JPS5927830A - 抗腫瘍性糖蛋白質物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な抗腫瘍性糖蛋白質物質に関する。

貝類の内部から抗腫瘍性物質がいくつか得られ、しかも
その抗腫瘍性物質は非細胞毒性でしかも広い抗腫瘍スペ
クトルを持つことは特公昭！７−１ｏｒｒ号、特開昭タ
弘−１１１３／グ号及び同ｊ≠−弘／３／ｊ号公報で本
発明者らが報告してきた。

これらの公報記載の貝類からの抗ハ・Ｏ温性物質は、特
公昭ｚ”ｙ−ｔｒｏｒｒ号にオイテは分子基カ１００ｐ
００〜３ｏｔ）ｏｏｏの範囲にある水溶性、熱安定ｔ１
“を示す糖蛋白質であシ、また特開昭ｊ１１．−≠／Ｊ
／グ号では、ホタテ貝の肝臓を除いた肉の部分から抽出
された平均分子量が約−２９，０００，等電点がｐＨ≠
、ｊをを示す物質であって少しづつ物性の異なる４”ａ
ｎ　頬の水溶性含糖蛋白質性物質であシ、また！１１ｊ
開昭ｊ開閉弘１３ｉｒ号では、肝臓を除いた貝類、特に
ホタテ貝、サザエ、トコブシ、アコヤガイの内部から得
られる平均分子量ＩＱ、０００〜３０，０００の水浴性
含糖蛋白質であるとしている。

このように貝類から従来得た抗腫瘍性物質としては、大
別すると分子量が約２０，０００のものを中心にｉｏ、
０００−３ｏ、０００のものと、１００，０００〜３０
０，０００の水溶性含糖蛋白質の一２種類のものが得ら
れていた。

氷見明若らは広い抗癌スペクトルを持ち、低い細ｆＩ（
？ａ性でしかも特に臨床において治療の困難性が指摘さ
れている固型１市瘍に対し、優れた抑制作用を示す抗腫
瘍性物質を求めて、軟体動物に的をしぼり鋭意０（究を
継続する内に、ホタテ貝の煮汁の乾燥粉末について従来
の報告にある抗Ｊｉ「ｌｆ瘍性物質の諸性質から説明の
出来ない現象を見い出し、これを］ｌ求している間に、
新規な比較的低分子量の抗ｊ１・＋ＸｆＱ’　ｌ’ｌ物
質が含有されることを発見し、その採取に成功して本発
明を完成するに至った。

抗Ｊｉｌｔ瘍性物質の内、免疫学的効果の増強又は賦活
作用のある物質は化学療法剤の中でも期待されているが
、その投与物實が比較的高分子のだめ、どうしても商分
子の物質の投与は抗原抗体反応によるアナフィラキシ−
が心配される。しかし本物質のような分子量の小さいも
のはその１■能性か少なく、優れた抗腫瘍剤として期待
される。

本発明による天然物から得られた暇１規な抗１１：１．
ｉ瘍性物質、更にｉ’＋’　Ｌ　＜はホタテ貝煮汁から
得られた水溶性の含糖蛋白質よシなる抗腫瘍性物質は比
較的低分子の含糖蛋白質からなるものであシ、液体クロ
マトグラフィ、ゲルヂ過クロマトグラフィーな、とて単
一のピークを示し、ディスク電気泳動などの電気泳動法
で単一のバンドを示す均質な物質（後Ｆｅの実施例３の
標品Ｆに相当）であって、次のような理化学的諸性質を
有する。

（リ　元素分析：　０４’Ｊざ％、Ｈ７２％、　Ｎ　／
　３．．２％ｉ９　Ｑ、　Ｏ３％、ＰＯ，０−％、灰分
／、０％（，２）分子量　：ＳＤ８’−１％と２０％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法によってインシュリン
。

チトクロームＣ，ミオプロピン、キモトリゾシノーゲン
Ａ、）リゾ・ドアアン、オブアルブミンなどの４Ｊ準物
質の泳動Ｒｆ値から相対的に求めた平均分子量約５ｏｏ
ｏダルトン （３）、２０％アクリルアミドゲルによる電気体動で、
ｐＨＬＯの泳動条件でブロモフェノールブルーに対する
相対泳動ｇｎ、ｔはＯ８り≠で単一ピークバンドを示ず
； （リ　融点：明確な融点及び分解点を示さないが２’ｌ
Ｏ℃の温度において分解が見られる：（ｊ）紫外線吸収
スペクトル：第２図に示すように、水溶液において２７
りｎｍ付近に極大峡収を持つ； （Ａ）　　赤外線吸収スペクトル：第１図に示すように
ＫＢｒ錠によシ測定した赤外部スペクトルには３ｊθ０
〜３３００，２りｌθ、　ｔｔｔｏ　、　ｔｓｓｏ　、
及び／　４’　２０６ｎ−”β１４近に主要な吸収ピー
クが認められる；（７）呈色反応：（［基礎生化学実験
法ｊ」（阿南功−９坩野邦夫、田刊善蔵、松橋通生、松
木重一部編）丸善発行（ｌり７６）記載の方法に従って
行なった。） ビウレット反応、ローリフオーリ法によるフェノール試
薬による反応、キサントプロティン反応。

