WO1986005185A1 - Antibiotic, process for its preparation, and microorganism - Google Patents

Antibiotic, process for its preparation, and microorganism Download PDF

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WO1986005185A1
WO1986005185A1 PCT/JP1985/000095 JP8500095W WO8605185A1 WO 1986005185 A1 WO1986005185 A1 WO 1986005185A1 JP 8500095 W JP8500095 W JP 8500095W WO 8605185 A1 WO8605185 A1 WO 8605185A1
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WO
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tan
antibiotic
deacetyl
salt
culture
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PCT/JP1985/000095
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French (fr)
Japanese (ja)
Inventor
Hideo Ono
Yukimasa Nozaki
Setsuo Harada
Original Assignee
Takeda Chemical Industries, Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to a novel antibiotic useful as an antibacterial agent, a method for producing the same, and a microorganism that can be used for the production.
  • the present inventors isolated a large number of microorganisms from soil for the purpose of searching for new antibiotics, and searched for antibiotics produced by the microorganisms.As a result, it was found that certain microorganisms produce new antibiotics.
  • the microorganism is a new species belonging to the genus Endobacter and the genus Rhizobacter, and by culturing the microorganism in an appropriate medium, an antibiotic exhibiting antibacterial activity against Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria can be obtained. Knowing that it can accumulate in the medium, etc., isolate this antibiotic, confirm from its physicochemical and biological properties that the antibiotic is a novel antibiotic, I decided to call it 588.
  • the present inventors have also found that the above-mentioned antibiotic TAN-588 has an N-acetyl group and a carboxy group in the molecule, and that the acetyl group is eliminated. I found that I could do it.
  • the bacteria of the genus Endopactor and the lysobacterium are capable of producing and accumulating the N-deacetyl body of the above-mentioned antibiotic TAN-588.
  • a mixed culture of Endobacter bacteria or Rhizobacter bacteria having the ability to produce 588 and Z or its N-deacetyl compound, and a mixed culture of AN-588 N-deacetyl compound with antibiotics It was found that a larger amount could be produced and accumulated than without.
  • the present invention relates to (1) an antibiotic TAN-588, a paranitrobenzyl or benzhydryl ester thereof, or an N-deacetyl derivative thereof or a salt thereof;
  • Rhizopater albus which forms a white colony and whose 0-F (oxidative-fantative) test is non-degradable and has no assimilation of inorganic nitrogen sources
  • This is a method for producing an N-deacetyl derivative of the antibiotic AN-588 or a salt thereof, which is characterized by collecting the same.
  • antibiotic TAN-588 may be simply referred to as “TAN-588”.
  • the antibiotic AN-588 used in the method of the present invention and the bacterium that produces no or its ⁇ '-deacetyl derivative belong to the genus Empedobacter or Lysobacter, and the antibiotic TA-588. And / or any microorganism having an ability to produce its N-deacetyl derivative.
  • a production bacterium belonging to the genus Endobacter there is, for example, a new bacterium species Emped bacterium lactamgenus.
  • YK-258 strain Lacta mugenus strain collected from the soil of Masuda ⁇ , Shimane Prefecture, Japan by the present inventors. can give.
  • the mycological properties of the Y-258 strain are as follows.
  • the cells were cultured at 24 ° C and observed for 1 to U days.
  • Broth agar flat culture The colony is translucent, light yellow, circular, head-shaped, and rim-shaped. No diffusible dye is formed.
  • Liquid broth culture Grows in a mixed state, precipitates, and forms a pellicle.
  • Juice gelatin stab culture Grows mainly in the upper part and liquefies like a crater. Liquefaction activity is relatively weak.
  • ⁇ Grows at ⁇ 5.4 to 8.5, but the optimal ⁇ is 5.8 to 6.6.
  • -Medium 0.1% Darcose, 0.01% yeast extract, 0.1% vanadium sulfate, 0.1% salt, 0.05% magnesium sulfate (7-hydrate), phosphate buffer Q.1M (separate sterilization).
  • the YK-258 strain having the above mycological properties was prepared by using the Verges Manual, Minuteif, and Bergey's Mann et al. Determinative B acteriology) Eighth Edition and International Journal 'OB' Systematic Bacteriology
  • the YK-258 strain is more likely to be used than the genus Flavobacterium. It is more appropriate to attribute it to the genus Endopactor. However, the GC content of the DNA exceeds 70%. Therefore, the YK-258 strain was identified as belonging to the ⁇ strain, and the new strain was named as Ninbedaku Yuichi * Empedobacter iactamgens.
  • Antibiotic T AN belonging to the genus Lysobacter used in the method of the present invention
  • bacteria producing 588 and / or its N-deacetyl form examples include Lysobacter albus, a new strain.
  • Lysobacter albus a new strain.
  • the present inventors may abbreviate Rhizobacta. Arbus sp. Nov. YK-422 strain (hereinafter referred to as "YK-422 strain") collected from soil in Kanzaki-gun, Shiga Prefecture, Japan. ).
  • the mycological properties of 422 are as follows.
  • the cells should be 0.4 to 0.7 m in length, 2.0 to 4.4 m in length, and 20 to 30 m in filament length. There is also. No flagella, no motility. It does not form spores or microcysts and has a negative Gram stain, indicating no acid resistance.
  • Broth liquid culture grows in a lightly mixed state, forms a small amount of precipitate, and forms a weak bacterial ring.
  • Dried yeast plate A lysis circle is formed around the colony, and it shows mobility due to gliding.
  • ⁇ ' Adjusted with caustic soda or sulfuric acid.
  • the YK-422 strain having the above-mentioned mycological properties was obtained by using the Burges' Manual. National 'Journal of the Systematic Pakterio Sigma, Vol. 30, pp. 225-420 (1980), Vol. 32, U6-149 (1982), and the validity of the literature.
  • ⁇ When compared with the species in the list, it is a gram-negative bacillus that shows mucoidal growth, some filamentous bacteria are also observed, showing motility by grinding, and the ability to degrade colloidal chitin and dry yeast It does not form micromixes and has a high GC content in DNA, so it is appropriate to belong to the genus Rhizobacta.
  • Rhizopactor International 'Journal', 'Ob', 'Systematic', Pacteriology, Volume 28, pp. 367-393. They differed in that they were degraded, did not have any distinct color in the colonies, and did not have the assimilation of inorganic nitrogen sources. Therefore, YK-422 bead was identified as a strain belonging to a new strain, and the new strain was named Rhizobacta'arbus (Lysobacter alb sp.) Sp. Nov. Y-422.
  • the bacteria belonging to the genus Acinetobacter used in the mixed culture used in the method of the present invention belong to the genus Acinetobacter (.ki netob acter), and have the ability to produce the antibiotics TA-588 and Z or the N-deacetyl derivative thereof. Any microorganism may be used as long as it has the ability to produce and accumulate a significant amount of the N-deacetyl derivative of the antibiotic TA-588 by co-cultivation with Escherichia coli or Rhizobacta.
  • the term "produce and accumulate a significant amount” as used above means that the microorganism of the genus Annetobacter is used. However, the target compound is produced and accumulated in a larger amount than the amount of the N-deacetyl product of the antibiotic TAN-588 when the Endobacter species or the Rhizobacter species are used alone. Means
  • microorganism belonging to the genus Acinetobacter examples include, for example, Acinetobacter sp.
  • Acinetobacter sp examples include, for example, Acinetobacter sp.
  • the present inventors may refer to a strain of yeast YSP-504 (hereinafter referred to as “YK-504”) isolated from fresh water collected from Yodogawa-ku, Osaka-shi, Osaka, Japan. )).
  • the mycological properties of the YK-504 strain are as follows.
  • the cells were found to be short rod-shaped or spherical with a diameter of 0 to 1.5 ⁇ 111 and a length of 1.1 to 2.1111. There are many. No flagella. No motility. It does not form spores and has a negative Gram stain, indicating no acid resistance.
  • the cells were cultured for 2 to 4 days and observed for 4 to 14 days.
  • Juice agar plate culture Colonies are small and dot-like, the surface is convex, and the periphery is all square. No diffusible dye is formed.
  • Liquid broth culture Grows turbid, precipitates, and does not form a pellicle.
  • 5Litmus ⁇ Milk Reduction of litmus, peptone formation and coagulation ( ⁇ , no negative activity is observed.
  • Carboxymethyl cellulose one
  • Colloidal chitin —
  • the above-mentioned facilitator Patricia sp. 504 strain was deposited with I F0 on January 31, 1985 as accession number I F 0 14420.
  • the microorganism has been deposited with the FRI on February 12, 1985 as a deposit under the Budapest Treaty, under the accession number F ERM II-709.
  • the properties of the bacteria of the genus Endobacter or Rhizobacter used in the present invention are generally liable to change.
  • ultraviolet rays, X-rays, and chemicals eg, nitrosoguanidine, ethyl methanesulfonic acid
  • Any mutant which can be easily mutated by means of artificial mutation and which has the ability to produce TA 588-588 and / or its N-deacetyl derivative, which is the subject of the present invention, can be used in the present invention.
  • the bacteria of the genus Acinetobacter used in the present invention generally change their properties easily, and are easily mutated by, for example, artificial mutation using ultraviolet rays, X-rays, chemicals (eg, nitrosoguanidine, ethyl methanesulfonic acid) and the like. Any mutant strain can be mixed with a microorganism belonging to the genus Endobactor or Lysobacter, which is capable of producing the antibiotic TAN-588 and / or its N-deacetyl derivative.
  • carbon sources include, for example, darcose, fructose, maltoses, and solvable starch, dextrin, oils and fats (eg, , Soybean oil, olive oil, etc.), and organic acids (eg, citric acid, succinic acid, dalconic acid, etc.) that can be used by bacteria can be used as appropriate.
  • organic nitrogen compounds such as soybean flour, cottonseed flour, corn gluten ⁇ meal, dried yeast, yeast extract, meat extract, and peptone.urea can be used.
  • the inorganic salts include, for example, sodium chloride, potassium chloride, calcium carbonate, magnesium sulfate, monolithium phosphate, and sodium phosphate required for culturing normal bacteria, alone or in combination. used.
  • Heavy metals such as ferric sulfate and copper sulfate, and vitamins such as vitamin B-biotin are also added as necessary.
  • an antifoaming agent such as silicone oil / polyalkylene dali coal ether or a surfactant may be added to the medium.
  • Other organic and inorganic substances that promote the growth of bacteria and promote the production of TAN-58 ⁇ and / or its deacetyl form may be added as appropriate.
  • the cultivation method may be the same as a general antibiotic production method, and may be solid culture or liquid culture.
  • any of static culture, stirring culture, shaking culture, and aeration culture may be performed, but aeration and agitation culture is particularly preferred.
  • the culture temperature is preferably about 15 ° (: to about 32 ° C, and the pH of the medium is about 5 to 8 for about 8 to 168 hours, preferably about 24 to 144 hours.
  • the mixed culture method for the production of the N-deacetyl form of the antibiotic TAN-588 should be performed in accordance with the culture method for the production of the antibiotic TAN-588 and / or its N-deacetyl form as described above. With power.
  • a TLC-bioautography method using pseudomonas.eruginosa C-U1 as a test bacterium is used.
  • the mixed culture is carried out using the microorganism of the genus Annetobacter of the present invention
  • the antibiotic TAN which is the target substance
  • the mixed culture method of the present invention is advantageous in industrial production.
  • antibiotic TAN-588 and Z or its N-deacetyl derivative are appropriate.
  • the antibiotic TAN-588 and its N-deacetyl derivative are water-soluble and are mainly contained in the culture filtrate. Therefore, a filtration aid is first added to the culture, followed by filtration or eccentric separation.
  • a means for removing the cells, bringing the resulting culture filtrate into contact with a suitable carrier to adsorb the active ingredient in the filtrate, desorbing the active substance with a suitable solvent, and separating and collecting the fraction is advantageously used.
  • a chromatographic carrier use the difference in the adsorptivity of compounds such as activated carbon, silica gel, powder cell mouth, and adsorbent resin, or use the difference in the functional groups of compounds such as ion-exchange resin and ion-exchange cellulose. It is advantageous to use the difference in molecular weight of compounds such as molecular sieves L and sex carriers. In order to elute the target compound from these carriers, combinations vary depending on the type and properties of the carriers.
  • aqueous solutions of water-soluble organic solvents that is, aqueous acetates and aqueous alcohols, or acids and alkalis
  • a buffer an aqueous solution containing an inorganic or organic salt, or the like is used in appropriate combination.
  • high-performance liquid mouth chromatography for preparative separation of the crude substance of this antibiotic obtained by these chromatographys (HP LC) for further purification.
  • the eluate desalted by activated carbon chromatography can be concentrated, and the antibiotic can be recovered from the concentrate using an ion-pair extraction method, that is, a quaternary alkylammonium it can.
  • TAN-588 is an acidic substance
  • an anion exchange resin such as Dowexu-1 (manufactured by Dow & Chemical Co., USA) and Amberlite IRA-68, 400, 402, 410 are used as carriers. (Roam & Haas Co., USA), Diaion SA-21A and C (Mitsubishi Kasei Kogyo Co., Ltd., Japan), etc., absorb the antibiotics in the filtrate and contain salts or acids. Is eluted with an aqueous solution or buffer solution.
  • Anion exchange cell openings such as DE-32 (Wattman, UK), DEAE-cellulose (Brown, Germany), etc., or anion-exchange molecular sieve resins such as DEAE- or QAE-Sephadex
  • the antibiotic can be adsorbed to a carrier such as [Falmasha, Sweden] and eluted with an aqueous solution or buffer containing salts or acids. To remove salts, coloring substances, etc.
  • Activated carbon for chromatography manufactured by Takeda Pharmaceutical Co., Ltd., Japan
  • an adsorbent resin such as Diaion HP-2.0 or S-207 (Mitsubishi Kasei Kogyo Co., Ltd., Japan), Amberlite XAD- ⁇ (Mouth And Haas Co., USA), etc.
  • the fractionated elution fractions are made into powder through processes such as concentration and freeze-drying. When the purity of the powder thus obtained is poor, high-performance liquid chromatography is advantageously used for further purification.
  • the carrier used examples include TS ⁇ ⁇ gel (manufactured by Toyo Soda Co., Ltd., Japan) and YMC gel (manufactured by Yamamura Chemical Research Laboratories, Japan).
  • the moving layer is formed of methanol or acetonitrile and an acidic aqueous solution. Alternatively, a mixed solution with a buffer solution or the like is used.
  • Ions mentioned above • Quaternary alkyl ammonium used in the paired extraction method ⁇
  • For halides for example, tri-n-butylmethylammonium chloride, tetra-n-pentylammonium chloride, ⁇ -tetradecyldimethylbenzyl There are ammonium chloride and the like.
  • the organic solvent methylene chloride, chloroform and dichloroethane are usually used.
  • ⁇ -deacetyl form of TAN-588 is an amphoteric substance and has a stronger basic property. Therefore, as a carrier, a cation exchange resin such as Dowex 50W (manufactured by Dow And Chemical Co., USA), Amberley G. Using IR-120B (manufactured by ANDOM Haas Co., USA), Diaion SK-U0 (manufactured by Mitsubishi Kasei Kogyo Co., Ltd., Japan), etc., the antibiotic in the filtrate is adsorbed, It is eluted with an aqueous solution or buffer containing salts or acids or alkalis.
  • a cation exchange resin such as Dowex 50W (manufactured by Dow And Chemical Co., USA), Amberley G. Using IR-120B (manufactured by ANDOM Haas Co., USA), Diaion SK-U0 (manufactured by Mitsubishi Kasei Kogyo Co., Ltd., Japan), etc.
  • the antibiotic can be adsorbed on a carrier such as a cation exchange molecular sieve resin such as CVI-Sephadex (Pharmacia, Sweden) and eluted with a salt-containing aqueous solution or buffer.
  • a carrier such as a cation exchange molecular sieve resin such as CVI-Sephadex (Pharmacia, Sweden)
  • activated carbon for chromatography or an adsorbent resin such as Dia SP-207 or HP-20 is advantageously used.
  • the fractionated elution fraction is powdered through steps such as concentration and freeze-drying. If the powder obtained in this way has a low density, high-performance liquid chromatography is advantageously used for coarse purification.
  • the carrier, moving bed, etc. are the same as in the case of the refinement of TAN-5 ⁇ .
  • TAN-588 is present in the form of salts used as salts, cations in a buffer solution, such as sodium, calcium, lithium, calcium, and amphibious ions. In this case, it is isolated as the corresponding salt by applying it to activated carbon at the same pH and applying it to ⁇ -matography. The eluate is adjusted to a pH of about 4.5 to 3, preferably about 4.5 to 3, and chromatographed on activated carbon to obtain a free product.
  • the N-deacetyl form of TAN-588 can be obtained as a zwitterion compound by activated carbon chromatography at near neutral pH.
  • the N-deacetyl form of TAN-588 can form a salt with a strong acid because it has a stronger basic property.
  • the strong acid include hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, and trifluoroacetic acid.
  • the TAN-588 thus obtained has two peaks on reversed-phase high performance liquid chromatography. If these peaks are referred to as A and B, the following phenomenon is observed. When the peaks of A and B are respectively collected by preparative high-performance liquid chromatography, a fairly single A and B are obtained.
  • a paranitrobenzyl or benzhydryl group is introduced into TAN-588 to form an ester form.
  • the acetyl group of 8 is also eliminated, and this is carried out by eliminating the para-nitrobenzil or Bench drillyl group, if necessary.
  • a compound capable of introducing a para-nitrobenzyl group is reacted with TAN-588 or a salt thereof.
  • the compound into which the paranitrobenzyl group can be introduced include, for example, paranitrobenzylbutamide and paranitrobenzyl chloride.
  • the amount of the compound capable of introducing a paranitrobenzyl group is about 1 to 5 equivalents, preferably about 1 to 2 equivalents.
  • the reaction is preferably performed in a solvent.
  • the solvent include dimethylformamide (DMF), dimethylacetamide (DMAA), and tetrahydrofuran (THF).
  • THF tetrahydrofuran
  • Et 3 N triethylamine
  • pyridine pyridine and the like may be added in an amount of about 0.1 to 0.5 equivalent, preferably about 0.1 to 0.2 equivalent to promote the reaction.
  • the reaction temperature is about O ° C to 40 ° C, more preferably about 20 ° (: to 30 ° C, and the reaction time is about 0.5 to 8 hours, more preferably about 1 to 4 hours. It is preferred to carry out with stirring.
  • a compound capable of introducing a benzhydryl group is reacted with TAN-588 or a salt thereof.
  • the compound into which the benzhydryl group can be introduced include, for example, diphenyldiazomethane, diphenylmethylbromide and the like.
  • the amount of the compound capable of introducing a benzhydryl group is about 1 to 6 equivalents, preferably about 2 to 4 equivalents.
  • the reaction is preferably carried out in a solvent, and examples of the solvent include THF, dioxane, ethyl acetate, digrometan and the like.
  • reaction To promote the reaction, a small amount of, for example, about 0.01 to 0.0 equivalents of dilute hydrochloric acid, dilute sulfuric acid, or dilute phosphoric acid is added to add PH to about 1 to 3, preferably about It is preferable to adjust to around 1.5 to 2.5.
  • the reaction temperature is about 110 ° C. to T 50 ° C., more preferably 0 to 30 ° C., and the reaction time is about 30 minutes to about 8 hours, more preferably about 1 to 3 hours.
  • the reaction is preferably performed with stirring.
  • the ester obtained above can be collected using a commonly used separation and purification means.
  • the target substance is, for example, dichlorme
  • the extract is concentrated into an organic layer with tan or black form, and the extract is concentrated. When the concentrate is added to ether or hexane, the ester is precipitated as a crystalline powder.
  • This ester compound is isolated into two components by the silylation gel method, but may be used as a mixture when proceeding to the next reaction.
  • Examples of the deacetylation reaction include an iminoether method, a solvolysis method, and a hydrolysis method using an enzyme.
  • the raw material compounds are also reacted with phosphorus pentachloride, phosgene, phosphorus trichloride, and oxychloride.
  • the reaction reagent is preferably used in an amount of about 1 to 5 equivalents, more preferably about 1.5 to 3 equivalents.
  • the reaction is conveniently carried out in the presence of a solvent such as, for example, methylene chloride, dichloroethane, chloroform, carbon tetrachloride, trichloromethane.
  • pyridine, ⁇ , ⁇ -dimethylylaniline, triethylamine, aniline, toluidine and the like may be used in excess, for example, about 3 to 20 equivalents, and more preferably about 5 to 10 equivalents.
  • the deacetylation reaction is carried out at a reaction temperature of about 130 ° C to 0 ° C, more preferably at 11 ° C to -5, and a reaction time of about 15 minutes to 8 hours, more preferably about 30 minutes to 2 hours. Is good.
  • the reaction is conveniently carried out with stirring.
  • reaction solution An excess of methanol is added to the reaction solution in order to convert imino chloride formed as an intermediate into imino ether, and the resulting mixture is added at about 130 ° (: 0 ° C, preferably about 15 ° C to 15 ° C).
  • the mixture is stirred for 2 hours, and then dilute hydrochloric acid is added to the reaction solution to cleave the C—N bond.
  • the reaction temperature is about i Ot; 4040 ° C., preferably about 20 to 30 ° C.
  • the reaction time is about 15 minutes to 2 hours, preferably about 30 minutes to 1 hour.
  • the starting compound is dissolved in methanol, ethanol or a mixed solution thereof with water, and the mixture is heated at about 20 ° C. to reflux temperature, preferably at about 50 ° C. to reflux temperature.
  • the reaction is carried out for 0.5 to 30 hours, preferably for about 2 to 8 hours.
  • reaction solution thus obtained is neutralized, and the product is extracted with an organic solvent that is immiscible with water, such as methylene chloride, getyl ether, and ethyl ethyl ester, and the extract is concentrated. 588 deacetyl-form paranitrobenzyl or Bench drills are obtained.
  • an acid hydrolyzing method for example, an acid hydrolyzing method, a direct contact reduction method, or the like is used.
  • trifluoroacetic acid formic acid, hydrochloric acid or the like is used as an acid in about 3 to 20 equivalents of the raw compound for reaction. It is preferable to add about 1 to 5 equivalents, preferably about 2 to 4 equivalents, of anisol.
  • a solvent for example, methylene chloride, chloroform, THF, ethyl acetate and the like are used.
  • Anti-Temperature about 130 ° C. to 0 ° C., more preferably about 120 ° C. to 1 ° C., and reaction time; about Q. 5 to 8 hours, more preferably about 1 to 4 hours. is there.
  • the catalytic reduction method for example, palladium, platinum, their oxides and the like are used as a catalyst and reacted under a stream of hydrogen.
  • the reaction temperature is about 0 to 50 ° C, more preferably about 10 ° (: to 40 ° C), and the reaction time is about 6 hours, more preferably about 2 to 2 hours.
  • the free carboxylic acid compound thus formed is separated by filtration of impurities in the reaction solution or removal by mouth chromatography, for example, by a method using activated carbon, an adsorbent resin, etc., followed by concentration and freeze-drying. , Collection, Can be purified.
  • the main absorption (wave number) of the absorption spectrum (Fig. 2) due to the bromide power failure is as follows.
  • Soluble water, dimethyl sulfoxide.
  • Amino acid analysis known to hydrolyze in 6 N-hydrochloric acid at L05 ° C for 20 hours Serine is detected as an amino acid.
  • Stability Stable at pH 5 in aqueous solution, slightly unstable at pH 3 and 7, unstable at pH 9.
  • TLC Thin layer chromatography
  • High Performance Liquid Chromatography (HP LC) (Carrier: YMC A-312, manufactured by Yamamura Chemical Laboratory, Japan, mobile phase: 4%, methanolic 0.01M phosphate buffer (PH6.3), 2 tnl / mln ):
  • silica gel (Merck, West Germany)
  • 3400 3090, 2950, 1805, 1760, 1680, 1610, 1530, 1450, 1380, 1355, 1270, 1180, 1105, 1055, 1015, 965, 910,
  • UV absorption (UV) spectrum (in methanol)
  • 3400 3050, 2970, 1800, 1780, 1740, 1600, 1500, 1460 ; 1305, 1270, 1190, 1110, 1060, 980, 920, 880, 850, 750, 710, 650, 620, 605 cm " 1
  • the main absorptions are as follows.
  • HP LC Equipment, carrier, and speed are the same as those of the above-mentioned benzhydryl ester (mixture of type A and type B) of deacetyl.
  • the main absorption is as follows.
  • TAN-588 has an acetyl group bonded to nitrogen and a carboxyl group.
  • TAN-588 sodium salt The therapeutic effects of TAN-588 sodium salt on experimental mouse infections are shown in Table 2. Infectious orchid administration method ED soCmg / kg) Staphylococcus ⁇ aureus 308A-1 subcutaneous 25.0 In addition, TAN-588 sodium salt was administered subcutaneously to mice at 400 mg / kg, or 4,000 mg Zkg was orally administered to mice. No acute toxicity was observed.
  • the biological properties of the N-deacetyl derivative of TAN-588 (a mixture of type A and type B) are described.
  • the mixture of the A-type and B-type compounds and the A-type and B-type compounds are equivalent in biological properties.
  • Table 3 shows the antibacterial spectrum of the N-deacetyl derivative of TAN-588 against various microorganisms.
  • Test bacteria Minimum growth inhibitory concentration (Note 1) Staphylococcus aureus FDA 209P 50 Micrococcus luteus IFO 12708 6.25 Bacillus subtilis NIIU PCI 219 12.5 Bacillus cereus FM 550 Escherichia coli NIfU JC 25 Salmonella typhimurium IFO 12529 50 Citrobacter iF ⁇ Indy IFO 12681 50 Klebsiella pneumoniae IFO 3317 100 Serratia Marce 'Socense IFO 12648 25 Proteus ⁇ Mirabilis.
  • ATCC 21100 100 Proteus, Bulgaris IFO 3988 100 Proteus Morgani — IFO 3168> 100 Shu Domonas aerugino —sa IFO 3080 50 Alkaligenes, Fucalis IFO 13111 100 Acacia tobacco ICO 13006 50 (Note 1) Bacterium, antibiotics ⁇ Medium 3
  • N-deacetyl form of TAN-588 can be used in various 3-lactamases. It is stable against.
