HU195425B

HU195425B - Process for producing retarde compositions for injections containing somatotropin

Info

Publication number: HU195425B
Application number: HU863652A
Authority: HU
Inventors: Thomas H Ferguson; Roger G Harrison; David L Moore
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1985-08-23
Filing date: 1986-08-22
Publication date: 1988-05-30
Also published as: CN1006197B; AU6170086A; PH25861A; EG17979A; DK396286D0; CN86105087A; HUT41637A; EP0211691A3; JPS6251624A; SU1683493A3; NZ217267A; IL79765A; ZA866218B; DK396286A; AU591516B2; CA1285874C; EP0211691A2

Description

Λ találmány tárgya eljárás olyan injektálható szomatotropin készítmény előállítására, amelyből a hatóanyag elnyújtva szabadul fel. A készítmény az 5—35 Ί koncentrációban levő borjú szomatotropint 1-207 viaszt cs 80 997 olajat tartalmazó közegben szuszpendálva tartalmazza.

Már több mint 35 éve ismert, hogy ha a tejelő teheneknek borjú szomatotropint adunk be, a tejtermelésük fokozódni fog anélkül, hogy ez kedvezőtlen hatással lenne a tej összetételére. [Cotes és munkatársai, Natúré, 164, 992 (1949)]. Cotes és munkacsoportjának eredményeit követően számos vizsgálatot végeztek a szomatotropin és a tejelő szarvasmarhák megnövekedőit tejtermelése közötti összefüggést illetően. Legújabban a figyelem a genetikailag módosított mikroorganizmusokkal történő szomatotropin termelésre terelődött [lásd például Eppard és munkatársai, Proc. Cornell Nutr. Conf. (1984), 5. old.]. Néhány kutató arról számolt be, hogy a mikroorganizmusok által termelt borjú szomatotropin még fokozottabb hatással van a tejtermelésre, mint a természetes hormon [DeGoster és munkatársai, 0085036 számú európai szabadalmi közzététel],

A találmányban a százalékok, arányok — hacsak másként jelezve nincs — tömegegységekre vonatkoznak.

A találmány módszert nyújt a tejelő tehenek tejtermelésének fokozására is, mely abból áll, hogy a fentebb jellemzett készítményt hatásos mennyiségben bejuttatjuk az állatba,

A készítményhez előnyösen növényi vagy állati eredetű viaszokat használunk. Alkalmas például az eszpártoviasz, japán viasz, a jojoba- (Simmondsia Californica) viasz, a gyapjúviasz, a cetveloviasz, a kínai viasz és főként a karnauba (Copernicia cerifera) viasz és a méhviasz. Könnyen beszerezhető a méhviasz különböző tisztaságú állapotban; a tisztított fehér méhviasz és a kereskedelmi közönséges sárga méhviasz egyaránt alkalmas a készítmény elkészítéséhez. Használhatjuk továbbá a petróleumviaszokat, ásványi viaszokat és szilikonviaszokat is.

Az olajokat a kellő tisztaságú és fiziológiák szempontokból alkalmazható, könnyen beszerezhető olajok közül választjuk ki. Az olajoknak természetesen kellő tisztaságúnknak kell lenniük, hogy a tárolás során minőségük ne változzon, állás közben csapadék ne keletkezzen, észrevehető kémiai reakciót ne szenvedjenek és az állatba beadva észlelhető élettani reakciót ne váltsanak ki. Alkalmas olajok a növényi olajok, például a szójaolaj, foldimogyorső-olaj, szezámolaj, gyapotmagolaj, kukoricaolaj, olívaolaj, riciniusolaj, pálmaolaj, mandulaolaj, ezek közül is főként a földimogyoró-olaj cs a szezámolaj. Más olajokat is használhatunk, például petróleumolajokat, ásványolajokat és szílikonolajokat.

Λ hordozóanyagban az olaj és a viasz arányát általában úgy választjuk meg, hogy a viasz 1 -207-ban szerepeljen. Előnyös, ha a hordozóanyag 5- 1 57-a, még előnyösebb, ha 5-107-a a viasz. Általában minél magasabb a viasz koncentrációja, annál elnyújtottabb a készítmény hutásidejc. A viaszkoncentráció felső hatását az az igény határozza meg, hogy a készítménynek vastag injekciós tűn keresztül befecskendezhetőnek kell lennie. A viaszkoncentráció felső határát 207-ban határozhatjuk meg, de a készítmény viszkozitásai és injcktálbatóságát több tényező, elsősorban a szomatotroΊ pin részecskemérete és koncentrációja, a tárolás hőmérséklete is meghatározza. Ezek szerint a viaszkoncentráció felső határai a készítmény más körülményeitől is változhat.