アンスロン硫酸反応、フェノール硫酸反応が陽性で、シ
スティン硫酸反応が陰性； （Ｉｒ）塩基性、酸性、中性の区別’　ｐＨ’、’　Ｖ
Ｌ　ｅ　ＩＩＪ。

点を有する温性電解質； （り）溶剤に対する溶解性：水に溶解するが、メタノー
ル、エタノール、アセトンなどの有機溶媒に不溶； （ｌの物質の色、外観：白色、固体粉末状；（／／）糖
含有量：フェノール硫酸法により測定しだグルコース換
算の糖含有量は／　７．２％である；（／、２）加水分
解物中のアミノｉ波＝ｔＮ塩酸中、１ｏｓ−ｉｉｏ℃で
２を時間の加水分解により少なくとも次のアミノ酸が認
められた。アスバ′ラギンＮ＋Ｚ、スレニオン、セリン
、クルタミン自ｚ、ｒｖジノ。

アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン
、フェニルアラニン、ヒスチ、シン、す、；ｊ／ｌアル
ギニン； （１３）加水分解物中の糖：ｌＮ塩酸中、ｇｏ−２ｏ℃
で３時間加水分解を行ない、イオン交換によジアミノ酸
を除いたものを還元した生成物甲に、少なくとも次の糖
が認めら扛だ。フルクトース、マンノース、ガラクトー
ス、フコース、ガラクトサミン、グルコサミン。

以上の諸性質から明らかなように、本発明の物質は比較
的分子量の小さな水溶性の含糖蛋白質性物質よシなる。

以上のような諸性質について、貝類から得られた抗腫瘍
性物質についての文献を調査したが、本発明の抗腫瘍性
物質は特公昭ｊ７−ｒｏｔｔ号、特開昭ｊ弘−’Ｉ／Ｊ
／グ号、同！弘−１ｌ／Ｊ／ｊ号公＊ＩＪ　、％ジャー
ナル　オブ　ナショナル　カンザー　インステイテユー
ト’　Ｖｏｌ、　６０゜ＮＯ，ｔ　、Ｐ／４ＡＦ９−／
１１１７０（／９７１）に記載の抗腫瘍性物ηと比べて
も同一でなく、新規な物質であり、抗腫瘍剤として有用
である。

本発明の水溶性含糖蛋白質性物質の分離、精製は、ホタ
テ貝の煮汁（ホタテ貝を蒸煮した時に得られる凝縮液を
含む）もしくはその濃縮物または乾燥粉末を原料とし、
一般的に蛋白質や糖類などの分離に用いられている処理
手段、例えば遠心分離、透析、限外濾過、ゲル濾過クロ
マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロ
マトフォーカス、イオン交換樹脂による処理、アフィニ
テイクロマトグラフイー、液体クロマトグラフィー、電
気泳動、等電点電気泳動などの各種′電気泳動処理や、
塩析、有機溶媒沈澱、等電点沈澱、減圧濃縮、熱風乾燥
、凍結乾燥などの処理の少なくとも一つ以上の処理を適
用して行なうことができる。これらの分離精製処理はど
のような順序で行なってもよいし、繰り返し使用しても
よい。

本発明の目的物質を得る原料としてホタテ貝煮汁とは、
ホタテ貝の可食部分を水、食塩水、海水のような水性溶
媒の熱蒸気または熱液体で蒸煮′または加熱加工して食
用貝肉を得る際に副生ずる煮汁または液汁を包含する。

ホタテ貝の加工は、貝全体に熱水性溶媒蒸気を直接当て
る方法、貝に熱水性溶媒液を直接注ぎかける方法、ある
いは貝を熱水性溶媒液中に浸漬して加熱する方法等があ
る。

貝の殻や肝臓は除いても除かなくてもよく、寸だ貝の肉
部分は細断したり、脳砕、破砕する心安がないので蒸煮
加熱処理後は全量食用に供することができる。蒸煮加熱
の温度条件は約ｊθ〜７．２０℃、特に１０〜７．２０
℃が好ましく、蒸煮加熱時間は約３〜／、２０分、特に
ｊ−１０分が好ましい。

