HU194310B - Process for preparing alkali metal, alkali earth metal, ammonium salt and n-deacetylated derivative of novel tan-588 antibiotic - Google Patents
Process for preparing alkali metal, alkali earth metal, ammonium salt and n-deacetylated derivative of novel tan-588 antibiotic Download PDFInfo
- Publication number
- HU194310B HU194310B HU851207A HU120785A HU194310B HU 194310 B HU194310 B HU 194310B HU 851207 A HU851207 A HU 851207A HU 120785 A HU120785 A HU 120785A HU 194310 B HU194310 B HU 194310B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- tan
- medium
- antibiotic
- deacetylated
- culture
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Description
A találmány tárgya eljárás új antibakteriális hálást) antibiotikum előállítására.
Ismeretes, hogy az antibiotikumok gátolják a baktérium-sejtfal bioszintézisét. Ismert antibiotikumok például a Natúré, 289 590-591, (1981) irodalmi helyen ismertetett szulfazecin és izoszulfazeein, valamint a Natúré, 291, 489-491 (1981) irodalmi helyen ismertetett SO 26 180, 26 700, 26 823, 26 875, 26 970, 26 812 stb. jelzésű antibiotikumok. Ezek az ismert antibiotikumok elsősorban a Gram negatív baktériumok ellen hatnak. A J. Antibiotics, 36, 1245 -1251: 1252-1257, (1983) irodalmi helyen további SO 28 332, 28 502, 28 503 stb. jelzésű antibiotikumokat ismertetnek.
Célul tűztük ki új antibiotikumok előállítását. A cél elérése érdekében nagyszámú mikroorganizmust izoláltunk táptalajból, majd meghatároztuk a mikroorganizmusok által termelt antibiotikumok jellemzőit. Úgy találtuk, hogy bizonyos mikroorganizmusok, amelyek az Empedobacter vagy Lysobacter nemzetségbe tartozó új fajok, megfelelő táptalajon tenyész.tve, Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok ellen ható új antibiotikumot képesek termelni. Az új antibiotikumot alkálifém-, alkáliföldfémvagy ammóniumsó formában izoláltuk, fiziko-kémiaj és biológiai jellemzőit meghatároztuk és „TAN-588 jelzéssel láttuk el.
Felismertük, hogy a TAN-588 antibiotikum molekulája N-acetil- és karboxil-csoportokat tartalmaz, amelyekből az acetilcsoportok eltávolíthatók.
Úgy találtuk továbbá, hogy egy az Empedobacter vagy Lysobacter nemzetségbe tartozó mikroorganizmus a TAN-588 antibiotikum N-dezacetilezett-származékát is tudja termelni. Felismertük azt is, hogy abban az esetben, ha egy Acinctobacter nemzetségbe és Egy Empedobacter vagy Lysobacter nemzetségbe tartozó mikroorganizmust táptalajon tenyésztünk, akkor a TAN-588 antibiotikum N-dezacetilezett-származékát nagyobb mennyiségben termelhetjük, mint ha csak az Empedobacter vagy Lysobacter nemzetségbe tartozó mikroorganizmust használjuk.
Találmányunk tárgya eljárás TAN-588 antibiotijum alkálifém-, alkáliföldfém- ammóniumsóinak /s Ndezacetilczett származékának előállítására, amely eljárás folyamán az ' Empedobacter lactantgenus YK-258 vagy a Lysobacter albus sp. nov. YK-422 antibiotikumokat vagy TAN-588 antibiotikum és/ vagy N-dezacetilczett-származékának termelésére képes mutánsaikat vagy variánsaikat megfelelő táptalajon tenyésztjük, majd azt feldolgozva az antibiotikumot kinyerjük, továbbá eljárás N dezacetilczett TAN-588 antibiotikum előállítására, amely eljárás folyamán egy Empedobacter lactanrgenus YK-588 vagy Lysobacter albus sp. nov. YK-422 mikroorganizmust vagy ezek TAN-588 antibiotikum és/vagy N-dezacetílezett származékának termelésére képes mutánsait vagy variánsait és az Acinetobacter sp YK-504 mikroorganizmust kevert tenyészetben tenyésztjük, majd a táptalajból az N-dezacetilezett TAN-588 antibiotikumot kinyerjük.
A TAN-588 antibiotikum és/vagy N-dezacetilezett-származékának termelésére használt Empedobacter lactamgenus új mikroorganizmus faj. Az Empedobacter lactantgenus YK-258 törzset Japánban Shiniane Prefecture, Masuda városban gyűjtött táptalajból izoláltunk.
Az YK-258 törzs mikrobiológiai jellemzői a következők:
(a) Morfológiai jellemzők:
Szilárd, ferde táptalajon 24 C hőmérsékleten öt napon át történő inkubálás után a sejtek 0,40,6 pm átmérőjű és 2,0-3,0 pm hosszúságú megnyúlt pálcika alakúak, esetenként 12-30 pm hoszszúságú szálformájúak. Ostorosodás sejt mozgással nem figyelhető meg, a sejtek nem spórásodnak, Gram-negatívok és savállók.
(b) Szaporodás különböző tápközegekben
A tenyésztést 24°C hőmérsékleten, a megfigyelést 1-14 nap elteltével végezzük.
1) Szilárd táptalaj csészében.
A kialakult telepek áttetszők, halványsárga színűek, köralakúak, redőzött felületűek, sima szétlel, nincs diffúzióképes pigment.
2) Szilárd ferde táptalaj.
A telepek jól szaporodnak, színűk a sárgától a borostánykő színig változik.
3) Folyékony táptalaj.
A táptalaj zavaros, csapadék képződik, a felszínen hártyásodás figyelhető meg.
4) Szúrt tápzselatinos tenyészet.
Szaporodás főleg a felső részben figyelhető meg, kráter-formájú elfolyósódással. Az elfolyósítási aktivitás viszonylag gyenge.
5) Lakmusz.
A lakmuszt nem redukálja, peptonizáció és koaguláció figyelhető meg.
(c) Fiziológiai jellemzők:
1) Nitrátok redukciója: negatív
2) Denitrifikálási reakció: negatív
3) (MR) Metilvörös vizsgálat: negatív
4) (VP) Voges-Proskauer vizsgálat: negatív
5) Indol termelés: negatív
6) Hidrogén-szulfid termelés (TS1 agar és ólom-acetát papír): negatív
7) Keményítő hidrolízise: negatív
8) Citrát hasznosítás (Kóser, Christensen, és
Simmon féle tápközegben): pozitív
9) Szervetlen nitrogén-források hasznosítása:
i) Kálium-nitrát: negatív ii) Ammónium-szulfát: negatív
10) Pigmenlképzés (King A és B és mannitélesztő-kivonat táptalajon):
diffúzióképes pigmentképzés nem figyelhető meg.
11) Urcáz: negatív
12) Oxidáz: negatív
13) Kataláz: negatív
14) Szaporodási tartományok:
i) pH: az optimális pH tartomány 5,8-6,6 között van, bár a mikroorganizmusok szaporodnak
5,4-8,5 pH-érték mellett is, táptalaj: 0,1% glükóz, 0,01% élesztőkivonat,
0,1% ammónium-szulfát, 0,1% nátrium-klorid,
0,05% magnézium-szulfát (heptahídrát) és 0,1 mólos foszfát-puffer (külön-külön sterilizálva), ii) hőmérséklet: az optimális hőmérséklettartomány 24-31°C között van, de a mikroorganizmusok 20-32°C hőmérsékleten szaporodnak.
táptalaj: folyékony táptalaj:
15) Oxigén igény: aerob
16) O-F (oxidációs-fermentációs) vizsgálat (Hugh. Leifson módszer): nem reagál
17) Cukorból sav és gáz termelése és ezek hasznosítása.
| Sav (vizes pepton) | Gáz (vizes pepton) | Haszno- sítás (Davis táptalajon) | |
| ]-Arabinóz | — | — | |
| d-Xilóz | ± | — | — |
| d-Glükóz | - | — | ♦ |
| d-Mannóz | — | - | •4 |
| d-Fruktóz | - | — | + |
| d-Galaktóz | — | - | - |
| Maltóz | — | — | + |
| Szacharóz | — | — | — |
| Laktóz | — | — | — |
| Trehalóz | - | — | + |
| d-Szorbit | — | — | — |
| d-Mannit | - | — | - |
| lnozit | — | - | - |
| Glicerin | — | — | |
| Keményítő | - | - | + |
18) a DNS-ben a gnanin + citozin mól %-a (Tm módszer): 74,4 ± 1,5
19) Képesség poliszacharidok bontására:
Karboxi-mctil-cellulóz: pozitív
Kolloidális kitin: pozitív
Nátrium-algínát: negatív
20) Actinomycin tolerancia: tolerálni képes.
(ellenáll).
A fentiekben jellemzett mikrobiológiai jellemzőkkel rendelkező YK-258 törzset, összehasonlítottuk a „Bergey s Mannual of Determinative Bacteriology,
8. kiadás és International Journal of Systematic Bacteriology, 30, 225-420 (1980) és 32, 146-149 (1982) irodalmi helyeken ismertetett törzsekkel. Azon jellemzők alapján, hogy a törzs sárga, Gramnegatív, sejt mozgásképessége nincs, aerób, cukorból nem képes savat és gázt előállítani, DNA-jában nagy a GC tartalom, megállapítottuk, hogy a törzs a Flavo-bacterium nemzetségbe tartozik. Mindazonáltal a baktcricid taxonómia szemszögéből nézve rámutattak, hogy a fent említett Flavo-baktérium törzsek keveredve vannak idegen, eltérő mikroorganizmus fajokkal, és a Flavobacterium nemzetség definícióját korrigálták az International Journal of Systematic Bacteriology, 29, 416-426 (1979) irodalmi helyen. Ezen és az Annual Review of Microbiology, 37, 233-252 (1983) irodalmi referenciák szerint valószínűbb, hogy az YK-258 törzs a Flavobacterium nemzetség helyett inkább az Empedobacter nemzetségbe tartozik. A fenti irodaimi helyeken nem ismertetnek olyan fajt, amely DNA-jának GC tartalma meghaladná a 70%-ot. A fentiek alapján megállapítottuk, hogy az YK-258 törzs egy új mikroorganizmus fajhoz tartozik. Ezt az új, mikroorganizmus fajt „Empedobacter lactamgenus -nak neveztük el.
Az. Empedobacter lactamgenus YK-258 törzset letétbe helyeztük az Instítute fór Fermentation, Osaka (IFO: 17—85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka, Japán) címen, IFO 14322 (1984. február 20.) számon. Az új mikroorganizmust a Fermentáljon Research Instítute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Induslry, Japan (FR1: 1-3, Yatabc-cho higashi 1-chonie, Tsukuha-gun, lbaragi Prefecture, Japan) is letétbe helyeztük FERM P-7558 (1984. március 26.) számon, majd a Budapesti szerződés feltételeinek megfelelően az FRI-ben, FERM, BP699 szám alatt.
