HU195536B

HU195536B - Process for producing 2-keto-l-gulonic acid

Info

Publication number: HU195536B
Application number: HU83755A
Authority: HU
Inventors: Takayasu Sonoyama; Shigeo Yagi; Bunji Kageyama
Original assignee: Shionogi & Co
Priority date: 1982-03-05
Filing date: 1983-03-04
Publication date: 1988-05-30
Also published as: EP0088408A3; GB8306232D0; EP0088408B1; AU562910B2; CA1200220A; DK161106C; AU1205083A; ES520323A0; DE3364468D1; EP0088408A2; ES8404411A1; DK103583D0; US4543331A; IE830487L; DK161106B; GB2116549A; DK103583A; IE54704B1; GB2116549B

Description

A jelen találmány általánosságban 2-keto-L-gulonsav

2,5-diketo-D-glükonsav mikrobiális (fermentatív, vagy cnzimatikus) redukciójával való előállítására vonatkozik. Részletesebben a találmány kapcsolatos: egy újonnan indukált mutáns használatával, amely defektív az 5-ketoD-glükonsav és a redukciós eljárásban keletkező bármely termékének metabolizálásában; valamilyen nitrát sónak, és valamilyen hidrogéndonorriak a redukciós rendszerhez való hozzáadásával, és olyan fermentlé valamilyen felületaktív anyaggal való sterilizálásával, amelyben valamilyen 2,5-diketo-D-glükonsavat termelő mikroorganizmust tenyésztettünk, és amelyet a mutáns által redukálandó nyersanyagként használunk.

A feltalálók már korábban találtak 2,5-diketo-D-glükonsavból 2-keto-L-gulonsav termelésére képes különböző mikroorganizmusokat [a továbbiakban 2-keto-Lgulonsavat termelő (l) törzs], és bejelentettek eljárásokat 2-keto-L-gulonsavnak a mikroorganizmusok segítségével való előállítására. [Lásd például a 3 922 194 (RE 30 872) sz., 3 959 076 sz. és 3 963 5 74 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat.] Ezen (I) törzsek mindegyike nem kívánt melléktermékként 2-ketoD-glükonsavat termel 2,5-diketo-D-glükonsavból, valamint a fő termékként 2-keto-L-gulonsavat. A feltalálók bejelentettek egy kevert tenyészetes eljárást is ennek, a nem kívánt 2-keto-D-gIükonsavnak a táptalajban való felhalmozódásának a megakadályozására. (Lásd például a 3 998 697 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást.)

Mindamellett 2-keto L-gulonsav előállítására egy iparilag megvalósíthatóbb eljárás kidolgozása régóta kívánatos volt. A 2-keto-L-gulonsav 2,5-diketo-D-glükonsavból való termelésében és moláris kitermelésében való javulás azonban még váratott a megvalósításra.

Ennélfogva a jelen találmány feladata az volt, hogy biztosítson egy javított mikrobiális eljárást 2-keto-Lgulonsav 2,5-diketo-D-glükonsavból való előállítására, amelyben az újonnan indukált mutánst alkalmazzuk a nem kívánt 2-keto-D-glükonsavnak a fermentlében való felhalmozódásának minimalizálására.

A jelen találmány célja továbbá, hogy javítsa az említett eljárást, amelyben valamilyen nitrát sót és hidrogéndonorként szénhidrátot vagy polihidroxi-alkoholt adunk a mutáns fermentációs táptalajához, és/vagy az eljárás kiindulási anyagaként a táptalajhoz adandó 2,5-diketoD-glukonsavhoz.

A jelen találmány célja lovábbá az említett eljárás javítása, amennyiben 2,5-diketo-D-glükonsav fermentlevet használunk az eljárás kiindulási anyagaként, és a fermentlevet előzetesen valamilyen felületaktív szerrel sterilizáljuk a 2,5-diketo-D-glükonsavat termelő és túlélő sejtek számának indokolt mértékig való, csökkentése céljából.

A jelen találmány eljárás 2-ke tó-L-gulonsav előállítására 2,5-diketo-D-glükonsav átalakításával 2-kcto-Lgulonsav termelésére képes élő, vagy feldolgozott mikroorganizmus jelenlétében vizes táptalajban, amelyhez

2,5-diketo-D-glükonsavat adunk, vagy kalcium-2,5-diketo-D-glükonát vizes oldata alakjában vagy a Gluconobacter vagy Erwinia nemzetséghez tartozó, 2.5-dikctoD-giükonsavat termelő mikroorganizmus D-glükózt tartalmazó táptalajban való tenyésztésével kapott, adott esetben sterilizált fermentlé alakjában, a 2-keto-L-gulonsav feldúsításával és a feldúsított 2-keto-L-gulonsavnak 2 a fermentlétől való elkülönítésével oly módon, hogy Coryuebactcriiim nemzetséghez tartozó és 2,5-diketoD-glükonsav 2-keto-L-gulonsavvá való átalakítására képes mikroorganizmusokat mu tagén kezelésnek vetünk alá, a kezelt sejteket D-glükonsavat, mint egyedüli szénforrást tartalmazó tápközegre oltjuk, majd a kifejlődött telepeket 5-kcto-D-glükonsavat, mint egyedüli szénforrást tartalmazó tápközegre oltjuk, a D-glükonsavon, mint egyedüli szénforráson növekvő, de 5-keto-D-glüθ konsavon, mint egyedüli szénforráson nem növekvő telepeket izoláljuk, és a telepek közül a 2,5-diketc-Dglükonsavból 2-keto-L-gulonsavat termelő, de 2-keto-Dglükonsavat lényegében nem termelő telepeket kiválasztjuk, és az átalakítást az így kiválasztott mutánsok alkal⁵ mazásával végezzük.

A találmány leírása során és az igénypontokban az „élő vagy feldolgozott mikroorganizmus” kifejezés a mikroorganizmus sejtjeinek kezelésével kapott valaθ milyen feldolgozott terméket, valamint a növekvő, vagy' nyugalomban lévő mikroorganizmust jelenti. A feldolgozott termék lehet például sejtszuszpenzió, sejtkivonat, nyers vagy tisztított enzim, vagy a mikroorganizmusokból kapott sejtzúzalák. Az eljárás során említett valag mennyi sav esetén bármely sója is értendő.

A jelen találmány szerint egy tovább javított eljárást biztosítunk, amelyben az említett mutáns tenyésztése és a 2,5-diketo-D-glükonsav 2-keto-L-gulonsavvá való álalakítása valamilyen hidrogéndonor vagy valamilyen 0 nitrát só jelenlétében történik. A hidrogéndonor adható a 2,5-diketo D-glükonsavva! együtt a táptalajhoz, vagy külön is. A nitrát adható a táptalajhoz a tenyésztés kezdetén, és/vagy hozzáadható a táptalajhoz kezdetben, vagy bármely időben a 2,5-diketo-D-glükonsav adagolása alatt.

Egy másik szempont szerint a jelen találmány még további javítást biztosít, amennyiben olyan fermentlevet adunk 2,5-diketo-D-glükonsav-forrásként a táptalajhoz, amelyben 2,5-diketo-D-glükonsavat termelő mikro0 organizmust (III) tenyésztettek, és az illető fermentlében , lévő túlélő (III) mikroorganizmus élő sejtjeit a betáplálás előtt valamilyen felületaktív anyaggal sterilizáljuk.

(1) A (II) mutáns deriválása.

A feltalálók egy 2,5-diketo-D-glükonsavból 2-ketoL-gulonsav termelésére képes szülő mikroorganizmus törzsből [(I) szülő törzs] származó (II) mutánst kapták az (1) szülő törzs mutáció előidézésére szolgáló szokásos módon való kezelésével. Ezt a (II) mutánst úgy szelektálni ták, hogy 5-keto-D-glükonsavon ne, vagy alig tenyésszen, és 2-keto-D-glükonsav termelésére képtelen legyen.' Ennélfogva itt, és a továbbiakban is úgy definiálható,¹mint „olyan mutáns, amely lényegében defektív 5-ketoD-glükonsav metabolizálásában, és lényegében képtelen

2-kcto-D-gliikonsav termelésére”. Így ha a (II) mutánst tenyésztési körülmények között 2,5-diketo-D-glükonsav-! val kerül érintkezésbe, akkor 2-keto-L-gulonsav keletke-; zik,és felhalmozódik az elegyben anélkül, hogy egyidejű-, lég a nemkívánt 2-keto-D-glükonsav is felhalmozódná.} Mutáció előidézésre alkalmas bármely szokásos mód-! szer használható a (11) mutánsnak az (I) törzsből való nyerésére. A módszer lehet ultraibolya sugárzásnak, vagy, X-sugár hatásának való kitétel és valamilyen mutagénnel, például N-metil-N'-nitro-N-nitrozo-guanidinnel (N.T.G.),

195 536 f

akriflavinnal, metán-szulfonsav-etil-észterrel és hasonlókkal való kezelés.

