 1-7 szénatomos alkilcsoporttal képezett észtereinek, 1-7 szénatomos alkil-amidjainak, belső észtereinek és a szabad hidroxilcsoportokon 2-8 szénatomos alkanoilcsoporttal peracilezett származékainak, mindezek fémsóinak és az ilyen vegyületek elegyeinek az előállítására, valamely Ν,Ν'-di-lizo-, Nacil-N,N'-di-Iizo vagy N'-acil-N,N'-di-lizo-gangliozidot a bevinni kívánt acilcsoportnak megfelelő szerves savval vagy ennek reakcióképes származékával acilezünk vagy diacilezünk, és kívánt esetben a kapott acilezett származékot észterré, amiddá, belső észterré vagy hidroxi-peracilezett származékká és/vagy gyógyászati szempontból elfogadható sóvá alakítjuk.

Ugyancsak a találmány körébe tartozik a fenti meghatározásnak megfelelő N,N'-diacil-N,N'-di-lizo-, Nacil-N-lizo-, illetőleg N'-acil-N'-lizo-gangliozidok sziálsav-karboxil-csoporton 1-7 szénatomos alkilcsoporttal képezett észtereinek, 1-7 szénatomos alkil-amidjainak, belső észtereinek és a szabad hidroxilcsoportokon 2-8 szénatomos alkanoilcsoporttal peracilezett származékainak, mindezek fémsóinak és az ilyen vegyületek elegyeinek, valamint az említett félszintetikus gangliozid-származékokat, azok fent meghatározott észtereit, amidjait, belső észtereit vagy peracilezett származékait akár hatóanyagként, akár vivő- vagy egyéb segédanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítása is.

A találmány szerinti eljárással előállítható félszintetikus gangliozid-származékokban a neuramin- vagy a

HU 210 744 Β szfingozin-rész nitrogénatomján az alifás acilcsoport 2-16 szénatomos alkánsavakból származó acilgyök, tehát például acetil-, propionil-, butiril-, izobutiril-, oktanoil- vagy lauroilcsoport lehet, amely adott esetben egy vagy több halogénatommal lehet helyettesítve. Az előnyös alifás acilcsoportok példáiként a diklór-acetil-, butiril- és lauroilcsoport említhetők.

A cikloalifás acilcsoportok 3-8 szénatomos, előnyösen 4-7 szénatomos cikloalkilgyurut tartalmazó acilcsoportok, mint a ciklobután-karbonil-, ciklopentán-karbonil- vagy cikloheptán-karbonil-csoport lehetnek, de a cikloalifás gyűrű kapcsolódhat alkilénláncon keresztül is a karbonilcsoporthoz, mint a norbornil-(28 szénatomos alkanoil)-csoportok esetében.

Az aralifás acilcsoportok fenil-, naftil- vagy indanozil-csoporttal helyettesített 2-8 szénatomos alkanoilcsoportok lehetnek, amelyek az aromás gyűrűben még 1-7 szénatomos alkoxicsoporttal helyettesítve is lehetnek. Az ilyen aralifás csoportok előnyös példaként a fenil-acetil- és az 5-metoxi-l-indanon-3-il-acetil-csoport említhetők.

Aromás acilcsoportként benzoil- vagy naftil-karbonil csoportok szerepelhetnek, amelyek az aromás gyűrűben 1-7 szénatomos alkoxi-csoportokkal lehetnek helyettesítve; különösen előnyösek a 2,6-dimetoxibenzoil- és a 3,4,5-trimetoxi-benzoil-csoport.

A heterociklusos acilcsoportokban a heterociklusos gyűrű közvetlenül vagy alkilénláncon keresztül kapcsolódhat a karbonilcsoporthoz, és a heterociklusos gyűrű alkil-szubsztituenst is hordozhat. A karboxilcsoporthoz közvetlenül kapcsolódó heterociklusos csoportok példaként a furoil-, tiofén-karbonil-, 1-metil-prolil-, 6-metil-nikotinoil-, 3-kinolin-karbonil- és l-metil-2ρίσοΐ-karbonil-csoportok, az alkiléncsoporton keresztül a karbonil-csoporthoz kapcsolódó heterociklusos csoportok példáiként pedig a 4-imid-azolil-acetil-, 1tetrazol-acetil-, 2-tiofen-acetil-, 2-piridil-acetil-, 4-piridil-tioacetil- és 7-teofillin-acetil-csoport említhetők.

Az egy vagy két fenti acilcsoportot tartalmazó félszintetikus gangliozidok szabad karboxilcsoportjain 17 szénatomos alkanollal észterezett származékok sorában különösen a metil- és etilészterek, az amidok sorában pedig az 1-4 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált amidok előnyösek.

A szabad hidroxilcsoportokon peracilezett származékok O-acilcsoportjai 2-8 szénatomos alkánsavakból, előnyösen ecetsavból, propionsavból vagy vajsavból származhatnak, míg a belső észterek általában a sziálsav karboxilcsoportján és a szacharid-rész hidroxilcsoportjai közötti laktonképződéssel jönnek létre, de lehetséges a belső észterekben másfajta, például a sziálsav karboxilcsoportjai és a sziálsav hidroxilcsoportjai között laktonképződés is.

A találmány szerinti N- és N'-acil-N,N'-di-(lizogangliozid)-okban az acil-csoport egyike a fent említett aromás, aliciklusos, aralifás vagy heterociklusos sorozatokba tartozó savaknak. Ezért mind a szfingozin-nitrogénen, mind a neuramin-nitrogénen legalább az egyik acil-csoportnak ilyen természetűnek kell lennie. Az N,N'-diacil-N,N'-di(lizogangliozid)-okban mindkét acil-csoport származhat a fenti sorozatok savaiból, és ezek a vegyületek különösen fontosak a találmány szempontjából, mivel ezeket könnyebb előállítani.

Az Ν,Ν'-diacil-származékokban az egyik acil-csoport azonban származhat telített, halogénatommal szubsztituált vagy szubsztituálatlan alifás savból is, előnyösen 2-16 szénatomszámmal. Az ilyen savak közül a 2-11 szénatomos, egyenesláncú vagy elágazó savak említendők, így az ecetsav, propionsav, vajsav, valeriánsav, különösen a n-valeriánsav és az izovaleriánsav, piválsav, kapronsav, izokapronsav, önántsav, kaprilsav, pelargonsav, kaprinsav, undekán-karbonsav, di(terc-butil)-ecetsav és 2-propil-valeriánsav. A hoszszabb láncú savak közül az egyenesláncúak megfelelőek, különösen a 12-16 szénatomszámúak, például a laurilsav, a mirisztilsav és a palmitinsav. Az elágazó szénláncú acil-csoportok oldalláncai előnyösen kis szénatomszámú alkil-csoportok, legfeljebb 4 szénatommal, elsősorban metil-csoportok.

Különös jelentőségűek azok az N,N'-diacil-N,N'di(lizogangliozid), amelyekben a neuramin-nitrogénen lévő alifás acil kevert acil, mint a természetes gangliozidokban, vagyis nagyobb részben acetil, kisebb részben glikolil, és amelyekben adott esetben a neuramin rész hidroxil-csoportjai is acilezve vannak. Ilyen származékok előállíthatok a gangliozidok szfingozin-nitrogénjén végzett szelektív hidrolízissel és az így kapott N'-lizogangliozidok N-helyzetű acilezésével a fent említett, aromás, aralifás, aliciklusos vagy heterociklusos sorozatokba tartozó savak valamelyikével.

Hasonlóképpen a gangliozidok a neuramin-nitrogénen is hidrolizálhatók szelektíven, és az így kapott N'-lizogangliozidok amino-csoportja acilezhető a fent említett, nem alifás savakkal. A nagyobb szénatomszámú zsírsavakból származó, kevert acil-csoportok, amelyek a természetes gangliozidokban jelen vannak, érintetlenül maradnak a szfingozin-nitrogénen. Ez az egyik előnyös célja a találmánynak.

A találmány szerint előállítható új acil-di(lizogangliozid)-ok sorában fontosak lehetnek a természetes gangliozidok, mint a GM_b GD_]a, GD_lb, GT_]b, GM₂ és GM₃ gangliozidok elegyeiből származó N-acil-N-lizogangliozidok. Ezekben a származékokban a neuraminon lévő acil-csoportok azok, amelyek a fenti gangliozidokban előfordulnak, vagyis kevert acetil-glikolilcsoportok, az acetil-csoport többségével, és amelyekben a sziál rész hidroxil-csoportjai adott esetben a megfelelő savakkal észterezve vannak. A gangliozidokból ezeket olyan enzimes hidrolízissel lehet előállítani amelyben a dezacilezés csak a szfingozin-nitrogénen megy végbe; ezt követi az acilezés aromás, aralifás, aliciklusos vagy heterociklusos savval. Az ilyen vegyületekre példák az alábbiak:

N-2,6-limotoxi-benzoil-N-lizo-GMj

N-5-metoxi-indanon-3-acetil-N-lizo-GM₁

N-fenil-acetil-N-lizo-GM]

N-ciklobután-karboxil-N-lizo-GMj

N-2-norbornán-acetil-N-lizo-GM)

N-furoil-N-lizo-GM]

N-imidazol-acetil-N-lizo-GM,

HU 210 744 Β

N-6-metil-nikotinil-N-lizo-GM]

N-metil-propil-N-lizo-GM j

N-1 -metil-2-pirrol-karboxil-N-lizo-GM ]

N-2-piridil-acetil-N-lizo-GM!

N-4,4-piridil-tioacetil-N-lizo-GM₁

N-3-kinolin-karboxil-N-lizo-GM!

N-tetrazolil-1 -acetil-N-lizo-GM!

N-7-teofillin-acetil-N-lizo-GM]

N-2-tiofén-acetil-N-lizo-GMj

N-3,4,5-trimetoxi-benzoil-N-lizo-GM₁

N-cikloheptán-acetil-N-lizo-GM]

N-ciklopentán-acetil-N-lizo-GM) és a fentebb megnevezett egyéb bázikus gangliozidok megfelelő származékai, továbbá mindezen vegyületek belső észterei.

Az N,N'-diacil-N,N'-di(lizogangliozid)-okra példák azok a származékok, amelyek a GM, vagy a fentebb megnevezett egyéb gangliozidokból származó, fent említett N-acil-N-lizogangliozidoknak felelnek meg, amelyekben azonban a neuramin-nitrogén aminocsoportja is acilezve van ugyanezekkel a savakkal. Például

N-N'-difcikloheptil-acetilj-N.N'-diQizo-GM)) N-N'-di(ciklopentil-karboxil)-N,N'-dí(lizo-GM,) N-N'-di(fenil-acetil)-N,N'-di(lizo-GM)) N-N'-diípiridil-acetilj-N.N'-diQizo-GM]) N-N'-di(5-metil-2-tiofén-acetil)-N,N'-di(lizo-GMj).

A GM, gangliozidból és a többi, fentebb megnevezett, bázikus gangliozidokból származó N'-monoacilN,N'-di(lizogangliozidok) ugyanolyan acil-csoportokat tartalmaznak, mint a GM, N-mono(lizogangliozidok) speciális példáiban említettek, de a neuramin-nitrogénen, nem pedig a szfingozin-nitrogénen. A találmány szerinti vegyületek másik érdekes csoportját alkotják például azok a fent említett N-acil-N-lizo-GM, vegyületeknek megfelelő gangliozid-származékok, amelyekben a neuramin-nitrogénen lévő, „természetes” kevert acil helyett 3-6 szénatomos alifás sav, így valeriánsav vagy piválsav, illetve ugyanilyen típusú, halogénnel szubsztituált sav, így monoklór-ecetsav vagy diklórecetsav vagy 12-18 szénatomos alifás sav, így palmitinsav szerepel.

A találmány szerinti félszintetikus gangliozid analógokat inért módon lehet előállítani, mégpedig a di(lizogangliozidok) vagy azok N-acil- vagy N'-acil-származékaik acilezésével vagy adott esetben a szfingozinnitrogénen és a neuramin-nitrogénen az N,N'-diacilN,N'-di(lizogangliozidok) szelektív dezacilezésével.

Olyan diacil-származékok előállítása, amelyekben az acil-amino-csoportok azonos savból származnak, az egyszerűség kedvéért úgy előnyös, hogy a di(lizogangliozid)-okat az ismert eljárással, egyetlen műveletben acilezzük. A di(lizogangliozidok) gangliozidokból vagy N-lizogangliozidokból lúgos hidrolízissel nyerhetők, például tetraalkil-ammónium-hidroxidokkal, kálium-hidroxiddal vagy más bázisokkal. Olyan, találmány szerinti termékek előállításához, amelyekben az acil-amino-csoportok különböző savakból származnak, előnyös a di(lizogangliozidok) N- vagy N'-monoacil származékait használni kiindulási anyagként. Az Nmonoacil-di(lizogangliozidok) szelektív acilezéssel állíthatók elő a di(lizogangliozid)-okból, mivel a szfingozin amino-csoportja reakcióképesebb, mint a neuramin aminja. A di(lizogangliozidok) enyhe acilezése ismert módszerekkel, például a peptidkémiában használt acilezési eljárásokkal lehetővé teszi a szfingozinnitrogénen a fent említett monoacil származékok előállítását. Ezt követi a neuramin-nitrogén acilezése a szokásos módon. A találmány szerinti termékek előállítására szolgáló acilezési eljárás ebben az esetben kétlépéses acilezési reakcióból áll.

Különféle módszerek alkalmazhatók a neuraminnitrogénen monoacil vegyületek előállítására. Kiindulhatunk például di(lizogangliozid)-okból, és folytathatjuk a szfingozin amino-csoportjának időszakos védő blokkolásával, például foszfatidil-kolinnal való hidrofób kölcsönhatás révén vagy megfelelő védőcsoporttal való acilezéssel, amit a neuramin-nitrogén acilezése követ azzal a sav-származékkal, amelyet erre a helyre be kívánunk vinni, végül eltávolítjuk a szfingozin-nitrogén védelmét. Acilezhetjük a di(lizogangliozidok) két amino-csoportját azonos savval, majd a diacil vegyületet olyan enzim hatásának tesszük ki, amely szelektíven csak az egyik acil-amino kötést hasítja a szfingozin-nitrogénen, például olyan enzimekkel, amelyekkel gangliozidokból lizogangliozidokat állítanak elő. Példa erre a glikoszfingolipid-ceramid-dezaciláz enzim (lásd 1. reakcióvázlat).