A TAN-588 antibiotikum és/vagy N-dezacetilezett származékának termelésére használhatjuk a Lysobacter albus-t is, ami egy új nükroorganizmus faj. Ezen belül megemlíthetjük a Lysobacter albus sp. nov. YK-422 törzset, amit Japánban, Shiga Prefecture, Kanzaki-gun-ban gyűjtött talajmintából izoláltunk. Az YK-422 törzs mikrobiológiai jellemzői a kővetkezők:
(a) Morfológiai jellemzők
Szilárd ferde táptalajon 24°C hőmérsékleten 2 napon át történő inkubálás után a sejtek 0,4-0,7 μηι átmérőjű és 2,0-4,4 pm hosszúságú megnyúlt pálcika alakúak, esetenként 20-30 pm hosszúságú megnyúlt pálcika alakúak, esetenként 20 -30 pm hosszúságú szálformájúak. Ostorosodás sejt mozgással nem figyelhető meg, a sejtek nem képeznek spórát vagy mikrocisztat,· Grain-negatív és nem savtűrő.
(b) Szaporodás különböző tápközegekben
A tenyésztést 24°C hőmérsékleten, a megfigyelést 1-14 nap elteltével végezzük.
1) Szilárd táptalaj csészében.
A kialakult telepek áttetszők, fehér színűek, köralakúak, konvex felületekkel és sima széllel, nyálkás felületet képeznek: nincs diffúzióképes pigment.
2) Szilárd ferde táptalaj.
A telepek szálas szerkezetben növekednek, fehér színűek.
3) Folyékony táptalaj.
A tenyészet enyhén zavaros, kismennyiségű csapadék képződik, gyenge gyűrűképződéssel.
4) Szúrt tápzselatinos tenyészet.
Szaporodás főleg a felső részben figyelhető meg, réteges elfolyósítással. Az elfolyósítási aktivitás viszonylag erős.
5) Lakmusz
A lakmuszt redukálja, peptonizáció figyelhető meg. Koaguláció nincs.
6) Száraz élesztős táptalaj.
A képződött telepek szélein tiszta zónák alakulnak ki.
(c) Fiziológiai jellmezők
1) Nitrátok redukciója: negatív
2) Denitrifikálási reakció: negatív
3) (MR) Metil vörös vizsgálat: negatív
4) (VP) Voges-Proskauer vizsgálat negatív
5) Indol termelés: negatív
6) Hidrogén-szulfid termelés (TSI agar és ólom-acetát papír): negatív
7) Keményítő lúrdolízise: negatív
8) Citrát hasznosítás (Christensen, és
Sinrmon féle tápközegben): pozitív
9) Szervetlen nitrogén-források hasznosítása:
i) Kálium-nitrát: negatív
Ii) Ammónium-szulfát: negatív
10) Pigmentképzés (King A és B és mannitélesztő kivonat táptalajon):
diffúzióképes pigmentlcépzés nem figyelhető meg:
11) Ureáz: negatív
12) Oxidáz: pozitív
13) Kataláz: negatív
14) Szaporodási tartományok:
i) píi: az optimális pH tartomány 6,3-7,9 között van, bár a mikroorganizmusok szaporodnak, 4,6-8,2 pH-érték mellett Is, táptalaj: 0,1% glükóz, 0,01% éíesztőki-31
194 310 vonat, 0,1% ammónium-szulfát, 0,1% nátrium-klorid, 0,05% magnézium-szulfát (heptahidrát), a pH-t nátrium-hidroxiddal vagy kénsavval állítjuk be:
ii) hőmérséklet: az optimális hőmérséklet-
| a mikroorganizmusok 14—32°C hőmérsékleten is szaporodnak, Táptalaj: folyékony táptalaj: | |||
| 15) Oxigén igény: | aerob | ||
| 16) O-F (oxidációs-fermentációs) vizsgálat | |||
| (Hugh. Leifson módszer): | nem reagál. | ||
| 17) Cukorból sav | és gáz termelése és | ezek hasz- | |
| nosítása. | Sav | Gáz | Haszno- |
| (vizes | (vizes | nosítás | |
| pepton) | pepton) | (Davis táptalajon) | |
| 1-Arabinóz | — | — | ± |
| d-Xilóz | — | — | + |
| d-Glükóz | — | — | + |
| d-Mannóz | — | — | + |
| d-Fruktóz | — | — | |
| d-Galaktóz | — | — | + |
| Maltóz | — | — | — |
| Szacharóz | — | — | ♦ |
| Laktóz | — | — | ♦ |
| Trehalóz | — | — | |
| d-Szorbit | — | ||
| d-Mannit | — | — | ♦ |
| Inozit | — | — . | — |
| Glicerin | — | — | ± |
| Keményítő | - | - | + |
18) a DNS-ben guanin ♦ cítozin mól%-a (Tm módszer): 70,2 ± 1,5
19) Képesség poliszacharidok bontására
| Karboxi-metil-cellulóz: | pozitív |
| Kolloidális kitin: | pozitív |
| Nátríum-alginát: | */- |
A fentiekben jellemzett mikrobiológiai jellemzó'kkel rendelkző XK-422 törzset, összehasonlítottuk a Bergey s Mannual of Determinative Bacteriology,
8. kiadás és International Journal of Systeinatic Bacteriology, 30, 225-420 (1980) és 32, 146-149 (1982) irodalmi helyeken ismertetett törzsekkel. Azon jellemzők alapján, hogy a mikroorganizmus Gram-negatív, a telepek nyálkás felületet képeznek és szálas szerkezetben növekszenek, a kolloidális kitint és száraz élesztőt bontani képes a DNS-ben nagy a guanin ♦ citozin tartalom, megállapítottuk, hogy a törzs a Lysobacter nemzetségbe tartozik, bár a törzs különbözött a Lysobacter nemzetségbe tartozó International Journal of Systemativ Bacteriology, 28, 367-393 (1978) irodalmi helyen említett fajoktól abban, hogy nem reakcióképes az O-F vizsgálatokban, szfntónusban nem különböző telepeket képez, valamint nem képes asszimilálni és hasznosítani a szervetlen nitrogén-forrásokat. A fentiek alapján megállapítottuk, hogy az YK-422 törzs egy új mikroorganizmus fajhoz tartozik. Ezt az qj mikroorganizmus fajt „Lysobacter albus sp. nov. -nak neveztük el. A Lysobacter albus sp. nov. YK-422 törzset az IFO-nál letétbe helyeztük, 14384 (1984. október 5.) számon. A törzset az FRI-ben is letétbe helyeztük FERM P-7938 (1984. november 14.) számon, majd a Budapesti Szerződés feltételeit teljesítve az FRI-ben FERM BP-698 szám alatt. A találmány szerinti kevert tenyészet, ami az
Acinetobacter sp YK-504 mikroorganizmus az Empedobacten lactamgenus YK-258 vagy a Lysobacter albus sp. nov. YK-422 mikroorganizmus vagy ezek TAN-588 és/vagy N-dezacetil származékát termelni képes mutánsai vagy variánsai keveréke, a TAN588 antibiotikum N-dezacetilezett származékát nagy mennyiségben termeli.
A nagy mennyiség alatt azt értjük, hogy a kevert tenyészet sokkal nagyobb mennyiségben termeli az N-dezacitelezett TAN-588 antibiotikumot, mintha csak az Empedobacter vagy Lysobacter mikroorganizmus tenyészetet használunk.
A acinetobacter sp. YK-504 törzset, Japánba, Osaka Prefecture, Osaka city, Yodogawa-ku-ban gyűjtött édesvízből izoláltunk.
Az YK-504 törzs mikrobiológiai jellemzői a következők:
(a) Morfológiai jellemzők
Szilárd, ferde táptalajon 24°C hőmérsékleten 5 napon át történő inkubálás után a sejtek 0,8-1,5 pm átmérőjű és 1,1-1,2 ptm hosszúságú rövid vagy megnyúlt pálcika alakúak, esetenként párosak vagy szálformájúak. Ostorodás, sejt mozgással nem figyelhető meg.
(b) Szaporodás különböző tápközegekben.
A tenyésztést 24°C hőmérsékleten, a megfigyelést
4—14 nap elteltével végezzük.
1) Szilárd táptalaj csészében.
Kis, köraiakú konvex felszínű és sima szélű telepek alakulnak ki. Nincs diffúzióképes pigment.
2) Szilárd ferde táptalaj.
A telepek mérsékelt ütemben szálas szerkezetben növekednek, színtelenek és fényes felületűek.
3) Folyékony táptalaj.
A tápoldat zavaros, csapadék képződik gyűrű kialaloilása nélkül.
4) Szúrt tápzselatinos tenyészet.
A felső részben csekély szaporodás figyelhető meg. Az elfolyósítási aktivitás negatív.
5) Lakmusz
A lakmuszt nem redukálja, peptonizáció és koaguláció nem figyelhető meg.
(c) Fiziológiás jellemzők:
1) Nitrátok redukciója: negatív
2) Denitrifikálási reakció: negatív
3) (MR) Metilvörös vizsgálat: negatív
4) (VP) Voges-Proskauer vizsgálat: negatív
5) Indol termelés: negatív
6) Hidrogén-szulfid termelés (TSI agar és ólom-acetát papír): negatív
7) Keményítő hidrolízise: negatív
8) Citrát hasznosítás (Kóser, Christensen, és
Simon féle tápközegben): negatív
9) Szervetlen nitrogén-források hasznosítása:
i) kálium-nitrát: negatív ii) ammónium-szulfát: negatív
10) Pigmentképzés (King A és B és mannitélesztő kivonat táptalajon):
diffúzióképes pigmentképzés nem figyelhető meg:
llJUreáz: negatív
12) Oxidáz: negatív
13) Kataláz: pozitív
14) Szaporodási tartományok:
194 310
i) pH : az optimális pH 6-7,5 között tartomány van, bár a mikroorganizmusok szaporodnak 5—8 pH-érték mellett is, táptalaj: folyékony táptalaj, aminek ρΗ-ját nátrium-hidroxiddal vagy kénsawal állítjuk be:
ii) hőmérséklet: az optimális hőmérséklettartomány : 15-22°C között van, de a mikroorganizmusok
7,5-39°C hőmérsékleten is szaporodnak, táptalaj: folyékony táptalaj,
15) Oxigénigény: aerob
16) O-F (oxidációs-fermentációs)
| vizsgálat (Hugit. Leifson módszer): 17) Cukorból sav és gáz termelése és ezek hasznosítása | nem reagál | |||
| Sav (vizes pepton) | Gáz (vizes pepton) | Haszno- sítás (Davis táptalajon) | ||
| 1-Arabinóz | — | — | ||
| d-Xilóz | — | — | - | |
| d-Glükóz | — | — | — | |
| d-Mannóz | — | — | — | |
| d-Frukóz | — | - | — | |
| d-Galaktóz | — | — | — | |
| Maltóz | — | - | ||
| Szacharóz | — | — | — | |
| Laktóz | — · | — | ||
| Trehalóz | — | — | — | |
| d-Szorbit | — | — | ||
| d-Mannit | — | — | — | |
| Inozit | — | — | — | |
| Glicerin | — | — | — | |
| Keményítő | - | - | - |
18) A DNS-bcn a guanin + citozin mól%-a (Tm módszer): 40,0 ±1,5
19) Képesség poliszacharidok bontására
Karboxi-metil-cellulóz: negatív
Kolloidális kitin: negatív
Nátrium-alignát: negatív.