  • Table 4 shows the results of examining the stability against two species of; 8-lactamase using Escherichia coli PG 8 as a test bacterium.
  • the numerical values indicate the diameter of the blocking circle (mm).
  • Medium Nutrient agar medium (PH7.0) containing diaminopimelic acid (20 mg /).
  • PCG benzylpenicillin, CPC: cephalosporin C, CMC: cephamycin C;
  • the drug concentration is T8-588 ⁇ '-Decetyl form is 1000 , All others are 100 gz mo
  • e 1 Bacillus ⁇ Derived from B. cereus, manufactured by Calbio Chemical Co. (USA).
  • TAN-588 its paranitrene or benzhydryl-ester form, or its N-deacetyl form [hereinafter, these are collectively referred to as compound (II)].
  • compound (II) Or their salts have antibacterial activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria and have low toxicity. Therefore, the compound (I) of the present invention or a salt thereof is useful for the treatment of bacterial infectious diseases in mammals [eg, rats, mice, dogs, cats, livestock (such as horses). Can be used.
  • the compound (I) of the present invention or a salt thereof as a therapeutic agent for bacterial infections
  • they can be administered orally as tablets, capsules, etc., together with pharmacologically acceptable carriers, excipients, diluents, etc., and parenterally as injections.
  • diluents and the like in the case of injections include physiological saline.
  • An example of a carrier in the case of a capsule is lactose.
  • the dose is about 5 to 50 mgZkgZ days, preferably about 10 mgZkgZ days for compound (I) in the case of an oral preparation, and about 2.5 to 25 mgZkgZ days, preferably about 5 to 5 in the case of a parenteral preparation. 20 mg kg Z days.
  • the compound (I) or a salt thereof obtained by the present invention can be used as a bactericide or disinfectant.
  • a compound (I) a solution prepared by dissolving in distilled water at a concentration of 0.01 to 0.1 WZV%, or vaseline or lanolin as a base, 0.2 to 20 mg, preferably 1 to 1 g of compound (I) per 1 g As an ointment containing 10 mg, it can be used for disinfection and disinfection of human and animal hands, feet, eyes and ears.
  • the compound (I) obtained by the method of the present invention is also a very promising compound as a synthetic intermediate for a new drug.
  • compound (I) a novel antibiotic.
  • FIG. 1 shows the UV absorption spectrum of TAN-588 (an equilibrium mixture of A and B).
  • FIGS. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7, 8, 9, 1Q, 11 and 12 show TAN-588 ( Equilibrium mixture of A and B), p-nitrobenzyl ester of TA-588 (mixture of A and B), TAN-588 para-n-benzyl ester (type A), TAN-588 para-nitro-benzyl ester (A) B), T AN—588 Benzhydryl ester
  • the content of the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
  • the percentage in the medium indicates the weight Z volume% unless otherwise specified.
  • This culture solution was inoculated into a 50 J2 tank containing 30 J2 of the above medium supplemented with 0.05% of an antifoaming agent Actol (manufactured by Takeda Pharmaceutical Co., Ltd.), and aerated at 24 ° C.
  • the cells were cultured for 48 hours under the conditions of 50 J2 / min, 200 rpm and Z minutes.
  • This culture solution 6 J2 was converted to an aqueous solution (PH6.5) containing dextrin 3% raw soy flour 1.5%, corn gluten meal 1.5%, polypeptide 0.2%, sodium thiosulfate 0.1_%.
  • the fermenter was inoculated into a 200 J2 fermenter containing a medium supplemented with 0.05% Factol, and cultured at 17 ° C for 66 hours under the conditions of aeration of 200 J2 / min and 150 rpm. After adjusting the culture solution (230J2) from the two
  • Lactamgenus YK-258 strain (IFO 14322, FERBP-699) grown on nutrient agar with glucose 2%, solubil
  • This culture solution 602 was converted into an aqueous solution (PH6.5) containing 3% dextrin, 1.5% raw soy flour, 1.5% corn gluten ⁇ meal, 1.5% polypeptone, and sodium sodium thiosulfate.
  • the tank was inoculated into a tank having a capacity of 2000 J2 containing 1200 J2 of medium supplemented with 0.05%, and cultured at 17 ° C for 90 hours under the conditions of aeration of 2000 £ / min and 120 rotations.
  • the culture solution thus obtained was filtered using Hyflo Super Cell (manufactured by Johns Manville, USA).
  • the filtrate (1150 ⁇ ) was subjected to column chromatography on Amberlite IRA-402 (C1 type) 40 ⁇ .
  • Antibiotics were eluted with 2% saline (200 J2), and the eluate was subjected to column chromatography on activated carbon (20 J2).
  • the 8% iso-butanol eluate (81J2) was subjected to column chromatography on Amberlite IR-68 (C1 type),
  • the eluate (54 ⁇ ) was again subjected to column chromatography on activated carbon (10J2), and the antibiotic was eluted with 8% aqueous isobutanol.
  • the eluate (80) is concentrated under reduced pressure, and the concentrated solution (5 £) is reduced to ⁇ 4.5, followed by 2% tree ⁇ 1-year-old octylmethylammonium chloride ⁇ nomethylene chloride solution (2.5J2 X 2).
  • the extract was treated with a 1.6% sodium iodide solution to transfer the antibiotic to the aqueous layer, and the transferred solution was concentrated.
  • the concentrate (1.5J2) was desalted by chromatography on activated carbon (0.5J2), and the eluate was concentrated.
  • the concentrated solution was subjected to column chromatography with QA II-Sephade's Sox (C1 type) 200 mJ2.
  • the fraction was eluted with 0.03M saline to obtain an active fraction (1.3J2).
  • the active fraction was desalted by chromatography on activated carbon (500 mJ2), and the eluate was concentrated and lyophilized to obtain a white powder of TAN-588 (3.56 g).
  • One-sided extraction Since approximately 50% of the antibiotic remained in the wastewater layer, the aqueous layer (5 was subjected to column chromatography with QAE-Sephadex (Type C1) 1J2.
  • the antibiotic was treated with Q.03M and 0.05M NaCl.
  • the column was eluted with water, and the eluate was subjected to activated carbon (column chromatography on column 2).
  • the salt-removed solution (22) was again added to a 2% tri-n-octylmethylammonium chloride.
  • the extract was treated with a sodium iodide solution and subjected to a step of desalting activated carbon to obtain a white powder of TAN-588 sodium salt (3.18 g).
  • 2J2 medium containing 500 mJ2 of 422 strain (IF 0 14384, FE RM BP-698) containing 2% glucose, 3% soluble starch, 1% raw soy flour, and 0.5% polypeptone (uncorrected PH) , And cultured with reciprocal shaking at 24 ° C for 48 hours.
  • the entire amount of this culture solution was inoculated into a 200 J2 tank containing 120 J2 of the above medium supplemented with 0.05% of the antifoaming agent Actcol, and aerated at 120 ° C / 180 rpm at 28 ° C under an aeration rate of 120 £ / min. Cultured for 48 hours.
  • This culture solution 1202 was added to an aqueous solution containing 3% dextrin, 3% raw soy flour, and 0.2% polybeptone (uncorrected PH), containing 4000% of culture medium and containing 4000 pounds. And incubated at 22 ° C for 66 hours under the conditions of aeration of 4000 J2 / min and 120 revolutions of Z minutes.
  • the culture solution thus obtained was filtered using Hyflo ⁇ Supercell (manufactured by Jones Manville, USA).
  • the filtrate (4360J2) was subjected to column chromatography using Amberlite IRA-402 (C1 type) 400J2.
  • Antibiotics were eluted with 2% saline (2000 ⁇ ), and the eluate was subjected to column chromatography on activated carbon (160J2).
  • the 8% isobutanol eluate (640J2) was applied to Amberlite IRA-68 (C1 type) column chromatography. Eluted with 1% saline.
  • the eluate (200 J2) was again subjected to column chromatography on activated carbon (80 J2), and the antibiotic was eluted with 8% isobutanol in water.
  • the eluate (400 fi :) was concentrated under reduced pressure.
  • the concentrate was freeze-dried, and acetone was added to the freeze-dried product to obtain a sodium salt of TAN-588 (620 g) as a precipitate.
  • This powder was found to contain 57% TAN-588 sodium salt by HP LC analysis.
  • the powder (5 g) thus obtained was dissolved in water and subjected to QAE-Sephadex (C1 type) 200 mJe column chromatography.
  • the fraction was eluted with 0.03M saline to obtain an active fraction (1.2J2).
  • the active fraction was desalted by means of activated carbon (500J2 :) chromatography, and the eluate was concentrated and lyophilized to obtain a white powder of TAN-588 (2.50 g
  • the purified TAN-588 powder was obtained from the TAN obtained in Example 1 by the Rf value of TLC, the Rt value of HPLC, IR, UV, CD and NMR spectrum and antibacterial spectrum. — Same as 588 sodium salt.
  • TAN-588 sodium salt 400 mg was dissolved in DMF (4 m), triethylamine (100 parts, paranitrobenzyl bromide (800 mg)) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours.
  • An acid buffer pH6.3.50m was added to the mixture, and ethyl acetate was extracted twice (50m. The extract was washed with water and concentrated. The oily substance obtained was powdered with ethyl acetate-petroleum benzine (507mg).
  • Example ⁇ Benzophenonhydrazone 58.8 g, 1,1,3,3-tetramethylguanidine 42rd, iodine 50 mg was dissolved in CH 2 C 1 2 500 m. After cooling the mixture to 0 ° (: — — 5 ° C, 74 g of m-chloroperbenzoic acid (70% purity) was added, and the mixture was stirred at 0 ° C for 40 minutes. The reaction solution was washed with water and dried over sodium sulfate. Then, the solvent was distilled off to obtain diphenyldiazomethane.
  • the cells were cultured under the conditions for 48 hours. This culture solution 6 ⁇ was added to an aqueous solution ( ⁇ 6.5) containing dextrin 3%, raw soy flour 1.5%, corn gluten meal 1.5%, polybuton 0.2%, sodium thiosulfate 0.1%.
  • the seeds were inoculated in a tank with a capacity of 2002 containing 120 J2 of medium supplemented with 0.05% per well and cultured at 17 C for 24 hours under the conditions of aeration of 20 QJ2 and 150 rpm.
  • the obtained medium contains N-deacetate of TAN-588 (mixture of A-type and B-type).
  • LC-Bio using C-141 as a test bacterium It was confirmed by the autograph method.
  • the total amount of this culture solution was inoculated into a tank having a capacity of 50 J2 containing 30 J2 of the above medium to which 0.05% of the antifoaming agent Actcol was added, and the aeration rate at 24 ° C was 50 J2 / min.
  • the culture was performed for 48 hours under the conditions of rotation.
  • This culture solution 6 J2 was mixed with dextrin 3%, raw soy flour 1.5%, corn and Dalten 'meal 1.5%, An aqueous solution (PH6.5) containing 0.2% of polypeptone and 0.1% of sodium thiosulfate was inoculated into a 20Q £ tank containing a medium 120J2 containing 0.05% of actcol, and aerated at 200 ° C at 17 ° C. Cultivated for 24 hours under conditions of £ min and 150 min Z.
  • the obtained medium contains the N-deacetyl derivative of TAN-588 (mixture of A-type and B-type). —Confirmed by one method of bioautography.
  • a strain of acinopactor 'SP YK-504 (1 F 0 14420, FE RM BP- 709) grown on a nutrient agar slope was prepared using glucose 2%, soluble starch 3%, raw soy flour 1%, poly ⁇ Inoculate a 2 J2 volumetric flask containing 500 ml of a medium containing 0.5% sedimentable calcium carbonate in an aqueous solution (PH 7.0) containing 0.5% ptone and 0.3% salt, and incubate at 24 ° C. The cells were cultivated with reciprocal shaking for hours.
  • This culture solution was inoculated into a tank with a volume of 5 O J2 containing 30 J2 containing the above-mentioned medium supplemented with 0.05% of antifoaming agent, and the aeration volume at 24 ° C was 50 J2 min.
  • the culture was performed for 48 hours under the conditions of 200 rpm and Z minutes.
  • Hyflo supercell was added to the culture solution, and the mixture was filtered to obtain a filtrate (100 L).
  • the filtrate was adjusted to ⁇ 5, subjected to column chromatography using Amberlite I18-402 ( ⁇ 1-type, 10 J2), washed with water and eluted with 2% saline (509.). .
  • the eluate contained TAN-588 at a concentration of 32 g / ml.
  • the passing solution (100J2) was subjected to column chromatography on Dowex 50 WX 2 CH + , 102) to adsorb the N-deacetyl compound of TAN-588.
  • Example 13 Lysopattor grown on nutrient agar slope '' Arbus sp. Nov. Y
  • K-422 (IF 0 14384, FE RM BP-698) strain was converted to an aqueous solution containing 2% glucose, 3% solvable starch, 1% raw soybean, 1% polypeptone, 0.3% salt and 0.3% salt (PH7.0)
  • the mixture was inoculated into a 2J2 volume flask containing 500 ml of a medium to which 0.5% of sedimentable calcium carbonate was added, and cultured with reciprocal shaking at 24 for 48 hours.
  • the entire amount of this culture was inoculated into a 50 J2 tank containing 30 £ of medium containing the above-mentioned medium supplemented with 0.05% of the antifoaming agent Actcol.
  • the cells were cultured for 48 hours under the same conditions.
  • a strain of Acinetobacter sp. YK-504 (1 FO 14420, FERM BP- 709) grown on a nutrient agar slope was prepared using glucose 2%, Soluble starch 3%, raw soy flour 1%, polypeptone 0.5%. Inoculate a 2J2 volumetric flask containing 50 Qml of a medium containing 0.5% of sedimentary carbon dioxide in an aqueous solution (pH 7.0) containing 3% salt, and shake back and forth at 2'4 ° C for 48 hours. Cultured.
  • aqueous solution containing 3% of dextrin 3%, raw soybean meal 5%, corn ⁇ ⁇ gluten 'meal 1.5%, polypeptone 0.2%, sodium thiosulfate 0.1% PH6.5 was inoculated into a 200-pound tank containing a medium 120 ⁇ supplemented with 0.05% of actcol, and mixed at 24 ° C for 24 hours under the conditions of aeration of 20 minutes and 150 rpm. After culturing, the temperature was changed to 20 ° C., and mixed culture was further performed for 42 hours.
  • the obtained medium contains the N-deacetyl form of TAN-588 (mixture of A-type and B-type), indicating that TLC using Pseudomonas aeruginosa C-1 as a test bacterium. It was confirmed by one method of bioautography.
  • the antibiotic TAN-588, its para-nitrobenzene or benzhydryl ester form, or their N-deacetyl form or salts thereof have antibacterial activity against Gram-positive and negative bacteria, It can be used as a therapeutic agent for bacterial infections such as poultry.

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Abstract

An antibiotic, TAN-588, produced by bacteria belonging to genus Empedobacter or Rhizobacter, p-nitrobenzyl or benzhydryl ester thereof, and N-deacetyl derivative thereof or its salts have an antibacterial effect on gram-positive and gram-negative bacteria, and can be used as agents for treating bacteria-induced diseases of mammals and fowls.

Description

明 細 書  Specification
抗生物質，その製造法および微生物  Antibiotics, their production and microorganisms
技術分野 , Technical field ,
本発明は、 抗菌剤などとして有用な新規抗生物質，その製造法および その製造に用いることのできる微生物に関する。  The present invention relates to a novel antibiotic useful as an antibacterial agent, a method for producing the same, and a microorganism that can be used for the production.
背景技術 Background art
従来パクテリァが産生する細胞壁合成阻害作用を示す抗生物質として、 スルファゼシンおよびイソスルファゼシンが知られており（N ature, 289巻， 590~591 頁， .1981年）、 その後、 S Q 26180, 26700, 26823, 26875, 26970, 26812 なども発見されている（Nature, 291巻， 489〜 Conventionally, sulfazesins and isosulfazecins are known as antibiotics produced by pacteria and exhibiting an inhibitory effect on cell wall synthesis (Nature, Vol. 289, 590-591, .1981). Thereafter, SQ 26180, 26700 , 26823, 26875, 26970, 26812, etc. (Nature, vol.291, 489-
491頁， 1981 年）。これらは主としてグラム陰性菌に対して抗菌性を示す 抗生物質として知られている。 また、 最近 S Q 28332, 28502, 28503 などの報告も見られる（J. Antibiotics, 36巻， 1245〜1251頁，' 1252〜 1257頁， 1983 年）。 491, 1981). These are mainly known as antibiotics that have antibacterial properties against Gram-negative bacteria. Recently, reports such as SQ 28332, 28502, 28503 have also been reported (J. Antibiotics, 36, 1245-1251, '1252-1257, 1983).
発明の開示 ' DISCLOSURE OF THE INVENTION ''
本発明者らは、 新規な抗生物質の探索を目的として多数の微生物を土 壌より分離し、 その産生する抗生物質を探索したところ、 ある種の微生 物が新規な抗生物質を産生すること、 該微生物がェンぺドバクター属ぉ よびリゾバクター属に属する新菌種であること、 該微生物を適宜の培地 に培養することによってグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌に対して 抗菌力を示す抗生物質を培地中に蓄積しうることなどを知り、 この抗生 物質を単離し、 その物理化学的および生物学的諸性質から、 当該抗生物 質が新規な抗生物質であることを確かめ、 これを抗生物質 T A N一 588 と称することにした。  The present inventors isolated a large number of microorganisms from soil for the purpose of searching for new antibiotics, and searched for antibiotics produced by the microorganisms.As a result, it was found that certain microorganisms produce new antibiotics. The microorganism is a new species belonging to the genus Endobacter and the genus Rhizobacter, and by culturing the microorganism in an appropriate medium, an antibiotic exhibiting antibacterial activity against Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria can be obtained. Knowing that it can accumulate in the medium, etc., isolate this antibiotic, confirm from its physicochemical and biological properties that the antibiotic is a novel antibiotic, I decided to call it 588.
本発明者らは、 また、 上記抗生物質 T AN - 588が分子中に N—ァセ チル基およびカルボキシ基を有すること、 該ァセチル基を脱離すること ができることを見い出した。 The present inventors have also found that the above-mentioned antibiotic TAN-588 has an N-acetyl group and a carboxy group in the molecule, and that the acetyl group is eliminated. I found that I could do it.
さらに、 本発明者らは、 ェンぺドパクター属菌およびリゾパクター属 菌が、 上記抗生物質 T AN- 588の N-デァセチル体を生成蓄積させ得 ること、 ァシネトパクター属菌と、 上記抗生物質 T AN— 588および Z またはその N—デァセチル体を生産する能力を有するェンぺドバクタ一 属菌またはリゾパクター属菌とを混合培養することにより、 抗生物質で AN— 588の N—デァセチル体を、 混合培養しない場合より多量に生成 蓄積せしめることができることを見い出した。  Furthermore, the present inventors have found that the bacteria of the genus Endopactor and the lysobacterium are capable of producing and accumulating the N-deacetyl body of the above-mentioned antibiotic TAN-588. — A mixed culture of Endobacter bacteria or Rhizobacter bacteria having the ability to produce 588 and Z or its N-deacetyl compound, and a mixed culture of AN-588 N-deacetyl compound with antibiotics It was found that a larger amount could be produced and accumulated than without.
本発明者らは、 これらの知見に基づいてさらに研究した結果、 本発明 を完成した。  The present inventors have further studied based on these findings and completed the present invention.
本発明は、 （1 )、 抗生物質 T AN— 588,そのパラニトロべンジルもし くはベンツヒ ドリルエステル体，またはこれらの N—デァセチル体また はそれらの塩，  The present invention relates to (1) an antibiotic TAN-588, a paranitrobenzyl or benzhydryl ester thereof, or an N-deacetyl derivative thereof or a salt thereof;
(2)、 ェンぺドバクタ—属またはリゾパクタ一属に属し抗生物質 T AN — 588および/またはその N—デァセチル体を生産する能力を有する微 生物を培地に培養し、 培養物中に抗生物質 T AN— 588および または その N—デァセチル体を生成蓄積せしめ、 これを採取することを特徵と する抗生物質 T AN— 588および/またはその N—デァセチル体または その（それらの）塩の製造法，  (2) cultivating a microorganism belonging to the genus Endobacter to the genus Rhizopactor and having the ability to produce the antibiotic TAN-588 and / or its N-deacetyl compound in a culture medium; A method for producing and accumulating T AN-588 and / or its N-decetyl form and collecting the T AN-588 and / or its N-decetyl form or a salt thereof,
(3)、 D NAの G C (グァニン +シ ト シン）含量が 70%をこえるェンぺ ド パクター · ラクタムゲヌス， (3) the DNA (GC + guanine + cytosine) content of DNA exceeds 70%;
(4)、 白色のコロニーを形成し、 0— F (ォキシダティブーフアーメ ン タティブ）テストが非分解型でかつ無機窒素源の資化性を有さないリゾ パクター · アルブス，  (4) Rhizopater albus, which forms a white colony and whose 0-F (oxidative-fantative) test is non-degradable and has no assimilation of inorganic nitrogen sources,
(5)、 抗生物質 TAN— 588またはその塩を脱ァセチル化することを特 徵とする抗生物質 T A — 588の N—デァセチル体またはその塩の製造 法， (5) Production of the N-deacetyl derivative of the antibiotic TA-588 or a salt thereof, which is characterized by deacetylating the antibiotic TAN-588 or a salt thereof. Law,
(6)、 抗生物質 T AN— 588またはその塩にベンツヒ ドリル基を導入し 得る化合物を反応させ、 抗生物質 T AN— 588のベンツヒ ドリルエステ ル体とし、 次いでこれを脱ァセチル化反応に付すことを特徵とする抗生 物質 T AN— 588の N—デァセチル体のベンツヒ ドリルエステル体の製 造法，およぴ  (6) reacting a compound capable of introducing a benzhydryl group with the antibiotic TAN-588 or a salt thereof to form a benzhydryl ester of the antibiotic TAN-588, and then subjecting the compound to a deacetylation reaction For producing benzhydryl ester of N-decetyl form of TAN-588, an antibiotic characterized by
(7)、 ェンぺドパクター属またはリゾパクター属に属し抗生物質 TAN 一 588およぴノまたはその N—デァセチル体を生産する能力を有する微 生物と、 該微生物と混合培養することにより該微生物に抗生物質 T AN 一 588の N—デァセチル体を蓄積させる能力を有するァシネ トパクター 属に属する微生物とを培地に混合培養 、 培養物中に、 抗生物質 TAN 一 588の N—デァセチル体を生成蓄積せしめ、 これを採取することを特 徵とする抗生物質 A N— 588の N—デァセチル体またはその塩の製造 法である。  (7) a microorganism belonging to the genus Endopactor or Rhizobacter and having the ability to produce the antibiotics TAN-588 and TN or the N-deacetyl compound thereof; and A microorganism belonging to the genus Acinetobacter having the ability to accumulate the N-deacetyl derivative of the antibiotic TAN-588 is mixedly cultured in a medium, and the N-deacetyl derivative of the antibiotic TAN-588 is produced and accumulated in the culture. This is a method for producing an N-deacetyl derivative of the antibiotic AN-588 or a salt thereof, which is characterized by collecting the same.
なお、 本明細書においては抗生物質 T AN - 588を単に「T AN— 588」 と称することもある。  In the present specification, the antibiotic TAN-588 may be simply referred to as “TAN-588”.
本発明方法で使用される抗生物質 A N一 588およびノまたはその ヽ'ーデァセチル体の生産菌としては、 ェンぺドパクター（Empedobacter) 属またはリゾバクタ—（L ysobacter)属に属し、 抗生物質 T A ― 588 および またはその N—デァセチル体を産生する能力を有するものであ れば如何なる微生物でもよい。 ェンぺドバクタ—属に属する生産菌の例 としては、 たとえば新菌種ェンぺドバクタ一 · ラクタムゲヌス （Emped obacter lactamgenus)があげられる。 その具体例としては、 本発明者 らが日本国島根県益田巿の土壌より採取したェンぺドパクター ♦ ラクタ ムゲヌス YK— 258株 （以下、 「Y K— 258株」と称することもある。）が あげられる。 Y — 258株の菌学的性状は下記のとおりである。 The antibiotic AN-588 used in the method of the present invention and the bacterium that produces no or its ヽ '-deacetyl derivative belong to the genus Empedobacter or Lysobacter, and the antibiotic TA-588. And / or any microorganism having an ability to produce its N-deacetyl derivative. As an example of a production bacterium belonging to the genus Endobacter, there is, for example, a new bacterium species Emped bacterium lactamgenus. A specific example thereof is the endpactor ♦ Lacta mugenus strain YK-258 (hereinafter sometimes referred to as “YK-258 strain”) collected from the soil of Masuda 島, Shimane Prefecture, Japan by the present inventors. can give. The mycological properties of the Y-258 strain are as follows.
(a)形 態  (a) Form
肉汁寒天斜面上で 24 C , 5 日間培養後の観察では、 細胞は直怪 0 . 4〜 0 . 6 z m ,長さ 2 . 0〜3 . 0 mの長椁状で、 12〜30 mのフィラメ ント状を呈 することもある。 鞭毛は認められず、 運動性も認められない。 胞子を形 成せず、 またグラム染色は陰性で、 抗酸性を示さない。  Observation after culture at 24 C for 5 days on the gravy agar slope revealed that the cells had a length of 0.4-0.6 zm, 2.0-3.0 m in length, and 12-30 m in length. It may have a filamentous shape. There are no flagella and no motility. It does not form spores and has a negative Gram stain, indicating no acid resistance.
0 各種培地上での生育状態 0 Growth on various media
24°Cで培養し、 1 ないし U日間にわたって観察した。  The cells were cultured at 24 ° C and observed for 1 to U days.
①肉汁寒天平扳培養：コロニ-は半透明なうす黄色で、 円形、 表面は 頭状、 周縁は全緣状である。 拡散性色素は生成しない。  (1) Broth agar flat culture: The colony is translucent, light yellow, circular, head-shaped, and rim-shaped. No diffusible dye is formed.