こうして得られるホタテ貝の煮汁は減圧下での加熱濃縮
、熱風搬送型乾燥法、凍結乾燥法等によシ譲細物または
乾燥粉末とする。熱風搬送型乾燥法例えば噴霧乾燥器を
使用する方法は乾燥器への熱ノ８．入口温度は約２００
〜３１０℃、出口温度は約ざ０，１７０℃であるが接触
（滞留）時間が約５〜１０秒と短かく、目的物５＜の変
質が避けられるので好ましい。

こうして得られるホタテ貝煮汁の濃縮物または乾燥粉末
から木兄Ｕ！１」目的物質の分離、精製は例えげ上記煮
汁粉末をまず水性溶媒に溶かし、遠心分離やｆｉ過など
で不溶解任を除去し、得られる水溶液をゲル濾過や透析
で脱塩し、次に塩基件陰イオン交換体例えば解離基とし
てジエチルアミノエチル基あるいｄ、アミノエチル基を
もつイオン交換ゲルに通し、これに吸着された画分を塩
化す）　ＩＪウム約０．０７〜Ｏ０参モル濃度を含有す
る溶出液で溶出させるイオン交換クロマトグラフィーに
付す。

こうして取得した画分を等電点がｐ）（ｊ、Ｊの成分を
採取できる条件例えばｐ）ｉ４’、７〜！、≠の範囲内
で等電点電気泳動に付し、こうして取得した両分を垂直
スラブゲル電気泳動、ゲル濾過などの分子積分画処理に
付して分子量ｚｏｏｏの目的物質を取得する。これらの
処理と処理との間に脱地が必要なときは透析やゲル濾過
で適宜脱塩し、またｒ／’４　ｋ＋ｉが必要なときは減
圧下での加熱濃縮や凍結乾燥で適宜濃縮する。例えば以
上のようにして目的物質を得ることができる。

本発明の水溶性含糖蛋白質性物質は、抗腫瘍剤として有
用であシ、細胞毒性もなく、広い抗ＩＰｊｔ　ｇ４スペ
クトルを示し、腫瘍に対し異なった部位からの投与（静
注識腔投４皮下投与１１・Ｉ傷内投与）によっても著し
い腫瘍縮退効果を示すというきわめて枦れた作用を有す
る。まだ本発明の目的物質は、食用として価値のある貝
肉部を損傷することなく、また従来は河川を汚染する有
機成分を含有したまま廃棄されていたホタテ貝煮汁を処
理することよシ得られるので公害防止の面でも利益があ
る。

本明細書において抗腫瘍活性の検定方法は！ｉｊ記しな
い限シ次の方法で行なった。

抗腫ｊ易活性の検定方法 乙ＪＩ４？Ｉ令のマウス（ＩＣＲ系雌）腹腔円にサルコ
ーマ（Ｓａｒｃｏｍａ　）／　ｇ　（ｌＪｌｐし瘍細胞
を接ｆ、１１ｉ　Ｌ、ｌＪｌ’ｄ間後に増殖した肺喝細
胞を腹水と共に抜き取り、このｘ’ｌｌｌ　ｌｉｔシ弘
×１０６　個を他の６週令マウス（ＩＯＩも糸雌）の１
１１＜窩皮下に移１１１１す不。その後検定試料を１ｉ
＋、ｉｊ瘍細ノφノ＄　４ｉ（ｆと反対側腋窩皮下注射
で隔日に３１ｊｌ投与する。肺場移稙３週間後の′固形
腫瘍の直径又は摘出したＩＪ・１形ｎＩｐ瘍の型炉を試
料の代υに生理食」μ水を投与した対照区の場合と比較
する。中間経過については固形腫瘍の直径を測定するこ
とによって調べた。ｆｌられた結果を次の式によって表
示した。

以下実施例によシ尋発明を胱明する。

実施例 生ホタテ貝に対し０．１０重ｉ倍の鼠の１０３〜／／θ
℃の熱スチームを生ホタテ貝に直接（）；ζきイリけ、
ｉｏ仕分間０〜１００℃に蒸煮することによシ有効成分
が凝縮水に溶けた一番煮汁を得た。原料としたホタテ貝
にはその重刑の約０．／倍Ｆ４のフジ貝が付着している
ものであった。一番煮汁は７時間でり０℃から３０℃に
徐冷した後、熱風入口温度−２１０℃、出口温度ｌノｊ
℃の哨Ｈａｍ乾燥器によ）滞留時間≠ｊ秒間で瞬間的に
乾燥して有効成分を粉末標品（／ａ）として得た。この
粉末の収率は貝に対して０．２７重量％であった。