A jelen találmány egyik megvalósítása szerint a kezelt (I) törzs szuszpenzióját először sterilizált fiziológiás sóoldattal alkalmas koncentrációra hígítjuk tetszés szerinti inkubálás után, és a hígított szuszpenzió egy részét (0,5 -1 ml) 0,5-2% D-glükonsavat (és vitaminokat, és a mikroorganizmusok növekedése szempontjából esszenciális nyomelemeket is) tartalmazó minimál (agar) táptalajon szélesztjük tenyésztésre. A táptalajon kinőtt telepeket lenyomatos módszerrel átvisszük egy 0,5—2% 5-keto-D-glükonsavat tartalmazó másik minimál (agar) táptalajra, és utána szelektáljuk azokat a telepeket, amelyek nem képesek 5-keto-D-glükonsavval tenyészni. A szelektált telepekben lévő sejtek teljesen elveszítik azt a képességüket, hogy 5-keto-D-glükonsavat hasznosítsanak, amelyet az (I) szülő törzs megtartott, vagy ez a képességük az (I) szülő törzshöz viszonyítva kevesebb, mint 1/10-ére csökken.

Bebizonyosodott továbbá, hogy a (fi) mutánsok mindegyike 2,5-diketo-D-glükonsav jelenlétében tenyésztési körülmények között lényeges 2-keto-D-glükonsav melléktermék nélkül termel 2-keto-L-gulonsavat.

A fent leírt módon nyert (II) mutánsok, például a FERM-BP 108 mutáns, amely a Corynebacterium sp., FERM-P 2770, ATCC No. 31 090 (I) szülőtörzstől származik, a FERM-BP' 107 mutáns, amely a Corynebacterium sp., FERM-P 2687, ATCC No. 31 081 (I) szülőtörzstől származik (lásd 1. táblázat). Ezeknek az (1) szülőtörzseknek a részletes rendszertani leírását a 3 959 076 és 2 998 697 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban adják meg.

1. táblázat

2-Keto-L-gulonsavat termelő mikroorganizmusok (szülők) és a belőlük származó, lényegében 5-keto-Dglükonsav metabolizálásában defektív és lényegében 2-keto-D-glükonsav termelésére képtelen mutánsok.

Szülők. Mutánsok.

Corynebacterium sp. FERM-P 2770, FERM-BP 108 ATCC No. 31090

Corynebacterium sp. FERM-P 2687, FERM-BP 107 ATCC No. 31 081.

Az az előbb leírt tény, hogy a 2-keto-D-glükonsav termelő aktivitás megszűnése vagy jelentős csökkenése a szülő törzs 5-keto-D-glükonsav metabolizáló aktivitásának megszűnésével együtt jár, minden olyan 2-keto-Lgulonsavat termelő mikroorganizmusra érvényes, amely a baktériumok Coryneform csoportjához tartozik (a Bergey’s Manual of Determinativc Bacteriology 8. kiadásában megadott definíció szerint). Az említett (II) mutánsok bármely további mutánsai vagy változatai alkalmazhatók a közölt eljárás megvalósítására, amennyiben eleget tesznek ennek a követelménynek. Továbbá alkalmazható bármely gén-klónozással, transzformációval vagy sejtfúzióval előállított olyan mikroorganizmus is, amelybe a (II) mutáns ezen jellegét kifejező gént bevitték.

(2) 2,5-Diketo-D-glükonsav átalakítása 2-keto-L-gulonsawá a (II) mutáns jelenlétében.

Az (I) szülőtörzs tenyésztésénél, a fermentlé kezelésénél, és a 2-kcto-L-giilonsavnak a fennentléből való kinye-j résénél alkalmazott ismert szokásos körülmények bármelyike, amelyeket például a 3 922 194 sz., a 3 959 076 sz., és 3 963 574 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban közölnek, hasonlóképp alkalmazható a (!!) mutáns tenyésztésére és az ezt követő lépésekre bizonyos lényegtelen módosításokkal.

Semmiféle különleges korlátozás nincs a (II) mutáns | 10 tenyésztésére szolgáló táptalaj összetételére. Szénforrásként cukrok, például glükóz, szacharóz és melaszok, polihidroxi-alkoholok, például glicerin, használhatók a 0,5-5% koncentrációban, nitrogénforrásként pedig szokásos nitrogéntartalmú anyagok, például kukoricalekvár, pcpton, húskivonat, aiiiinóniiunsók, nitrátok,; és hasonlók 0,5-5% koncentrációban. A táptalajhoz egyéb szervetlen sók (például kalcium-, magnézium-, kálium-, cink-, mangán- és vassók) vagy a végtermék

2θ termelését elősegítő faktorok is adhatók. Az összetétel az alkalmazott törzs tulajdonságaitól, a nyersanyag, a

2,5-diketo-D-glükonsav mennyiségétől és az egyéb kísérő körülményektől függően változhat.

A 2,5-diketo-D-glükonsav bármely sójának vizes

2g oldata használható nyersanyagként. Hasonlóképpen megfelelő olyan fermentlé használata is, amelyet D-glükózból 2,5-diketo-D-glükonsav termelésére képes olyan mikroorganizmus tenyésztésével kaptunk, amely az Erwinia vagy Gluconobacter nemzetséghez tartozik (a

3q Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 8. kiadásban megadott definíció szerint, és ennélfogva ide tartozik a 7. kiadásban megadottak szerint az Acetomonas, Acetobacter és Gluconobacter nemzetség). A fcrmentlcvct scjlmcntcs szűrletként vagy vegyszerekkel (például nátrium-dodecil-szulfonáttal) sterilizált oldatként alkalmazzuk.

A jelen találmány szerinti eljárás megvalósításában alkalmazott 2,5-diketo-D-glükonsavat termelő (III) mikroorganizmus olyan mikroorganizmus, amely a

Gluconobacter vagy Erwinia nemzetségbe tartozik. Ilyen mikroorganizmusokat a 2. táblázatban sorolunk fel példaként.

2. táblázat

Mikroorganizmus	FERM-P	ATCC
Acetomonas albosesarnea	2439	21998
Gluconobacter melanogeum
IFO 3293	—	—
Gluconobacter rubisinosus
IFO 3244	—	-
Erwinia citreus	5449	31623
Erwinia punctata	5452	31626
Erwinia punctata var.	5450	31624
Erwinia punctata var.	5451	31625
Erwinia punctata var.	5453	31627
Erwinia terreus	5454	31628
Erwinia terreus var.	5455	31629
Erwinia terreus var.	5456	31630
Erwinia terreus var.	5457	31631

A fenti törzsek részletes rendszertani leírása vagy a 3 998 697 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi 3

19S 536 leírásban, vagy a 0 046 284 sz. nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésben található. Ezen mikroorganizmus törzsek, valamint az előbb leírtak mintái a Fermentation Research Institute, Yatabe, Japán, és/vagy az American Typc Culture Collection. Maryland, U.S.A. intézeteknél találhatók letétben, és ezekről a letéti helyekről a Budapesti Egyezmény rendelkezései értelmében beszerezhetők. Az IFO számmal jelzett mikroorganizmusok az Institute of Fermentation, Osaka, Japán, intézettől is beszerezhetők.

Bár a táptalajhoz hozzáadandó 2.5-dikcto-D-gliikonsav mennyisége és a hozzáadás módja az alkalmazott mikroorganizmustól, és a táptalaj, és a tenyésztés körülményeitől függően változik, az említett savat általában egyszerre vagy időszakosan adagolva adjuk a táptalajhoz, vagy a fernientléhez 1 — 10% összesített koncentrációnak megfelelően. Az említett sav mennyisége minden egyes időszakos adagolásnál előnyösen 0,05-2% koncentrációnak megfelelő mennyiség a táptalaj, vagy a fermentlé összes mennyiségére számítva a beadagolás időpontjában.

A táptalaj vagy fermentlé pH-ját általában 5,0-9,0, és előnyösen 6,0-8,5 között tartjuk az átalakítás közben lúgos anyagok, például kalcium-karbonát óvatos adagolásával. Más módszer szerint valamilyen alkalmas pufferis adható a táptalajhoz a tenyésztés kezdetén.