②肉汁寒天斜面培養：良好な拡布状の生育を示し、 淡黄色な!/、しこは く色を呈する。  ② Gravy agar slant culture: Shows good spread-like growth and shows pale yellow! /, Amber color.
③肉汁液体培養：混蜀状に生育し、 沈澱を生じ、 菌膜を形成する。 ③ Liquid broth culture: Grows in a mixed state, precipitates, and forms a pellicle.
④肉汁ゼラチン穿刺培養：主として上部で生育し、 噴火口状に液化す る。 液化活性は比较的弱い。 (4) Juice gelatin stab culture: Grows mainly in the upper part and liquefies like a crater. Liquefaction activity is relatively weak.
ø リ トマス · ミルク：リ トマスの還元、 ペプトン化および凝固 L、ずれ の活性も認められない- (c)生理的性質 ø Litmus · Milk: No activity of litmus reduction, peptonization and coagulation L, slippage is observed-(c) Physiological properties
①硝酸塩の還元： - ②脱窒反応：一  ① Nitrate reduction:-② Denitrification reaction: 1
③ M R (メチルレツ ド）テス ト：一  ③ M R (methyl red) test: 1
④ V P (フォーゲス ♦ プロス力ゥエル）テス ト：一  ④ V P (Forges ♦ Pros Power)
⑤ィン ド―ルの生成：一  Generating a Pin Doll: One
⑥硫化水素の生成（T S I寒天および詐酸鉛紙）： - ⑦デンプンの加水分解：一  水 素 Production of hydrogen sulfide (TS I agar and lead acid paper):-⑦Hydrolysis of starch: 1
⑧久 ン酸の利用 （コーゼル，ク リステンセンおよびシモンズの各培 地）：十 Utilization of Hisanoic acid (Kosel, Christensen and Simmons cultures) Ground): Ten
⑨無機窒素源の利用  利用 Use of inorganic nitrogen sources
i )硝酸力リウム：一  i) Potassium nitrate: one
ii )硫酸アンモニゥム：—  ii) Ammonium sulfate: —
⑩色素の生成（キング Α,Βおよびマンニッ ト酵母エキス寒天の各培地） ⑩Dye formation (King Α, Β and Mannit yeast extract agar media)
：拡散性色素の生成は認められない。 : No diffusible dye was formed.
⑪ゥレア—ゼ：一  ⑪ ゥ Lease: One
©ォキシダーゼ： τ  © Oxidase: τ
®力タラーゼ：一  ® Power Tarase: One
⑭生育の範囲  ⑭Range of growth
i )ρΗ:ρΗ 5.4〜8.5で生育するが、 最適 ρΗは 5.8〜 6.6。 - 培地：ダルコ—ス 0.1%，ィース トエキス トラク ト 0.01% ,硫酸ァン 乇ニゥム 0.1% ,食塩 0.1% , 硫酸マグネシウム （7水塩） 0.05% ,リ ン酸バッファー Q.1M (別滅菌）。  i) ρΗ: Grows at ρΗ 5.4 to 8.5, but the optimal ρΗ is 5.8 to 6.6. -Medium: 0.1% Darcose, 0.01% yeast extract, 0.1% vanadium sulfate, 0.1% salt, 0.05% magnesium sulfate (7-hydrate), phosphate buffer Q.1M (separate sterilization).
)温度： 2Q〜32°Cで生育するが最適温度は 24~31° (：。  ) Temperature: Growing at 2Q ~ 32 ° C, but the optimal temperature is 24 ~ 31 ° (:.
培地：肉汁液体培地。  Medium: broth liquid medium.
©酸孝に対する態度：好気的  © Attitude toward Xiao Xiao: Aerobic
'© 0 _ F (ォキシダティブーフアーメ ンタティブ）テス ト [ヒュ一 · レ ィフソ ン（H gh * L eifson)法::非分解型。  '© 0 _ F (oxidative-proof) test [Hugh * Leifson] method :: non-decomposed type.
©镨からの酸，ガスの生成および利用性： 酸 ガ ス 利用性 © Generation and utilization of acid and gas from 镨: Acid gas availability
(ぺプトン水) (ぺプト ン水）（デービス培地） (Peptone water) (Peptone water) (Davis medium)
Lーァラビノ ース L-arabinose
D—キシロース  D—Xylose
D一グルコ ース  D-glucose
D—マンノ 一ス  D—Manno
D—フラ ク ト ース  D—Fructose
D—ガラク ト 一ス  D—galactose
麦 芽 糖  Malt sugar
シ ョ 糖  Sucrose
乳 耱  Breasts
ト レノヽロ ース  Trendy Rose
D—ソルビッ ト  D—Sorbit
D—マンニツ ト  D—Mannit
イノ シッ 卜  Ino Sit
グリ セリ ン  Glycerin
デ ン プ ン  Starch
⑱ D X AO G C (グァニン— シ ト シ ン）含量： 74.4%亡 1.5%(Tm法） ⑩多糖の分解能： ⑱ D X AO G C (guanine-cytosine) content: 74.4%, 1.5% (Tm method) ⑩ Polysaccharide resolution:
カルボキシメチルセゾレロ —ス：二  Carboxymethylsezorero
コロイダルキチン：  Colloidal chitin:
アルギン酸ナ ト リ ウム：一  Sodium alginate: one
®ァクチノマイシンに対する感受性：耐性  ®actinomycin sensitivity: resistance
以上の菌学的性状を有する YK— 258株を、バージ―ズ · マニュアル デタ一 ミ ネィティフ · 'くクテリオロジー (B ergey' s Mannじ al of Determinative B acteriology) 第 8版およびインターナショナル · ジャーナル ' ォブ ' システマティック ·バクテリオロジ一 The YK-258 strain having the above mycological properties was prepared by using the Verges Manual, Minuteif, and Bergey's Mann et al. Determinative B acteriology) Eighth Edition and International Journal 'OB' Systematic Bacteriology
(International Journal of Systematic B acteriology)第 30巻 225~420頁 （1980年）、 同第 32巻 146〜 U9頁（1982年）に記載の種と照合 すると、 淡黄色のグラム陰性桿菌で、 運動性を有さず、 好気的で、 糖か らの酸，ガスの生成能がなく、 D N Aの G C含量が高いことから、 フラ ボバクテリゥム属に属するとするのが妥当である。 しかし、 これまでに 記載されたフラボパクテリゥム属の菌種は異質な種が混在していること が細菌分類学の見地から指摘されてきており、 近年、 フラボバクテリ ウ ム属の定義の修正がィンタ—ナショナル♦ ジャーナル . ォブ · システマ ティッ ク ·バクテリオロジ—第 29巻、 416〜426頁（1979年）でおこなわれ た。 当該文献およびァニュアル♦ レビュー ' ォブ ' マイクロバイオ口ジ - (Annual Review of MicrobioLogy)37巻， 233〜252頁（1983年）に よれば、 YK— 258株はフラボバクテリゥム属より も、 むしろェンぺド パクター属に属するとした方がより妥当である。 しかし、 D NAの G C 含量が 70%を越える値を示ォ種の記載':ま見当らない。 そこで YK— 25 8株は、 斩菌種に属する株であると認め、 該新菌種をニンべドバク夕一 * ラクタムゲヌス (E mpedobacter iactamgen s)と命名し," (International Journal of Systematic B acteriology) Vol. 30, pp. 225-420 (1980), compared with the species described in Vol. 32, pp. 146-U9 (1982). It is appropriate to belong to the genus Flavobacterium because it is aerobic, has no ability to generate acid and gas from sugar, and has a high GC content of DNA. However, it has been pointed out from the viewpoint of bacterial taxonomy that the species of the genus Flavobacterium described so far are heterogeneous, and in recent years the definition of the genus Flavobacterium has been revised. International ♦ Journal of the Systematic Bacteriology, Vol. 29, pp. 416-426 (1979). ♦ Review According to the “Review of MicrobioLogy”, Vol. 37, pp. 233-252 (1983), the YK-258 strain is more likely to be used than the genus Flavobacterium. It is more appropriate to attribute it to the genus Endopactor. However, the GC content of the DNA exceeds 70%. Therefore, the YK-258 strain was identified as belonging to the 斩 strain, and the new strain was named as Ninbedaku Yuichi * Empedobacter iactamgens.
上記ェンぺドバク夕— ♦ ラクタムゲヌス Y K— 258株:ま昭和 59年 (1984年） 2月 20日に財団法人発酵研究所（ I F 0 ,日本国大阪府大阪市淀 上 記 Lactamgenus YK— 258 strains: Fermentation Research Institute (IF 0, Yodo, Osaka, Japan) on February 20, 1984
Ml区十三本町 2丁目 17番 85号）に I F 0 14322として寄託されている。 また本微生物は、 昭和 59年（1984年） 3月 26日に日本国通商産業省工業技 術院微生物工業技術研究所（F R I ，日本国茨城県筑波郡谷田部町東 1丁 目 1番 3号）に受託番号 F E P— 7558として寄託され、 該寄 ΐ乇は ブタペスト条約による寄 Ϊ乇に切換えられて F E RM B P— 699としてIt has been deposited as IF 0 14322 in Jusanhoncho 2-chome 17-17, Ml-ku. In addition, this microorganism was released on March 26, 1984 by the Ministry of International Trade and Industry, Japan, at the Institute of Microbial Engineering (FRI, 1-3-1 Higashi, Yatabe-cho, Tsukuba-gun, Ibaraki, Japan). Deposit No. FEP-7558, which has been converted to a deposit under the Budapest Treaty and has been deposited as FE RM BP-699.
F R I に保管されている。 本発明方法で使用されるリゾパクター属に属する抗生物質 T AN—Stored at FRI. Antibiotic T AN— belonging to the genus Lysobacter used in the method of the present invention
588および またはその N—デァセチル体の生産菌の例としては、 たと えば新菌種リゾパクター · アルブス（Lysobacter albus)があげられる。 その具体例としては、 本発明者らが日本国滋賀県神崎郡の土壌より採取 したリゾバクタ— . アルブス sp. nov. YK— 422株（以下、 「YK— 422株」と略称することもある。 ）があげられる。 Examples of bacteria producing 588 and / or its N-deacetyl form include Lysobacter albus, a new strain. As a specific example, the present inventors may abbreviate Rhizobacta. Arbus sp. Nov. YK-422 strain (hereinafter referred to as "YK-422 strain") collected from soil in Kanzaki-gun, Shiga Prefecture, Japan. ).
Υ Κ一 422抹の菌学的性状は下記のとおりである。  The mycological properties of 422 are as follows.
(a)形 態 (a) Form
肉汁液体培養で 24°C, 2 日間培養後の観察では、 細胞は直怪 0.4〜0.7 m,長さ 2.0~4.4〃 mの長捍伏で、 20~ 30 mのフィラメ ン ト伏を呈する こともある。 鞭毛は認めらず、 運動性も認めらない。 胞子またはミ クロ シストを形成せず、 またグラム染色は陰性で、 抗酸性を示さない。  Observation after 2 days of culture at 24 ° C in broth liquid culture, the cells should be 0.4 to 0.7 m in length, 2.0 to 4.4 m in length, and 20 to 30 m in filament length. There is also. No flagella, no motility. It does not form spores or microcysts and has a negative Gram stain, indicating no acid resistance.
ひ）各種培地上での成育状態 H) Growth on various media
24てで培養し、 1 ないし 14日間にわたって観察した。  They were cultured for 24 days and observed for 1 to 14 days.
①肉汁寒天平板培養：コロニ-は半透明な白色で、 円形、 表面は凸円 状、周緣は全緣伏でムコィダルな生育を示す。拡散性色素は生成しない。 (1) Gravy agar plate culture: The colony is translucent white, circular, the surface is convex, and the circumference is all-round, showing mucoidal growth. No diffusible dye is formed.
②肉汁寒天斜面培養：良好な糸状の生育を示し、 白色を呈する-② Gravy agar slant culture: shows good filamentous growth and exhibits white color-
③肉汁液体培養：うすく混蜀状に生育し、 少量の沈澱を生じ、 弱い菌 環を形成する。 (3) Broth liquid culture: grows in a lightly mixed state, forms a small amount of precipitate, and forms a weak bacterial ring.
④肉汁ゼラチン穿刺培養：上部で生育し、 層状に液化する。 液化活性 は比铰的強い。  ④ Nuts gelatin stab culture: grows on top and liquefies in layers. Liquefaction activity is relatively strong.
⑤リ トマス . ミ ルク：リ トマスの還元、 ペプトン化が認められるが凝 固は認められない。  ⑤Litmus. Milk: Reduction of litmus and peptone formation are observed, but no solidification is observed.
⑥乾燥酵母平板：コロニー周辺に溶菌円を形成し、 グライディングに よる運動性を示す。  (4) Dried yeast plate: A lysis circle is formed around the colony, and it shows mobility due to gliding.
(c)生理的性質 ①硝酸塩の還元： -(c) Physiological properties ① Reduction of nitrate:-
②脱窒反応： -② Denitrification reaction:-
③ MR (メチルレッ ド）テス ト：一 ③ MR (methyl red) test: 1
④ V P (フォ—ゲス · プロスカウエル）テス ト：一  ④ V P (Forges Proscowell) Test: One
⑤ィン ドールの生成：一  Generation of Pin Doll: One
—⑥硫化水素の生成（T S I寒天および酢酸鉛紙）：一  —⑥Production of hydrogen sulfide (TS I agar and lead acetate paper): 1
⑦デンプンの '加水分解：一  'Hydrolysis of starch: one
⑧クェン酸の利用（ク リステンセンおよびシモンズの各培地）： + ⑧ Utilization of citrate (Christensen and Simmons medium): +
⑨無機窒素源の利用 利用 Use of inorganic nitrogen sources
i )硝酸カ リ ウム：—  i) Ca nitrate: —
ϋ：)硫酸ァンモニゥム：—  ϋ:) Sulfuric acid: —
⑩色素の生成（キング Α,Βおよびマンニッ ト酵母エキス寒天の各培地） ：拡散性色素の生成は認めらない。 .  ⑩Dye formation (King I and II and Mannit yeast extract agar medium): No diffusible dye is formed. .
⑪ゥレア一ゼ：一  ⑪ ゥ rare one: one
@ォキシダーゼ：一 '  @ Oxidase: one '
®力タラ—ゼ：一  ® Power tara: one
®生育 範囲  ® Growth range
i )ΡΗ :ΡΗ4.6〜8·2で生育するが、 最適 ρΗ:ま 6.3〜7.9。  i) ΡΗ: Grows at 4.6-8.2, but optimal ρΗ: 6.3-7.9.
培地：ダルコース 0.1%,ィース トエキス トラク ト 0.01% ,硫酸ァ ンモニゥム 0.1% ,食塩 0.1% ,硫酸マグネシゥム（7水塩） Medium: Dulcose 0.1%, yeast extract 0.01%, ammonium sulfate 0.1%, salt 0.1%, magnesium sulfate (7-hydrate)
0.05%。 ρΗ':ま苛性ソ一ダまたは硫酸で調節。 0.05%. ρΗ ': Adjusted with caustic soda or sulfuric acid.
ϋ )温度： U〜32°Cで生育するが最適温度は 2i〜28て。  ϋ) Temperature: It grows at U ~ 32 ° C, but the optimal temperature is 2i ~ 28.
培地：肉汁液体培地。  Medium: broth liquid medium.
©酸素に対する態度：好気的  © Attitude to oxygen: aerobic
® 0— F (ォキシダティブーファ一メ ンタティブ）テス トこヒュ一 ' レ ィフソ ン（H gh · L eifson)法：：非分解型。 ⑰糖からの酸，ガスの生成および利用性 ® 0—F (oxidative-fundamental) test This method is the non-decomposable type (H gh · Leifson) method. 酸 Generation and utilization of acid and gas from sugar
酸 ガス 利用性 Acid gas availability
(ぺプトン水）（ぺプトン水）（デービス培地）(Peptone water) (Peptone water) (Davis medium)
Lーァラビノ ース ― ― 土L-arabinose ― ― Sat
D—キシ口一ス D—Kiss mouth
D -グルコース — 一 -μ D-glucose—one-μ
D—マンノ ース D—Mannose
D—フラク トース  D—Fructose
D—ガラク トース  D—Galactoose
麦 芽 糖 Malt sugar
シ ョ 糖 Sucrose
乳 糖 Lactose
ト レハロース  Trehalose
D -ソルビッ ト  D-Sorbit
D—マンニヅ ト D—Mannite
イノ シ 'ソ 卜 Wild boar
グリセリ ン Glycerin
デンプン Starch
⑬ D Ν Αの G C (グァニン シ ト シン）含量： 70.2%二 1.5% (Tin法） ⑲多耱の分解能： ⑬ D Ν G GC (guanine cytosine) content: 70.2 %% 1.5% (Tin method) ⑲Multiple resolution:
カルボキシメチルセルロース：  Carboxymethyl cellulose:
コロイダルキチン：  Colloidal chitin:
アルギン酸ナ ト リ ウム：士  Sodium alginate:
以上の菌学的性状を有する YK— 422株を、バ—ジ―ズ · マニュアル ォブ . デター ミ ネイティブ ' バクテリオロジ一 第 8版及びィ ンタ一 ナシ ョナル ' ジャーナル · ォブ . システマティ ッ ク · パ 'クテリオ σジ一 第 30巻 225〜420頁（1980年）、 同第 32巻 U6〜149頁（1982年）および当該 文献のバリデ—シヨ ン ♦ リス トに記載の種と照合すると、 ムコィダルな 成育を示すグラム陰性桿菌で、 一部フィラメ ント状の菌も認められグラ イデイングによる運動性を示し、 コロイダルキチンおよび乾燥酵母の分 解能を有し、 ミ クロシス 卜を形成せず、 D N Aの G C含量が高いことか ら、 リゾバクタ一属に属するとするのが妥当である。 しかし、 これまで に記載されたリゾパクター属の菌種（ィンタ—ナショナル ' ジャーナル ' ォブ ' システマティ ッ ク 'パクテリォロジー第 28卷、 367〜393頁 97 8年））とは、 0 Fテストが非分解型であること、 コロニーに何ら明瞭な 色調を有さないこと、 無機窒素源の資化性を有さないなどの点で異なつ ていた。 そこで Y K— 422珠は、 新菌種に属する株であると認め、 該新 菌種をリ ゾバクタ— ' アルブス（L ysobac t er a l bじ s) sp . nov . Y - 422と命名した。 The YK-422 strain having the above-mentioned mycological properties was obtained by using the Burges' Manual. National 'Journal of the Systematic Pakterio Sigma, Vol. 30, pp. 225-420 (1980), Vol. 32, U6-149 (1982), and the validity of the literature. ♦ When compared with the species in the list, it is a gram-negative bacillus that shows mucoidal growth, some filamentous bacteria are also observed, showing motility by grinding, and the ability to degrade colloidal chitin and dry yeast It does not form micromixes and has a high GC content in DNA, so it is appropriate to belong to the genus Rhizobacta. However, the 0 F test is not possible with the previously described species of the genus Rhizopactor (International 'Journal', 'Ob', 'Systematic', Pacteriology, Volume 28, pp. 367-393). They differed in that they were degraded, did not have any distinct color in the colonies, and did not have the assimilation of inorganic nitrogen sources. Therefore, YK-422 bead was identified as a strain belonging to a new strain, and the new strain was named Rhizobacta'arbus (Lysobacter alb sp.) Sp. Nov. Y-422.
上記リゾバクタ ·— · アルブス sp . nov . Υ Κ— 422株：ま、 昭和 59年（198 Above sp. Nov. ブ Κ— 422 shares: Well, 1984
4年） ίθ月 5日に I F 0に受託番号 I F 0 14384として寄託されている。 また、 本微生物:ま、 昭和 59年（1984年） U月 14日に F R I に受託番号 F Ε R Μ Ρ 一 7938として寄託され、 該寄 ί乇はブダぺス ト条約による寄託に 切換えられて F E R Μ Β Ρ— 698として F R I に保管されている。 (4 years) さ れ Deposited at IF0 on May 5 as accession number IF014384. In addition, the microorganism was deposited on F14 on U.S.A. 1984 (1984) as Accession No. FR-1938, and the deposit was changed to a deposit under the Budapest Treaty. FER Μ Β Ρ—Stored at FRI as 698.
本発明方法で使用される混合培養に用いられるァシネ トバクター属菌 としては、 ァシネ トバクタ一（.k i netob act er)属に属し、抗生物質 T A 一 588および Zまたはその N—デァセチル体を生産する能力を有するェ ンべドバク夕一属菌またはリゾバクタ一属菌と混合培養することにより、 抗生物質 T A - 588の N -デァセチル体を著量生成蓄積せしめる能力 を有するものであれば如何なる微生物でもよい。  The bacteria belonging to the genus Acinetobacter used in the mixed culture used in the method of the present invention belong to the genus Acinetobacter (.ki netob acter), and have the ability to produce the antibiotics TA-588 and Z or the N-deacetyl derivative thereof. Any microorganism may be used as long as it has the ability to produce and accumulate a significant amount of the N-deacetyl derivative of the antibiotic TA-588 by co-cultivation with Escherichia coli or Rhizobacta.
上記でいう著量生成蓄積せしめるとは、 該アンネ トバクタ一属菌を用 いないで、 該ェンぺドバクタ一属菌または該リゾバクタ一属菌を単独に 用いた場合の抗生物質 T A N一 588の N—デァセチル体の生成蓄積量よ り も多量に該目的物が生成蓄積されることをいう。 The term "produce and accumulate a significant amount" as used above means that the microorganism of the genus Annetobacter is used. However, the target compound is produced and accumulated in a larger amount than the amount of the N-deacetyl product of the antibiotic TAN-588 when the Endobacter species or the Rhizobacter species are used alone. Means
ァシネトバクター属に属する該微生物の例としては、 たとえばァシネ トパクター ·エスピー（Acinetobacter sp.)があげられる。 その具体例 としては、 本発明者らが、 日本国大阪府大阪市淀川区で採取した淡水よ り分離したァシネ トバクタ一 'エスピー YK— 504株（以下 [YK— 504株」 と することもある。 ）があげられる。  Examples of the microorganism belonging to the genus Acinetobacter include, for example, Acinetobacter sp. As a specific example, the present inventors may refer to a strain of yeast YSP-504 (hereinafter referred to as “YK-504”) isolated from fresh water collected from Yodogawa-ku, Osaka-shi, Osaka, Japan. )).
YK - 504株の菌学的性伏は下記のとおりである。  The mycological properties of the YK-504 strain are as follows.
(a)形 態 (a) Form
肉汁寒天斜面上で 2 4 °C, 5 日間培養後の観察では、 細胞は直径 0 〜 1.5〃111，長さ 1.1〜2.1 111の短桿状ないし、球状で二個が対となつて存在 するこどが多い。鞭毛は認め.られず、運動性も認められない。胞子を形成 せず、またグラム染色は陰性で、抗酸性を示さない。  After observation on gravy agar slope at 24 ° C for 5 days, the cells were found to be short rod-shaped or spherical with a diameter of 0 to 1.5〃111 and a length of 1.1 to 2.1111. There are many. No flagella. No motility. It does not form spores and has a negative Gram stain, indicating no acid resistance.
）各種培地上での生育状態 .  ) Growth on various media.
2 てで培養し、 4ないし 1 4日間にわたって観察した。  The cells were cultured for 2 to 4 days and observed for 4 to 14 days.
①肉汁寒天平板培養：コロニーは小さく点状で、 表面は凸円状、 周縁 は全緣状である。 拡散性色素は生成しない。  (1) Juice agar plate culture: Colonies are small and dot-like, the surface is convex, and the periphery is all square. No diffusible dye is formed.
②肉汁寒天斜面培養：中程度の糸伏の生育を示し、 無色で、 光沢を有 する。  (2) Gravy agar slant culture: Shows moderate growth of filiform, colorless and shiny.
③肉汁液体培養：混濁状に生育し、 沈澱を生じ、 菌膜は形成しない。 ③ Liquid broth culture: Grows turbid, precipitates, and does not form a pellicle.
④肉汁ゼラチン穿刺培養：主として上部で弱く生育する。 液化活性は 認められない。 ④ Gravy gelatin stab culture: grows weakly mainly in the upper part. No liquefaction activity is observed.
⑤リ 卜マス · ミルク：リ トマスの還元、 ペプトン化および凝固 (<、ずれ の活性も認められない。  ⑤Litmus · Milk: Reduction of litmus, peptone formation and coagulation (<, no negative activity is observed.
(c)生理的性質 一 L3- ①硝酸塩の還元： -(c) Physiological properties I L3- ① Reduction of nitrate:-
②脱窒反応： -② Denitrification reaction:-
③ MR (メチルレ 'ソ ド）テス ト： ③ MR (methyl methyl) test:
④ V P (フォーゲス · プロスカウエル）テス ト ：一  ④ V P (Forges Proscowell) Test: 1
⑤イン ドールの生成：— "  ⑤Indole generation: — "
⑥硫化水素の生成（T S I寒天および詐酸鉛紙）： - 水 素 Hydrogen sulfide formation (TS I agar and lead acid paper):-
⑦デンプンの加水分解：一 加 水 Hydrolysis of starch: 1
③クェン酸の利用（コーゼル，ク リステンセンおよびシモンズの各培地） ⑨無機窒素源の利用  ③ Utilization of citrate (Kosel, Christensen and Simmons medium) 利用 Utilization of inorganic nitrogen source
i ) 硝酸力 リ ウム：一  i) Nitrate: Li: 1
ϋ ) 硫酸ァンモニゥム：一  ϋ) ammonium sulfate: 1
⑩色素の生成（キング A , Βおよびマンニッ ト酵母エキス寒天の各培地） ：拡散性色素の生成:ま認められない。  ⑩Dye formation (King A, Β and Mannit yeast extract agar medium): Diffusible dye formation: Not observed.