一番煮汁を取得した後の加熱ホタテμから貝柱部分のみ
を取シ出しこれを原料とした。沸１賞ｊ〜でいる食塩水
（塩ｆ１度ｉｏ重儀％）ｌ／−！θに７の中へ貝柱ｊｔ
Ｏｋｆを浸漬した。浸漬によ゛シ液温←１．７０℃にな
るが２０分間加熱して再度沸とうさせ、この時点で貝柱
を食塩水から引き嶌げた。得られた煮汁中で上記と同様
にして貝柱ｊ　Ｏｋ７ずつをさらに３回処理した。こう
して得られた二番煮汁を１３時間で２重℃からチ（１）
℃に徐冷しだ後、一番煮汁の乾燥と同じ条件で噴霧乾燥
器によシ有効成分を粉末として得た。この粉末標品（／
ｂ）の収率は貝に対してＯ，コ０７１ｊ　）；ｆ−％で
あった。

一番煮汁から得だ粉末２重（１１：部と二番煮汁から得
た粉末１１■量ｉ％１５とを混合して混合粉末の標品（
／Ｃ）を調合した。

実施例 ＡＯＯｙのホタテ貝の煮汁粉末（／ｃ）を３ｔのｐｉ　
７・３０，１Ｍのリン酸緩衝液に溶解し、ｉｏ、ｏｏθ
０．２０分間の信性で遠心分離をして不溶性の沈ｉｌｌ
、ｉ２物を除き、粉末を溶解したと同じ組成の緩衝液で
充分に平衡化したセファデックスＧ−−２３（スウェー
デンのファルマシアーファイン、ケミカルズ社製、デキ
ストランをエビクロロヒドリンで三次元的に架橋して得
られたゲル濾過用ゲルで分子ｈ４分画範囲は約ｓｏｏ、
ｚｏｏｏ・である。）のカラム（高さ／　ｊ　ｃｒｎ、
内容積／１ｌ−）ヘチャージし、上記と同様の緩衝液（
流液λｏ　ｔ７ｈ　）を展開剤としてゲルｐ過クロマト
グラフィーを行ない、脱塩しｔ％溶出液の電気伝導度を
連続的に測定しながら、低分子の塩などを含む両分と高
分子の１ｉｊｉｊ分とを分ける。一方、これと同様の緩
衝液で充分に平衡化したＤＥＡＥ−セファロース・イオ
ン交換ゲル（ファルマシア、ファイン、ケミカルズ社製
のＤ　ＥＡＥ−セファロースＣＬ−４８０これはアガロ
ースを２．３−、）−ｊ”ロモゾロノξノールを用いて
三次元架橋したものにジエチルアミンエチル基をエーテ
ル結合で結合したもので対イオンとしてＣ／、−を持ち
、排除限界分子量は約／ｙ、１０６、総交換容量はＩＩ
±−２ｍｅｇ／１００−ゲルである）を充填した工業用
カラム中へ、先の脱塩された溶出液を通し、カラム中を
通過させて非吸着性成分を除き、充分に展開剤を通して
洗浄したカラム中に、これまで使用した展開剤（ｐＨ７
，ｔ　　ｏ、　ｔ　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液）中に０．２　
Ｍの塩化す）　ＩＪウム全混合して調製しだ混液を溶出
剤として通す。この塩化ナトリウム入シの溶出剤でＤＥ
ＡＥ−セファロース、カラムから脱着して溶出してくる
両分（柚々の分子量の糖蛋白質を含む）を取シ、これを
３０℃以下で約２の２ｔになる寸で減圧濃縮したあと、
コ昼夜ｊ 試験例！ （イ）実施例−で得だ粉末標品（Ｓ）の中の目的有効成
分の所在を調べるだめ、次の如く標品（Ｓ）を先ず等電
点電気泳動法で分画した。すなわちこの粉末ＩＱ　品（
Ｓ）　３００〜をセファデックスＧｉｏｏスーパーファ
イン（ファルマシア、ファイン、ケミカルズ社製、デキ
ストランをエビクロロヒドリンで三次元架橋したもの、
分子端分画範囲は約−２，０００〜／　００．θ００＞
を支持体とし、ｐＨ勾配をつけるキャリア、アンホライ
ト（ｃａｒｒｉｅｒ　ａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ）としてセ
ルパリト　アーゲー弘−６〔西独３ｅｒｖａ社製のもの
で、グアニＹ基のような２級および３級窒素含有基、ス
ルホン酸基およびホスホン酸基を有する分子量ＳＯＯな
いしざ００の脂肪族性化合物の両性電解質混合物からな
シ、ｐＨｔｉ、、ｏ　、　ｘ、ｏのｐＨ勾配をつけるの
に使用される〕を使用し、ｐＨ４４０からｐＨ６・Ｏの
範囲で等電点電気泳動ができるよう先の粉末標品（Ｓ）
　３００■の入ったゲルペッドを調製した（巾７０．り
σ、長さ−２４’　Ｌ：ｒｎ、厚さｊ、！　、　（７）
型に上記セルパリト　アーグーグーＡを２用Ｊｌｉｔ、
−％を含むセファデックスＧ１００スーツξ−ファイン
のゲル／　００　ｒＭを流し込み、約７０ｆのゲルがで
きるよう徐々に乾燥して作る）。これを２０ｗ７ｚ電力
の条件で１０時間等電点電気泳動を行ない、ｐｌ−１範
囲としてｐＨｊ、７以下の両分（イ）とｐ）−Ｉ　４＋
−、７〜よ、グの画分（Ｂ）とｐＨｊ、≠以上の両分（
０）の３つに分ける。