A készítmény hordozóanyagát úgy határozhatjuk meg, mint egy olaj és viasz elegye. Teljesen alkalmas az olyan készítmény, ami hordozóanyagként csak az említett két alkotórészt tartalmazza, azonban az e területen ja'ratos szakemberek előtt érthető, hogy bizonyos körülmények között kívánatos lehet, hogy a készítmény más. viszonylag alacsony koncentrációban szereplő alkotórészeket is tartalmazzon; ez a találmány lényegét nem érinti. Ilyen alacsony koncentrációban szereplő alkotórészek lehetnek például festékek, tartósítószerek, az injektálás helyén esetleg fellépő fertőzést megakadályozó antibiotikumok, viszkozitást befolyásoló szerek, viszkozitást stabilizáló anyagok és a készítmény eltarthatósági idejét növelő antioxidánsok. A készítményben ezeknek az anyagoknak a koncentrációja néhány század százaléktól néhány százalékig terjedhet. Alkalmas színezőanyagok például az élelmiszer-, gyógyszer- és kozmetikai festékek. Tartósító anyag lehet a benzoesav, klór-butanol, kálium-szorbát, szorbitsav, széndioxid, propil-gallát, a parabének, etil-vanillin, glicerin, fenol, p-klór-fenol stb. A viszkozitást befolyásoló anyagok közül megemelíthetjük például a izopropil-mirisztátot, kolloidális szilícíum-dioxidot, nátrium-alginátot, metil-cellulózt, alumínium-monosztearátot, hexaglicerin-disztearátot, glicerin-monosztearátot stb. Alkalmas stabilizátor az etilén-diamin és az agar. Antioxidánsként aszkorbil-palmiátot, nátrium-hidrogén-szulfitot, nátrium-mela-biszulfitot, kéndioxidot, maleinsavat, propil-gallátot, nátrium-formaldehid-szulfoxilátot, butilált hidroxi-anizolt (BHA), butilált hidroxi-toluolt (BHT), terc-butil-hidrokinont stb. használhatunk. Valamennyi fenti anyag ismert a gyógyszertechnológusok előtt.

A találmány szerinti készítményben használt borjú szomatotropin eredete a találmány lényegét nem érinti. Használhatunk állatokból nyert természetes szomatotropint, vagy bármilyen, mikroorganizmus által szintetizált szomatotropint is; ezt hozzáférhetősége, vagy gazdasági okok határozzák meg. A találmány szempontjából a természetes eredetű, illetve mikoorganizmus által készített borjú szomatotropin fizikai tulajdonságai egyaránt megfelelnek. Vagyis a találmány szerinti készítmény megfelelő aktív hatóanyaga bármilyen borjú szomatotropin lehet.

Számos eljárást közöltek a borjú szomatotropin mikrobiológiai úton való előállítására. Megjegyzendő, hogy néhány átalakított mikroorganizmus módosított szomatotropint termel; jellegzetes módosított az a szomatoíropin polipeptid, mely egyik végén egy vagy néhány aminosawal többet tartalmaz, mint a természetes hormon. Az irodalmi utalások szerint ezek a módosított hormonok ugyanolyan tulajdonságokkal és aktivitással rendelkeznek, mint a természetes borjú sz.omatotropin. Ezek szerint a találmányban használt ,.borjú szomatotropin’’ kifejezésbe beletartoznak azok, a genetikailag megváltoztatott mikroorganizmusok által termelt borjú szomatotropinok is, melyek a természetes borjú szomatotropin tulajdonságaival és aktivitásával rendelkeznek.

Az alábbiakban olyan szabadalmi leírásokat és közleményeket sorolunk fel, melyek ilyen átalakított mik-2195 425 roorganizmusokkal és a borjú szomatotropint szintetizáló mikroorganizmusok előállításával foglalkoznak:

Mayne és munkatársai, 0095361 számú európai szabadalmi leírás;

George és munkatársai, 0111814 számú európai sza- 5 badalmi leírás;

Rottman és munkatársai, 0067026 számú európai szabadalmi leírás;

Miller és munkatársai, 0047600 számú európai szabadalmi leírás; 10

Frazer és munkatársai, 0068646 számú európai szabadalmi leírás;

Aviv és munkatársai, 2073245 számú brit szabadalmi leírás;

De Boer és munkatársai, 007544 számú európai sza- 15 badalmi leírás;

Sclioner és munkatársai, Biotechnology, 1985. febr., 151-154;

Sclioner és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 57,5403-07(1984). 20

A készítmény előállításánál a borjú szomatotropint hatásos koncentrációban (5—35%) keverjük a hordozóanyaghoz. A koncentráció az elnyújtott hatás kívánt hosszától és a beviendő dózistól függ. Természetesen figyelembe kell venni a rendelkezésre álló szomatotropin 25 tisztaságát és hatásosságát is.