N-monoacil-N,N'-di(lizogangliozid)-ok azonban előállíthatok az N,N'-diacil-N,N'-di(lizogangliozid)-ok neuramin-nitrogénjének dezacilezésével, szelektív kémiai hidrolízissel, például 0,1 mólos alkoholos káliumhidroxiddal.

Az így kapott acil-di(lizogangliozid)-ok, ha szükséges, átalakíthatok funkcionálisan a sziálsavak karboxilcsoportjain vagy az ilyen savak hidroxil-csoportjain. Például ezek a csoportok átalakíthatok észterekké vagy amidokká, illetve a hidroxilok észterezhetők (peracilezhetők) savakkal.

A találmány szerinti eljárás N-acil-N,N'-di(lizogangliozidok), N'-acil-N,N'-di(lizogangliozidok) és N,N'-diacil-N,N'-di(lizogangIiozidok) előállítására magában foglalja az N,N'-di(lizogangliozidok), az Nacil-N,N'-di(lizogangliozidok) és az N'-acil-N,N'-di(lizogangliozidok) acilezését a fent említett acil-csoportoknak megfelelő savakkal avagy a megfelelő N,N'diacil-N,N'-diacil-N,N'-di(lizogangliozidok) vagy keverékeik szelektív dezacilezését a szfingozin-nitrogénen vagy a neuramin-nitrogénen. Ha szükséges, az így kapott vegyületek átalakíthatok észterekké, amidokká, belső észterekké vagy hidroxil-csoportjaikon peracilezhetők. Mindezek a vegyületek átalakíthatok a megfelelő sókká is.

A fent említett eljárással az N-acilezés szokásos módszerekkel végrehajtható, például úgy, hogy a kiindulási anyagot acilezőszerrel, mindenekelőtt a sav funkciós származékával reagáltatjuk, amikor is a sav acil-csoportja belép a molekulába. A savak funkciós származékaiként használhatók a halogenidek és az anhidridek, az acilezés pedig előnyösen tercier bázisok,

HU 210 744 B így piridin vagy kollidin jelenlétében végezhető. Dolgozhatunk vízmentes körülmények között, szobahőmérsékleten vagy e fölött, de előnyösebben a Schotten-Baumann módszerrel vizes közegben, szervetlen bázis jelenlétében. Bizonyos esetekben használhatók a savak észterei is funkciós származékként. Az acilezéshez aktivált karboxil-csoportot tartalmazó származékokat alkalmazhatunk, például a peptidkémiában használatosakat, például kevert anhidrideket vagy karbodiimid-származékokból nyert származékokat vagy izoxazólium-sókat.

A különböző előállítási módszerek közül az alábbiak a legmegfelelőbbek:

1. A lizogangliozid-származékok reagáltatása savaziddal.

2. A lizogangliozid-származékok reagáltatása a sav acil-imidazoljával, amely a sav és Ν,Ν'-karbonildiimidazol reakciójával nyerhető.

3. A lizogangliozid-származékok reagáltatása a sav kevert anhidridjével és trifluor-ecetsavval.

4. A lizogangliozid-származékok reagáltatása sav-kloriddal.

5. A lizogangliozid-származékok reagáltatása a savval karbodiimid (így diciklohexil-karbodiimid) és adott esetben olyan vegyület, mint az 1-hidroxi-benztriazol jelenlétében.

6. A lizogangliozid-származékok reagáltatása a savval, melegítés közben.

7. A lizogangliozid-származékok reagáltatása a sav metil-észterével magas hőmérsékleten.

8. A lizogangliozid-származékok reagáltatása a sav fenol-észterével, így p-nitro-fenollal alkotott észterével.

9. A lizogangliozid-származékok reagáltatása olyan észterrel, amely a sav sója és l-metil-2-klór-piridínium-jodid kicserélődése révén jön létre.

Már említettük, hogyan végezhetők szelektív, parciális acilezések mind a szfingozin-nitrogénen, mind a neuramin-nitrogénen. Az 1. reakcióvázlat szemlélteti ezeket az eljárásokat.

Az N,N'-diacil-N,N'-di(lizogangliozidok) szfmgozin-nitrogénjének enzimes dezacilezése ugyanolyan körülmények között végezhető, mint amit említettünk a gangliozidok parciális dezacilezésénél, például ilyen található: J. Biochem., 103, 1 (1988). Az Ν,Ν'-diacilN,N'-di(lizogangliozidok) kettős dezacilezését N,N'di(lizogangliozid)-okká ugyanolyan módon végezhetjük, mint a dez(N-acetil)-lizogangliozidok előállításánál, például az alábbi leírások szerint: Biochemistry, 24, 525 (1985); J. Bioi. Chem., 255, 7657 (1980); Bioi. Chem. Hoppé Seyler 367, 241 (1986); Carbohydr. Research, 179, 393 (1988); Biochem. Biophys. Rés. Comm. 147, 127 (1987).

A fenti, utolsó előtti közlemény a neuramin-nitrogén szelektív dezacilezésére is ad módszert: a GM₃ gangliozidot reagáltatja 0,1 mólos KOH 90% n-butanolt tartalmazó oldatával. Ezt a dezacilezést a találmány szerint alkalmazni lehet N,N'-diacil-N,N'-di(lizogangliozid)-okra, amikor is N-acil-N,N'-di(lizogangliozid)-okat nyerünk. Természetesen a találmány szerint bármilyen, kémiailag egyenértékű előállítási módszer alkalmazható, amely a szakembereknek rendelkezésükre áll.

Az említett eljárásokkal nyert, új acil-lizogangliozidok karboxil- vagy hidroxil-származékainak előállítása ismert eljárásokkal elvégezhető, kivéve azokat a módszereket, amelyek megváltoztatnák a gangliozid alapszerkezetét. Ez kizárja azokat az eljárásokat, amelyek erősen savas reagenseket alkalmaznának, vagy amelyeket erősen lúgos vagy savas körülmények között játszatnánk el, vagy amelyek a szacharid rész hidroxil-csoportjainak nemkívánatos alkileződéséhez vezetnének.

Az N-acil-gangliozidok karboxil-csoportjainak észterezését vagy amidálását például a 4 713 374 sz. USA-beli szabadalmi leírás szerint végezhetjük, amely gangliozidokra vonatkozik. A találmány szerinti származékok belső észtereinek kialakítására ugyanazt az eljárást alkalmazhatjuk, mint a gangliozidok belső észtereinek előállítására, például a 4 593 091 sz. USA-beli és a 0 072 722 sz. EP szabadalmi leírások szerintit.

Ezek a belső észterek nemcsak a sziálsav karboxilcsoportjai és a szacharid hidroxiljai közötti laktonképződéssel alakulhatnak ki, hanem lakton-gyűrű jöhet létre például a sziálsav karboxilja és a sziálsav hidroxilja között i^ mivel ez utóbbiak a szacharid részhez is kötődnek; képződhetnek azonban más lakton-szerkezetek is. Az említett szabadalmak eljárásai belső észterek előállítására a gangliozidokat laktonképző szerekkel kezelik nemvizes, szerves oldószerben, vízmentes körülmények között. Az alkalmas szerves oldószerek a következők: dimetil-szulfoxid, dimetil-formamid, szulfolán, tetrahidro-furán, dimetoxi-etán, piridin vagy ezek keverékei. Alkalmas reagensek a laktonképzéshez a szerves oldószerekben oldódó karbodiimidek, így a diciklohexil-karbodiimid, a benzil-izopropil-karbodiimid, a benzil-etil-karbodiimid, a 2-klór-metil-piridin sói, az etoxi-acetilén és a Woodward-reagens (N-etil-5fenil-izoxazólium-3'-szulfonát). Régebbi módszerek a gangliozid reakcióit használják ecetsavval, triklór-ecetsavval vagy vízben, illetve vizes közegben oldódó karbodiimiddel. Mindezek a módszerek alkalmasak az új N-acil-lizogangliozidok belső észtereinek előállítására is. A karboxil-csoport „külső” észterezéséhez, azaz a fent említett sorozatokba tartozó alkoholokkal való észterezéshez például reagáltathatjuk az N-acil-lizogangliozidokat a kívánt alkohollal ioncserélő, pl. Dowex-50 típusú gyanta jelenlétében; a kitermelést azonban a belső észterek egyidejű képződése korlátozza, és a reakcióidő meglehetősen hosszú. Másik módszere az észterezésnek, hogy az alkoholt Dowel-50Wx8 típusú gyantán (H-forma, 100-200 mesh) bocsátjuk át, és az eluátumot ugyanebben az alkoholban oldva, a megfelelő diazo-alkánnal kezeljük.

Másik, alkalmas észter-előállítási módszer értelmében a lizogangliozid-származék fémsóját éterező szerrel kezeljük. Alkálifém és alkáli földfém sók alkalmazhatók, de bármely más fémsó is megfelelő. Éterező szerként az irodalomban ismertetettek használhatók, így elsősorban különböző szervetlen savak vagy szerves szulfonsavak észterei, így hidrogén-savak, más

HU 210 744 B szóval halogén-szénhidrogének, így metil- vagy etil-jodid stb., szénhidrogének semleges szulfátjai vagy savai, szulfitok, karbonátok, szilikátok, foszfitok vagy szénhidrogén-szulfonátok, például p-toluol-szulfonát. A reakciót alkalmas oldószerben, például alkoholban, előnyösen a beviendő alkil-csoportnak megfelelő alkoholban, de akár apoláris oldószerekben is, így ketonokban vagy éterekben, így dioxánban vagy dimetil-szulfoxidban hajthatjuk végre.

Az észterezés különösen előnyös módja a lizogangliozid-származék belső észterének kezelése a kívánt alkohol és az annak megfelelő alkoholét keverékével. A reakciót az alkohol forráspontján játszathatjuk le, de végezhetjük alacsonyabb hőmérsékleten is; ilyenkor azonban a reakcióidő hosszabb lesz.

A találmány szerinti lizogangliozid-származékok amidjait ismert módszerekkel állíthatjuk elő. Különösen az alábbiakkal:

a) Az N-acil-lizogangliozid-származékok belső észtereinek reagáltatása ammóniával vagy aminokkal.

b) Az N-acil-lizogangliozid-származékok karboxilésztereinek reagáltatása ammóniával vagy aminokkal.

c) Az N-acil-lizogangliozid-származékok karboxilcsoportjainak aktiválása, majd a reagáltatásuk ammóniával vagy aminokkal.

Az a) reakció közvetlen kezeléssel hajtható végre, oldószerrel vagy anélkül, amikor is a gangliozid belső észterét ammóniával vagy a kívánt amidnak megfelelő aminnal reagáltatjuk. A reakciót alacsony hőmérsékleten, így -5 és +10 °C között is végezhetjük, de előnyösebb szobahőmérsékleten vagy afölött, például 30-120 ’C-on. Oldószerként használhatunk ketonokat, aromás szénhidrogéneket, dimetil-formamidot, dimetil-szulfoxidot, dioxánt vagy tetrahidro-furánt. A b) reakciót előnyösen ugyanolyan körülmények között hajtjuk végre, mint az a) reakciót. A találmányi leírásban szereplő észtereken kívül más észtereket, például fenol-észtereket is alkalmazhatunk.

A c) reakcióban a karboxil-csoport aktiválására a peptidkémiában ismert módszereket alkalmazhatjuk, elkerülve azokat, amelyeknek körülményei túlságosan savasak vagy lúgosak, nehogy a gangliozid molekulát elbontsuk. Ha például a kiindulási gangliozidok nátrium-só alakjában vannak jelen, célszerű először a sót Dowex típusú ioncserélő gyantával vagy más kationcserélővei kezelni. Kondenzációs módszer is alkalmazható, karbodiimidek, például diciklohexil-karbodiimid, benzil-izopropil-karbodiimid vagy benzil-etil-karbodiimid, illetve 1-hidroxi-benztriazol vagy Ν,Ν'-karbonildiimidazol jelenlétében.

A szacharid, a sziálsav és adott esetben a ceramid rész acilezését is az ismert módszerekkel végezhetjük, például sav-halogeniddel vagy -anhidriddel, előnyösen tercier bázis, így piridin vagy kollidin jelenlétében. Eredményként a fent említett peracilezett származékokat kapjuk. A találmány szerinti eljárás meghatározása értelmében dez(N-acetil)-lizogangliozidot is alávethetünk acilezésnek, így visszaállíthatjuk az acetil-amino csoportot a neuraminsavon acilezés után. Ezt az acetilezést is végezhetjük az ismert módon. Ebben az esetben viszonylag enyhe körülményeket kell választani az N-acilezéshez, hogy a neuraminsav hidroxil-csoportja érintetlen maradjon. Ennek a csoportnak az acetilezését a szfingozin-nitrogén acilezése után erélyes módszerekkel, például ecetsav-anhidriddel végezhetjük el.

Végül, mint fentebb megjegyeztük, a fenti eljárással kapott összes olyan vegyület, amely sóképző csoportot tartalmaz, sóvá alakítható át a megfelelő só képzésére szolgáló, ismert módszerekkel.

A találmány tárgya az új származékok előállítási eljárásának módosítása is. Ennek során az eljárás bármelyik stádiumában megszakítható, vagy indítható eleve köztitermékből, amikor is csak a hátralévő lépéseket hajtjuk végre, de a kiindulási anyagokat is előállíthatjuk ugyanebben a műveleti sorban.