A fentiekben mikrobiológiai jellemzőkkel jellemzett YK-504 törzset, összehasonlítottuk a Bergey s Manuual of Determinatíve Bacteriology, 8. kiadás, és International Journal of Systematic Bacteriology, 30, 225—420 (1980) és 32, 146-149 (1982) irodalmi helyeken ismertetett törzsekkel. Azon jellemzők, alapján, hogy a mikroorganizmus Gram-negatív, rövid pálcika vagy gömbalakú, nem mozgékony, aerób, a cukrokból savat és gázt nem termel, oxidázokkal végzett vizsgálata negatív, a kataiázokkal végzett vizsgálat pozitív, DNS-ben a guanin + citozin tartalom 40,0 ± 1,5 megállapítottuk, hogy az YK-504 törzs az Acinetobacter nemzetségbe tartozik és Acinetobacter sp. YK-504 jelzéssel jelöljük.
Az Acinetobacter sp. YK-504 törzset az 1FO törzsgyűjteménybe 1985. január 31-én letétbe helyeztük, 1FO 14420 számon és az FRI törzsgyűjteménybe 1985. február 12-én FERM BP-709 számon.
A találmány szerint alkalmazható Empedobacter vagy Lysobacter mikroorganizmus könnyen változhat vagy módosulhat és hajlamos a mutációra, mesterséges mutációs eszközöket alkalmazó módszereket, mint például ultraibolya besugárzást, röntgenbesugárzást és kémiai szereket, úgymint nitrozó-guanidint, etil-metán-szuifonsavat, stb. alkalmazva. A találmány szerinti eljárásban alkalmazhatók azok a mutánsok, amelyek a TAN-588 és/vagy N--dezacetilezett származékának termelésére képesek.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazható Acinetobacter sp. YK-504 mikroorganizmus általában könnyen változhat vagy módosulhat és hajlamos a mutációra, mesterséges mutációs eszközöket alkalmazó módszerek, mint például ultraibolya-besugárzás, röntgenbesugárzás és különböző kémiai szerek, úgymint nitrozó-guanidin, etil-metán-szulfonsav, stb. hatására. A találmány szerinti eljárásban alkalmazhatók azok a mutánsok, amelyek a TAN-588 antibiotikum és/vagy N-dezacetilezett származékát előállító törzset nagymennyiségű N-dezacetilezett TAN-588 előállítására képesek késztetni a találmány szerinti kevert tenyészetben.
A TAN-588 és/vagy N-dezacetilezett származékának termelésére alkalmas mikroorganizmus tenyésztésénél szénforrásként olyan anyagokat használhatunk, amelyeket a mikroorganizmus asszimilálni képes. így például használhatunk glükózt, fruktózt, maltózt, oldható keményítőt, dextrint, olajokat és zsírokat, úgymint szójaolajat, olívaolajat, stb. és szerves savakat, úgymint citromsavat, glükonsavat és borostyánkősavat. Hasznosítható nitrogénforrásként alkalmazhatunk szerves nitrogénvegyületeket, mint például szója-hsztet, gyapot-mag-lisztet, kukoricasikér-lisztet, száraz élesztőt, élesztő kivonatot, liszt kivonatot, peptont és karbamidot. Szervetlen sóként használhatunk önmagukban vagy megfelelő kombinációban, a mikroorganizmusok tenyésztésénél általában használatos szervetlen sókat, mint például nátrium-kloridot, kálium-kloridot, kálcium-karbonátot, magnéziumszulfátot, kálium-foszfátot és dinátrium-foszfátot.
A táptalaj tartalmazhat még a fentieken kívül nehézfém-sókat, mint például vas(II)szulfátot: vitaminokat, például Bj vitamint és bio tint. A táptalajhoz szükség szerint adhatunk habzásgátlókat és felületaktív anyagokat is, mint például szilikonolajat vagy polialkilén-glikol étereket. A táptalajba adagolhatunk továbbá olyan szerves és szervetlen anyagokat, amelyek a mikroorganizmus szaporodását és a TAN588 és/vagy N-dezacetilezett származékának termelését elősegítik.
A tenyésztést az antibiotikumok termelésénél általában használatos módszerekkel végezhetjük. A tenyésztéshez akár szilárd, akár folyékony táptalajt használhatunk. Folyékony táptalaj használata esetén stacioner, rázott, merített, aerób stb. tenyészeteket alkalmazhatunk, de legelőnyösebb az aerób merített tenyészet alkalmazása.
Az inkubálás hőmérséklete előnyösen 15-32°C és a tápközeg pH értéke 5-8 között van. A tenyésztést 8—16 óra — előnyösen 24—144 óra időtartam alatt végezzük.
A kevert tenyésztést a TAN-588 és/vagy N-dezacetilezett származékát termelő, az Empedobacter vagy Lysobacter mikroorganizmus tenyésztéséhez hasonló körülmények között végezzük.
Az N-dezacetilezett TAN-588 antibiotikum detektálását vékonyréteg kromatográfia bioautográfiás módszerrel végezzük (TCL-bioautography method) Pseudomonas aeruginosa C-141-et alkalmazva.
A találmány szerinti eljárásban Alkalmazott kevert tenyészet, amelyben egy Acinetobacter mikroorga-51
194 310 nizmus is van, nagyobb mennyiségben eredményezi az N-dezacetilezett ΤΑΝ-588-at, mint a csak Ernpedobacter vagy Lysobacter mikroorganizmus tenyészet.
A TAN-588 antibiotikum alkálifém- alkálföldfém-, vagy ammóniumsóját és/vagy N-dezacetilezett származékát a tenyészetből jól ismert módszerekkel nyerhetjük ki. Mivel a TAN-588 és/vagy N-dezacetilezett származéka vizoldható és ezért főtömegben a fermentlé szürletében van, célszerűen úgy járunk el, hogy a folyékony tenyészethez először egy szűrést elősegítő anyagot adunk, ami elősegíti a szűrésnél vagy a centrifugálásnál a mikrosejtek eltávolítását, ntajd ezután a szürletet egy, az aktív anyagot adszorbeálni képes hordozóval érintkeztetjük, amiről azután az aktív anyagot egy megfelelő oldószer segítségével eltávolítjuk. Hordozóként használhatunk olyan anyagokat, amelyek a vegyületeket különböző mértékben adszorbeálják, mint például aktívszenet, szilikagélt, kristályos cellulózt, vagy amelyek a vegyületek funkciós csoportjait különböző mértékben kötik meg, mint például anioncserélő műgyantákat, és anioncserélő cellulózt, vagy olyan anyagokat, amelyek a molekulaméret szerinti elkülönítést teszik lehetővé, mint például gélszűrésnél alkalmazott közeget. Eluálószerként használhatjuk például vízzel elegyedő oldószerek vizes oldatait, mint például vizes aceton vagy alkoholok vizes oldatát, vagy lúgokat, puffereket, szervetlen vagy szerves sókat tartalmazó vizes oldatokat, vagy ezek megfelelő kombinációit.
A fenti módszerek valamelyikével kinyert nyers antibiotikumot nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel tisztíthatjuk tovább. Egy másik megoldás szerint az aktívszénről eluált sótalanított oldatot koncentráljuk és a koncentrátumból ionpár extrakciós módszerre], mint például kvaterner alkilammóníum-halogenidet tartalmazó szerves oldószert alkalmazva, nyerjük ki az antibiotikumot.
Előnyösen járunk el például, ha a savas tulajdonsa'gú ΤΑΝ-588-at egy anioncserélő gyantával, mint például Dowex-1 gyantával (gyártó cég: Dow Chemical Co., USA), Amberlíte IRA-68,400,402 és 410 gyantával (gyártócég: Rhom and Haas, USA) vagy Diaion SA-21 és C gyantával (gyártó cég: Mitsubishi Czenrical Industries, Japán) a szürletből adszorbeáljuk és onnan például sókat, savakat vagy puffereket tartalmazó vizes oldatokkal eluáljuk. Ugyanígy az antibiotikumot adszorbeáltathatjuk például egy anioncserélő cellulózon, mint például DE-32 (gyártó cég: Whatman Co., Nagy-Britannia) vagy DEAECellulose-on (gyártó cég: Braun Co., nszk), vagy egy anioncserélő molekulaszitán, mint például DEAE vagy OAE-Sepbadex (gyártó cég: Pharmacia, Svédország), és onnan sókat, savakat vagy puffereket tartalmazó vizes oldatokkal eluáljuk. Az eluátumokból a sók és a színezőanyagok eltávolítását kromatográfis célokra készült aktívszénnel, mint például a Takeda Chemical Industries, Ltd., Japán által forgalomba hozott aktívszén, vagy adszorpciós gyanták, mint például Diaion HP-20 vagy SP-207 gyanta (gyártó cég: Mitsubishi Chemical Industries, Jaoán) vagy Amberlit XAD-II gyanta (gyártó cég: Rohm and Haas Co., USA) alkalmazásával végezhetjük.
Az eluált frakciót különböző, egymást követő műveletekkel, mint például koncentrálás, liofilizálás, stb. porrá alakítjuk. A kapott port szükség szerint tovább tisztíthatjuk, előnyösen preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás módszenei. Ehhez a tisztítási művelethez különböző hordozóanyagokat, mint például TSK. Gél (gyártó cég: Toyo Soda Kfg. Co., Japán) vagy YMC Gél (gyártó cég: Yamamura Chemical Laboratories, Japán) használhatunk. Mozgófázisként metanol, acetonitril, stb. és vizes savas oldatok vagy pufferek elegyeit használhatjuk. Az ionpár extrakciós módszernél kvaterner alkil-ammónium-halogenidként használhatunk például tri-n-oktil-metil-ammónium-kloridot, tetra-n-pentil-ammónium-kloridot vagy n-tetradecil-dimetil-benzil-ammónium-kloridot, míg szerves oldószerként a szokásosan alkalmazott oldószereket mint például, metilén-kloridot, kloroformot vagy diklór-etánt használhatunk.