それぞれの両分を含むゲルを充分な蒸留水を使用して濾
過して支持体ゲルを炉別除去し、それぞれの両分を含む
溶液を得た。次にこの溶出溶液を凍結乾燥によシ濃縮粉
末化し、これを少量の蒸ｉイ水（／ｊ２ｄ）に溶解し、
使用したキャリヤ、アンホライトの除去を目的として蒸
留水で充分に平衡化したセファデックスＧｊＯ（ファル
マシア、ファイン、ケミカルズ社製デキストランをエビ
クロロヒドリンで三次元架橋したもので、分子液分画範
囲は約３００〜３θ、０００　）のカラムヘチャージし
てゲル濾過クロマトグラフィー処理を行う。このことに
より上記画分Ａ、Ｂ、０の夫々から分子ｉ＝ｉ”［２３
００以下の両分を除去し、分子ｆｆ（２１００以上の両
分を取得し、それぞれ凍結乾燥して粉末標品（Ａ−ｌ）
ｔ（Ｂ−１，（ｃ−１を得た。

これらの収量と先に述べた試験法で評価した抗腫瘍活性
とを調べだところ、次表の通シの結果を得た。

第　　ｌ　　表 上記の実験において、イオン交換ゲルＤＥＡＥ−セファ
ロースによる吸脱着により０１２Ｍの塩化す）　ＩＪウ
ム含有溶液で溶出して来た画分を等電点ると、どの等電
点ｐｌ（範囲画分にも抗＋＋ｑＩ場活性のある物質が存
在するようにみえる。しかしながら画分（Ｂ−／）すな
わちｐＨｊ、７ないしｐＨｊ、弘の等′電点を示す両分
に最も強い抗腫瘍活性を示す物ケＩｊ、が存在すること
がわかる。

（ロ）そこで試験例１（イ）で最も抗ＩＩ・１１賜活性
の強い両分（Ｂ−／）について、５Ｄ８−３％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法は単量体のアクリルアミド、架橋剤Ｎ
　、　Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドと重合触媒そ
れにドデシル硫酸ナトリウム８　Ｄ　Ｓを含む混合液を
重合させて調製されたゲルを用いる電気泳動法で、調製
液中のアクリルアミド７４度が例えば５重量％であれば
５ＤＳ−３％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法という
。本試験は例えば昭和３３年を月２Ｑ日丸善株式会社発
行の「功実験化学Ｎｑ座２０．生物化学ＩＪｉ／Ｉ、／
３゜頁に詳述されている〕によりこの両分（Ｂ−／）の
分子量分布を調べだ。この画分（Ｂ−／）には、子【−
：の所に強く発色する単一ノ々ンドのピークがみられ、
その他は分子量約１万〜３Ｑ万の所に連続した発色がみ
られた。。そこで、本発明者らのこれまでの知見では抗
腫瘍活性がないと考えられていた低分子ふ１−の約５ｏ
ｏｏ附近に単一バンドを示す物質の存在が１恩められた
ので、この物質を分離してその抗腫瘍活性を調べるため
、試料調製用の厚さ一２ｆｌ、縦、横約１４ｔＩＭノ型
中（ｐ　ｏ　７　）での７１％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法〔ポリアクリルアミｒゲル電気泳動法はアク
リルアミドＮ。

Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドと重合触媒を含む混
合液を重合させて調製されたゲルを用いる電気泳動法で
、調製液中のアクリルアミＰ濃度が例えば７．ｊ重喰％
であれば７．５％アクリルアミドゲル電気泳動法という
。本実験は例えば前述「新実験化学講座−２０．生物化
学■」４Ｉ−り〜Ｓａ頁に詳述されている〕により（Ｂ
−／）標品２０〜をチャージして９１１ｇ、Ｏで垂直ス
ラブゲル電気泳動を３回行なった。こうして（Ｂ−／）
標品ＡＯｎｇから、ブロモフェノールブルーに対する相
対泳動でｒ％−ｆ値Ｏ０り３（分子量ｚｓｏｏに相当）
以上の低分子画分と、几ｆ値０〜Ｏ０り３までの篩分子
画分とを分＾［ｔした。この低分子画分を含むゲルはｐ
Ｈ７，ｊの０．１Ｍリン酸緩衝液中でホモジナイザーで
ゲルをＡ（１１粒化しだ後この緩衝液中に抽出した。そ
ののち抽出液両分を凍結乾燥して粉末化し、この粉末を
ｉ。