JDゥ レア一ゼ：一  JD ゥ Rare Ize: One
ォキシダーゼ：一  Oxidase: One
@カタラーゼ： τ  @ Catalase: τ
®生育の範囲  ® Range of growth
i ) pH:pH 5〜8で生育するが、最適 PHは 6〜 7.5。  i) pH: Growing at pH 5-8, optimal pH 6-7.5.
培地：肉汁液体培地。  Medium: broth liquid medium.
ϋ ) 温度： 7.5〜39てで生育するが最適温度は 15〜22て。  ϋ) Temperature: Grows at 7.5-39, but the optimal temperature is 15-22.
培地：肉汁液体培地。  Medium: broth liquid medium.
酸素に対する態度：好気的  Attitude to oxygen: aerobic
⑱ 0— F (ォキシダティブ一ファーメ ン夕ティブ）テス ト [ヒユー · レ ィフソ ン（Ηし gh · し eifson)法：：非分解型。  ⑱ 0—F (oxidative-family-fundamental) test [Hu-Leifson method]: Non-decomposition type.
©瑭からの酸，ガスの生成および利甲性 丄 ― 酸 ガス 利用性 © 瑭 Acid and gas generation and profitability 丄-Acid gas availability
(ぺプトン水）（ぺプトン水）（デービス培地） (Peptone water) (Peptone water) (Davis medium)
L—ァラビノース 一 一 一 L-arabinose
D—キシロース 一 一 - D—Xylose one-
5 D—グルコース 一 一 一 5 D—glucose
D—マンノ ース 一 一 一  D—Mannose
D—フラク トース 一 - 一  D—Fructose One-One
D—ガラク トース 一 一 一  D—Galactoose
麦 芽 糖 一 一 一 シ ョ 糖 一 一 一  Maltose sucrose sugar
乳 糖 一 一 一 卜 レノ、ロ ース ― ― ―  Lactose 11-Lenose, Loose---
D—ソルビッ ト ― 一 一  D-Sorbit-one
D—マンニッ ト ― 一 ―  D—Mannit ― One ―
5 イノ シッ 卜 一 一 一 5 Innocent
グリセリ ン 一 一 一  Glycerin
デンプン 一 一 一  Starch
- ' ペプトン水，デービス培地での生育は極めて弱い。 ただし、 デービス 基礎培地に L -アルギニンを 0.2 %添加した培地では良好な生育を示す < ⑩ DMAの G C (グァニン +シントン）含量：40.0%±1.5%(1^法） -'Growth is extremely weak on peptone water and Davis medium. However, the medium with 0.2% L-arginine added to the Davis basal medium shows good growth. <⑩ G C (guanine + synthon) content of DMA: 40.0% ± 1.5% (1 ^ method)
⑲多糖の分解能： 分解 能 Polysaccharide resolution:
カルボキシメチルセルロース：一  Carboxymethyl cellulose: one
コロイダルキチン：—  Colloidal chitin: —
アルギン酸ナトリウム：一 Sodium alginate: one
5 以上の菌学的性状を有する YK - 504株を、 バージーズ♦ マニュアル A strain of YK-504 with more than 5 mycological properties was added to the Barges ♦ Manual.
.ォブ ' デタ一ミネイティブ ·パクテリォロジ一第 8版およびインター ナショナ · ジャーナル ' ォブ ' システマティッ ク · ノくクテリォロジ一第.Ob 'Data Pacteriology 8th Edition and Inter National journal 'ob' systematics
30巻 225〜420頁（1980年）、同第 32巻 146〜149頁（1982年）に記載の種と照 合すると、グラム陰性の短桿状ないし球状の細菌で、運動性がなく、好気 的で、糖からの酸、ガスの生成能がなく、ォキシダーゼが陰性，カタラーゼ が陽性、 DMAの G C含量が 40.0%土 L5%(Tm法）であることから、 ァ シネ トバクタ一（Acinetobacter )属に属するとするのが妥当と考えられ る。そこで、該菌株をァシネ トバクタ一 · エスピー（Acinetobacter sp.) YK— 504と呼称することにした。 When compared with the species described in Vol. 30, pp. 225-420 (1980), and Vol. 32, pp. 146-149 (1982), it is a gram-negative short rod-shaped or spherical bacterium that has no motility and is aerobic. And lacks the ability to produce acid and gas from sugar, is negative for oxidase, positive for catalase, and has a GC content of 40.0% soil L5% (Tm method), indicating that it is of the genus Acinetobacter. It is considered appropriate to belong to Therefore, this strain was designated as Acinetobacter sp. YK-504.
上記ァシネ トパクター ' エスピー ΥΚ— 504株は、 昭和 60年（1985年） 1 月 31日に I F 0に受託番号 I F 0 14420として寄託されている。また本 微生物は、昭和 60年（1985年） 2月 12日に F R Iにブダぺス ト条約による寄 ΐ乇として受託番号 F ERM Β Ρ— 709として寄託されている。  The above-mentioned facilitator Patricia sp. 504 strain was deposited with I F0 on January 31, 1985 as accession number I F 0 14420. The microorganism has been deposited with the FRI on February 12, 1985 as a deposit under the Budapest Treaty, under the accession number F ERM II-709.
本発明に用いられるェンぺドバクター属細菌またはリゾバクタ—属細 菌は一般にその性状が変化しやすく、 たとえば紫外線 ，Χ線 ，化学薬品 (例、 ニトロソグァ二ジン，ェチルメタンスルホン酸）などを用いる人工 変異手段で容易 ¾変異しうるものであり、 どの様な変異株であっても本 発明の対象とする T A Ν— 588および/またはその N—デァセチル体の 生産能を有するものはすべて本発明に使用することができる。  The properties of the bacteria of the genus Endobacter or Rhizobacter used in the present invention are generally liable to change. For example, ultraviolet rays, X-rays, and chemicals (eg, nitrosoguanidine, ethyl methanesulfonic acid) are used. Any mutant which can be easily mutated by means of artificial mutation and which has the ability to produce TA 588-588 and / or its N-deacetyl derivative, which is the subject of the present invention, can be used in the present invention. Can be used for
本発明に用いられるァシネ トパクター属钿菌は一般にその性状が変化 しゃすく、 たとえば紫外線， X線，化学薬品（例、 ニトロソグァ二ジン，ェ チルメタンスルホン酸）などを用いる人工変異手段で容易に変異しうる ものであり、 どの様な変異株であっても、 抗生物質 TAN— 588および /またはその N—デァセチル体を生産する能力を有するェンぺドバクタ ー属またはリ ゾパクター属に属する微生物と混合培養することにより、 抗生物質 TAN— 588の N—デァセチル体を該ェンぺドバクタ一属菌ま たはリ ゾバクター属菌 著量蓄積させる能力を有するものはすべて本発 明方法に使用することができる。 The bacteria of the genus Acinetobacter used in the present invention generally change their properties easily, and are easily mutated by, for example, artificial mutation using ultraviolet rays, X-rays, chemicals (eg, nitrosoguanidine, ethyl methanesulfonic acid) and the like. Any mutant strain can be mixed with a microorganism belonging to the genus Endobactor or Lysobacter, which is capable of producing the antibiotic TAN-588 and / or its N-deacetyl derivative. By cultivation, all those which have the ability to accumulate a significant amount of the N-deacetyl derivative of the antibiotic TAN-588 in the above-mentioned bacteria of the genus Endobacter or the genus Rhizobacter are developed. Can be used in the light method.
T A N— 588および Zまたはその N —デァセチル体の生産菌の培養に 際しては、 炭素源としては、 たとえばダルコ—ス，フラク トース，マルト —ス，ソルブル♦ スターチ ，デキストリ ン，油脂類（例、 大豆油，ォリーブ 油など），有機酸類（例、 クェン酸，コハク酸， ダルコン酸など）など菌が 資化しうるものが適宜用いられる。 窒素源としては、 たとえば大豆粉， 棉実粉，コ—ン · グルテン ♦ ミ ール，乾燥酵母， 酵母エキス，肉エキス，ぺ プトン.尿素などの有機窒素化合物が利用できる。 また、 無機塩として は、 たとえば塩化ナトリウム， 塩化カリウム，炭酸カルシヴム，硫酸マグ ネシゥム，リ ン酸一力リウム.リ ン酸ニナトリゥムなどの通常細菌の培養 に必要な無機塩類が単独もしくは適宜、 組合せて使用される。  In culturing bacteria producing TAN-588 and Z or its N-deacetyl product, carbon sources include, for example, darcose, fructose, maltoses, and solvable starch, dextrin, oils and fats (eg, , Soybean oil, olive oil, etc.), and organic acids (eg, citric acid, succinic acid, dalconic acid, etc.) that can be used by bacteria can be used as appropriate. As the nitrogen source, for example, organic nitrogen compounds such as soybean flour, cottonseed flour, corn gluten ♦ meal, dried yeast, yeast extract, meat extract, and peptone.urea can be used. Examples of the inorganic salts include, for example, sodium chloride, potassium chloride, calcium carbonate, magnesium sulfate, monolithium phosphate, and sodium phosphate required for culturing normal bacteria, alone or in combination. used.
また、 硫酸第 t鉄，硫酸銅などの重金属類，ビタ ミ ン B ビォチンなど のビタミ ン類なども必要に応じて添加される。 さらに、 シリコーンオイ ルゃポリアルキレンダリコールェ—テルなどの消泡剤や界面活性剤を培 地に添加してもよい。 その他菌の発育を助け、 T A N— 58δおよび/ま たはその —デァセチル体の生産を促進するような有機物や無機物を適 宜に添加してもよい。  Heavy metals such as ferric sulfate and copper sulfate, and vitamins such as vitamin B-biotin are also added as necessary. Further, an antifoaming agent such as silicone oil / polyalkylene dali coal ether or a surfactant may be added to the medium. Other organic and inorganic substances that promote the growth of bacteria and promote the production of TAN-58δ and / or its deacetyl form may be added as appropriate.
培養方法としては、 一般の抗生物質の生産方法と同様に行えばよく、 固体培養でも液体培養でもよい。 液体培養の場合は静置培養，攪拌培養， 振盪培養.通気培養などいずれを実施してもよいがとくに通気攪拌培養 が好ましい。 又培養温度はおよそ 15° (：〜 32°Cの範囲が好ましく、 培地の P Hは約 5 〜 8の範囲でおよそ 8時間〜 168時間好ましくはおよそ 24時間 ~ 144時間培養する。  The cultivation method may be the same as a general antibiotic production method, and may be solid culture or liquid culture. In the case of liquid culture, any of static culture, stirring culture, shaking culture, and aeration culture may be performed, but aeration and agitation culture is particularly preferred. In addition, the culture temperature is preferably about 15 ° (: to about 32 ° C, and the pH of the medium is about 5 to 8 for about 8 to 168 hours, preferably about 24 to 144 hours.
抗生物質 T A N— 588の N -デァセチル体の生産のための混合培養法 は、 先に述べた抗生物質 T A N— 588および/またはその N —デァセチ ル体の生産のための培養法に準じて行うこと力 でまる。 抗生物質 T A N— 588の N—デァセチル体の検出には、 シユー ドモナ ス . エルギノ一ザ C— U1を試験菌とする T L C 一バイオォートグラフィ —法が用いられる。 The mixed culture method for the production of the N-deacetyl form of the antibiotic TAN-588 should be performed in accordance with the culture method for the production of the antibiotic TAN-588 and / or its N-deacetyl form as described above. With power. For detection of the N-deacetyl form of the antibiotic TAN-588, a TLC-bioautography method using pseudomonas.eruginosa C-U1 as a test bacterium is used.
本発明のアンネ トバクタ一属菌を用いて混合培養すると、本発明のェ ンぺ ドバクタ一属菌あるいはリゾバクタ一属菌を単独に用いて培養する 場合に比し、目的物である抗生物質 T A N— 588の N—デァセチル体を多 量に生成蓄積させることができるので、 本発明の混合培養法は工業的生 産上有利である。  When the mixed culture is carried out using the microorganism of the genus Annetobacter of the present invention, the antibiotic TAN—which is the target substance, is compared with the case of culturing using the genus of the genus Endobacter or the genus Rhizobacta alone of the present invention. Since the N-deacetyl body of 588 can be produced and accumulated in a large amount, the mixed culture method of the present invention is advantageous in industrial production.
培養物から目的とする抗生物質 T A N— 588および Zまたはその N— デァセチル体を採取するには微生物の生産する代謝物をその微生物の培 養物から採取するのに通常使用される分離手段が適宜利用される。 たと えば抗生物質 T A N— 588およびその N—デァセチル体は水溶性である 性質を示し、 主として培養ろ液中に含まれるので、 まず培養液にろ過捕 助剤を加えてろ過あるいは違心分離によつて菌体を除去し、 得られた培 養ろ液を適宜の担体に接触させてろ液中の有効成分を吸着させ、 次いで 適宜の溶媒で有効物質を脱着させ、 分別採取する手段が有利に利用され る クロマ トグラフィーの担体として:ま活性炭、 シリカゲル、 粉末セル 口--ス、 吸着性樹脂など化合物の吸着性の差を利用、 またはイオン交換 樹脂、 イオン交換セルロースなど化合物の官能基の差を利用、 あるいは 分子ふる L、性担体類など化合物の分子量の差を利用するのが有利に用い れる。 これら担体から目的とする化合物を溶出するためには担体の種 類、 性質によって組み合せが異なるが、 たとえば水溶性有機溶媒の含水 溶液すなわち、 含水アセ ト ン、 含水アルコール類など、 あるいは酸、 ァ ルカリ、 緩衝液もしくは無機あるいは有機塩を含む水溶液などが適宜組 み合わせて用いられる。 また、 これらのクロマ トグラフィ —によって得 れた本抗生物質の粗物質を分取用高速液体ク口マトグラフィ —（H P L C )に付し、 さらに精製する事もできる。 他に活性炭クロマトグラフィ —によって脱塩された溶出液を濃縮し、 濃縮液からイオン ·ペア一 ド抽 出法すなわち 4級アルキルアンモニゥム ♦ハライ ドを含む有機溶媒で本 抗生物質を回収することもできる。 To obtain the desired antibiotic TAN-588 and Z or its N-deacetyl derivative from the culture, appropriate separation means commonly used to collect the metabolites produced by the microorganism from the culture of the microorganism are appropriate. Used. For example, the antibiotic TAN-588 and its N-deacetyl derivative are water-soluble and are mainly contained in the culture filtrate. Therefore, a filtration aid is first added to the culture, followed by filtration or eccentric separation. A means for removing the cells, bringing the resulting culture filtrate into contact with a suitable carrier to adsorb the active ingredient in the filtrate, desorbing the active substance with a suitable solvent, and separating and collecting the fraction is advantageously used. As a chromatographic carrier: use the difference in the adsorptivity of compounds such as activated carbon, silica gel, powder cell mouth, and adsorbent resin, or use the difference in the functional groups of compounds such as ion-exchange resin and ion-exchange cellulose. It is advantageous to use the difference in molecular weight of compounds such as molecular sieves L and sex carriers. In order to elute the target compound from these carriers, combinations vary depending on the type and properties of the carriers. For example, aqueous solutions of water-soluble organic solvents, that is, aqueous acetates and aqueous alcohols, or acids and alkalis A buffer, an aqueous solution containing an inorganic or organic salt, or the like is used in appropriate combination. In addition, high-performance liquid mouth chromatography for preparative separation of the crude substance of this antibiotic obtained by these chromatographys (HP LC) for further purification. Alternatively, the eluate desalted by activated carbon chromatography can be concentrated, and the antibiotic can be recovered from the concentrate using an ion-pair extraction method, that is, a quaternary alkylammonium it can.
さらに詳しく述べるならば、 T A N— 588は酸性物質なので、 担体と して陰イオン交換樹脂たとえばダウエックスー 1 (ダウ · アンド . ケミ カル社製、 米国）、 アンバーライ ト I R A— 68、 400、402、410 (ローム · ァ ン ド ' ハース社製、 米国）、 ダイヤイオン S A - 21 Aおよび C (三菱化成 工業株式会社製、 日本）などを用いるとろ液中の本抗生物質は吸着され、 塩類あるいは酸含有の水溶液あるいは緩衝液などで溶出される。 また、 陰イオン交換セル口—スたとえば D E— 32 (ワッ トマン社製、 英国）、 D E A E—セルロース（ブラウン社製、 西独）など、 あるいは陰イオン交換 分子ふるい性樹脂たとえば D E A E —あるいは Q A E —セフアデヅ クス 〔フアルマシャ社製、 スウェーデン）などの担体に本抗生物質を吸着せし め、 塩類あるいは酸含有の水溶液あるいは緩衝液などによって溶出させ ることが出来る。 これら溶出液中の塩類、 着色物質なども取り除く ため に:ま,クロマト用活性炭（武田薬品工業株式会社製、 日本）あるいは吸着性 樹脂た'とえばダイヤイオン H P— 2·0または S Ρ 一 207 (三菱化成工業株式 会社製、 日本）、 アンバーライ ト X A D— Ε (口—ム · アン ド · ハース社 製、 米国）などが有利に用いられる。 分画された溶出区分は、 濃縮、 凍 結乾燥などの工程を経て、 粉末化される。 かく して得られた粉末の純度 が悪い場合、 さらに精製するためには高速液体ク口マトグラフィ一が有 利に利用される。 用いられる担体としては、 たとえば T S Κゲル（東洋 曹達株式会社製、 日本）、 Y M Cゲル（山村化学研究所製、 日本）などが 挙げられ、 移動層としてはメタノ ―ルあるいはァセトニトリルなどと酸 性水溶液あるいは緩衝液などとの混合液が用いられる。 上述したイオン ·ペア— ド抽出法において用いられる 4級アルキルアンモニゥム ♦ハラ イ ドについてはたとえばトリ一 n—才クチルメチルアン乇ニゥムクロラ ィ ド，テトラー n—ペンチルアンモニゥムクロライ ド，η—テトラデシルジ メチルベンジルアンモニゥムクロライ ドなどがあり、 有機溶媒としては 通常メチレンクロライ ド，クロ口ホルム，ジクロ口ェタンなどが用いられ る。 More specifically, since TAN-588 is an acidic substance, an anion exchange resin such as Dowexu-1 (manufactured by Dow & Chemical Co., USA) and Amberlite IRA-68, 400, 402, 410 are used as carriers. (Roam & Haas Co., USA), Diaion SA-21A and C (Mitsubishi Kasei Kogyo Co., Ltd., Japan), etc., absorb the antibiotics in the filtrate and contain salts or acids. Is eluted with an aqueous solution or buffer solution. Anion exchange cell openings such as DE-32 (Wattman, UK), DEAE-cellulose (Brown, Germany), etc., or anion-exchange molecular sieve resins such as DEAE- or QAE-Sephadex The antibiotic can be adsorbed to a carrier such as [Falmasha, Sweden] and eluted with an aqueous solution or buffer containing salts or acids. To remove salts, coloring substances, etc. in these eluates: Activated carbon for chromatography (manufactured by Takeda Pharmaceutical Co., Ltd., Japan) or an adsorbent resin such as Diaion HP-2.0 or S-207 (Mitsubishi Kasei Kogyo Co., Ltd., Japan), Amberlite XAD-Ε (Mouth And Haas Co., USA), etc. are advantageously used. The fractionated elution fractions are made into powder through processes such as concentration and freeze-drying. When the purity of the powder thus obtained is poor, high-performance liquid chromatography is advantageously used for further purification. Examples of the carrier used include TS ら れ gel (manufactured by Toyo Soda Co., Ltd., Japan) and YMC gel (manufactured by Yamamura Chemical Research Laboratories, Japan). The moving layer is formed of methanol or acetonitrile and an acidic aqueous solution. Alternatively, a mixed solution with a buffer solution or the like is used. Ions mentioned above • Quaternary alkyl ammonium used in the paired extraction method ♦ For halides, for example, tri-n-butylmethylammonium chloride, tetra-n-pentylammonium chloride, η-tetradecyldimethylbenzyl There are ammonium chloride and the like. As the organic solvent, methylene chloride, chloroform and dichloroethane are usually used.
また、 T A N - 588の Ν -デァセチル体は両性物質で、 塩基性の性質 の方が強いため、 担体としては陽イオン交換樹脂たとえばダウエツクス 50W (ダウ ' アン ド ' ケミカル社製，米国），アンバーライ ト I R— 120 B (口 ーム，アンド ·ハース社製，米国），ダイヤイオン S K— U0 (三菱化成工業 株式会社製，日本）などを用いると、 ろ液中の本抗生物質は吸着され、 塩 類あるいは酸またはアルカリ含有の水溶液あるいは緩衝液などで溶出さ れる。 また、 陽イオン交換分子ふるい性樹脂たとえば C VI—セフアデッ クス（フアルマシア社製，スウェーデン）などの担体に本抗生物質を吸着 仕しめ、 塩類含有の水溶液あるいは緩衝液などによって溶出させること が出来る。 これら溶出液中の塩類，着色物質などを り除く ためにはク 口マ トグラフ ィ 一用活性炭あるいは吸着性樹脂たとえばダイヤィォン S P - 207あるい':ま H P - 20などが有利に用いられる。 分画された溶出区' 分は濃縮，凍結乾燥などの工程を経て、 粉末化される。 このようにして 得られた粉末の钝度が悪い場合、 ざらに精製するために高速液体クロマ トグラフィーが有利に利用される。 担体，移動層などは T A N— 5δδの精 製の場合と同様である。  In addition, the Ν-deacetyl form of TAN-588 is an amphoteric substance and has a stronger basic property. Therefore, as a carrier, a cation exchange resin such as Dowex 50W (manufactured by Dow And Chemical Co., USA), Amberley G. Using IR-120B (manufactured by ANDOM Haas Co., USA), Diaion SK-U0 (manufactured by Mitsubishi Kasei Kogyo Co., Ltd., Japan), etc., the antibiotic in the filtrate is adsorbed, It is eluted with an aqueous solution or buffer containing salts or acids or alkalis. The antibiotic can be adsorbed on a carrier such as a cation exchange molecular sieve resin such as CVI-Sephadex (Pharmacia, Sweden) and eluted with a salt-containing aqueous solution or buffer. In order to remove salts, coloring substances and the like in these eluates, activated carbon for chromatography or an adsorbent resin such as Dia SP-207 or HP-20 is advantageously used. The fractionated elution fraction is powdered through steps such as concentration and freeze-drying. If the powder obtained in this way has a low density, high-performance liquid chromatography is advantageously used for coarse purification. The carrier, moving bed, etc. are the same as in the case of the refinement of TAN-5δδ.
T A N— 588は精製過程において、 用いられた塩類，緩衝液中の陽ィォ ンたとえばナ ト リ ウム，カ リ ウム，リチウム，カルシウム，アン乇ニゥムィ オンなどと結合した伏態で存在するカ 、 この場合そのままの p Hで活性 炭ク σマトグラフィ一に付すると対応する塩として単離さ..ね、 p H約 5 ないし 2好ましくは PH約 4. 5ないし 3に溶出液を調整し、 活性炭のクロ マトグラフィ ーに付すと遊離体として得られる。 T A N— 588の N—デ ァセチル体は中性付近の p Hで活性炭クロマトグラフィ一に付すと、 両 性イオン化合物として得られる。 また、 T A N— 588の N—デァセチル 体は、塩基性の性質の方が強いため、強酸と塩を形成し得る。該強酸とし ては、たとえば塩酸，リ ン酸，硫酸， トリフルォロ舴酸などが挙げられる。 かく して得られた T A N— 588は逆層系高速液体クロマトグラフィ ― 上 2本のピークを有する。 これらのピ「クを仮に A， Bと称すると、 以 下に述べる現象が認められる。 分取用高速液体クロマトグラフィ —によ り A . Bのピークをそれぞれ採取すると、 かなり単一の A， Bが得られる が、 これらを P H 3 , 5 , 7の緩衝液中に室温で放置すると、 いずれの pH においても約一時間後には Aは Bとなり、 Bは Aとなって、 A : Bが約 ' 1 ： 1の平衡混合物に変化する。 従って T A N— 588そのものを Α , Βに 分離することは現在知られている分離技術では不可能と思われる。 しか し、 T A — 588を ρ—二トロべンジルエステル体あるいはベンツヒ ドリ ル体とすると A型化合物と B型化合物にそれぞれ分けることができる。 抗生物質 A - 588またはその塩を脱ァセチル化する方法として：ま、 - 公知の脱ァセチル化反応が採用される。 In the purification process, TAN-588 is present in the form of salts used as salts, cations in a buffer solution, such as sodium, calcium, lithium, calcium, and amphibious ions. In this case, it is isolated as the corresponding salt by applying it to activated carbon at the same pH and applying it to σ-matography. The eluate is adjusted to a pH of about 4.5 to 3, preferably about 4.5 to 3, and chromatographed on activated carbon to obtain a free product. The N-deacetyl form of TAN-588 can be obtained as a zwitterion compound by activated carbon chromatography at near neutral pH. Further, the N-deacetyl form of TAN-588 can form a salt with a strong acid because it has a stronger basic property. Examples of the strong acid include hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, and trifluoroacetic acid. The TAN-588 thus obtained has two peaks on reversed-phase high performance liquid chromatography. If these peaks are referred to as A and B, the following phenomenon is observed. When the peaks of A and B are respectively collected by preparative high-performance liquid chromatography, a fairly single A and B are obtained. When these are left at room temperature in the pH 3, 5, 7 buffer solution, A becomes B and B becomes A after about one hour at any pH, and A: B becomes about '1: 1 Equilibrium mixture, so it seems impossible to separate TAN-588 itself into Β and で は by the currently known separation techniques, but TA-588 is converted to ρ-Nitro The benzyl ester form or benzhydryl form can be divided into a compound of type A and a compound of type B. Methods for deacetylating the antibiotic A-588 or a salt thereof include: Adopted.
その一例としては、 たとえばまず T A N— 588にパラニトロべンジル もしくはベンツヒ ドリル基を導入しエステル体とし、 さらに T A N— 58 For example, first, a paranitrobenzyl or benzhydryl group is introduced into TAN-588 to form an ester form.
8のァセチル基も脱離し、 必要により該パラ二トロべンジルもしくはべ ンッヒ ドリル基を脱離することにより行なわれる。 The acetyl group of 8 is also eliminated, and this is carried out by eliminating the para-nitrobenzil or Bench drillyl group, if necessary.