Az amfoter tulajdonságú N-dezacetilezett TAN588 a szürletből kationcserélő gyantával, mint például Dowex 50W gyantával (gyártó cég: Dow Chemical Co., USA) és Amberlíte IR-120B gyantával (gyártó cég. Rohm and Haas, USA) adszorbeáltatható, és onnan sókat, savakat vagy lúgokat tartalmazó vizes oldatokkal vagy pufferekkel eluálható.
A találmány szerinti eljárással előállított antibiotikumot kationcserélő molekula szitákkal is adszorbeálhatjuk. Ilyen például a CM-Sephadex (gyártó cég: Pharmacia, Svédország) márkanemű molekulaszita. Az adszorbeáit antibiotikumot a molekulaszitáról sótartalmú vizes oldatokkal vagy pufferekkel eluálhatjuk.
Az eluátumokból a sók, színezőanyagok eltávolítását kromatográfiás célokra készült aktívszénnel, mint például Diaion SP-207 vagy HP-20 márkanevű aktívszénnel végezhetjük.
Az összegyűjtött eluátumokat koncentráljuk, majd liofizáljuk. A kapott poralakú terméket szükség szerint tovább tisztíthatjuk, előnyösen preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel. A folyadékkromatográfiás tisztításnál hordozóanyagként és mozgófázisként a TAN-588 antibiotikum tisztításnál fent ismertetett anyagokat használhatjuk.
A tisztítás olyamán a TAN-588 az alkalmazott sókból vagy pufferekből a kationokkal, mint például kálium-, nátrium-, lítium-, kalcium- vagy ammóniumionokkal a megfelelő sóvá alakul, és aktívszénen kromatografálva só formában nyerhető ki. Ha az eluátum pH-ját 5-2, előnyösen 4,5-3 közé állítjuk be, akkor az aktívszénen történő kromatografálás után a ΤΑΝ-588-t szabad sav formában nyerjük ki.
Az N-dezacetilezett ΤΑΝ-588-t amfoter formában kapjuk meg az aktívszenes kromatografálás után semleges eluálószert használva. Mivel az N-dezacetilezett TAN-588 amfoter sajátossága mellett bázikus tulajdonságú, erős savakkal sót képez. Ilyen savak például a sósav, foszforsav és trifluor-ecetsav.
Az ily módon kapott TAN-588 alkálifém-, alkáliföldém- vagy ammóniumsója a fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatografálás során két csúcsot mutat. Ezeket a csúcsokat A és B jelöléssel láttuk el és magyarázatukat a következőkben adjuk meg. A folyadékkromatografálás során kapott A és B csúcsoknak megfelelő frakciókat külön-külön kigyűjtve a TAN-588 A típust és TAN-588 B típust tiszta egyedüli formában kapjuk meg. Ha ezeket a frakciókat 3, 5 és 7 pH-jú pufferekben, szobahőmérsékleten állni hagyjuk, azt tapasztaljuk, hogy körülbelül másfél óra múlva a pH értéktől függetlenül az A és B frakciók egymásba alakulnak és így az A és B egyen-61
194 310 (dlyi keveréke alakul ki, amelyben A : B közel 1:1. A jelenleg ismeretes elválasztási technikákkal a TAN-588 A és B típusa nem választható szét.
Megjegyezzük azonban, hogy a TAN-588 alkálifém-, alkáíiföldfém- vagy ammóniumsóját p-nitro-benzil-észter vagy benzhidril-származékká alakítva az A és B típus elválasztása lehetővé válik.
Az 1. példában ismertetett eljárással előállított TAN-58S antibiotikum nátriumsóiának (A és B típus egyensúlyi keveréke) fiziko-kémiai tulajdonságai a következők:
1) Külső forma: fehér por,
2) Fajlagos forgatás: [α] θ -19,0° b± 10* (c = 0,5 vízben)
3) Elem-analízis: (a mintát előzetesen 40°C hőmérsékleten 6 órán át foszfor-pentoxid felett szárítottuk) talált: számított:*
C% 38,5 ±2,0 C% 39,61
H% 4,5 ±1,0 H% 3,99
N% 9,1 ± 1,5 N% 9,24
0% 39,58
Na%6,9±l,5 Na% 7,58 * ~ a számított értéknél 0,5 mól kötött vizet is számításba vettünk.
4) Kötött víztartalom (termogravimetiás módszerre] meghatározva): 3,0 ± 1,5%.
5) SIMS módszer szerint meghatározott molekuláris ion csúcs:
m/e 611 (2M * Na)+, 317 (M ♦ Na)+, 295 (Μ * H)*
6) összegképlet: Cj 0Hi iN207Na
7) Ultraibolya sugárzás abszorpció (UV spektrum, vízben):
I. ábra
Xmax216nm(E;^ 130)
8) Infravörös spektrum (felvétel KBr-ban)
IR spektrum (2. ábra) alapján a jellemző abszorpciós maximumok a következők:
3450, 1780, 1730, 1660, 1550, 1385, 1320, 1290, 1260, 1200, 1120, 1040, 980, 810, 770, 690, 600, 540 cm’1
9) MNR-spektrum (100 MHz, D2 O-ban) jellemző csúcsok:
182,02(s), 177,30(s),-173,79(s), 173,30(s), 173,25(s), 172,58(s), 96,97(s), 96,92(s),
74,27», 72,68(1), 55,75(d), 55.34(d),
3l,92(t), 31,08(t), 30,98(t), 24,58(q), ppm (ahol s = szingulett d = duplett, t = triplett és q « kvartett)
10) Dikroizmus (CD) spektrum (vízben): negatív Cotton effektus 232 ± 3 nm-nél
11) Oldhatóság:
oldódik vízben, dimetil-szulfoxidban, enyhén oldódik etil-acetátban, kloroformban, dietil-éterben
12) Színreakció:
pozitív: Ninhidrín reakció negatív: Greig-Leaback reakció, SakaguchJ reakEhrlich reakció, Barton reakció, Dragendorff s reakció,
13) Aminosav-analízis n sósav-oldattal, 105°C hőmérsékleten, 20 órán át hidrolizálva szerint mutatható ki:
14) Stabilitás: vizes oldatban pH 5 érték mellett - stabil, pH 3 és 7 érték mellett — enyhén stabil, pH 9 érték mellett — nem stabil,
15) Vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat réteg: Cellulose f (gyártó cég: Tokyo Koséi Co.,
Japán)
Oldószer-rendszer Rf érték
Acetonitril: víz (4 :1) 0,33
Butanol: ecetsav : víz ( 1 :1 :1) 0,77
Acetonitril: 3% ammónium-szulfát (4:1) 0,28
16) Savas, neutrális, bázikus jelleg: neutrális,
17)Nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat: töltet: YMC A 312 (gyártó cég: Yamamura Chemical Laboratories, Japán) mozgófázis: 4% metanol/0,01 M foszfát-puffer (pH 6,3), 2 ml/perc, Rt = 4,3 és 4,8 perc.
A fiziko-kémiai tulajdonságok és az eljárási reakció alapján megállapítottuk, hogy a TAN-588 molekulájában egy karboxilcsoport és egy nitrogénatomhoz kapcsolódó acetilcsoport van.
Az I. táblázatban összefoglaljuk a TAN-588 nátriumsójának antibaktenális hatását különböző mikroorganizmusok ellen.
Táptalaj összetétele:
17,5 g Bacto Antibiotic Médium 3 (gyártó cég: Difko Laboratories, USA)
5,0 g Bacto Yeast extract (élesztőkivonat) (gyártó cég: Difko Laboratories, USA)
2,0 g Bacto Agár (gyártó cég: Difko Laboratories, USA)
1000 ml desztillált víz (pH beállítás nélkül). Baktérium oltóanyagként miként 10* telepképző egységet tartalmazó oldatot használunk.
7. táblázat
Mikroorganizmus Minimális inhibitor koncentráció üg/ml
Staphylococcus aureus FDA 209 P 3,13
Micrococcus luteus IFO 12708 0,39
Bacillus subtilis NIHJ PCI 219 3,13
Bacillus cereus FDA 5 12,5
Salmonella typhimurim IFO 12529 50,0
Éscherichia coli NIHJ JC 2 50,0
Citrobacter freundii IFO 12581 100
Klebsiella pneumoniae IFO 3317 100
Serratia marcescens IFO 12648 50
Proteus mirabilis ATCC 21100 25
Proteus vulgáris IFO 3988 25
Proteus morganii IFO 3168 100
Pseudomonas aeruginosa IFO 3080 > 100
Alcaligenes faecalis IFO 13111 50
Acinetobacter calcoaceticus IFO 13006 25
A TAN-588 nátriumsójának terápiás hatását fertőzött egereken végzett vizsgálatokkal állapítjuk meg. A vizsgálatok eredményeit a 2. táblázatban adjuk meg.
2. táblázat
Fertőző mikroorganizmus Beadagolás EDS 0 mg/kg módja
Staphylococcus aureus
308A-I szubkután 25,0
A TAN-588 nátriumsóját 400 mg/kg dózisban szubkután beadagolva sincs toxikus hatás.
A következőkben az N-dezacetilezett TAN-588
194 310 antibiotikum (A és B típusú vegyületek keveréke) biológiai jellemzőit adjuk meg. Megjegyezzük, hogy az A és B típusú vegyületek keverékére kapott biológiai jellemzők az A és B típusú vegyületekrc különkiilön is mérvadók.
A 3. táblázatban összefoglaljuk az N-dezatilezett TAN-588 antibakteriális hatását különböző mikroorganizmusok ellen.
Táptalaj összetétele:
17,5 g Baeto Antibiotie Médium 3 (gyártó cég: Difko Laboratories, USA)
50,0 g Baeto Yeast extract (élesztökivonat) (gyártó cég: Difko Laboratories, USA)
20,0 g Baeto Agár (gyártó cég: Difko Laboratories, USA)
1000 níl desztillált víz (pH beállítás nélkül). Baktérium oltóanyagként ml-ként 10b telepképző egységet tartalmazó oldatot használunk.
