HU208153B

HU208153B - Process for enriching and/or separating heart glycosides by using apolar adsorbent resins

Info

Publication number: HU208153B
Application number: HU88492A
Authority: HU
Inventors: Werner Haering; Gustav Lettenbauer; Carl Heinz Ross; Rudolf Machat
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1986-12-20
Filing date: 1987-12-12
Publication date: 1993-08-30
Also published as: WO1988004663A1; EP0294410B1; HUT57792A; DD270918A5; DE3643760A1; DE3766248D1; US5062959A; JP2648507B2; JPH01501624A; EP0294410A1

Description

A jelen találmány tárgyát szívglikozidokat tartalmazó elegyek, így nyers extraktumok, kémiai átalakítások és kristályosítási fokozatok tennékei, valamint anyalúgok feldolgozására szolgáló eljárások képezik. Szívglikozidokon

R-O-(D-O) ₁_₃-(glükózmaradék-O-) |_₂-H (I),

R-O-(D-O), _vagy 3-R’ (II),

R-O-(glükózmaradék-O-)₁_₂-H (III) általános képletű vegyületeket - amely képletben R jelentése valamilyen ágiikon;

R’ jelentése hidrogénatom, metil- vagy acetilesöpört; és

D jelentése valamilyen dezoxieukor-maradék (lásd Ullmann, 3. kiadás, 8. kötet, 222-231. old.) értünk.

A szívglikozidok, így digoxin, metil-digoxin, strofantinok, lanatozidok olyan keverékekből történő elkülönítésére, amilyenek például a növényi részek extrakcióinál, kémai átalakításoknál és kristályosítási műveleteknél keletkeznek, legtöbbnyire költséges eljárások, így többszörös ellenáramú megoszlatás, átoldások és átcsapások szükségesek (lásd például Ullmann előbb említett hivatkozását).

Ezek az eljárások nagy mennyiségű potenciálisan környezetkárosító szerves oldószer, például kloroform, diklór-metán, triklór-etilén felhasználását igénylik. Ezen oldószerek nagy mennyiségekben való kezelése a levegő és víz tisztántartása érdekében nagy műszaki ráfordítást igényel. Az értékes glikozidok veszteségei nagyok a nem értékesíthető anyalúgokban és koncentrátumokban.

Itt nyújt a találmány segítséget. A találmány, amint azt az igénypontban jellemezzük, megoldja a feladatot szívglikozidok olyan elegyekből történő dúsítására és elkülönítésére szolgáló eljárással, mint nyers extraktumok, kémiai átalakítások és kristályosítási fokozatok termékei, valamint anyalúgok, amelyek messzemenőleg a technika jelenlegi állása szerint szükséges, potenciálisan környezetkárosító oldószerek nélkül keletkeznek, és emellett az értékes glikozidok veszteségeit csökkenti, és ezáltal a kitermeléseket növeli.

Felismertük, hogy a szívglikozidoknak a fentebb részletesebben megnevezett keverékekből és anyalúgokból való dúsítása és tisztítása vizes oldatokból, adott esetben vízzel elegyedő oldószerek hozzáadása mellett apoláros, nagy pórusú gyantákon való adszorpcióval és ezt követően víz/oldószer elegyekkel vagy tiszta oldószerekkel végzett deszorpcióval megvalósítható. Emellett különösen meglepő az, hogy ennek során egyidejűleg a glikozidkeverékek egyes vegyületekre vagy csoportokra való szétválasztása is lehetséges a deszorpciós oldat összetételének változtatásával.

Értékes anyagok, így az antibiotikus hatású cefalosporinok erősen hígított oldatokból polimer apoláros gyanták segítségével végzett elkülönítése régóta ismeretes. A szívglikozidok komplex szívglikozid-elegyekből való dúsításának és elkülönítésének problematikája és különösen az ehhez szükséges oldószerek által okozott károsítás még régebben ismeretes. A jelen találmány tehát egy hosszú ideje fennálló igényt elégít ki.

A találmány szerinti dúsításhoz és izoláláshoz szükséges adszorpció és deszorpció végezhető folyamatosan vagy szakaszosan (batch-eljárás). Ezt a műveletet azonban előnyösen oszlopon gyenge (10⁵— 10⁶ Pa) nyomás mellett 20 °C-tól 50 °C-ig terjedő hőmérsékleten, előnyösen szobahőmérsékleten hajtjuk végre.