上記したパラ二ト口ベンジル基を導入するには、 T A N— 588または その塩にパラニトロベンジル基を導入し得る化合物を反応させる。 該パ ラニトロベンジル基を導入し得る化合物の例としては、 たとえば、 パラ ニトロベンジルブ口マイ ド，パラニトロべンジルクロライ ドなどが挙げ ら lる o" In order to introduce the above-mentioned para-nitro benzyl group, a compound capable of introducing a para-nitrobenzyl group is reacted with TAN-588 or a salt thereof. Examples of the compound into which the paranitrobenzyl group can be introduced include, for example, paranitrobenzylbutamide and paranitrobenzyl chloride. O l
パラニトロベンジル基を導入し得る化合物の使用量は、 約 1 ないし 5 当量，好ましくは約 1 ないし 2当量である。 反応は溶媒中で行なうのが 好ましく、 該溶媒としてはたとえば、 ジメチルフオルムアミ ド（D M F ) . ジメチルァセ トアミ ド（D MA A) ,テ トラヒ ドロフラ ン（T H F )などが 挙げられる。 該反応においては、 反応を促進するために、 たとえばトリ ェチルアミ ン（Et3N),ピリ ジンなどを約 0.1ないし 0.5当量，好ましくは 約 0.1ないし 0.2当量の量で添加してもよい。 " 反応温度は、 約 O °C~40°Cさらに好ましくは約 20° (：〜 30°Cであり、 反 応時間は約 0.5~ 8時間さらに好ましくは約 1〜4時間である。 反応は 攪拌下に行なうのが好ましい。 The amount of the compound capable of introducing a paranitrobenzyl group is about 1 to 5 equivalents, preferably about 1 to 2 equivalents. The reaction is preferably performed in a solvent. Examples of the solvent include dimethylformamide (DMF), dimethylacetamide (DMAA), and tetrahydrofuran (THF). In the reaction, for example, triethylamine (Et 3 N), pyridine and the like may be added in an amount of about 0.1 to 0.5 equivalent, preferably about 0.1 to 0.2 equivalent to promote the reaction. The reaction temperature is about O ° C to 40 ° C, more preferably about 20 ° (: to 30 ° C, and the reaction time is about 0.5 to 8 hours, more preferably about 1 to 4 hours. It is preferred to carry out with stirring.
上記したベンツヒ ドリル基を導入するには、 T AN— 588またはその 塩にベンツヒ ドリル基.を導入し得る化合物を反応させる。 該ベンツヒ ド リル基を導入し得る化合物の例としては、 たとえば、 ジフヱニルジァゾ メ タ ン，ジフエニルメチルブロマイ ドなどが挙げられる。 ベンツヒ ドリ ル基を導入し得る化合物の使用量は、 約 1 ないし 6当量，好ましくは約 2ないし 4当量である。 反応は溶媒中で行なうのが好ましく、 該溶媒と してはたとえば T H F ,ジォキサン，酢酸ェチル，ジク gロメ タ ンなどが 挙げられる。 該反応において:ま、 反応を促進するために、 たとえば希塩 酸，希硫酸.希リ ン酸などを少量、 たとえば約 0.01ないし〖.0当量添加し て PHを約 1 ないし 3，好ましくは約 1.5ないし 2.5付近に調整することが 好ましい。 反応温度は約一 10°C ~ T 50°Cさらに好ましくは 0て〜 30°Cで あり、 反応時間は約 30分ないし約 8時間さらに好ましくは約 1 ないし 3 時間である。 反応は、 攪拌下に行なうのが好ましい。  To introduce the above-mentioned benzhydryl group, a compound capable of introducing a benzhydryl group is reacted with TAN-588 or a salt thereof. Examples of the compound into which the benzhydryl group can be introduced include, for example, diphenyldiazomethane, diphenylmethylbromide and the like. The amount of the compound capable of introducing a benzhydryl group is about 1 to 6 equivalents, preferably about 2 to 4 equivalents. The reaction is preferably carried out in a solvent, and examples of the solvent include THF, dioxane, ethyl acetate, digrometan and the like. In the reaction: To promote the reaction, a small amount of, for example, about 0.01 to 0.0 equivalents of dilute hydrochloric acid, dilute sulfuric acid, or dilute phosphoric acid is added to add PH to about 1 to 3, preferably about It is preferable to adjust to around 1.5 to 2.5. The reaction temperature is about 110 ° C. to T 50 ° C., more preferably 0 to 30 ° C., and the reaction time is about 30 minutes to about 8 hours, more preferably about 1 to 3 hours. The reaction is preferably performed with stirring.
上記で得られたエステル体は、 通常用いられる分離 ·精製手段を用い て採取され得る。 該手段としてはたとえば目的物はたとえばジクロルメ タン，クロ口ホルムなどで有機層に抽出され、 抽出液を濃縮し，濃縮液を エーテルあるいはへキサンなどに加えると該エステル体が結晶性粉末と して折出する。 このエステル体はシリ力ゲル法で 2成分に単離されるが、 次の反応に進む場合には混合物として用いてもよい。 The ester obtained above can be collected using a commonly used separation and purification means. As the means, for example, the target substance is, for example, dichlorme The extract is concentrated into an organic layer with tan or black form, and the extract is concentrated. When the concentrate is added to ether or hexane, the ester is precipitated as a crystalline powder. This ester compound is isolated into two components by the silylation gel method, but may be used as a mixture when proceeding to the next reaction.
さらに、 上記で得られた T A N— 588のパラニトロべンジルエステル 体もしくはベンツヒ ドリル体を脱ァセチル化反応に付す。  Further, the paranitrobenzyl ester or benzhydryl of TAN-588 obtained above is subjected to a deacetylation reaction.
該脱ァセチル化反応としては、 たとえば、 イミノエ—テル法，加溶媒 分解法，酵素を用いた加水分解法などが挙げられる。  Examples of the deacetylation reaction include an iminoether method, a solvolysis method, and a hydrolysis method using an enzyme.
ィミ ノエーテル法を用いる場合には、 たとえば原料化合物に五塩化リ ン，ホスゲン，三塩化リ ン，ォキシ塩化リ ンなども反応させる。 上記反応 試薬は、 約 1〜 5当量さらに好ましくは約 1 . 5〜 3当量用いるのが好ま しい。 該反応はたとえばメチレンクロライ ド，ジクロロェタン，クロロホ ルム，四塩化炭素， トリ クロ口エタンなどの溶媒の存在下に行なうと好都 合である。 反応を促進させるために、 たとえばピリジン， Ν , Ν—ジメチ ルァニリ ン， トリェチルァミ ン，ァニリ ン，トルイジンなども過剰量たと えば約 3〜2 0当量さらに好ましくは約 5〜10当量用いるとよい。  When the iminoether method is used, for example, the raw material compounds are also reacted with phosphorus pentachloride, phosgene, phosphorus trichloride, and oxychloride. The reaction reagent is preferably used in an amount of about 1 to 5 equivalents, more preferably about 1.5 to 3 equivalents. The reaction is conveniently carried out in the presence of a solvent such as, for example, methylene chloride, dichloroethane, chloroform, carbon tetrachloride, trichloromethane. In order to accelerate the reaction, for example, pyridine, Ν, Ν-dimethylylaniline, triethylamine, aniline, toluidine and the like may be used in excess, for example, about 3 to 20 equivalents, and more preferably about 5 to 10 equivalents.
該脱ァセチル化反応は、 反応温度約一 30°Cないし 0 °Cさらに好ましく は一 1 °Cないし— 5てで、 反応時間約 15分ないし 8時間さらに好ましく は約 30分ないし 2時間で行なうのが良い。 反応は攪拌下に行なうのが好 都合である。  The deacetylation reaction is carried out at a reaction temperature of about 130 ° C to 0 ° C, more preferably at 11 ° C to -5, and a reaction time of about 15 minutes to 8 hours, more preferably about 30 minutes to 2 hours. Is good. The reaction is conveniently carried out with stirring.
中間体として生成されるィミノ クロライ ドをィミ ノエーテルにするた めに反応液中に過剰のメタノ ールを加え、 約一 30° (：〜 0 °C好ましくは約 一 15°C〜一 5 °Cで約 15分ないし 2時間好ましくは約 30分ないし 1時間攪 拌し、 さらに反応の終結のために約 10°C〜40°C好ましくは約 20°C〜30°C で約 30分ないし 2時間攪拌する。 さらに反応液中に希塩酸を加え、 C 一 N锆合を切断する。 反応温度は約 i Ot；〜 40°C好ましくは約 20て〜 30°Cで、 反応時間は約 15分ないし 2時間好ましくは約 30分ないし 1時間である。 加溶媒分解法を用いるには、 たとえば原料化合物をメタノ —ル，エタ ノ —ルあるいはそれらと水の混合溶液にとかし、 約 20°Cないし還流温度 好ましくは約 50°Cないし還流温度で、 約 0 . 5ないし 30時間，好ましくは約 2ないし 8時間反応させる。 An excess of methanol is added to the reaction solution in order to convert imino chloride formed as an intermediate into imino ether, and the resulting mixture is added at about 130 ° (： 0 ° C, preferably about 15 ° C to 15 ° C). Stir at about 15 minutes to 2 hours, preferably about 30 minutes to 1 hour, at about 10 ° C to 40 ° C, preferably about 20 ° C to 30 ° C for about 30 minutes to complete the reaction. The mixture is stirred for 2 hours, and then dilute hydrochloric acid is added to the reaction solution to cleave the C—N bond.The reaction temperature is about i Ot; 4040 ° C., preferably about 20 to 30 ° C. The reaction time is about 15 minutes to 2 hours, preferably about 30 minutes to 1 hour. To use the solvolysis method, for example, the starting compound is dissolved in methanol, ethanol or a mixed solution thereof with water, and the mixture is heated at about 20 ° C. to reflux temperature, preferably at about 50 ° C. to reflux temperature. The reaction is carried out for 0.5 to 30 hours, preferably for about 2 to 8 hours.
かく して得られた反応液は中和され、 水と混和しない有機溶媒たとえ ばメチレンクロライ ド，ジェチルエーテル，舴酸ェチルなどで、 生成物を 抽出し、 抽出液を濃縮し、 T A N— 588のデァセチル体のパラニトロべ ンジルもしくはべンッヒ ドリル体が得られる。  The reaction solution thus obtained is neutralized, and the product is extracted with an organic solvent that is immiscible with water, such as methylene chloride, getyl ether, and ethyl ethyl ester, and the extract is concentrated. 588 deacetyl-form paranitrobenzyl or Bench drills are obtained.
次に最終工程としてエステル基を離脱させるためには、 たとえば酸加 水分解法，接独還元法などが用いられる。  Next, in order to remove the ester group as a final step, for example, an acid hydrolyzing method, a direct contact reduction method, or the like is used.
酸加水分解法を用いる場合には、 酸としてたとえばトリフルォロ詐酸， ギ酸，塩酸なども原枓化合物に対し約 3 ~ 20当量用い反応させる。 また、 ァニソ—ルを約 1 ないし 5当量，好ましくは約 2ないし 4当量加えるの が好ましい。 該反応においては、 溶媒として、 たとえばメチレンクロラ ィ ド，クロ口ホルム， T H F J乍酸ェチルなどが用いられる。  In the case of using the acid hydrolysis method, for example, trifluoroacetic acid, formic acid, hydrochloric acid or the like is used as an acid in about 3 to 20 equivalents of the raw compound for reaction. It is preferable to add about 1 to 5 equivalents, preferably about 2 to 4 equivalents, of anisol. In the reaction, as a solvent, for example, methylene chloride, chloroform, THF, ethyl acetate and the like are used.
反^温度:ま約 一 30°C 〜 0 °Cさらに好ましくは約 一 20て〜 一 i O°Cで あり、 反応時間;ま約 Q . 5〜 8時間さらに好ましくは約 1 〜 4 時間であ . る。  Anti-Temperature: about 130 ° C. to 0 ° C., more preferably about 120 ° C. to 1 ° C., and reaction time; about Q. 5 to 8 hours, more preferably about 1 to 4 hours. is there.
接触還元法を用いる場合には、 触媒としてたとえばパラジウム，白金， それらの酸化物などを用い、 水素気流下に反応させる。  When the catalytic reduction method is used, for example, palladium, platinum, their oxides and the like are used as a catalyst and reacted under a stream of hydrogen.
反応温度は約 0て〜 50°Cさらに好ましくは約 10° (：〜 40てであり、 反応 時間は約 6時間さらに好ましくは約 2〜 2時間である。  The reaction temperature is about 0 to 50 ° C, more preferably about 10 ° (: to 40 ° C), and the reaction time is about 6 hours, more preferably about 2 to 2 hours.
このようにして生成した遊離のカルボン酸体は反応液中の不純物をろ 過あるいはク口マトグラフィ —法たとえば活性炭，吸着性樹脂などを用 いた方法などで取り除き、 濃縮，凍結乾燥することにより、 分離，採取， 精製できる。 The free carboxylic acid compound thus formed is separated by filtration of impurities in the reaction solution or removal by mouth chromatography, for example, by a method using activated carbon, an adsorbent resin, etc., followed by concentration and freeze-drying. , Collection, Can be purified.
上記各工程において、 得られた化合物が異性体の混合物である場合に は、 たとえばカラムクロマトグラフィ一，たとえば担体としてシリカゲ ル.セフアデッ クス L H— 20(フアルマシア社製、 スエーデン），ダイヤィ オン H P— 20などを用いた方法，あるいは再結晶法など、 また、 分取用 逆層系ク口マトグラフィ — [担体の例： YMCゲル， T S Kゲル ，移動層 の例：緩衝液またはメタノールあるいはァセトニトリルを含む緩衝液]な どにより各異性体成分に分離することが出来る。  In each of the above steps, when the obtained compound is a mixture of isomers, for example, column chromatography, for example, silica gel. Sephadex LH-20 (Pharmacia, Sweden) as a carrier, Diaion HP-20, etc. Reversed-layer chromatography for preparative methods, such as a method using a gel or a recrystallization method. [Example of carrier: YMC gel, TSK gel, Example of moving bed: buffer or buffer containing methanol or acetonitrile] For example, it can be separated into each isomer component.
後述の実施例 1で得られた TAN - 588ナトリゥム塩（Aおよび Bの平 銜混合物）の物理化学的性状をつぎに示す。  The physicochemical properties of the TAN-588 sodium salt (a mixture of A and B) obtained in Example 1 described below are shown below.
1 ) 外観：白色粉末  1) Appearance: white powder
23  twenty three
2) 比旋光度： [α] 19.0° ±10° (c = 0.5, 水中）  2) Specific rotation: [α] 19.0 ° ± 10 ° (c = 0.5, in water)
D  D
3 ) 構成元素が C , H， N , 0および Naからなる元素分析値（％)：五酸化 リ ン上 40°Cで 6時間乾燥した資料  3) Elemental analysis value (%) consisting of C, H, N, 0, and Na as constituent elements: Data dried for 6 hours at 40 ° C on phosphorus pentoxide
実 測 値 計 算 値 ¾ C , 38.5±2.0 C , 39.61 H, 4.5±1.0 H , 3.99 Measured value Calculated value ¾ C, 38.5 ± 2.0 C, 39.61 H, 4.5 ± 1.0 H, 3.99
N, 9.1±1.5 , 9.24  N, 9.1 ± 1.5, 9.24
0 , 39. 8  0, 39. 8
Na, 6.9±1.5 Na, 7.58  Na, 6.9 ± 1.5 Na, 7.58
(χ· 0.5モルの付着水を含むとして計算） ( χ · Calculated as including 0.5mol of attached water)
4 ) 水分含量： 3.0± 1 · 5% (熟天秤法） 4) Moisture content: 3.0 ± 1.5% (ripening method)
δ ) S I M S法による分子ィォンピークは次のとおりである。 δ) The molecular ion peaks by the SIMS method are as follows.
m/z 611(2 ÷ a)+, 317( +Na)+, 295( -rH)+ 6 ) 分子式：
Figure imgf000027_0001
m / z 611 (2 ÷ a) + , 317 (+ Na) + , 295 (-rH) + 6) Molecular formula:
Figure imgf000027_0001
) 紫外部吸収（UV)スぺク トル（水中）：第 1図 λ 216nm(E =130,肩） ) Ultraviolet absorption (UV) spectrum (in water): Fig. 1 λ216nm (E = 130, shoulder)
max lcm max lcm
) 赤外部吸収（〖 R)スペク トル（KBr法）： ) Infrared external absorption (〖R) spectrum (KBr method):
臭化力リゥム綻による吸収スぺク トル（第 2図）の主な吸収（波数） は次のとおりである。  The main absorption (wave number) of the absorption spectrum (Fig. 2) due to the bromide power failure is as follows.
3450, 1780, 1730, 1660, 1550, 1385, 1320, 1290, 1260, 1200, 1120, 1040, 980, 910, 810, 770, 690, 600, 540cm— L) 13C—核磁気共鳴（NMR)スぺク トル（100MHz,重水中）：下記の シグナルが認められる。 3450, 1780, 1730, 1660, 1550, 1385, 1320, 1290, 1260, 1200, 1120, 1040, 980, 910, 810, 770, 690, 600, 540cm— L ) 13 C—nuclear magnetic resonance (NMR) Vector (100MHz, heavy water): The following signals are observed.
182.02(s), 177.30(s), 173.79(s), 173.30(s), 173.25(s), 172.58(s), 96.97(s), 96.92(s), 74.27(t), 72.63(t), 55.57(d), 55.34(d), 31.92(0, 31.08(0, 30.98(t), 24.58 ( 'PPm (ただし、 s ； singlet , d ； doublet , t ； triplet , q; quartet) 182.02 (s), 177.30 (s), 173.79 (s), 173.30 (s), 173.25 (s), 172.58 (s), 96.97 (s), 96.92 (s), 74.27 (t), 72.63 (t), 55.57 (d), 55.34 (d), 31.92 (0, 31.08 (0, 30.98 (t), 24.58 ('PPm (where s; singlet, d; doublet, t; triplet, q; quartet)
) 円二色性（C D)スペク トル（水中）： ) Circular dichroism (CD) spectrum (underwater):
232二 3Mに negativeのコッ トン効果を示す。 232-23M shows a negative cotton effect.
) 溶解性： ) Solubility:
可溶；水，ジメチルスルフォキサイ ド。  Soluble; water, dimethyl sulfoxide.
難溶； g乍酸ェチル，クロ口ホルム，ジェチルエーテル。 Poorly soluble; g ethyl ether, black form, getyl ether.
) 呈色反応： ) Color reaction:
陽性；ニンヒ ドリ ン反応  Positive; ninhydrin reaction
陰性；グレイグ ' リ ーバヅ ク ，坂口，エールリ 、ソ ヒ，バー トン， ド ラ—ゲン ドルフ反応 Negative; Greig's Reevek, Sakaguchi, Ehrli, Sohi, Burton, Dragendorf reaction
) ァミ ノ酸分折： 6 N-塩酸中， 20時間，L05°Cで加水分解すると既知 アミ ノ酸としてセリ ンが検出される。 ) Amino acid analysis: known to hydrolyze in 6 N-hydrochloric acid at L05 ° C for 20 hours Serine is detected as an amino acid.
14) 安定性：水溶液中 PH 5では安定、 pH 3および 7ではやや不安定、 PH 9では不安定。  14) Stability: Stable at pH 5 in aqueous solution, slightly unstable at pH 3 and 7, unstable at pH 9.
15) 薄層クロマトグラフィー（T L C) (セルロース f,東京化成工業株式 会社製、 日本）：  15) Thin layer chromatography (TLC) (cellulose f, manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Japan):
溶 媒 系 Rf 値 ァセト二トリル：水（4： 1 ) 0. 33 ブタノ —ル：酢酸：水（1 : 1 : 1 ) 0. 77 ァセト二トリル： 3 %硫酸ァンモニゥム（ 4： 1 ) 0. 28  Solvent system Rf value Acetonitrile: water (4: 1) 0.33 Butanol: acetic acid: water (1: 1: 1) 0.77 Acetonitrile: 3% ammonium sulfate (4: 1) 0. 28
16) 酸性，中性，塩基性の区別：中性物質 16) Distinguishing between acidic, neutral and basic: neutral substances
17) 高速液体クロマトグラフィ—（HP L C) (担体： YMC A-312, 山村化学研究所製， 日本，移動層： 4 %, メタノールノ 0.01M憐酸 緩衝液（PH6.3), 2 tnl/mln):  17) High Performance Liquid Chromatography (HP LC) (Carrier: YMC A-312, manufactured by Yamamura Chemical Laboratory, Japan, mobile phase: 4%, methanolic 0.01M phosphate buffer (PH6.3), 2 tnl / mln ):
Rt = 4.3および 4.8(min)  Rt = 4.3 and 4.8 (min)
後述の実施例 4で得られた T A N— 588のパラニトロべンジルエステ ル（ Aおよび Bの混合物）の物理化学的性状をつぎに示す。  The physicochemical properties of TAN-588 paranitrobenzyl ester (mixture of A and B) obtained in Example 4 described below are shown below.
1 ) 外観：白色粉末  1) Appearance: white powder
23  twenty three
2) 比旋光度：[ ] +16.3° ±5° (C =0.485, C H C 13中） 2) Specific rotation: [] + 16.3 ° ± 5 ° (C = 0.485, in CHC 1 3)
3) 分子量： 407(S I MS法による） 3) Molecular weight: 407 (by SMS method)
4) 元素分圻値：  4) Element value:
計算値： C , 50.13; H.4.21; .10.32; 0 ,35.35  Calculated: C, 50.13; H.4.21; .10.32; 0, 35.35
実測値： C, 50.26; H.4.32; ,10.31  Found: C, 50.26; H.4.32;, 10.31
5) 分子式： C 17H17N3〇 3 6) UVスぺク トル： AMe0 H nm(E1% ) = 262 ± 2(281± 20) . 5) Molecular formula: C 17 H 17 N 3 〇 3 6) UV spectrum: A Me0 H nm (E 1% ) = 262 ± 2 (281 ± 20).
max lcm  max lcm
214± 2(278±20,肩）  214 ± 2 (278 ± 20, shoulder)
7 ) I Rスぺク トル： KB r法，第 3図  7) IR spectrum: KBr method, Fig. 3
3400, 3080, 2960, 1805, 1760, 1680, 1610, 1520, 1450 3400, 3080, 2960, 1805, 1760, 1680, 1610, 1520, 1450
1380, 1350, 1270, 1180, 1105, 1050, 1015, 970, 905, 850. 740, 690, 600. 540 cm"1 1380, 1350, 1270, 1180, 1105, 1050, 1015, 970, 905, 850.740, 690, 600.540 cm " 1
8 ) — NMRスペク トル： 90MHz. CD Cl3中 5 ppm J (Hz). 8) - NMR spectrum: 90 MHz CD Cl 3 in 5 ppm J (Hz)
2.05(3H,s), 2.3-3.3(4H,m), 4.iO(lH,m), 4.5 -5.1(2H, m) , 5.35 (2H,s), 6.25(lH,d,like),7.55(2H>dd like), 8.27(2H,d, like)2.05 (3H, s), 2.3-3.3 (4H, m), 4.iO (lH, m), 4.5 -5.1 (2H, m), 5.35 (2H, s), 6.25 (lH, d, like), 7.55 (2H > dd like), 8.27 (2H, d, like)
9 ) Tし C : 9) T then C:
担体：シリ力ゲル（メルク社製，西独）  Carrier: Siri force gel (Merck, West Germany)
展開溶媒：クロ口ホルム：メタノ ―ル（19: 1 ) .  Developing solvent: black form: methanol (19: 1).
Rf値， 25および 0.32 Rf value, 25 and 0.32
0) 酸性，中性，塩基性の区別：中性物質  0) Distinguishing between acidic, neutral and basic: neutral substances
後述の実施例 4で得られた T'AN— 588Aパラ二 ト σベンジルエステ ルの物理化学的性状を以下に示す。  The physicochemical properties of the T'AN-588A para-sigma benzyl ester obtained in Example 4 described below are shown below.
1 ) 外観：白色粉末  1) Appearance: white powder
20  20
2) 比旋光度： [α] 97.3° ±15。 （C =0.48, C H C 13中） 2) Specific rotation: [α] 97.3 ° ± 15. (C = 0.48, in CHC 1 3)
D  D
3 ) 分子量： 407(S I MS法による）  3) Molecular weight: 407 (by SMS method)
4) 元素分折値：  4) Element analysis value:
計算値： C , 50.13;. H.4.21; .10.32; 0 ,35.35  Calculated: C, 50.13 ;. H.4.21; .10.32; 0, 35.35
実測値： C , 50.20; H ,4.22; .I0.13  Found: C, 50.20; H, 4.22; .I0.13
5 ) 分子式： C 17H17N3〇 3 6 ) UVスぺク トル： A Me0 n (E 1% ) = 262± 2 ηπι(280±30), 5) Molecular formula: C 17 H 17 N 3 〇 3 6) UV spectrum: A Me0 n (E 1% ) = 262 ± 2 ηπι (280 ± 30),
max lcm  max lcm
214土 2 nm(276±30. 肩）  214 earth 2 nm (276 ± 30. Shoulder)
7 ) l3C— NMRスペク トル：（100MHz, C D C l3), 7) l3 C-NMR spectrum: (100MHz, CDC l 3) ,
173.70(s), 171.53(s), 170.72(s), 165.09(s), 148.06(s), 141.38(s), 128.86(d), 123.91(d), ei.82(s), 71.60(t), 173.70 (s), 171.53 (s), 170.72 (s), 165.09 (s), 148.06 (s), 141.38 (s), 128.86 (d), 123.91 (d), ei.82 (s), 71.60 (t ),
67.29(t), 53.00(d), 29.09(t), 27.49(t), 22.64(q) . ppm.67.29 (t), 53.00 (d), 29.09 (t), 27.49 (t), 22.64 (q) .ppm.