Ezek a körülmények a jelen találmány más megvalósításaira is alkalmazhatók a megfelelő leírásban való bizonyos módosításokkal, (3) Nitrát só és hidrogéndonor alkalmazása a tenyésztésben.

A 2-keto-L-gulonsavnak 2,5-diketo-D-glükonsavból 2-keto-D-glükonsav egyidejű felhalmozódása nélkül a (II) mutáns alkalmazásával való előállítása megvalósítása során a feltalálók azt észlelték, hogy a 2-keto-L-gulonsav termelése jelentékenyen megnő, és a 2-keto-L-gulonsav

2,5-diketo-D-glükonsavból való molekuláris kitermelése is jelentősen javítható, ha nitrátot adnak a (II) mutáns tenyésztésére szolgáló elegybe, és/vagy ahhoz a táptalajhoz, amelyben a (II) mutáns hat a 2,5-diketo-D-glükonsavra, és ha a 2,5-diketo-D-glükonsav adagolásával egyidejűleg valamilyen hidrogéndonort adnak a fermentléhez, és ezen észleletek alapján ezt a jelen találmány második lényeges jellemzőjének tartják.

Ha a (II) mutánst 0,1-0,5% nitrát adalékot tartalmazó táptalajra oltjuk, és ezen tenyésztjük, a (II) mutáns növekedése a tenyésztés kezdete utáni 10-24 órában éri el maximumát. Továbbá a nitrátot a táptalajhoz 0,05— 0,5% koncentrációban adjuk olyan fázisban, amikor a növekedés eléri maximumát, vagy ezután a fázis után 10 órán bclü). Az eljárás során alkalmazható nitrátok alkálifémsók, például kálium-nitrát és nátrium-nitrát, alkáliföldfémsók, például kalcium-nitrát és magnéziumnitrát, továbbá mangán-nitrát.

A nitrát a (II) mutáns tenyésztésének kezdetén adható a táptalajhoz. Az adagolás végezhető a 2,5-diketoD-glükonsav hozzáadásával egyidejűleg egyszerre, vagy a betáplálással párhuzamosan adagokban. Ajánlatos a tenyésztés kezdetén, és a 2,5-diketo-D-glükonsav betáplálás kezdetén végrehajtani. Azt is tapasztaltuk még, hogy a nitrát-adagolásnak tulajdonítható javulás még jelentősebb lesz, ha a 2,5-diketo-D-glükonsav betáplálással egyidejűleg valamilyen hidrogéndonort is adunk a táptalajhoz. Tehát a 2-kcto-L-gulonsav-tcrmelés jclcn4 tősen növelhető valamilyen hidrogéndonor hozzáadásával is.

Hidrogéndonorként bármely szénhidrát és poííhidroxi-alkohol alkalmazható, amennyiben a törzs hasznosítani tudja ezeket. Ajánlatos, ha a hidrogéndonort a 2,5-diketo-D-glükonsav betáplálással egyidejűleg adagoljuk a 2,5-diketo-D-glükonsawal kombinálva. Bár a hidrogéndonor koncentrációja változhat a 2,5diketo-D-glükonsav adagolásának körülményeitől, és az alkalmazandó mutánstól vagy a fermentlétől függően, amelyben n mutánst inkubáljuk, a hidrogéndonort általában a betáplálandó 2,5-diketo-D-glükonsav mennyisége 5-50%-ának megfelelő koncentrációban adjuk a fermentléhez.

A nitrátnak a találmány szerinti hozzáadása által elérhető javulás annak a ténynek tulajdonítható, hogy a nitrát részt vesz a hidrogéudonerként hozzáadott szénhidrát vagy szerves sav mikroorganizmus sejtek által való

2q metabolizálásában. Aktiválja a 2,5-diketo-D-glükonsav 2-keto-L-gulonsawá való redukciós rendszerét a mikroorganizmus sejtekben, és a hidrogéndonorból felszabadított hidrogént a redukciós rendszerhez juttató szerepet játszik. A hidrogéndonor hozzáadása nélkül a nitrát

2g egyedüli hozzáadásának hatása csekély befolyással lenne a 2-keto-L-gulonsav termelésére; azaz a nitrátsó beadagolás javító hatása a termelés növekedésére és a 2-ketoL-gulonsav magas kitermelése lényegesen fokozható a hidrogéndonor jelentős adagolásával.

Az előbb leírt előnyökön kívül a nitrát adagolás hatásos a fermentlé előírt pH-értékének (6,5-8,0) ismételt fenntartásában is, amely előnyös a 2-keto-L-gulonsav 2,5-diketo-D-gliikonsavból való termelésére.

Összegezve az állapítható meg, hogy a nitrát a hidro35 géndonor mikroorganizmus által való metabolizálásának javítására szolgál, és inkább a redukciós rendszer aktiválásában és stabilizálásában játszik szerepet, mint a mikroorganizmusok által nitrogénforrásként való hasznosításában.

Általában egy nitrogéntartalmú vegyület hasznosítható nitrogénforrásként való hatását a sejtkoncentráció növekedésében értékelhetjük. Hasonló szervetlen vegyületek közül egy ammóniuinsónak sokkal nagyobb hatása van erre a növekedésre, mint a nitrátnak. Az ammónium45 só a sejtkoncentráció növekedésére akkor hatásos, ha a tenyésztés kezdetén adjuk a fermentléhez, vagy a 2,5diketo-D-glükonsav betáplálás idején, de csak kis hatása van a 2-keto-L-gulonsav termelés fokozására.

Ezzel ellentétben a nitrátnak kisebb hatása van a sejt50 koncentráció növekedésére, mint az ammóniumsónak, de közrejátszik a 2-kcto-L-gulonsav-termelés jelentős növekedésében. Ezeket a hatásokat a példákban később szemléltetjük.

(4) A 2,5-diketo-D-glükonsav fermentlé sterilizálása felületaktív anyaggal.

2-Keto-L-gulonsav ipari méretű előállításának megvalósítása során a feltalálók megkísérelték, hogy úgy állítsanak elő hatásosan 2-keto-L-gulons3vat, hogy a (III) törzs tenyésztésével kapott 2,5-diketo-D-glükcnsav fér⁶θ mentlevet [amely milliliterenként I0⁸—10^l° élő (III) sejtet tartalmaz] táplálták be közvetlenül a (II) mutáns tenyészetébe.

A kísérleti eljárás során azt tapasztalták, hogy az (I) 05 szülűtörzs esetétől eltérően, ha a (II) mutánst alkalmaz-41

195 536 zák a fenti eljárásban, akkor a 2-keto-L-gulonsav termelése jelentősen gátolt. Kiterjedt vizsgálat eredményeképpen világossá vált, hogy a gátlási jelenség abban az esetben fordul elő, ha a (III) törzs 10⁵ élő sejt/ml feletti mennyiségben tenyészik az eljárás során.

A (III) törzs sterilizálási módszerként a 2,5-diketoD-glükonsav fermentlében a hősterilizálást és a szűréssel való sterilizálást vizsgálták meg. A 2,5-diketo-D-glükonsav hőérzékenysége és a szűréssel való sterilizálás ipari méretben nagy költségekkel is csak gyenge eredményességgel megvalósítható volta miatt a feltalálók a (III) törzs sterilizálásának egy másfajta megvalósítási módszerét találták alkalmazhátónak 2-ketó-L-gulonsav ipari termelésének megvalósítása céljára. Egy sor különféle vizsgálat után a feltalálók a harmadik megoldást, a (III) törzs valamilyen felületaktív anyaggal való sterilizálásának módszerét találták biztonságosan és olcsón megvalósíthatónak.

A jelen találmány szempontjából ennek az, az előnye van, hogy nincs szükség további, különlegesen a sterilizálásra tervezett berendezésre az eljárás megvalósításához, a felületaktív anyag könnyen kiválasztható a sok ilyen közül, hogy ne gátolja a (II) mutáns 2-keto-L-gulonsav termelését, és a felületaktív anyag maga olcsó és könnyen hozzáférhető.

További haladás az, hogy az eljárás könnyen megvalósítható nagy méretekben való termelésnél.

A vizsgált felületaktív anyagok közül a nátrium-dodecil-szulfonátot találtuk különösen előnyösnek.

A találmány szerinti eljárás röviden a következőképp szemléltethető.

Először, a D-glükóz szubsztrátot, nitrogénforrásként kukoricalekvárt és szervetlen sókat tartalmazó táptalajt beoltjuk a 2,5-diketo-D-glükonsavat termelő (III) törzszsel, és 28 °C-on tenyésztjük keverés és levegőztetés közben.