Valamilyen alkalmas gyantával töltött oszlopra ráengedjük valamilyen nyers extraktum vagy szennyezett glikozidkeverék vizes oldatát adott esetben 1-80% rövid szénláncú alkohol, előnyösen metanol, etanol vagy izopropanol hozzáadása mellett, miután a nyers extraktum valamilyen apoláros oldószerrel, előnyösen hexánnal, toluollal, izohexánnal vagy petroléterrel végzett kezelésével a zsírtartalmú alkotórészeket eltávolítottuk.

Az összes erősen poláros anyagot, így cukrokat, vízzel végzett öblítéssel eltávolítjuk a töltött oszlopból. Vízzel elegyedő oldószerek, előnyösen alkoholok, valamint sók hozzáadásával és bizonyos pH-érték beállításával az eluáló oldatot úgy változtatjuk, hogy egyes szívglikozidok vagy glikozidok csoportjai deszorbeálódjanak a gyantáról. Minden oldószer megválasztható úgy, hogy lehetőleg a környezet által elviselhető legyen. Ezáltal az előtisztításhoz szükséges nagy mennyiségű klórozott szénhidrogén alkalmazását elkerüljük.

Adszorbensként nagy felületű apoláros adszorbensgyanták megfelelők. Különösen nagy pórusú nemionos gyanták, így előnyösen térhálósított sztirolpolimerek, akril-észter polimerizátumok és/vagy sztirol/divinilbenzol kopolimerizátumok. A gyanták lehetnek kémiailag módosítottak, különösen halogénezettek vagy fizikailag osztályozottak, például szitáltak, szemcsenagyság, felület szerint egységesítettek.

Ilyen gyanták kaphatók például Amberlite XAD (Pohm and Haas Co.), Diaion HP (Mitsubishi Chemical Industries Limited) vagy Sepabeads SP (Mitsubishi Chemical Industries Limited) márkanév megjelölésekkel különböző felületű és ezáltal különböző adszorpciós tulajdonságú sorozatokban. Erre vonatkozó adatok a következő táblázatokban találhatók.

	Kémiai szerkezet	Fajlagos felület m²/g gyanta
Amberlite^R XAD-2	CAS-Reg. Nr.* 9060-05-3	300
Amberlite^R XAD-4	CAS-Reg. Nr.* 37380-42-0	725
Amberlite^R XAD-7	CAS-Reg. Nr.* 37380-43-1	450
Diaion^R HP 10	-ch₂chch₂ch-	501
Diaion^R HP 20	718
Diaion^R HP 30	Ο Φ -ch₂ch-	570
Diaion^R HP 40	705
Diaion^R HP 50	590
Sepabeads^R SP 207	(la) képlet	400

* Chemical Abstracts Service Registernummer

HU 208 153 B

A sorozatokon belül még szemcsenagyság szerint is differenciálnak.

	Kémiai szerkezet	Fajlagos felület m²/g gyanta
Diaion¹* HP 20 SS	(mint Diaion¹* HP 20)	510
Diaion¹* HP 2MG	ch₃ ch₃ 1 1 -ch₂c—ch₂c1 COOCH₂ COOR 1 (CH₂)_n 1 C00CH₂ 1 -ch₂c- 1 ch₃	550
Diaion¹* HP 21	(mint Diaion¹* HP 20)	700
és Diaion¹* HP 21 SS	(mint Diaion¹* HP 20)	580

Ez a 4 gyanta különösen alkalmasnak bizonyult. Főként a Diaion^R HP 20 SS és HP 21 SS.

A különböző gyantatípusok eltérő adszorpciós képességei különösen célszerű elválasztási eljárásokká kombinálhatók.

Növények által tartalmazott további anyagokat, például klorofillt szerves oldószereknek, előnyösen alkoholoknak, az oszlopra engedésével deszorbeálunk. Az így kapott oldatok bepárlása után tiszta anyagokat átoldás és adott esetben segédanyagok, előnyösen aktív szén, alumínium-oxid vagy derítőföld (így Floridin) hozzáadása mellett végzett kicsapás után kapunk. Az energiaigényes bepárláson kívül a vizes oldatokból történő elkülönítés történhet valamilyen polimer gyantára való felvitellel (adszorpció) és valamilyen szerves oldószerrel végzett deszorpcióval.

