HU206743B - Process for fermenting dihydroxy-aceton - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás dihidroxi-aceton előállítására glicerin parciális mikrobiológiai oxidációjával, melynek során a fermentációt a legfeljebb 10 t% kezdeti glicerinkoncentrációval, majd glicerin és adott esetben más táptalajkomponensek folya- matos vagy szakaszos rátáplálásával süllyesztett, levegőztetett körülmények között végzik, és a rátáplálás alatt a glicerinkoncentrációt legfeljebb 6 t% értéken tartják. HU 206 743 B A leírás terjedelme: 4 oldal

Description

A találmány tárgya eljárás dihidroxi-aceton előállítására glicerin parciális mikrobiológiai oxidációjával, ecetsav-baktériumokkal végzett rátáplált fermentációval.

Az ecetsav-baktériumok közös jellemzője, hogy az alkoholt megfelelő körülmények között ecetsavvá oxidálják. A két fő nemzetség: Acetobacter és Gluconobacter nemcsak morfológiailag különbözik - az Acetobacterek peritrich, a Gluconobacterek amfitrich flagellum elrendezésűek hanem határozott eltérést mutatnak a biokémiai anyagcsereutak vonatkozásában is.

Az Acetobacter nemzetség teljes citromsav ciklussal rendelkezik, és az ecetsav továbboxidálására a glioxálsav híd biztosít lehetőséget.

A Gluconobacter nemzetség esetében viszont nem működik a Szentgyörgyi-Krebs ciklus, az idetartozó mikroorganizmusok a glükózt és néhány más, egyszerű cukrot a pentózfoszfát cikluson keresztül bontják le. Néhány törzs alternatív reakcióutat is tartalmaz, itt a glükóz —> glukonsav —> 2-ketoglükonsav —> 2,5diketoglükonsav reakcióéit a jellemző. Az ecetsavbaktériumok alapvető ipari hasznosításával, az ecetsavgyártással kapcsolatos néhány elnevezés is, az ecetsavat továbboxidáló fajokat „túloxidálónak” nevezték, például Acetobacter peroxidans, a reakciót csak az ecetsav létrehozásáig katalizáló törzseket „aluloxidálónak”, például Gluconobacter suboxidans. Léteznek olyan törzsek is, amelyek ugyan „túloxidáló” típusúak, de az ecetsavat igen lassan bontják, így ipari termelésre alkalmazhatók, például A. aceti. Az etil-alkohol ecetsavvá való oxidációján kívül az ecetsavbaktériumok képesek számos másféle vegyület parciális oxidációjára is.

A megvalósítható átalakításokra jellemző, hogy azok során hidroxilcsoport oxidációja megy végbe, például: propanol —> propionsav, izopropanol —> aceton, 2,3-butándiol —> acetoin, szorbit —> szorbóz, mannit —> fruktóz, glukóz —> glükonsav, glicerin —> dihidroxi-aceton.

A dihidroxi-aceton a legegyszerűbb cukrok közé tartozik (trióz, egyben a legegyszerűbb ketóz).

Az 51-33617 (1976) számú japán szabadalmi leírás és a J. Soc. Cosmet, Chem., 28, 25. (1977) cikke önbarnító kozmetikumok hatóanyagaként írja le.

A 3 177 120 számú amerikai egyesült államokbeli és a 416-6837 (1971) számú japán szabadalmi leírások illatfokozó adalékként történő alkalmazását ismertetik az élelmiszer- és dohányiparban. Ugyancsak alkalmazható mint szerves szintézisek kiindulóanyaga, műanyaglágyító alapanyag stb.

A dihidroxi-aceton előállítása világszerte fermentációs úton történik. Az ecetsavbaktériumokkal végzett fermentáció lehet egylépcsős, amikor a szaporodás és a glicerin oxidációja egy lépésben történik [lásd J. Ferment. Technoi., 57(3), 215-220. (1979)], vagy kétlépcsős, amikor az előzetes elszaporított sejteket szeparálás és mosás után használják fel a glicerin oxidációjára. Ez utóbbi eljárást ismerteti a 427 050 számú szovjet szabadalmi leírás.

Az eddig ismeretes eljárások két csoportra oszthatók. Az ún. szakaszos (batch) módszerek során egysze2 rű, „hagyományos” fermentációt végeztek, a szubsztrátumot tartalmazó táptalaj beoltásával, majd a fermentáció végén a végtermék elválasztásával. Ilyen módszert ismertetnek a fenti J. Ferment. Technoi, cikkében Yamada és munkatársai. E módszer hátránya, hogy a fermentáció kezdeti szakaszában a konverzió gyenge, ezáltal a fermentációs idő hosszú.