Ezt követően a fent leírt módon készített fcrnicntlevet két részre osztjuk, és az egyiket 0,01-0,25 súly/térf.% végső koncentrációig aszeptikusán adagolt felületaktív anyaggal kezeljük, és 5—28 °C-on hagyjuk néhány órát állni óvatos, és mérsékelt keverés közben. A másik részt felületaktív anyag hozzáadása nélkül hagyjuk állni hasonlóképpen 5-28 °C-on néhány óra hosszáig.

A felületaktív anyaggal, például nátrium-dodecilszulfonáttal való kezelés alatt a (III) törzs élő sejtjeinek száma a kezelt fermentlében kevesebb, mint egymilliomod részére csökken a kezeletlenben lévő élő sejtszámhoz képest. A csökkenés azonban az alkalmazott törzstől és felületaktív anyagtól függően változik. A kezeletlen 2,5-diketo-D-glükonsav fcrnicntlc egy másik részét szűréssel sterilezzük.

Ezután hidrogéndonorként glükózt adunk aszeptikus körülmények között a felületaktív anyaggal kezelt fermentléhez, a szűréssel sterilezett fermentléhez, illetve a kezeletlen 2,5-diketo-D-glükonsav fermentléhez 1-10% végső koncentrációig, mielőtt a fernientleveket hozzáadnánk a (II) mutáns tenyészetéhez.

A fentiektől függetlenül a (II) mutánst megfelelően tenyésztjük a 2,5-diketo-D-glükonsav fertmentlé felületaktív anyaggal való kezelésének ideje alatt. A (II) mutáns tenyészetéhez 15-120 perces időközönként adagonként betápláljuk az előbb készített három 2,5diketo-D-glükonsav fermentlét úgy, hogy 0,05—2,0% <

2,5-diketo-D-glükonsav koncentrációt érjünk el, közben figyeljük a fermentlében megmaradó 2,5-diketo-Dglükonsav mennyiségét, és a tenyésztést a betáplálás kezdete után 48 óráig folytatjuk. A felületaktív anyaggal·' való sterilezés, vagy a szűréssel való sterilezés esetében is a 2,5-diketo-D-glükonsav simán átalakul 2-keto-L-gulonsawá. Viszont a sterilizálás elhagyása esetében a (III) törzs sejtszaporulata több, mint 10⁵ sejt/ml fölé emelkedik,és végül leállítja a 2-kcto-L-gulonsav termelését.

Amint később a példában szemléltetjük, a sterilizálás felületaktív anyaggal való kezeléssel vagy szűréssel végezhető. Mivel azonban a fermentlé szűrésével való sterilizálása csak lépcsőzetes kezeléssel lehetséges, ha a fermentlé nagy koncentrációban tartalmaz. 2,5-diketo-D-glükonsavat, erre való tekintettel ennek megvalósítása Ipari termelési léptékben költségessége miatt csaknem lehetetlen. Ennélfogva a jelen találmány szerinti felületaktív anyaggal való sterilezés nagy jelentőségűnek bizonyult. Az előnyös megvalósítások leírása:

A következő leírásban a jelen találmányt példa útján részletesebben szemléltetjük. A leírás tartalma és részletezése a következő:

1. példa A (II) mutáns deriválása.

A előállítási példa: 2,5-Diketo-D-glükonsav fermentlé.

B előállítási példa: 2,5-Diketo-D-glükonsavkalciumsó oldata.

2. példa A (II) mutáns alkalmazása 2-keto-L-gulonsav fermentációval való előállításában. ·'

3. példa. A (II) mutáns sejtszuszpenziójának és sejtextraktumának felhasználása 2-keto-Lgulonsav termelésében.

4. példa. Nitrátsó és hidrogéndonor hozzáadása a fermentléhez.

5. példa. 2,5-Diketo-D-glükonsav fermentlé sterilizálása felületaktív anyaggal.

Analízis módszer:

(i) 2-Keto-L-gulonsav, 2-keto-D-gulonsav és 2,5-diketoD-glükonsav.

(a) Gáz-folyadék kromatográfia:

Oszlop: SE 52 (5%); minta: trimetil-szililezve; vivőgáz:hélium; hőmérséklet: 160—210 C.

(b) Papír-vagy vékony réteg-kromatográfia:

Hordozó: Toyo Roshi No. 50, vagy cellulóz vékonyréteg alumíniumfólián (beszerezhető a Toyo Roshi K. K. vagy Merck A. G, cégektől). Kifejlesztő oldószer:

fenol :hangyasav :víz = 75 :4 :25. Színreagens:

Anilin-hidrogén-ftalát (AHF) oldat. (Készítése: 0,93 g anilint és 1,66 g ftálsavat oldunk 100 ml vízzel telített n-butanolban). Akromatogramot bepermetezés után 105 °C-on 2 percig melegítjük.

(ii) D-glükóz:

„Glucose B test”. Beszerezhető a Wako Junyaku Kógyó K. K. cégtől.

195 536

1. példa [A (II) mutáns deriválása.] (1) Folyékony táptalaj:

% Bacto marhahús kivonatot (Difco), % Bacto peptont és 0,5% nátrium-kloridot tartalmazó vizes oldat pll-ját 7,2-rc állítjuk. A oldat 50 ml-es részleteit 500 ml-es kúpos lombikokba töltjük, és 115 °C-on 20 percig sterilizáljuk.

(2) Minimál (agar) táptalaj.

Az alábbi összetételű táptalaj pH-ját 7,2-rc állítjuk,
és 115 C-on 15 percig sterilizáljuk.
Ammónium-klorid	0,5%
ammónium-nitrát	0,1%
nátrium-szulfát	0,2%
magnézium-szulfát-he ptahidrát	0,1%
kalcium-karbonát	0.0001 %
kálium-dihidrogén-foszfát	0,3%
dikáliiim-hidrogcn-foszfát	0,1%
nyomelem oldat*	0,1%
vitamin oldat**	0,1% és
agar	2,0%.
^Nyomelem oldat (alkotórészek 1 liter oldathoz):
Dináírium-tetraborát-dekahidrát	88 mg.
ammónium-molibdenát-tetrahidrát	37 mg,
vas(III)-triklorid-liexahidrát	970 mg,
cink-szulfát-heptahidrát	88 mg,
réz(ll)-szulfát-pentahidrát	270 mg és
mangán(II)-diklorid-tetrahidrát	27 mg.

^Vitamin oldat (alkotórészek 1 liter oldathoz):

Ttamin 1,0 mg, pantoténsav 10 mg, niacin 10 mg és biotin ' 0,1 mg.

(3) D-Glükonsav és 5-keto-D-glükonsav oldata. Nátrium-D-glükonát és nátrium-5-keto-D-glükonát

10%-os vizes oldatainak pH-ját 6,8—7,2-re állítjuk, és szűréssel sterilizáljuk.

(4) A mutánsok elkülönítésének módja.

Egy-egy kacsnyi Corynebacterium sp. FERM-P

2770-t és Corynebacterium sp. FERM-P 2687-t oltunk az (i) folyékony táptalajra, és 28 °C-on 8 óra hosszáig tenyésztjük. Minden egyes tenyészethez előzetesen sterilizált 0,2%-os vizes N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidin oldatot adunk 0,02% végső koncentrációig, és utána a tenyésztést még 30 percig folytatjuk. A tenyészetet centrifugáljuk [10 000 ford./perc, 15 perc], és a sejteket összegyűjtjük.

Az összegyűjtött sejteket háromszor mossuk sterilizált fiziológiás nátrium-klorid oldattal, és 10-10 ml nátrium-klorid oldatban szuszpendáljuk. A szuszpenziókból 1-1 ml-t oltunk az (1) táptalajra, és 28 °C-on 15 óra hosszáig tenyésztjük. A tenyészetet utána ΙΟ²—IO³ élő sejt/ml-re hígítjuk sterilizált nátrium-klorid oldattal. Utána minden egyes hígított tenyészetből 0,5-1 ml-t szélesztünk a (3) D-glükonsav oldat és a (2) minimál agar táptalaj 1 :9 arányú keverésével készített lemezeken, és 28 °C-on 3-5 napig hagyjuk tenyészni.

A kinőtt sejtek telepeit [a 3. táblázat (1) törzse· amely D-glükonsav táptalajon tenyészik] bársony kendővel átvisszük a (3) 5-keto-D-glükonsav oldat és a (2) minimál agar táptalaj 1 :9 arányú keverésével készített táptalaj lemezre. 3-5 nap tenyésztés után azoknak a sejteknek a telepeit, amelyek a D-glükonsav táptalajon nőnek, de nz. 5-kclo-D-glílkonsav táptalajon nem nőnek, leszedjük, és D-glükonsav táptalajra oltjuk tenyészteni.