A találmányt részletesebben a következő példákkal szemléltetjük:

1. példa

Digoxin

Egy 410 mg Diaion¹* HP 20 SS (gyártó: Mitsubishi, Japán) töltésű oszlopra 3,6 liter vizes/metanolos Digitális lanata nyers-extraktumot viszünk fel előzetes fermentáció, elszappanosítás és zsírtalanítás után. Az extraktum 117 g szárazanyagot tartalmaz, melynek digoxin-tartalma 1,95 g. Az oszlopon 4,9 liter vízzel végzett öblítés után 12,2 g szárazanyag kötődik meg, melyben 1,95 g digoxin van.

Vizes izopropanollal 3 bar nyomáson végzett eluálás után digoxinban erősen feldúsult frakciókat kapunk. 6,3 liter 15%-os izopropanol oldatot gyűjtünk össze, és 100 ml-re bepároljuk. A kikristályosodott 4,9 g nyers digoxin frakciót 50 ml metanol/kloroform (1 : 1) elegyben forrón oldjuk, aktív szénnel derítjük, és átszűrjük 7,5 g alumínium-oxidon. Lemossuk 80 ml metanol/kloroform (1 : 1) eleggyel, az egyesített szűrleteket 50 ml-re bepároljuk, és 65 ml diizopropil-éterrel kicsapjuk. így 1,4 g digoxint különítünk el.

IR: 702,0, 734,1, 865,6, 902,7, 948,6, 1022,4, 1079,7,

1166,5, 1273,9, 1323,1, 1382,4, 1625,5, 1720,6,

2935,6,3433,6 cm¹.

2. példa

Lanatozid C

Digitális lanatából származó eredeti glikozid 20 g száraz extraktumát (tartalom: 12% lanatozid C, körülbelül 1% digoxin, körülbelül 1,5% a-acetil-digoxin) oldjuk 150 ml víz és 45 ml metanol elegyében. Ezt az oldatot 1,4 liter/óra átfolyási sebességgel felvisszük egy 410 ml Diaion¹* HP 20 SS-sel töltött oszlopra. Utána 4-5xl0⁵ Pa nyomással vízzel eluáljuk, amelyhez egyre növelt mennyiségben metanolt adunk. Az 50%-os metanolos résztől kezdve a glikozidok az eluátumban a lanatozid C, digoxin, a-acetil-digoxin, β-acetil-digoxin, lanatozid A sorrendben mutathatók ki. A 6 liter 55%-os metanolos frakciót teljesen bepároljuk (2,53 g 60-70% lanatozid C-t és 3% digoxint tartalmazó anyag), és etanolból aktív szén hozzáadása mellett átkristályosítjuk. Ily módon 1,0 g tiszta lanatozid C-t kapunk.

IR: 611,6, 868,1, 1084,0, 1160,0, 1256,5, 1383,7,

1627,4, 1739,6, 2934,5, 3459,7 cm^-1. Az anyalúgmaradékokat és a keverék-frakciókat az oszlopon újból tisztítjuk és elválasztjuk.

3. példa

K-Strofantin

Strophantus kombé magok etanolok extraktumának hexánnal zsírtalanított szárazanyagából 20 g-ot oldunk 100 ml vízben, és egy 410 ml Diaion¹* HP 20 SS töltetű oszlopra pumpáljuk.

4,2 liter vízzel 4-5xlO⁵ Pa nyomáson és 1,4 liter/óra átfolyási sebességnél minden nem-glikozid jellegű anyagot lemosunk. (8,3 g szárazanyag).

Az eluáló folyadékhoz 45% metanolt adva 7,8 liter glikozidos folyadékot kapunk. Ezt bepároljuk (6,9 g), etanolban oldjuk, aktív szénnel kezeljük, és diizopropil-éterrel kicsapjuk. így 6,06 g tiszta glikozid-keveréket (75% gamma-K-strofantin, 12,5% 3_rK-strofantin, 9,5% β₂-Κ-5ΐΓθίΗηύη) kapunk. A keverék nagyobb további feldolgozás nélkül megfelel a gyógyszerkönyvek követelményeinek.

