HU194584B

HU194584B - Process for preparing protein-type material with antineoplastic effect and monoclonal antibodies specific thereto and bonded to a carrier

Info

Publication number: HU194584B
Application number: HU844267A
Authority: HU
Inventors: Tsutomu Irikura; Koichi Takagi; Jiro Hosomi; Satoshi Murayama; Koji Saito; Takashi Okazaki
Original assignee: Kyorin Seiyaku Kk
Priority date: 1983-11-21
Filing date: 1984-11-15
Publication date: 1988-02-29
Also published as: KR850003729A; JPS60112718A; ES537826A0; HUT36863A; IN160606B; DK549584A; EP0149751A3; AU579119B2; DK549584D0; US4777241A; EP0149751A2; MX7655E; AU3565884A; ES8604400A1

Description

A találmány tárgya eljárás tumorgátló hatású, fehérjeszerű anyag előállítására, amelyet sejttenyészet felülúszójába ürítenek a tenyésztett sejtek; a fenti anyagot olyan emlős sejtek termelik, amelyek korlátlanul képesek proliferálni és az E. coli egy lipopoliszacharidjának hatására makrofág-típusú sejtté képesek differenciálódni. A sejtek kerek formát vesznek fel, és fagocita aktivitással rendelkeznek.

Pincus W. B. [J. Reticuloendothel. Soc. 4, 122-139 (1967)] ismertette, hogy ha normális tengerimalac hasüregi makrofágjának folyékony tenyészetéhez tisztított tuberkulin proteint adnak, a makrofágokból felszabadul egy anyag, amely tumorölő hatást fejt ki a tápközegbe vitt egér tumorsejtek ellen. A markofágok tumorölő aktivitását ezidáig a célsejtekkel való közvetlen érintkezés hatásának tulajdonították. Ezért Pincus felismerése igen jelentős, hiszen azt mutatja, hogy létezik egy folyékony intermedier anyag.

Ezt követően Meltzer M. S. és munkatársai kimutatták μ. Natl. Cancer Inst. 49, 1439-1443 (1975)], hogy ha BCG-érzékenyítéssel aktivált egér lépsejtekhez tisztított tuberkulin proteint adnak, a felülúszó folyadékban egy olyan anyag van jelen, amely nem mutat aktivitást normális magzati sejtek vagy normális fibroblaszt sejtek ellen, de az L-sejíeket specifikusan elpusztítja. A fenti felismerés is igen jelentős abból a szempontból, hogy a fenti anyag nem azonos a limfocitákból kapott, nem specifikus citotoxinnal (limfotoxin), hanem specifikusan csak a tumorsejtekre hat.

Carswell és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3666-3670 (1975)] megfigyelése szerint ha BCG-vel fertőzött egérnek intravénásán coii-bacillus lipopoliszacharid-toxint (LPS-t) injektálnak, a szérumba az LPS injekció után 2 órával egy olyan anyag kerül, amely L-sejteket ölő aktivitással rendelkezik. Ezen túlmenően, a szérum nem toxikus normális állatok vagy normális sejtek esetén, de ba a szérumból 0,5 ml-t Meth-A-tumoros egérbe injektálnak, vérzéses nekrózist vált ki, vagy teljes gyógyulást eredményez. Carswell és munkatársai a fenti anyagot tumor-nekrózis faktornak (rövidítve TNFnek) nevezték el. Kimutatták, hogy a TNF molekulasúlya közei 150 000.

Noha számos kiegészítő vizsgálatot végeztek — többek között Mathews N., Ruff M. R., Mánnel D. N., Kuli F. C. Jr. és munkatársai —, nem sikerült megállapítani,hogy a TNF egy tiszta anyag-e, vagy hasonló aktivitású anyagok elegye.

Carswell és munkatársai TNF-fel folytatott vizsgálatai óta fokozott figyelmet fordítottak azokra a kutatásokra, amelyek olyan anyagok vizsgálatára irányultak, amelyek nem hatnak a normális sejtekre, csak a tumorsejtek ellen hatásosak. A kutatás iránya négy csoportra osztható, az alábbiak szerint.

1. Az első kutatási irányzat szerint egy alacsony toxicitású anyagot kerestek az LPS helyett, ennek megfelelően a kis toxicitású lipid A-t, jelölt Pseudomonas aeruginosa baktériumot vagy az LPS metanolos dezacetilezésével kapott endotoxint vizsgálták.

·, 2. A második kutatási irányzat szerint az egér és nyúl TNF-et Carswell és munkatársai módszere szerint a humán daganat-terápiában kívánták alkalmazni.

Az elgondolás alapjául az a kísérleti tény szolgált, hogy az intcrleukin—1 és interleukln—2, amely a TNFhez hasonlóan szintén egy fajta limfokin, fajokra való tekintet nélkül hatásos, így feltételezhető, hogy a TNF sem fi j-specifikus, azaz az állatokból nyert TNF emberben is i.kalmazható.

Az eljárásnak az a hátránya, hogy az extrakciót a teljes szérumból kell végezni, ezért a különböző kutatók eredményei egymástól teljesen eltérőek, még a molekulasúly tekintetében is.