ｍｅの蒸留水に溶かしセファデックスＧ２夕によシ蒸留
水を展開剤として用いて脱塩処理を行ない無機塩等分子
量２０００以下の物質を含まない両分を得、これを凍結
乾燥して粉末標品（Ｂ　−／　−ａ）のｌコ■を得た。

また参考のためＬｆ値０　、０．２３までの高分子画分
も同様にして精製し粉末標品（Ｂ−／−ｂ）の３６■を
得た。これらの粉末４．λ品について抗１１ａ瘍活性を
調べたところ次表の結果を得た。

第１表 （注）腋下皮下投与、／−Ｊ−１日、３遍間飼育、ＩＯ
几メＩＦマウス使用、 標品試料（１３−／　−ａ　）は等電点電気泳動でｐ）
ｌ弘、７以上、　ｐ）ｉ　３．４’以下の両分中にある
物質であって、またスラブゲル電気泳動により分子セｔ
が約５ｚｏｏ又はそれ以下（後述実施例に示すように実
際の分子量は約ｈｏｏｏである）の両分である。

このように分子量約１０００又はそれ以下の物質で等電
点がｐ）（４（、７〜ｊ、弘の範囲にある両分（ｎ−／
−ａ）は、分子ｙｚｓｏｏ以上のものを全部含む両分（
Ｂ−／−ｂ）に比べて抗腫瘍活性の高い低分子抗腫瘍活
性物質を含有することが示唆されたのは馬くべきことで
ある。

実施例３ 実施例λの粉末標品（Ｓ）　／、ｊ　ｔを、セルパ社！
／′！セルパリト、アーゲ−ｐ−＋とファルマシア、フ
ァイン、ケミカルズ社製セファデックスＱ−１００スー
パーファインのゲルと共に蒸留水中に懸１局。

膨潤させ、充分な蒸留水でこのゲルを洗浄、戸別し更に
粉末乾燥化して作ったゲルを用いて、ｐｌ（≠Ｏからｐ
Ｈｔ、ｏの範囲で調製用等電点電気泳動が可能なゲルペ
ッド３枚を試験例１（イ）と同様な手法で調製した。調
製した粉末標品（Ｓ）入シのゲルペッドについて、それ
ぞれ−２０Ｗの定電力電気泳動の条件で７４４時間等電
点電気泳動を行ない、電気泳動したゲルをｐｌＬｔ、　
ｏ以下の両分（Ｄ）　、　ｔ、０　＜　ｐＨ（ｊ、≠の
画分（”’）＋ｐ”弘以上の画分（Ｆ）に分画し、両分
（Ｆ）　ｋ＋、捨て、両分（］））と両分（匂を充分な
蒸留水で溜出分とゲルに戸別した。これらの両分（Ｄ）
と両分（匂を含むＦＤをそれぞれ凍結乾燥をして、一度
粉末化したのちこれをそれぞれ少ｆｔ（／　０ｍ１）の
蒸留水に翁解し、試験例１（イ）と同様な方法でセファ
デックスＱ−１０ゲルで、分子量−２３００以上の両分
を分離した。ここで得られた。Ｈｚ、ｏ以下で分子量２
．ｚｏ。

以上のものを含む画分をｎ−／、ｔたｐＨ！、　０−　
Ｊ：弘のもので分子量λ、Ｓ　ＯＯ以上の両分をＢ−／
とじてそれぞれ凍結乾燥して粉末標品を得だ。得られた
粉末標品（１）　−／　）は２を岬、（Ｅ−／）はｊり
■であった。

得られた標品の一部を取って８８８−２０％ポリアクリ
ルアミＰゲル電気泳動法によｐｊＯｍｋの定電流の条件
で６時間泳動し、常法に従って泳動蛋白をインシュリン
人、インシュリンＢ、チトクロームＣ，キモトリプシノ
ーゲンＡ、オプアルブミンなどを分子量標準物質とする
相対的な分子量を測定した。この結果、両分（Ｄ−／）
には、分子量ｆＯθ０〜２００θに相当する几ｆ値のと
ころに、殆んど発色するものがないのに対し、（Ｅ−／
）の両分には、分子量弘ｏｏｏ〜ｚｏｏｏに相当するｌ
Ｌｆ値の処に強い単一バンドの発色があシ、この１．ｉ
　−／中に平均分子Ｈｓｏｏｏのものが存在することが
判明した。尚、両分（Ｄ−／）と（Ｅ、−／）には、分
子１ｉ　７０．０００以上の帝も；、無数に見られたが
、分子量ｊ、０００からｉｏ、ｏｏｏの間にピークはな
かった。