Az így szelektált mutánst [a 3. táblázatban (2) törzs, amely nem nő az 5-keto-D-glükonsav táptalajon] 1% 5-keto-D-glükonsavat tartalmazó (1) táptalajra oltjuk, és 28 °C-on 24 óra hosszáig tenyésztjük. A tenyészetben megmaradó 5-kcto-D-glíikonsavat papírkromatográfiával meghatározzuk, hogy megerősítsük, hogy ez a (2) törzs ⁶ nem képes 5-keto-D-glükonsavat hasznosítani.

A 2. példában leirt (2) táptalajt beoltjuk egy kacsnyi mutánssal, amelyről bebizonyosodott, hogy nem képes 5-keto-D-glükonsavat hasznosítani [(3) törzs a 3. táblá2θ zatban], és 20 órán keresztül inkubáljuk. Az így inkubált táptalajhoz, adjuk 1,0% végső koncentrációig a kaicium2,5-diketo-D-glükonát oldatot, amelyet a B előállítási példában írunk le, és az inkubálást további 24 órán keresztül folytatjuk.

A tenyészclcgyben lévő 2-keto-D-glükonsav és 2-ketoL-gulonsav mennyiségét papírkromatográfia segítségével határozzuk meg. Az eredmények á 3. táblázatban láthatók.

így 84 520 mutagenizált Corynebacterium sp. FERM-P

2770 telepből 308 kívánt mutánst kapunk, amelyek defektívek 5-keto-D-glükonsav metabolizálásában, és lényegében képtelenek 2-keto-D-glükonsav termelésére, és hasonló módon 11 kívánt mutánst kapunk 29,100 mutagenizált Corynebacterium sp. FERM-P

2687 telepből.

3. táblázat

Coryne- Corynebacterium bacterium

2-Keto-L-gulonsavat termelő pERM-P sp. FERM-P mikroorganizmus (szülők) ₂770 2687 (A mutáns törzsek száma)

	Törzsek (1), amelyek D-glükonsav táptalajon tenyésznek	84,520	29,100
50	Olyan (1) törzsek (2), amelyek 5-keto-D-glükonsav-	363	45
	táptalajon nem tenyésznek Olyan (1) törzsek (3), amelyek 5-keto-D-glükonsavat	319	13
55	nem hasznosítanak Olyan (3) törzsek, amelyek 2-keto-L-gulonsavat termelnek,	308	11
60	de nem termelnek 2-keto-Dglükonsavat.

A előállítási példa. (2,5-Diketo-D-glükonsav fermentlé) (i) Oltó táptalaj:

1,0% D-G!ükózt,

5,0% kukoricalekvárt,

195 536

0,1 % kálium-dihidrogén-foszfátot,

0,02% magnézium-szulfát-heptahidrátot és

0,5% kalcium-karbonátot tartalmazó vizes oldat pH-ját 10%-os nátrium-hidroxid oldattal 6,8—7,0-re állítjuk,és 50 ml-es részletekre osztva 500 ml-es kúpos lombikokba töltjük. Az oltótáptalajt 120 °C-on 20 percig sterilizáljuk.

(ii) Oltó tenyészet;

A lombikban lévő (i) oltó táptalajt egy kacsnyi, az 1. táblázatban feltüntetett Erwinia punctata FERM-P 5452-vel oltjuk be, és rázatás közben (71 mm amplitúdó 270 ford./perc) 28 °C-on 8-11 óra hosszáig inkubátjuk. Az oltó tenyészetet abban az időpontban állítjuk le, amikor optikai sűrűsége körülbelül 8-at ér el (végpont).

(iii) Fermentációs táptalaj:

20% D-Glükózt, % kukoricalekvárt,

0,1 % kálium-dihidrogén-foszfátot,

6,3% kalcium-karbonátot és

0,01 % habzásgátló polipropilén-glikott (P-2000) tartalmazó vizes oldat pH-ját 6,8—7,0-re állítjuk és 120 C-on 20 percig sterilizáljuk, majd 455 ml-es adagokat töltünk aszeptikusán 1 literes sterilizált fermentorba, és 45—45 ml fenti (ii) oltó tenyészetet adunk mindegyikhez.

(iv) Fermentáció:

A fermentációt 28 °C-on 600 Nml/perc levegő átvezetéssel és 1740 ford./perc keveréssel végezzük 20—30 óra hosszáig (a végső 2,5-diketo-D-glükonsav koncentráció körülbelül 19 súly/térf.%). A fermentlevet a sejtek eltávolítása céljából centrifugáljuk, és a felülúszót szűréssel sterilizáljuk. Ezt használjuk 2^5-diketo-D-glükonsav fermentléként.

(v) Végpont:

A fermentációt akkor állítjuk le, amikor a 2-keto-D5 glükonsav piros foltja eltűnik a fermentlé vékonyrétegkreiiiatogiainjáról.

B előállítási példa. (2,5-Diketo-D-glükonsav-kalciumsó oldata.) ¹θ 5% porított 2,5-diketo-D-glükonsav-kalciurtisó oldásával készített 5,0%-os vizes oldatot sterilizálunk szűréssel.

2. példa.

1® [A (II) mutáns használata 2-keto-L-gulonsav fermentációval való termelésére.] (1) Oltó táptalaj. (Az összes következő példákban haszon nálatos).

1,0% D-Glükóz.t,

0,5 % Bacto élesztőkivonatot/Difco),

0,5 % Bacto peptont (Difco),

0,1 % kálium-dihidrogén-foszfátot és

0,02% magnézium-szulfát heptahidrátot tartalmazó vizes oldat pH-ját 7—7,2-re állítjuk 10%-os nátriuiu-liidroxi oldattal. 50—50 ml-es adagokat töltünk 500 ml-es kúpos lombikokba, és 115 °C-on 20 percig sterilezzük.

(2) Fermentációs táptalaj.

1,0% D-Glükózt,

3,0% kukoricalekvárt,

4. táblázat

2-Keto-L-gulonsav és a 2-keto-D-glükonsav felhalmozódás (mg/ml) olyan fermen Hevekben, amelyekben az (I) szülőtörzset, illetve (II) mutánst tenyésztettük.

A meghatározás a tenyésztés kezdete után 48 órával történt.

A 2,5-diketo-

2-Keto-L-gulonsavat termelő mikroorganizmus törzsek	D-glükonsav betáplálás ideje a tenyésztés kezdete után (óra)	2,5 -Dike to-D-glükonsav-kal ciumsó vizes oldata (szűréssel sterilizálva)	FERM-P 5452, ATCC 31626 fermentleve (szűréssel sterilizálva)
2 KLG, mg/ml	2 KDG, mg/ml	2 KLG,	mg/ml 2 KDG, mg/ml
Corynebacterium sp.	0	1,50	0,46	1,75	0,58
FERM-P 2770
ATCC No. 31090	16	3,85	1,38	4,10	1,45
5 -Ke to-D-glükonsav	0	5,20	0	5,33	0
metabolizmus hiány-	16	7,30	0	8,20	0

mutáns (FERM-BP 108)

Corynebacterium sp.	0	0,28	0,42	0,38	0,24
FERM-P 2687, ATCC No. 31081	16	0,70	0,70	0,73	0,68
5-Keto-D-glükonsav	0	0,25	0	0,40	0
metabolizmus hiány-	16	0,83	0	0,86	0

mutáns (FERM-BP 107)

KLG; 2-keto-L-gulonsav; 2 KDG: 2-kcto-D-glükonsav.

195 536

0,1 % kálium-dihidrogén-foszfátot és 0,02% magnézium-szulfát heptahidrdtot tartalmazó vizes oldat pH-ját 10%-os nátrium-hidroxid oldattal 7—7,2-re állítjuk. 50—50 ml-cs adagokat töltünk 500 ml-es kúpos lombikokba, és 115 °C-on 20 percig sterilizáljuk.

(3) 2— Keto-L-gulonsav előállítása.

Az (1) oltó táptalajt beoltjuk egy-egy kacsnyi 2-ketoL-gulonsav termelő mikroorganizmussal [(I) szülő] vagy az (I)-ből derivált (II) mutánssal, amelyek a 4. táblázatban láthatók, és a beoltott táptalajt 28 °C-on 24 óra hosszáig tenyésztjük. Utána 5-5 ml oltótenyészetet oltunk a (2) fermentációs táptalajba, és tenyésztjük. A

2,5-diketo-D-glükonsav oldatok valamelyikét ¢4 és B előállítási példák) adjuk a fermentléhez 2% végső koncentráció eléréséig a kezdéskor és a fermentáció kezdetétől számított 16 órán belül bármely időben, és a fermentációt további 48 óra hosszáig folytatjuk.

