HU202274B - Process for producing bepi restriction endonukleaze from brevibacterium epidermidis - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás új Bepl restrikciós endonukleáz előállítására Brevibacterium epidermidisből.

A restrikciós endonukleázok azon enzimek, melyek a kettósláncú DNS-ben bizonyos, rájuk jellemző szekvenciákat felismernek, majd endonukleolitikusan mindkét láncot hasítják.

Mai tudásunk szerint restrikciós endonukleázok csak prokarióta szervezetekben, azaz baktériumokban és kékalgákban keletkeznek, itt viszont elég gyakoriak. Az eddig ismert restrikciós endonukleázok száma meghaladja a 400-at. Különböző eredetű és szerkezetű enzimek végezhetnek azonos funkciót - ún. izoszkizomer enzimek, igy a felismerési specifitás az enzimek nagy száma mellett is kevesebb, mint 100 féle. Az enzimes bontások egy részénél az enzim a két láncot szemben, azonos helyen vágja el .tompa’ véget eredményezve. Egy másik csoportnál az enzim a két láncot aszimmetrikusan vágja el, Így 3’vagy 5’- túlnyúló .ragadós' vég keletkezik. A restrikciós endonukleázok felismerő szekvenciája gyakran ún. palindrom, azaz olyan DNS szakasz, amely leolvasás-szimmetrikus, az egyik szál bázissorendje a komplementer szál megfelelő darabján visszafelé olvasva azonos, például

CTGCAG

GACGTC

A restrikciós endonukleázok ma már nélkülözhetetlen eszközei az elméleti és alkalmazott genetikai kutatásnak, emellett jelentőséget nyertek minden olyan azonosító, minősítő, diagnosztikai módszerben, ahol a vizsgálat alapja a DNS jellemző szerkezetének, vagy egy jellemző részének a kimutatása. Természetesen annál szélesebb az alkalmazás köre, minél nagyobb a választék a specifikusan felismert szekvenciákban.

Az említett, kb. 100 féle szerkezetet az esetek egy részében olyan enzimek ismerik fel, melyek általánosan előforduló, jól tenyészthető baktériumokból megfelelő mennyiségben elöállithatók. Más szerkezeti változatok felismerhetősége és hasithatósága elvi jelentőségű maradt, mert a specifikus enzim gyakorlatilag nem, vagy rendkívül nehezen termelhető. Ilyenkor jelentős műszaki haladást képvisel egy olyan izoszkizomer enzim felismerése, mely már gyakorlati alkalmazhatóságot ígér.

A CGCG palindromot felismerő enzimek alaptípusa elég ritka és különleges enzim, eredete miatt. Ezt az enzimet egy obiigát anaerob, patogén mikroorganizmusban mutatták ki (Nucleic Acid. Rés., 6, 1-15, 1979), és a törzs után - Fusobacterium nucleolatum FnuDII-nek nevezték. Ismertté vált egy iparszerűen előállítható másik izoszkizomer változat is (Nucleic Acid Rés., 5, 1729-1739, 1978) Thai néven, azonban ennek termelője extrém módon termofil, és pH=0,7-2,0 között szaporítható.

A törzs Thermoplasma acidophilum.

Kutatásaink során azt találtuk, hogy egy gyakran előforduló, jól tenyészthető és ellenálló baktériumfaj képes a FnuDII enzim izoszkizomerjét előállítani. Az enzim, melyet Bepl-ként jelölünk, magas hozammal kinyerhető. A törzset Brevibacterium spidermidis-ként azonosíthattuk, egyszerű táptalajon 50 perces generációs idővel jól szaporítható.

A törzset a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében MIMNG (NCAIM Β) P 001019 számon deponáltuk.

A találmány szerint úgy járunk el, hogy Brevibacterium epidermis MIMNG (NCAIM B) P 001019 törzset vagy annak Bepl enzimet termelő mutánsát vagy variánsát asszimilálható szén-, nitrogénforrást és ásványi sókat tartalmazó táptalajon süllyesztett, aerob körülmények között tenyésztünk, majd a sejttömegből kinyerjük a kivánt enzimet.

Az 1. és 2. ábra magyarázatát a példákban adjuk meg.

Az enzim előállításának néhány lehetséges módját mutatjuk be az alábbi példákban.

1. példa

Brevibacterium epidermidis MIMNG (NCAIM Β) P 001019 számú törzset 6 havonkénti átoltással tartunk fenn YTA táptalajon. A ferde agar tenyészetről kacsnyi mintával beoltunk kémcsőben sterilezett 7 ml YTB táptalajt, ebben a baktériumokat egy éjszakán át tenyésztjük. A tenyészettel 1 liter YTB táptalajt oltunk 3 literes Erlenmeyer lombikban, melyet rázatással (350 rpm) 27 °C-on 22 órán át inkubálunk. A fermentléből a baktériumokat centrifugálással (4000 rpm 30 perc) leválasztjuk, így 62 g fuganedves sejtet nyerünk. Ebből 50 g-os mintát az alábbi szerint dolgozunk fel:

A sejtmasszához 100 ml, 0,01 M pH=7,4 Tris-HCl puffért adunk, mely 0,01 M 2-merkapto-etanolt tartalmaz. A sejteket ultrahanggal feltárjuk (a készülék Sonifer Cell Disruptor, a feltárás ideje 10 perc, 50%-os munkaidővel). A sejttörmeléket 60 perces ultracentrifugálással (35 000 rpm) távolítjuk el. A felülúszóhoz 1M koncentrációig NaCl-ot adunk és a nyers kivonatot 4x90 cm-es Bio-Gel A -0,5 m oszlopon történő kromatografálással tisztítjuk. Άζ alkalmazott eluens 1M NaCl-tartalmú 0,01 M pH=7,4 Tris-HCl puffer, 0,01M 2-merkapto-etanol adalékkal. Az enzimaktivitást mutató frakciókat egyesítjük.

Az enzimaktivitás vizsgálata a következő:

μΐ 0,01M pH=7,4 Tris-HCl pufferhez 0,01M MgCl-ot és ImM ditiotreitolt, valamint

Mg lambda fág DNS-t adunk. A rendszerhez μΐ mintát mérve azt 30 °C-on 60 percig inkubáljuk. A DNS bontási reakciót 3 μΐ leállító pufferral leállítjuk, melynek összetétele 50%

HU 202274 Β szacharóz, 0,2M EDTA és 0,1% brómfenolkék. A rendszerből vett néhány ul mintát agaróz gélen elektroforetizálunk. A gél etidium-bromidot tartalmaz, melynek jelenlétében a DNS csíkok UV-fényben láthatóvá válnak. Enzimaktivitást jelez, ha egységes csík helyett elkülönülő fragmensek láthatók. Az enzimet tartalmazó egyesitett eluátumot PC pufferral szemben dializáljuk. Az ezt kővető tisztítás során PC pufferral ekvilibrélt 3x25 cm-es DEAE cellulóz oszlopot alkalmazunk, az elválasztás lineáris gradiens elúcióval történik PC pufferben 0,0-0,5 NaCl-ot adagolva. A vizsgálatok alapján a 0,25-0,30M NaCl-dal nyert frakciókat gyűjtjük össze, ezeket ismét dializáljuk. Végül 1,5x15 cm-es Pll foszfocellulóz oszlopon választjuk el a 0,05-0,12M NaCl-dal eluált aktív frakciót, ezt tároló pufferral szemben dializáljuk, mely egyben kb. háromszoros töményitést hoz létre.

A nyert BepI enzim hozama 380 egység/9 nedves sejt. Az enzim nem igényel Navagy K-ionokat, Mg²· igénye kb. lOmM, pH optimuma 7,4, hőoptimuma 25-30 °C.

A fentiekben alkalmazott táptalajok és pufferek összetétele a következő:

YTA táptalaj: Bacto tripton 10 g, Bacto élesztőkivonat 5 g, NaCl, Bacto agar 15 g, csapviz ad. 1 liter.

YTB táptalaj: mint YTA, agar hozzáadása nélkül.

PC puffer: 0,01M pH=7,4 kálium-foszfát puffer,

0,lmM EDTA,

0,01M 2-merkapto-etanol.

tároló puffer: 0,05M KC1,

0,01M pH=7,5 Tris-HCl puffer,

O.lmM EDTA, l,0mM ditiotreitol,

200 Mg/ml marhaszérum albumin,

50% glicerin.

2. példa

A felismerőhely igazolása

Ismert módon elvégezzük pBR 322 plazmid hasítását az azonosnak vélt EnuDII enzimmel, az új BepI enzimmel, illetve kettős hasítást végzünk az előbbiekkel. A kapott fragmensek mindhárom esetben azonosak.

(1. ábra).

3. példa

Brevibacterium epidermidis MIMNG (NCAIM Β) P 001019 törzset az 1, példa szerint tartunk fenn és tenyésztünk. A fermentlé centrifugálásával nyert nedves sejttömegből az enzimet az alábbi módon tisztítjuk:

g nedves sejtmasszához 42 ml 0,01M pH=7,4 Tris-HCl puffért adunk, mely 0,01M 25 -merkapto-etanolt tartalmaz. A sejteket ultrahanggal (MSE készülék 20x30 másodperc) feltárjuk, a sejttörmeléket ultracentrifugálással (35 000 rpm, 60 perc) eltávolítjuk. A nyers sejtkivonathoz olvadó jégfürdöben lassú kevertetés mellett streptomicin-szulfátot adunk 5% végkoncentrációig. A kevertetést 60 percen át folytatjuk, majd a keletkezett csapadékot centrifugálással (12 000 rpm 20 percig) eltávolítjuk. A felülúszót egy éj15 szakán át PC pufferral szemben (1. példa szerinti összetétel) dializáljuk.

A tisztítás következő lépéseként Heparin-sepharose oszlopon (1,6x15 cm-es) történő kromatografálást végzünk. Az eluens PC puffer, mely 0,0-l,0M NaCl-ot tartalmaz. Az enzimaktív frakciókat a 0,095-0,225M NaCl-os tartományban találjuk. A frakciókat egyesítve PC pufferral szemben dializáljuk. Befejező lépésként omega-aminopentil-agaróz (1,6-3,0 cm) oszlopos tisztítást végzünk, ahol az eluens hasonlóan PC pufferben NaCl gradiens. Az aktív frakciók megjelenése a 0,250 és 0,410M NaCl koncentrációk között várható. A mintákat egyesítés után tároló pufferral szemben dializáljuk, melynek öszszetétele az 1. példa szerinti.

A kapott enzim hasítási helyén Maxam-Gilbert szekvenálással ellenőrizzük (Methods Enzymol. 5, 499-560 1980) és eredményét a

2. ábrán mutatjuk be. A hasítás helye a

CGCG szakasz közepe.

4. példa

Brevibacterium epidermidis MIMNG (NCAIM Β, P 001019 törzset 6 havonkénti átoltással YTA táptalajon tartunk fenn. Egy ferde agar tenyészetet lemosunk 5 ml AGK táptalajjal és a szuszpenzióval beoltunk 300 ml AGK táptalajt 1 literes Erlenmeyer lombikban. A tenyésztést rázatással (350 rpm) 27 °C-on 18 órán át folytatjuk, majd a fermentléből a sejtanyagot centrifugálással leválasztjuk (4000 rpm, 30 perc). A nyert biomassza 29 g, ezt az 1. vagy 3. példa szerint feldolgozva, azonos ismérvekkel jellemezhető BepI enzimet nyerünk.

Az AGK táptalaj összetétele:

aszparagin glukóz kukoricalekvár por KH2PO4 g 5 g g 2 g 0,05 g

0,01 g csapviz 1

KH2PÜ4

MgSOí liter.

HU 202274 Β

Claims (1)

1. SZABADALMI IGÉNYPONT

   Eljárás BepI restrikciós endonukleáz előállítására, azzal jellemezve, hogy Brevibacterium epidermidis MIMNG (NCAIM B) 5 P 001019 törzset vagy annak BepI enzimet termelő mutánsát vagy variánsát asszimilálható szén-, nitrogénforrást és ásványi sókat tartalmazó táptalajon süllyesztett, aerob körülmények között tenyésztünk, majd a sejt- 10 tömegből kinyerjük a kívánt enzimet.

   Kiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: dr. Szvoboda Gabriella osztályvezető R 4981 - KJK

   91.3911.66-13-2 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Szabó Viktor vezérigazgató