3. A harmadik kutatási irányzat szerint a tumorellenes hatású anyagot in vitro tenyésztett sejtek felülúszó folyadékából kívánták előállítani. Elvi alapja ugyanaz, mint a 2. irányzatban, azaz az állati sejt eredetű aktív anyag is ugyanúgy alkalmazható a humán terápiában, mint a humán sejtek által termelt anyag.

4. A negyedik kutatási irányzat szerint a tumorellenes hatású anyagot úgynevezett biotechnológia útján kívánták előállítani, oly módon, azoknak a sejteknek a messenger RNS-ét, amelyek tenyészetében antitumor aktivitású anyag keletkezik, izolálják, és coli-bacillusba vagy élesztőgombába transzformálják. A fenti módszerrel peptidláncot kaphatunk ugyan, de fennáll annak a lehetősége, hogy nem érünk el immun-toleráns hatást, mivel a cukor-lánc hiányzik. Ezért a fenti módszerrel szemben vannak kétségeink.

Abban az esetben, ba a tumorellenes hatású anyagot a 3. irányzatnak megfelelően egy sejttenyészet felühíszójából nyerik, a normális állatból származó sejtek szaporodása lassú, és sorozatosan, több generáción át tenyészteni a sejteket igen bonyolult, így ez a módszer ipari megvalósításra nem alkalmas. Természetesen elképzelhető az Is, hogy olyan sejteket — például tumorsejteket használnak, amelyek gyorsan szaporodnak. Elsőként Mánnel D. N. és munkatársai [Infect. and Immun,, 30, 523—530 (1980)] használtak ilyen sejteket. Leírták, hogy ha a makrofág-szerű PU5 -1,8 sejtekhez EPS-t adnak és a sejteket 2 órán át tenyésztik, a sejtekből egy olyan anyag szabadul fel, amelynek hőstabilitása 56 °C-on 3£) perc, és molekulasúlya 50000—60000.

Williamson B. D. és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Soc. USA 80, 5397-5401 (1983)] kimutatták, hogy az Epstein-Barr vírussal tumor-transzformált humán B-sejt humán TNF-et termel, amelynek molekulasúlya közel 70000. Ohnishi és munkatársai [Vienna Intern. Chemotherapy Soc., Preprint PS 12.4. 7-26. oldal (1983)] is közölték, hogy humán B-tumorsejtekből, BALL—1 sejtekből 15 000 körüli molekulasúlyú tumorellenes anyag válik szabaddá, ha a sejteket Sendai vírussal kezelik.

A találmány szerinti eljárással előállított tumorellenes hatású anyag, és a fenti ismert anyagok közötti különbségek az alábbiakban foglalhatók össze.

A) A rcticuloszarconiák közül csak a fagocitáló képességgel rendelkező hisztocitákat klónozzuk és használjuk fel. A Ralph és munkatársai [Natúré 257, 393-394 (1975)] által klónozott sejtek közül csak a cirkuláris sejteket klónozzuk tovább és használjuk fel. Ezek közé tartoznak a J774.1 sejtek, amelyek tenyésztésével állítjuk elő a találmány szerinti fehérjeszerű anyagokat.

A fenti sejteket jellegzetes módon úgy használjuk, hogy nem engedjük meg, hogy a stimulánssal makroíaggá differenciálódjanak.

B) Noha a monocita formában levő sejtek az A) pontban leírtak szerint LPS, növényi lektin vagy egyéb hasonló anyag hozzáadására inakrofág-szerií sejtekké képesek differenciálódni, a találmány szerinti eljárás jellemzője, hogy a tumorgátló anyag olyan sejtekből válik szabaddá, amelyek differenciálódás előtti alakkal rendelkeznek. Így az extrakció egyszerű, mivel nincs jelen

-2194 584 olyan anyag — például LPS amelyet azután nehéz eltávolítani.

C) Λζ Λ) pontban ismertetett sejtek magzati borjúszérumot tartalmazó táptalajban gyorsan szaporodnak (a sejtek száma 24 óra alatt megkétszereződik). Miután a fenti borjúszérum-tartalmú tápközegben megfelelő szaporodást értünk el, a tápközeget szérum nélküli közeggel helyettesítjük, és a sejteket néhány napon át tovább tenyésztjük, majd a felülúszó folyadékot összegyűjtjük.

A találmány szerinti megoldás jellemzője, hogy mivel a visszamaradó sejtek nem szenvednek károsodást, újra felhasználhatók oly módon, hogy a szérumtartalmú tápközegbe visszavezetjük azokat, majd a tápközeget szérum nélküli tápközegre cserélve újabb felülúszó folyadékot nyerünk, és ez iparilag igen előnyös.

D) A fehérjeszerű anyag szérummentes tápközegből való extrakciójakor a közegben levő főbb proteinek közül a marhaszérumalbumin és transzferrin Blue Sepharosc-zal és DEAE-Scphadex-szel könnyen eltávolítható. Az ammónium-szulfát sem befolyásolja a találmány szerinti anyag tisztítását, mivel nem okoz sem polimerizációt, sem asszociációt. Ennek megfelelően egyszerűen kapható a tiszta anyag. Még ha jelen is van lizozim vagy interleukin-1 a találmány szerinti eljárással kapott felülúszó folyadékban, a fenti anyagok is könnyen elválaszthatók gélszú'rés vagy ultraszűrés segítségével, mivel molekulasúlyuk 14400, illetve 15 000.