3. táblázat
| Mikrooragnizmus Minimális inhibitor koncentráció | |
| fíg/ml | |
| Staphylococcus aureus FDA 209P | 50 |
| Micrococcus luteus IFO 12708 | 6,25 |
| Bacillus subtilis N1HJ PCI 219 | 12,5 |
| Bacillus cereus FDA 5 | 50 |
| Escherichia coli NIHJ JC2 | 25 |
| Salmonella typhymurium IFO 12529 | 50 |
| Citrobacter freundii IFO 12681 | 50 |
| Klebsiella pneumoniae IFO 3317 | 100 |
| Serratia marcescens IFO 12648 | 25 |
| Proteus mirabilis ATCC 21100 | 100 |
| Proteus vulgáris IFO 3988 | 100 |
| Proteus morganii IFO 3168 | > 100 |
| Pseudomonas aeruginosa IFO 3080 | 50 |
| Alcaligenes faecalis IFO 13111 | 100 |
| Acinetobacter calcoaceticus IFO 13006 | 50 |
Az N-dezaeetilezett TAN-55 stabilitását különböző β-laktamázokkal szemben vizsgáltuk. A vizsgálatokban Escherichia coli PG 8 mikroorganizmust alkalmaztunk. Az eredményeket a 4. táblázatban foglaljuk össze. A táptalaj 20 mg/1 diamino-pimelinsavat tartalmazó szilárd táptalaj (pH 7).
Hatóanyagkoncentráció:
N-de/AtxllteueU. TAN-588 l000gg/ml egyéb hatóanyagok 100Mg/ml.
A táblázatban használatos jelölések:
PCG: benzil-penicillin
CPC: cefalosporin C
CMC: ceamicin C
Xj: Bacillus cereus (gyártó cég: Calbio Chemical
Co.,USA) x2: Enterobacter closcae x3: Nincs inhibiciós zóna.
A táblázatban lévő értékek a kapott inhibiciós zó-
| nák átmérői. | 4. táblázat | |||
| 0-laktamáz | dezaceti- lezett TAN-588 | PCG | CPC | CMC |
| _ | 22,5 | 22 | 33 | 34 |
| Penlcillináz x, Cefalo s. pori- | 24,5 | ~>3 | 32 | 34 |
| názx] 8 | 21,5 |
A találmány szerinti eljárással előállított alkálifém-, alkáliföldfém- vagy ammóniumsót és a dezacetilezett TAN-588 — a továbbiakban (I) vegyületek — antibakteriális hatást fejtenek ki a Gram-pozitív és Gram negatív mikroorganizmusokra.
Ezen hatásuk következtében bakteriálisán fertőzött emlősök [mint például patkányok, egerek, kutyák, macskák, háziállatok (lovak, stb.) emberek], baromfi, stb. kezelésére használhatók.
A találmány szerinti eljárással előállított (I) vegyületek gyógyszerészetileg elfogadható hordozó-, vivő-, hígítóanyagokkal gyógyszerészeti készítményekké alakíthatók. A gyógyszerészeti készítményeket különböző formákban készíthetjük el, így például szájon át történő adagoláshoz tabletta, kapszula, stb.: parenterális adagoláshoz injekciós oldatok formájában. Injekciós oldatok készítéséhez, például izotóniás sóoldatot használhatunk. Kapszulák p készítéséhez például laktózt használhatunk.
A hatóanyag /(I) vegyületek/ dózisa — szájon át történő adagolásnál - 5-50 mg/kg/nap, előnyösen 10-20 mg/kg/nap, és parenterális adagolásnál 2,525 mg/kg/nap, előnyösen 5-20 mg/kg/nap.
A találmány szerinti eljárással előállított (I) vegyületek külsőleg alkalmazható antibakteriális és fertőtlenítő szerekként is használhatók - oldat vagy kenőcs formájában.
Oldatkészítésnél az (I) vegyületeket 0,1 vegyes %-ban desztillált vízben oldjuk fel. Kenőcskészítésnél fehér vazelinnel vagy lanolinnal keverjük össze az (I) vegyületeket. A kenőcsökben a hatóanyagkoncentráció 0,2—20 mg/lg kenőcs, előnyösen 1-10 mg/1 g kenőcs.
A találmány szerinti eljárással előállított (1) vegyületek fontos intermedierek új gyógyszerek szintézisében.
A találmány szerinti eljárással előállított vegyületekre jellemző spektrumok a következők:
1. ábra — TAN-588 nátriumsójának (A és B típusú vegyület egyensúlyi keverékének) UVspektruma,
2. ábra — TAN-588 nátriumsójának (A és B típusú vegyület egyensúlyi keveréke) infravörös spektruma,
3. ábra - N-dezacetilezett TAN-588 (A és B típusú vegyület keveréke) infravörös spektruma.
A találmányt a következő példákon és referenciapéldákon keresztül mutatjuk be.
1. példa
Empedobacter lactamgenus YK-258 (IFO 14322,
FERM BP-699) szilárd táptalajon tenyésztett törzset 2 1 térfogatú Sakaguchi edényben lévő 500 ml táptalajra oltunk be. A táptalaj egy vizes oldat (pH 7,0), és összetétele a következő: 2 v% glükóz, 3 v% oldható keményítő, 1 v% nyers szójaliszt, 0,5 v%Polypepton (gyártó cég: Dalgo Nutritive Chemicals, Japán) és 03 v% nátrium-klorid kiegészítve 0,5 precipitált kálcium-karbonáttal. Az edényeket 24ÖC hőmérsékleten, 48 órán át rázatva inkubáljuk. Az ilymódon kapott folyékony tenyészetet ezután egy 501 térfogatú fermentor tartályban lévő 301 táptalajba oltjuk át.
A táptalaj összetétele a fentivel megegyező, 0,05 v%
Actcol (gyártó cég: Takeda Chemical Industries Ltd., Japán) márkanevű habzásgátlóval kiegészítve.
Az inku bálás folyamán a tenyészetet 24°C hőmér· sékleten tartjuk, 50 1/perc levegőárammal levegőztetjük és 200 fordulat/perc sebességű keverővei kevertetjük 48 órán át. A kapott tenyészetből 6 1-t egy 200 1 térfogatú fermentor tartályban lévő 120 1 táptalajba oltjuk át. A táptalaj egy vizes oldat (pH 6,5), és összetétele a következő: 3 v% dextrin, 1,5 v% nyers szójaliszt, 1,5 v% kukoricasikér-liszt, 0,2 v% Polypepton és 0,1 v% nátrium-tioszulfát, kiegészítve 0,05 v% Actcol habzásié tlóval. Az inkubálás folyamán a tenyészetet 17 cl hőmérsékleten tartjuk, 200 1/perc levegőárammal levegőztetjük és 150 fordulat/perc sebességű keverővei kevertetjük 66 órán át. Kétszer megismételve a fenti tenyésztési eljárást, a kapott 230 1 folyékony tenyészet pH-ját 8-ra állítjuk be, majd leszűrjük. A szűréshez 9 kg Hyflo Super Cél (gyártó cég: Johns Manville Co., USA) szűrőközeget használunk. A 200 1 szürlet IRA-402 (Cl típus) (gyártó cég: Rohm and Haas Co., USA) hordozóval töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopról az antibiotikumot 2 v% vizes nátrium-klorid oldattal eluáljuk. Az 53 1 eluátum pH-ját 6-ra állítjuk be, és 5 1 aktívszénnel (gyártó cég: Takeda Chemical Industries Ltd., Japán) töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopról az antibiotikumot 8 v% izo-butanollal eluáljuk. A 14 1 cluátumot vákuum alkalmazásával 5 1 térfogatra koncentráljuk. A koncentrátum pH-ját 6-ra állítjuk be és kétszer
2,5 1 2 v% tri-n-oktil-metil-ammónium-kloridmetilén-klorid oldattal extraháljuk. Az extraktumot
2,5 1, 1,6 v% vizes nátrium-jodiddal kezeljük. A vizes fázist betöményítjük és 500 ml aktívszénncl töltött oszlopon kromatografáljuk. Eluálószcrkcnt 8 v% izobutanolt használunk.
Az cluátumot betöményítjük, majd liofilizáljuk. 1,41 g porformájú anyagot kapunk, amit 100 ml vízben feloldunk, majd az oldatot 200 ml OAE-Sephadex A-25 (Cl típusú) (gyártó cég: Pharmacia Co., Svédország) hordozóval töltött oszlopon kromatografáljuk. Az cluáláshoz 0,03 mólos vizes nátrium-klorid oldatot használunk.
A frakciókat összegyűjtük. 600 ml eluátum pH-ját 5,1-re állítjuk be és sótalanítjuk aktívszénne] töltött oszlopon. Az eluátumot bepároljuk és liofilizáljuk. 384 mg port kapunk, amit vízben feloldunk. Az oldatot preparatív folyadékkromatográfiás módszerrel tisztítjuk tovább. A kromatografálást YMC-Pack SH-343 folyadékkromatográffal (gyártó cég: Yamainura Chemical Laboratories, Japán) végezzük. Eluálásra 0,01 mólos foszfát-puffért (pH 63) használunk. Az antibiotikumot tartalmazó cluátumokat összegyűjtjük, aktívszénnel töltött oszlopon sótalanítjuk. Az eluátumok bepárlása, majd liofilizálása után 141 mg TAN-588 antibiotikum nátriumsóját kapjuk, fehér por formájában.