IR: 1073,1, 1384,0, 1625,7, 1738,6, 2935,2, 3433,8 cm^-1.

4. példa gamma-K-Strofantin és $₂-K-strofantin

A 3. példában leírtakhoz hasonlóan 20 g szárazanyagot viszünk fel 410 ml Diaion¹* HP 20 SS-re. Az oszlopot egészen 30%-ig növekvő mennyiségű meta3

HU 208 153 Β nőit tartalmazó vízzel eluáljuk. Az így kapott frakciók (szárazanyag 10,1 g) nem tartalmaznak K-strofantin glikozidokat. A 2,8 liternyi 40%-os metanolos frakció bepárlás 5,3 g gamma-K-strofantint szolgáltat.

IR: 1073,2, 1384,0, 1627,0, 1739,0, 2936,0, 3438,5 cm'¹.

A metanol részarányának 45%-ra növelése után

7.5 liter gamma, β,- és 3₂-K-strofantinokat tartalmazó keverékfrakciót kapunk (bepárlás után 3,0 g), míg

2.5 liter 50%-os metanolos eluátum 0,61 g (szárazanyag) β^Κ-strofantint tartalmaz.

5. példa g-Strofantin

Strophantus gratus magok etanolos extraktumainak olyan anyalúgját, amely már nem bírható kristályosodásra, de még tartalmaz glikozidot, száraz állapotba hozzuk.

g szárazanyagot 100 ml 10%-os metanolban oldunk, és 0,9 liter/óra átfolyási sebességgel egy 410 ml Diaion^R 20 SS töltetű oszlopba nyomatjuk. Az összes cukor-alkotórészt és poláros nem-szívglikozidot 4 liter 10%-os metanollal eluáljuk.

A metanoltartalom 20%-ra való növelése után 3-4bar nyomáson és 1,4 liter/óra átfolyási sebességgel 3 liter eluálószerrel kimossuk a g-strofantint (3,69 g) az oszlopból. Bepárlás után vízből aktív szén hozzáadásával átkristályosítjuk. így 2,12 g tiszta g-strofantint kapunk.

IR: 907,7, 1044,7, 1384,0, 1625,0, 1735,9, 2934,2,

3433,6 cm-¹.

6. példa

Digoxin (lásd 1. ábrát) g száraz extraktumot (körülbelül 1,0 g digoxint tartalmaz) - amelyet Digitális lanata vizes/metanolos extrakciójával, fermentációval, elszappanosítással, zsírtalanítással és szárítással készítünk - 120 ml metanollal és 480 ml vízzel oldunk, tömény ammóniumhidroxid oldattal 7,5-re állítjuk a pH-t, és az oldatot a (3) jelzésű szivattyúval az (1) jelzésű oszlopba nyomatjuk, amely 410 ml Diaion^R HP 2 MG gyantával van töltve. A (6) jelzésű szelepet kifolyásra (8) állítjuk.

2,2 liter és 3,8 liter metanol/víz (25:75) térfogatarányú eleggyel való öblítés után az elfolyóból bepárlás után 54,8 g szárazanyagot kapunk, amely szívglikozidokat nem tartalmaz. A (6) és (5) jelzésű szelepeket most úgy állítjuk be, hogy az (1) jelzésű oszlopról az elfolyót a (2) jelzésű oszlopra vezessék, amely 50 ml Diaion^R HP 20 SS gyantával van töltve. A (7) jelzésű elfolyóból kapott 5 liter metanol/víz (45 : 55) térfogatarányú eleggyel készült eluátum nem tartalmaz digoxint. A mellék-glikozidokat tartalmazó frakciókat külön feldolgozhatjuk. A (4) és (5) jelzésű szelepeket ezután úgy állítjuk be, hogy az elúciós oldatot közvetlenül a (2) jelzésű oszlopra adagoljuk. 1 liter metanol/víz (50 : 50) térfogatarányú elegy után, amely 0,9 g 27% digoxin-tartalmú szárazanyagot tartalmaz és az elválasztási eljárásba visszavezetjük, 1,5 liter metanol/víz (55 : 45) térfogatarányú eleggyel eluálunk. Ezt a frakciót bepároljuk, metanol/víz elegyből átcsapjuk, metanol/kloroform elegyben oldjuk, aktív szénnel és alumínium-oxiddal kezeljük, és diizopropil-éterrel kicsapjuk. így 684 mg nagy tisztaságú digoxint különítünk el.