A termékek ga'z-folyadék kromatográfiájának eredményeit a 4. táblázatban összegezzük. Amint a 4. táblázatban jelezzük, a (II) mutáns fermentleveiből nem mutattunk ki 2-keto-D-g!ükonsavat, míg az (I) szülő törzs fermcntlevébcn jelentős mennyiségű 2-keto-D-glükonsav volt.

3. példa [Sejtszuszpenzió és sejtkivonat használata 2-keto-L-gulonsav kontakt-termelésben.] (1) Oltó tenyészet:

A 2. példában leírt (1) oltó táptalajt beoltjuk egy kacsnyi Corynebacterium sp. FERM-P 2770-nel (I), vagy az 5-keto-D-glükonsav metabolizálásában defektív, és 2-keto-D-glükonsav termelésre lényegében képtelen FERM-BP 108 mutánssal (II), és rázás közben 28 °C-on 24 óra hosszáig tenyésztjük.

(2) Tenyészet sejtszuszpenzió vagy sejtkivonat előállításához:

455 ml 2. példa (2) pontjában leírt fermentációs táptalajt, amely még 0,01% habzásgátló polipropilénglikol P 2000-t tartalmaz, aszeptikusán egy 1 literes fermentorba töltünk, és 45 ml (1) oltókuítúrával beoltjuk. A fermentációt 28 °C-on 16 óra hosszáig végezzük 1740 ford./perc keverés, és 600 normál ml/perc levegőztetéssel.

(3) Sejtszuszpenzió készítése:

A (2) tenyészetet 15 000 ford./perc-nél centrifugáljuk a sejtek összegyűjtése céljából, amelyeket utána kétszer mosunk fiziológiás sóoldattal. A mosott sejteket 0,05 mólos trisz-pufferban (pH = 7,5) szuszpendáljuk θθίβο nm = 12 szuszpenzióig.

(4) Sejtkivonat készítése:

A mosott sejteket a (3) pontban leírthoz hasonló módszerrel szuszpendáljuk 0,05 mólos trisz-pufferban (pH = 7,8) OD,;_űn = 100 szusz.pcnzióig, amelyet egy sejtprésen nyomatunk át 131 kPo nyomáson. Az érintetlen sejteket és a sejttörmeléket 20 000 G-nél 30 percig tartó centrifugálással eltávolítjuk. A visszamaradó felülúszót 0,05 mólos trisz-pufferrel (pH = 7,5) szemben 15 óra hosszáig dializáljuk, és a kapott folyadékot tekintjük sejtkivonatnak.

(5) 2-Keto-L-gulonsav termelése a (3) scjtszuszpcnzióval.

ml (3) sejtszuszpenziót elegyítünk 2 ml 2,5-di8 keto-D-glükonsav-kalciumsó oldattal (B előállítási példa), és az elegyet rázás közben 30 °C-on 15 óra hosszáig hagyjuk reagálni. Ezután a reakcióelegyet 15 OOO G-nél 15 percig centrifugáljuk a sejtek eltávolítása céljából, és gáz-folyadék kromatográfiával meganalizáljuk 2-keto-Lgulonsavra és 2-keto-D-glükonsavra. A kvantitatív meghatározás eredményeit az 5. táblázatban adjuk meg.

J. táblázat

A sejtszuszpenzió készítésére Koncentráció használt mikroorganizmusok: a reakclóelegyben:

Corynebacterium sp FERM-P 2770 ATCC31 090	2-keto-L- gulonsav 1,93 mg/ml	2-keto-Dglükonsav 0,64 mg/ml
5-Keto-D-glükonsav
metabolizálásában defektív
FERM-BP 108 mutáns	2,65 mg/ml	0 mg/ml

(6) 2-Keto-L-gulonsav termelése a (4) sejtkivonattal:

0.5 ml (4) sejtkivonatot adunk 2,5 ml 0,1 mólos trisz-pulfcrhoz (pH = 7,5), amely 75 Mmól 2,5.-diketoD-glükonsav-kalciumsót és 15 Mmól NADPH-t (redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfátot) tartalmaz, és 30 °C-on 16 óra hosszáig hagyjuk reagálni. A reakcióclcgy kvantitatív meghatározásának eredményeit a

6. táblázatban adjuk meg.

6. táblázat

A sejtkivonat készítésére Koncentráció használt mikroorganizmusok: reakcióelegyben:

Corynebacterium sp.	2-keto-L- gulonsav	2-keto-D- glükonsav
FERM-P 2770 5-Keto-D-glükonsav metabo- lizálásában defektív	285 Mg/ml	32 Mg/ml
FERM-BP 108 mutáns	356 Mg/ml	0 Mg/ml

A fenti 5. és 6. táblázatokban látható eredményekből kiderült, hogy 2-keto-L-gulonsav keletkezett mindegyik reakcióban, ahol a (3) sejtszuszpenziót vagy a (4) sejtkivonatot használtuk.

Mindkét esetben a terméket a jelenlévő 2-keto-Lgulonsavat termelő mikroorganizmus törzs termelte, azonban az (I) FERM-P 2770 törzs 2-keto-D-glükonsavat is termel a 2-keto-L-gulonsavval együtt, míg a (II) mutáns termel 2-keto-L-gulonsavat, de nem termel 2-kcto-D-glükonsavat.

4. példa [Nitrát és hidrogén donor hozzáadása a fermentléhez.] (1) 2,5-Diketo-D-glükonsav fermentlé.

Az A előállítási példa szerint készített fermentlét

000 ford./perc-nél 15 percig centrifugáljuk a sejtek

195 536 eltávolítása céljából, és a felülúszót szűréssel sterilizáljuk (2,5-diketo-D-glükonsav koncentráció: 19%).

A sterilizált fermcntlevet sterilizált 50%-os vizes D-glükóz oldattal elegyítjük, amíg a hidrogéndonor D-glükóz koncentrációja 3,8% lesz a fermentlében.

(2) Fermentációs táptalaj (a 2-keto-L-gulonsav előállítására megfelelő példákhoz szokásos):

2,0% D-Glükózt,

3,0% kukoricalekvárt,

0,1 % kálium-dihidrogén-foszfátot,

0,02% magnézium-szulfát heptahidrátot és 0,01 % polipropilén-glikol (P-2000) habzásgátlót tartalmazó vizes oldat pH-ját 7,0-7,2-re állítjuk és 450 ml-es adagokat 115 °C-on 20 percig sterilizálunk, és aszeptikusán 1 literes sterilizált fermentorba töltjük.

(3) Nitrogénvegyület adalékok készítése.

Nátrium-nitrátból, kálium-nitrátból, nátrium-nitritből és ammónium-kloridból külön-külön 10%-os vizes oldatot készítünk, és szűréssel sterilizáljuk, hogy a tenyésztés kezdetén és a 2,5-diketo-D-glükonsav betáplálás kezdetén adjuk hozzá az adalékokat a táptalajhoz.

(4) Fermentáció (2-keto-L-gulonsav előállítására).

A 2. példában leírt (1) oltótáptalajt egy kacsnyi 5keto-D-glükonsav metabolizálásában defektív, és lényegében 2-keto-D-glükonsav. termelésére képtelen FERM-BP 108 mutánssal oltjuk be, amelyet Corynebacterium sp. FERM-P 2770, ATCC No. 31 090-ből deriváltunk, és a beoltott táptalajt rázás közben 28 °C-on 20-24 óra hosszáig inkubáljuk. Az oltótenyészet 50-50 miét oltjuk a (2) fermentációs táptalajba, és a (3) pont szerint készített különböző nitrogénvegyület adalékok 0,25 %-os < végső koncentráció eléréséig való aszeptikus hozzáadása után 28 °C-on 1,2 térf./térf./perc levegőztetés és 1740;

ford./perc keverés mellett 10-16 óra hosszáig tenyészt-, jük.

Miután az előbb leírt kvantitatív meghatározással meggyőződünk a D-glükóz elfogyásáról, újból hozzáadunk a (3) pont szerinti nitrogénvegyület adalékokból

0,1% végső koncentrációig. Továbbá 3,8% D-glükózt tartalmazó 2,5-dikclo-D-glükonsav fermcntlevet adunk hozzá 0,2% végső D-glükóz koncentrációig.