E) A találmány szerinti eljárással előállított fehérjeszerű anyagot adjuvánssal együtt egér bőre alá injektáljuk, majd az állatot még egyszer érzékenyítjük, és összegyűjtjük a lépscjtekct.

Ezután a lépsejteket öröklött rákos egerek B-tumorsejtjével, pontosabban P3-X63-Ag653 sejtvonallal fuzionáltatva hibridoma sejteket állítunk elő, amelyek monoklórozott antitest előállítására képesek. A fenti hibridóma sejtek által termelt monoklónozott antitestet hordozóhoz kötjük.

A fenti módszert a találmány szerinti eljárással előállított anyag tisztítására és meghatározására alkalmazva az eljárás könnyen ellenőrizhető lesz.

F) A találmány szerinti eljárással előállított fehérjeszerű anyag molekulasúlya 45 000± 5000, izoelektromos pontja (pl) 4,8±0,3.

Az anyag 56 °C-on melegítve 30 percen át stabil. Nem azonos a Williamson és munkatársai által humán B-sejtekből nyert humán TNF-fel, mivel az utóbbinak molekulasúlya 70000. Az Ohnishi által BALL—1 sejtekből előállított aktív anyagtól is különbözik, mivel annak molekulasúlya 15 000. A találmány szerinti eljárással előállított anyag fizikai-kémiai adatai tehát mind a két ismert anyagétól különböznek.

G) A találmány szerinti eljárással előállított anyag nem lázkeltő hatású, nyulaknak intravénásán injektálva még nagy dózisban sem okoz rendellenes viselkedést vagy pusztulást.

H) A találmány szerinti eljárással előállított anyag fiziológiai hatása eltér a telep-stimuláló faktorétól (colony stimulating factor, továbbiakban CSF), amelynek hatására a granulociták növekednek. A CSF úgy nyerhető, hogy makrofág tenyészethez stimulátort — például LPS-t, dextránt, zimozánt, tuberkulint, forbol-mirisztát-acetátot (PMA-t) vagy egyéb hasonló szert — adunk.

I) Ha a PMA-t vagy LPS-t P 388D1 sejtekkel (makrofág típusú tenyésztett sejtek) reagáltatjuk, a tenyészet feiülúszójában interleukin—1 keletkezik. Mivel ennek molekulasúlya 14 000, és pirogén (lázkeltő') hatással rendelkezik, vagy egy ainiloid-szerű anyagot termel a szérumban, tulajdonságai nyilvánvalóan különböznek a találmány szerinti eljárással előállított anyagétól.

A fentieken kívül a találmány szerinti eljárással előállított tumorellenes hatású anyag a többi, eddig ismert, sejtekből származó tumorellenes anyagokra emlékeztető tulajdonságai a következőkben foglalhatók össze. .

I) A találmány szerinti eljárással előállított anyag L-929, Meth—A, S—180 és L—1210 egér tumorsejtekre in vitro sejtölő hatást fejt ki. Ugyanakkor humán karcinomákkal (HSC—1, EAC—1 és HeLa) szemben is hasonló sejtölő hatást mutat. Ezzel szemben normális sejtekre — például humán felnőtt vagy magzati bőr-fibroblaszt sejtekre, vagy állati V—79 vagy Don-sejtekre - nem fejt ki sejtölő hatást, azaz nagy tumor-specificitással rendelkezik.

K) Öröklött Meth-A tumoros BALB/c egereknek egyszerre 72 egység találmány szerinti eljárással előállított anyagot adunk, intravénás injekció formájában, mikor a tumor átmérője eléri az 5-6 mm-t. Megfigyeléseink szerint az injekció hatására nemcsak a tumorban észlelhető vérzéses nekrózis, de a limfociták beszűrődése is megszűnik. Ezután a tumor kb. 7 nap alatt felbomlik és az állatok 84 %-a teljesen meggyógyul. A teljes gyógyulási arány — Carswell 25 %-os értékével összehasonlítva — igen magas. Ha ugyanabból a tumorból 10 sejtet újra beültetünk a gyógyult egerek bőre alá, a tumor nem fogan meg. Az eredményből arra következtethetünk, hogy a tumorral szemben immunitás alakul ki. A találmány szerinti eljárással előállított feherjeszerű anyagot a továbbiakban tumorellenes anyagnak nevezzük, és AT^-nek rövidítjük.

L) Az ATF savas protein, molekulasúlya 45 000± 5000, és cukor-komponense is lehet. Tripszinnel szemben érzékeny, de melegítéssel szemben 56 °C-on 30 percen át stabil. Ribonukleáz és galaktozidáz nem inaktiválja.

A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példák segítségével kívánjuk ismertetni.