IR: 702,0, 734,1, 865,9, 902,7, 1022,3, 1079,9, 1163,6,

1323,0, 1383,2, 1625,5, 1721,2, 1935,6, 3439,2cm^_1.

A 6. példa szerinti eljárást az 1. ábra alapján tovább magyarázzuk. Ez pusztán a folyamatábra egy lehetséges kialakítását mutatja.

Ebben a számjelzések jelentése a következő:

(1) 410 ml Diaion” HP 2 MG gyantával töltött oszlop:

(2) 50 ml Diaion HP 20 SS gyantával töltött oszlop;

(3) szivattyú;

(4) 3-utas szelep;

(5) 3-utas szelep;

(6) 3-utas szelep;

(7) kifolyószelep;

(8) kifolyószelep.

7. példa

Metil-digoxin

Digoxin dimetil-szulfáttal végzett metilezésből kapott és főként β-metil-digoxinból (60-65%) a-metildigoxinból (körülbelül 7,5%), digoxinból (15-20%) és a digoxin dimetil-étereiből (körülbelül 8%) álló keverék 10 g-ját 85 ml vízmentes etanol és 12 ml víz elegyében oldjuk melegen, és tisztára szűrjük. Az oldatot egy 410 ml HP 20 SS-el töltött oszlopra nyomatjuk, amelyet előzetesen 30%-os etanollal átöblítettünk. Utána 4xl0⁵ Pa nyomáson növekvő etanoltartalmú vízzel 1 liter/óra átfolyási sebességgel mossuk.

4,75 liter 40%-os etanolos eluátum 3,91 g szilárd anyagot tartalmaz. Az elegy tartalmazza az összes elreagálatlan digoxint, α-metíl-digoxint és β-metil-digoxint, és újból elválasztható az oszlop. A következő 5 liternyi frakció 4,73 g kissé szennyezett β-metil-digoxint tartalmaz. Amennyiben az etanoltartalmat növeljük, a digoxin diétere és magasabb éterei eluálódnak. A metil-digoxinos főfrakciót metanol/víz elegyből átcsapjuk, kloroformmal felforraljuk és acetonnal kevertetjük.

Ily módon 3,65 g standard minőségű β-metil-digoxint kapunk.

IR: 725,4, 867,2, 1016,3, 1087,2, 1129,3, 1165,1,

1383,7, 1448,7, 1632,4, 1737,9, 1934,7, 3464,5 cm¹·.

8. példa

Digoxin

120 g körülbelül 1,9 g digoxint tartalmazó száraz extraktumot (lásd 6. példa) oldunk szobahőmérsékleten 960 ml víz, 240 ml etanol és 5 ml tömény ammóniumhidroxid oldat elegyében, és tisztára szűrjük. Az oldatot egy 410 ml Diaion” HP 20-szal töltött oszlopba nyomatjuk. (Nyomás 2xl0⁵ Pa, átfolyási sebesség 11.2 liter/óra).

Az oszlopról elfolyó oldat és 1,8 liter vizes öblítés

87.2 g szívglikozidoktól mentes szárazanyagot tartalmaz.

Ezután 4,4 liter 20%-os etanollal és 2,4 liter 27,5%4

HU 208 153 Β os etanollal végzett elúció következik. Az utóbbi kevés digoxint (<2,5%) tartalmaz, és újból feldolgozzuk.