8 ) I Rスペク トル： KBr法 第 4図 8) IR spectrum: KBr method Fig. 4
3400, 3080, 2950, 1805, 1775, 1760, 1680, 1610, 1530, 1450, 1380, 1350, 1300, 1275, 1190, 1105, 1060, 1020 980, 910, 850, 740, 700, 600, 540 cm"1 9 ) Tし C： 3400, 3080, 2950, 1805, 1775, 1760, 1680, 1610, 1530, 1450, 1380, 1350, 1300, 1275, 1190, 1105, 1060, 1020 980, 910, 850, 740, 700, 600, 540 cm " 1 9) T then C:
担体：シリカゲル（メルク社製，西独）  Carrier: silica gel (Merck, West Germany)
展開溶媒，クロ口ホルム：メタノ ール（19: 1 )  Developing solvent, black form: methanol (19: 1)
Rf値，0.25  Rf value, 0.25
10) 酸性，中性，塩基性の区別：中性物質 '  10) Distinguishing between acidic, neutral and basic: neutral substances ''
後述の実施例 4で得られた T A N— 588 Bパラニトロべンジルエステ ルの物理化学的性状をつぎに示す。  The physicochemical properties of TAN-588B paranitrobenzyl ester obtained in Example 4 described below are shown below.
1 ) 外観：白色粉末 1) Appearance: white powder
20  20
2) 比旋光度：[α] 64.5° ±15° (C =0.50, C H C 13中） 2) Specific rotation: [α] 64.5 ° ± 15 ° (C = 0.50, in CHC 1 3)
D  D
3 ) 分子量： 407 (S I MS法による）  3) Molecular weight: 407 (by SMS method)
4) 元素分忻値：  4) Elemental Xin value:
計算値： C , 50.13; H.4.21; N.10.32; 0 ,35.35  Calculated: C, 50.13; H.4.21; N.10.32; 0, 35.35
実測値： C , 50.10; Η,4.21; ' , 10.15  Found: C, 50.10; Η, 4.21; ', 10.15
5 ) 分子式： C t7H 17Μ3〇 3 一 29- 5) Molecular formula: C t7 H 17 Μ 3 〇 3 I 29-
6 ) UVスペク トル：え Me° H(E 1%) = 262土 2 nm(282±30), max lcm 6) UV spectrum: Me ° H (E 1% ) = 262 soil 2 nm (282 ± 30), max lcm
214+ 2 nm(280±30, 肩）  214+ 2 nm (280 ± 30, shoulder)
7 ) 13C— NMRスペク トル：（100MHz, C D C l3), 7) 13 C-NMR spectrum: (100MHz, CDC l 3) ,
173.59(s), 170.86(s), 170.61(s), 165.06(s), 148.12(s),  173.59 (s), 170.86 (s), 170.61 (s), 165.06 (s), 148.12 (s),
141.24(s), 128.96(d), 123.96(d), 91.69(s), 74.60(t), 67.39141.24 (s), 128.96 (d), 123.96 (d), 91.69 (s), 74.60 (t), 67.39
(t), 51.94(d), 29.11(0, 27.38(t), 22.67 (q) . pptn. (t), 51.94 (d), 29.11 (0, 27.38 (t), 22.67 (q) .pptn.
8 ) I Rスペク トル： KBr法，第 5図  8) IR spectrum: KBr method, Fig. 5
3400, 3090, 2950, 1805, 1760, 1680, 1610, 1530, 1450, 1380, 1355, 1270, 1180, 1105, 1055, 1015, 965, 910, 3400, 3090, 2950, 1805, 1760, 1680, 1610, 1530, 1450, 1380, 1355, 1270, 1180, 1105, 1055, 1015, 965, 910,
10 Ten
855, 740, 695, 600, 540 cm-1 855, 740, 695, 600, 540 cm -1
9) でし じ：丁八^ ー ^八パラニトロべンジルエステルの場合と同一 条件 - Rf値， 0.32  9) Deji: same conditions as in the case of chopachi ^-^ p-paranitrobenzyl ester-Rf value, 0.32
ンッヒ ドリルエステル（ A型 ぎに示す。 Nrich drill ester (shown in Type A)
.52, C H C 13中） .52, in CHC 1 3)
39; 0 ,25.5439; 0, 25.54
28
Figure imgf000031_0001
7) UVスペク トル：メタノ ール中 28
Figure imgf000031_0001
7) UV spectrum: in methanol
1%  1%
λ max 220土 2 ntn(E 285土 50. 肩）および  λ max 220 soil 2 ntn (E 285 earth 50. shoulder) and
lcm  lcm
1%  1%
250 - 260nm(E 28 ±10, 肩）  250-260nm (E 28 ± 10, shoulder)
lcm  lcm
8) I Rスぺク トル： KB r法，第 6図  8) IR spectrum: KBr method, Fig. 6
3380, 3080, 3050, 2960, 1800, 1780, 1750, 1705, 1690, 1600, 1590, 1540, 1500, 1460, 1380, 1310, 1280, 1190; 3380, 3080, 3050, 2960, 1800, 1780, 1750, 1705, 1690, 1600, 1590, 1540, 1500, 1460, 1380, 1310, 1280, 1190 ;
1110, 1060, 980, 920, 880, 750, 710, 700, 650, 630 610, 570, 550, 470 cm"1 1110, 1060, 980, 920, 880, 750, 710, 700, 650, 630 610, 570, 550, 470 cm " 1
9) lH— NMRスぺク トル： 90MHz, C D C 13中， 9) l H- NMR spectrum: 90 MHz, in CDC 1 3,
<5 ppm J(Hz) ,  <5 ppm J (Hz),
1.97(3H,s')， 2.1-3.5(4H,m) 3.8-4.2(1H, in) , 4.5 -5.1(2H, m) , 6.1-6.4(lH,br), 6.97(lH,s), 7.3-7. (10H, m)  1.97 (3H, s'), 2.1-3.5 (4H, m) 3.8-4.2 (1H, in), 4.5-5.1 (2H, m), 6.1-6.4 (lH, br), 6.97 (lH, s), 7.3-7. (10H, m)
(mrmult iplet , br : broad, H： roton を表わす)  (mrmult iplet, br: broad, H: roton)
10) T L C：後述 A型のそれと同じ条件  10) TLC: The same conditions as those of type A described later
Rf値， 0.58および 0.65  Rf values, 0.58 and 0.65
11) 酸性，中性，塩基性の区別：中性物質  11) Distinguishing between acidic, neutral and basic: neutral substances
後述する実施例 5で得られた T A N― 588ベンッヒ ドリルエステル（ A 型）および T AN— 588ベンツヒ ドリルエステル（B型）の'物理化学的性状 をつぎに示す。  The physicochemical properties of TAN-588 Benzhydryl ester (Type A) and TAN-588 Benzhydryl ester (Type B) obtained in Example 5 described below are shown below.
A型化合物 Type A compound
1 ) 外観：無色結晶 1) Appearance: colorless crystal
2) 融点： 9'7〜135°C (徐々に発泡，分解）  2) Melting point: 9'7 ~ 135 ° C (slow foaming, decomposition)
3) 比旋光度： [α]21 +44.2° ±10° ( C = 0.505 , C H C 13中） 3) Specific rotation: [α] 21 + 44.2 ° ± 10 ° (C = 0.505, in CHC 1 3)
4) 分子量： Ε I — MS法による分子イオンピーク m/z 438(M+) 4) Molecular weight: Ε I — Molecular ion peak by MS method m / z 438 (M + )
5 ) 元素分折値： 5) Element analysis value:
計算値： C .63.01: H ,5.06; N.6.39; 0 ,25.54  Calculated: C. 63.01: H, 5.06; N. 6.39; 0, 25.54.
実測値： C , 62.62: H.5.06; .6.32  Found: C, 62.62: H.5.06; .6.32
) 分子式： C 23H22N207 ) Molecular formula: C 23 H 22 N 2 0 7
) 紫外線吸収（UV)スペク トル：（メタノ ―ル中）  ) Ultraviolet absorption (UV) spectrum: (in methanol)
1 ο 1 ο
λ 220土 2 nm(E = 290 ±50, 肩）  λ 220 soil 2 nm (E = 290 ± 50, shoulder)
max lcm および 250 - 260nm(E =30±10, 肩） - lcm  max lcm and 250-260nm (E = 30 ± 10, shoulder)-lcm
8) I Rスペク トル： KB r法，第 7図  8) IR spectrum: KBr method, Fig. 7
3380, 3080, 3050, 1800, 1780, 1760, 1685, 1540, 1500, 1450, 1380, 1310, 1280, 1190, 1110 1050， 980, 920, 3380, 3080, 3050, 1800, 1780, 1760, 1685, 1540, 1500, 1450, 1380, 1310, 1280, 1190, 1110 1050, 980, 920,
880, 750, 710, 650, 610, 550 cm一1 880, 750, 710, 650, 610, 550 cm one 1
9) 1H— NMRスペク トル ： 100MHz, C D Cl3, de — DMS〇 液中， <5 ppm J (Hz) 9) 1 H- NMR spectrum: 100MHz, CD Cl 3, d e - DMS_〇 solution, <5 ppm J (Hz)
1.98(3H,s), 2.2-3.4(4H,ni), 4.10(1H, dd, J = 8, 10) , 4.4-o.0(2H, m), 6.93(lH,s), 7.3 -7.5(10H, m) , 8.27(lH,d, J = 7)  1.98 (3H, s), 2.2-3.4 (4H, ni), 4.10 (1H, dd, J = 8, 10), 4.4-o.0 (2H, m), 6.93 (lH, s), 7.3 -7.5 (10H, m), 8.27 (lH, d, J = 7)
10) 薄層クロマ ト グラフィ ー（T L C): . 担体，シリカゲル（メルク社製，西独），  10) Thin-layer chromatography (TLC): carrier, silica gel (Merck, West Germany),
展開溶媒，詐酸ェチル  Developing solvent, ethlic acid
Rf値， 0.58 Rf value, 0.58
1) 酸性，中性，塩基性の区別：中性物質  1) Distinguishing between acidic, neutral and basic: neutral substances
B型化合物 Type B compound
1 ) 外観：無色結晶  1) Appearance: colorless crystal
2) 融点： 157- i60°C (分解点） 2) Melting point: 157- i60 ° C (decomposition point)
2 - . I 2-. I
5 32  5 32
21  twenty one
3) 比旋光度： [な ] —D — 28.8° ±10° (C =0.5, C H C 13中） 3) Specific rotation: [Do] - D - 28.8 ° ± 10 ° (C = 0.5, in CHC 1 3)
4) 分子量： πιΖζ 438(M+)(E I - MS法） 4) Molecular weight: πιΖζ 438 (M +) (E I-MS method)
5) 元素分圻値：  5) Element value:
計算値： C , 63.01; H.5.06; N.6.39; 0 ,25.54 実測値： C .63.11; H.5.13; N.6.30  Calculated: C, 63.01; H.5.06; N.6.39; 0, 25.54 Found: C.63.11; H.5.13; N.6.30
6) 分子式： C 23H22N207 6) Molecular formula: C 23 H 22 N 2 0 7
7 ) UVスペク トル：メタノール中  7) UV spectrum: in methanol
1 o  1 o
λ 220土 2 nm(E = 300 ±50, 肩）  λ 220 soil 2 nm (E = 300 ± 50, shoulder)
max lcm  max lcm
10  Ten
1%  1%
および 25Q - 260ηπι(Ε 26±10, 肩）  And 25Q-260ηπι (Ε 26 ± 10, shoulder)
lcm  lcm
8) I Rスぺク トル： K B r法，第 8図  8) IR spectrum: KBr method, Fig. 8
3400, 3080, 3050, 1815, 1780, 1735, 1705, 1540, 1460 1380, 1290, 1265, 1190, 1060, 980, 920, 880, 760， 715, 610, 550 cm—1 3400, 3080, 3050, 1815, 1780, 1735, 1705, 1540, 1460 1380, 1290, 1265, 1190, 1060, 980, 920, 880, 760, 715, 610, 550 cm— 1
9) lH- NMRスぺク トル 'ΛΟΟΜΗζ, CD C 中 9) l H-NMR spectrum 'ΛΟΟΜΗζ, in CD C
δ ppm J (Hz) ,  δ ppm J (Hz),
1.98(3H,s), 2.2-3.4(4H,m), 4.03(1H, dd, J = 8, 10) , 4.6-5.2(2H, fli), 6.32(lH,d, J = 5), 6.96(lH,s), 7.2 -7.5(10H, m) 0 10) Tし C :(A型の場合と同じ条件）  1.98 (3H, s), 2.2-3.4 (4H, m), 4.03 (1H, dd, J = 8, 10), 4.6-5.2 (2H, fli), 6.32 (lH, d, J = 5), 6.96 (lH, s), 7.2 -7.5 (10H, m) 0 10) T then C: (Same conditions as for type A)
Rf値， 0.65  Rf value, 0.65
11) 酸性，中性.塩基性の区別：中性物質  11) Distinguishing between acidic, neutral and basic: neutral substances
実施例 6で得られた T A N— 588の N—デァセチル体のベンツヒ ドリ ルエステル（ A型および B型の混合物）の物理化学的性状を以下に示す。 1 ) 外観：白色粉末 ) 比旋光度： [a] 15.2° ± 5 ° (C =0.5, C H C 13中） ) 分子量： mZz 396(Μ+)(Ε I - MS法）The physicochemical properties of the benzhydryl ester of N-deacetyl of TAN-588 (mixture of type A and type B) obtained in Example 6 are shown below. 1) Appearance: white powder ) Specific rotation: [a] 15.2 ° ± 5 ° (C = 0.5, in CHC 1 3)) molecular weight: mZz 396 (Μ +) ( Ε I - MS method)
) 元素分圻値：  ) Element value:
計算値： C , 63.63; H ,5.09; N ,7.07; 0 ,24.22  Calculated: C, 63.63; H, 5.09; N, 7.07; 0, 24.22
実測値： C , 63.63; H.5.05; Ν,'7.02  Found: C, 63.63; H.5.05; Ν, '7.02
^ D ^ D
) 分子式： C 21Η20Ν2〇 8 ) Molecular formula: C 21 Η 20 Ν 2 〇 8
) UVスペク トル：メタノ ール中  ) UV spectrum: in methanol
1 ο/  1 ο /
λ 220士 2 nm(E = 336±50, 肩）  λ 220 person 2 nm (E = 336 ± 50, shoulder)
max lcm  max lcm
1 ¾  1 ¾
250 -260nm(E =32±10, 肩）  250 -260nm (E = 32 ± 10, shoulder)
lcm lcm
) I Rスペク トル： K Br法，第 9図  ) IR spectrum: K Br method, Fig. 9
3400, 3050, 2970, 1800, 1780, 1740, 1600, 1500, 1460; 1305, 1270, 1190, 1110, 1060， 980, 920, 880, 850, 750, 710, 650, 620, 605 cm"1 3400, 3050, 2970, 1800, 1780, 1740, 1600, 1500, 1460 ; 1305, 1270, 1190, 1110, 1060, 980, 920, 880, 850, 750, 710, 650, 620, 605 cm " 1
8 ) lH ^)NMRスぺク トル： 90MHz, C D C 13中 8) l H ^) NMR spectrum: 90MHz, CDC 1 3 in
δ ppm J (.Hz;,  δ ppm J (.Hz ;,
2.2-3.5(4H,m), 3.7 -4.0 (2H, m) , 4. -4.6(1H, m) , 6.97(lH,s), 7.2- 7.4(10H，m)  2.2-3.5 (4H, m), 3.7 -4.0 (2H, m), 4.-4.6 (1H, m), 6.97 (lH, s), 7.2-7.4 (10H, m)
9 ) 高速液体クロマ トグラフィ ー（H P L C):  9) High Performance Liquid Chromatography (HPLC):
機器， Model 6000 AZ660 440(ゥォ—タ―ズ社製、 米国） 担体， YMC - P ack A - 312 (山村化学研究所製，日本）  Equipment, Model 6000 AZ660 440 (manufactured by Waters Inc., USA) Carrier, YMC-Pack A-312 (manufactured by Yamamura Chemical Laboratory, Japan)
移動相， 65%メタノ ール Z0.01Mリ ン酸緩衝液（PH 6.3)  Mobile phase, 65% methanol Z0.01M phosphate buffer (PH 6.3)
流速， 2 ml 'min.
Figure imgf000035_0001
Flow rate, 2 ml 'min.
Figure imgf000035_0001
0) 呈色反応：  0) Color reaction:
陽性，ニン.ヒ ドリ ン 陰性，塩化第二鉄 Positive, nin.hydrin Negative, ferric chloride
11) 酸性，中性，塩基性の区別：塩基性物質 11) Distinguishing between acidic, neutral and basic: basic substances
実施例 7で得られた T AN— 588の N—デァセチル体（A型および B型 の混合物）の物理化学的性状をつぎに示す。  The physicochemical properties of the N-deacetyl form of TAN-588 (mixture of type A and type B) obtained in Example 7 are shown below.
1 ) 外観：白色粉末  1) Appearance: white powder
2) 比旋光度： [ ]— 一 11° ± 5° (C =0.1,水中） 2) Specific rotation: [] — 11 ° ± 5 ° (C = 0.1, underwater)
3) 分子量： mZz 231 (M+H)+ (FD - MS法） 3) Molecular weight: mZz 231 (M + H) + (FD-MS method)
4 ) 元素分忻値：  4) Elemental Xin value:
実 測 値 計 算 値' X'  Measured value Calculated value 'X'
C ,40.42 C ,40.17  C, 40.42 C, 40.17
Η, 4.36 H, 4.64  Η, 4.36 H, 4.64
Ν, 11.65 N.11.71  Ν, 11.65 N.11.71
0 ,43.48  0, 43.48
Cx 付着水 0.5モルを含むとして計算） Calculated as including 0.5 mol of C x attached water)
5 ) 分子式： CeH NaOeCO.SHsO)  5) Molecular formula: CeH NaOeCO.SHsO)
6 ) じ Vスべク トル：水中  6) J V vector: Underwater
1 OA  1 OA
λ 221± 2 nm(E =154±20)  λ 221 ± 2 nm (E = 154 ± 20)
max lcm  max lcm
7) I Rスペク トル： KBr法，第 10図  7) IR spectrum: KBr method, Fig. 10
主な吸収はつぎのとおりである。  The main absorptions are as follows.
3450, 3220, 2960, 2900, 1800, 1760, 1740, 1670, 1580 1420, 1390, 1370, 1310, 1250, 1200, 1120, 1050, 1030. 980, 950, 920, 810, 770, 720, 690, 610, 540 cm"1 3450, 3220, 2960, 2900, 1800, 1760, 1740, 1670, 1580 1420, 1390, 1370, 1310, 1250, 1200, 1120, 1050, 1030.980, 950, 920, 810, 770, 720, 690, 610 , 540 cm " 1
8) — NMRスペク トル： 400MHz, D20中、 下記のシグナルが認 めら lる。 Sppm J (Hz) 2.52 (lH,m), 2.72 (lH.m), 2.91 (lH.m), 3.08 (lH.m), 4.35 (lH.m), 4.56 (lH.m) 4.80 (lH.m) 8) - NMR spectrum: 400 MHz, in D 2 0, the following signal is Ru sure Mera l. Sppm J (Hz) 2.52 (lH, m), 2.72 (lH.m), 2.91 (lH.m), 3.08 (lH.m), 4.35 (lH.m), 4.56 (lH.m) 4.80 (lH.m)
9) 円二色性（CD)スペク トル：水中  9) Circular dichroism (CD) spectrum: underwater
233土 3 nmに negativeのコ ッ ト ン効果を示す。  233 soil shows a negative Cottton effect at 3 nm.
10) 溶解性  10) Solubility
可溶：水  Soluble: water
難溶：ジメチルスルフォキサイ ド，詐酸ェチル，ジェチルェ—テル Poorly soluble: dimethyl sulfoxide, ethyl sulphate, getyl ether
11) HP L C：機器，担体，' 速は前述のデァセチル体のベンツヒ ドリル エステル（A型および B型の混合物）の条件と同じ。 11) HP LC: Equipment, carrier, and speed are the same as those of the above-mentioned benzhydryl ester (mixture of type A and type B) of deacetyl.
移動相， 0.01Mリ ン酸緩衝液（PH6.3)  Mobile phase, 0.01M phosphate buffer (PH6.3)
Rt: 3.1および 3.3min  Rt: 3.1 and 3.3min
12) 呈色反応 .  12) Color reaction.
陽性：ニンヒ ドリ ン， ョ ー ド  Positive: ninhydrin, anode
陰性：塩化第二鉄  Negative: ferric chloride
13) 酸性，中性，塩基性の区別：両性物質  13) Acidic, neutral and basic: amphoteric
実施例 8で得られた T A N— 588の N デァセチル体（ A型）の結晶の 物理  Physics of the crystals of the N deacetyl form of TAN-588 (form A) obtained in Example 8
化学的性伏を以下に示す。 ― -The chemical properties are shown below. ―-
1 ) 外観：無色結晶 · 1) Appearance: colorless crystal ·
2) 融点： 177- 18 C (分解点）  2) Melting point: 177-18 C (decomposition point)
25  twenty five
3) 比旋光度：[α] 124° ±20° (C =0.1, 水中）  3) Specific rotation: [α] 124 ° ± 20 ° (C = 0.1, in water)
D  D
4 ) 分子量： ηιΖζ 23ΚΜ H)+ (F D— MS法）  4) Molecular weight: ηιΖζ 23ΚΜ H) + (FD-MS method)
δ) 元素分圻値： δ) Element value:
実 測 値 計 算 値  Measured value Calculated value
C , 41.57 C ,41.75 H, 4.39 H, 4.38 C, 41.57 C, 41.75 H, 4.39 H, 4.38
, 12.11 N.12.17  , 12.11 N.12.17
0 ,41.71 0, 41.71
) 分子式： C8Ht。N20 ) Molecular formula: C 8 H t. N 2 0
) UVスぺク トル：水中 ) UV spectrum: Underwater
1%  1%
λ 221± 2 mn(E =151±20)  λ 221 ± 2 mn (E = 151 ± 20)
max lcm max lcm
) I Rスペク トル： KBr法，第 11図 · ) IR spectrum: KBr method, Fig. 11 ·
主な吸収はつぎの通り。  The main absorption is as follows.
3450, 3220, 2950, 2900, 1800, 1735, 1660, 1580, 1440, 1420, 1400, 1360, 1340, 1310, 1280, 1200, 1160, 1110, 1050, 1025, 980, 940, 920, 810, ' 770, 710, 690, 600, 540 cm"1 3450, 3220, 2950, 2900, 1800, 1735, 1660, 1580, 1440, 1420, 1400, 1360, 1340, 1310, 1280, 1200, 1160, 1110, 1050, 1025, 980, 940, 920, 810, '770 , 710, 690, 600, 540 cm " 1
) — NMRスぺク トル： 400MHz, D 20中、 下記のシグナルが認 めら る。 5 pp-m J (Hz; ) — NMR spectrum: 400 MHz, the following signal is observed in D 20 . 5 pp-m J (Hz;
2.52 (lH.m), 2.72 (lH,m), 2.91 (lH.m), 3.08 (lH.m), 4.34 (lH.m), 4.55 (lH.tn), 4.78 (IH.m) 2.52 (lH.m), 2.72 (lH, m), 2.91 (lH.m), 3.08 (lH.m), 4.34 (lH.m), 4.55 (lH.tn), 4.78 (IH.m)
) C Dスぺク トル： 中 ， -) C D vector: Medium,-
238士 3 mnに negativeのコ 'ソ ト ン効果を示す。238 people 3 mn show a negative co-Son effect.
) 溶解性： ) Solubility:
可溶：水  Soluble: water
難溶：ジメチルスルフォキサイ ド，酢酸ェチル，クロ口ホルム，ジ ェチルエーテル ) HP L C：条件は前述の A型と B型との混合物の場合と同じ  Poorly soluble: dimethyl sulfoxide, ethyl acetate, chloroform, dimethyl ether) HPLC: Conditions are the same as for the mixture of type A and type B described above.
Rt， 3.3min Rt, 3.3min
) 酸性，中性，塩基性の区別：両性物質 37 ) Distinguishing between acidic, neutral and basic: amphoteric 37
実施例 9で得られた T A N— 588の N—デァセチル体（ B型）の粉末の 物理化学的性状を以下に示す。  The physicochemical properties of the powder of the T-N-588 N-deacetyl derivative (form B) obtained in Example 9 are shown below.
1 ) 外観：白色粉末  1) Appearance: white powder
2 ) 分子量： mZz 231(M+ H)+ (F D— M S法）  2) Molecular weight: mZz 231 (M + H) + (FD-MS method)
3) 元素分析値：  3) Elemental analysis value:
実 測 値 計 算 値'  Measured value Calculated value '
C ,40.98 C ,40.17  C, 40.98 C, 40.17
H , 4.88 H , 4.64 H, 4.88 H, 4.64
.12.17 iN.ll.71  .12.17 iN.ll.71
10 0 ,43.48  10 0, 43.48
0s 0.5モルの付着水を含むとして計算） 0 s Calculated as including 0.5 mol of attached water)
4 ) 分子式： CsH ^N aO s .  4) Molecular formula: CsH ^ NaOs.
5 ) U Vスぺク トル：水中 · 33±20) 図 1670, 1570 1520, 1390, 1050, 990, 920, 810, 760, Hz, D20中、 下記のシグナルが認 2.90 (lH.m), 3.08 (lH,m), 4.86 (lH.m)
Figure imgf000039_0001
5) UV spectrum: in water · 33 ± 20) FIG. 1670, 1570 1520, 1390, 1050 , 990, 920, 810, 760, Hz, in D 2 0, the following signal is certified 2.90 (lH.m) , 3.08 (lH, m), 4.86 (lH.m)
Figure imgf000039_0001
224± 2 nmに negativeのコッ トン効果を示す。 - 9 ) 溶解性： A negative Coton effect is shown at 224 ± 2 nm. - 9) Solubility:
可溶：水  Soluble: water
難溶：ジメチルスルフォキサイ ド，詐酸ェチル，クロロフオルム，ジ ェチルエーテル  Poorly soluble: dimethyl sulfoxide, ethyl sulphate, chloroform, dimethyl ether
10) HP L C：条件は前述の A型と B型との混合物と同じ 10) HP L C: Conditions are the same as for the mixture of type A and type B described above.
Rt, 3. lmin  Rt, 3. lmin
11) 酸性，中性，塩基性の区別：両性物質 11) Acidic, neutral and basic: amphoteric
以上述べた物理化学的性状および反応工程から、 TAN— 588は、 窒 素に結合したァセチル基を有し、 またカルボキシル基を有することが分 かる。  From the physicochemical properties and the reaction steps described above, it is understood that TAN-588 has an acetyl group bonded to nitrogen and a carboxyl group.
次に T AN— 588の生物学的性状について述べる。 T AN— 588ナトリ ゥム塩（Aおよび Bの平衡混合物）の各種微生物に対する抗菌スぺク トル は第 1表に示すとおりである。 · Next, the biological properties of TAN-588 are described. The antibacterial spectrum of TAN-588 sodium salt (an equilibrium mixture of A and B) against various microorganisms is shown in Table 1. ·
最小生育阻止濃度（注 1 )Minimum growth inhibitory concentration (Note 1)
^ ( g/ ml) ^ (g / ml)
スタフイロコ ヅカス · ァゥレウス FDA 209P 3.13 ミ クロコッカス 《 ルテウス IFO 12708 0.39 バチルス · ズブチリ ス NIHJ PCI 219 3.13 ノくチルス · セレウス FDA • 5 12. δ ェシエリ ヒア . コリ NIHJ JC 2 50 サルモネラ * チフィムリ ウム IFO 12529 50 シ トロ くクタ一 · フ σインディ IFO 12681 100 ク レブシェラ ♦ ニューモニエ IFO 3317 100 セラチア · マ Jレセッセンス IFO 12648 50 プロテウス · ミ ラビリス ATCC 21100 25 プ σテウス · ブルガリス IFO 3988 25 プロテウス · モルガニー IFO 3168 100 シュ一 ドモナス · エルギノ 一サ IFO 3080 >100 アルカ リゲネス · フエカ リス IFO 13111 50 ァシネ トバクタ一 · カルコアセテ' f クス IFO 13006 25 Staphylococcus apareus FDA 209P 3.13 Micrococcus 《Luteus IFO 12708 0.39 Bacillus subtilis NIHJ PCI 219 3.13 S. cereus F. cereus FDA • 5 12. δ Escherichia coli.ク タ Indy σ Indy IFO 12681 100 Cleb シ ェ scher ♦ Pneumonia IFO 3317 100 Serratia Ma J. Recessessen IFO 12648 50 Proteus mirabilis ATCC 21100 25 σ ウ ス Teus Bulgaris IFO 3988 25 Proteus Morgany IFO 3168 100 Sh 一 domonas · Elgino IFO 3080> 100 Arca Ligenes · Fuécaris IFO 13111 50 Acinet Tobacco · Calcoacete 'fcus IFO 13006 25
(注 1 ) 培地として、 バク ト · アンティピオティ、：；ク · メディウム 3 (Note 1) Bacterium antipioty, as medium :;
(ディフコ ' ラボラ ト リ ーズ、 米国）； 17.5g,バク ト ' イース ト • エキス トラク ト（ディフコ ' ラボラ ト リ —ズ、 米国）； 5.0gノく ク ト · ァガー（ディフコ · ラボラ トリ—ズ、 米国）； 20g,蒸留水； 1000mJ2(pH無調整）を用い、 接種菌液として約 108コロニー · フ ォ一ミ ング .ュニッ ト/ mJgを用いた。 (Difco's Laboratories, USA); 17.5g, Bact's East Extract (Difco's Laboratories, USA); 5.0g, Noct Agar (Difco's Laboratories) 's, USA); 20 g, distilled water; 1000MJ2 used (pH unadjusted) and used about 108 colony-off O seemingly ring as inoculum Yuni' DOO / MJG..
また TAN— 588ナトリ ゥム塩の実験的マウス感染症における治療効 果は第 2表に示すとおりである。 感 染 蘭 投与法 E D soCmg/kg) スタフイロコッカス ♦ ァゥレウス 308A-1 皮 下 25.0 さらに、 T AN— 588ナトリゥム塩を 400mg/kgでマウスに皮下投与し てもあるいは 4000mgZkgをマウスに経口投与しても急性毒性'は認めら れなかつた。 The therapeutic effects of TAN-588 sodium salt on experimental mouse infections are shown in Table 2. Infectious orchid administration method ED soCmg / kg) Staphylococcus ♦ aureus 308A-1 subcutaneous 25.0 In addition, TAN-588 sodium salt was administered subcutaneously to mice at 400 mg / kg, or 4,000 mg Zkg was orally administered to mice. No acute toxicity was observed.
次に T AN― 588の N—デァセチル体（ A型および B型の混合物）の生 物学的性伏について述べる。 なお、 該化合物の A型および B型の混合物 と A型化合物および B型化合物は生物学的性質において同等である。  Next, the biological properties of the N-deacetyl derivative of TAN-588 (a mixture of type A and type B) are described. The mixture of the A-type and B-type compounds and the A-type and B-type compounds are equivalent in biological properties.
T AN— 588の N -デァセチル体の各種微生物に対する抗菌スぺク ト ルは第 3表に示すとおりである。 Table 3 shows the antibacterial spectrum of the N-deacetyl derivative of TAN-588 against various microorganisms.
第 3 number 3
試 験 菌 最小生育阻止濃度（注 1 ) スタフイロコ . /カス * ァウ レウス FDA 209P 50 ミ クロコ ヅカス · ルテウス IFO 12708 6.25 バチルス · ズブチリス NIIU PCI 219 12.5 バチルス · セレウス FM 5 50 ェシエリ ヒア · コリ NIfU JC 2 25 サルモネラ · チフィムリ ウム IFO 12529 50 シ トロバクタ一 · フ σインディ IFO 12681 50 ク レブシエラ · ニューモニエ IFO 3317 100 セラチア · マルセ 'ソセンス IFO 12648 25 プロテウス 《 ミ ラビリス . ATCC 21100 100 プロテウス ， ブルガリス IFO 3988 100 プロテウス * モルガ二 — IFO 3168 >100 シュウ ドモナス · エルギノ —サ IFO 3080 50 アルカ リゲネス ， フヱカ リス IFO 13111 100 ァシネ トバクタ一 · カルコァセテイクス IFO 13006 50 (注 1 ) 培地として、 バク ト . アンティビォテイ ツ ク · メディウム 3  Test bacteria Minimum growth inhibitory concentration (Note 1) Staphylococcus aureus FDA 209P 50 Micrococcus luteus IFO 12708 6.25 Bacillus subtilis NIIU PCI 219 12.5 Bacillus cereus FM 550 Escherichia coli NIfU JC 25 Salmonella typhimurium IFO 12529 50 Citrobacter iF σ Indy IFO 12681 50 Klebsiella pneumoniae IFO 3317 100 Serratia Marce 'Socense IFO 12648 25 Proteus 《Mirabilis. ATCC 21100 100 Proteus, Bulgaris IFO 3988 100 Proteus Morgani — IFO 3168> 100 Shu Domonas aerugino —sa IFO 3080 50 Alkaligenes, Fucalis IFO 13111 100 Acacia tobacco ICO 13006 50 (Note 1) Bacterium, antibiotics · Medium 3
(ディフコ ' ラボラ トリ ーズ、 米国）； 17.5gノくク ト . ィ—ス ト . エキス トラク ト（ディフコ . ラボラ ト リ —ズ、 米国）； 50gノく ク ト · ァガ—（ディフコ · ラボラ トリーズ、 米国）； 20g，蒸留水 1000inJ2 (PH無調整）を用い、 接種菌液として約 106コロニ— · フォー ミ ング ' ユニッ ト Ztd を用いた。 (Difco Laboratories, USA); 17.5g Nectar East Extract (Difco Laboratories, USA); 50g Nectar Aga (Difco Laboratories Trees, USA); 20 g, using distilled water 1000inJ2 (PH unadjusted), about 106 colonies as inoculum - were used-for Mi ring 'unit ZTD.
また、 T AN- 588の N—デァセチル体は種々の 3—ラクタメ —スに 対して安定である。 第 4表に、ェシエリ ヒア ♦ コリ P G 8を被検菌とし、 2 種の ;8—ラクタメ一スに対する安定性をしらべた結果を示す。 第 4 表 Also, the N-deacetyl form of TAN-588 can be used in various 3-lactamases. It is stable against. Table 4 shows the results of examining the stability against two species of; 8-lactamase using Escherichia coli PG 8 as a test bacterium. Table 4
Figure imgf000044_0002
数値は阻止円直径（mm)を示す。 培地：ジアミ ノ ピメ リ ン酸（20mg/ )を含む栄養寒天培地（PH7.0)。 P C G ：ベンジルペニシリ ン， C P C :セファロスポリ ン C, CMC :セファマイシン C；。 .薬剤濃 度は T八 ー588の^'—デァセチル体は1000
Figure imgf000044_0001
，他は全て 100 gz m o
Figure imgf000044_0002
The numerical values indicate the diameter of the blocking circle (mm). Medium: Nutrient agar medium (PH7.0) containing diaminopimelic acid (20 mg /). PCG: benzylpenicillin, CPC: cephalosporin C, CMC: cephamycin C; The drug concentration is T8-588 ^ '-Decetyl form is 1000
Figure imgf000044_0001
, All others are 100 gz mo
:e 1 ：バチルス ♦ セレウス由来，カルビオケミカル社（米国）製。 : e 1: Bacillus ♦ Derived from B. cereus, manufactured by Calbio Chemical Co. (USA).
2：ェンテロバクタ― · クロア力由来。  2: Enterobacter-Derived from the Croix force.
* 3 ：阻止円怪なし。  * 3: No stopping circle.
このように、 TAN— 588,そのパラニ ト ロべンジルーもしく はベンツ ヒ ドリル—エステル体，またはこれらの N—デァセチル体 [以下、 これら を総称して、 化合物（Ί )という。 ]またはそれらの塩は、 グラム陽性菌， グラム陰性菌に対して抗菌性を示し、 また毒性は低.い。 したがって、 本 発明の化合物（ I )またはそれらの塩は、 哺乳動物 [例、 ラッ ト、 マウス、 ィヌ、 ネコ、 家畜（ゥマ等）.ヒ ト]，家禽などの細菌感染症の治療に用い ることができる。  As described above, TAN-588, its paranitrene or benzhydryl-ester form, or its N-deacetyl form [hereinafter, these are collectively referred to as compound (II)]. ] Or their salts have antibacterial activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria and have low toxicity. Therefore, the compound (I) of the present invention or a salt thereof is useful for the treatment of bacterial infectious diseases in mammals [eg, rats, mice, dogs, cats, livestock (such as horses). Can be used.
本発明の化合物（ I )またはそれらの塩を細菌感染症の治療剤として用 いるには、 薬理学的に許容し得る担体，陚形剤，希釈剤などと共に、 錠剤， カプセル剤などとして経口的に、 注射剤などとして非経口的に投与する ことができる。 注射剤とする場合の希釈剤等の例としては、 たとえば生 理食塩水等が挙げられる。 カプセル剤とする場合の担体の例として、 た とえば乳糖などが挙げられる。 その投与量は、 経口剤の場合は、 化合物 ( I )として約 5〜50mgZkgZ日、 好ましくは約 lO mgZkgノ日であり、 非経口剤の場合は、 約 2.5〜25mgZkgZ日、 好ましくは約 5〜20mg kg Z日である。 Use of the compound (I) of the present invention or a salt thereof as a therapeutic agent for bacterial infections For example, they can be administered orally as tablets, capsules, etc., together with pharmacologically acceptable carriers, excipients, diluents, etc., and parenterally as injections. Examples of diluents and the like in the case of injections include physiological saline. An example of a carrier in the case of a capsule is lactose. The dose is about 5 to 50 mgZkgZ days, preferably about 10 mgZkgZ days for compound (I) in the case of an oral preparation, and about 2.5 to 25 mgZkgZ days, preferably about 5 to 5 in the case of a parenteral preparation. 20 mg kg Z days.
また、 本発明によって得られる化合物（ I )またはそれらの塩は、 殺菌 剤，消毒剤として用いることができる。 たとえば化合物（ I )として 0.01 〜0.1WZV%の濃度で蒸留水に溶解した液剤、 またはワセリ ン，ラノ リ ンを基剤とし、 .1 gあたり化合物（ I )として 0.2〜20mg，好ましくは 1〜 10mg含有する軟膏剤として、 ヒ トおよび動物の手，足，眼，耳などの殺菌， 消毒に用いることができる。  The compound (I) or a salt thereof obtained by the present invention can be used as a bactericide or disinfectant. For example, as a compound (I), a solution prepared by dissolving in distilled water at a concentration of 0.01 to 0.1 WZV%, or vaseline or lanolin as a base, 0.2 to 20 mg, preferably 1 to 1 g of compound (I) per 1 g As an ointment containing 10 mg, it can be used for disinfection and disinfection of human and animal hands, feet, eyes and ears.
本発明方法で得られる化合物（ I )は、 また、 新しい医薬品の合成中間 体としても極めて有望な化合物である。  The compound (I) obtained by the method of the present invention is also a very promising compound as a synthetic intermediate for a new drug.
以上述べた物理化学的性伏および生物学的諸性質から、 化合物（ I ):ま 新規抗生物質である。  From the physicochemical properties and biological properties described above, compound (I): a novel antibiotic.
図面の簡単な説明 · Brief description of drawings ·
第 1図は、 T AN— 588(Aおよび Bの平衡混合物）の紫外部吸収スぺ ク トルを示す。 第 2図，第 3図，第 4図，第 5図，第 6図，第 7図，第 8図， 第 9図，第 1Q図，第 11図および第 12図は、 T AN— 588(Aおよび Bの平衡 混合物）， T A 一 588のパラ二 トロベンジルエステル（Aおよび Bの混合 物）， T AN— 588パラ二ト口べンジルエステル（A型）， TAN— 588パラ ニト口ベンジルエステル（B型）， T AN— 588ベンツヒ ドリルエステル FIG. 1 shows the UV absorption spectrum of TAN-588 (an equilibrium mixture of A and B). FIGS. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7, 8, 9, 1Q, 11 and 12 show TAN-588 ( Equilibrium mixture of A and B), p-nitrobenzyl ester of TA-588 (mixture of A and B), TAN-588 para-n-benzyl ester (type A), TAN-588 para-nitro-benzyl ester (A) B), T AN—588 Benzhydryl ester
(Aおよび Bの混合物）， T AN— 588ベンツヒ ドリルエステル（A型），Τ AN— 588ベンツヒ ドリルエステル（B型）， TAN— 588の N—デァセチ ル体のベンツヒ ドリルエステル（Aおよび Bの混合物）， TAN— 588の N —デァセチル体のベンツヒ ドリルエステル（A型）. T AN— 588の N—デ ァセチル体のベンツヒ ドリエステル（B型）， T AN— 588の N—デァセチ ル体（Aおよび Bの混合物）， T AN— 588の N -デァセチル体（A型）およ び T AN - 588の N—デァセチル体（B型）の赤外部吸収スぺク トルをそ れぞれ示す。 (Mixture of A and B), TAN—588 benzhydryl ester (type A), II AN—588 Benzhydryl ester (form B), TAN—588 N-deacetyl form of benzhydryl ester (mixture of A and B), TAN—588 N—decetyl form of benzhydryl ester (form A). T AN-588 N-deacetyl derivative of benzhydryl ester (form B), TAN-588 N-deacetyl derivative (mixture of A and B), TAN-588 N-deacetyl derivative (form A) The infrared absorption spectrum of the N-deacetyl form (B type) of TAN-588 is shown, respectively.
発明を実施するための最良の形態 BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
次に実施例をもってさらに詳細に本発明の内容を説明するが、 これに よって本発明が限定されるものではない。 なお、 培地におけるパ—セン トは、 特にことわりのないかぎり重量 Z容量％を示す。  Next, the content of the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto. In addition, the percentage in the medium indicates the weight Z volume% unless otherwise specified.
実施例 1 Example 1
栄養寒天斜面上に生育させたェンぺドパ'クタ— · ラクタムゲヌス · Y - 258( I F 0 14322, F ERM B F— 699)の菌株を、 ダルコ— ス 2 % ,ソルブル · スターチ 3 % .生大豆粉 1 % ,ポリペプトン（大五栄養 化学株式会社製，日本） 0.5%,食塩 0.3%を含有する水溶液（pH 7.0)に沈 降性炭酸カルシウム 0.5%を添加した培地 500m£を含む 2 J2 容坂ロフラス コに接種して、 24°Cで 48時間往復振盪培養した。 この培養液全量を上記 培地に消泡剤ァク.トコール（武田薬品工業株式会社製，日本） 0.05%を添 加した培地 30J2を含む容量 50J2 のタ ンクに接種し、 24°Cで通気量 50J2 / 分， 200回転 Z分の条件下で 48時間培養した。 この培養液 6 J2 をデキス トリ ン 3 %生大豆粉 1.5%,コーン · グルテン · ミ ール 1.5%,ポリぺプ トン 0.2%,チォ硫酸ナトリゥム 0.1_%を含有する水溶液（PH6.5)にァク トコール 0.05%を添加した培地 を含む容量 200J2 のファーメ ンタ— に接種し、 17°Cで通気量 200J2 /分， 150回転//分の条件下で 66 時間培 養した。 フ アーメ ンター 2基からの培養液（230J2 )を pH 8に調整後、 ハイフロLactamogenus, Y-258 (IF 0 14322, F ERM BF-699) strain grown on nutrient agar slope, darcos 2%, Soluble starch 3%. 2 J2 volume containing 500 ml of medium containing 0.5% precipitating calcium carbonate in an aqueous solution (pH 7.0) containing 1% soy flour, 0.5% polypeptone (manufactured by Daigo Kunyu Kagaku Co., Japan) and 0.3% salt Saka lofrasco was inoculated and cultured with shaking at 24 ° C for 48 hours. The whole amount of this culture solution was inoculated into a 50 J2 tank containing 30 J2 of the above medium supplemented with 0.05% of an antifoaming agent Actol (manufactured by Takeda Pharmaceutical Co., Ltd.), and aerated at 24 ° C. The cells were cultured for 48 hours under the conditions of 50 J2 / min, 200 rpm and Z minutes. This culture solution 6 J2 was converted to an aqueous solution (PH6.5) containing dextrin 3% raw soy flour 1.5%, corn gluten meal 1.5%, polypeptide 0.2%, sodium thiosulfate 0.1_%. The fermenter was inoculated into a 200 J2 fermenter containing a medium supplemented with 0.05% Factol, and cultured at 17 ° C for 66 hours under the conditions of aeration of 200 J2 / min and 150 rpm. After adjusting the culture solution (230J2) from the two
' スーパ— . セル（ジョ ンズ . マンビル社製、 米国） 9 kgを用いてろ過し た。 ろ液（200J2 )を PH 6に調整後アンバーライ ト I R A— 402(C 1型， 10J2 ，口一ム ' アン ド ' ハース社製、 米国）のカラムクロマトグラフィ ー に付した。 抗生物質を 2 %食塩水で溶出し、 溶出液（53β )を pH 6に調 整後活性炭クロマ トグラフィ ー（5 J2 ，武田薬品工業株式会社製、 日本） に付した。 抗生物質を 8 %イソブタノ ールで溶出し、 溶出液（14J2 )を減 圧下 5 J2 まで濃縮した。 濃縮液を ΡΗ 6に調整後 2 %トリ—η—才クチ ルメチルァンモニゥムクロライ ド Ζメチレンクロライ ド溶液 X 2 ) で油出した。 抽出液を 1.6%ヨウ化ナ ト リ ウム水（2.5β )で処理し、 抗生 物質を水層に転溶させた。 水層を濃縮し、 濃縮液を活性炭のクロマトグ ラフィ —（500m£)に付し、 8 %イソブタノ ールで溶出した。 溶出液を濃 縮後、 凍結乾燥して、 粗粉末 1.41gを得た。 粗粉末（1.4g)を水（100mJ2)に 溶かし、 溶解液を Q AE—セフアデッ クス A— 25 (C 1型，ファルマンャ 社製，スゥヱ 一デン） 200mJ2のカラムクロマ トグラフィ 一に付し、 0.03M 食塩水で溶出分画した。 分画区分を集め（600mの，ρΗ 5.1に調整後活性炭 クロマトグラフィ ー脱塩し、 溶出液を濃縮後、 凍結乾燥し、 扮末（384mg) を得た。 この粉末を、 水に溶解させ担体として YMC— P ack S H - 3 43 (山村化学研究所製、 日本）を用いた分取用高速液体クロマトグラフィ 一に付し、 0.01Mリ ン酸緩衝液（PH6.3)で溶出した。 抗生物質を含む画 分を集め、 活性炭クロマトグラフィ -で脱塩し、 溶出液を濃縮，凍結乾 燥し、 T A M— 588ナトリゥム塩の白色粉末（Ulmg)を得た。 ろ 過 Filtration was carried out using 9 kg of super cell (manufactured by Jones Manville, USA). The filtrate (200J2) was adjusted to PH6 and then subjected to column chromatography on Amberlite IRA-402 (C1, 10J2, manufactured by Anderson Haas, USA). The antibiotic was eluted with 2% saline, and the eluate (53β) was adjusted to pH 6 and then subjected to activated carbon chromatography (5J2, manufactured by Takeda Pharmaceutical Co., Ltd., Japan). The antibiotic was eluted with 8% isobutanol, and the eluate (14J2) was concentrated to 5 J2 under reduced pressure. After the concentrated solution was adjusted to ΡΗ6, oil was removed with 2% tri-η-methylmethylammonium chloride (methylene chloride solution X 2). The extract was treated with 1.6% aqueous sodium iodide (2.5β) to transfer the antibiotic to the aqueous layer. The aqueous layer was concentrated, and the concentrate was subjected to activated carbon chromatography (500 mL) and eluted with 8% isobutanol. The eluate was concentrated and freeze-dried to obtain 1.41 g of a coarse powder. Dissolve the coarse powder (1.4 g) in water (100 mJ2) and apply the solution to column chromatography of 200 mJ2 QAE-Sephadex A-25 (Type C1, Falmanja, Sweden) to obtain a 0.03 M salt solution. The fraction was eluted with water. The fractionated fractions were collected (600m, adjusted to ρΗ5.1, desalted with activated charcoal chromatography, the eluate was concentrated and lyophilized to give a powder (384mg). This powder was dissolved in water to serve as a carrier. Preparative high-performance liquid chromatography using YMC—Pack SH-3343 (Yamamura Chemical Laboratories, Japan) was performed and eluted with 0.01 M phosphate buffer (PH6.3). The fractions containing were collected, desalted by activated carbon chromatography, and the eluate was concentrated and lyophilized to give a white powder of TAM-588 sodium salt (Ulmg).
実施例 2 Example 2
栄養寒天上生育させたェンぺドバクタ— · ラクタムゲヌス Y K— 258 株（ I F O 14322, F E R B P— 699)をグルコース 2 % ,ソルブル Lactamgenus YK-258 strain (IFO 14322, FERBP-699) grown on nutrient agar with glucose 2%, solubil
• スターチ 3 %，生大豆粉 1 %,ポリぺプトン Q.5%,食塩 0.3%を含有す る水溶液（p H 7.0 )に沈降性炭酸カルシウム Q .5 %を添加した培地 500 mJ2を 含む 2J2 容坂ロフラスコ 2本に接種して、 24°Cで 48時間往復振盪培養し た。 この培養液全量を上記培地に消泡剤ァク トコール 0.05%を添加した 培地 120J2 を含む容量 200J2 のタ ンクに接種し、 24°Cで通気量 200J2 /分， 1 50回転 Z分の条件下で、 48時間培養した。 この培養液 602 をデキストリ ン 3 %，生大豆粉 1.5%, コ—ン · グルテン ♦ ミ —ル 1.5% ,ポリペプトン 0.2%，チォ硫酸ナトリゥム を含有する水溶液（PH6.5)にァク トコ —ル 0.05%を添加した培地 1200J2 を含む容量 2000J2 のタ ンクに接種し、 17°Cで通気量 2000£ /分， 120回転 分の条件下で 90時間培養した。 • Contains 3% starch, 1% raw soy flour, 5% polyptone, 0.3% salt The mixture was inoculated into two 2J2 volume flasks containing 500 mJ2 of medium supplemented with precipitated calcium carbonate (Q.5%) in an aqueous solution (pH 7.0) and reciprocated with shaking at 24 ° C. for 48 hours. The whole volume of the culture was inoculated into a 200-J2 tank containing 120 J2 of the above medium supplemented with 0.05% of the antifoaming agent Actolol, and aerated at 200C2 / min at 150 ° C at 24 ° C. And cultured for 48 hours. This culture solution 602 was converted into an aqueous solution (PH6.5) containing 3% dextrin, 1.5% raw soy flour, 1.5% corn gluten ◆ meal, 1.5% polypeptone, and sodium sodium thiosulfate. The tank was inoculated into a tank having a capacity of 2000 J2 containing 1200 J2 of medium supplemented with 0.05%, and cultured at 17 ° C for 90 hours under the conditions of aeration of 2000 £ / min and 120 rotations.