Ezt követően 2,5-diketo-D-glükonsavat adagolunk apránként a tenyészethez 15—120 percenként körülit belül 0.2% koncentrációig, közben minden egyes betáplálás után nyomon követjük az illető sav elfogyását a fermentlcből. ·

A 2,5-diketo-D-glükonsav betáplálást a beadagolás 2Q kezdete után 45 órával megszüntetjük, de a tenyésztést további 3 óráig folytatjuk (összes tenyésztési idő az indulástól: 48 óra).

Miután a tenyésztést befejeztük, a fermentlét gázkromatográfiával meganalizáljuk 2-keto-L-gulonsavra,

2-keto-D-glükonsavra és 2,5-diketo-D-giükonsavra.

Eredményként megállapíthatjuk, hogy a ferméntlevek egyikéből sem mutatható ki 2-keto-D-glükonsav. A különböző nitrogénvegyület adalékokkal dúsított fermentlcvekben felhalmozódott 2-keto-L-gulonsav mennyi3Q segeket a 7. táblázatban összegezzük.

7. táblázat

Az eredeti fermentációs táptalajhoz és a táptalajhoz a 2,5-diketo-D-glükonsav betáplálás kezdetén adott különböző nitrogénvegyület adalékok előnyös hatása a 2-keto-L-gulonsav felhalmozódására

A táblázatban megadott értékek a fermentlében felhalmozódott 2-kcto-L-gulonsav töménységét, a zárójelben lévő értékek a prekurzorból keletkezett 2-keto-L-gulonsav moláris kitermelését adják meg, amelyet a [termelt 2-keto-L-gulonsav (mól): betáplált 2,5-diketo-D-glükonsav(mól)]X 100 képlettel számítottunk.

A 2,5-Diketo-D-glükonsav betáplálás kezdetén hozzáadott nitrogénvegyület

2-Keto-L-gulonsav felhalmozódás, mg/ml; (2-keto-L-gulonsav moláris kitermelése, %)

D-Glükóz hidrogéndonor jelenléte

Semmi

Nátriumnitrát

Káliumnitrát

Nátriumnitrit

Ammóniumklorid

Az eredeti fermentációs táptalajhoz adott nitrogénvegyület mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml mg/mi

Semmi

Nátrium-nitrát

Kálium-nitrát

Nátrium-nitrit

Ammóniurn-kloiid nem igen nem igen nem igen nem igen nem igen

8,2

15.7

8,6

26,5

8,8

25.8

3.2 8,1

9.2 17,0 (41) (75) (49) (91) (52) (92) (31) (54) (42) (78)

8,9

22,0

12.1

40,2 (43) (87) (48) (93)

9,0

22,1 (43) (86)

3,9

6,0

4.4

16,0 (38) (62) (45) (88)

8,9

16,0

9,2

27,5 (46) (78) (43) (90)

12,2

40,3 (46) (93)

3,6

7,8 (38) (53)

9,7

18,3 (45) (80)

195 536

Amint a 7. táblázatból látható, amelyben összehasonlítást teszünk azon esetek között, amikor nitrátot adunk a táptalajhoz vagy a fermentléhez a fermentáció kezdetén valamint a 2,5-diketo-D-glükonsav betáplálás kezdetén, és D-glükózt - amely hidrogéndonorként szolgál — 5 adunk 2,5-diketo-D-glükonsav adagolásával együtt, illetve nem adunk ilyen adalékokat, nyilvánvaló, hogy a 2-kctoL-gulonsav felhalmozódás a fermentlében 8,2 mg/inl-től 40 mg/ml-ig nő (körülbelül ötszörös növekedés) és a 2keto-L-gulonsav kitermelése (mól%) 41 %-tól 93 %-ig nő. 10

Mértük a sejtkoncentrációt optikai sűrűség (O.D.) egységekben, amikor a D-glükóz eltűnik a fermentléből, és a 8. táblázatban összegezzük az eredményeket. Ezek azt jelzik, hogy a nitrát nitrogénforrásként nem hatásos. Amint a 8. táblázatból látszik, bár a sejtkoncentrációban ¹⁵a nitrát hozzáadására fellépő növekedés csak 11,6%-ra korlátozódik, de az ammóniumsó hozzáadására körülbelül 40%-ra nő. Ez a tény azt mutatja, hogy a nitrát hatása nitrogénforrásként gyengébb, mint az ammó- 20 niumsóé.

A fenti tényből megerősítést nyer az, hogy a nitrátnak a táptalajhoz való hozzáadása csak kis hatással van a sejtkoncentráció növekedésére, de nagyon előnyös hatása van a 2-keto-L-gulonsav termelés növekedésére, 25 és a 2,5-diketo-D-glükonsav - 2-keto-L-gulonsawá való átalakítása moláris kitermelésének emelésére.

8. táblázat

A tenyésztés kezdetén hozzáadott adalékok hatása a mikroorganizmusok növekedésére [Λ táblázatban felsorolt értékek 660 nm-nél mért optikai sűrűségben (O.D.) adják meg a sejtkoncentrációt a D- 35 glükóz elfogyásának idején.]

A tenyésztés kezdetén hozzáadott adalék	Optikai sűrűség (O.D.)	40
Semmi	13,7
Nátrium-nitrát	15,3
Kálium-nitrát	15,0
Nátrium-nitrit	11,1	45
Ainmónium-klorid	19,3

5. példa [2,5-Diketo-D-glükonsav fermentlé sterilizálása 50 felületaktív anyagokkal.]

Az A előállítási példa szerint előállított fermentlevet néhány adagra szétosztjuk közvetlenül azután, hogy a gg tenyésztést megszakítottuk. A felsorolt felületaktív anyagokat aszeptikusán adjuk a fermentlé egyes adagjaihoz 0,025 súly/térf.% végső koncentrációig. Az alkalmazott felületaktív anyagokat a 9. táblázatban soroljuk fel.

A felületaktív anyaggal való kezelést óvatos rázás θθ közben 28 °C-on 6 óráig végezzük. Ezek közül a 2,5diketo-D-glükonsav fermentlevek közül a nátrium-dodecil-szulfonáttal kezeltet használjuk a 2-keto-L-gulonsav (II) mutánssal való fermentálására, amelyet később írunk le. 65

9. táblázat

Különböző felületaktív anyagok bactericid hatása

a (III) FERM-P 5452 törzsre
Felületaktív anyag (0,025 súly/térf.%)	Csökkenés a milliliterenként! élő sejtszámban
Kezdeti	28 °C-on 6 óráig tartó kezelés után
Semmi Nátrium-dodecil-szulfonát	2,3X10’ 2,3X10’	1,5X10® 7,5X10®

Zsírsav-szorbitát (Span 60, beszerezhető a Kaoo Atlas

K.K.-tól)		2,3X10’	2,2X10®
Nátrium-sztearát		2,3X10’	l,7X10⁸
Nátriuni-mirisztát		2,3X10’	1,6X10®
	HS210	2,3X10’	3,8X10“
Nonion	HS 215	2,3X10’	4,5X10“
(beszerezhető	HS 230	2,3X10’	6,7X10“
a Nihon Yushi K.	L 4	2,3X10’	2,1X10®
K.-tól)	NS240	2,3X10’	5,0X10^s

(1) D-glükóz hozzáadása a 2,5-diketo-D-glükonsav fermentléhez.

50%-os vizes D-glükóz oldatot adunk minden egyes nátrium-dodecil-szulfonáttaí kezelt fermentléhez, a fermentlevet szűréssel sterilizáljuk, és a kezeletlen fertmentlé végső koncentrációját 3,8%-ra állítjuk be, közvetlenül a fermentlének a (II) mutáns tenyészetéhez való hozzáadása előtt. Ezek a 2,5-diketo-D-glükonsav fermentlevek szerepelnek a következőkben „szubsztrát oldaí’-ként, és szolgálnak nyersanyagként a 2-keto-L-gulonsav termeléshez.

(2) 2-Keto-L-gulonsav termelése 2,5-diketo-D-glükonsavból a (II) mutánssal.

(i) Oltó tenyészet:

A 2. példában leírt (1) oltó táptalajt egy kacsnyi 5keto-D-glükonsav metabolizálásában defektív és lényegében 2-keto-D-glükonsav termelésére képtelen FERM-BP 108 (II) mutánssal oltunk be, amelyet Corynebacterium sp. FERM-P 2770, A'I'CC No. 31 090-ből deriváltunk, és 28 °C-on 20—24 óra hosszáig inkubáljuk rázás közben (71 mm amplitúdó, 270 ford./perc).