2. példa
Empedobacter lactamgenus YK-258 (IFO 14322, FERM BP-699) szilárd táptalajon tenyésztett törzset 2 1 térfogatú Sakaguchl edényekben lévő 500 ml táptalajra oltunk be. A táptalaj egy vizes oldat (pH 7,0) és összetétele a következő: 2 v% glükóz, 3 v% oldható keményítő, 1 v% nyers szójaliszt. 0,5 v% Polypepton és 03 v% nátrium-klorid kiegészítve 0,5 v% precipltált kálcium-karbonáttal. Az edényeket 24eC hőmérsékleten 48 órán át rázatva inkubáljuk. Az ilymódon kapott folyékony tenyészetet ezután egy 200 1 térfogatú fermentor-tartáíyban lévő 120 táptalajba oltjuk át. A táptalaj összetétele a fentivel megegyező, 0,05 v% Actcol márkanevű habzásgátíóval kiegészítve. Az inkubálás folyamán a tenyészetet 24°C hőmérsékleten tarjtuk, 2001/perc levegőárammal levegőztetjük és 150 fordulat/perc sebességű keverővei kevertetjük 48 órán át. A kapott 60 1 tenyészetet egy 2000 1 térfogatú fermentor-tartályban lévő 1200 1 táptalajba oltjuk át. A táptalaj egy vizes oldat (pH 6,5) és összetétele a következő: 3 v% dextrin, 1,5 v% nyers szójaliszt, 1,5 v% kukoricasikér-liszt, 0,2 v% Polypepton és 0,1 v% nátrium-tioszulfát, kiegészítve 0,05 v% Actcol habzásgátlóval. Az inkubálás folyamán a tenyészetet 17°C hőmérsékleten tartjuk, 2000 1/perc levegőárammal levegőztetjük és 120 fordulat/perc sebességű keverővei kevertetjük 90 órán át. A kapott folyékony tenyészetet Hyflo Super Cél. szűrőközeget használva leszűrjük. Az 1150 1 szürletet 40 1 Amberlite IRA402 (Cl típus) hordozóval töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopról az antibiotikumot 200 1 v% vizes nátrium-klorid oldattal eluáljuk és az eluátumot 20 1 aktívszénnel töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopról az antibiotikumot 81 1 8 v% izo-butanollal eluáljuk, majd 10 1 Amberlite IRA-68 (Cl típus) hordozóval töltött oszlopon kromatografáljuk. Az cluálást 1 v% vizes nátrium-klorid-oldattal végezzük. A kapott 54 1 cluátumot 10 1 aktívszénncl töltött oszlopon ismét kromatografáljuk. Az antibiotikum cluálásához 8 v% vizes izo-butanol-oldatot használunk. A 80 1 eluátumot vákuum alkalmazásával 5 1 térfogatra koncentráljuk. A koncentrátum pll-ját, 4,5-re állítjuk be és kétszer
2.5 1 2 v% tri-n-oktil-mctil-ammónium-klorid-metílén-klorid oldattal extraháljuk. Az extraktumot
1.6 v% vizes nátrium-jodiddal kezeljük. A vizes fázist
1,5 1 térfogatra tömenyítjük be és 0,5 1 aktívszénnel töltött oszlopon kromatografáljuk. Az eluátumot betöményítjük, majd a konccntrátumöt 200 nú OAE-Scpbadcx (Cl típus) hordozóval töltött oszlopon kromatografáljuk. Az cluáláshoz 0,03 mólos vizes nátrium-klorid-oldatot használunk, 1,3 1 frakciót összegyűjtünk és sótalanítjuk 500 ml aktívszénnel töltött oszlopon. Az eluátumot bepároljuk és liofilizáljuk. 3,56 g ΤΑΝ-588-at kapunk fehér por formájában. Az extrahálásnál kapott 5 1 vizes fázist — ami az antibiotikum 50%-át tartalmazza - OAE-Sephadex (Cl típus) hordozóval töltött oszlopon kromatografáljuk. Az eluálást 0,03 és 0,05 mólos vizes nátrium-klorid oldattal végezzük, majd az eluátumot 2 1 aktívszénnel töltött oszlopon kromatografáljuk. Az eltávozó 2 1 nátrium-klorid oldatot ismét kétszer 1 1 2 v% tri-n-oktfl-metil-ammónium-kloríd-mcíílén-klorid oldattal extraháljuk. Az extraktumot vizes nátrium-jodid-oldattal kezeljük, majd aktívszénnel töltött oszlopon sótalanítjuk. 3,18 g TAN-588 antibiotikum nátriumsóját kapjuk fehér por alakjában. A kapott anyag IR- és NMR — spektruma azonos az
1. példában előállított termék spektrumaival.
3. példa
Lysobacter albus sp. nov. YK422 (IFO 14384, FERM BP-698) szilárd táptalajon tenyésztett törzset 2 1 térfogatú Sakaguchl edényekben lévő 500 ml táptalajra oltunk be. A táptalaj egy vizes oldat (pH beállítás nélkül) és összetétele a következő: 2 v% glükóz, 2 v% oldható keményítő, 1 v% nyers szójaliszt, 0,5 v% Polypepton. Az edényeket 24°C hőmérsékle-91
194 310 ten, 48 órán át rázatva inkubáljuk. Az flymódon kapott folyékony tenyészetei ezután egy 200 1 térfogatú fermentor tartályban lévő 120 1 táptalajba oltjuk át. A táptalaj összetétele a fentivel megegyező, 0,05 v% Aclcol márkanevű habzásgátlóval kiegészítve. Az Inkubálás folyamán a tenyészetet 28°C hőmérsékleten tartjuk., 120 1/perc levegőárammal levegőztetjük és 180 fordulat/perc sebességű keverővei kevertetjük 48 órán át. A kapott 120 1 tenyészetet egy 6000 1 térfogatú fermentor-tartályban lévő 4000 1 táptalajba oltjuk át. A táptalaj egy vizes oldat (pH beállítás nélkül) és összetétele a következő: 3 v% dextrin, 3,0 9ív nyers szójaliszt, 0,2 v%Polypepton, kiegészítve 0,05 v% Actcol habzásgátlóval. Az inkubálás folyamán a tenyészetet 22 C hőmérsékleten tartjuk, 4000 1/perc levegőárammal levegőztetjük és 120 fordulat/pcrc sebességű keverővei kevertetjük 66 órán át. A kapott folyékony tenyészetet Hylfo Supei Cél. szú'rőközeget használva leszűrjük. A 4360 1 szürletet 400 1 Amberllte 1RA-402 (Cl típus) hordozóval töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopról az antibiotikumot 2000 1 2 v% vizes nátriuni-klorid oldattal eluáljuk és az eluátumot 160 1 aktívszénnel töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopról az antibiotikumot 640 1 8 v% izo-butanollal eluáljuk, majd 40 1 Amberllte 1RA-68 (Cl típus) hordozóval töltött oszlopon kromatografáljuk. Az eluálást 1 v% vizes nátrlum-klorid-oldattal végezzük. A kapott 200 eluátumot 80 1 aktívszénnel töltött oszlopon ismét kromatografáljuk. Az antibiotikumot eluáláshoz 8 v% vizes izo-butanol-oldatot használunk.
A 400 1 eluátumot vákuum alkalmazásával bepároljuk, majd liolilizáljuk. A liofilizált terméket acetonnal kezeljük. 620 g TAN-588 nátriumsót kapunk, csapadék formájában. Nagynyomású folyadékkromatográfiás analízis alapján megállapítottuk, hogy a poralakú termék 57%-a TAN-588 nátriumsó. 5 g port feloldunk vízben, majd a kapott oldatot 200 ml OAE-Sephadex (Cl típus) hordozóval töltött oszlopon kromatografáljuk. Az eluáláshoz 0,03 mólos vizes nátrium-kloríd-oldatot használunk. 1,2 1 összegyűjtött aktív anyagot tartalmazó frakciót 500 1 aktívszénnel töltött oszlopon sótalanítunk. Az eluátumot koncentráljuk, majd liofilízáljuk. 2,5 g TAN-588 Na-sót kapunk, fehér por formájában.
A kapott termék vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatában kapott Rf érték, valamint a nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálatban és IR-, UV-, CD- és NMR-spektrumában kapott Rt érték alapján megállapítható, hogy a tennék az 1. példa szerinti eljárással előállított TAN-588-nátriumsóval megegyező,
4. példa
Empedobacter lactamgenus YK-258 (IFO 14322, FERM BP-699) szilárd táptalajon tenyésztett törzset,
1 térfogatú Sakaguchi edényben lévő 500 ml táptalajra oltunk be. A táptalaj egy vizes oldat (pH 7,0) és összetétele a következő: 2 v% glükóz, 3 v% oldható keményítő, 1 v% nyers szójaliszt, 0,5 v% Polypepton és 0,3 nátriuin-klorid kiegészítve 0,5 v% precipitált kálcíum-karbonáttal. Az edényeket 24eC hőmérsékleten 48 órán át rázatva inkubáljuk. Az flymódon kapott folyékony tenyészetet ezután egy 50 1 térfogatú fermentor tartályban lévő 30 1 táptalajra nlljuk rá. A táptalaj összetétele a fentivel megegyező. 0,05 v% Actcol márkanevű habzásgátlóval kiegészítve. Az inkubálás folyamán a tenyészetet 24°C hőmérsékleten tartjuk, 50 1/perc levegőárammal levegőztetjük és 200 fordulat/perc sebességű keverővei 48 át kevertetjük. A kapott 6 1 tenyészetet egy 200 1 térfogatú fermentor-tartályban lévő 120 1 táptalajba oltjuk át. A táptalaj egy vizes oldat (pH 6,5) és összetétele a következő:
v% dextrin, 1,5 v% nyers szójaliszt, 1,5 v% kukoricasikér-liszt, 0,2 v% Polypepton és 0,1 v% nátriumtioszulfát, kiegészítve 0,05 v% Actcol habzásgátlóval. Az inkubálás folyamán a tenyészetet 17°C hőmérsékleten tartjuk, 200 1/perc levegőárammal levegőztetjük és 150 fordulat/perc sebességű keverővei 24 órán át kevertetjük.
A kapott tenyészetet Pseudomonas aeruglnosa C-141 alkalmazásával vékonyréteg-kromatográfiás bioautográfiás módszerrel vizsgálva megállapítottuk, hogy az N-dezacetilezett TAN-588 antibiotikum (A és B típus keveréke). Nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat: készülék: 6000/A/660/440 (gyártó cég: Waters Assoc. USA), oszlop: YMS-Pack A 312 (gyártó cég: Yamamura Chein. Láb., Japán), mozgó fázis: 0,01 m foszfát-puffer pH 6,3) Rt = 3,1 és 3,3 perc.
5. példa
Lysobacter albus sp. nov. YK-422 (IFO 14384 FERM BP-698) szilárd táptalajon tenyésztett törzset. 2 1 térfogatú Sakaguchi edényben lévő 500 ml táptalajra oltunk be. A táptalaj egy vizes oldat (pH 7,0) és összetétele a következő: 2 v% glükóz, 3 v% oldható keményítő, 1 v% nyers szójaliszt, 0,5 v% Polypepton és 0,3 v% nátrium-klorid, kiegészítve 0,5 v% precipitált kálcium-karbonáttal. Az edényeket 24 C hőmérsékleten 48 órán át rázatva inkubáljuk. Az flymódon kapott folyékony tenyészetet ezután egy 50 1 térfogatú fermentor tartályban lévő 30 1 táptalajra oltjuk át. A táptalaj összetétele a fentivel megegyező, 0,05 v% Actcol márkanevű habzásgátlóval kiegészítve. Az inkubálás folyamán a tenyészetet 24°C hőmérsékleten tartjuk, 50 1/perc levegőárammal levegőztetjük és 200 fordulat/perc sebességű keveiővel 48 órán át kevertetjük. A kapott 6 1 tenyészetet egy 200 1 térfogatú fermentortartályban lévő 120 táptalajba oltjuk át. A táptalaj egy vizes oldat (pH 6,5) és összetétele a következő: 3 v% dextrin,
1,5 v% nyers szójaliszt, 1,5 v% kukoricasikér-liszt, 0,2 v% Polypepton és 0,1 v% nátrium-tioszulfát, kiegészítve 0,05 v% Actcol habzásgátlóval. Az inkubálás folyamán a tenyészetet 17aC hőmérsékleten tartjuk, 200 1/perc levegőárammal levegőztetjük és 150 fordulat/perc sebességű keverővei 24 órán át kevertetjük.