A találmány tárgya továbbá az új acil-lizogangliozid-származékokat, különösen az itt említetteket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására is. Ezeket a gyógyszerkészítményeket orális, rektális, parenterális, lokális vagy transzdermális alkalmazásokra lehet előállítani. Ezek tehát szilárdak vagy félszilárdak, például drazsék, tabletták, zselatinkapszulák, kapszulák, végbélkúpok és lágy zselatinkapszulák. Parenterális alkalmazásra intramuszkuláris, szubkután vagy transzdermális formák készíthetők vagy olyanok, amelyek infúzióra vagy intravénás alkalmazásra szolgálnak. Ezek a készítmények tehát a hatóanyagokat oldat vagy fagyasztva szárított porok alakjában tartalmazzák, ez utóbbiakat egy vagy több, gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyaggal vagy hígítószerrel kombinálva, hogy az említett alkalmazásokhoz kényelmes legyen, és ozmózisnyomása a fiziológiai folyadékokénak megfelelő legyen. Helyi alkalmazásra a készítmények lehetnek permetek, például „orr-spray”, krémek vagy kenőcsök helyi kezelésre vagy megfelelően készített tapaszok transzdermális alkalmazásra.

A találmány szerinti készítmények beadhatók embernek vagy állatnak. Az oldatok, permetek, krémek és kenőcsök előnyösen 0,01-10 tömeg% hatóanyagot tartalmaznak, a szilárd formák 1-100, előnyösen 5-50 tömeg%-ot. Az adagolás az egyedi kívánalmaktól függ, a szükséges hatástól és a bevitel módjától.

A találmány magában foglalja mind az új acil-lizogangliozidok, mind a már ismert, fentebb felsorolt típusok gyógyászati alkalmazását. E gyógyászati alkalmazások az összes felsorolt javallatokat felölelik. Emberek napi adagja injekcióval (szubkután vagy intramuszkulárisan), transzdermálisan vagy orálisan testtömegkilogrammonként 0,05 mg és 5 mg között mozog a hatóanyagra számítva.

Az alábbi példák szemléltetik a találmány szerinti acil-lizogangliozidok és az őket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítását és gyógyászati alkalmazásait. Ezek a példák csupán szemléltetőek, és nem tekinthetők a találmányt korlátozó eseteknek.

HU 210 744 Β

1. példa

N,N'-Di(lizo-GMf előállítása g GM_ret feloldunk 200 cm³ 3N KOH-ban, és 72 óráig 90 °C-on hidrolizáljuk.

Az oldatot lehűtjük, pH-ját sósavval 6,5-re állítjuk be, majd 18 órát állni hagyjuk 4 °C-on. A kicsapódott zsírsavakat kiszűrjük, a visszamaradt oldatot vízzel szemben dializáljuk, 500 cm³-re betöményítjük, végül 5 liter acetonnal kicsapjuk.

A terméket szárítjuk, és nagyfelbontású szilikagélkromatográfiának vetjük alá, eluensként kloroform/metanol/5N ammónia 55:45:10 arányú elegyét alkalmazva. A terméket tartalmazó frakciókat megszárítjuk, majd vízben újra feloldjuk. pH-ját 0,01N NaOHdal 10-re állítjuk be, dializáljuk, 100 mg/cm³-re töményítjük, és 5-szörös térfogatnyi acetonban kicsapjuk. 5,7 g N,N'-di(lizo-GM,)-et kapunk (az elméleti 70%a). Kloroform/metanol/5N NH₃ 55:45:10 arányú elegyével futtatott, szilikagélen végzett kromatografálás egységes terméket mutat Rf = 0,05 értékkel (a GM] értéke 0,35).

2. példa

N-Lizo-GM] előállítása g (6,37 mM) GM_ret feloldunk 200 cm³ 3N KOH-ban, és 72 órát 90 °C-on hidrolizáljuk. Az oldatot lehűtjük, és pH-ját sósavval 6,5-re állítjuk be. 18 órát 4 °C-on állni hagyjuk, majd a kicsapódott zsírsavakat kiszűrjük. A szűrletet vízzel szemben dializáljuk, 500 cm³-re töményítjük, és 5 liter acetonnal kicsapjuk.

A termék N'-lizo-GM, -et és 20% N,N'-di(lizo-GM, )et tartalmaz. Vákuumszárítás után újra feloldjuk 100 cm³ dimetil-formamidban. Lassan hozzáadunk 20 cm³ tetrahidro-furánban feloldott 2,15 g (6,37 mM) 9-fluorenilmetil-oxi-karbonil-N-hidroxi-szukcinimidet, és a reakciót szobahőmérsékleten 1 óra alatt lejátszatjuk. Ekkor hozzáadunk 3 cm³ (31,85 mM) ecetsav-anhidridet és 0,9 cm³ (63,7 mM) trietil-amint. 30 perc után 12,5 cm³ piperidin hozzáadásával eltávolítjuk a védőcsoportot. Az elegyet 18 órát szobahőmérsékleten reagáltatjuk, 2 liter acetonban kicsapjuk. A csapadékot megszárítjuk, majd 1M Na₂CO₃-ban feloldjuk, és 60 °C-on 1 órát állni hagyjuk. Dialízis után 100 mg/cm³-re betöményítjük, és 5szörös térfogatnyi acetonban kicsapjuk.

A terméket átbocsátjuk S Sepharose (H⁺ forma) oszlopon, amelyet metanollal egyensúlyba hoztunk. Metanollal mossuk, és az N-lizo-GMret 10 mM metanolos NH4C1 oldattal eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat megszárítjuk, és vízben újra feloldjuk. Az oldat pH-ját 0,01N NaOH-dal 10-re állítjuk be, dializáljuk, 100 mg/cm³-re töményítjük, és 5-szörös térfogatnyi acetonban kicsapjuk. Mintegy 5 g terméket kapunk (az elméleti 60%-a). Kloroform/metanol/5N NH3 55:45:10 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat (Rf = 0,11).

3. példa

N-Ciklobután-karbonil-N-lizo-GM) előállítása

A 2. példa szerint előállított 500 mg (0,38 mM) lizo-GM_ret feloldunk 1 cm³ dimetil-formamidban, és szobahőmérsékleten hozzáadunk 1,050 cm³ (7,6 mM) trietil-amint és 0,728 cm³ (7,6 mM) ciklobután-karbonil-kloridot.

A kondenzációs reakció szobahőmérsékleten 4 óra alatt lejátszódik. A reakció végén az oldatot 10 cm³, vízzel telített etil-acetátban kicsapjuk. A leszűrt csapadékot vákuumban megszárítjuk. A terméket szilikagélkromatográfiával tisztítjuk, eluensként kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel.

A tiszta frakciókat összegyűjtjük, bepároljuk, IN Na₂CO₃-tal kezeljük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, 5 cm³-re betöményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

350 mg terméket kapunk (az elméleti 66%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf=O,33 (RfGMi =0,43; Rí^o-gmi = 0,24).

4. példa

N-(2-Norbornán-acetil)-N-lizo-GM₁ előállítása

A 2. példa szerint előállított 500 mg (0,38 mM) lizo-GM_ret feloldunk 2,5 cm³ dimetil-formamidban, és 0 °C-on hozzáadunk 0,106 cm³ (0,76 mM) trietilamint és frissen készült norbornán-ecetsav-anhidridet, amelyet úgy állítunk elő, hogy 1,1 cm³ (7,6 mM) 2norbornán-ecetsavat reagáltatunk 20 cm³ tetrahidro-furánban oldott 939 mg (9,12 mM) diciklohexil-karbodiimiddel, majd 2 órával később a képződött diciklohexil-karbamidot kiszűrjük.

A kondenzációs reakciót 0 °C-on, keverés közben, 18 óráig végezzük. A reakció végén az oldatot 1 cm³-re töményítjük, 10 cm³ acetonban kicsapjuk, majd vákuumban szárítjuk.

A terméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú elegyével futtatva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk.

A tiszta frakciókat összegyűjtjük, bepároljuk, IN Na₂CO₃-tal kezeljük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, 5 cm³-re töményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

508 mg terméket kapunk (az eméleti 92%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,33 (RfoMi ~ 0,43; R^zo-gmi ⁼ 0,24).

5. példa

N-(Fenil-acetil)-N-lizo-GM_} előállítása

A 2. példa szerint előállított 500 mg (0,38 mM) lizo-GM_ret feloldunk 2,5 cm³ dimetil-formamidban, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 0,528 cm³ (7,6 mM) trietil-amint, 260 mg (1,9 mM) fenil-ecetsavat és 194,2 mg (0,76 mM) 1 -metil-2-klór-piridíniumjodidot, utóbbit 2,5 cm³ dimetil-formamidban oldva.

Az elegyet szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ acetonban kicsapjuk. A szüredéket megszárítjuk, és kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eluenssel szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, IN

Na₂CO₃-tal kezeljük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, 5 cm³-re betöményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

HU 210 744 Β

354 mg terméket kapunk (az elméleti 65%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel eluálva a szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,37 (Rf_GMi = 0,43; Rf_Uz0._GMi = 0,24), 254 nm-nél végzett fluorimetriás leolvasással.

6. példa

N-^ó-Dimetoxt-benzoilpN-lizo-Ghf előállítása

A 2. példa szerint előállított 500 mg (0,38 mM) lizo-GM_ret feloldunk 1 cm³ dimetil-formamidban, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 1,056 cm³ (7,6 mM) trietil-amint és frissen készült dimetoxi-benzoesav-anhidridet, amelyet úgy állítunk elő, hogy 2,76 g (15,2 mM) 2,6-dimetoxi-benzoesavat reagáltatunk 1,08 g (3,8 mM) l-metil-2-fluor-piridínium-p-toluol-szulfonáttal 10 cm³ 1:1 arányú dimetil-formamid/tetrahidro-furán keverékben.

A kondenzációs reakciót keverés közben, szobahőmérsékleten 4 óra alatt játszatjuk le. A reakció végén az oldatot betöményítjük 5 cm₃-re, 50 cm³ acetonban kicsapjuk, szűrjük, és a csapadékot vákuumban megszárítjuk. Kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiának vetjük alá. A tisztított frakciókat egyesítjük, bepároljuk, IN Na₂CO₃-tal kezeljük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, 5 cm³-re betöményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

506 mg terméket kapunk (az elméleti 90%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,35 (Rf_GM] = 0,43; Rí^-gmi = 0,24), 254 nm-en végzett fluorimetriás leolvasással.

7. példa

N-(2-Furoil)-N-lizo-GM_} előállítása

A 2. példa szerint előállított 500 mg (0,38 mM) lizoGMj-et feloldjuk 2,5 cm³ dimetil-formamidban, majd hozzáadunk szobahőmérsékleten 0,528 cm³ (3,8 mM) trietil-amint, 210 mg (1,9 mM) 2-furán-karbonsavat és

194,2 mg (0,76 mM) l-metil-2-klór-piridínium-jodidot, utóbbit 2,5 cm³ dimetil-formamidban oldva.

Az elegyet szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 10 cm³ acetonban kicsapjuk. A csapadékot szűrjük és szárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk. A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, IN Na₂CO₃-tal kezeljük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, 5 cm³-re betöményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

402 mg terméket kapunk (az elméleti 75%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,37 (RígMi = 0,43; Rfii_Z0._GM! = 0,24), fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

8. példa

N-íd-Imidazol-acetilfN-lizo-GM^ előállítása

A 2. példa szerint előállított lizo-GMj-ből 500 mgot (0,38 mM) feloldunk 2,5 cm³ dimetil-formamidban, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 1,056 cm³ (7,6 mM) trietil-amint, 310 mg (1,9 mM) 4-imidazolecetsav-hidrokloridot és 194,2 mg (0,76 mM) 1-metil2-klór-piridínium-jodidot, ez utóbbit 2,5 cm³ dimetilformamidban oldva. A reakciót szobahőmérsékleten 18 óra alatt játszatjuk le. Az elegyet 100 cm³ acetonban kicsapjuk, szűrjük, szárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 eleggyel eluálva, szilikagélkromatográfiával tisztítjuk. A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, IN Na₂CO₃-tal kezeljük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, 5 cm³-re betöményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

352 mg terméket kapunk (az elméleti 65%-a).

Kloroform/metanol/0,3-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,33 (Rí_Gmi = 0,43; RÍh^-gmi = 0,24).

9. példa

N-(l-Metil-prolil)-N-lizo-GM_} előállítása

A 2. példa szerint előállított lizo-GMj-ből 500 mgot (0,38 mM) feloldunk 3,5 cm³ 2,5:1 arányú dimetilformamid/víz elegyben, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 1,056 cm³ (7,6 mM) trietil-amint, 260 mg (1,9 mM) N-metil-L-prolint és 2,5 cm³ dimetil-formamidban oldott 194,2 mg (0,76 mM) l-metil-2-klór-piridínium-jodidot. Az elegyet szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ acetonban kicsapjuk, szűrjük és szárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiával tisztítjuk. A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, IN Na₂CO₃-tal kezeljük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, 5 cm³-re töményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

380 mg terméket kapunk (az elméleti 70%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,33 (Rf_GMi = 0,43; Rfn_Z0__GMi = 0,24).

10. példa

N-( 1 -Metil-2-pirrol-karbonil )-N-lizo-GM_} előállítása

A 2. példa szerint előállított lizo-GMj-ből 500 mg-ot (0,38 mM) feloldunk 2,5 cm³ dimetil-formamidban, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 0,528 cm³ (7,6 mM) trietil-amint, 220 mg (1,9 mM) l-metil-2-pirrol-karbonsavat és 2,5 cm³ dimetil-formamidban oldott 194,2 mg (0,76 mM) l-metil-2klór-piridínium-jodidot.

Az elegyet szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ acetonban kicsapjuk. A reakcióelegyet szüljük, a szüredéket szárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk. A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, IN Na₂CO₃-tal kezeljük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, 5 cm³-re betöményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

487 mg terméket kapunk (az elméleti 90%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,38 (Rf_GM, = 0,43; RÍu_Z0._Gmi = 0,24) fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

HU 210 744 B

77. példa

N-( 1 -Tetrazol-acetil)-N-lizo-GM_} előállítása

A 2. példa szerint előállított lizo-GM_rből 500 mg-ot (0,38 mM) feloldunk 2,5 cm³ dimetil-formamidban, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 0,528 cm³ (7,6 mM) trietil-amint, 250 mg (1,9 mM) 1-tetrazol-ecetsavat és 2,5 cm³ dimetil-formamidban oldott 194,2 mg (0,76 mM) l-metil-2-klór-piridínium-jodidot.