Úgy találtuk, hogy egy tejelő tehénnek 2—10 g készítményt beadva, az kellő hosszúságú ideig biztosítja a késleltetett hatóanyag-kiszabadulást, és nem túl nagy mennyiség ahhoz, hogy az állat számára kellemetlen, a 30 kezelő személy számára kényelmetlen lenne a beadása.

A készítmény ilyen beadandó mennyiségében a szomatotropin koncentráció 5—35%, előnyösen 10—25%..

A készítmény hordozóanyagát úgy készítjük el, hogy az olajban - ha szükséges melegítés közben - fel- 35 oldjuk a viaszt. Ugyancsak előnyös a minor alkotórészeket is addig adagolni, amíg az elegy még forró. Amikor a keverék lehűl, viszkozitása hirtelen megnő, minthogy a viasz, legalábbis részben, kiválik az oldatból. Miután a keverék szobahőmérsékletűre hűlt, előnyös el- 40 homogenizálni, hogy a viaszrészecskék méretét és ezáltal a keverék viszkozitását csökkentsük. Erre alkalmasak a szokásosan használt készülékek. Használhatunk például egy olyan berendezést, mely a keveréket nagy nyomással finom nyíláson nyomja át, vagy olyan nagy 45 hatásfokú keverőt, melyben a keveréket egy nagy fordulatszámú keverő bordázott falú állórészében keveri,

hogy ezáltal is növeljük a nyíróerőt. Sok készüléktípus		nap	szomatotropin konc.
ismeretes, különféle kereskedelmi név alatt; mindazok			(ng/ml)
alkalmasak, melyek nagy nyíróerejű keverést biztosí-	50
tanak.		2.	128
Az előnyösen finom por alakjában levő boíjú szo-		5.	171
matotrpint viszonylag kíméletes keveréssel hozzákever-		9.	109
jük az elhomogenizált hordozóanyaghoz. Minthogy a		12.	86
készítménynek injektálhatónak kell lenni, a szomato-	55	16.	54
tropin részecskék méretének elég kicsinek kell lennie		19.	43
ahhoz, hogy könnyen átjussanak az injekcióstűn. Aján-		23.	27
latos a szomatotropint enyhe keverés mellett elkeverni		26.	20
a hordozóanyaggal, például lapátos keverővei vagy ha-
sonlóval, de a szomatotropin hozzáadását követően al-	60	A kontroll állatoknál	mért értékeket a táblázatban

kalmazhatunk erélyesebb keverést is, feltéve, hogy el tudjuk kerülni a helyi felmelegedést és a túlzott nyíróerő fellépését.

A találmány szerinti készítmények hatásosságát az alábbi vizsgálatok szerint ellenőriztük:

nem tüntettük fel, minthogy valamennyi esetben a szűk 2,9-3,3 ng/ml tartományba estek.

Amint az a szomatotropin kiváló mértékű felszabadulásából várható volt, a kezelt tehenek tejtermelése lényegesen megnőtt, és a tej összetétele is normális volt.

7. vizsgálat

A vizsgálat kezdetén naponta kb. 26 liter tejet adó Holstein teheneket kísérleti és kontroll csoportba osztottuk. Egy csoportban 7-7 állat volt, de a kontrollcsoportból egyet idegentest-fertőzés miatt, a kísérleti csoportból egyet idegentest-fertőzés miatt, egyet tőgygyulladás miatt el kellett távolítani. A teheneket rekeszekre osztott, nagy istállóban tartottuk, naponta két órára a szabadba víve őket vizsgálatra, mialatt az istállót kitisztították és újra almozták.

A tehenek tetszés szerinti mennyiségű élelmet ehettek, mely - szárazanyagra számolva - 60% takarmányból (3 rész kukorica siló és 1 rész felaprított lucernaszéna) és 40% koncentrátumból állt. A koncentrátum összetétele a következő volt:

szárított répapép 10,00% őrölt kukorica 48,50% szójaolaj gyártásnál nyert liszt 33,10% mészkőpor 1,65% cukornád melasz 3,50% mononátrium-foszfát 1,05% vitamin A, D₃ és E premix 0,35%.

szelénes premix 0,05% nátrium-hidrogén-karbonát 0,75% nyomelemeket tartalmazó só 1,05%

A teheneket naponta kétszer, 11 -14 órás időközzel fejtük. A tejtermelést feljegyeztük és a tejet a szokásos eljárásokkal analizáltuk.

napos kondicionálás után a kísérleti állatokba 7,3 g, a 6. példa szerint elkészített készítményt fecskendeztünk szubkután, 14-es injekcióstűn keresztül. Az első injekciót követő 29. napon 7,3 g, a 7. példa szerint elkészített, az 57. napon 7,3 g, ugyancsak a 7. példa szerint elkészített készítményt fecskendeztük az állatokba.

Ezek szerint a kísérlet három 28 napon elnyújtott hatóanyag felszabadulási kezelésből állt.

A szomatotropin felszabadulását a kezelt állatok vérplazmájában mértük. Minden hét hétfőjén és péntekén vért vettünk a nyaki vagy a farkcsíkcsonti vénából, és a vérmintát radioimmun vizsgálattal analizáltuk, kettős antitestet használva.

A három 28 napon periódus megfelelő adatait átlagolva az alábbi szomatotropin koncentrációkat mértük nanogram/milliméterben megadva:

-3195 425

2. vizsgálat

A vizsgálatban 3 3 állatból állt a kísérleti, illetve a kontroll csoport. A teheneket úgy tartottuk cs tápláltuk, ahogyan azt az 1. vizsgálatnál leírtuk, ugyancsak a fentiek szerint határoztuk meg a vérplazma szomatoíropin szintjét is. 7,3 g, az 5. példa szerint elkészített készítmény befecskendezését követően 29 napig végeztük a vizsgálatot. Az alábbi eredményhez jutottunk:

nap	kontroll	szomatotropin konc. (mg/ml) kezelt
0.	5	6
2.	9	225
4.	7	106
6.	10	81
8.	20	50
10.	17	49
12.	14	47
14.	15	38
16.	13	34
18.	8	25
20.	18	31
22.	10	17
24.	6	21
29.	7	17
ben az	esetben feltüntettük	a kontroll állatoknál

nyert értékeket is, mert a vérük szomatotropinsziirtje, amint az az adatokból látható, erősen ingadozott.

3. vizsgálat

Lényegében az 1. vizsgálatot ismételtük meg, azzal a különbséggel, hogy a csoportok csak három állatból álltak. Kontroll csoport nem volt, de a kezelés előtt mintákat vettünk, és ezek analízisének eredményei adták a kontroll értékeket. Az egyes csoportokat az 1., 2., illetve 3. példa szerint előállított készítményekkel kezeltük, mindegyik állatba 4,9 g készítményt fecskendezve a 0. napon.

A vérminták borjú szomatotropin koncentrációját az alábbi táblázatban foglaljuk össze:

szomatotropin konc. (ng/ml)

nap	1. példa készítménye	2. példa készítménye	3. példa készítménye
-5.	2,9	3,6	3,3
-2.	2,3	1,2	1,6
1.	43	56	42
2,	42	82	53
3.	64	106	81
4.	74	109	76
5.	104	156	93
9.	182	181	172
12.	141	112	124
16.	89	65	82
19.	71	49	64
23.	47	30	42
26.	40	22	30

A fenti kísérletek a beadagolt borjú szomatotropin kiváló, 28 napos elnyújtott felszabadulását szemléltetik. Nyilvánvaló, hogy a 28 naponkénti vagy még ritkább injektálás, amit a találmány szerinti készítmény ehetővé tesz, kényelmes és gazdaságos, és e készítmény r borjú szoniatotropin bejuttatásának kiváló módját biztosítja.

Az alábbi példák az elmondottak részletesebb szemléltetését szolgálják; kizárólag szemléltető célzatúak. igy a találmány oltalmi körét semmi módon nem korlátozzák.

1. példa

1800 g szezámolajat 100 °C hőmérséklet körülire melegítünk, és hozzáadunk 200 g tisztított, fehér méhviaszt. A keveréket ezen a hőmérsékleten kevertetjük, amíg a viasz fel nem oldódik az olajban. A keveréket állandó enyhe keverés mellett lehűtjük 22 °C hőmérsékletre. Az olaj-viasz keveréket Ultra-Turrax homogenizátorban homogenizáljuk, amíg az „sima és krémszerű nem lesz és viszkozitása csökken.

A fenti olaj-viasz keverék 13,16 grammjához 22 °C hőmérsékleten, enyhe keverés mellett hozzáadunk 2,83 g borjú szomatotropint, amit a 0095361 számú európai szabadalmi leírás szerint módosított Escherichia coli-val állítottunk elő. A szomatotropin készítmény teljesen tiszta volt, az oldott anyag optikai sűrűségmérése alapján 75% összfehérjét tartalmazott, melynek 95%-a a kizárásos kromatográfiás adatok szerint monomer borjú szomatotropin és azzal rokon anyag volt. Az így előállított készítmény 12,6% borjú szomatotropint és azzal rokon anyagot tartalmazott.

3.10. példa

Az alábbi példákban szereplő készítményeket lényegében az 1. példában leírtak szerint állítjuk elő. A készítményeket az alábbi táblázatban soroljuk fel:

példa	hordozó szomatotropin %
2.	szezámolaj/fehér méhviasz, 95:5	12,4
3.	földimogyoró-olaj/sárga méhviasz, 90:10	12,6
4.	földimogyoró-olaj/sárga méhviasz, 99:1	12,6
5.	földimogyorsó-olaj/sárga méhviasz, 99:1	12,6
6.	földimogyoró-olaj/sárga méhviasz, 99:1	10,9
7.	földimogyoró-olaj/sárga méh-
	viasz, 90:10	12,6
8.	szilikonolaj (poli-dimetil-sziloxán), gyógyászati minőségű, 350 cs/szilikonviasz (sztearoxi-trimetil-szilán-
	-sztearilalkohol), 90*10	12,6
9.	ugyanaz, mint a 8. példában, de a szilikonolaj élelmiszer minőségű	12,6
10.	szilikonolaj (polifenil-metil-sziloxán kopolimer, 22,5 cs)/szilikonviasz. (sztearoxi-trimetil-szilán-sztearilalkohol), 90-1 0	12,6

-4195 425

11.-26. példa

A példákban szereplő készítményeket az 1. példában leírtakkal azonos módon állítjuk elő.

példa	hordozó szomatotropin %
11.	földimogyoró-olaj/sárga méhviasz, 90:10	15	10
12.	földimogyoró-olaj/fehér méhviasz, 95:1	6
13.	földimogyoró-olaj/karnaubaviasz, 95:5	35
14.	szójaolaj/karnaubaviasz, 87:13	27	15
15.	szezánrolaj/sárga méhviasz, 85:15	9
16.	gyapotmagolaj/fehér méhviasz, 973	5
16.	gyapotmagolaj/karnaubaviasz 92:8	18	20
18.	szójaolaj/sárga méhviasz, 85:15	22
19.	jojobaolaj/szilikonviasz, 80:20	30
20.	pálmaolaj/petróleumolaj, 82:18	25	25
21.	szilikonolaj/karnaubaviasz 95:5	20
22.	olivaolaj/méhviasz, 93:7	17
23.	kukoricaolaj/jojobaviasz, 98:2	32
24.	mandulaolaj/eszpártóviasz, 89:11	24	30
25.	ricinusolaj/japán viasz, 86:14	14
26.	ásványolaj/gyapjúviasz, 83:17	16

7. példa

A hordozóanyag összetétele:

szezámolaj 89,80% fehér méhviasz 9,98% propil-gallát 0,02% metil-parabén 0,18% propil-parabén 0,02%

Az alkotórészeket 125 °C hőmérsékletűre melegítjük, majd szobahőmérsékletűre hűtjük. A lehűlt keveréket az 1. példában leírtak szerint homogenizáljuk, és szobahőmérsékletre hűtjük. 82 súlyrész hordozóanyagot enyhe keverés mellett összekeverünk 18 súlyrész, az 1. példában ismertetett borjú szomatotropinnal, olyan készítményt nyerve, melyben a borjú szoma’otropin és az azzal rokon anyagok koncentrációja 1 2,8%.

Claims

1. Eljárás injektálható, időben elnyújtva felszabaduló borjú szomatotropinl tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a borjú szomatotropin t 5—35% koncentrációban 1—20% viaszból és 80-99%, olajból álló közegben szuszpendáljuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olajként növényi olajat alkalmazunk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy viaszként növényi vagy állati eredetű viaszt alkalmazunk.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a közeg homogenizált, és 5 — 18% viaszt tartalmaz.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy viaszként méhviaszt vagy karnaubaviaszt alkalmazunk.

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olajként földimogyoró-olajat vagy szezámolajat rlkalmazunk.

7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a közeg homogenizált és 5 — 10% viaszt tartalmaz.