A folyamatos eljárások során, melyet például Izuo és munkatársai ismertetnek a J. Ferment. Technoi., 58(3), 221-226. (1980) cikkükben, az adaptációs fázis után egyenletes termelési szakasz jelentkezik, melynek termékképzése azonban viszonylag alacsony. Ugyanakkor az elválasztott tenyészléből a kiindulási anyag és végtermék elválasztása meglehetősen bonyolult.

A találmány célkitűzése ezért olyan eljárás kidolgozása, mely a fenti eljárások hátrányait kiküszöböli, és jó kitermeléssel, rövid idő alatt a glicerint jó hatásfokkal alakítja dihidroxi-acetonná.

A találmány szerint úgy járunk el, hogy a glicerint ecetsavbaktériumokkal rátáplált (fed-batch) rendszerben fermentáljuk.

Az eljárás előnye, hogy a szaporodás és termékképzés az alacsony kiinduló szubsztrátszint következtében gyakorlatilag adaptációs (lag) fázis nélkül indul meg. Az alacsony szubsztrátszint egyben az anyagcsere és termékképzés megnövekedését is eredményezi. A lag fázis elmaradása és a nagy termékképződési sebesség következtében a fermentációs idő jelentős mértékben lerövidül.

A rövidebb fermentációs idő és az optimális termékképződési feltételek lehetővé teszik azt, hogy a képződött dihidroxi-aceton gátló hatása később és kisebb mértékben érvényesüljön. Ennek tudható be, hogy a találmány szerinti eljárással a szakaszos eljáráshoz képest 30-40%-os titernövekedést sikerül elérni.

A találmány szerint célszerűen úgy járunk el, hogy Acetobacter vagy Gluconobacter genusba tartozó baktérium törzset asszimilálható nitrogénforrást és ásványi sót, továbbá glicerint tartalmazó tápoldatba süllyesztett, levegőztetett körülmények között tenyésztünk, majd a dihidroxi-aceton végtermék megjelenését követően a fermentléhez szakaszosan vagy folyamatosan glicerint és adott esetben asszimilálható nitrogénforrást és/vagy ásványi sókat tartalmazó tápoldatot adagolunk.

A fermentáció kezdeti szakaszában az alkalmazott táptalaj viszonylag kis mennyiségű, legfeljebb 10, előnyösen 1-6 tömeg% glicerint tartalmaz. A rátáplálandó oldat összetétele tág határok között változhat, a mikroorganizmus tenyésztési optimumától és a fermentáció idejétől függően. így adagolhatjuk kizárólag a glicerin - célszerűen tömény - oldatát, például vizes oldatát, azonban tartalmazhat az oldat más táptalaj-alkotórészeket is, például nitrogénforrást, illetve ásványi sókat. A rátáplálandó táptalaj a glicerint célszerűen nagy mennyiségben tartalmazza, a fermentor-térfogat jobb kihasználása érdekében. így az ilyen táptalaj például 30-95 tömeg%, előnyösen 40-60 tömeg% glicerint tartalmazhat. A rátáplálás során a glicerinkoncentrációt alacsony értéken tartjuk. Ez a 6 t%-ot nem lépi túl, célszerűen legfeljebb 3,5%, előnyösen 2-3 t%.

HU 206 743 Β

Magát a fermentációt végezhetjük egy lépcsőben vagy két lépcsőben is, mely utóbbi esetében az előzetesen elszaporított sejteket szeparálás és mosás után használjuk fel a glicerin oxidálására. A találmány szerinti eljárást bármely Acetobacter vagy Gluconobacter genusba tartozó törzzsel végezhetjük, mely képes a glicerinnek részleges oxidálására.

Jóllehet, a találmány szerinti eljárást az alábbiakban az Acetobacter suboxydans törzs alkalmazása példáján ismertetjük, szakember számára nyilvánvaló, hogy bármely más, konverzióra alkalmas mikroorganizmus törzs is alkalmazható.

A példákban alkalmazott % jelölések tömeg%-ot jelentenek.

1. példa db steril inokulumot készítünk 1000 cm³-es Erlenmeyer-lombikokban, 150 cm³ térfogattal. A táptalaj összetétele: 2% glicerin, 1,5% kukoricalekvár, 0,1% kálium-dihidrogén-foszfát és 0,3% kalcium-karbonát. A steril táptalajt kémcsőről, Acetobacter suboxydans ATCC 621 H törzssel oltjuk be, majd rázógépen 30 ‘’Con 16 órán át inkubáljuk.