Az elegyet szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ acetonban kicsapjuk. A csapadékot szűrjük és szárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk. A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, IN Na₂CO₃-tal kezeljük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, 5 cm³-re betöményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

472 mg terméket kapunk (az elméleti 87%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,32 (Rf_GM] = 0,43; Rf_Uz0._GM1 = 0-24).

72. példa

N-(2-Tiofén-acetil)-N-lizo-GM_} előállítása

A 2. példa szerint előállított lizo-GM_rből 500 mgot (0,38 mM) feloldunk 2,5 cm³ dimetil-formamidban, majd szobahőmérsékleten 0,528 cm³ (7,6 mM) trietilamint, 270 mg (1,9 mM) 2-tiofén-ecetsavat és 2,5 cm³ dimetil-formamidban oldva 194,2 mg (0,76 mM) 1metil-2-klór-piridínium-jodidot adunk hozzá.

Az elegyet szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ acetonban kicsapjuk, szűrjük, szántjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk. A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, IN Na₂CO₃-tal kezeljük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, 5 cm³-re betöményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

383 mg terméket kapunk (az elméleti 70%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,34 (Rf_GM1 = 0,43; Rfi_izo._GM1 = 0,24), fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

73. példa

N-(6-Metil-mkotinoil)-N-lizo-GM_i előállítása

A 2. példa szerint előállított lizo-GMj-ből 500 mg-ot (0,38 mM) feloldunk 2,5 cm³ dimetil-formamidban, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 0,528 cm³ (7,6 mM) trietil-amint, 260 mg (1,9 mM) 6-metil-nikotinsavat és 2,5 cm³ dimetil-formamidban oldott 194,2 mg (0,76 mM) l-metil-2-klór-piridínium-jodidot.

Az elegyet szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ acetonban kicsapjuk. Szűrés és mosás után a terméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, IN Na₂CO₃-tal kezeljük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, 5 cm³-re betöményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

218 mg terméket kapunk (az elméleti 40%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,38 (Rf_GM] = 0,43; Rfii₂₀-GMi = 0,24), fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

14. példa

N-(2-Piridil-acetil)-N-lizo-GMi előállítása

A 2. példa szerint előállított lizo-GMj-ből 500 mgot (0,38 mM) feloldunk 3,5 cm³ 2,5:1 arányú dimetilformamid/víz elegyben, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 1,056 cm³ (7,6 mM) trietil-amint, 330 mg (1,9 mM) 2-piridil-ecetsav-hidrokloridot és 2,5 cm³ dimetil-formamidban oldott 194,2 mg (0,76 mM) 1-metil-2-klór-piridínium-j odidot.

Szobahőmérsékleten reagáltatjuk 18 órát, majd 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűijük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiával tisztítjuk. A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, IN Na₂CO₃-tal kezeljük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, 5 cm³-re betöményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

327 mg terméket kapunk (az elméleti 60%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,35 (Rí_Gmi = 0,43; Rfu_Z0.GMi = 0,24), fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

75. példa

N-(4-Piridil-tioacetil)-N-lizo-GMi előállítása

A 2. példa szerint előállított lizo-GM_rből 500 mg-ot (0,38 mM) feloldunk 2,5 cm³ dimetil-formamidban, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 0,528 cm³ (7,6 mM) trietil-amint, 320 mg (1,9 mM) 4-piridil-tioecetsavat és 2,5 cm³ dimetil-formamidban oldott

194,2 mg (0,76 mM) l-metil-2-klór-piridínium-jodidot.

Szobahőmérsékleten reagáltatjuk 18 órát, majd 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűijük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiával tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, IN Na₂CO₃-tal kezeljük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, 5 cm³-re betöményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

390 mg terméket kapunk (az elméleti 70%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,34 (Rf_GM1 - 0,43; Rfij_Z0_GMi = 0,24), fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

76. példa

N-(3-Kinolin-karbonil)-N-lizo-GM\ előállítása

A 2. példa szerint előállított lizo-GMj-ből 500 mg-ot (0,38 mM) feloldunk 2,5 cm³ dimetil-formamidban, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 0,528 cm³ (7,6 mM) trietil-amint, 330 mg (1,9 mM) 3-kinolin-karbonsavat és 2,5 cm³ dimetil-formamidban oldott

194,2 mg (0,76 mM) l-metil-2-klór-piridínium-jodidot.

Az elegyet szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiával tisztítjuk.

HU 210 744 Β

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, IN Na₂CO₃tal kezeljük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, 5 cm³-re betöményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

358 mg terméket kapunk (az elméleti 64%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,35 (Rf_GM, = 0,43; Rf,_iz0._GMi = 0,24), fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

17. példa

N-(7-Teofillin-acetil)-N-lizo-GM] előállítása

A 2. példa szerint előállított lizo-GM,-ből 500 mg-ot (0,38 mM) feloldunk 2,5 cm³ dimetil-formamidban, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 0,528 cm³ (7,6 mM) trietil-amint, 460 mg (1,9 mM) 7-teofillinecetsavat és 2,5 cm³ dimetil-formamidban oldott

194,2 mg (0,76 mM) l-metil-2-klór-piridínium-jodidot.

Szobahőmérsékleten reagáltatjuk 18 órát, majd 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiával tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, IN Na₂CO₃-tal kezeljük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, 5 cm³-re betöményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

397 mg terméket kapunk (az elméleti 68%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf=0,35 (Rf_GM1 = 0,43; Rf_Uz0._GM] = 0,24), fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

18. példa

N-2,6-Dimetoxi-benzoil-di(lizo-GMf) előállítása

A 1. példa szerint előállított di(lizo-GM])-ből 500 mg-ot (0,39 mM) feloldunk 5 cm³ dimetil-formamidban, és ehhez az oldathoz lassan hozzáadunk 145 mg (0,43 mM) 9-(fluorenil-metil)-oxi-karbonil-Nhidroxi-szukcinimidet (FMOC-succ), majd szobahőmérsékleten 1 órát reagáltatjuk.

A reakció végén 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:30:6 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk. A reakció köztitermékét, az N-FMOC-di(lizo-GMj)-et tartalmazó frakciókat egyesítjük, megszárítjuk, majd ismét feloldjuk 2,5 cm³ 1:1 arányú dimetil-formamid/metanol elegyben. 0 °C-on hozzáadunk 1,1 cm³ (7,92 mM) trietil-amint és 0,40 cm³ (3,96 mM) metil-trifluor-acetátot. Szobahőmérsékleten 3 napig reagáltatjuk.

Az így kapott reakcióelegyhez hozzáadunk 1 cm³ piperidint a fluorenil-csoport eltávolítása céljából. Ezt a reakciót szobahőmérsékleten játszatjuk le, 18 óra alatt, majd a terméket 100 cm³ 9:1 arányú aceton/víz elegyben kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk. Ezt a köztiterméket feloldjuk 2,5 cm³ 1:1 arányú dimetil-formamid/metanol elegyben, és hozzáadunk frissen készült dimetoxi-benzoesav-anhidridet, amelyet úgy állítunk elő, hogy 1,88 g (7,6 mM) 2,6-dimetoxi-benzoesavat és 5 cm³1:1 arányú dimetil-formamid/tetrahidrofurán elegyben oldott 5,40 mg (1,9 mM) fluor-metil-piridínium-p-toluol-szulfonátot reagáltatunk egymással. Ezt az elegyet szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, 100 cm³ acetonban kicsapjuk, 5 cm³ vízzel felvesszük, pH-ját 0,01N NaOH-dal 9,0-ra állítjuk be, a trifluor-acetil csoport eltávolítása érdekében 2 órát szobahőmérsékleten reagáltatjuk, dializáljuk, 3 cm³-re betöményítjük, és 15 cm³ acetonban kicsapjuk.

Az így kapott nyers terméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiával tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, 2 cm³ 1:1 arányú kloroform/metanol elegyben újra feloldjuk, és 10 cm³ acetonban kicsapjuk.

283 mg terméket kapunk (az elméleti 51 %-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,18, a folt ninhidrin-rápermetezésre pozitív. Fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

19. példa

N-2-Pirídil-acetil-di(lizo-GMy) előállítása

A 1. példa szerint előállított diQizo-GM^-ből 500 mg-ot (0,39 mM) feloldunk 5 cm³ dimetil-formamidban, majd ehhez az oldathoz lassan hozzáadunk 145 mg (0,43 mM) 9-(fluorenil-metil)-oxi-karbonil-Nhidroxi-szukcinimidet (FMOC-succ), majd szobahőmérsékleten 1 órát reagáltatjuk.

A reakció befejezése után 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:30:6 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk. Az N-FMOC-di(lizo-GM]) köztiterméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, megszárítjuk, majd újra feloldjuk 2,5 cm³ 1:1 arányú dimetil-formamid/metanol elegyben. Az oldathoz 0 °C-on hozzáadunk 1,1 cm³ (7,92 mM) trietil-amint és 0,40 cm³ (3,96 mM) metil-trifluor-acetátot, és szobahőmérsékleten reagáltatjuk 3 napig.

A fluorenil-csoport eltávolítása céljából ekkor hozzáadunk 1 cm³ piperidint, szobahőmérsékleten reagáltatjuk 18 órát, majd 100 cm³ 9:1 arányú aceton/víz elegyben kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk.

Ezt a köztiterméket feloldjuk 2,5 cm³ 1:1 arányú dimetil-formamid/metanol elegyben, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 1,056 cm³ (7,6 mM) trietilamint, 330 mg (1,9 mM) 2-piridil-ecetsav-hidrokloridot és 194,2 mg (0,76 mM) klór-metil-piridínium-jodidot, ez utóbbit 2,5 cm³ dimetil-formamidban oldva.

A rendszert szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 50 cm³ acetonban kicsapjuk, a csapadékot feloldjuk 5 cm³ vízben, és pH-ját 0,01N NaOH-dal 9,0-re állítjuk be. A trifluor-acetil csoport eltávolítása céljából az oldatot szobahőmérsékleten 2 órát reagáltatjuk, majd dializáljuk, 3 cm³-re betöményítjük, és 15 cm³ acetonban kicsapjuk.

Az így kapott nyersterméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, újra feloldjuk 2 cm³ 1:1 arányú kloroform/metanol elegyben, és 10 cm³ acetonban kicsapjuk.

HU 210 744 B

296 mg terméket kapunk (az elméleti 55%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,19. A ninhidrin-pozitív folt fluoreszcenciáját 254 nm-en olvassuk le.

20. példa

N,N'-Di(cikloheptán-karbonil)-di(lizo-GM]) előállítása

A 1. példa szerint előállított diflizo-GMjj-ből 500 mg-ot (0,39 mM) feloldunk 2,5 cm³ dimetil-formamidban, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 0,33 cm³ (2,37 mM) trietil-amint, 0,162 cm³ (1,18 mM) cikloheptán-karbonsavat és 0,2 g (0,79 mM) klór-metil-piridínium-jodidot, ez utóbbit

2,5 cm³ dimetil-formamidban oldva.

Szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:25:4 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiával tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, IN Na₂CO₃-tal kezeljük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, 5 cm³-re betöményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

407 mg terméket kapunk (az elméleti 68%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 60:35:8 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,32.

27. példa

N,N'-Di( ciklopentán-karbonil )-di( lizo-GMj) előállítása

A 1. példa szerint előállított di(lizo-GM,)-ből 500 mg-ot (0,39 mM) feloldunk 2,5 cm³ dimetil-formamidban, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 0,33 cm³ (2,37 mM) trietil-amint, 0,123 cm³ (1,18 mM) ciklopentán-karbonsavat és 0,2 g (0,79 mM) klór-metil-piridínium jodidot, ez utóbbit

2,5 cm³ dimetil-formamidban oldva.

Az elegyet szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ acetonban kicsapjuk. A csapadékot leszűrjük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:25:4 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiával tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, IN Na₂CO₃tal kezeljük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, 5 cm³-re betöményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

277 mg terméket kapunk (az elméleti 48%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 60:35:8 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,30.

22. példa

N,N'-Di(feml-acetil)-di(lizo-GM_}) előállítása

A 1. példa szerint előállított diílizo-GM^-ből 500 mg-ot (0,39 mM) feloldunk 2,5 cm³ dimetil-formamidban, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 0,88 cm³ (6,34 mM) trietil-amint, 430 mg (3,17 mM) fenil-ecetsavat és 2,5 cm³ dimetil-formamidban oldott 0,2 g (0,79 mM) klór-metil-piridínium-jodidot.

Szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:25:4 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiával tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, IN Na₂CO₃-tal kezeljük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, 5 cm³-re betöményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

564 mg terméket kapunk (az elméleti 95%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 60:35:8 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,32, fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

23. példa

N,N'-Di(5-metoxi-]-indanon-3-acetil)-di( lizoGM\) előállítása

A 1. példa szerint előállított di(lizo-GM,)-ből 500 mg-ot (0,39 mM) feloldunk 2,5 cm³ dimetil-formamidban, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 0,88 cm³ (6,34 mM) trietil-amint 700 mg (3,17 mM) 5-metoxi-l-indanon-3-ecetsavat és 2,5 cm³ dimetilformamidban oldott 0,2 g (0,79 mM) klór-metil-piridínium-jodidot.

Szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:25:4 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiával tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, IN Na₂CO₃-t felvesszük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, 5 cm³-re betöményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

601 mg terméket kapunk (az elméleti 91%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 60:35:8 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,33, fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

24. példa

N,N'-Di(2-piridil-acetil)-di(hzo-GM_}) előállítása

A 1. példa szerint előállított di(lizo-GM,)-ből 500 mg-ot (0,39 mM) feloldunk 2,5 cm³ dimetil-formamidban, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 0,88 cm³ (6,34 mM) trietil-amint, 550 mg (3,17 mM) 2-piridil-ecetsavat és 2,5 cm³ dimetil-formamidban oldott 0,2 g (0,79 mM) klór-metil-piridínium-jodidot.

Szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűtjük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:25:4 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiával tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, IN Na₂CO₃-tal kezeljük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, 5 cm³-re betöményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

268 mg terméket kapunk (az elméleti 43%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 60:35:8 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf - 0,23, fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

HU 210 744 B

25. példa

N,N'-Di( 5-metil-2-tiofén-karbonil)-di( lizo-GMf előállítása

A 1. példa szerint előállított di(lizo-GM 0-ből 500 mg-ot (0,39 mM) feloldunk 2,5 cm³ dimetil-formamidban, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 0,88 cm³ (6,43 mM) trietil-amint, 450 mg (3,17 mM) 5-metil-2-tiofén-karbonsavat és 2,5 cm³ dimetil-formamidban oldott 0,2 g (0,79 mM) klór-metil-piridíniumjodidot.

Szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:25:4 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiával tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, IN Na₂CO₃-tal kezeljük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, 5 cm³-re betöményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

509 mg terméket kapunk (az elméleti 85%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 60:35:8 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = O,33 fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

26. példa

N-Acetil-N'-2-piridil-acetil-di(lizo-GM_i) előállítása

A 1. példa szerint előállított di(lizo-GMj)-ből 500 mg-ot (0,39 mM) feloldunk 5 cm³ dimetil-formamidban, majd ehhez az oldathoz lassan hozzáadunk 145 mg (0,43 mM) 9-(fluorenil-metil)-oxi-karbonil-Nhidroxi-szukcinimidet (FMOC-succ), majd szobahőmérsékleten 1 órát reagáltatjuk.

A reakció végén 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:30:6 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk. Az N-FMOC-di(lizo-GM]) köztiterméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, megszárítjuk, és újra feloldjuk 2,5 cm³ 1:1 arányú dimetilformamid/metanol elegyben, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 1,056 cm³ (7,6 mM) trietil-amint, 330 mg (1,9 mM) 2-piridil-ecetsav-hidrokloridot és

2,5 cm³ dimetil-formamidban oldott 194,2 mg (0,76 mM) klór-metil-piridínium-jodidot. Az elegyet szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk.

Ehhez az elegyhez hozzáadunk 1 cm³ piperidint a fluorenil csoport eltávolítása céljából. Szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk.

A köztiterméket feloldjuk 30 cm³ 1:1:0,1 arányú kloroform/metanol/víz elegyben, majd hozzáadunk

1,1 cm³ (7,92 mM) trietil-amint és 0,373 cm³ (3,96 mM) ecetsav-anhidridet. Szobahőmérsékleten 2 órát reagáltatjuk, megszárítjuk, 5 cm³ 1M Na₂CO₃-tal kezeljük, és 60 °C-on 1 órát állni hagyjuk. Dializáljuk, betöményítjük 5 cm³-re, és 5-szörös térfogatnyi acetonban kicsapjuk.

A nyersterméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, újra feloldjuk 2,0 cm³ 1:1 arányú kloroform/metanol elegyben, és 10 cm³ acetonban kicsapjuk.

299 mg terméket kapunk (az elméleti 54%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,37, fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

27. példa

N-Acetil-N'-(3,4,5-trÍmetoxi-benzoil)-di(lizo-GM_}) előállítása

A 1. példa szerint előállított di(lizo-GM 0-ből 500 mg-ot (0,39 mM) feloldunk 5 cm³ dimetil-formamidban, majd ehhez az oldathoz lassan hozzáadunk 145 mg (0,43 mM) 9-(fluorenil-metil)-oxi-karbonil-Nhidroxi-szukcinimidet (FMOC-succ). Szobahőmérsékleten 1 órát reagáltatjuk. A reakció végén 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűtjük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:30:6 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk. Az N-FMOC-di(lizoGM0 köztiterméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, megszárítjuk, majd újra feloldjuk 2,5 cm³ 1:1 arányú dimetil-formamid/metanol elegyben. Ehhez az oldathoz frissen készült trimetoxi-benzoesav-anhidridet adunk 20 cm³ tetrahidro-furánban oldva. Az anhidridet úgy állítjuk elő, hogy 0,3 g (1,9 mM) diciklohexil-karbodiimidet és 20 cm³ tetrahidro-furánban oldott 0,3 g (1,4 mM) trimetoxi-benzoesavat reagáltatunk, majd 2 órával később a képződött diciklohexil-karbamidot kiszűrjük.

A kondenzációs reakciót keverés közben, 25 °C-on, 18 órát végezzük.

Ekkor a reakcióelegyhez hozzáadunk 1 cm³ piperidint a fluorenil-csoport eltávolítása céljából. Szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ 9:1 arányú aceton/víz elegyben kicsapjuk, leszűtjük és megszárítjuk,

A köztiterméket feloldjuk kloroform/metanol/víz 1:1:00 arányú elegyében, majd hozzáadunk 1,1 cm³ (7,92 mM) trietil-amint és 0,373 cm³ (3,96 mM) ecetsav-anhidridet. Szobahőmérsékleten 2 órát reagáltatjuk, megszárítjuk, 5 cm³ 1M Na₂CO₃-tal kezeljük, és 1 órát 60 °C-on állni hagyjuk. Dializáljuk, betöményítjük 5 cm³-re, és 5-szörös térfogatnyi acetonban kicsapjuk.

A nyersterméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, újra feloldjuk 2,0 cm³ 1:1 arányú kloroform/metanol elegyben, és 10 cm³ acetonban kicsapjuk.

286 mg terméket kapunk (az elméleti 49%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,39, fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

28. példa

N-(Diklór-acetil )-N'-( 2-piridil-acetil )-di( lizo-GM_l) előállítása

A 1. példa szerint előállított di(lizo-GM 0-ből

500 mg-ot (0,39 mM) feloldunk 5 cm³ dimetil-forma16

HU 210 744 Β midban, majd ehhez az oldathoz lassan hozzáadunk 145 mg (0,43 mM) 9-(fluorenil-metiI)-oxi-karbonil-Nhidroxi-szukcinimidet (FMOC-succ). Szobahőmérsékleten 1 órát reagáltatjuk.

A reakció végén 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:30:6 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk. Az N-FMOC-di(lizo-GM]) köztiterméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, megszárítjuk, majd újra feloldjuk 2,5 cm³1:1 arányú dimetil-formamid/metanol elegyben, és hozzáadunk szobahőmérsékleten 1,056 cm³ (7,6 mM) trietil-amint, 330 mg (1,9 mM) 2-piridil-ecetsav-hidrokloridot és

2,5 cm³ dimetil-formamidban feloldott 194,2 g (0,76 mM) klór-metil-piridínium-jodidot. Szobahőmérsékleten 18 napig reagáltatjuk.

Ekkor a reakcióelegyhez hozzáadunk 1 cm³ piperidint a fluorenil-csoport eltávolítása céljából. Szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ 9:1 arányú aceton/víz elegyben kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk.

A köztiterméket feloldjuk 30 cm³ 1:1:0,1 arányú kloroform/metanol/víz elegyében, majd hozzáadunk

1,1 cm³ (7,92 mM) trietil-amint és 950 mg (3,96 mM) diklór-ecetsav-anhidridet. Szobahőmérsékleten 2 órát reagáltatjuk, megszárítjuk, 5 cm³ 1M Na₂CO₃-tal kezeljük, és 1 órát 60 °C-on állni hagyjuk. Dializáljuk, betöményítjük 5 cm³-re, és 5-szörös térfogatnyi acetonban kicsapjuk.

A reakcióterméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, újra feloldjuk 2,0 cm³ 1:1 arányú kloroform/metanol elegyben, végül 10 cm³ acetonban kicsapjuk.

267 mg terméket kapunk (az elméleti 46%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilíkagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,40, fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

29. példa

N-(Diklór-acetil )-N'-(3,4,5-trimetoxi-benzoil)di(lizo-GM\) előállítása

A 1, példa szerint előállított di(lizo-GM])-ből 500 mg-ot (0,39 mM) feloldunk 5 cm³ dimetil-formamidban, majd ehhez az oldathoz lassan hozzáadunk 145 mg (0,43 mM) 9-(fluorenil-metil)-oxi-karbonil-Nhidroxi-szukcinimidet (FMOC-succ), és szobahőmérsékleten 1 órát reagáltatjuk.

A reakció végén a kapott elegyet 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:30:6 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk.

Az N-FMOC-di/lizo-GM]) köztiterméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, megszárítjuk, majd újra feloldjuk 2,5 cm³ 1:1 arányú dimetil-formamid/metanol elegyben, és hozzáadunk 10 cm³ tetrahidro-furánban feloldott, frissen készült trimetoxi-benzoesav-anhidridet, amelyet úgy állítunk elő, hogy 0,3 g (1,9 mM) diciklohexil-karbodiimidet és 0,3 g (1,4 mM) trimetoxi-benzoesavat 10 cm³ tetrahidro-furánban reagáltatunk, majd 2 órával később a képződött diciklohexilkarbamidot kiszűrjük.

A kondenzációs reakciót keverés közben, 25 °C-on, 18 órát végezzük.

Ekkor a fluorenil-csoport eltávolítása céljából hozzáadunk 1 cm³ piperidint, és az elegyet szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, végül 100 cm³ 9:1 arányú aceton/víz elegyben kicsapjuk, leszűqük és megszárítjuk. Ezt a köztiterméket feloldjuk 30 cm³ 1:1:0,1 arányú kloroform/metanol/víz elegyében, majd hozzáadunk 1,1 cm³ (7,92 mM) trietil-amint és 950 mg (3,96 mM) diklór-ecetsav-anhidridet. Szobahőmérsékleten 2 órát reagáltatjuk, megszárítjuk, 5 cm³ 1M Na₂CO₃-tal kezeljük, és 1 órát 60 °C-on állni hagyjuk. Dializáljuk, betöményítjük 5 cm³-re, és 5-szörös térfogatnyi acetonban kicsapjuk.

A nyersterméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, újra feloldjuk 2,0 cm³ 1:1 arányú kloroform/metanol elegyben, végül 10 cm³ acetonban kicsapjuk.

293 mg terméket kapunk (az elméleti 48%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilíkagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,41, fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

30. példa

N-(2-Furoil)-N'-butiril-di(lizo-GMfl) előállítása

A 1. példa szerint előállított diflizo-GM^-ből 500 mg-ot (0,39 mM) feloldunk 5 cm³ dimetil-formamidban, majd ehhez az oldathoz lassan hozzáadunk 145 mg (0,43 mM) 9-(fluorenil-metil)-oxi-karbonil-Nhidroxi-szukcinimidet (FMOC-succ). Szobahőmérsékleten 1 órát reagáltatjuk.

A reakció végén 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:30:6 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk. Az N-FMOC-di(lizo-GM]) köztiterméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, megszárítjuk, majd ismét feloldjuk 2,5 cm³ 1:1 arányú dimetil-formamid/metanol elegyben. Az oldathoz 0 °Con hozzáadunk 1,1 cm³ (7,92 mM) trietil-amint és 626 mg (3,96 mM) vajsav-anhidridet. Szobahőmérsékleten 2 órát reagáltatjuk. A reakcióelegyhez 1 cm³ piperidint adunk a fluorenil-csoport eltávolítása céljából. A reakciót szobahőmérsékleten 18 óráig folytatjuk, 100 cm³ 9:1 arányú aceton/víz elegyben végzett kicsapás után leszűrjük és megszárítjuk.

A köztiterméket feloldjuk 2,5 cm³ dimetil-formamidban, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 0,528 cm³ (3,8 mM) trietil-amint, 210 mg (1,9 mM) 2-furán-karbonsavat és 2,5 cm³ dimetil-formamidban oldva

194,2 mg (0,76 mM) klór-metil-piridínium-jodidot.

Szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűijük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiával tisztítjuk.

HU 210 744 B

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, újra feloldjuk 2,0 cm³ 1:1 arányú kloroform/metanol elegyben, végül 10 cm³ acetonban kicsapjuk.

289 mg terméket kapunk (az elméleti 52%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,39, fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

31. példa

N-(2,6-Dimetoxi-benzoil)-N'-butiril-di( lizo-GMf előállítása

A 1. példa szerint előállított di(lizo-GM])-ből 500 mg-ot (0,39 mM) feloldunk 5 cm³ dimetil-formamidban, majd ehhez az oldathoz lassan hozzáadunk 145 mg (0,43 mM) 9-(fluorenil-metil)-oxi-karbonil-Nhidroxi-szukcinimidet (FMOC-succ). Szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk.

A reakció végén 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:30:6 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk. Az N-FMOC-di(lizo-GM]) köztiterméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, megszárítjuk, majd ismét feloldjuk 2,5 cm³ 1:1 arányú dimetil-formamid/metanol elegyben. 0 ’C-on hozzáadunk 1,1 cm³ (7,92 mM) trietil-amint és 626 mg (3,96 mM) vajsav-anhidridet, és szobahőmérsékleten 2 órát reagáltatjuk.

A fluorenil-csoport eltávolítása céljából a reakcióelegyhez hozzáadunk 1 cm³ piperidint. Szobahőmérsékleten reagáltatjuk 18 órát, majd 100 cm³ 9:1 arányú aceton/víz elegyben kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk.

A köztiterméket feloldjuk 1 cm³ dimetil-formamidban, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 1,056 cm³ (7,6 mM) trietil-amint és frissen készített 2,6-dimetoxibenzoesav-anhidridet, amelyet úgy állítunk elő, hogy 2,76 g (15,2 mM) 2,6-dimetoxi-benzoesavat és 1,08 g (3,8 mM) fluor-metil-piridínium-p-toluol-szulfonátot 10 cm³ 1:1 arányú dimetil-formamid/tetrahidro-furán elegyben. A kondenzációs reakciót keverés közben, szobahőmérsékleten, 4 óra alatt hajtjuk végre. A reakció végén az oldatot 5 cm³-re betöményítjük, 50 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűijük, és vákuumban megszárítjuk.

297 mg terméket kapunk (az elméleti 51 %-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,37, fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

32. példa

N-(2-Piridil-acetil)-N'-lauroil-di(lizcj-GM_l) előállítása

A 1. példa szerint előállított di(lizo-GM 0-ből 500 mg-ot feloldunk 5 cm³ dimetil-formamidban, majd ehhez az oldathoz lassan hozzáadunk 145 mg (0,43 mM) 9-(fluorenil-metil)-oxi-karbonil-N-hidroxiszukcinimidet (FMOC-succ). Szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk.

A reakció végén 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:30:6 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk. Az N-FMOC-di(lizo-GMj) köztiterméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, megszárítjuk, majd újra feloldjuk 2,5 cm³1:1 arányú dimetil-formamid/metanol elegyben. 0 ’C-on hozzáadunk

1,1 cm³ (7,92 mM) trietil-amint és 1,51 g (3,96 mM) laurilsav-anhidridet, és szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk. A fluorenil-csoport eltávolítása céljából a reakcióelegyhez hozzáadunk 1 cm³ piperidint, és szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd a 100 cm³ 9:1 arányú aceton/víz elegyben kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk.

A köztiterméket feloldjuk 2,5 cm³1:1 arányú dimetil-formamid/metanol elegyben, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 1,056 cm³ (7,6 mM) trietil-amint, 330 mg (1,9 mM) 2-piridil-ecetsav-hidrokloridot és

2,5 cm³ dimetil-formamidban oldott 194,2 mg (0,76 mM) klór-metil-piridínium-jodidot. Szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ acetonban kicsapjuk.

A nyersterméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, újra feloldjuk 2,0 cm³ 1:1 arányú kloroform/metanol elegyben, végül 10 cm³ acetonban kicsapjuk.

262 mg terméket kapunk (az elméleti 43%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,61 fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

33. példa

N-(3,4,5-Trimetoxi-benzoil)-N'-lauroil-di(lizoGM] ) előállítása

A 1. példa szerint előállított di(lizo-GM])-ből 500 mg-ot (0,39 mM) feloldunk 5 cm³ dimetil-formamidban, majd lassan hozzáadunk 145 mg (0,43 mM) 9-(fluorenil-metil)-oxi-karbonil-N-hidroxi-szukcinimidet (FMOC-succ). Szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk. A reakció végén 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:30:6 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk. Az N-FMOC-di(lizo-GM0 köztiterméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, megszárítjuk, majd újra feloldjuk 2,5 cm³ 1:1 arányú dimetil-formamid/metanol elegyben. 0 ’C-on hozzáadunk

1,1 cm³ (7,92 mM) trietil-amint és 1,51 g (3,96 mM) laurilsav-anhidridet. Szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk.

A fluorenil-csoport eltávolítása céljából az elegyhez hozzáadunk 1 cm³ piperidint, és szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ 9:1 arányú aceton/víz elegyben kicsapjuk, leszűijük és megszárítjuk.

A köztiterméket feloldjuk 2,5 cm³1:1 arányú dimetilformamid/metanol elegyben, és ehhez az oldathoz hozzáadunk 10 cm³ tetrahidro-furánban oldott, frissen készített trimetoxi-benzoesav-anhidridet, amelyet úgy állítunk elő, hogy 0,3 g (1,9 mM) diciklohexil-karbodiimidet és 0,3 g (1,4 mM) trimetoxi-benzoesavat 10 cm³ tetrahidro18

HU 210 744 B furánban reagáltatunk, majd 2 órával később a keletkezett diciklohexil-karbamidot kiszűrjük.

A kondenzációs reakciót keverés közben, 25 °C-on, 18 óráig végezzük, majd a terméket 100 cm³ acetonban kicsapjuk.

A nyersterméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiával tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, újra feloldjuk 2,0 cm³ 1:1 arányú kloroform/metanol elegyben, és 10 cm³ acetonban kicsapjuk.

294 mg terméket kapunk (az elméleti 46%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,63, fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

34. példa

N-(3,4,5-Trimetoxi-benzoil)-N'-(2-piridil-acetil)di(lizo-GM\) előállítása

A 1. példa szerint előállított di(lizo-GM,)-ből 500 mg-ot (0,39 mM) feloldunk 5 cm³ dimetil-formamidban. Ehhez az oldathoz lassan hozzáadunk 145 mg (0,43 mM) 9-(fluorenil-metil)-oxi-karbonil-N-hidroxiszukcinimidet (FMOC-succ), és szobahőmérsékleten 1 órát reagáltatjuk.

A reakció végén 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:30:6 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk. Az N-FMOC-di(lizo-GM]) köztiterméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, megszárítjuk, majd újra feloldjuk 2,5 cm³ 1:1 arányú dimetil-formamid/metanol elegyben. Az oldathoz szobahőmérsékleten hozzáadunk 1,056 cm³ (7,6 mM) trietilamint, 330 mg (1,9 mM) 2-piridil-ecetsav-hidrokloridot és 2,5 cm³ dimetil-formamidban oldott 194,2 mg (0,76 mM) klór-metil-piridínium-jodidot. A reakciót szobahőmérsékleten 18 óra alatt játszatjuk le.

A fluorenil-csoport eltávolítása céljából a reakcióelegyhez hozzáadunk 1 cm³ piperidint, és szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ 9:1 arányú aceton/víz elegyben kicsapjuk, leszűijük és megszárítjuk.

A köztiterméket feloldjuk 2,5 cm³1:1 arányú dimetilformamid/metanol elegyben, és ehhez az oldathoz hozzáadunk 10 cm³ tetrahidro-furánban oldott, frissen készített trimetoxi-benzoesav-anhidridet, amelyet úgy állítunk elő, hogy 0,3 g (1,9 mM) diciklohexil-karbodiimidet és 0,3 g (1,4 mM) trimetoxi-benzoesavat 10 cm³ tetrahidrofuránban reagáltatunk, majd 2 órával később a keletkezett diciklohexil-karbamidot kiszűrjük.

A kondenzációs reakciót 25 °C-on 18 órát végezzük, keverés közben, majd a terméket 100 cm³ acetonban kicsapjuk.

A nyersterméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, újra feloldjuk 2,0 cm³ 1:1 arányú kloroform/metanol elegyben, és 10 cm³ acetonban kicsapjuk.

243 mg terméket kapunk (az elméleti 43%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf=0,59, fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

35. példa

N-( 2-Piridil-acetil )-N'-( 2,6-dimetoxi-benzoil )di(lizo-GMi) előállítása

A 1. példa szerint előállított di(lizo-GM])-ből 500 mg-ot feloldunk 5 cm³ dimetil-formamidban, majd ehhez az oldathoz lassan hozzáadunk 145 mg (0,43 mM) 9-(fluorenil-metil)-oxi-karbonil-N-hidroxiszukcinimidet (FMOC-succ), és szobahőmérsékleten 1 órát reagáltatjuk.

A reakció végén 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk. A terméket kloroform/metanol/víz 60:30:6 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk. Az N-FMOC-di(lizo-GM,) köztiterméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, megszárítjuk, majd újra feloldjuk 2,5 cm³ 1:1 arányú dimetil-formamid/metanol elegyben, és az oldathoz hozzáadunk frissen készült dimetoxi-benzoesav-anhidridet, amelyet úgy állítunk elő, hogy 1,88 g (1,6 mM) 2,6-dimetoxi-benzoesavat és 540 mg (1,9 mM) fluor-metilpiridínium-p-toluol-szulfonátot 5 cm³1:1 arányú dimetil-formamid/tetrahidro-furán elegyben reagáltatunk szobahőmérsékleten 4 órát.

A fluorenil-csoport eltávolítása céljából hozzáadunk 1 cm³ piperidint, és az elegyet szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ 9:1 arányú aceton/víz elegyben kicsapjuk, leszűijük és megszárítjuk.

A köztiterméket feloldjuk 2,5 cm³1:1 arányú dimetil-formamid/metanol elegyben, majd szobahőmérsékleten hozzáadunk 1,056 cm³ (7,6 mM) trietil-amint, 330 mg (1,9 mM) 2-piridil-ecetsav-hidrokloridot és

2,5 cm³ dimetil-formamidban oldott 194,2 mg (0,76 mM) klór-metil-piridínium-jodidot. Szobahőmérsékleten reagáltatjuk 18 órát, majd a terméket 100 cm³ acetonban kicsapjuk.

A nyers reakcióterméket kloroform/metanol/víz 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiával tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, újra feloldjuk 2,0 cm³ 1:1 arányú kloroform/metanol elegyben, és 10 cm³ acetonban kicsapjuk.

247 mg terméket kapunk (az elméleti 41%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,58, fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

36. példa

N'-(3,4,5-Trimetoxi-benzoil)-N'-lizo-GM_} előállítása

500 mg (0,33 mM) N'-lizo-GM,-et feloldunk 50 cm³ 1:1 arányú kloroform/metanol elegyben, és ehhez az oldathoz hozzáadunk 0,28 g (0,7 mM) trimetoxi-benzoesav-anhidridet 20 cm³ tetrahidro-furánban oldva, amelyet frissen úgy készítünk, hogy 0,3 g (1,9 mM) diciklohexil-karbodiimidet és 0,3 g

HU 210 744 B (1,4 mM) trimetoxi-benzoesavat 20 cm³ tetrahidro-furánban reagáltatunk, majd 2 órával később a képződött diciklohexil-karbamidot kiszűqük.

A kondenzációs reakciót 25 °C-on 18 óráig végezzük, keverés közben.

A reakció végén a terméket megszárítjuk, 5 cm³ 1:1 arányú kloroform/metanol eleggyel felvesszük, és 100 cm³ acetonban kicsapjuk.

Az így nyert nyersterméket kloroform/metanol/víz 60:15:2 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, újra feloldjuk 5 cm³ 1:1 arányú kloroform/metanol elegyben, és a terméket 10 cm³ acetonban kicsapjuk.

320 mg terméket kapunk (az elméleti 56,7%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 60:35:8 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes fluoreszkáló vegyületet mutat, 0,50 Rf értékkel.

37. példa

N'-(2-Furoil)-di(lizo-GM_l) előállítása

A 1. példa szerint előállított di(lizo-GM_])-ből 500 mg-ot (0,39 mM) feloldunk 5 cm³ dimetil-formamidban, majd ehhez az oldathoz lassan hozzáadunk 145 mg (0,43 mM) 9-(fluorenil-metil)-oxi-karbonil-Nhidroxi-szukcinimidet 2 cm³ tetrahidro-furánban oldva. Szobahőmérsékleten 1 órát reagáltatjuk.

A reakció végén szobahőmérsékleten hozzáadunk

2,5 cm³ dimetil-formamidban oldva 0,528 cm³ (3,8 mM) trietil-amint, 210 mg (1,9 mM) 2-furán-karbonsavat és 194,2 mg (0,76 mM) klór-metil-piridínium-jodidot. Az elegyet szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk. Az így kapott terméket feloldjuk 10 cm³ 1M Na₂CO₃-ban, és 1 órát 60 °C-on állni hagyjuk. Ezután dializáljuk, betöményítjük 5 cm³-re, és 5-szörös térfogatnyi acetonban kicsapjuk.

A nyers reakcióterméket kloroform/metanol/2,5N NH₃ 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiával tisztítjuk.

A tiszta terméket tartalmazó frakciókat megszárítjuk, majd újra feloldjuk 5 cm³ vízben. Az oldat pH-ját 0,01N NaOH-dal 10-re állítjuk be, dializáljuk, 5 cm³-re betöményítjük, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

301 mg terméket kapunk (az elméleti 57%-a)

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, amely ninhidrin-festésre pozitív. Rf - 0,31, fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

38. példa

Ν'-(3,4,5-Trimetoxi-benzoi l)-di( lizo-GM,) előállítása

Az 1. példa szerint előállított di(lizo-GM])-ből 500 mg-ot (0,39 mM) feloldunk 5 cm³ dimetil-formamidban, majd ehhez az oldathoz lassan hozzáadunk 2 cm³ tetrahidro-furánban oldott 145 mg (0,43 mM) 9-(fluorenil-metil)-oxi-karbonil-N-hidroxi-szukcinimidet, és szobahőmérsékleten 1 órát reagáltatjuk.

A reakció végén 20 cm³ tetrahidro-furánban oldott, frissen készült trimetoxi-benzoesav-anhidridet adunk hozzá, amelyet úgy állítunk elő, hogy 0,3 g (1,9 mM) diciklohexil-karbodiimidet és 0,3 g (1,4 mM) trimetoxi-benzoesavat 20 cm³ tetrahidro-furánban reagáltatunk, majd 2 órával később a keletkezett diciklohexilkarbamidot kiszűrjük.

A kondenzációs reakciót keverés közben, 25 ’Con, 18 órát végezzük. A védőcsoport eltávolítása céljából ekkor 2 cm³ piperidint adunk hozzá, és szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd 100 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk. Az így kapott terméket feloldjuk 10 cm³ 1M Na2CO3ban, és 60 ’C-on 1 órát állni hagyjuk. Dializáljuk, betöményítjük 5 cm³-re, és 5-szörös térfogatnyi acetonban kicsapjuk. A nyers reakcióterméket kloroform/metanol/2,5N NH3 60:35:8 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat megszárítjuk, és 5 cm³ vízben újra feloldjuk, pH-ját 0,01N NaOH-dal 10-re állítjuk be, dializáljuk, betöményítjük 5 cm³-re, és 50 cm³ acetonban kicsapjuk.

317,5 mg terméket kapunk (az elméleti 56%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, amely ninhidrines festésre pozitív. Rf = 0,35, fluorimetriás leolvasás 254 nm-nél.

39. példa

Gangliozid-keverék (GA keverék) előállítása marha agyvelő szövetből való extrahálással Az állatból eltávolított marha agykérget 6,8 pH-jú foszfát pufferben homogenizáljuk, majd hozzáadunk 6-szoros térfogatnyi tetrahidro-furánt, és az így kapott elegyet centrifugáljuk. A felülúszót még kétszer extraháljuk tetrahidro-furánnal. Centrifugálás után az apoláris anyagokat etil-éteres kirázással eltávolítjuk, és a vizes-tetrahidrofurános fázist 50%-os etanollal egyensúlyba hozott ioncserélő oszlopra visszük fel. Az oszlopról lejövő termékhez bárium-hidroxidot és négyszeres térfogatnyi jeges etanolt adunk. 18 órát hidegen tartjuk, a csapadékot összegyűjtjük, sósavval enyhén megsavanyítjuk, miután vízben feloldottuk. Az így kapott oldatot dializáljuk, és fagyasztva szárítjuk. Ezen a ponton a kitermelés mintegy 0,6 mg nyers gangliozidkeverék 1 g idegszövegre számítva. A fagyasztva szárított port 20 térfogat 2:1 arányú kloroform/metanol elegyben eloszlatjuk. Amint az így kapott oldatot víztisztára szűrtük, hozzáadunk 0,2 térfogat 0,88%-os vizes kálium-klorid oldatot, és kirázzuk.

A felső réteget elkülönítjük, dializáljuk, és fagyasztva szárítjuk. A végső kitermelés mintegy 0,3 mg tisztított gangliozid-só keverék 1 g agyszövetre számítva. A kapott gangliozid-keveréket különböző adagokra frakcionálhatjuk, amelyek lényegében tiszta gangliozidokat jelentenek (a fentebb leírtak értelmében), a frakcionálási kovasav oszlopokon, metanol/kloroform eluensekkel végezve. így a következő hozzávetőleges átlagösszetételt kapjuk: 40% GD_la gangliozid, 21 = GM] gangliozid, 19% GIj_b gangliozid és 16% GD_]b gangliozid.

HU 210 744 B

40. példa

N-Lizogangliozidok keverékének 2-furoilszármazékainak előállítása

1. N-Lizogangliozidok előállítása

A 39. példa szerint előállított gangliozid-keverékből 10 g-ot feloldunk 200 cm³ 3N KOH-ban, és 90 ’Con 72 órát hidrolizáljuk.

Az oldatot lehűtjük, és pH-ját sósavval 6,5-re állítjuk be. 18 órát 4 ’C-on állni hagyjuk, majd a kicsapódott zsírsavakat kiszűrjük. A szűrletet vízzel szemben dializáljuk, 500 cm³-re betöményítjük, és 5 liter acetonban kicsapjuk.

Az N'-lizogangliozidokat és N,N'-di(lizogangliozid)okat (<20%) tartalmazó terméket vákuumban szárítjuk, majd újra feloldjuk 100 cm³ dimetil-formamidban.

Ehhez az oldathoz lassan hozzáadunk 20 cm³ tetrahidro-furánban oldott 2,15 g (6,37 mM) 9-(fluorenilmetil)-oxi-karbonil-N-hidroxi-szukcinimidet, és szobahőmérsékleten 1 órát reagáltatjuk. Végül hozzáadunk 3 cm³ (31,85 mM) ecetsav-anhidridet és 0,9 cm³ (63,7 mM) trietil-amint. 30 perc után hozzáadunk

12,5 cm³ piperidint a védőcsoport eltávolítása céljából. Szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, 2 liter acetonban kicsapjuk, és megszárítjuk. Az így kapott anyagot IM Na2CO3-ban feloldjuk, és 1 órát 60 ’C-on állni hagyjuk. Ezután dializáljuk, betöményítjük 100 mg/cm³-re, és 5-szörös térfogatnyi acetonban kicsapjuk. A terméket metanollal egyensúlyba hozott SSepharose (H⁺ forma) oszlopon átbocsátjuk. Metanollal mossuk, és metanolos 10 mM NH4Cl-dal eluálva N-lizogangliozidokhoz jutunk.

A terméket tartalmazó frakciókat megszárítjuk, majd vízben újra feloldjuk. pH-ját 0,01N NaOH-dal 10-re állítjuk be, dializáljuk, betöményítjük 100 mgcm³-re, és 5-szörös térfogatnyi acetonban kicsapjuk.

4,7 g terméket kapunk (az elméleti 55%-a).

2. A 2-furoil-származék előállítása

Az előzőekben előállított N-lizogangliozid keverékből 500 mg-ot (0,31 mM) feloldunk 2,5 cm³ dimetil-formamidban, és ehhez az oldathoz hozzáadunk 0,431 cm³ (3,1 mM) trietil-amint, 174 mg (1,55 mM) 2-furán-karbonsavat és 2,5 cm³ dimetil-formamidban oldott 158,4 mg (0,62 mM) l-metil-2-klór-piridíniumjodidot.

Szobahőmérsékleten 18 órát reagáltatjuk, majd a terméket 10 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük és megszárítjuk.

Az acilezett terméket metanollal egyensúlyba hozott S-Sepharose (H⁺ forma) oszlopon végzett kromatografálással elkülönítjük az el nem reagált vegyülettől. A furoil-származékot metanollal eluáljuk, megszárítjuk, IN Na₂CO₃-tal felvesszük, dializáljuk, betöményítjük 2,5 cm³-re, és 25 cm³ acetonban kicsapjuk.

373 mg terméket kapunk (az elméleti 72%-a).

41. példa

Az N-(2-furoil)-N-lizo-GM_[ metil-észterének előállítása

A 7. példa szerint előállított N-(2-furoil)-N-lizoGMj nátrium-sójából 500 mg-ot (0,36 mM) feloldunk 5 cm³ N-metil-pirrolidonban, és ehhez az oldathoz hozzáadunk 44,5 mm³ (0,72 mM) metil-jodidot. Szobahőmérsékleten 3 órát reagáltatjuk, majd etilacetátban kicsapjuk, leszűrjük és vákuumban megszárítjuk.

A terméket kloroform/metanol/víz 60:30:6 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, újra feloldjuk 2,5 cm³ 1:1 arányú kloroform/metanol elegyben, és 25 cm³ acetonban kicsapjuk.

449 mg terméket kapunk (az elméleti 89%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,4 [az N-(2-furoil)-lizo-GM] Rf értéke 0,37],

42. példa

Az N-(2-Furoil)-N-lizo-GMf metil-észter peracetilátjának előállítása A 41. példa szerint előállított N-(2-furoil)-N-lizoGMj metil-észterből 500 mg-ot (0,36 mM) feloldunk 5 cm³ piridinben, és ehhez az oldathoz hozzáadunk

2,5 cm³ frissen desztillált ecetsav-anhidridet. Az elegyet szobahőmérsékleten 72 órát keverjük. A reakció végén az oldószert forgó bepárlóban elpárologtatjuk, és a maradékot 10 cm³ jeges víz és 10 cm³ etil-acetát fázisok között kirázzuk. Az etil-acetátos fázist hideg IM HCl-val, vízzel, végül IM NaHCO₃-tal mossuk. A szerves fázisokat nátrium-szulfáttal vízmentesítjük, bepároljuk, és a maradékot diklór-metán/etil-acetát/izopropanol 70:30:45 arányú eleggyel eluálva, szilikagélkromatográfiával tisztítjuk. A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, újra feloldjuk 5 cm³ etil-éterben, és 25 cm³ n-hexánban kicsapjuk.

463 mg terméket kapunk (az elméleti 62%-a).

Kloroform/metanol/etil-acetát 70:10:30 arányú eleggyel és etil-acetát/izopropanol 95:5 arányú elegygyel végzett szilikagél-kromatográfia egyaránt egységes terméket mutat, 0,45, illetve 0,26 Rf értékkel.

43. példa

AzN-(2-Furoil)-N-lizo-GM\ belső észterének előállítása

500 mg (0,36 mM) N-(2-furoil)-N-lizo-GM₁ nátrium-sót 4 ’C-on feloldunk 5 cm³ N-metil-pirrolidonban, és hozzáadunk 55 mm³ (0,4 mM) trietil-amint és 100 mg (0,41 mM) l-metil-2-klór-piridínium-jodidot. A reakciót 4 órát végezzük, amely alatt teljesen végbemegy. A terméket 50 cm³ aceton hozzáadásával kicsapjuk, leszűrjük, 5 cm³ 1:1 arányú kloroform/izopropanol eleggyel felvesszük, és 25 cm³ acetonban ismét kicsapjuk. 476 mg (96%) túlnyomórészt a szialinsav karboxilcsoportjai és a szacharid-hidroxilcsoportok közötti laktonkötéseket tartalmazó belső észtert kapunk.

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,44 [az N-(2-furoil)-N-lizoGM, Rf értéke 0,37],

HU 210 744 Β

44. példa

Az N-(2-Furoil)-N-lizo-GM_} 2-butil-amidjának előállítása

A 41. példa szerint előállított N-(2-furoil)-N-lizoGMj metil-észterből 500 mg-ot (0,36 mM) feloldunk 5 cm³ piridinben, és ehhez az oldathoz hozzáadunk

2,5 cm³ 2-butil-amint. Szobahőmérsékleten 72 órát reagáltatjuk, majd forgó bepárlóban szárazra pároljuk, feloldjuk 5 cm³ 1:1 arányú kloroform/metanol elegyben, és 25 cm³ acetonban kicsapjuk, leszűrjük, és vákuumban megszárítjuk.

A terméket kloroform/metanol/víz 60:25:4 arányú eleggyel eluálva, szilikagél-kromatográfiásan tisztítjuk.

A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, újra feloldjuk 2,5 cm³ 1:1 arányú kloroform/metanol elegyben, és 25 cm³ acetonban kicsapjuk.

376 mg terméket kapunk (az elméleti 75%-a).

Kloroform/metanol/0,3%-os CaCl₂ 50:42:11 arányú eleggyel végzett szilikagél-kromatográfia egységes terméket mutat, Rf = 0,50 [az N-(2-furoil)-N-lizoGMj metil-észter Rf értéke 0,42],

45. példa

Injekcióval beadható gyógyszerkészítmények előállítása

1. készítmény: 2 cm³-es ampullában:

mg hatóanyag, mg nátrium-klorid, cm³-re 6 pH-jú citrát-puffer injekciós minőségű vízben.

A hatóanyag az 5. vagy 12. példában leírt gangliozid-származékok közül választható.

2. készítmény: 2 cm³-es ampullában:

mg hatóanyag, mg nátrium-klorid, cm³-re 6 pH-jú citrát-puffer injekciós minőségű vízben.

A hatóanyag a 7. példában leírt gangliozid-származékok csoportjából választható.

3. készítmény: 4 cm³-es flakonban:

100 mg hatóanyag, mg nátrium-klorid, cm³-re 6 pH-jú citrát-puffer injekciós minőségű vízben.

A hatóanyag a 27., 29., 38. és 40. példában leírt gangliozid-származékok közül választható.

46. példa

Kettős flakonban kiszerelt gyógyszerkészítmények előállítása

Az ebben a példában bemutatott készítményeket két külön üvegcsébe mérjük be. Az első flakonba helyezzük a hatóanyagot fagyasztva szárított por alakjában, 10-90%-os töménységben, gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyaggal, így glicinnel vagy mannitollal hígítva. A második flakon tartalmazza az oldószert, vagyis a nátrium-klorid oldatot és a citrát-puffert. Közvetlenül a beadagolás előtt a két flakon tartalmát összekeverjük, amikor is a hatóanyagot tartalmazó, fagyasztva szárított por gyorsan feloldódik, és injekcióval beadható oldatot képez. A hatóanyagot fagyasztva szárított por alakjában tartalmazó flakonból álló gyógyszerforma a találmány előnyös megvalósítása.

1. rendszer

a) 2 cm³-es flakon a fagyasztva szárított porral:

mg hatóanyag, mg glicin;

b) 2 cm³-es ampulla az oldószerrel:

mg nátrium-klorid, cm³-re citrát-puffer injekciós minőségű vízben.

A hatóanyag az 5. vagy 12. példában leírt gangliozid-származékok közül választható.

2. rendszer

a) 3 cm³-es fiola a fagyasztva szárított porral:

mg hatóanyag, mg mannitol;

b) 2 cm³-es ampulla az oldószerrel:

mg nátrium-klorid, cm³-re cifrát puffer injekciós minőségű vízben.

A hatóanyag az 5. vagy 12. példában leírt gangliozid-származékok közül választható.

3. rendszer

a) 3 cm³-es fiola a fagyasztva szárított porral:

mg hatóanyag, mg glicin;

b) 3 cm³-es fiola az oldószerrel:

mg nátrium-klorid, cm³-re citrát-puffer injekciós minőségű vízben.

A hatóanyag a 18., 33. vagy 38. példában leírt gangliozid-származékok közül választható.

4. rendszer

a) 3 cm³-es fiola a fagyasztva szárított porral:

mg hatóanyag, mg mannitol;

b) 3 cm³-es fiola az oldószerrel:

mg nátrium-klorid, cm³-re citrát-puffer injekciós minőségű vízben.

A hatóanyag a 18., 33. vagy 38. példában leírt gangliozid-származékok közül választható.

5. rendszer

a) 5 cm³-es flakon a fagyasztva szárított porral:

150 mg hatóanyag, mg glicin;

b) 4 cm³-es ampulla az oldószerrel:

mg nátrium-klorid, cm³-re citrát-puffer injekciós minőségű vízben.

A hatóanyag a 27., 29., 38. vagy 40. példában leírt gangliozid-származékok közül választható.

6. rendszer

a) 5 cm³-es flakon a fagyasztva szárított porral:

100 mg hatóanyag, mg mannitol;

b) 4 cm³-es fiola az oldószerrel:

mg nátrium-klorid, cm³-re citrát-puffer injekciós minőségű vízben.

A hatóanyag a 27., 29., 38. vagy 40. példában leírt gangliozid-származékok közül választható.

7. rendszer

a) 3 cm³-es flakonban:

mg steril, mikrométeres szemcseméretö hatóanyag;

HU 210 744 Β

b) 3 cm³-es fiola az oldószerrel:

mg Tween 80, mg nátrium-klorid, cm³-re foszfát-puffer injekciós minőségű vízben.

A hatóanyag a 41., 42. vagy 43. példában leírt gangliozid-származékok közül választható.

8. rendszer

a) 5 cm³-es flakonban:

100 mg steril, mikrométeres szemcseméretű hatóanyag;

b) 4 cm³-es fiola az oldószerrel:

mg Tween 80, mg szója-lecitin, mg nátrium-klorid, cm³-re citrát-puffer injekciós minőségű vízben.

A hatóanyag a 41., 42. vagy 43. példában leírt gangliozid-származékok közül választható.