5,0 liter 40%-os etanollal kapott eluátum tartalmazza a digoxin fő mennyiségét (8,3 g szárazanyag, körülbelül 20% digoxin). 1,2 liternyi 43%-os etanolos közbülső frakció után, amelyet visszavezetünk, az oszlopot tiszta etanollal öblítjük a következő ciklushoz. Az öblítő etanol első 2 literében található a digitoxin fő mennyisége (száraz maradék: 3,5 g, 10% digitoxin), amely abból kinyerhető. A digoxin-frakciót desztillációval 1,42 literre betöményítjük, és egy 410 ml HP 20 SS töltetű oszlopba nyomatjuk (nyomás 4— 10xl0⁵ Pa átfolyási sebesség 1,2 liter/óra). Az oszlopról elfolyó 1,5 liternyi oldat és a 20%-os etanollal nyert

1,5 liternyi, 24,5%-os etanollal nyert 4,6 liternyi és 27%-os etanollal nyert 3,75 liternyi frakciók nem tartalmaznak digoxint. A digoxigenin-bisz-digitozid elválasztása céljából 0,5 liter 33%-os etanollal végzett öblítés után az etanoltartalmat 40%-ra növeljük.

Ha, egyenként 0,39 literes frakciót szedünk. Az 1., 5. és 6. frakciókat visszavisszük a HP 20 oszlop eluálására. A 2., 3. és 4. frakciók bepárlásával nyert 3,72 g szárazanyag 1,86 g digoxint tartalmaz. Az oszlopot tiszta etanollal végzett öblítéssel regeneráljuk. A nyers digoxint 50 ml etanol/víz (1:1) elegyben melegen oldjuk, 25 ml-re bepároljuk, lehűtjük, majd szűrjük. 1,85 g anyagot kapunk, amelyet kloroform/metanol (9:1) elegyben oldunk, szilikagéllel és aktív szénnel kezeljük, majd bepároljuk. A kristályos anyagot etanollal forraljuk ammónia hozzáadása közben, forrón szűrjük és megszárítjuk. így 1,1 g tiszta digoxint kapunk.

IR: 702,0, 734,0, 856,6, 948,6, 1022,3, 1079,7, 1166,4,

1273,9, 1323,4, 1625,4, 1720,8, 2935,6, 3434,6 crrr¹.

9. példa

Digoxin, gitoxin, digitoxin

Digitális lanata 50 g zsírtalanított száraz extraktumát (mint a 6. példában) 415 ml víz, 154 ml metanol és 2 ml tömény ammónium-hidroxid oldat elegyében oldjuk. A tisztára szűrt Diaion^R HP 21 SS-sel töltött oszlopba nyomatjuk. 4X10⁵ Pa nyomással és 1,0 liter/óra átfolyási sebességgel, majd frakcionáltan eluáljuk.

Az 55% metanolkoncentrációig az oszlopról lefolyó oldatban lévő 43,4 g szárazanyag nem azonosított cukrokat és glikozidokat tartalmaz.

Az utolsó frakciók erősen feldúsult digoxigeninbisz-digitozidot tartalmaznak, és erre a glikozidra feldolgozhatok.

A 2,5 liternyi 65%-os metanolos eluátum 1,12 g szárazanyagot tartalmaz, melynek több mint 60%-a digoxin, és a szokásos tisztítási műveletek után 0,52 g tiszta digoxint szolgáltat. A 2,5 liternyi, 70%-os metanollal nyert frakciókban csekély mennyiségű digoxin van. Ezt újból felvisszük az oszlopra.

Az 1,5 liternyi 80%-os metanolos frakció erősen feldúsulva tartalmazza a gitoxin glikozidot, és erre feldolgozható. A tiszta metanollal nyert 0,9 liternyi frakcióban lévő 0,81 g anyag 80 mg digitoxint tartalmaz, amely ebből a frakcióból elkülöníthető.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONT

Eljárás szívglikozidok - előnyösen digoxin, lanatozid C, K-strofantin, gamma-K-strofantin, p₂-K-strofantin, g-strofantin, metil-digoxin, gitoxin és digitoxin dúsítására és/vagy elkülönítésére megoszlásos folyadékkromatográfiával, azzal jellemezve, hogy térhálósított, 100-1000 m²/g fajlagos felületű sztirolpolimer, akrilészter-polimerizátum és/vagy sztirol-divinilbenzol-kopolimerizátum alapú apoláros, nemionos, tág pórusú gyantán végzünk adszorpciót és deszorpciót, eluálószerként víz és legfeljebb 6 szénatomos alkanolok 99 : 1-től 20 : 80-ig terjedő elegyeit alkalmazva.