1. kísérlet

Citotoxikus hatás meghatározása

Az ATF aktivitásának mérésére célsejtként egér tumor L-sejteket használunk. Az L-scjtcket 2X 10⁵ scjl/ml koncentrációban Eagle-féle minimál táptalajban (MÉM) szuszpendáljuk, amelyet 10 % magzati boíjúszérummal (FCS, hő-inaktivált) egészítettünk ki. A fenti szuszpenzióból 0,1 ml-t mérünk egy 96 lyukú mikrotitrátor-lemez minden egyes lyukába, majd a sejteket 37 °C-on 5 % szén-dioxid tartalmú inkubátorban tenyésztjük. 24 órás inkubálás után a tápközeget eltávolítjuk és négyszeres sorozat-hígításban ATF-et tartalmazó táptalajt adunk a sejtekhez, majd 48 órán át tovább folytatjuk a tenyésztést. Az élő sejtszámot eritrozinos festés után hemocitométerben mérjük. A titert úgy számoljuk ki, hogy a kontrolihoz képest 50 %-os sejtpusztulást okozó ATF hígításának reciprokát vesszük.

194 584

2. kísérlet

Az ATI⁷ in vitro citotoxikus hatását tumorsejtekre és normális sejtekre az 1. példa szerint előállított tápközeg, alkalmazásával határozzuk meg. Az 50 %-os sejtpusztú- 5 lást okozó hígítás nagysága humán tüdő pikkelyes sejt karcinomák (EAC-1) esetén 100-szoros, humán bőr pikkelyes sejt karcinoma (HSC—1) esetén 32-szeres.

Másrészről normális humán diploid fibroblaszt-sejtekkel (IMR—90) és aranyhörcsög Don-sejtekkel szem- 10 ben nem tapasztalunk citotoxikus hatást, még akkor sem, ha a sejteket hígítatlan tápközeggel kezeljük.

3. kísérlet 15

ATF lázkeltő hatásának vizsgálata

Az interleukin— 1-gyel való összehasonlítás céljából 10 ml 1. példa szerint előállított tápközeget új-zélandi 20 fehér nyúl vénájába injektálunk, és méqük a végbélben a testhőmérsékletet. Az injektálás után 1 órával 0,3 °C, órával 0,1 °C hőmérsékletemelkedést észleltünk csak.

Λ fenti eredmény szerint a találmány szerinti eljárással előállított anyag (ATF) nem rendelkezik lázkeltő hatással. 25

4. kísérlet

A TF in vivő tumorellenes hatása 30

Beltenyészeti BALB/c egerek bőre alá a lágyék táján 10⁶ Meth-A fibroszarkoma sejtet transzplantálunk.

nap múlva az egerekbe intravénásán 0,2 ml olyan tápközeget injektálunk, melyet az 1A. példa szerint előállí- 35 tott tápközeg koncentrálásával nyertünk (specifikus aktivitása 90 egység/mg protein).

Az injekció utáni napon 2-3 mm átmérőjű vérzéses nekrózist figyeltünk meg a 19 vizsgált állat közül 17 állaton, azaz az állatok 89 %-ánál (1. fénykép). * 40

A tumorok egyikének egy részét kimetszettük, abból a célból, hogy a tumor vagy a tumoros szövet környezetének hisztopatológiaí változását megfigyeljük.

A 2. fényképen látható, hogy a tumoros szövet környezetében sok olyan limfocita-szerű sejt van, amely 45 feltehetően a gazdasejtből származik.

Ezután az idő előrehaladtával a Meth—A szarkoma mérete csökkent, különösen egyes esetekben volt jelentős a tumor nekrózis.

A 7. napon a tumor kisebbedése mellett varképződést 50 észleltünk. A 10. napon a var levált, mint az a 3 - fényképen látható. A fentiek szerint 19 állat közül 16 esetben (84 %) a tumor teljes mértékben eltűnt. A teljesen gyógyult állatok bőre alá újra Meth-A sejteket transzplantáltunk, de azok nem fogantak meg. A fenti eredmény 55 a szerzett immunitás létezésére utal.

5. kísérlet

Ammónium-szulfát hatása az ATF tisztítására

A 2. példa szerinti felülúszó folyadékot, valamint az

5. példában leírt, 0-65 %-ig telített ammónium-szulfátos frakciót 2,5 X 85 cm-es Sephacryl S-200 (Pharmacia 65

Fine Chemicals) oszlopra visszük, és mindkét mintában megvizsgáljuk a molekulasúlyokban mutatkozó különbséget. Az oszlopot 0,03 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel(pH 7,5) ekvilibráljuk, és az ATF-et is a fenti oldattal eluáljuk. Az eluciós térfogatok között alig van különbség a két minta esetén.

A fenti eredményből arra következtethetünk, hogy az ammónium-szulfátos frakcionálás hatására nem asszociálódik, sem más proteinekhez nem kötődik az ATF.

6. kísérlet

A TF molekulasúlyának meghatározása

Részlegesen tisztított ATF-et 2,5X85 cm-es Sephacryl S—200 (Pharmacia Fine Chem.) oszlopra viszünk, melyet 0,3 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,5) ekviiibráltunk. A molekulasúlyt az L-sejtekre nézve citotoxikus hatással rendelkező ATF-frakciók eluciós térfogatából határozzuk meg. Az oszlopot ismert molekulasúlyú anyagként rlboiíukleáz A-val, kimotripszinogén A-val, ovalbuminnal, marhaszérum-albuminnal, kék dextránnal kalibráljuk. Az ATF molekulasúlya a fenti módszerrel meghatározva 45 000±5000.