A tenyészetet Pseudomonas aeruglnosa C-141 alkalmazásával vékonyréteg kromatográfiás bioautográfiás módszerrel vizsgálva megállapítottuk, hogy az N-dezatelezett TAN-588 (A és B típus keveréke). Rt-értéke a 4, példa szerint előállított N-dezaetílezett TAN-588 antibiotikum Rt-értékével azonos.
6. példa
Empedobacter lactamgenus YK-258 (IFO 14322, FERM BP-699) szilárd táptalajon tenyésztett törzset,
1 térfogatú Sakaguchi edényben lévő 500 ml táptalajra oltunk be. A táptalaj egy vizes oldat (pH 7,0) és összetétele a következő: 2 v% glükóz, 3 v% oldható
-101
194 310 keményítő, 1 v% nyers szójaliszt, 0,5 v% Polypepton és 0,3 nátrium-klorid, kiegészítve 0,5 precipitált kalcium-karbonáttal. Az edényeket 24°C hőmérsékleten 48 órán át rázatva Inkubáljuk. Az llymódon kapott folyékony tenyészetet ezután egy 501 térfogatú fennentor tartályban lévő 30 1 táptalajra oltjuk át. A táptalaj összetétele a fentivel megegyező, 0,05% Actcol márkanevű habzásgátlóval kiegészítve. Az Inkubálás folyamán a tenyészetet 24°C hőmérsékleten tartjuk, 50 1/perc levegőárammal levegőztetjük és 200 fordulat/perc sebességű keverővei 48 órán át kevertetjük. Acinetobacter sp. YK-504 (IFO 14420, FFRM BP-70) szilárd táptalajon tenyésztett törzset,
1 térfogatú Sakaguchl edényben lévő 500 ml táptalajra oltunk be. Λ táptalaj egy vizes oldat (pH 7,0) és összetétele a következő: 2 v% glukóz, 3 v% oldható keményítő, 1 v% nyers szójaliszt, 0,5 v% Polypepton és 0,3 v% nátrium-klorid, kiegészítve 0,5 v% precipltált kalcium-karbonáttal. Az edényeket 24°C hőmérsékleten 48 órán át rázatva inkubáljuk. Az llymódon kapott folyékony tenyészetet ezután egy 50 1 térfogatú fennentor tartályban lévő 30 1 táptalajra oltjuk át. A táptalaj összetétele a fentivel megegyező, 0,05 v%- Actcol márkanevű habzásgátlóval kiegészítve. Az inkubálás folyamán a tenyészetet 24°C hőmérsékleten tartjuk, 501/perc levcgőárammal levegőztetjük és 200 fordulat/perc sebességű keverővei 48 órán át kevertetjük.
Az Empedobacter lactamgenus YK-258 tenyészetből 3 1-t és a Acinetobacter sp. YK-504 tenyészetből
1-t egy 200 1 térfogatú fennentor tartályban lévő 120 1 táptalajba oltjuk át. A táptalaj egy vizes oldat (pH 6,5) és összetétele a következő: 3 v% dextrin,
1,5 v% nyers szójaliszt, 1,5 v% kukorica sikérliszt, 0,2 v% Polypepton és 0,1 v% nátrium-tioszulfát, kiegészítve 0,05 v% Actcol habzásgátlóval. Az inkubálás folyamán a tenyészetet 24 u hőmérsékleten tartjuk, 200 1/perc levegőárammal levegőztetjük és 150 fordulat/perc sebességű keverővei 24 órán át, majd 20°C hőmérsékleten további 42 órán át kevertetjük.
A kapott tenyészethez Hyflo Super Cél szűrőközeget adunk és leszűrjük. 100 1 szürletet kapunk, aminek pll-ját 5 re állítjuk be, majd 101 Ambcrlite IRA402 (Cl típus) hordozóval töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopról az antibiotikumot vizes mosás után 50 1 2 v% vizes nátrium-klorid oldattal eluáljuk. Az cluátum a ΤΑΝ-588-at 32±g/ml koncentrációban tartalmazza. A vizes éluátumot, ami az. N-dezacetilezett ΤΛΝ-588-at tartalmazza 10 1 Dovex 50 W X 2 (H* típus) hordozóval töltött oszlopon kromatografáljuk. Az cluálást 50 1 vízzel és 0,2 n vizes ammóniával végezzük. Az eluátumokat egyesítjük és 13 1 térfogatúra pároljuk be, majd 2 1 aktívszén lel töltött oszlopon, pH 5 értéken kromatográfiás módszerrel tisztítjuk.
Az eluáláshoz 8 v% izobutanolt használunk. A kapott 20 1 éluátumot 1 1 térfogatúra bepároljuk, majd 0.Ί 1 10,5-1 mm szltafrakdójú Dowex 50W X 2 (H típus) hordozóval töltött oszlopon ismét kromatografáljuk. Az eluáláshoz 0,2 n vizes ammónia-oldatot használunk. Az aktív hatóanyagot tartalmazó 1,4 1 frakciót aktívszénnel töltött oszlopon kromatográfiás módszerrel sótalanítjuk. Az eluátumot bepároljuk, majd acetont adunk hozzá. Az oldatból poralakú anyag válik ki. A nyers port preparatív folyadékkromatográfiás módszenei tisztítjuk,
YMC-Pack, ODS, SH-343 típusú kromatográfot alkalmazva (gyártó cég: Yamamura Chemical Laboratories, Japán) és eluálószerként 0,02 mólos (pH 6,3) foszfát-puffért alkalmazva.
Az. aktív anyagot tartalmazó eluátumokat egyesítjük és aktívszénnel töltött oszlopon kromatográfiás módszenei sótalanítjuk. Az antibiotikumot tartalmazó éluátumot bepároljuk és llofillzáljuk. A liofilizált anyaghoz acetont adunk. 50 mg porfortnájú N-dezacetilezett ΤΑΝ-588-at kapunk. A kapott anyagot N-dezaeetilezett TAN-588 (A és B típus keveréke) standard mintát alkalmazva azonosítottuk vékonyréteg kromatográfiás bioautográfiás, nagynyomású folyadékkromatográfiás biohisztlogranr, ÍR és NMR spektrumok alapján. ÍR-spektruin: 3. ábra (felvétel KBr-ban)
3450, 3220, 2960, 2900, 1800, 1760, 1740,
1670, 1580, 1420, 1390, 1370, 1310, 1250,
1200, 1120, 1050, 1030, 980, 950, 920, 810,
770, 720, 690,610, 540, cm'1, 1 H-NMR-spektrum: 400, MHz, D2 O-ban, ppm J (Hz), 2,52(111, m), 2,72(lH,m), 2,91(lH,m),
3,O8(lH,m),4.35(in,m),4,56(lH,m),4,8O(lH,m).
7. példa
Lysobacter albus sp. nov. YK-422 (IFO 14384, FERMP BP-698) szilárd táptalajon tenyésztett törzset, 2 1 térfogatú Sakaguchl edényben lévő 500 ml táptalajra oltunk be. A táptalaj egy vizes oldat (pH 7,0) és összetétele a következő: 2 v% glükóz, 3 v% oldható keményítő, 1 v% szójaliszt, 0,5 v% Polypepton és 0,3 v% nátrium-klorid, kiegészítve 0,5 v% precipltált kalcium-karbonáttal. Az edényeket 24°C hőmérsékleten 48 órán át rázatva inkubáljuk. Az ilymódon kapott folyékony tenyészetet ezután egy 50 1 térfogatú fennentor tartályban lévő 30 1 táptalajra oltjuk át. A táptalaj összetétel a fentivel megegyező, 0,05 v% Actcol márkanevű habzásgátlóval kiegészítve. Az inkubálás folyamán a tenyészetet 24 c hőmérsékleten tartjuk, 50 1/perc levegőárammal levegőztetjük és 200 fordulat/perc sebességű keverővei 48 órán át kevertetjük.
Acinetobacter sp. YK-504 (IFO 14420, FERM BP-709) szilárd táptalajon tenyésztett törzset, 2 1 térfogatú Sakaguchi edényben lévő 500 ml táptalajra oltunk be. A táptalaj egy vizes oldat (pH 7,0) és összetétele a következő: 2 v% glükóz, 3 v% oldható keményítő, 1 v% nyers szójaliszt, 0,5 v% Polypepton és 0,3 v% nátrium-klorid, kiegészítve 0,5 v% precipltált kalcium-karbonáttal. Az edényeket 24°C hőmérsékleten 48 órán át rázatva Inkubáljuk. Az Ily módon kapott folyékony tenyészetet ezután egy 50 1 térfogatú fermentor tartályban lévő 30 1 táptalajra oltjuk át. A táptalaj összetétele a fentivel megegyező, 0,05 v% Actcol márkanevű habzásgátlóval kiegészítve. Az inkubálás folyamán a tenyészetet 24° C hőmérsékleten tartjuk, 50 1/perc levegőárammal levegőztetjük és 200 fordulat/perc sebességű keverővei 48 órán át kevertetjük.
A Lysobacter albus sp. nov. YK-422 tenyészetből 3 1-t és az Acinetobacter sp. YK-504 tenyészetből 3 1-t egy 200 1 térfogatú fermentor tartályban lévő 120 1 táptalajba oltunk át. A táptalaj egy vizes oldat (pH 6,5) és összetétele a következő: 3 v% Jextrin, 1,5 v% nyers szójaliszt, 1,5 v% kukoricaslkér liszt, 0,2 v% Polypepton és 0,1 v% nátriumtioszulfát, kiegészítve 0,05 v% Actcol habzásgátló11
-112
194 310 val. Az Inkubálás folyamán a tenyészetet 24’C hőmérsékleten tartjuk, 200 1/perc levegőárammal levegőztetjük és 150 fordulat/perc sebességű keverővei 24 órán át, majd 20°C hőmérsékleten további 5 42 órán át kevertetjük.
A kapott tenyészetet Pseudomonas aeruglnosa C-141 alkamazásával vékonyréteg kromatográfiás módszerrel vizsgálva megállapítottuk, hogy az N-dezacetflezett TAN-588 (A és B típus keveréke). Rt-értéke a 4. példában előállított N-dezatflezett TAN-588 antibiotikum Rt-értékével azonos.