1 fermentációs táptalajt készítünk egy 10 1 hasznos térfogatú keverés fermentorban. A táptalaj összetétele: 5% glicerin, 3% kukoriealekvár, 0,1% kálium-dihidrogén-foszfát, 0,3% ammónium-acetát és 0,1% kalcium-karbonát, pH = 5,4.

1 rátáplálandó táptalajt készítünk, amelynek öszszetétele: 42% glicerin, 0,1% kálium-dihidrogén-foszfát, 0,3% ammónium-acetát és 1% kalcium-karbonát. A táptalajokat 0,11 MPa nyomáson 2 órán át sterilezzük.

A fermentációs táptalajt 30 °C-ra hűtjük, és beoltjuk 450 cm³ inokulummal. A fennen tort 1,5 1/I/perc levegő térfogatárammal és 750/perc fordulatszámmal működtetjük. A hőmérsékletet 30 °C-on tartjuk, a pH szabályozást nem igényel. A fermentációt SCHOORL redukáló cukor meghatározási módszerével követjük nyomon. 3-5% dihidroxi-aceton tartalom elérésekor megindítjuk a rátáplálást, mindvégig 80 cm³/h térfogatárammal.

A fermentáció 35. órájában az elért dihidroxi-aceton-koncentráció 27%.

2. példa

1000 cm³-es Erlenmeyer-lombikokban 150 cm³ térfogattal inokulum táptalajt készítünk. A táptalaj összetétele: 10% szorbit, 5% kukoricalekvár, 0,1% káliumdihidrogén-foszfát és 1% kalcium-karbonát, pH=5,4.

A steril táptalajt kémcsőről Acetobacter suboxydans ATCC 621 H törzzsel oltjuk be, majd rázógépen 30 °C-on, 16 órán át inkubáljuk.

A szaporítást 2 db 5 1 hasznos térfogatú keverős fermentorban folytatjuk. A táptalaj összetétele: 10% szorbit, 3,6% kukoricalekvár, 0,1% kálium-dihidrogénfoszfát és 0,5% kalcium-karbonát; pH=5,4. A steril táptalajt az előző lépcsőből származó 10% inokulummal oltjuk, majd megindítjuk a tenyésztést 30 °C-on, 750 fordulat/perc és 1,11/1/perc paraméterek beállításával, 16 órán át.

A termelő fermentáció előtti utolsó szaporító lépés 1 db 80 1 hasznos térfogatú keverős fermentor felhasználásával történik. A táptalaj összetétele: 10% szorbit, 3,6% kukoricalekvár, 0,1% kálium-dihidrogén-foszfát és 0,5% kalcium-karbonát, pH=5,4.

A steril táptalajt az előző lépcsőből származó 10% inokulummal beoltjuk, majd megindítjuk a tenyésztést 30 °C, 350 fordulat/perc és 1,21/1/perc paraméterek beállításával, 16 órán át.

A termelő fermentációt 1 db 800 1 hasznos térfogatú fermentorban futtatjuk le. A táptalaj összetétele: 5,8% glicerin, 4,4% kukoricalevár, 0,1% kálium-dihidrogén-foszfát és 0,5% kalcium-karbonát, pH = 5,4. A steril táptalajt beoltjuk az előző lépcsőből származó 10% inokolummal, majd megindítjuk a tenyésztést 30 °C, 350 fordulat/perc és' 1,2 1/1/perc paraméterek beállításával, 10 órán át. Ezután 180 1 86,4%-os glicerint adagolunk 6 óránként és 30 benként, az utolsó adagolás után még 6 óráig végezve a fermentációt. A pH tartása kalcium-karbonát adagolással történik.

A 46. órában, a fermentáció leállításakor a dihidroxi-aceton tartalom 26,7%.

3. példa db inokulumot készítünk 1000 cm³-es Erlenmeyer-lombikokban, 15Ö cm³ térfogattal. A táptalaj összetétele: 10% szorbit, 5% kukoricalekvár, 0,1% kálium-dihidrogén-foszfát és 1% kalcium-karbonát, pH=5,4.

A steril táptalajt kémcsőről Acetobacter suboxydans ATCC 621 H törzzsel oltjuk be, majd rázógépen 30 °C-on, 16 órán át inkubáljuk.

A szaporítást egy 10 1 hasznos térfogatú keverős fermentorban végezzük, 5 1 fermentlé-térfogattal. A táptalaj összetétele: 10% szorbit, 3,6% kukoricalekvár, 0,1% kálium-dihidrogén-foszfát és 0,5% kalcium-karbonát, pH = 5,4. A steril táptalajt az előző lépcsőből származó 10% inokulummal oltjuk be, majd megindítjuk a tenyésztést 30 °C, 750 fordulat/perc és 1,2 1/1/perc paraméterek beállításával, 16 órán át.