7. kísérlet

ATF izoelektromos pontjának meghatározása

Az izoelektromos pontot poliakrilamid gélelektroforézis módszerrel mérjük, Ampholine (pH tartomány:

3,5-7,0) reagens alkalmazásával (gyártja az LKB Co.).

A gélt 5 mm-enként elvágjuk, desztillált vízzel extraháljuk és minden egyes extrahált frakcióban mérjük a pH-t és az L-sejtek elleni citotoxikus aktivitást.

A vizsgálat eredménye szerint az ATF izoelektromos pontja (pl) 4,8±0,3.

1. példa

A) ATF előállítása komplett tápközegben % magzati boíjúszérummal (FCS) kiegészített RPMI-1640 táptalajt 3X 10⁶ J774.1 sejttel - melyet a japán National Institute of Health-től szereztünk be — beoltjuk, és 5 % szén-dioxid-tartalom mellett 37 °C-on tenyésztjük. A sejtek közül sok gömb alakot vesz fel, vagy egy réteget képez, és erősen kötődik a csésze aljához, miközben erőteljesen szaporodik.

Mikor a tenyészetben kezdenek úszó sejtek is megjelenni, a sejteket az üveg felületéről leválasztjuk, és 10:1 arányban hígítva új csészébe helyezzük. A fenti tenyésztési időszakban minden 3 -4. napon összegyűjtjük a tenyészet felülúszóját, amely a találmány szerinti anyagot tartalmazza. A fenti módszerrel 500 egység/ml titerű felülúszó folyadékot kapunk.

B) Az L-sejtekkel szembeni citotoxikus aktivitás (titer) annál nagyobb, minél nagyobb a tenyészet sejtszáma, és minél hosszabb ideig folytatjuk a tenyésztést.

Ha a J774.1 sejteket 1,4X 10⁷ sejt/cm² denzitás

194 584 mellett tenyésztjük az 1A. példa szerinti táptalajban, a titer a 3. napon 140 egység/ml-re, a 6. napon 630 egység/ml-re növekedik. 10,7X 10⁷ sejt/cm² denzitás esetén a titer a 2. napon 630 egység/ml, és a 4. napon 1580 egység/ml-re növekszik.

2. példa

ATFelőállítása szérummentes tápközegben

A J774.1 sejteket magzati borjúszérumot tartalmazó RPMI-1640 táptalajban addig tenyésztjük, míg összefüggő tenyészetet kapunk, majd a tápközeget szérummentes tápközegre cseréljük, és a J774.1 sejteket néhány napon át abban tovább tenyésztjük. A fenti módon kapott felülúszó folyadékban az ATF titere 2000 egység/ml.

3. példa

A TF előállítása forgó tenyészetben

A J774.1 sejteket 37 °C-on szérumméntes tápközegben, forgó tenyésztő lombikban 3—7 napon át tenyésztjük. Ily módon olyan felülúszó folyadékot kapunk, amelynek ATF-titcrc 1412 egyscg/ml.

4. példa

A TF előállítása mikrohordozó alkalmazásával

A J774.1 sejteket és a mikrohordozót - például DEAE-dextrán gyöngyöt (Dainihon Seíyaku) vagy Cytodex-et (Pharmacia Fine Chemicals) 20% magzati borjúszérummal kiegészített RPMI-1640 táptalajt tartalmazó forgó lombikba helyezzük, majd a sejteket 3 napon át 37 °C-on tenyésztjük, eközben a sejtek a mikrohordozóhoz tapadnak. Ezután a táptalajt szérummentes tápközegre cseréljük, és a tenyésztést 37 °C-on tovább folytatjuk. A fenti módon olyan felülúszót nyerünk, amelyben az ATF titere 700 egység/ml.

5. példa

Szérummentes táptalajban előállított ATF tisztítása

A 2. példa szerint nyert felülúszó 3 literéhez 70 ml 1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,2 mól/1 koncentrációjú foszfát-puffért (pH 7,5) adunk. Az elegyet jeges hűtés közben keverjük, és porított ammónium-szulfáttal 65 %-ra telítjük.

óra múlva az elegyet 12 fordulat/perc sebességgel 30 percen át centrifugáljuk, majd a csapadékot 1,5 ml 1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,2 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferben (pH 7,5) oldjuk.

A fenti lépésnél az aktivitás 95 %-át nyerjük vissza, és a tisztítás foka 2,2-szeres, a kiindulási felülúszóhoz viszonyítva.

Az ammónium-szulfátos frakciót ezután Sephacryl S-200 oszlopra (2,5 X 85 cm) visszük, amelyet előzőleg

0,1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,5) ekvilibrálunk.

Az eluálást ugyanezzel a pufferrel végezzük, 20 ml/óra átfolyási sebességgel. 9,2 ml-es frakciókat szedünk folyamatosan. Az ATF-et tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és ultraszűréssel koncentráljuk.

Ennél a lépésnél az aktivitás 99 %-át visszanyerjük, és a tisztítás foka 3,2-szeres. A két lépésben együttesen 94 %-át nyerjük vissza az aktivitásnak, és a tisztítás foka az eredeti felülúszóhoz képest 7,2-szeres.