Claims (3)
1. Eljárás TAN-588 antibiotikum nátriumsója, amelynek fizikai állandói a következők:
külső forma: fehér por fajlagos forgatás [α] θ = —19,0° ± 10° (c = 0,5 vízben),
SIMS módszer szerint meghatározott molekuláris CSÚCS* m/e 611 (2M ♦ Na)+, 317 (M+Na)+, 295 (M+H)\ összegképlet: Cj0Hj ,N2Ö2Na, 25 ultraibolya sugárzás abszorpció (UV spektrum, vízben):
l.ábra: ·
130) infravörös spektrum (felvétel KBr-ban): 30
ÍR spektrum (2. ábra) alapján a jellemző abszorpciós maximumok a következők:
3450, 1780, 1730, 1660, 1550, 1385, 1320,
1290, 1260, 1200, 1120, 1040, 980, 910, 810,
770,690,600, 540 cm·’,
NMR spektrum (100 MHz, D2 O-ban). 35 jellemző csúcsok:
182,02(s), 177,30(s), 173,79(s), 173,30(s),
173,25(s), 172,58(s), 96,97(s), 96,92(s), 74,27(t), 72,68(t), 5S,57(d), 55,34(d), 31,92(t), 31,08(t), 30,98(t), 24,58(q), ppm. 40 valamint más alkálifém-,•alkáliföldfém- és ammóniumsója és N-dezacetilezett TAN-588 antibiotikum, amelynek fizikai állandói a következők:
külső forma: fehér por, fajlagos forgatás: [α]2θ s 11°Δ ± b 5° (C = 0,1, vízben), 45 molekulatömeg (FD-MS módszer szerint): m/z 231 (M+H)+, összegképlet: CgH,oN2O6 (0,5 H2O),
UV-spektrum (vízben).
ViX221i2nm(E1^m.154i20). 5θ
IR spektrum: (3. ábra, felvétel KBr-ban).
3450, 3220, 2960, 2900, 1800, 1760, 1740,
1670, 1580, 1420, 1390, 1370, 1310, 1250,
1200, 1120, 1050, 1030, 980, 950, 920, 810,
770,720,690,610, 540 cm'1, o’H-NMR spektrum: 400, MHz, D2O-ban, δ ppm
J(Hz):
2,52 (1H, m), 2,72 (1H, m), 2,91 (1H, m), 3,08 (1H, m), 4,35 (1H, m), 4,56 (1H, m), 4,80 (1H, m), előállítására, azzal j e 11 emez ve,hogy
a) Empedobacter lactamgenus YK-258 (FERM BP-699) vagy Lyosbacter albus sp. nov. YK-422 (FERM BP-698) mikroorganizmust vagy ezek TAN-588 N-dezacetilezett TAN-588 antibiotikum termelésére képes valamely mutánsát vagy variánsát szén-, nitrogén- és ásványisó forrást tartalmazó steril táptalajon tenyésztjük, majd a tenyészetet Ismert módszerekkel feldolgozzuk, és az N-dezacetilezett TAN-588 antibiotikumot kinyeijük, vagy a feldolgozás után alkálifém-, alkáliföldfém- vagy ammóniumsó-oldattal a megfelelő sóformává alakítva a TAN-588 antibiotikum alkálifém-, alkáliföldfém- vagy ammóniumsóját kinyeijük, vagy
b) N-dezacetilezett TAN-588 antibiotikum előállítására Empedobacter lactamgenus YK-258 (FERM BP-699) vagy Lysobacter albus sp. nov. YK-422 (FERM BP-698) mikroorganizmust vagy ezek N-dezacetilezett TAN-588 antibiotikum termelésére képes valamely mutánsát vagy variánsát és Acinetobacter sp. YK-504 (FERM-BP-709) mikroorganizmust kevert tenyészetben szén-, nitrogén- és ásványisó fonást tartalmazó táptalajon tenyésztünk, majd a táptalajból az N-dezacetilezett TAN-588 antibiotikumot kinyeijük. (Elsőbbsége: 1985. 02. 28.)
2. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás azzal jellemezve, hogy az Empedobacter lactamgenus YK-258 (FERM BP-699) vagy Lysobacter albus sp. nov. YK422 (FERM BP-698) mikroorganizmust vagy ezek TAN-588 antibiotikum termelésére képes valamely mutánsát vagy variánsát szén-, nitrogén- és ásványisó forrást tartalmazó táptalajon tenyésztünk, majd a tenyészetet ismert módszerekkel feldolgozzuk, és alkálifém-, alkáliföldfém- vagy ammóniumsó oldattal a megfelelő sóformává alakítva a TAN-588 alkálifém-, alkáliföldfém- vagy ammóniumsóját kinyeijük. (Elsőbbsége: 1984.11.29.)
3. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás azzal jellem ezve, hogy az Empedobacter lactamgenus YK-258 (FERM BP-699) mikroorganizmust vagy ennek TAN-588 antibiotikum termelésére képes valamely mutánsát vagy variánsát szén-, nitrogén- és ásványisó fonást tartalmazó táptalajon tenyésztünk, majd a tenyészetet ismert módszerekkel feldolgozzuk, és alkálifém-, alkáliföldfém- vagy ammóniumsó oldattal a megfelelő sóoldattá alakítva a TAN-588 alkálifém-, alkáliföldfém- vagy ammóniumsóját kinyerjük. (Elsőbbsége: 1984. 03. 29.)
3 db ábra
Kiadja: Országos Találmányi Hivatal Felelős kiadó: Hímet Zoltán
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/JP1984/000150 WO1985004408A1 (en) | 1984-03-29 | 1984-03-29 | Antibiotic tan-588, process for its preparation, and novel strainbelonging to genus empedobacter |
| PCT/JP1984/000222 WO1985005109A1 (en) | 1984-04-27 | 1984-04-27 | Antibiotic tan-588, process for its preparation, and novel species belonging to the genius empedobacter |
| PCT/JP1984/000568 WO1986003205A1 (en) | 1984-11-29 | 1984-11-29 | Antibiotic, process for their preparation, and microorganisms producing the same |
| PCT/JP1985/000095 WO1986005185A1 (en) | 1985-02-28 | 1985-02-28 | Antibiotic, process for its preparation, and microorganism |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT39777A HUT39777A (en) | 1986-10-29 |
| HU194310B true HU194310B (en) | 1988-01-28 |
Family
ID=27466904
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU851207A HU194310B (en) | 1984-03-29 | 1985-03-29 | Process for preparing alkali metal, alkali earth metal, ammonium salt and n-deacetylated derivative of novel tan-588 antibiotic |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4656288A (hu) |
| EP (1) | EP0157544A3 (hu) |
| ES (2) | ES8702428A1 (hu) |
| HU (1) | HU194310B (hu) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4897489A (en) * | 1984-12-18 | 1990-01-30 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Antibiotic derivatives, their production and use |
| EP0219923B1 (en) * | 1985-04-30 | 1992-09-02 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Antibiotic derivatives, their production and use |
| JP5170940B2 (ja) * | 2002-10-03 | 2013-03-27 | ユニバースィティ オブ ミシシッピー | 高純度アンホテリシンｂを含有する組成物 |
| US8648050B2 (en) * | 2002-10-03 | 2014-02-11 | University Of Mississippi | Methods and formulations for reducing amphotericin B treatment side effects |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB787741A (en) * | 1954-08-24 | 1957-12-18 | Commercial Solvents Corp | Improvements in or relating to alkaline earth metal salts of cycloserine and processof producing the same |
| JPS58318B2 (ja) * | 1977-07-11 | 1983-01-06 | 住友化学工業株式会社 | 制癌性物質の製造方法 |
| US4275214A (en) * | 1978-05-15 | 1981-06-23 | The Upjohn Company | Substituted alkoxy carbonyl-3-oxo-α-phthalimido-5-isoxozolidineacetic acids |
| US4409210A (en) * | 1982-01-15 | 1983-10-11 | Bristol-Myers Company | Antibiotic compound |
-
1985
- 1985-03-20 EP EP85301948A patent/EP0157544A3/en not_active Withdrawn
- 1985-03-20 US US06/714,084 patent/US4656288A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-03-21 ES ES541441A patent/ES8702428A1/es not_active Expired
- 1985-03-29 HU HU851207A patent/HU194310B/hu not_active IP Right Cessation
-
1986
- 1986-06-02 ES ES555584A patent/ES8707251A1/es not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4656288A (en) | 1987-04-07 |
| ES8702428A1 (es) | 1986-12-16 |
| EP0157544A2 (en) | 1985-10-09 |
| ES555584A0 (es) | 1987-07-16 |
| EP0157544A3 (en) | 1987-08-05 |
| ES541441A0 (es) | 1986-12-16 |
| HUT39777A (en) | 1986-10-29 |
| ES8707251A1 (es) | 1987-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0182315B1 (en) | Novel antibiotic nk84-0218 pharmaceutical compositions containing it and process for the production of the same | |
| KR960013432B1 (ko) | 항균제 fr109615 및 이의 제조방법 | |
| US4229436A (en) | Antibiotic G-6302 | |
| US5013550A (en) | Antibiotics called "chloropolysporins B and C", a process for their preparation, and their therapeutic and veterinary use | |
| IE841760L (en) | Antibiotics produced by kibdelosporangium aridum | |
| HU194310B (en) | Process for preparing alkali metal, alkali earth metal, ammonium salt and n-deacetylated derivative of novel tan-588 antibiotic | |
| GB2111495A (en) | Aminoglycoside antibiotics | |
| HU181721B (en) | Process for preparing antibiotics c-19393sdown 2 and c-1939hdown 2 | |
| US4587333A (en) | Cephalosporins and their production | |
| Werner et al. | Directed biosynthesis of new indolmycins | |
| US4752469A (en) | Potentiators of beta-lactam antibiotics | |
| US4906618A (en) | Prophylactic and therapeutic agent against swine dysentery | |
| HU214738B (hu) | Eljárás új antibakteriális vegyületek előállítására | |
| EP0150378B1 (en) | Cephem compounds and their production | |
| Takasawa et al. | Platomycins A and BI Taxonomy of the producing strain and production, isolation and biological properties of platomycins | |
| CA1159782A (en) | Antibiotic pa-39504-x.sub.n and production thereof | |
| US4950605A (en) | FR-900493 substance, a process for its production and a pharmaceutical composition containing the same | |
| EP0413967B1 (en) | Novel antibiotic | |
| EP0144238B1 (en) | A new compound, fr-900451, production and use thereof | |
| USRE29903E (en) | Antibacterial antibiotics AM31α, AM31β and AM31γ | |
| US4234685A (en) | Microbiological methylation of aminoglycosyl-aminoglycosides | |
| CA1225052A (en) | Cephalosporins and their production | |
| US5364623A (en) | Antibiotic produced by Bacillus subtilis ATCC 55422 capable of inhibiting bacteria | |
| JP3523290B2 (ja) | 化合物３１６６８ｐおよび３１６６８ｕ、それらの製造方法およびそれらの使用 | |
| US4298599A (en) | Novel antibiotic BN-235 substance, and process for the production thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 | ||
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |