HU208829B

HU208829B - Process for synthetizing dimeric alkaloid compounds

Info

Publication number: HU208829B
Application number: HU884126A
Authority: HU
Inventors: James P Kutney; Lewis S L Choi; Jun Nakano; Hiroki Tsukamoto; Camille A Boulet; Michael Mchugh
Original assignee: Univ British Columbia
Priority date: 1987-08-06
Filing date: 1988-08-08
Publication date: 1994-01-28
Also published as: AU617342B2; AU2051288A; GB2215331B; HUT50351A; IT8821678A0; JPH01151590A; SE8802813D0; BE1003228A4; JPH0613532B2; ZA885765B; CH676711A5; GB8818765D0; CA1341262C; DE3826412A1; GB2215331A; SE8802813L; SE467875B; IT1227155B; NL8801966A

Description

A találmány tárgya új eljárás dimer alkaloid vegyületek előállítására, főleg olyanok előállítására, amelyek a Catharantus (Vinca) családba tartoznak, így vinblasztinok, vinkrisztinek és leurozidinok előállítására.

A találmány szerinti eljárással előállított dimer alkaloidok jelentős antivirális, antitumor és antileukémiás hatásúak. Korábban ezeket az alkaloidokat Catharantus fajból, különösen C. roseusból izolálták, azonban kis mennyiségben. Újabban haladás mutatkozott ezeknek a vegyületeknek a szintézisében [4144237 és 4279817 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások (James P. Kutney)]. Ezeknek a technika állásából ismert szintéziseknek a hátránya, hogy a célvegyületeket kis kitermelésben kapjuk meg. A találmány szerinti eljárással a cél alkaloid vegyületeket jelentősen nagyobb kitermelésben állítjuk el, a kapott vegyületek mennyisége pl. 10—15%-kal magasabb, mint a technika állása szerinti eljárásokkal előállított vegyületeké. Ráadásul a technika állása szerint ismert eljárásokkal nem lehet közvetlenül, például vinblasztint előállítani, ott a célvegyület 3’,4’-dehidrovinblasztin.

A találmány szerinti eljárással több lépésben állíthatjuk elő a dimer alkaloid vegyületeket, különösen azokat, amelyek a Catharantus (Vinca) családba tartoznak, így például a vinblasztinokat, a vinkrisztineket és a leurozidinokat.

A találmány szerinti eljárásnál (I) általános képletű vegyületeket állítunk elő - a képletben vinblasztin esetén:

alk jelentése metilcsoport,

Rj jelentése metilcsoport,

R₂ jelentése -CO-CH₃,

R₃ jelentése hidrogénatom,

R₄ jelentése -COO-CH₃,

Z jelentése -CH=CH-csoport,

R jelentése (II) általános képletű csoport, ahol

R₇ jelentése -COO-CH₃R₈ jelentése hidroxilcsoport,

R₉ jelentése etilcsoport,

R₁₀ jelentése hidrogénatom, leuorozidin esetén:

alk, R,, R₂ R₃, R₄ és Z jelentése a fenti, R jelentésénél a (Π) általános képletben R₈ jelentése etilcsoport és R₉jelentése hidroxilcsoport, R₇ és R₁₀ jelentése a fenti, vinkrisztin esetén:

alk, R₂, R₃, R₄, Z és R jelentése azonos a vinblasztinnál megadottakkal és R, jelentése -CHO-csoport - oly módon,hogy

1. egy (III) általános képletű vegyületet egy (Illa) általános képletű vegyületté oxidálunk - a képletekben R jelentése COO-CH₃-csoport —77 °C és +40 °C közötti hőmérsékleten valamely persav alkalmazásával, majd izolálás nélkül

2. a kapott terméket, egy (IV) képletű vegyülettel kapcsoljuk ecetsavanhidrid, halogénezett ecetsavanhidrid vagy acetil-klorid jelenlétében -70 °C és +40 °C közötti hőmérsékleten inért gázatmoszférában és inért oldószerben, majd

3. a kapott (VI) képletű vegyületet adott esetben izolálás nélkül egy (IX) általános képletű vegyülettel - a képletben

i) R,i-R₁₆ jelentése hidrogénatom, vagy ii) Rh jelentése benzil-, difenil-metil-, 1-metoxikarbonil-izobutil-, 2’,3’,-4’,-6-tetraacetil-P-Dglükopiranozidil-, 2’-metoxi-karbonil-izopiranol-, l’,2’-dimetoxi-karbonil-etil-, izobutil-1karbonsav-Na-só-csoport, és

R,₃ jelentése -CO-NH₂, -CN vagy (a) képletű csoport, és

R₁₂, R₁₄-R,₆ jelentése hidrogénatom, vagy iii) R,| jelentése hidrogénatom,

R|₂ és R|₆ jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport,

R13 és R₁₅ jelentése 1-6 szénatomos alkoxi-karbonil-csoport, és

R₁₄ jelentése fenilcsoport redukáljuk, majd

4. az így kapott (VIII) képletű enamint ismert módon oxidáljuk, előnyösen oxigénnel vagy levegővel, majd

5. a kapott vegyületet ismert módon alkálifém-bórhidriddel reduáljuk, majd

6. a kapott terméket kromatografáljuk a kapott vinblasztin és leurozidin elválasztására, és kívánt estben a kapott vinblasztint vinkrisztinné alakítjuk az R[ = metilcsoport ismert módon R, = formilcsoporttá való oxidálásával.

Ha tehát az (I) általános képletben alk jelentése metilcsoport, R, jelentése metilcsoport, R₂ jelentése CO-CH3, R₃ jelentése hidrogénatom, R₄ jelentése COOCH3, Z jelentése -CH=CH-, R jelentése (II) képletű csoport, R₇ jelentése COOCH₃, R₈ jelentése hidroxilcsoport, R₉ jelentése etilcsoport és R₁₀ jelentése hidrogénatom, akkor vinblasztint állítunk elő. Ha az (I) általános képletben alk jelentése metilcsoport, R, jelentése metilcsoport, R₂ jelentése CO-CH₃, R₃ jelentése hidrogénatom R⁴ jelentése COOCH₃, Z jelentése -CH = CH-, R jelentése (II) képletű csoport, R₇ jelentése COOCH3, R_g jelentése etilcsoport, R₉ jelentése hidroxilcsoport és R₁₀ jelentése hidrogénatom, akkor leurozidint állítunk elő, és ha az (I) általános képletben alk jelentése metilcsoport, R) jelentése CHO, R₂ jelentése CO-CH3, R₃ jelentése hidrogénatom, R₄ jelentése COOCH3, Z jelentése -CH=CH-, R jelentése (II) képletű csoport, R₇ jelentése COOCH₃, R₈ jelentése hidroxilcsoport, R₉ jelentése etilcsoport és R₁₀ jelentése hidrogénatom, akkor vinkrisztint állítunk elő.

A leírásban a %-os adatok tömeg%-ot jelentenek, az idő intervallumokat percben adjuk meg, és a hőmérséklet értékek °C-ot jelentenek, ha másként ezeket az egységeket nem jelöljük.

A találmány szerinti dimer-alkaloid vegyületek előállításában kiindulási vegyületként (III) általános képlettel jellemzett indol egység N-oxid-származékát alkalmazzuk - a képletben R jelentése -COO-CH₃. A találmány szerinti eljárásban az indolegységet a nitrogénhíd oxidálásával (Illa) általános képletű N-oxidszármazékká oxidáljuk. A találmány szerinti 1. eljáráslépésben alkalmazott indolegység előnyösen katarantin.

HU 208 829 Β

Az N-oxid-származékot a nitrogén hídon oxidáljuk, amikor a reakciókörülmények -77-(-40) °C és a reakcióban persavat alkalmazunk, így m-klór-perbenzoesavat vagy p-nitro-perbenzoesavat közömbös szerves oldószerben, mint például metilén-kloridban vagy egyéb polihalogén szerves oldószerben [1. reakciólépés]. Az így kapott N-oxid-intermediert izolálás nélkül alkalmazzuk a 2. eljárási lépésben. Az 1. eljárási lépésben ily módon előállított N-oxid-származékot a 2. eljárási lépésben egy dihidroindol egységgel, így például (IV) képletű vindolinnal kapcsoljuk. A (Illa) és (IV) képletű vegyületek szén-szén hídon keresztül kapcsolódnak. Ezek a szén-szén hidak az N-oxid-származékban a C₁₈ alifás központ, a dihidroindol egységben a C₁₅ aromás szénatom.

Az indol N-oxid C₅-C_I8-as kötését a hasítási reakcióban például trifluor-ecetsavanhidrid jelenlétében hasítjuk. A dihidroindol egységet a hasítási reakció előtt adhatjuk a reakcióelegyhez, ily módon a C|₈ (indol egység) és a C₁₅ (dihidroindol egység) szénatomoknál természetes dimer kötés kialakulását elősegítjük, maximalizáljuk a következő kapcsolási reakciót. A hasítási és a kapcsolási reakcióban trifluor-ecetsavanhidrid helyett alkalmazhatunk még triklór-ecetsavanhidridet, ecetsavanhidridet, acetil-halogenideket és tozil-anhidridet. Ezek a reagensek ^aC5~C₁₈ kötés Polonovski-típusú hasításával a (Illa) általános képletű vegyületeket adják.

A reakciókörülmények, a reakcióidő és a nyomás hasonló a Polonovski-reakciónál ajánlottakhoz. A Polonovski-reakcióban a tercier és heterociklusos aminok dealkilezését a megfelelő N-oxidok ecetsavanhidriddel vagy acetil-kloriddal történő acilezésével végzik (Merck index, 8. kiadás, 1968, 1203. oldal). A hasítás és a kötési lépéseknél a hőmérséklet változhat -70 °C+40 °C hőmérséklet között, előnyösen -70 °C-(30) °C, különösen előnyösen -60 °C-(-40) °C között. Az N-oxid-származék kialakítását, a hasítási lépést és a kötési lépést elvégezhetjük szabad, nyitott berendezésben, vagy zárt berendezésben inért gáz atmoszférában, így argon vagy egyéb, a periódusos rendszer 0 csoportjába tartozó inért gáz jelenlétében, így például hélium, neon stb. vagy nitrogén jelenlétében. A következő reakciólépésekhez szükséges alacsony hőmérséklet következtében az 1-2. reakciólépések mindegyike néhány perctől néhány napig tarthat. Az 1. reakciólépésben a reakcióidő például 5 perc - néhány óra, a 2., 3. reakciólépésben 10 perc - nénány óra közötti idő.

A találmány szerinti eljárás kapcsolási reakcióinak körülményei előnyösebbek, mint a technika állásából ismert körülmények [4279817 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, Helv. Chim. Acta. 59, 2858 (1976) és Areakcióvázlat], A 2. eljárási lépés szerinti kapcsolásban egy viszonylag instabil dihidropiridínium közbenső tennéket állítunk elő és izolálhatunk, amely az N-oxid-származék és a dihidroindol egység kapcsolásakor keletkezik.

A 2. reakciólépésben a sztereospecifikus kapcsolás során előállított viszonylag instabil indol-dihidro-indol dimer közbenső termék az indol maradék N_b atomján kialakított imínium só. Az instabil dimer vegyületet ezentúl imínium intermedierként nevezzük. Az imínium intermediert (VI) képlet határozza meg.

A 4279817 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban, a technika állása szerinti módon ezt az instabil imínium intermediert alkálifém-bórhidriddel (NaBH₄, KBH₄, LíBH₄) redukálják, és így stabil dimer alkaloidokat kapnak. így például, ha egy (VI) általános képletű imínium intermediert alkálifém-bórhidriddel redukálják, akkor a (VII) általános képlettel jelzett és a Β reakcióvázlat szerint előállított 3’,4’-dihidro-vinblasztint kapják.

A találmány szerinti eljárásban a viszonylag instabil imínium intermediert (VI) képletű vegyület] nem szükséges redukálni és különböző kromatográfiás eljárással izolálhatók. így például az említett imínium intermediert izolálhatjuk, ha a 2. eljárási lépésben kapott reakcióelegyet közvetlenül megfelelő kromatográfiás rendszerbe visszük, így oszlopkromatográfiásan rétegkromatográfiásan vagy túlnyomásos oszlopkromatográfiával, előnyösen fordított fázisú és/vagy kizárásos elválasztási módszerrel elkülönítjük. A művelethez szükséges hőmérséklet-tartomány 4 °C - szobahőmérséklet. Ha a reakcióelegyben az imínium intermedierrel együtt illékony reagensek és oldószerek vannak, akkor ezeket csökkentett nyomáson és hőmérsékleten, előnyösen -10 °C alatti hőmérsékleten és 5 Hgmm alatti nyomáson eltávolítjuk. Az így kapott szilárd vegyületeket [(VI) általános képletű] megfelelő szerves oldószerben, így például halogénezett szénhidrogénben, éterben, alkoholban, acetonitrilben vagy hasonló oldószerekben vagy vizes pufferoldatokban feloldjuk. A pufferoldat pH-ja változhat 2-10 között. Megfelelő vizes pufferoldatok például a foszfát, triszhidrogénklorid, és MES puffer. A (VI) általános képletű imínium intermedier oldatát ezután kromatográfiás módszerrel tisztítjuk. Alternatívaként megemlítjük, hogy az imínium intermedier oldatot közvetlenül is felhasználhatjuk a következő reakciókban.

Az 1. példában bemutatjuk az imínium-intermedier előállítását, amikor is katarantint [(III) általános képletű indolegységben R jelentése COOCH₃] vindolinnel reagáltatunk [(IV) képletű dihidroindol egység].

I. példa (VI) képletű imínium intermedier előállítása módosított Polonovski-reakcióval A reakciót vízmentes körülmények között végezzük. Összes üvegárut 120 °C hőmérsékletű kemencében szárítjuk. Az oldószereket, metilén-kloridot és a kapcsoló reagenst, trifluor-ecetsav-anhidridet, P₂O₅-tel a technika állásából ismert módon desztilláljuk.

mg (0,6 mmól) (III) általános képletű katarantint (R = CO₂CH₃) szárított metilén-kloridban (2 ml) feloldjuk és -20 °C hőmérsékleten argongáz atmoszférában hozzáadunk 132 mg, 0,8 mmól m-klór-perbenzoesavat, és a reakcióelegyet 5 percig keverjük. Az így keletkezett katarantin N-oxidhoz [(Illa), R jelentése -COOCH₃] 1 ml metilén-kloridban oldott 270 mg (0,6 mmól) vindolint [(IV) képletű vegyület] adunk, és

HU 208 829 Β a reakcióelegyet -60 °C hőmérsékletre hűtjük. A -60 °C hőmérsékleten tartott reakcióelegyhez keverünk 0,2 ml, 1,5 mmól, trifluor-ecetsavanhidridet, és az elegyet tovább ezen a hőmérsékleten 2 óráig tartjuk. Ezután az oldószert és a felesleges reagenst vá- 5 kuumban -20 °C hőmérsékleten lehajtjuk. Ily módon megkapjuk a vörösesbarna imínium intermediert. Az intermediert fordított fázisú túlnyomásos oszlopkromatográfiával meghatározzuk (HPLC, Waters Radial-Pak C_]g vagy CN töltet, eluálószer: metanol- 10 H₂O-Et₃N). A (VI) képletű imínium intermedier kitermelés 80%:

Az imínium intermediert [(VI) képlet] (VIII) képletű enaminná alakítjuk, amikor is az imínium intermediert 1,4-dihidropiridinnel a C reakcióvázlat szerinti mó- 15 dón redukáljuk.

Mint ahogy már említettük, az átalakítást elvégezhetjük az imínium intermedier izolálása után, vagy a 2. reakciólépésben kapott reakcióelegy közvetlen kezelésével. A (VI) képletű imínium intermedierből a vin- 20 blasztin és leuorzidin végtermékeket kapjuk. A vinkrisztint úgy kapjuk, hogy a vinblasztint, speciálisan az R[ szubsztituens metilcsoportját oxidáljuk. így például az említett metilcsoportot úgy oxidáljuk, hogy a vinblasztint Jones-reagenssel (CrO₃) acetonban és ecet- 25 savanhidridben nagyon alacsony hőmérsékleten, így -78°-on reagáltatjuk (J. P. Kutney és munkatársai, Heterocycles, 9. kötet, 201. oldal, 1978).

Ha a kiindulási indolegységben a C₃-C₄ kettős kötés van [például katarantin, (III) általános képlet - R = CO- 30 OCH₃], akkor a keletkező intermedier alfa, béta-telítetlen imínium funkciós csoportot tartalmaz, amelyet a (VI) képlettel jelöltünk. Ezt az imínium intermediert a 3. eljárási lépésben alakítjuk át, amikor is 1,4-redukcióval (Vili) képletű enamint kapunk. Ehhez a redukcióhoz a (IX) 35 általános képletű 1,4-dibidropiridin vegyületeket alkalmazzuk - a képletben R,,, R₁₂, R_L3, R_]4, R₁₅ és R,₆ jelentése a fenti. Az ilyen vegyületeket előállíthatjuk az irodalomból ismert módon [Chem. Rév. 82, 232 (1982); Chem. Rév. 72,1 (1972)]. így kapjuk például a Hantzchésztereket, amikor is a (IX) általános képletben R₎₃ és R₁₅jelentése karbonsav-észterek, így például -COOC₂H₅, vagy az N-helyettesített 1,4-dihidro-nikotin-amidokat [(IX) általános képletben R,, jelentése például benzilcsoport és R|₃ jelentése a fenti].

Az 1,4-redukcióban alkalmazott 1,4-dihidro-piridinek közül előnyösek azok a (IX) általános képletű 1,4dibidro-piridinek, amelyek képletében R₁₂, R₁₄, R₁₅ és Ri6 jelentése hidrogénatom, R,, jelentése valamely fenti csoport és R₁₃ jelentése -CN vagy (a’) csoport.

Másik előnyös csoport az 1,4-dihidro-piridinekre az 1,4-dihidro-nikotin-amidok, amelyek képletében R₁₂, R₁₄, R₁₅ és R₁₆ jelentése hidrogénatom, R₁₃ jelentése -CONH₂ és Rj| jelentése valamely fenti csoport.

Különösen előnyösen azokat az 1,4-dihidro-nikotin-amidokat alkalmazzuk a reakcióban, amelyek képletében R,i jelentése sok elektront tartalmazó csoport, így például a fentiek szerint sav-észter és karbonsavsó. Kutatásaink azt bizonyították, hogy ezek a sók elektront tartalmazó funkciós csoporttal rendelkező

1,4-dihidro-nikotin-amidok különösen alkalmasak a pozitív töltésű imínium intermedierekkel [(IV) képlet] végzett reakcióban, mivel fokozzák a térszelektivitást (1,4-redukció túlsúlyban az 1,2-redukcióval) és fokozzák az imínium intermedier [(VI) képlet] redukciójának mértékét. Ily módon a (VIII) képletű enamint nagy kitermelésben kapjuk. Az 1. táblázatban ezekre az előnyös és különösen előnyös 1,4-dihidro-piridinekre speciális példákat sorolunk fel (IX-A- IX-J képletek).

1. táblázat

Képlet	Redukálószer	Eljárás	Redukálószer	Eljárás	Képlet
	• nh₂ N képletű vegyület ft* '		0 * O EtoXzXXoEt MeX^Me	B	IX-B
1X-A	ahol R’	A		D	IX-D
1X-C	ch(c₆h₅)₂	C	CH2C6H5
1X-F	CÜ2Me ‘X	F	iry^C0-^NQ C0NH₂ ch₂c₆h₅	E	IX-E
1X-G	OR” R=Ac	G

HU 208 829 Β

Képlet	Redti kálószer	Eljárás	Redukálószer	Eljárás	Képlet
IX-H	—^OMe	H
IX-I	- MeO2C«^ztcQ₂w_e	I
IX-J	< C0₂ ^eNo? •x	J,K

Az itt felsorolt redukálószereket alkalmazhatjuk önmagukban vagy kombinálva. A redukciót inért atmoszférában, például argongázban vagy a periódusos rendszer nulla csoportjába tartozó gázok, így hélium, neon jelenlétében vagy nitrogéngáz jelenlétében végezzük. A 3. lépésben zajló redukcióhoz különböző oldószert alkalmazhatunk. Megfelelő oldószerek például az alkoholok, acetonitrilek vagy dimetil-szulfoxid, dimetil-formamid, különböző éterek, így dioxán és tetrahidrofurán, klórozott szénhidrogének, amelyeket normálisan, vizes puffer alkalmazása nélkül használunk.

A 3. lépés szerinti redukció lefolyását a reakcióelegy közvetlen analízisével, így például megfelelő kromatográfiás rendszerrel, előnyösen fordított fázisú túlnyomásos oszlopkromatográfiásan ellenőrizzük. Ezt a módszert azért végezzük, hogy a reakció hőmérsékletét, idejét, nyomását és a reagens koncentrációját optimalizáljuk. A reakció hőmérséklete változhat -60+60 °C, előnyösen -60-+20 °C, és különösen előnyösen -60-(-20) °C között. A reakcióidő változhat néhány perctől néhány napig, amely egyéb paraméterektől függ.

A következő kiviteli példákat (2-12. példa, A-K eljárás) az enamin szintézisének bemutatására közöljük. A reakcióban imínium intermediert az 1. táblázatban közölt redukálószerekkel a C) reakcióvázlat szerint reagáltatjuk. A példákban a „(VI) képletű imínium intermedier”-ként az 1. példa szerint előállított imíniumvegyületet alkalmaztuk.

2. példa

Imínium-intermedier redukálása 1-Benzil-l,4dlhidro-nlkotinamiddal [(IX) képlet, R_u = benzil, R₁₂, /?i4, Nis és R_i6 = H; R_n = CONHy, [(IX-A) képlet, A eljárás] ml gáztalanított acetonitrilben feloldunk 100 mg (VI) képletű imínium-intermediert, az oldatot keverjük, és hozzáadunk argongáz atmoszférában (nagyobb, mint 760 Hgmm) szobahőmérsékleten (20 °C) 5 óra alatt 135 mg, 0,63 mmól, 6 mól ekvivalensnyi l-benzil-l,4-dihidro-nikotinamidot. Ezután a reakcióelegyet HPLC-n fordított fázisú tölteten (Waters Radial-Pak C_lg vagy CN töltet, metanol/víz/Et₃N eluens) ellenőrizzük, majd a (VI) képletű vegyület teljes átalakulása után megkapjuk a (VIII) képletű enamin és a (VII) képletű 3’,4’-dehidrovinblasztin 1 :

arányú elegyét.

Kitermelés: 75%.

3. példa

Imínium-intermedier redukálása 1-Benzil-l,4dihidro-nikotinamiddal [(IX) képlet, R_n = benzil,

R12, λ 14, ^15 és R_l6 = H; R₁₃ = C0NH₂ (IX-A) képlet, A eljárás] ml metanolban feloldunk 100 mg (VI) általános képletű imínium-intermediert, és az oldatot keverjük, majd kezdetben 0 °C hőmérsékleten tartjuk fél órán keresztül, és cseppenként, kis adagokban hozzáadunk ml metanolban oldott 56 mg, 0,26 mmól 2,5 mól ekvivalensnyi l-benzil-l,4-dihidronikotinamidot. Az adagolást argongáz atmoszférában (760 Hgmm feletti) és 5 óra alatt végezzük. Ez idő alatt hagyjuk, hogy a reakcióoldat szobahőmérsékletre melegedjen. A reakcióoldatot HPLC-vel ellenőrizzük az 1. példa szerinti módon, és a (VI) képletű vegyület teljes átalakulása után megkapjuk a (VIII) képletű enamin és a (VII) képletű 3’,4’-dehidrovinblasztin 1: 1 arányú elegyét.

4. példa

A 2. példában kapott (VIII) képletű enamin és (VII) képletű 3’,4’-dehidro-vinblasztin elegyét 0 °C hőmérsékleten 500 mg feleslegben lévő nátrium-bórhidriddel kezeljük. A reakcióelegyet ammónium-hidroxid oldattal meglúgosítjuk, majd etil-acetáttal (háromszor 200 ml) extraháljuk. Az összeöntött szerves fázisokat magnézium-szulfáttal víztelenítjük. Az így kapott termékről a szerves oldószert eltávolítjuk, majd a maradékot szilikagélen preparatív rétegkromatográfiásan eluáljuk (eluálószer: metanol/etil-acetát), a kromatográfiás vizsgálat alapján a termék el nem reagált (VII) képletű 3’,4’-dehidro-vinblasztin, és az ismert 4’-deoxo-vinblasztin [(X) általános képlet, R = -COOCH₃] és 4’-deoxo-4’-epivinblasztin [(XI) általános képlet, R = -COOCH₃] elegye. Ez utóbbi vegyületek jelenléte egyértelmű bizonyíték a (VIII) képletű enamin szerkezetére.

HU 208 829 Β

5. példa

A 4. példa szerinti eljárást megismételjük, azzal a megkötéssel, hogy a 3. példában kapott reakcióelegyet a 2. példában kapott elegy helyett nátrium-bórhidrid felesleggel kezeljük. A termék vizsgálatából ismét kiderül, hogy el nem reagált (VII) képletű 3’,4’-dehidrovinblasztin és ismert (X) általános képletű (R = -COOCH3) 4’-deoxo-vinblasztin vegyület és (XI) általános képletű (R =-COOCH3) 4’-deoxo-4’-epivinblasztin elegye. Az utolsó vegyületek jelenléte a (VIII) képletű enamin szerkezetre egyértelmű bizonyíték.

6. példa

Imínium-intermedier redukálása 3,5-Dietoxi-karbonil-2,6-dimetil-4-fenil-l ,4-dihidro-piridinnel [(IX) általános képlet, R_n = H; R_l3 és R_l5 = -COOCH₂CH₃; R_l2 és R_i6 = -CH₃; K₁₄ = fenil [(IX-B) képlet, B eljárás] ml gáztalanított acetonitrilben feloldunk 100 mg (VI) képletű intermediert. Az oldatot keverjük, majd hozzáadunk 12 ml etanolban oldott 264 mg, 8 ekvivalensnyi 3,5-dietoxi-karbonil-2,6-dimetil-4-fenil-l,4dihidropiridint. Az adagolást argongáz atmoszférában (760 Hgmm feletti) és -20-40 °C közötti hőmérsékleten végezzük. A reakcióelegyet 3 órán keresztül visszafolyó hűtő alatt forraljuk, majd fordított fázisú oszlopkromatográfiásan ellenőrizzük. A termék többek között tartalmazza (VIII) képletű enanim és a (VII) képletű 3’,4’-dehidrovinblasztin 1: 1 arányú elegyét (60% kitermelés).

7. példa

Imínium-intermedier redukálása difenil-metil-1,4dihidro-nikotinamiddal [(IX) általános képlet, R_x= difenil-metil; R₂, R_it R₅ és = H; R₃ = -CONH₂; (IX-C) képlet, C eljárás] ml gáztalanított etanolban feloldunk 100 mg (VI) általános képletű imínium-intermediert, az oldatot keverjük, majd hozzáadunk argongáz atmoszférában (760 Hgmm feletti) és 20 °C hőmérsékleten 6 ml metanolban oldott 76 mg, 2,5 mól ekvivalensnyi 1-difenilmetil-1,4-dihidro-nikotinamidot [(IX-C) képlet]. Az adagolásnál minden 60 percben 1 mól ekvivalensnyi mennyiségű redukálószert teszünk az elegybe. Ezután a reakcióelegyet HPLC-vel ellenőrizzük (Waters Radial-Pak C,₈ vagy CN töltet, metanol-H₂0-Et₃N eluens), ily módon a (VIII) képletű enamin és a (VII) képletű 3’,4’-dehidrovinblasztin 0,9 : 1 arányú elegyét kapjuk.

Kitermelés: 60%.

8. példa

Imínium-intermedier redukálása l-benzil-3-ciano1,4-dihidro-piridinnel [(IX) általános képlet, R^ = benzil; R_l2, R_u, R_l5 és R^- H; R_l3 = -CN; (IXD) képlet, D eljárás] ml gáztalanított metanolban feloldunk 100 mg imínium-intermediert [(VI) képlet], az oldatot keverjük, majd argongáz atmoszférában (nagyobb, mint 760 Hgmm) 20 °C hőmérsékleten hozzáadunk 10 ml metanolban oldott 206 mg 10 mól ekvivalensnyi 1benzil-3-ciano-l,4-dihidropiridnt [(IX-D) képlet]. A redukálószer adagolását 60 percenként 1 mól ekvivalens mennyiségben végezzük. Ezután a reakcióelegyet HPLC-vel ellenőrizzük, így a (VIII) képletű enamin és a (VII) képletű 3’,4’-dehidrovinblasztin 1: 1 arányú elegyét kapjuk.

Kitermelés: 40%.

9. példa

Imínium-intermedier redukálása I-benzil-1,4dihidro-nikotinil-(2’-karbamoiTpirrolidinil)-amiddal [(IX) általános képlet, = benzil; R₂, R$, ifi és Rf, = H; R₃ = (2’-karbamoiTpirrolldinll)-karbonil; (IX-E) képlet, E eljárás] ml gáztalanított metanolban feloldunk 100 mg imínium-intermediert [(VI) képlet], az oldatot keverjük, majd hozzáadunk argongáz atmoszférában (760 Hgmm feletti nyomás) 20 °C hőmérsékleten 163 mg 5 mól ekvivalensnyi 1-benzil-1,4-dihidro-nikotinil-(2’-karbamoil-pirrolidinil)-amidot [(IX-E) képlet]. A redukálószer adagolását 30 percenként 1 mól ekvivalens mennyiségben végezzük. Ezután a reakcióelegyet HPLC-vel ellenőrizzük, ily módon (VIII) képletű enamin és (VII) képletű 3’,4’-dehidrovinblasztin 1,1 : 1 arányú elegyét kapjuk.

Kitermelés: 60%.

10. példa

Imínium-intermedier redukálása 1,4-dihidro-l-(lmetoxi-karbonil-izobutll-nikotinamiddal [(IX) általános képlet, R\\ = l-metoxi-karbonil-izobutll;

R_l2, R_u, R_l5 és R_i6 = H; R_l3 = -C0NH₂; (IX-F) képlet, F eljárás] ml gáztalanított metanolban feloldunk 100 mg imínium-intermediert [(VI) képlet], az elegyet keverjük, majd argongáz atmoszférában (760 Hgmm feletti nyomás), és 20 °C hőmérsékleten hozzáadunk 6 ml metanolban oldott 150 mg 6 mól ekvivalensnyi 1,4dihidro-l-(l-metoxi-karbonil-izobutil)-nikotinamidot [(IX-F) képlet]. A redukálószert kis adagokban adagoljuk 30 perceként 1 ekvivalensnyi mennyiségben. Ezután a reakcióelegyet fordított fázisú oszlopkromatográfiával ellenőrizzük, ily módon 2: 1 arányban (VIII) képletű enamint és (VII) képletű 3’,4’-dehidrovinblasztint kapunk.

Kitermelés: 65%.

11. példa

Imínium-intermedier redukálása 1 -(2’,3’,4’,6'-tetraacetil-(béta)-D-glukopiranozidÍl)-l,4-dihidronikotinamiddal [(IX) általános képlet, R,_A = (2 ’ ,3 ’ ,4’ ,6'-tetraacetil-(béta)-D-glukopiranozidil;

R12, /? _l4, /?₁₅ és R_l6 = H; R_l3= -C0NH₂; (IX-G) képlet. G eljárás] ml gáztalanított metanolban feloldunk 100 mg imínium-intermediert [(VI) képlet], az oldatot keverjük, majd hozzáadunk argongáz atmoszférában (760 Hgmm feletti nyomás) és 20 °C hőmérsékleten 10 ml metanolban oldott 238 mg 5 mól ekvivalensnyi

HU 208 829 Β l-(2’,-3’,4’,-6’-tetraacetil-(béta)-D-gIikopiranozidil)1,4-dihidro-nikotinamidot [IX-G képlet], A redukálószer adagolását 60 percenként 1 ekvivalens mennyiségben végezzük. Ezután a reakcióelegyet fordított fázisú HPLCvel ellenőrizzük, és így 1,5 : 1 arányban (Vili) képletű enamint és 3’,4’-dehidrovinblasztint kapunk.

Kitermelés: 70%.

12. példa

Imínium-intermedier redukálása 1,4-dihidro-l-(2’ metoxi-karbonil-lzopropil)-nikotinamiddal [(IX) általánosképlet, /?n = 2’-metoxi-karbonil-izopropil; /?_l2, Rh, Λ|5 és tf₁₆ = H;R_l3 = -C0NH₂; (IX-H) képlet, H eljárás] ml gáztalanított metanolban feloldunk 100 mg (VI) képletű imínium-íntermediert. Az oldatot keverjük, majd argongáz atmoszférában (760 Hgmm feletti nyomáson) és 20 °C hőmérsékleten hozzáadunk 7 ml metanolban oldott 82 mg 3,5 mól ekvivalensnyi 1,4dihidro-l-(2’-metoxi-karbonil-izopiOpil)-nikonamidot [(IX-H) képlet], A redukálószer adagolását 30 percenként 1 mól ekvivalens mennyiségben végezzük. Ezután a reakcióelegyet fordított fázisú HPLC-vel ellenőrizzük, így 1,1 = 1 arányban (VIII) képletű enamint és (VII) képletű 3’,4’-dehidrovinblasztint kapunk. Kitermelés: 65%.

13. példa

Imínium-intermedier redukálása 1,4-dihidro-1(r2’dímetoxi-karbonil-etil)-nikotinamiddal [(IX) általános képlet, Λ,, = Γ,2’-dimetoxi-karboníletil; R_l2, R_u, R_í5 és R_í6 = H; R,₃ = -CONH₂;

(IX-l) képlet, I eljárás] ml gáztalanított metanolban feloldunk 100 mg imínium-intermediert [(VI) képlet], és az oldatot keverjük, majd hozzáadunk argongáz atmoszférában (760 Hgmm feletti nyomás) 20 °C hőmérsékleten 10 ml metanolban oldott 148 mg, 5 mól ekvivalensnyi 1,4-dihidro-1-(1 ’2’dimetoxi-karbonil-etil)-nikotinamidot [(IX-I) képlet], a redukálószer adagolását 30 percenként 1 mól ekvivalensnyi mennyiségben végezzük. Ezután a reakcióelegyet fordított fázisú HPLC-vel ellenőrizzük, így 1,1:1 arányban (VIII) képletű enamint és 3’,4’-dehidrovinblasztint [(VII) képlet] kapunk.

Kitermelés: 70%.

14. példa

Imínium-intermedier redukálása 1,4-dihidro-l (nátrium-izobutil-l-karboxilát)-nikotinamiddal [(IX) általános képlet, R,, = nátrium-izobutil-Ikarboxilat; R]₂, R\a, R]$ R[f, ^{= 77,1} ~

-C0NH₂; (IX-J) képlet, J eljárás] ml gáztalanított metanolban feloldunk 100 ml imínium-intermediert [(VI) képlet], az oldatot keverjük, majd argongáz atmoszférában (760 Hgmm feletti nyomás) 20 °C hőmérsékleten 6 ml metanolban oldott 130 mg 5 mól ekvivalensnyi 1,4-dihidro-l-(nátriumizobutil-l-karboxilát)-nikotinamidot [(IX-J) képlet] hozzáadunk. A redukálószer adagolását 30 percenként 1 mól ekvivalensnyi mennyiségben végezzük. Ezután a reakcióelegyet fordított fázisú HPLC-vel ellenőrizzük, így 2,2: 1 arányban enamint [(VIII) képlet] és 3’,4’dehidrovinblasztint [(VII) képlet] kapunk.

Kitermelés: 70%.

15. példa

Imínium-intermedier redukálása 1,4-dihidro-1(nátrium-izobutil-l-karboxilát)-nlkotinamiddal [(IX) általános képlet, R,·. = nátrium-izobutil-1karboxllát; Ri₂, R,₄, R_I5 és R_](í = H; R_l3 = -C0NH₂; (IX-J) képlet, alacsony hőmérsékleten K eljárás] ml gáztalanított metanolban feloldunk 100 mg imínium-intermediert [(VI) képlet], az oldatot keverjük -20 °C hőmérsékleten, majd argongáz atmoszférában (760 Hgmm feletti nyomás) 6 ml metanolban oldott 155 mg 6 mól ekvivalensnyi 1,4-dihidro-l-(nátriumizobutil-l-karboxilát)-nikotinamidot adunk [IX-J) képlet], A redukálószert egy adagban adjuk az elegybe. 45 perc múlva ugyanezen a hőmérsékleten fordított fázisú HPLC analízist végzünk ily módon megállapítjuk, hogy 3,2 = 1 arányban (VIII) képletű enamint és (VII) képletű 3’,4’-dehidrovinblasztint kapunk. Kitermelés: 80%.

16. példa

A 15. példa szerinti eljárást megismételjük, azzal az eltéréssel, hogy a reakciót -40 °C hőmérsékleten végezzük. 60 perc múlva 4,2 : 1 arányban megkapjuk a (VIII) képletű enamin és a (VII) képletű 3’,4’-dehidrovinblasztint.

Kitermelés: 85%.

Az ily módon elvégzett eljárást L eljárásnak jelezzük.

A 2. és 3. táblázatban összefoglaljuk a 2-16. példák eredményeit.

2. táblázat

A redukálószemek a (VI) képletű imínium 1,4- és 1,2-redukciójára kifejtett hatása

Példa száma	Redukálási eljárás	1,4: 1,2-redukciós termék¹	Hozam² (%)
2; 3.	A	1 : 1	75
6.	B	1 : 1	60
7.	C	0,9: 1	60
8.	D	1 : 1	40
9.	E	1,1 : 1	60
10.	F	2: 1	65
11.	G	1,5: 1	70
12.	H	1,1 : 1	65
13.	I	2,3: 1	70
14.	J	2,2: 1	70
15.	K	3,2: 1	80
16.	L	4,2: 1	85

1. A fordított HPLC mennyiségi kiértékelése

2. A (VII) képletű 3,4-dehidrovinblasztin 1,2- és a (VIII) képletű enamin 1,4-redukálási termékeinek összege

HU 208 829 Β

3. táblázat

A hőmérséklet hatása a (VI) képletű 1,4- és 1,2-redukciójára

Példa száma	Redukálási eljárás	Hőmérséklet (°C)	1,4: 1,2-redukciós termék¹	Hozam² (%)
14.	J	+20	2,2: 1	70
15.	K	-20	3,2: 1	80
16.	L	-40	4,2: 1	85

1. HPLC-vel végzett mennyiségi kiértékelés

A 2. táblázatból kiderül, hogy azok a redukáló eljárások (I és J eljárások, 13. és 14. példák), amelyekben a (IX—I) és (IX-J) képletű redukálószereket alkalmaztuk, 20 °C hőmérsékleten a legjobb enamin kitermelést adják [(VIII) képletű vegyület]. A 3. táblázatban a hőmérséklet függvényt adtunk meg, amikor a (VI) képletű imínium intermedier reakciójához (IX-J) képletű redukálószert alkalmaztunk. A 3. táblázatból kitűnik, hogyha a redukció hőmérsékletét 20 °C-ról (15. példa, K eljárás) -40 °C-ra csökkentjük (16. példa, Leijárás), akkor az 1,4-redukálási terméknek az 1,2-redukálási termékhez viszonyított aránya nő, valamint a teljes kitermelésben is növekedés tapasztalható. A J eljárással kapott eredmények (kevesebb kitermelés, és kevesebb az 1,4-redukálási termék) megegyeznek a K és L eljárásoknál kapott eredményekkel, bár a J eljárásban csak 5 mól ekvivalensnyi redukálószert alkalmaztunk, ellentétben a K és L eljárásokkal, ahol a redukálószer mennyisége 6 mól ekvivalensnyi volt.

Összefoglalva, a (VIII) képletű enamin kitermelést növelhetjük, ha a (VI) képletű imínium-intermeider

1,4-redukciójában olyan (IX) általános képletű 1,4dihidro-piridint alkalmazunk, amely képletben R, jelentése sok elektront tartalmazó csoport, így például karbonilsav-észter és karbonsav-só. A redukciót a legjobb zárt berendezésben végezni inért körülmények között, például argongáz atmoszférában, és alacsony hőmérsékleten, így például -60 °C -+60 °C, előnyösen -60 °C -+20 °C, legelőnyösebben -60 °C-(-20) °C hőmérséklet-tartományban.

A 3. lépésben kapott (VIII) képletű enamint közvetlenül felhasználhatjuk a következő reakcióban, vagy különböző kromatográfiás technikával izolálhatjuk, így például az enamint izolálhatjuk, ha a 3. lépésben kapott reakcióelegyet közvetlenül megfelelő kromatográfiás rendszerbe visszük, így oszlopkromatográfiával, rétegkromatográfiával vagy HPLC rendszerrel izoláljuk. Előnyös a fordított fázisú és/vagy gélkromatográfiás szeparálás, az izolálásnál alkalmazott hőmérsékleti tartomány 4 °C-szobahőmérséklet. Alternatívként megemlítjük, hogyha a reakcióelegyben illékony reagens és oldószer van, akkor ezeket csökkentett nyomáson és hőmérsékleten, előnyösen -10 °C alatti hőmérsékleten eltávolítjuk. A keletkezett maradékot kromatográfiás módszertel az előzőek szerinti módon tisztítjuk, mielőtt tovább vizsgálnánk vagy átalakítanánk.

Ha a (VIII) képletű enamint ismert eljárásokkal alkálifém bórhidriddel (NaBH₄, KBH₄, LiBH₄) kezeljük, megkapjuk a (X) képletű (R = COOCH₃) 4’-deoxo-vinblasztinokat, és a (XI) képletű 4’-deoxo-4’-epivinblasztinokat.

A 4. eljárási lépésben alkalmazott oxidációs körülmények között a (VIII) képletű enamin (XVI) és (XVIa) képlettel jellemzett második imínium-intermedierré alakul.

A (VIII) képletű enaminnak a (XVI) és (XVIa) képletű második imínium-intermedierré alakításához szükséges oxidációs eljárás a következő:

i) szabályozott levegőztetés/oxigénellátás ii) flavin koenzim adagolás [(XII) képlet]: [riboflavin, (XII) képlet, R = H; flavin mononukleotid (FMN), (XII) képlet, R = PO₃ ²~; flavin adenin dinukleotid (FAD), (XII) képlet, R = (P0₃)₂-adenozin), ezután szabályozott le vegőztetés/ox igénél látás;

iii) a flavin koenzim redukált formájának [(XIII) képlet) adagolása dihidro-riboflavin, (XIII) képlet, R = H; dihidroflavin, mononukleotid (FMNH₂), (XIII) képlet, R = PO₃ ^2-; dihidro-flavin adenin dinukleotid (FADH₂); (XIII) képlet, R = (PO₃)²-adenozin], ezután szabályozott levegőztetés/oxigénellátás;

iv) a (XII) képletű flavin koenzim adagolása, így előállítjuk in situ módon a (XIII) képletű megfelelő

1,5-dihidroflavin koenzimet, majd ellenőrzött levegőztetés/oxigénellátás;

v) a (XIV) képletű izo-alloxazin szerkezetű flavin koenzim adagolása - a képletben R,, R₂ és R₃ függetlenül jelentik az alkilcsoportot, helyettesített alkilcsoportot, arilcsoportot és helyettesített árucsoportot; majd szabályozott levegőztetés/oxigénellátás;

vi) (XV) képletű koenzim redukált formájának (1,5-dihidro) adagolása - a képletben R,, R₂ és R₃függetlenül jelentik az alkilcsoportot, helyettesített alkilcsoportot, arilcsoportot és helyettesített arilcsoportot, majd ellenőrzött levegőztetés/oxigénellátás;

vii) hidrogén-peroxid és/vagy R-OOH képletű hidrogén-peroxidok adagolása - a képletben R jelentése alkilcsoport, helyettesített alkilcsoport, arilcsoport vagy helyettesített arilcsoport;

viii) R-CO₃H képletű persavak adagolása - a képletben R jelentése alkilcsoport, helyettesített alkilcsoport, arilcsoport vagy helyettesített arilcsoport;

ix) szuperoxidok adagolása,

x) hidroxilgyök adagolás (amelyet különböző módon állítunk elő, például vasionok jelenlétében hidrogén-peroxidot alkalmazunk) vagy xi) jó elektroakceptor tulajdonságú fémion adagolás, így például vasion (Fe⁺⁺⁺), réz ion (Cu⁺), higany ion (Hg₂ ⁺⁺⁺) és ezüstion (Ag⁺); szabályozott levegőztetés/oxigénellátás.

Az i) és az v)-x) oxidációs eljárásokat szerves oldószerben, például alkoholban, acetonitrilben, dimetilszulfoxidban, dimetil-formamidban, különböző éterben, például dioxánban, tetrahidrofuránban és aromás szénhidrogénekben, így benzolban, toluolban végezzük.

HU 208 829 Β

A flavin koenzim felhasználásával zajló oxidációs eljárásokhoz (ii), (iii) és (iv) vizes puffer, (például trisz HC1, MES puffer) szükséges, amelynek pH-ja 5-9, előnyösen 6-8. Szerves segédoldószet is alkalmazhatunk, így például alkoholt, acetonitrilt, dioxánt, tetrahidrofuránt, dimetil-szulfoxidot vagy dimetilformamidot.

Az oxidációs eljárás lefolyását a reakcióelegy közvetlen analízisével ellenőrizzük, így például megfelelő kromatográfiás rendszert alkalmazunk, előnyösen fordított fázisú HPLC-t. Ezt a módszert azért alkalmazzuk, hogy a reakció hőmérsékletét, a reakcióidőt, a nyomást és a reagensek koncentrációját optimalizáljuk, A reakció-hőmérséklet -60+60 °C, előnyösen 4 °C-szobahőmérséklet között változik. A reakcióidő változhat néhány perctől néhány napig, attól függően, hogy például milyen a reakció-hőmérséklet és milyen az oxidációs körülmény. A reakciót általában atmoszferikus nyomáson végezzük.

Az eljárás egy alternatív változataként megemlítjük, hogy a (VI) képletű imínium-intermedier 1,4redukciójával kapott enamin oldatot a redukcióban alkalmazott oldószerrel 5-50-szeresre hígítjuk, miközben a hőmérséklet 0-(-70) °C. A hígított enamin oldatot ezután a 4. lépésben oxidáljuk, így megkapjuk az egyik előzőekben leírt oxidációs eljárással a második imínium-intermediert [(XVI) és (XVIa) képletű vegyületek].

A találmány szerinti eljárásban előnyös oxidációs eljárások a következők:

a) levegőztetés/oxigénellátás, amikor is az enamin oldatot nyitott berendezésben keverjük, miközben levegő/oxigént buborékoltatunk keresztül az elegyen;

b) az a) lépés szerinti eljárás, azzal a különbséggel, hogy vas-kloridot adagolunk;

c) az a) lépés szerinti eljárás, azzal a különbséggel, hogy (XII) képletű flavin-koenzimet adagolunk, így in situ módon a megfelelő (XIII) képletű 1,5-dehidro-flavin-koenzimet termeljük, vagy

d) az a) eljárás, azzal a különbséggel, hogy hidrogén-peroxidot és/vagy R-OOH képletű hidro-peroxid vegyületeket adagolunk - a képletben R jelentése alkilcsoport vagy arilcsoport.

Az oxidációs eljárásokat szerves oldószerben végezzük, így alkoholban, acetonitrilben, dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban, éterben, így dioxánban, tetrahidrofuránban, aromás szénhidrogénben, így benzolban, toluolban. Segédoldószerként alkalmazhatunk 5-9 pH-jú, előnyösen 6-8 pH-jú vizes puffért, így foszfátot, trisz-hidrokloridot, MES puffért. A reakció hőmérséklete változhat -60 °C+60 °C között.

A 4. oxidációs átalakításhoz szükséges különböző paramétereket vizsgáltuk, ily módon optimalizáltuk a célvegyület, különösen az (I) képletű vinblasztin kitermelését.

Vizsgálataink eredményét a 4-7. táblázatokban közöljük.

4. táblázat

Vas-klorid hatása (VIII) képletű enaminból³ történő vinblasztin előállítására

FeClj mól ekvivalensnyi mennyisége	Oxidációs körülmények (hőmérséklet, idő)	Vinblasztin²kitermelése (%)
0	Air¹, 0 °C, 5 perc	0
1	Air¹, 0 °C, 5 perc	13,3
2	Air¹, 0 °C, 5 perc	19,0
3	Air¹, 0 °C, 5 perc	10,4

1. 60 ml/perc áramlási sebességű levegő

2. fordított fázisú, kvantitatív HPLC meghatározás az NaBH₄redukció után.

3. L eljárással -40 °C-on előállított (Vili) képletű enamin

5. táblázat

Az oxidációs idő hatása a (VIII) képletű enaminból³előállított vinblasztin kitermelésre

idő¹ (perc)	%-os vinblasztin² kitermelés
1	8,2
5	15,4
10	15,5
15	15,7
45	6,5

1. reakciókörülmények: 2 mól ekvivalens vas-klorid adagolás, az oldaton 0 °C-on 60 ml/perc áramlási sebességgel levegő átbuborékoltatás

2. NaBH₄ redukció után fordított fázisú kvantitatív HPLC meghatározás

3. L eljárással -40 °C-on előállított (VIII) képletű enamin

6. táblázat

Az oxidációs hőmérséklet hatása (VIII) képletű enaminból³ előállított vinblasztin kitermelésre

hőmérséklet, ”C'	vinblasztin² %-os kitermelése
-40	3,7
-23	6,2
0	19,6
20	20,6
45	16,0

1. reakciókörülmények: 2 mól ekvivalens vas-klorid adagolása, levegő átbuborékoltatása az oldaton: idő 15 perc, áramlási sebesség: 60 ml/perc

2. NaBH₄ redukció után fordított fázisú kvantitatív HPLC meghatározás

3. L eljárással -40 °C-on előállított enamin

HU 208 829 Β

7. táblázat

A hígítás hatása a (VIII) képletű enaminból³ előállított vinblasztin kitermelésére

Hígítási faktor’·⁴	vinblasztin² %-os kitermelése
1	19,6
5	25,2
10	30,1
20	29,6
50	24,7

1. reakciókörülmények: 2 mólekvivalens vas-klorid adagolása, levegő átbuborékoltatás 15 percig 60 ml/perc áramlási sebességgel 0 °C-on

2. NaBH₄ redukció után fordított fázisú kvantitatív HPLC meghatározás

3. L eljárással -40 °C-on előállított enamin

4. hígítási faktor 1 - 6 ml metanolban oldott 100 mg (VI) kcplclű imínium, amelyhez 6 ml metanolban oldott 6 mól ekvivalensnyi (IX-J) képletű redukálószert adunk (ossz. térf. = 12 ml) hígítási faktor 5 » össz. térf. 60 ml, hígítási faktor 10 = össz. térf. 120 ml, hígítási faktor 20 = össz. térf. 240 ml, hígítási faktor 50 = össz. térf. 600 ml.

A 4. táblázatból kiderül, hogy az (I) általános képletű vinblasztin kitermelését a vas-klorid koncentrációjának növekedése először növeli, majd csökkenti. Maximális vinblasztin kitermelést érünk el, hogyha a vasklorid koncentrációja 2 mól ekvivalensnyi.

Az 5. táblázatból kiderül, hogy az oxidálási időnek milyen hatása van az (I) általános képletű vinblasztin kitermelésére, ezek alapján maximális kitermelést érhetünk el, ha 2 mól ekvivalensnyi vas-klorid jelenlétében 5-15 percig végezzük a levegőztetést, és a kitermelésjelentősen csökken, ha az oxidálási idő 45 perc.

A 6. táblázatban megadtuk a különböző oxidálási hőmérsékletek hatását az (I) általános képletű vinblasztin kitermelésére. Az eredmények alapján NaBH₄ redukálás után fordított fázisú HPLC-vel végzett mennyiségi meghatározással a legnagyobb (I) általános képletű vinblasztin kitermelést érjük el 0-20 °C hőmérsékleten,

A 7. táblázatban megadtuk a (VIII) képletű enaminból készített oldat hígításának hatását az (I) általános képletű vinblasztin kitermelésre. A redukciót NaBH₄-gyel, majd ezután a mennyiségi kiértékelést fordított fázisú HPLC-vel végezzük, akkor 0 °C hőmérsékleten és 2 mól ekvivalensnyi vas-klorid jelenlétében történő levegőztetés előtt a (VIII) képletű enamin oldatot 5-20-szorosára kell hígítani, így a legjobb (I) általános képletű vinblasztin kitermelést kapjuk.

A 4-7. táblázatokban megadott eredmények összefoglalásaként megállapíthatjuk, hogy a 4. lépésben történő oxidációs átalakításban a (VI) képletű imíniumintermedier 3. lépésében zajló 1,4-redukálásakor kapott enamin oldatot a redukcióban alkalmazott oldószerrel, előnyösen 5-20-szorosra kell hígítani, különösen előnyösen 10-szeresre (8-12-szeres hígítás). A hígítási eljárást alacsony hőmérsékleten [0-(-70) °C hőmérsékleten, előnyösen -40 °C alatti hőmérsékleten] és zárt berendezésben, így argongáz atmoszférában végezzük. Az enamin oxidációs átalakítása kedvező, ha a következő paramétereket alkalmazzuk:

1. levegőztetés áramlási sebesség 60 ml/perc, és az idő 5-20 perc, és előnyösen 15 perc;

2. a hőmérséklet-tartomány 0-20 °C, előnyösen 20 °C;

3. 2 mól ekvivalensnyi vas-klorid jelenlétében, így a megfelelő második imínium-intermediert kapjuk (XVI és XVIa) képletű vegyületek.

Az 5. lépésben a második imínium-intermediert [(XVI) és (XVIa) képletű vegyületek] alkáli fém-bórhidriddel (NaBH₄, KBH₄, LiBH₇) redukáljuk, így a vinblasztin és leuorzidin célvegyületeket kapjuk, valamint a következő melléktermékeket: (VII) képletű 3’,4’-dehidrovinblasztin, (XVII) képletű leuorzin, (XVIII) képletű katarin, (XIX) képletű vinamidin és (XX) képletű vinamidin redukálási terméke.

A redukciót megfelelő oldószerben (szerves és szervetlen) végezzük, így például a 4. oxidációs átalakításban alkalmazott oldószerekben. A redukciót alacsony hőmérsékleten, -20 °C-+4 °C hőmérsékleten, előnyösen 0 °C-on végezzük, az oldat pH-ja 8,5-nél alacsonyabb, előnyösen 7,5-8. Ezután az egész reakcióelegyet vákuumban alacsony hőmérsékleten, 010 °C hőmérsékleten töményíthetjük, mielőtt extraháljuk, és a célvegyületet izoláljuk.

A következő 17-21. példákban (1-5. módszerek) a vinblasztin előállítását írjuk le, amelyben (VIII) képletű enamint oxidáljuk.

17. példa (Vili) képletű enamint (XVI) képletű imínium-intermedierré oxidáljuk flavin mononukleotid jFMN (XII) képlet, R = POffij felhasználásával, 1. módszer, így előállítjuk a vinblasztint A 2. példa szerint A) eljárással kapott (VI) képletű imínium-intermedierből előállított reakcióelegyet [amely még 100 mg (VIII) képletű enamint tartalmaz] keverjük, majd hozzáadunk argongáz atmoszférában (760 Hgmm feletti nyomás) 2 ml trisz-HCl pufferban oldott 80 mg, 1 mól ekvivalensnyi FMN-t. Az oldószert sötétben szobahőmérsékleten (20 °C) 16 órán keresztül állni hagyjuk, ezután argongáz atmoszféra helyett levegőt alkalmazunk, és a reakcióelegyet 2,5 órán keresztül keverjük. Fordított fázisú HPLC analízis alapján megállapítjuk, hogy a (VIII) képletű enamin a (XVI) általános képletű intermedierré alakult [R(O₂CH₃)], valamint egyéb melléktermékek is keletkeztek. Ezután 0 °C hőmérsékleten 500 mg nátrium-bórhidridet adunk az elegybe, és az elegyet ammóniumhidroxid oldattal meglúgosítjuk, majd etil-acetáttal (háromszor 200 ml) extraháljuk. Az összeöntött szerves fázisokat vízmentes magnézium-szulfáttal víztelenítjük, és az oldószert vákuumban elpárologtatjuk, így 85 mg nyersterméket kapunk. A nyersterméket vékonyréteg-kromatográfiásan tisztítjuk [szilikagél, metanol; etil-acetát (1 : 5], így a következő dimer termékeket kapjuk: vinblasztin [(I) általános képlet, 22 mg,

HU 208 829 Β

23%]; 3’,4’-dehidrovinblasztin [(VII) képlet, 16 mg, 17%)]; leuorzin [(XVII) képlet, 8 mg, 9%], katarin [(XVIII) képlet, 7 mg, 7,5%]; vinamidin [(XIX) képlet, 5 mg, 5,6%] és vinamidin redukált formája [(XX) képlet, 19 mg, 20%].

18. példa

Vinblasztin előállítása enamin [(Vili) képlet] hidrogén-peroxiddal (XVI) általános képletű imíniumintermedierré való oxidálásával (2. módszer)

A 2. példa szerint A eljárással (VI) képletű imínium-intermedierből 100 mg (VIII) képletű enamint tartalmazó oldatot állítunk elő, majd az oldathoz adunk inért argongáz atmoszférában 30%-os 1,2 ml 95 mól ekvivalensnyi hidrogén-peroxidot. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 5,5 órán keresztül keverjük, majd fordított fázisú analízis alapján megállapítjuk a teljes (VIII) képletű enamin átalakulását. A reakcióelegyhez adunk 0 °C hőmérsékleten 500 mg nátrium-bórhidridet, és az így kapott oldatot háromszor 200 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az összeöntött szerves fázist vízmentes magnézium-szulfáttal víztelenítjük, majd az oldószert vákuumban elpárologtatjuk. Ily módon kapott termékelegyet vékonyréteg-kromatográfiásan, szilikagélen, metanol/etil-acetáttal elválasztjuk, és így a következő dimer alkaloidokat kapjuk: vinblasztin [(I) általános képlet, 4 mg, 4%], 3’,4’-dehidrovinblasztin [(VII) képlet, 5 mg, 4,8%], leuorzin [(XVII) képlet, 13 mg, 12,5%], katarin [(XVIII) képlet, 5 mg, 4,8%], vinamidin redukált formája [(XX) képlet, 30 mg, 27,6%].

19. példa

Vinblasztin előállítása (VIII) képletű enamin levegővel történő oxidálásával, így (XVI) képletű imínium-intermediert kapunk - 3. módszer A 2. példa szerinti módon E eljárással (VI) képletű imínium-intermedierből 100 mg (VIII) képletű enamint tartalmazó oldatot állítunk elő, amelyet nyitott berendezésben levegő jelenlétében szobahőmérsékleten 3 óráig keverünk. Ezután az elegyhez adunk 0 ’C hőmérsékleten 500 mg nátrium-bórhidridet, és a reakcióelegyet ammónium-hidroxid oldattal lúgosítjuk, majd háromszor 200 ml etil-acetáttal extraháljuk. A szerves fázisokat összeöntjük, és vízmentes magnézium-szulfáttal víztelenítjük, majd az oldószert vákuumban elpárologtatjuk. Az így kapott nyersterméket vékonyréteg-kromatográfiásan szeparáljuk (szilikagél, metanol/etil-acetát), így 4 mg (4% kitermelés) (I) általános képletű vinblasztint kapunk.

20. példa (1) általános képletű vinblasztin szintézise (Vili) képletű enamin oxidálása levegővel vas-klorid jelenlétében (XVI) képletű imínium-intermedierré (4. módszer)

A 2. példa szerinti módon E eljárással (VI) képletű imínium-intermedierből 100 mg (VIII) képletű enamint tartalmazó oldatot állítunk elő, amelyet keverünk, és hozzáadunk 1 mól ekvivalensnyi vas-kloridot, majd az oldaton keresztül 0 °C hőmérsékleten, 0,5 óra alatt levegőt buborékoltatunk. A reakcióelegyhez adunk 0 °C hőmérsékleten 500 mg Na-bór-hidridet, és a reakcióelegyet ammónium-hidroxid oldattal meglúgosítjuk, majd háromszor 100 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az összeöntött szerves fázisokat vízmentes nátrium-szulfáton víztelenítjük, és az oldószert vákuumban lehajtjuk. A nyersterméket vékonyréteg-kromatográfiásan (szilikagél, metanol/etil-acetát) tisztítjuk, így vinblasztint kapunk [(I) általános képlet, 37 mg], A vinblasztin kitermelés 70%, ha az elegyben lévő 50 mg enaminra vonatkoztatjuk.

21. példa (I) általános képletű vinblasztin előállítása (Vili) képletű enamint levegővel vas-klorid jelenlétében nagymértékű hígítással oxidáljuk (XVI) képletű imínium-intermedierré (5. módszer)

A 16. példa szerint L eljárással (VI) képletű imínium-intermedierből 200 mg (VIII) képletű enamint tartalmazó oldatot állítunk elő, amelyet metanollal ötszörösre hígítunk (teljes térfogat: 120 ml). A reakcióelegyhez adunk 75 mg 2 mól ekvivalensnyi vas-kloridot és a reakcióelegyen 0 ’C hőmérsékleten 20 percig levegőt buborékoltatunk keresztül. Az elegyhez adunk 200 mg Na-bór-hidridet, majd az oldatot vákuumban betöményítjük, ezután 100 ml vizet adunk hozzá, és az elegyet háromszor 200 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az összeöntött szerves fázisokat vízmentes nátrium-szulfáttal víztelenítjük, és az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A nyersterméket oszlopkromatográfiásan (szilikagél, vékonyréteg-kromatográfiás minőségű, 15 g), tisztítjuk. Eluálószer: éter: kloroform (10:7). így 3’,4’-dehidrovinblasztint kapunk [(VII) képlet, 18 mg, 11%]. További éter: kloroform : metanol = 10 : 7 : 0,5 eluenssel végzett tisztítással megkapjuk a vinblasztint [(I) általános képlet, 62 mg, 37%].

Mivel gyakorlati célhoz nem szükséges a közbenső termékek izolálása [(V), (VI), (VIII), (XVI), (XVIa) képletű vegyületek], így az indolegységre [(III) képlet] és a dihidroindol egységre [(IV) képlet] alkalmazott teljes eljárást előnyösen egy berendezésben folyamatosan végezzük, mint ahogy a 22. példában közöljük.

22. példa

A katarantin [(III) általános képlet, R jelentése

COOCHfl és a vindolin [(IV) képlet] egy berendezésben folyamatosan zajló átalakítása (I) általános képletű vinblasztinná és leurozidinná 500 mg, 1,5 mmól katarantint -15 ’C hőmérsékleten argongáz atmoszférában (760 Hgmm-nél nagyobb nyomás) feloldunk 4,5 ml szárított diklór-metánban, majd az oldathoz adunk egy adagban 330 mg,

1,9 mmól m-klór-perbenzoesavat. A reakcióelegyet 10-(-15) °C hőmérsékleten 5 percig keverjük. Ezután a reakcióelegyet -40 °C hőmérsékletre hűtjük, és a vindolin oldatát [(IV) képlet, 450 mg, 1 mmól) szárított diklór-metánba (1 ml) adjuk, majd hozzáadunk 1 ml (7,1 mmól) trifluor-ecetsavanhidridet. 2 óra múlva -60 ’C hőmérsékleten a vákuumban (vákuum pumpa

HU 208 829 Β alkalmazás) eltávolítjuk az illékony komponenseket, és a reakcióelegyet szárítjuk, ezután a rendszert argonnal átöblítjük, és hozzáadunk 12 ml gáztalanított metanolt. Az így kapott narancsos színű oldatot -40 °C hőmérsékletre hűtjük, és argongáz atmoszférában szárított gáztalanított metanolban (12 ml) feloldott 1,4-dihidro(nátrium-izobutil-l-karboxilát)-nikotinamidot [(IX-J) képlet, 1,5 g, 6 mmól] adunk hozzá. Miután a redukció végbemegy (fordított fázisú HPLC-vel ellenőrizzük a teljes redukciót), a reakcióelegyhez adunk 300 ml hideg metanolt, majd az elegy hőmérsékletét -5 és 0 °C között tartjuk. Az elegyhez adunk 330 mg, 2 mmól vas-kloridot, és az oldaton 20 percig 60 ml/perc áramlási sebességgel levegőt buborékoltatunk keresztül. Az elegyhez adunk 1 g nátrium-bórhidridet, és az oldatot vákuumban betöményítjük, majd hozzáadunk 100 ml vizet, és háromszor 150 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az összeöntött szerves fázisokat vízmentes nátrium-szulfáttal víztelenítjük, és az oldószert vákuumban elpárologtatjuk. Az így kapott nyersterméket kromatográfiásan tisztítjuk, és ily módon 3’,4’-dehidrovinblasztint [(VII) képlet, 95 mg, 12%], vinblasztint (315 mg, 39%) és leurozidint kapunk (130 mg, 16%).

Összefoglalva, a találmányunk szerinti megoldás jelentősen különbözik a technika állásából ismert megoldásoktól mind a reakció néhány fontosabb lépését tekintve, mind pedig a (VI), (VIII), (XVI) és (XVIa) képletű instabil intermediereket tekintve. Ezeket az intermediereket izolálhatjuk, azonban izolálásuk nem szükséges a reakció során, mivel ezeket a vegyületeket a D reakcióvázlat szerinti módon egy berendezésben folyamatosan vihetjük reakcióba.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás (I) általános képletű dimer-alkaloidok előállítására - a képletben vinblasztin esetén: alk jelentése metilcsoport,

Rí jelentése metilcsoport,

R₂ jelentése -CO-CH₃,

R₃ jelentése hidrogénatom,

R⁴ jelentése -COO-CH₃,

Z jelentése -CH=CH-csoport,

R jelentése (II) általános képletű csoport, ahol

R₇ jelentése -COO-CH₃,

R_g jelentése hidroxilcsoport,

R₉ jelentése etilcsoport,

R₁₀ jelentése hidrogénatom, leuorzidin esetén:

alk, R_b R₂, R₃, R₄ és Z jelentése a fenti, R jelentésénél a (II) általános képletben R_g jelentése etilcsoport és R₉jelentése hidroxilcsoport, R₇ és R₁₀ jelentése a fenti, vinkrisztin esetén:

alk, R₂, R₃, R₄, Z és R jelentése azonos a vinblasztinnál megadottakkal és R, jelentése -CHO-csoport azzal jellemezve, hogy

1. egy (III) általános képletű vegyületet egy (Illa) általános képletű vegyületté oxidálunk - a képletekben R jelentése -COO-CH₃ csoport —77 °C és +40 °C közötti hőmérsékleten valamely persav alkalmazásával, majd izolálás nélkül
2. a kapott terméket, egy (IV) képletű vegyülettel kapcsoljuk ecetsavanhidrid, halogénezett ecetsavanhidrid vagy acetil-klorid jelenlétében -70 °C és +40 °C közötti hőmérsékleten inért gázatmoszférában és inért oldószerben, majd
3. a kapott (VI) képletű vegyületet adott esetben izolálás nélkül egy (IX) általános képletű vegyülettel - a képletben

i) R||-R|₆ jelentése hidrogénatom, vagy ii) R|, jelentése benzil-, difenil-metil-, 1-metoxikarbonil-izobutil-, 2’,3’,4’,6-tetraacetil-3-D-glükopiranozidil-, 2’-metoxi-karbonil-izopiranil-, l’,2’dimetoxi-karbonil-etil-, izobuti 1-1-karbonsav-Nasó-csoport, és

R₁₃ jelentése -CO-NH₂, -CN vagy (a’) képletű csoport, és

R12, R]₄-R|6 jelentése hidrogénatom, vagy iii) R, | jelentése hidrogénatom,

R,2 és R|6 jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport,

R,3 és R₁₅ jelentése 1-6 szénatomos alkoxi-karbonil-csoport, és

R,₄ jelentése fenilcsoport redukáljuk, majd
4. az így kapott (VIII) képletű enamint ismert módon oxidáljuk, előnyösen oxigénnel vagy levegővel, majd
5. a kapott vegyületet ismert módon alkálifém-bórhidriddel redukáljuk, majd
6. a kapott terméket kromatografáljuk a kapott vinblasztin és leurozidin elválasztására, és kívánt esetben a kapott vinblasztint vinkrisztinné alakítjuk az R₍ = metilcsoport ismert módon R) = formilcsoporttá való oxidálásával.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 3. lépésben kapott enamin oldatot a 4. lépésben történő alkalmazás előtt 5-50-szeresre hígítjuk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 3. lépés szerinti redukciót inért gáz atmoszférában -60 és +40 °C közötti hőmérsékleten következő oldószerek legalább egyikében végezzük: kis szénatomszámú alkanolok, acetonitril.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 3. lépés szerinti redukciót -20-+30 °C közötti hőmérsékleten végezzük.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 4. lépés szerinti oxidációt a következő lépések valamelyikével végezzük:

i) az enamin oldatot nyitott berendezésben levegő jelenlétében keverjük, ii) az enamin oldatot és egy féminont, így vasiont (Fe³⁺), nyitott berendezésben levegő jelenlétében keverjük, vagy az oldaton levegőt/oxigént buborékoltatunk keresztül;

iii) az enamin oldatot és flavin koenzimet nyitott berendezésben levegő jelenlétében keverjük, ív) hidrogén-peroxidot tartalmazó enamin oldatot nyitott berendezésben levegő jelenlétében keverjük.

HU 208 829 Β

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 4. lépés szerinti oxidációt 6-8 pH-jú rendszerben végezzük.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 4, lépésben 2 mól ekvivalensnyi vas-kloridot alkalmazunk.
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2. lépés szerinti oxidációban a levegőztetés ideje 5-20 perc.
9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 4. lépés szerinti oxidációban a reakció-hőmérséklet 0-20 ’C.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 3. lépésben kapott enamint, mielőtt a 4. lépésben alkalmaznánk, 5-20-szorosára hígítjuk.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az enamint 8-12-szeresére hígítjuk.
12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 5. lépés szerinti redukciót +4-(-20) ’C hőmérsékleten, 7,5-85 pH tartományban végezzük, majd a reakcióelegyet 0-10 ’C hőmérsékleten vákuumban betöményítjük, mielőtt a célvegyületet extra5 hálnánk és izolálnánk.
13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 5. lépés szerinti redukcióban a 4. lépésben kapott reakcióterméket alkálifém-bórhidriddel, így NaBH₄-del, reagáltatjuk.

10
14. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1-5. lépéseket a közbenső intermedierek izolálása nélkül egy berendezésben folyamatosan hajtjuk végre.
15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez15 ve, hogy a 2., 3. és 4. lépésekben kapott intermedierek közül legalább egyet izolálunk, mielőtt a következő lépésben felhasználnánk.