Λ gélszűréssel kapott aktív frakciókat ezután BlueSepharose CL-6B-vel töltött oszlopon (2,0X11 cm, Pharmacia Fine Chem.) folyatjuk át, melyet előzőleg 0,05 mól/i nátrium-kloridot tartalmazó 0,01 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,5) ekvilibrálunk.

ml-es frakciókat szedünk, az átfolyási sebesség 4 ml/óra. A fenti pufferoldáttal végzett alapos mosás után az abszorbeálódott anyagot 1,0 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,01 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,5) eluáljuk. Az abszorbeált frakcióknak nincs ATF-aktivitásuk, az összes aktivitást a nem-abszorbeált frakciókat ultraszűréssel koncentráljuk.

fenti lépés után az aktivitás 84 %-át nyerjük vissza, a tisztítási fok 12-szeres. Az eredeti felülúszóhoz képest a visszanyerés 78 %, a tisztítási fok 85-szörös.

Az aktív frakciókat ezután DEAE-Sephádex A—50 töltetű oszlopra (2,0X8,0 cm, Pharmacia FineChein.) visszük, melyet előzőleg 0,1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,5) ekvilibrSlunk. A fenti pufferrel mossuk az oszlopot, majd az eluálást 0,3 mól/1 nátrium-kloridot, illetve 0,5 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel végezzük.

4z aktív frakciókat a 0,3 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó foszfát-pufferrel eluáljuk, majd ultraszűréssel koncentráljuk.

Ennél a lépésnél az aktivitás 80 %-át nyerjük vissza, és a tisztítás foka 5-szörös. A kiindulási anyaghoz képest a visszanyerés 63 %, a tisztítási fok 427-szeres.

Az aktív frakciókat TSK—G3000-SWG töltetű nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopra (2,1 cmX X 60 cm, TOYOSODA Co., Ltd.) visszük, melyet előzőleg 0,3 mól/1 nátrium-szulfátot tartalmazó 0,01 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 6,8) ekvilibrálunk. 2,0 ml/perc átfolyási sebesség mellett 2 ml-es frakciókat szedünk.

Ennél a lépésnél az aktivitás 37 %-át nyeljük vissza, és a tisztítás foka 2,4-szeres. A kiindulási anyaghoz képest a visszanyerés 23 %, a tisztítás foka 1025-szőrös.

TSK-G3000—SWG-vel kapott aktív frakciókat TSK-DEAE-3SW töltetű nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopra (7,5 mmX75 mm, TOYOSODA Co , Ltd.) visszük, melyet előzőleg 0,04 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 6,8) ekvilibrálunk. Az oszlopom ugyanezzel a pufferrel, majd 0,15 mól/1 nátrium-kloriddal kiegészített fenti pufferrel mossuk. Az ATF-et 0,15—0,5 mól/1 lineáris nátrium-klorid-gradienssel eluáljuk. 0,6 ml/perc átfolyási sebesség mellett 1,2 ml-es frakciókat szedünk. A fenti módon nyert tisztított ATF poliakrilamid gélelektroforézis lemezen egyetlen sávot ad.

A fenti lépésnél az aktivitás 30 %-át nyerjük vissza, a tisztítási fok 2,5-szeres. A teljes visszanyerés 7 %, a tisztítási fok 2563-szoros., Az ATF specifikus aktivitása 1,1 X 10^{5 6} egység/ing'protein. '

-5194 584

6. példa

Szérumtartalmú tápközegben előállítottATFtisztítása

Az 1. példa szerint előállított felülúszó 3 literéhez 250 ml, 1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,2 mól/1 koncentrációjú foszfát-puffért (pH 7,5) adunk. Az elegyet keverés és jeges hűtés közben porított arnmónium-szulfát fokozatos hozzáadásával 30 %^:ra telítjük. 3 óra múlva az elegyet 12 000 fordulat/perc sebességgel 30 percen keresztül centrifugáljuk, és a felülúszót összegyűjtjük. A felülúszót jeges hűtés és keverés közben porított ammónium-szulfát fokozatos hozzáadásával 65 %-ra telítjük.

óra múlva az elegyet 12 000 fordulat/perc sebességgel 30 percen át centrifugáljuk, és a csapadékot kis mennyiségű, 0,1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferben (pH 7,5) oldjuk.

A fenti lépésben az aktivitás 98 %-át nyerjük vissza, a tisztítási fok 1,6-szeres a felülúszóhoz viszonyítva.

A 30-65 %-os frakciót ezután egy éjszakán át 0,1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,5) szemben dializáljuk, majd DEAE-Sephadex A-50 oszlopra (9X 15 cm) visszük, melyet előzőleg a fenti pufferrel ekvilibráltunk. Az oszlopot azonos pufferrel mossuk, majd 0,2, 0,3, illetve 0,5 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,5) eluáljuk. Az eluálást 60 ml/óra átfolyási sebesség mellett végezzük, 15 ml-es frakciókat szedünk. Az aktív frakciókat ultraszűréssel koncentráljuk.

A fenti lépésben az aktivitás 93 %-át nyerjük vissza, a tisztítási fok 38-szoros. A kiindulási anyaghoz viszonyítva az aktivitás 72 %-át nyerjük vissza, a tisztítási fok 60-szoros.