A fermentáció végén a sejteket centrifugáljuk, majd a centrifugált sejttömeget egy 10 1 hasznos térfogatú, 5 1 táptalajt tartalmazó keverős fermentorban használjuk fel. A táptalaj összetétele: 5% glicerin, 0,2% kukoricalekvár és 1% kalcium-karbonát, pH = 5,4.

1 rátáplálandó táptalajt is készítünk, melynek összetétele: 42% glicerin és 0,5% kalcium-karbonát.

A fermentort 1,5 1/1/perc levegő térfogatárammal és 750/perc fordulatszámmal működtetjük. A hőmérsékletet 30 °C-on tartjuk, a pH szabályozást nem igényel. A fermentációt Schoorl redukálócukor meghatározási módszerével követjük nyomon. 3-5% dihidroxi-aceton tartalom elérésekor megindítjuk a rátáplálást 80 cm³/h térfogatárammal. A fermentáció 35. órájában az elért dihidroxi-aceton koncentráció 22%.

HU 206 743 Β

4. példa

Rázott inokultumtenyészetet készítünk a következő táptalajon:

2% glicerin, 1,5% kukoricalekvár, 0,3% CaCO₃, 0,1% KH₂PO₄. Az 1000 cm³-es Erlenmeyer-lombikba 300 cm³ 5-ös pH-jú tápoldatot mérünk be. Az alkalmazott törzs Acetobacter suboxydans ATCC 621 H.

A 30 °C-on rázógépen (350 löketszám/perc) 15 óráig inkubált tenyészetet használjuk a 10 literes keverős fermentor oltásához.

A szaporítást 30 °C-on, 750 ford./perc keverőfordulaton 1,5 1/1/min. levegőztetéssel, 10% inokulummal végezzük a következő táptalajon 1,5 óráig: 4% glicerin, 3% kukoricalekvár, 0,3% NH₄ acetát, 0,1% KH₂PO₄, 1% CaCO₃, 0,1% antihabzin, pH = 5. A fermentáció végén a sejteket a fermentléből kinyerjük (centrifugáljuk), majd a centrifugált sejttömeget 10 literes hasznos térfogatú, 5 liter tápoldatot tartalmazó keverős fermentorban használjuk fel. A táptalaj összetétele 5% glicerin és 1,5% kukoricalekvár, pH = 4,8. (A CaCO₃-ot a szeparált sejtekkel visszük a fermentorba). A fermentort 1,5 1/1/perc levegő térfogatárammal 750/perc fordulatszámmal működtetjük 30 °C-on.

A kb. 80 tömeg% glicerinadagolást 1 óra után 50 cm³/óra térfogatárammal megindítjuk. 15 óra után a térfogatáramot kétszeresére, azaz 100 cm³/óra állítjuk. A rátáplálást 30-32 óráig folytatjuk. A fermentáció pH szabályozást nem igényel. A glicerin-DHA mikrobiológiai parciális oxidációt Schoorl redukálócukor meghatározással követjük nyomon. A fermentáció 35. órájában elért dihidroxiaceton-koncentráció 40%, ami kb. 94%-os konverziót jelent.

Claims (6)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás dihidroxi-aceton előállítására glicerin parciális mikrobiológiai oxidációjával, azzal jellemezve, hogy a fermentációt legfeljebb 10 t% kezdeti glicerinkoncentrációval, majd glicerin és adott esetben más táptalajkomponensek folyamatos vagy szakaszos rátáplálásával süllyesztett, levegőztetett körülmények között végezzük, és a rátáplálás alatt a glicerinkoncentrációt legfeljebb 61% értéken tartjuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy Acetobacter vagy Gluconobacter genusba tartozó baktériumtörzset, asszimilálható nitrogénforrást és ásványi sót, továbbá glicerint tartalmazó tápoldatba süllyesztett, levegőztetett körülmények között tenyésztünk, majd a dihidroxi-aceton végtermék megjelenését követően a fermentléhez szakaszosan vagy folyamatosan glicerint és adott esetben asszimilálható nitrogénforrást és/vagy ásványi sókat tartalmazó tápoldatot adagolunk.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fermentációt legfeljebb 61% kezdeti glicerinkoncentrációval végezzük.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rátáplálás során legfeljebb 3,5 t% glicerinkoncentrációt állítunk be.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fermentációt szeparált (nemszaporodó) sejtekkel végezzük.
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fermentációt Acetobacter suboxydans ATCC 621 H törzzsel végezzük.