前記の如くして得られた粉末標品（１（−／　）２０■
を蒸留水、２−に溶かし、これを試料調製用の厚さ、２
咽横巾ｌ参ｍの７．３％ポリアクリルアミド垂直スラブ
ゲル中でｐＨｔ、ｏの緩衝液を用いてｒｏｍへの定電流
で電気泳動を３時間行なった。この操作を２回繰返し、
電気泳動を終了したゲルを、いずれも、ブロモフェノー
ルブルーに対する相対泳動でＲｆ値００７３以上の低分
子画分と考えられる両分（本発明による分子量約５ｏｏ
ｏの糖飯白負を含む両分）の所と、０１２３以下のＩＬ
ｆ値を持つ両分（分子量が約３０００よシ大きい糖蛋白
質を含むと考えられる画分）に分けた。このブロモフェ
ノールプル→別ち相対泳動値で０９２３以上のゲルをＱ
、１Ｍ　ｐｔ＋　７．　ｊリン酸緩衝液中でホモジナイ
ザーを便ってゲルを解こう攪拌し、そのうちゲルと几ｆ
値Ｏり３以上の物質が抽出されたＦ？ｆｆｌを分は取り
、この抽出物を含むＦ液を一旦凍結乾燥して粉末化した
。

次にこの乾燥粉末をｉｏ−の蒸留水に浴かしセファデッ
クスＧ−コｊを充填したカラム（内径／ｃｒｎ長さ≠よ
（７））を用いて蒸留水を展開剤としてゲル沖過クロマ
トによシ脱塩し、無機塩を含まない分子１目００以上の
両分を取シ、この両分を凍結乾燥することにより粉末標
品（１つの／≠■を得た。

実施例ｑ ８　Ｄ　８−２０％ポリアクリルアミドゲルの垂直ゲル
電気泳動法によシ、インシュリンＡ、インシュリンＢ、
チトクロームＣ，キモトリゾシノーゲンＡ、オプアルブ
ミン、トリプトファンなどを分子量標準物質とする相対
的な分子量を実施例３で得た粉末標品（１”）について
測定した。この結果、粉末標品＜Ｆ′）ｔよ平均分子量
ｓ、ｏｏｏの所に単一のピークバンドがあシ（約±１ｏ
ｏｏの測定誤差がある）、平均分子＋＋４：　ｊθ００
と考えられた。

またセルパ社製等電点電気泳動用プレコートフィルムセ
ルパリト　プコレーツ（Ｐｒｅｃｏｔｅｓ）≠−６（セ
ルパリトＡＧ４’−４と５％ポリアクリルアミドゲルよ
りなるゲル）を使用して、ｐＩ（４ｔ、０−　Ａ、０の
間の等１Ｌ、７点を実施例３で得た粉末標品（乃につい
て測定した。その結果、粉末標品（Ｆ）はｐＨ１−２１
ｔＲ近に単一ピークバンドを示して本物質の等電点はｐ
ｌ［！、−２附近と考えられた。

また粉末標品（Ｆ）の物理化学的諸性１勺を測定した。

この結果は先に本文中の理化学的諸性質として述べた値
が得られた。

実施例ｊ ｔ退会のＩＯＲ系マウス雌の腹ｊ外にサルコーマｉｒｏ
腫瘍細胞を接種し、この細胞Ａ　Ｘ　／　０’個を他の
６退会ＩＣＲ系雌のマウスのそけい都皮下に移植した。

！日間後から検定試料である実施１列３の標品（Ｆ′）
を生理食塩水に溶かしｐＨ７，０に調ν１１シた水溶液
を隔日に３回投与した。投与経路は直接腫瘍内投与、尾
の静脈投与、腹腔内投与および腫瘍細胞を植えた反対側
の腋窩部皮下投与で行なった。腫瘍移植からｊ６週間後
に固形ｊ重傷を摘出し、その重量を試料の代シに生理食
丈な水を投与した対照区の場合と比較した。腫瘍阻止率
（％）および完全治癒は抗腫瘍活性の検定と同様方法で
行なって次表の結果を得た。

第　　３　　表 （注）長与助期、！、７，７日目 本実ハ′Ｖ・、例に示しだように粉末標品（Ｆ）は、腫
瘍内投与、静脈内投与、腹腔内投与及び皮下投与におい
てもザルコーマｉｇｏ固形腫瘍に対し腫瘍を縮退させ、
光治させる効力がある。

まだ標品（１’）の直接細胞毒性をマウス白血病（Ｌｊ
　／　７１　　Ｙ　Ｌｙ＋ｎｐｈｏｍａ）＋１（１１胞
により調べたが、毒性は認められなかった。

実施例６ サルコーマｌざＯ固形腫瘍以外の各種固形腫瘍であるエ
ールリッヒ・カルシノーマ癌、白面性腹水１抹瘍（ＳＮ
−３ｔ）、ＮＴＦ細網細胞肉腫（ＮＴＦｒｅｔｉｃｕｌ
ｕｍ　ｃｅｌｌ　ｓａｒｃｏｍａ　、メチルコラ／スレ
ン誘発繊維肉腫（Ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ）について
実施例３の粉末標品（Ｆ）の抗腫瘍活性を調べた。繊維
肉、腫はＩ）ａｌｂ／Ｃ系のマウスで、その他はＩＯＲ
系のマウス雌を退会に１それぞれ同種の担癌マウスから
得た細胞弘×ＩＯ６個をそけい部皮下に移植した。ｌり
・′仕置後固形腫瘍が形成されていることを確認して、
生理食塩水に溶かした検定試料（Ｆ）をそのハ…瘍内に
隔日、３回投与する。腫瘍移植！週間稜の固形１ｊ・１
！瘍を摘出し、その重量を試料の代シに生理食塩水を投
与した対照区の場合と比較してＩＭｔ　瘍阻止率と完全
治ゆ菌数／試験匹数を求めた。膜力量はすべて０．２　
ｍｙ　／マウス白血病で行なった。

第　　４Ａ　　　表 実施例 実施例１の煮汁粉末（ｌ・Ｃ）の代りにオｉ、汁粉末（
／、）を使用した以外は実施例２，３と同様の手法にて
分子量！θ００の水溶性含糖蛋白質よシなる抗ｊトロ瘍
性物質を分離した。このものの理化学的性質および抗＋
ｈ１ｒ瘍活性は実Ｍｉｔ例３で得られた粉末標品（Ｉ”
）と差がみられなかった。

実施例を 実施１ｐｊｌ　／の煮汁粉末（／ｃ）の代シに煮汁粉末
（／ｂ）を使用した以外ｉ実施例コ、３と同様の手法に
て分子６４：ｔ　ｏ　ｏ　ｏの水溶性含糖蛋白質よシな
る抗ｌｌ１１！Ｊ易性′４ｆＩｌＪ員を分離した。この
ものの理化学的性質および抗ｉｆ！ｉｊ　ｔｊ％活性は
実施例３で得られた粉末標品（１’）と差がみられなか
った。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の水溶性含糖蛋白Ｔ１よりなる抗腫瘍性
物質の赤外線吸収スペクトル図（ＫＢｒ　ｋＮ　）を、
第２図は同物質の０・３〜／　ｍｅ水浴液の紫外Ｆ−吸
１区スペクトル図を示す。 帛２囲 タ　長（ｎｒｒｔ） 手続補正書（自発） 昭和５８年　１月２４日 特許庁長官殿 ↓、事件の表示 昭和　５７年特許願第Ｌ３７２０９号 ２、発明の名称 抗ＩＩａ！瘍性糖蛋白質物質 ３、補正をする者 事件との関係　　　　　特ｔ′１出願人住所　　　大阪
府大阪市南区島之内１丁目２０番１９号（５８６）名称
　　丸善石油株式会社 ４、代理人 〒１０５　　住所　東京都港区西新橋１丁目１番１５号
物産ビル別館　電話（５９１）　０２６１５、補正の対
象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 （１）　　明細書、第２５頁下から第４行の［プコｖ　
−ツ（Ｐｒｅｃｏｔｅｓ　）　Ｊを１−プレコート（Ｐ
ｒｅｃｏｔｅ　）　ｊとＭＩ＋　正ｔ　７．）。 （２）同書、第２７頁第３表の第３欄（平均的岬傷Ｍ量
の４［＃ｌ）の「腫瘍内」の行の「１．８５　Ｊをｉｆ
ｌ、５ｚｊと袖正し、同じ欄の「腹腔」の行の１０．５
０」を［２，５０Ｊと補正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ホタテ貝の煮汁から得られ、次の特性＝１　白色、固体
   粉末状； １１　　水に溶け、メタノール、エタノ−、ル、アセト
   ンの有機溶媒に不溶性； ｉｉｉ　　ｐＨｊ、　、２に等電点を持つ両性電解質；
   １■　　赤外線吸収スペクトルで３３００〜３３００゜
   ／６６０及び／３３０．＝附近に主要な吸収ピークを有
   し： ■　水溶液の紫外糾吸収スペクトルで、２７りｎｍ附近
   に極大吸収を有し； ■１　　呈色反応のヒラレット反応、キサントプロティ
   ン反応、ローリーフオーリ法のフェノール試薬による反
   応、アンスロン硫酸反応、およびフェノール硫酸反応は
   陽性、システィン硫酸反応は陰性； ■１１　　ゲル１に気泳動法による平均分子量約Ｓ、Ｏ
   Ｏθ；を有する水溶性含糖蛋白質よ勺なる抗腫瘍性物質
   。