A fenti módon kapott. aktív frakciókat Sephacryl

S-200 oszlopra (2,5 X 85 cm) visszük, melyet előzőleg 0,1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,5) ekvilibrálunk. 20 ml/óra átfolyási sebesség mellett 6 ml-es frakciókat gyűjtünk.

A fenti lépésben az aktivitás 95 %-át nyerjük vissza, és a tisztítási fok 12-szeres. A kiindulási anyaghoz viszonyítva a visszanyerés 68 % és a tisztítási fok 725-szörös.

Az aktív frakciókat ezután ultraszűréssel koncentráljuk, és Blue-Sepharose CL-6B-vel töltőit oszlopon (5X10 cm) folyatjuk át, melyet megelőzően 0,05 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,01 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,5) ekvilibrálunk. Az abszorbeált frakciókat 1,0 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,01 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,5) eluáljuk. Az aktivitás a nem-abszorbeálódó frakciókban található. Az aktív frakciókat koncentráljuk.

A fenti lépésben az aktivitás 82 %-át nyerjük vissza, a tisztítás foka 6-szoros. A kiindulási anyaghoz képest a visszanyerés 56 %, a tisztítási fok 4320-szoros.

Az aktív frakciókat TSK-G3000-SWG-veI töltött oszlopra (2,1 X 60 cm, TOYOSODA Co., Ltd.) visszük, melyet előzőleg 0,3 mól/1 nátrium-szulfátot tartalmazó 0,01 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 6,8) ekvilibrálunk. Az ATF-aktivitással rendelkező frakciókat a fenti pufferrel eluáljuk. 2,0 níl/perc átfolyási sebesség mellett 2 ml-es frakciókat szedünk.

A fenti lépésben az aktivitás 35 %-át nyerjük vissza, a tisztítás foka 4-szeres. A kiindulási anyaghoz képest az aktivitás visszanyerése 20%, a tisztítás foka 17280szoros.

A TSK—G3000-SWG-vel kapott frakciókat TSKDEAE-3SW töltetű nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopra (7,5X75 mm, TOYOSODA Co., Ltd.) visszük, melyet előzőleg 0,04 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 6,8) ekvilibráltunk. Az oszlopot először a fentiípufferrel, majd olyan pufferrel mossuk, melyet 0,15 mól/1 nátrium-kloriddal kiegészítettünk. Az ATF-aktivitással rendelkező frakciókat 0,15-0,5 mól/1 lineáris nátrium-klorid-gradienssel eluáljuk. 0,6 ml/perc átfolyási sebesség mellett 1,2 ml-es frakciókat szedünk. A fenti tisztított ATF poliakrilamid gélelektroforézls lemezen egyetlen sávot mutat.

A fenti lépésben az aktivitás 28 %-át nyerjük vissza, a tisztítás foka 3-szoros. Az egész tisztítási művelet során az aktivitás visszanyerése 6 %, a tisztítás foka 51840-szeres. A kapott ATF specifikus aktivitása l,0X 10® egység/nrg protein.

7. példa

ATF tisztítása monoklónozott antitesttel 1. Monoklónozott hibridoma előállítása

Részlegesen tisztított ATF-et szubkután módon C3H/HeN egerekbe — szükség esetén más fajtát is használhatunk — injektálunk, adjuvánssal együtt. Az immunitást heti egy immunizálással 3-4-szeresére növeljük, majd meghatározzuk az antitest-titer növekedését.

A magas ATF-titerrel rendelkező egereknek adjuváns nélkül, intraperitoneálisan ATF-et injektálunk, majd 3 nap múlva az egereket leöljük és a lépet eltávolítjuk. A lépsejtek kinyerése céljából a lépet szikével feldaraboljuk és az eritrocitákat heniolr'zis-pufferrel eltávolítjuk. A lépsejteket egérmieloma-sejtekkel (P3-x 63-Ag 8.653 vagy P3 NS-1, a Dainippon Seiyaku Kabusíki Kaisha termékei) keverjük, 10:1 - 1:1 arányban. Mindkét fajta sejtet poli(etilén-glikol)-lal fuzionáljuk. A fuzionált sejteket»HAT szelektív táptalajban tenyésztjük, közel 2 héten át, majd a HAT táptalajból az aminopterint eltávolítva HT táptalajban tovább tenyésztjük a sejteket.

A fuzionált sejttcnycszct felülúszóját és az ATF-oIdatot megfelelő hígításban egyidejűleg az L-sejt-tenyészethez adjuk. Kiválasztjuk azokat a fuzionált sejteket, amelyek képesek az ATF hatását semlegesíteni, ezeket tekintjük olyan hibridoma sejteknek, amelyek ATF-antitestet termelnek. A hibridoma klónozását korlátozott hígítási módszerrel végezzük. A klónozott sejteket ismét megvizsgáljuk, abban a fázisban, mikor a sejtek szaporodása megfelelő mértékű, és a pozitív egyedeket ismét klónozzuk.

2. Monoklónozott antitest előállítása és tisztítása, nagyobb méretekben

Az ATF elleni antitestet termelő hibridoma kiónok közül kiválasztjuk a legnagyobb aktivitású kiónt. A fenti kiónt nagy léptékben tenyésztve nagy mennyiségű antitestet állítunk elő. A nagy léptékű tenyésztésre két módszer alkalmazható. Az egyik módszer szerint egereknek intraperitoneálisan 10 sejtet injektálunk, és mint aszci-61

194 584 tesz tumort hagyjuk azokat osztódni. A másik módszer szerint a sejteket nagy lombikban tenyésztjük, szérummentes tápközegben. Az aszciteszt vagy a tenyészet felülúszóját ammónium-szulfáttal vagy ultraszűréssel koncentráljuk, és az immun-globulin t ioncserélő gyantás kezeléssel — például DEAE—Sephadex-szel - vagy proteinA-celIulózzal eltávolítjuk.

a tumorsejtek körül a limfocita-szerű sejtek beszűrődése, ami a sejt pusztulását jelzi.

A 3. fényképen a 4. példában ismertetett teljes gyóL gyulás látható. A baloldali képen a kontroll állat, a jobb5 oldali képen az 1A. példa szerint előállított felülúszóval kezelt állat látható.

3. A TF tisztítása affinitást kromatográfiás eljárással -| q

A tisztított immun-globulint bróm-cianiddal aktivált hordozóhoz — például Agarose-hoz vagy Sepharosehoz — kötjük, majd megfelelő térfogatú oszlopba töltjük.

Az oszlopon átfolyatva a J774.1 sejtek sűrű tenyészeté- 15 nek felülúszóját, csak az ATF kötődik a töltethez, melyet azután az ionkoncentráció növelésével eluálunk, tiszta ATF-et kapva.

4. A TF mennyiségének meghatározása jelzett antitesttel j

A fenti módon előállított antitestet jóddal jelezve az ATF-tartalmat gyorsabban meg tudjuk határozni, mintha az aktivitást biológiai módszerrel mérnénk. 25

Az 1. ábrán az ATF eluciós profilja látható, TSKDEAE-3SW töltetű oszlopon végzett nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással meghatározva. Az

5. példában a TSK-G3000-SWG töltetű oszlopon kapott ATF frakciót TSK-DEAE—3SW töltetű oszlopon 30 tisztítjuk. 0,6 ml/perc átfolyási sebesség mellett 1,2 ml-es frakciókat szedünk.

A 2. ábrán a tisztított ATF poliakrilamid gélelektroforézis profilja látható. A gélt Coomassie Brilliant Blueval festjük. A többi gélt 5 mm-es sávokra vágjuk, RPMI- 35 1640 táptalajjal extraháljuk és mérjük az ATF-aktivitást az extraktumban.

Az 1. fénykép a 4. kísérletben ismertetett vérzéses nekrózist mutatja egéren. A baloldali kép a kontroll állatot, a jobboldali felvétel a kezelt állatot mutatja, 40 24 órával az 1A. példa szerint előállított felülúszóval való injektálás után.

A 2. fénykép a 4. kísérletben ismertetett Meth—A tumorszövet hisztológiai preparátumát mutatja. A felső képen a kontroll egérből nyert Meth-A tumor, az alsó 45 képen az 1 A. példa szerinti felülúszóval injektált egérből preparált Meth-A tumor látható. Az első képen látható

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás tumorgátló hatású, fehérjeszerű anyag - amely

A) L—929 egér tumorsejtek ellen erős citotoxikus hatást mutat, de normális sejtekre — például humán magzati fibroblaszt-sejtek, humán felnőtt bőr fibroblasztsejtek vagy aranyhörcsög fibroblaszt-sejtek (Don, V-79) - nem citotoxikus, azaz in vitro nagy tumor-specifitással rendelkezik;

B) Meth—A szarkomával szemben in vivő erős tumorellenes hatást mutat, és a gyógyult állat immunitást szerez az újabb transzplantációval szemben;

C) nyulaknak intravénásán injektálva nem fejt ki lázkeltő hatást;

D) molekulasúlya 45j00Ő±5 000, Sephacryl S-200-οη végzett gélszűréssel meghatározva;

E) izoelektromos pontja (pl) 4,8 ±0,3 előállítására, azzal jellemezve, hogy J 774.1 tumorsejteket magzati borjúszérumot tartalmazó komplett tápközegben tenyésztünk, a sejteket szérummentes tápközegben továbbtenyésztjük, és a tenyészet felülúszóját . elválasztjuk, és kívánt esetben tisztítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás tisztítási lépése nagy tisztaságú, tumorgátló hatású, fehéijeszerű anyag előállítására, azzal jellemezve, hogy szérummentes tápközegben tenyésztett sejtek felülúszóját ammónium-szulfáttal kicsapjuk, a csapadékot Sephacryl S-200-οη gélsz űrjük, Blue-Sepharose-on kromatografáljuk, a nem-abszorbeálódott frakciókat összegyűjtjük és DEAE-Sephadex Α-50-oszIopon átfolyatjuk.
3. Eljárás hordozóhoz kötött monoklónozott antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-2. igénypontok bármelyike szerint előállított tumorgátló hatású, fehérjeszerű anyaggal és adjuvánssal szubkután injektált, majd intenzív immunizálásnak alávetett egérből nyert lépsejtek és P3—X63—Ag 653 egér mieloma-sejtvonal hibridizálásával nyert hibridoma sejtekből kapott monoklónozott antitestet megfelelő hordozóhoz kötjük.