(ii) Fermentáció (a):

A 4. példa (2) pontjában leírt fermentációs táptalajt, amely még 0,2% nátrium-nitrátot is tartalmaz, 50 ml oltó tenyészet oldattal oltjuk be, és 28 °C-on ΙΟΙ 6 óra hosszáig inkubáljuk 600 normál/ml/perc levegőztetés és 1740 ford./perc keverés mellett.

(iii) Fermentáció (b):

Miután a D-glükóz felhasználódott, és eltűnt a FERM-BP 108 (II) mutáns tenyészetéből, az(l) pontban leírtak szerint készített szubsztrát oldatot hozzáadjuk a tenyészethez úgy, hogy a 2,5-diketo-D-glükonsav koncentráció 0,2% legyen.

Ezt követően a szubsztrát oldatot 15—120 percenként adagoljuk a tenyészethez, miközben nyomon követjük a 2,5-diketo-D-glükonsav fogyását a tenyészetben, és

-10I

195 536 ügyelünk arra, hogy koncentrációja minden egyes betáplálás után közvetlenül körülbelül 0,2 % legyen.

A szubsztrát oldat betáplálását a 45. óra után abbahagyjuk, de a tenyésztést további 3 óráig folytatjuk, így az összes tenyésztési idő a betáplálás kezdetétől számítva 48 óra lesz.

A fermentléből előre meghatározott időközönként aszeptikusán mintát veszünk, meganalizáljuk 2,5-diketoD-glükonsavra és 2-keto-L-gulonsavra, és megszámoljuk a mintában lévő élő sejteket [lásd (3) pont], 10

Az analízis és a sej (számlálás eredményeit a 10. táblázatban összegezzük.

(3) A (111) törzs élő sejtjei számának meghatározása.

A fermentlé mintáját sterilizált fiziológiás sóoldattal hígítjuk, és glicerines húsleves agar táptalajon szélesztjük, amelyet utána 28 °C-on, 24—36 óra hosszáig inkubálunk.

A táptalajon lévő élő sejtek számát a telepek számával határozzuk meg.

Megjegyzés: mivel a (111) törzs növekedési sebessége „„ jóval nagyobb mint a (II) mutánsé, a (II) mutáns setjeivel összekeveredett (III) törzs sejtjei különösebb nehézség nélkül külön megszámolhatok.

A fenti kísérletek eredményeiből a következő tényeket tudjuk alátámasztani:

(1) A 2,5-diketo-D-glükonsav fcnncntlébcn lévő (111) törzs részére baktericid szerként ajánlott és kipróbált különböző felületaktív anyagok közül a nátrium-dodecilszulfonát a legkiválóbb a baktericid hatás szempontjából (lásd 9. táblázat).

(2) Azon 2-keto-L-guIonsav termelési kísérletek eredményeképp (lásd 10. táblázat), amelyekben az előbbi körülmények között háromféle különbözőképp készített szubsztrát-oldatot alkalmaztunk;

(i) abban a fermentációs kísérletben, amelyben a kezeletlen szubsztrát oldatot használtuk, a (III) törzs élő sejtjeinek száma a szubsztrát oldat beadagolásának kezdete után 24 órával 10⁵ —10⁷ scjt/ml-re nőtt, míg a 2-keto-L-gulonsav felhalmozódás a másik két kísérlethez viszonyítva 24 óra múlva úgyszólván alig nőtt;

(ii) abban a fermentációs kísérletben, ahol a nátrium- ₍dodecil-szulfonáttal' kezelt szubsztrát oldatot ada5 goltuk, a (III) törzs élő sejtjei számának növekedése hatásosan 10⁴ scjt/ml-nél kevesebbre korlátozódott még a szubsztrát oldat hozzáadásának kezdetétől számított 48 óra múlva is, és a 2-keto-L-gulonsav felhalmozódása körülbelül 27 mg/ml-re nőtt;

(iii) az (ii) pontnál említett 2-keto-L-gulonsav felhalmozódás egyforma azzal a fermentációs kísérletével, amelyben a szűréssel sterilizált szubsztrát oldatot használtuk; és (iv) Az utóbb említett fermentációs kísérletben, amelyben szűréssel sterilizált szubsztrát oldatot adagoltunk, a (III) törzs élő sejtjeit nem tudtuk kimutatni, és a 2-keto-L-gulonsav termelés minden nehézség nélkül végbement.

Claims

1. Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására 2,5-diketoD-gliikonsav átalakításával 2-kcto-L-gulonsav termelésére képes élő, vagy feldolgozott mikroorganizmus jelenlétében vizes táptalajban, amelyhez 2,5-diketo-D-glükonsavat adunk, vagy kalcium-2,5-diketo-D-glükonát vizes oldata alakjában, vagy a Gluconobacter vagy Erwínia nemzetséghez tartozó, 2,5-diketo-D-glükonsavat termelő mikroorganizmus D-glükózt tartalmazó táptalajban való tenyésztésével kapott, adott esetben sterilizált fermentlé alakjában, a 2-keto-L-gulonsav feldúsításával, és a feldúsított 2-keto-L-gulonsavnak a fermentlével való elkülönítésével, azzal jellemezve, hogy a Corynebacterium nemzetséghez tartozó és 2,5-diketo-D-glükonsav 2-ketoL-guIonsavvá való átalakítására képes mikroorganizmusokat mutagén kezelésnek vetünk alá, a kezelt sejteket D-glükonsavat, mint egyedüli szénforrást tartalmazó

10. táblázat

A 25 DKG* fermentlé betáplálásának kezdete utáni idő (óra) 25 DKG fermentlé baktericides kezelése Kezeletlen Kezelés nátrium-dodecil- szulfonáttal Sterilezés szűréssel Termelt 2 KLG** (mg/ml) 10,2 10,8 10,9 8 A (III) törzs élő sejtjeinek száma (sejt/ml) 8.9X10³ nem volt mérve nem volt mérve Termelt 2 KLG (mg/ml) 14,8 18,6 18,7 24 A (III) törzs élő sejtjeinek száma (sejt/ml) 2,3 X10⁵ 3,5X10³ nem volt mérve Termelt 2 KLG (mg/ml) 15,8 26,6 26,3 48 A (III) törzs élő sejtjeinek száma (sejt/ml) 3,1 X10⁷ 3,3X10⁴ nem volt mérve

*25 DKG: 2,5-diketo-D-glükonsav, **2KLG: 2-kcto-L-gulonsav.

-111

195 536 tápközegre oltjuk, majd a kifejlődött telepeket 5-ketoD-glükonsavat, mint egyedüli szénforrást tartalmazó tápközegre oltjuk, a D-glükonsavon, mint egyedüli szénforráson növekvő, de 5-kcto-D-glükonsavon, mint egyedüli szénforráson nem növekvő telepeket izoláljuk, és a telepek közül a 2,5-diketo-D-glükonsavból 2-keto-Lgulonsavat termelő, de 2-keto-D-glükonsavat lényegében nem termelő telepeket kiválasztjuk, és az átalakítást az így kiválasztott mutánsok alkalmazásával végezzük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az átalakítást Coryncbactcriuin sp. FERM-BP 107 mutáns alkalmazásával végezzük.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az átalakítást Corynebacterium sp. FERM-BP 108 mutáns alkalmazásával végezzük.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mutáns tenyésztését és a 2,5-dikcto-D-glükonsav 2-keto-L-guIonsavvá való átalakítását szénhidrát vagy polihidroxi-alkohol hidrogéndonor, vagy nitrátsó jelenlétében végezzük.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nitrátsóként alkálifém- vagy alkáliföldfém-nitrátot használunk.

6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nitrátsóként nátrium-nitrátot vagy kálium-nitrátot használunk.

7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nitrátsót 0,05-0,5 tömeg/térf.% koncentrációban használjuk.

8. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 5 hogy hidrogéndonorként glicerint, glükózt, fruktózt, szacharózt vagy melaszt használunk.

9. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szénhidrát vagy polihidroxi-alkohol hidrogéndonort a 2,5-diketo-D-glükonsav 5-50 %-ának megfelelő θ mennyiségben használjuk.

10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2,5-diketo-D-glükonsavat tartalmazó fermentlét beadagolás előtt felületaktív anyaggal sterilizáljuk.

11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, ⁰ hogy felületaktív anyagként nátrium-dodecil-szulfátot használunk.

12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nátrium-dodecil-szulfátot 0,01—0,25 tömeg/térf.%

0 koncentrációban használjuk.

13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmust sejtszuszpenzió formájában használjuk. i

14. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 5 hogy a mikroorganizmust sejtkivonat formájában használjuk.