47. példa

Transzdermális gyógyszerkészítmények eló'állítása

1. készítmény: minden tapasz tartalmaz:

100 mg hatóanyagot,

1,6 mg glicerint,

200 mg poli( vinil-alkohol)-t,

100 mg polí(vinil-pirrolidon)-t, mg bőrön való áthatolást növelő vivőanyagot,

1,5 g vizet.

A hatóanyag a 22., 23. vagy 25. példában leírt gangliozid-származékok közül választható.

2. készítmény: 100 g kenőcs tartalmaz:

4,0 g hatóanyagot (5 g kevert foszfolipid liposzomában),

1,5 g poli(etilén-glikol)-monosztearátot,

1,5 g glicerint,

125 mg p-hidroxi-benzoesav-észtert, 72,9 g vizet.

A hatóanyag a 22., 23. vagy 25. példában leírt gangliozid-származékok közül választható.

48. példa

Orális gyógyszerkészítmények eló'állítása ]. készítmény: 1 tabletta tartalmaz:

mg hatóanyagot,

150 mg mikrokristályos cellulózt, mg laktózt, mg amidot, mg magnézium-sztearátot.

A hatóanyag a 9., 13., 19. vagy 26. példában leírt gangliozid-származékok közül választható.

2. készítmény: 1 drazsé tartalmaz:

mg hatóanyagot,

150 mg karboxi-metil-cellulózt, mg amidot, mg sellakot, mg szacharózt,

0,5 mg színezőanyagot.

A hatóanyag a 9., 14. vagy 28. példában leírt gangliozid-származékok közül választható.

3. készítmény: 1 zselatin-kapszula tartalmaz:

mg hatóanyagot,

100 mg laktózt, mg gyomorban fel nem szívódó bevonóanyagot.

A hatóanyag a 15., 24. vagy 34. példában leírt gangliozid-származékok közül választható.

4. készítmény: 1 lágy zselatin-kapszula tartalmaz:

mg hatóanyagot,

200 mg növényolajat, mg méhviaszt,

150 mg zselatint, mg glicerint, mg színezőanyagot.

A hatóanyag a 15., 24. vagy 34. példában leírt gangliozid-származékok közül választható.

Claims (27)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás GMj-gangliozidból vagy gangliozidelegyből származó módosított, a neuramin-rész nitrogénatomján (N) és a szfingozin-rész nitrogénatomján (Ν') az alább felsorolt alifás, aralifás, aromás, aliciklusos vagy heterociklusos acilcsoportok valamelyikével, de legfeljebb a két nitrogénatom egyikén alifás acilcsoporttal acilezett N,N'-diacil-N,N'-di-lizo-, N-acil-N-lizo- vagy N'-acil-N'-lizo-gangliozidok - amelyekben az acilcsoportok a következők lehetnek:

   (i) adott esetben halogénatommal helyettesített 2-16 szénatomos alkanoilcsoport;

   (ii) adott esetben egy vagy két 1-7 szénatomos alkoxicsoporttal helyettesített benzoil- vagy naftil-karbonil-csoport;

   (iii) fenil-, naftil- vagy l-indanon-2- vagy -3-il-csoporttal helyettesített 2-8 szénatomos alkanoilcsoport, amelyek az aromás gyűrűkön 1-7 szénatomos alkoxicsoporttal lehetnek helyettesítve;

   (iv) 3—8 szénatomos cikloalkil-karbonil-csoport, norbornil-2-8-szénatomos-alkanoil-csoport;

   (v) 1-7 szénatomos alkil-karbonil- vagy 1-7 szénatomos alkil-tiokarbonil-csoport, amelyek imidazolil-, tetrazolil-, tienil-, furil-, piridil- vagy 7-teofillinilcsoporttal vannak helyettesítve;

   (vi) furoil-, tienil-karbonil-, 4-6 szénatomos, adott esetben valamely metiléncsoport helyett -O-, -S- vagy -NH- csoportot tartalmazó alkilén-imino-karbonilcsoport, amelyben az alkilén-imino-csoport valamely szénatomján keresztül kapcsolódik a karbonil-csoporthoz; pirrolil-karbonil-, piridil-karbonilvagy kinolil-karbonil-csoport, mimellett a fenti heterociklusos csoportok adott esetben 1-7 szénatomos alkilcsoporttal lehetnek helyettesítve valamint az ilyen gangliozid-származékok szialsavkarboxilcsoporton 1-7 szénatomos alkilcsoporttal képezett észtereinek, 1-7 szénatomos alkil-amidjainak, belső észtereinek és a szabad hidroxilcsoportokon 2-8 szénatomos alkanoilcsoporttal peracilezett származékainak, mindezek fémsóinak és az ilyen vegyületek elegyeinek az előállítására, azzal jellemezve, hogy va23

   HU 210 744 B lamely Ν,Ν'-di-lizo-, N-acil-N,N'-di-lizo- vagy N'acil-N,N'-di-lizo-gangliozidot vagy adott esetben annak szabad aminocsoporton védett származékát a bevinni kívánt acilcsoportnak megfelelő szerves savval vagy ennek reakcióképes származékával acilezünk vagy diacilezünk, és kívánt esetben a kapott acilezett származékot a tárgyi körben meghatározott észterré, amiddá, belső észterré vagy hidroxi-peracilezett származékká és/vagy gyógyászati szempontból elfogadható sóvá alakítjuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont jellemző részében megadott acil-di(lizogangliozid) acilezését a megfelelő sav reaktív funkciós származékával végezzük.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont jellemző részében megadott acildi(lizogangliozid)-ot az alábbi reakciók valamelyikébe visszük:

   a) a lizogangliozid-származék reakciója a sav azidjával;

   b) a lizogangliozid-származék reakciója acil-imidazollal;

   c) a lizogangliozid-származék reakciója a sav és trifluor-ecetsav vegyes anhidridjével;

   d) a lizogangliozid-származék reakciója sav-kloriddal;

   e) a lizogangliozid-származék reakciója a savval karbodiimid és adott esetben 1-hidroxi-benztriazol jelenlétében;

   f) a lizogangliozid-származék reakciója a savval magas hőmérsékleten;

   g) a lizogangliozid-származék reakciója a sav metilészterével magas hőmérsékleten;

   h) a lizogangliozid-származék reakciója a sav fenolészterével magas hőmérsékleten;

   i) a lizogangliozid-származék reakciója a sav sója és l-metil-2-klór-piridínium-jodid közötti kicserélődésből származó észténél.
4. 4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakcióban részt nem vevő primer vagy szekunder aminocsoportokat az acilezési reakció folyamán a peptidkémiában szokásos módszerekkel védjük.
5. 5. A 2-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az acilezést enyhe körülmények között végezzük, amikor kiindulási anyagként N'-lizogangliozidot alkalmazunk.
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás az 1. igénypont szerint acilezett lizogangliozidok észter-, illetőleg amidszármazékainak az előállítására, azzal jellemezve, hogy az acilezett lizogangliozidot a sziálsav-molekularész szabad karboxilcsoportjain észterezzük vagy amiddá alakítjuk.
7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás az 1. igénypont meghatározott olyan acil-di(lizogangliozid)-ok előállítására, amelyekben egy vagy két olyan acilcsoport van, amelyek aromás, aliciklusos vagy heterociklusos gyűrűje közvetlenül kapcsolódik a karboxilcsoporthoz, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
8. 8. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás az 1. igénypontban meghatározott olyan acil-di(lizogangliozid)-ok előállítására, amelyekben egy vagy két olyan acilcsoport van, amelyek aromás, aliciklusos vagy heterociklusos gyűrűje alkiléncsoport közvetítésével kapcsolódik a karboxilcsoporthoz, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
9. 9. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás az 1., 7. és 8. igénypontokban meghatározott olyan N,N'-diacil-N,N'-di(lizogangliozid)-ok előállítására, amelyekben mindkét acilcsoportban levő aromás, aralifás, aliciklusos vagy heterociklusos sorokba tartozó savak valamelyikéből származik, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
10. 10. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás az 1., 7. és 8. igénypontokban meghatározott olyan N,N'-diacil-N,N'-di(lizogangliozid)-ok előállítására, amelyekben a szfingozin nitrogénjén lévő acilcsoport karboxilcsoportjához aromás, aralifás, aliciklusos vagy heterociklusos csoport kapcsolódik, míg a neuramin nitrogénjén lévő acilcsoport 2-16 szénatomos telített alifás savból származik, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
11. 11. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás az 1. igénypontban meghatározott N,N'-diacil-N,N'di(lizogangliozid)-ok előállítására, amelyekben a neuramin nitrogénjén lévő alifás acil-csoport szénatomszáma legfeljebb 11, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
12. 12. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a 10. igénypontban meghatározott olyan N,N'-diacilN,N'-di(lizogangliozid)-ok előállítására, amelyekben a neuramin nitrogénjén lévő alifás acil-csoport 12-16 szénatomot tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
13. 13. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a 10. igénypontban meghatározott olyan N,N'-diacilN,N'-di(lizogangliozid)-ok előállítására, amelyekben a neuramin nitrogénjén lévő alifás acil-csoport a természetes gangliozidokban jelen lévő, vegyes acil-csoport, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
14. 14. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás az 1., 7. és 8. igénypontokban meghatározott, olyan N,N'-diacil-N,N'-di(lizogangliozid)-ok előállítására, amelyekben a neuramin nitrogénjén lévő acilcsoportban aromás, aralifás, aliciklusos vagy heterociklusos csoport kapcsolódik a karboxilcsoporthoz, míg a szfingozin nitrogénjén lévő acilcsoport 2-16 szénatomos telített alifás savból származik, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
15. 15. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a 14. igénypontban meghatározott, olyan N,N'-diacilN,N'-di(lizogangliozid)-ok előállítására, amelyekben a szfingozin nitrogénjén lévő alifás acil-csoport a természetes gangliozidokban jelen lévő, vegyes acil-csoport, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
16. 16. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás N-(2,6-dimetoxi-benzoil)-N-lizo-GM j, N-(5-metoxi24

    HU 210 744 B indanon-3-acetil)-N-lizo-GM], N-(fenil-acetil)-N-lizoGM_i( N-(ciklobután-karbonil)-N-lizo-GM], N-(2-norbornén-acetil)-N-lizo-GM_b N-furoil-N-lizo-GM_b N(imidazol-acetil)-GM], N-(6-metil-nikotinoil)-N-lizoGM_b N-(metil-prolil)-N-lizo-GM_b N-(l-metil-2-pirrol-karbonil)-N-lizo-GM_b N-(2-piridil-acetil)-N-lizoGM_b N-(4-piridil-tioacetil)-N-lizo-GM_b N-(3-kinolinkarbonil)-N-lizo-GM_b N-(tetrazolil-l-acetil)-N-lizoGM_b N-(7-teofillin-acetil)-N-lizo-GM_b N-(2-tiofénacetilj-N-lizo-GMj, N-(5-hidroxi-indol-3-acetil)-N-lizo-GM_b N-(3,4,5-trimetoxi-benzoil)-N-lizo-GM_b N(cikloheptán-acetil)-N-lizo-GM_b N-(ciklopentán-acetil)-N-lizo-GMi és N-(5-metil-2-tiofén-acetil)-N-lizoGMj előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
17. 17. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a 16. igénypontban bemutatott, GM,-bői származó Nacil-N-lizogangliozidoknak megfelelő és szintén a GM, gangliozidból származó N,N'-diacil-N,N'-di(lizogangliozid)-ok csoportjából olyan acil-di(lizogangliozid)-ok előállítására, amelyekben a neuramin acil-csoport szubsztituense ugyanaz az acil-csoport, amely a szfingozin nitrogénjén szerepel, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
18. 18. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a 16. igénypontban bemutatott, GM, gangliozidból származó N-acil-N-lizogangliozidoknak megfelelő N,N'-diacil-N,N'-di(lizogangliozid)-ok csoportjából olyan acil-di(lizogangliozid)-ok előállítására, amelyekben a neuramin-nitrogénen lévő természetes, vegyes acil-csoport 2-6 szénatomos, adott esetben egy vagy több halogén atommal szubsztituált alkanoilcsoporttal van helyettesítve, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
19. 19. A 6. igénypont szerinti eljárás a 16. és 17. igénypontban meghatározott vegyületek sziálsav-karboxiljain képzett, olyan észterek előállítására, amelyek a következő alkoholokból származhatnak: etil-, propil-, izopropil-, η-butil-, izobutil-, terc.butil-, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
20. 20. A 6. igénypont szerinti eljárás a 16. és 17. igénypontban meghatározott vegyületek sziálsav-karboxiljain képzett, olyan amidok előállítására, amelyek a következő aminokból származhatnak: metil-amin, etil-amin, propil-amin, dimetil-amin, dietil-amin, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
21. 21. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás a 16. és 17. igénypontokban meghatározott vegyületek peracetilátjainak, perpropionilátjainak vagy perbutirilátjainak előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
22. 22. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás az 1., 7. és 8. igénypontokban meghatározott acil-dilizogangliozidok belső észtereinek előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1., 7. vagy 8. igénypontban meghatározott acil-dilizogangliozidokat nem vizes szerves oldószerben, vízmentes körülmények között laktonképző szenei reagáltatjuk.
23. 23. Az 1. igénypont szerinti eljárás az 1. igénypontban meghatározott acil-dilizogangliozidok peracilezett származékainak előállítására, amelyek legfeljebb 6 szénatomos telített alifás karbonsavakból származnak, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
24. 24. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás bármelyik előző igénypont szerinti acil-dilizogangliozidok keverékeinek előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
25. 25. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás bármelyik előző igénypontban meghatározott acil-dilizogangliozidok vagy keverékeik olyan, gyógyászatilag elfogadható fémsóinak előállítására, amelyek molekulánként legalább egy savfunkciós csoportot tartalmaznak, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
26. 26. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás bármelyik előző igénypontban meghatározott acil-dilizogangliozidok vagy keverékeik nátrium-, kálium-, ammónium-, kalcium-, magnézium- vagy alumíniumsóinak előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
27. 27. Eljárás hatóanyagként az 1. igénypont szerinti gangliozid-származékok legalább egyikét tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított hatóanyagot gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyaggal keverjük össze.