かく して得られた培養液をハイフロ · スーパーセル（ジョンズ *マン ビル社製、 米国）を用いてろ過した。 ろ液（1150β )をアンバーライ ト I R A— 402(C 1型） 40β のカラムクロマ トグラフィ ーに付した。 抗生物質 を 2 %食塩水（200J2 )で溶出し、 溶出液を活性炭（20J2 )のカラムクロマ トグラフィ—に付した。 8 %イソ · ブタノ —ル溶出液（81J2 )をアンバ— ライ ト I R Α— 68(C1型） のカラムクロマトグラフィ ーに付し、 1 The culture solution thus obtained was filtered using Hyflo Super Cell (manufactured by Johns Manville, USA). The filtrate (1150β) was subjected to column chromatography on Amberlite IRA-402 (C1 type) 40β. Antibiotics were eluted with 2% saline (200 J2), and the eluate was subjected to column chromatography on activated carbon (20 J2). The 8% iso-butanol eluate (81J2) was subjected to column chromatography on Amberlite IR-68 (C1 type),
%食塩水で溶出した。 溶出液（54β )を再び活性炭（10J2 )のカラムクロマ トグラフィ —に付し、 抗生物質を 8 %イソブタノ —ル水で溶出した。 溶 出液（80 )を減圧下濃縮し，濃縮液（5 £ )を ΡΗ4.5に浦正後 2 % トリー η 一才クチルメチルアンモニゥム · クロライ ド'ノメチレンクロライ ド溶液 (2.5J2 X 2)で抽出した。 抽出液を 1.6%ヨウ化ナトリウム溶液で処理し て抗生物質を水層へ転溶し、 転溶液を濃縮した。 濃縮液（1.5J2 )を活性 炭（0.5J2 )のクロマトグラフィ —で脱塩操作し、 溶出液を濃縮した。 濃 縮液を Q A Ε—セフアデ'ソクス（C 1型） 200mJ2 のカラムクロマ トグラフィ 一に付した。 0.03M食塩水で溶出分画し、 活性画分（1.3J2 )を得た。 活 性画分を活性炭（500mJ2)のクロマトグラフィーで脱塩操作し、 溶出液を 濃縮後、 凍結乾燥して T AN— 588の白色粉末（3.56g)を得た。 一方抽出 廃水層には約 50%の抗生物質が残存していたので、 水層（5 を QAE— セフアデックス（ C 1型） 1J2 のカラムクロマ トグラフィーに付した。 抗生 物質を Q .03Mおよび 0.05M食塩水で溶出し、 溶出液を活性炭（2のの カラムクロマトグラフィ 一に付した。 食塩除去液（22 )を再度 2 %トリ 一 n—ォクチルメチルアンモニゥム . クロライ ド Zメチレンクロライ ド 溶液で抽出（1β Χ2)した。 抽出液をヨウ化ナ ト リ ウム溶液で処理、 活性 炭の脱塩工程を経て、 T AN— 588ナトリウム塩の白色粉末（3.18g)を得 実施例 3 It was eluted with a% saline solution. The eluate (54β) was again subjected to column chromatography on activated carbon (10J2), and the antibiotic was eluted with 8% aqueous isobutanol. The eluate (80) is concentrated under reduced pressure, and the concentrated solution (5 £) is reduced to ΡΗ4.5, followed by 2% tree η 1-year-old octylmethylammonium chloride · nomethylene chloride solution (2.5J2 X 2). The extract was treated with a 1.6% sodium iodide solution to transfer the antibiotic to the aqueous layer, and the transferred solution was concentrated. The concentrate (1.5J2) was desalted by chromatography on activated carbon (0.5J2), and the eluate was concentrated. The concentrated solution was subjected to column chromatography with QA II-Sephade's Sox (C1 type) 200 mJ2. The fraction was eluted with 0.03M saline to obtain an active fraction (1.3J2). The active fraction was desalted by chromatography on activated carbon (500 mJ2), and the eluate was concentrated and lyophilized to obtain a white powder of TAN-588 (3.56 g). One-sided extraction Since approximately 50% of the antibiotic remained in the wastewater layer, the aqueous layer (5 was subjected to column chromatography with QAE-Sephadex (Type C1) 1J2. The antibiotic was treated with Q.03M and 0.05M NaCl. The column was eluted with water, and the eluate was subjected to activated carbon (column chromatography on column 2). The salt-removed solution (22) was again added to a 2% tri-n-octylmethylammonium chloride. Chloride methylene chloride solution. The extract was treated with a sodium iodide solution and subjected to a step of desalting activated carbon to obtain a white powder of TAN-588 sodium salt (3.18 g).
栄養寒天上に成育させたリゾバクタ一 · アルプス sp. nov. YK- Nov. YK-, Rhizobacta grown on nutrient agar
422株（I F 0 14384, F E RM B P— 698)をグルコース 2 %，ソルブ ル · スターチ 3 %, 生大豆粉 1 %, ポリペプトン 0.5%を含有する培地 (PH無修正） 500mJ2を含む 2J2 容坂ロフラスコに接種して、 24°Cで 48時間 往復振盪培養した。 この培養液全量を上記培地に消泡剤ァク トコール 0.05%を添加した培地 120J2 を含む容量 200J2 のタ ンクに接種し、 28°Cで 通気量 120£ /分， 180回転 分の条件下で、 48時間培養した。 この培養液 1202 をデキス ト リ ン 3 %，生大豆粉 3 %，ポリべブトン 0,2%を含有する 水溶液（PH無修正）にァク トコール 0.05%を添加した培地 4000£ を含む 容量 6000J2 のタ ンクに接種し、 22°Cで通気量 4000J2 /分， 120回転 Z分の 条件下で 66時間培養した。 2J2 medium containing 500 mJ2 of 422 strain (IF 0 14384, FE RM BP-698) containing 2% glucose, 3% soluble starch, 1% raw soy flour, and 0.5% polypeptone (uncorrected PH) , And cultured with reciprocal shaking at 24 ° C for 48 hours. The entire amount of this culture solution was inoculated into a 200 J2 tank containing 120 J2 of the above medium supplemented with 0.05% of the antifoaming agent Actcol, and aerated at 120 ° C / 180 rpm at 28 ° C under an aeration rate of 120 £ / min. Cultured for 48 hours. This culture solution 1202 was added to an aqueous solution containing 3% dextrin, 3% raw soy flour, and 0.2% polybeptone (uncorrected PH), containing 4000% of culture medium and containing 4000 pounds. And incubated at 22 ° C for 66 hours under the conditions of aeration of 4000 J2 / min and 120 revolutions of Z minutes.
かく して得られた培養液をハイフロ ♦ スー パ ーセル（ジョ ンズ · マン ビル社製、 米国）を用いてろ過した。 ろ液（4360J2 )をアンバーライ ト I R A— 402(C 1型） 400J2 のカラムクロマトグラフィ 一に付した。 抗生物 質を 2 %食塩水（2000β )で溶出し、 溶出液を活性炭（160J2 )のカラムク 口マ トグラフィ —に付した。 8 %イソブタノ —ル溶出液（640J2 )をアン バーライ ト I R A— 68(C 1型） のカラムクロマ トグラフィ一に付し、 1 %食塩水で溶出した。 溶出液（200J2 )を再び活性炭（80J2 )のカラムク 口マトグラフィ —に付し、 抗生物質を 8 %イソブタノ—ル水で溶出した。 溶出液（400fi ：)を減圧下濃縮し.濃縮液を凍結乾燥し、 凍結乾燥品にァセ トンを加え沈澱物として T AN— 588のナトリゥム塩（620g)を得た。 こ の粉末は HP L C分析の結果、 T AN— 588ナ ト リ ウム塩を 57%含有し ていた。 かく して得られた粉末（5 g)を水にとかし、 QAE—セフアデッ クス（C 1型） 200mJeのカラムクロマ トグラフィ ーに付した。 0.03M食塩水 で溶出分画し、 活性画分（1.2J2 )を得た。 活性画分を活性炭（500J2 ：)のク 口マ トグラフィ 一で脱塩操作し、 溶出液を濃縮後、 凍結乾燥して T AN —588の白色粉末（2.50g)を得た。 The culture solution thus obtained was filtered using Hyflo ♦ Supercell (manufactured by Jones Manville, USA). The filtrate (4360J2) was subjected to column chromatography using Amberlite IRA-402 (C1 type) 400J2. Antibiotics were eluted with 2% saline (2000β), and the eluate was subjected to column chromatography on activated carbon (160J2). The 8% isobutanol eluate (640J2) was applied to Amberlite IRA-68 (C1 type) column chromatography. Eluted with 1% saline. The eluate (200 J2) was again subjected to column chromatography on activated carbon (80 J2), and the antibiotic was eluted with 8% isobutanol in water. The eluate (400 fi :) was concentrated under reduced pressure. The concentrate was freeze-dried, and acetone was added to the freeze-dried product to obtain a sodium salt of TAN-588 (620 g) as a precipitate. This powder was found to contain 57% TAN-588 sodium salt by HP LC analysis. The powder (5 g) thus obtained was dissolved in water and subjected to QAE-Sephadex (C1 type) 200 mJe column chromatography. The fraction was eluted with 0.03M saline to obtain an active fraction (1.2J2). The active fraction was desalted by means of activated carbon (500J2 :) chromatography, and the eluate was concentrated and lyophilized to obtain a white powder of TAN-588 (2.50 g).
この T AN— 588 の精製粉末は、 T L Cの Rf値， HP L Cの Rt値， I R , U V , C Dおよび N M Rスぺク トルおよび抗菌スぺク トルによって、 前記実施例 1で得られた T AN— 588ナトリゥム塩と同一である。  The purified TAN-588 powder was obtained from the TAN obtained in Example 1 by the Rf value of TLC, the Rt value of HPLC, IR, UV, CD and NMR spectrum and antibacterial spectrum. — Same as 588 sodium salt.
実施例 4 Example 4
T AN— 588ナトリウム塩（400mg)を DMF (4 m に溶解し、 トリェチ ルァミ ン（100 の，パラニトロべンジルブロマイ ド（800mg)を加え、 室 温で 3時間攪拌した。 反応液に 0.01Mリ ン酸緩衝液（PH6.3. 50mのを加 え酉乍酸ェチル（50mので 2回抽出した。 抽出液を水洗後、 濃縮して得られ た油伏物を酢酸ェチルー石油ベンジンで粉末（507mg)にし、 T AN— 588 — A—パラニトロべンジルエステルおよび T A — 588— B—パラニト 口べンジルエステルの混合物を得た。 得られた粉末を移動相として昨酸 ェチル：メタノ 一ル = 19:1を用いてセフアデックス L H— 20の力ラムク ロマ トグラフィ 一に付し、 T A N— 588— A—パラニトロべンジルエス テル（105mg), T A N— 588— B—パラニトロベンジルエステル（67mg)お よび両者の混合物（280mg)を得た。  TAN-588 sodium salt (400 mg) was dissolved in DMF (4 m), triethylamine (100 parts, paranitrobenzyl bromide (800 mg)) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. An acid buffer (pH6.3.50m) was added to the mixture, and ethyl acetate was extracted twice (50m. The extract was washed with water and concentrated. The oily substance obtained was powdered with ethyl acetate-petroleum benzine (507mg). Then, a mixture of TAN—588—A—para-nitrobenzyl ester and TA—588—B—paranith benzyl ester was obtained, and the obtained powder was used as a mobile phase using ethyl acetate: methanol = 19: 1. Tandem chromatography on Sephadex LH-20, TAN-588-A-paranitrobenzyl ester (105 mg), TAN-588-B-paranitrobenzyl ester (67 mg) and a mixture of both (280 mg). ).
実施例 δ. ベンゾフヱノ ンヒ ドラゾン 58.8g , 1 , 1 , 3 , 3—テトラメチルグァニ ジン 42rd,ョー ド i50mgを C H2C 12 500m ことかした。混合液を 0 ° (：〜 — 5 °Cに冷却後 m—クロ口過安息香酸（70%純度） 74gを加え、 0 °Cで 40 分間攪拌した。 反応液を水洗後、 硫酸ナトリウムで脱水し、 溶媒を留去 し、 ジフヱニルジァゾメタンを得た。 Example δ. Benzophenonhydrazone 58.8 g, 1,1,3,3-tetramethylguanidine 42rd, iodine 50 mg was dissolved in CH 2 C 1 2 500 m. After cooling the mixture to 0 ° (: — — 5 ° C, 74 g of m-chloroperbenzoic acid (70% purity) was added, and the mixture was stirred at 0 ° C for 40 minutes.The reaction solution was washed with water and dried over sodium sulfate. Then, the solvent was distilled off to obtain diphenyldiazomethane.
T A - 588 31gを THF に懸蜀し、 上記で得られたジフヱ二ルジァ ゾメタン全量を THF 150mJg に溶かして加えた。 混合液を 0°Cに冷却 後、 2 N H C 1, 60mJ2を滴下し、 室温で 1時間攪拌した。 2 N HC1 1 0mJ2 加え、 さらに 1時間攪拌後、 CH2C12を 3J2加えた。 得られた溶液 を水洗後、 濃縮し、 残渣にェ—テルを加え、 T AN— 588ベンツヒ ドリ ルエステル（ A型および B型の混合物）の白色锆晶性粉末 28gが得られた。 上記混合物（1.8g)をシリ力ゲル（180m£)のカラムクロマ トグラフィー に付し、 クロロフオルム：メタノ ール（97: 3 )の溶媒系で溶出した。 B型 の化合物が先に溶出し、 A型の化合物が後で溶出した。 各分画を濃縮す ると T AN— 588ベン ;ソヒ ドリルエステルの A型化合物（433tng)， B型化 合物（40 Omg)および A型および B型の混合物（476mg)が無色結晶として得 られた。 31 g of TA-588 was suspended in THF, and the entire amount of diphenyldiazomethane obtained above was dissolved in 150 mJg of THF and added. After cooling the mixture to 0 ° C., 2 NHC 1,60 mJ2 was added dropwise, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. 2 N HC1 1 0mJ2 added and after stirring for further 1 hour, was added CH 2 C1 2 3J2. The obtained solution was washed with water and concentrated, and ether was added to the residue to obtain 28 g of a white crystalline powder of TAN-588 benzhydryl ester (mixture of A-type and B-type). The above mixture (1.8 g) was subjected to column chromatography on a silica gel (180 mL), and eluted with a solvent system of chloroform: methanol (97: 3). Compound of type B eluted first, compound of type A eluted later. Concentration of each fraction yielded TAN-588ben ; sohydryl ester type A compound (433 tng), type B compound (40 Omg) and a mixture of type A and type B (476 mg) as colorless crystals. Was done.
実施冽 6 · " ' Implemented cold 6 · "'
T AX— 588ベンツヒ ドリルエステル（A型および B型の混合物） 26g (59mmol)を C H2C 12 1.2J2 に懸蜀させ、 — 20°Cに冷却した。 ピリ ジンT AX-588 Bentsuhi drill ester (A-type and B-type mixture) 26 g of (59 mmol) was Kaka蜀in CH 2 C 1 2 1.2J2, - cooled to 20 ° C. Pyridine
49m£, δ塩化リ ン 37.6gを加え― 10~ - 15°Cで 50分間攪拌した。一 30°Cま で温度を下げた後 MeOH 180mJ2も加え、 — 5° 〜一 15°Cで 30分間攪拌 し、 さらに室温で 1時間攪拌した。 I N H C 1 300m£を加え室温で 45分 間攪拌後、 反応液に 50%リ ン酸ナトリウム 100m 2 N aOH(ca 500 mJ2)を加え、 水層の PHを 8.0に調整した。 C H 2 C 12層と水層を分け、 水 層をさらに C H2C 12 (600mJ2) で抽出し、 C H2C12層を合わせ、 濃縮 後、 残渣にェ—テルを加えて T AN— 588の N—デァセチル体のベンツ ヒ ドリルエステル（A型および B型の混合物）の粉末 17.9gを得た。 49 ml, 37.6 g of δ-lin chloride were added, and the mixture was stirred at -10 to -15 ° C for 50 minutes. After lowering the temperature to 30 ° C, MeOH 180mJ2 was also added, and the mixture was stirred at —5 ° to 115 ° C for 30 minutes, and further stirred at room temperature for 1 hour. After 300 mL of INHC was added and the mixture was stirred at room temperature for 45 minutes, 50% sodium phosphate 100 m 2 NaOH (ca 500 mJ2) was added to the reaction solution, and the pH of the aqueous layer was adjusted to 8.0. CH 2 C 1 divided two layers and the aqueous layer, the aqueous layer was further extracted with CH 2 C 1 2 (600mJ2) , combined CH 2 C1 2 layer, concentrated Thereafter, ether was added to the residue to obtain 17.9 g of powder of a benzhydryl ester of N-deacetyl derivative of TAN-588 (mixture of type A and type B).
実施例 7 Example 7
T AN— 588の N—デァセチル体のベンツヒ ドリルエステル（A型およ び B型の混合物） 396mgを C H2C 12 10m£に懸蘅させ、 一 20°Cに冷却した。 ァニソール 434 £ トリフルォロ酢酸 924 £を加え一 20° 〜― 10°Cで 40 分間攪拌した。 反応液に C H2C 12 280mJ2を加え、 0.1M H3P 04- Na 2HP C 溶液 ρΗ7.3)(420ιη2)で抽出した。 抽出液を pH 5.5に調整後、 濃縮し、 ダイヤイオン HP— 20 (50 - 100 mesh 100mのを 充¾した力 ラムを通過させ、 水洗後 40% MeO H水で溶出分画した。 抗菌性を示 す分画を集め濃縮後、 凍結乾燥して T A N— 588の N—デァセチル体（ A 型および B型の混合物）の白色粉末 143 m gを得た。 396 mg of a benzhydryl ester of a N-deacetyl derivative of TAN-588 (mixture of Form A and Form B) was suspended in CH 2 Cl 2 10 mL and cooled to 120 ° C. Anisole 434 £ Trifluoroacetic acid 924 £ was added and the mixture was stirred at 20 ° to -10 ° C for 40 minutes. The CH 2 C 1 2 280mJ2 added to the reaction solution, 0.1MH 3 P 0 4 - extracted with Na 2 HP C solution ρΗ7.3) (420ιη2). The extract was adjusted to pH 5.5, concentrated, passed through a column filled with Diaion HP-20 (50-100 mesh, 100 m), washed with water, and eluted and fractionated with 40% MeOH water. The fractions shown were collected, concentrated and freeze-dried to obtain 143 mg of a white powder of an N-deacetyl derivative of TAN-588 (mixture of type A and type B).
実施例 8 Example 8
T AN— 588の N—デァセチル体 （A型および B型の混合物） の白色 粉末 lOOmgを水にとかし、 7 °Cで 1夜放置すると、 無色锆晶が圻出した。 忻出結晶をろ取すると、 T A — 588の N -デァセチル体（A型） 40mgが 得られた。  When 100 mg of a white powder of N-deacetyl form (mixture of Form A and Form B) of TAN-588 was dissolved in water and allowed to stand at 7 ° C overnight, colorless crystals crystallized. The Xinide crystals were collected by filtration to obtain 40 mg of N-deacetyl derivative (form A) of T A —588.
実施例 9 - - -Example 9---
T AN— 588ベンツヒドリルエステル（B型） 657mgを実施例 6と同様の 反応および処理を行い、 T AN— 588の N—デァセチル体のベンツヒ ド リルエステル（B型） 200tngを得た。 該化合物 180 gを T H F：水（ 1 ： 1 )18 mJ2 にとかし、 10%パラジュゥムー炭素 90mgを加え、 水素気流中攪拌し た。 反応液をろ過後、 ろ液を濃縮し、 ジェチルエ-テルで水層を洗滌後、 水層を濃縮、 凍結乾燥し、 T AN— 588の N -デァセチル体（B型）の粉 末 77mgを得た。 657 mg of TAN-588 benzhydryl ester (form B) was subjected to the same reaction and treatment as in Example 6 to obtain 200 tng of an N-deacetyl-form benzhydryl ester (form B) of TAN-588. 180 g of the compound was dissolved in 18 mJ2 of THF: water (1: 1), 90 mg of 10% palladium carbon was added, and the mixture was stirred in a hydrogen stream. After filtration of the reaction solution, the filtrate is concentrated, and the aqueous layer is washed with getyl ether. The aqueous layer is concentrated and freeze-dried to obtain a powder of a T-588 N-deacetyl derivative (B type). Was.
実施例 1 0 栄養寒天斜面上に生育させたェンぺドパクター · ラクタムゲヌス Y KExample 10 Endpactor Lactamgenus YK grown on nutrient agar slopes
— 258( 1 F O 14322, F E RM B P— 699)の菌株を、 グルコース 2 %，ソルブル · スターチ 3 %,生大豆粉 1 %,ポリぺプトン 0.5%,食塩 0.3 %を含有する水溶液（PH7.0)に沈降性炭酸カルシウム 0.5%を添加した 培地 500mlを含む 2 J2容坂ロフラ,スコに接種して、 2 4 °Cで 4 8時間往復 振盪培養した。 この培養液全量を上記培地に消泡剤ァク トコ一ル 0.05% を添加した培地 30£ を含む容量 50J2 のタンクに接種し、 2 4 °Cで通気量 50J2 Z分， 200回転ノ分の条件下で 4 8時間培養した。 この培養液 6 β を デキストリ ン 3 %，生大豆粉 1.5% ,コーン · グルテン · ミール 1.5% ,ポ リぺブトン 0.2%,チォ硫酸ナトリゥム 0.1%を含有する水溶液（ΡΗ6.5)に ァク トコ一ル 0.05%を添加した培地 120J2 を含む容量 2002 のタンクに接 種し、 1 7 Cで通気量 20QJ2 ノ分， 150回転/分の条件下で 2 4時間培養 • した。 得られた培地中には、 T AN— 588の N-デァセル体（A型および B 型の混合物）が含まれていることカ^ シユードモナス · エルギノ一ザ C —141を試験菌とする L C—バイオォートグラフィ一法により確認さ れた。 — 258 (1 FO 14322, FE RM BP— 699) strain was converted to an aqueous solution containing 2% glucose, 3% solvable starch, 1% raw soy flour, 0.5% polypeptone, and 0.3% salt (PH7.0 )) Was inoculated into 2J2 Tosaka Rofura, Sco containing 500 ml of a medium supplemented with 0.5% precipitated calcium carbonate, and cultured at 24 ° C. for 48 hours with shaking. The entire amount of this culture solution was inoculated into a 50-J2 tank containing 30 培 地 of the above medium supplemented with 0.05% of the antifoaming agent, and aerated at 24 ° C for 50 J2Z and 200 rpm. The cells were cultured under the conditions for 48 hours. This culture solution 6β was added to an aqueous solution (ΡΗ6.5) containing dextrin 3%, raw soy flour 1.5%, corn gluten meal 1.5%, polybuton 0.2%, sodium thiosulfate 0.1%. The seeds were inoculated in a tank with a capacity of 2002 containing 120 J2 of medium supplemented with 0.05% per well and cultured at 17 C for 24 hours under the conditions of aeration of 20 QJ2 and 150 rpm. The obtained medium contains N-deacetate of TAN-588 (mixture of A-type and B-type). LC-Bio using C-141 as a test bacterium It was confirmed by the autograph method.
実施例 1 1  Example 1 1
栄養寒天斜面上に生育させたリゾパクター ♦ アルプス sp. nov. Y — 422( 1 F O 14384, F E RM B P— 698)の菌株を、グルコース 2 % , ソルブル * スターチ 3 % ,生大豆粉 1 %，ポリぺプトン 0.5% ,食塩 0.3% を含有する水溶液（ΡΗ7.0)に沈降性炭酸力ルシゥム 0.5%を添加した培地 500mJ2を含む 2 J2 容坂ロフラスコに接種して、 2 4 °Cで 4 8時間往復振 盪培養した。 この培養液全量を上記培地に消泡剤ァク トコール 0.05%を 添加した培地 3 0 J2 を含容量 5 0 J2 のタ ンクに接種し、 2 4 °Cで通気量 5 0 J2 /分， 200回転 分の条件下で 4 8時間培養した。 この培養液 6 J2 をデキス トリ ン 3 %,生大豆粉 1.5%,コーン ， ダルテン ' ミール 1.5%, ポリぺプトン 0.2%,チォ硫酸ナトリウム 0.1%を含有する水溶液（PH6.5) にァク トコール 0.05%を添加した培地 120J2を含む容量 20Q£ のタンクに 接種し、 1 7 °Cで通気量 200£ 分， 150回転 Z分の条件下で 2 4時間培 養した。 得られた培地中には、 T AN— 588の N—デァセチル体（A型お ょぴ B型の混合物）が含まれていることが、 シユードモナス *エルギノ 一ザ C一 141を試験菌とする T L C—バイオオートグラフィ一法により 確認された。 Rhizopactor grown on nutrient agar slope ♦ Alps sp. Nov. Y — 422 (1FO 14384, FE RM BP— 698) strain, glucose 2%, Soluble * starch 3%, raw soy flour 1%, poly Inoculate a 2 J2 volume flask containing 500 mJ2 of a medium containing 0.5% sedimentary carbonate calcium in an aqueous solution (ΡΗ7.0) containing 0.5% peptone and 0.3% salt, and incubate at 24 ° C for 48 hours. Reciprocal shaking culture was performed. The total amount of this culture solution was inoculated into a tank having a capacity of 50 J2 containing 30 J2 of the above medium to which 0.05% of the antifoaming agent Actcol was added, and the aeration rate at 24 ° C was 50 J2 / min. The culture was performed for 48 hours under the conditions of rotation. This culture solution 6 J2 was mixed with dextrin 3%, raw soy flour 1.5%, corn and Dalten 'meal 1.5%, An aqueous solution (PH6.5) containing 0.2% of polypeptone and 0.1% of sodium thiosulfate was inoculated into a 20Q £ tank containing a medium 120J2 containing 0.05% of actcol, and aerated at 200 ° C at 17 ° C. Cultivated for 24 hours under conditions of £ min and 150 min Z. The obtained medium contains the N-deacetyl derivative of TAN-588 (mixture of A-type and B-type). —Confirmed by one method of bioautography.
実施例 1 2 Example 1 2
栄養寒天斜面上に生育させたェンぺドバクタ一 · ラクタムゲヌス YK - 258( I F 0 14322, F E RM B P— 699)の菌株を、 グルコース 2 A strain of Endobacter lactamgenus YK-258 (IF014322, FERMBP-699) grown on a nutrient agar slope was converted to glucose 2
%，ソルブル · スターチ 3 %，生大豆粉 1 %,ポリぺプトン 0.5%.食塩 0.3 %を含有する水溶液（PH7.0)に沈降性炭酸カルシウム 0.5 %を添加した培 地 500mlを含む 22 容坂.口フラスコに接種して、 2 4 °Cで 4 8時間往復 振盪培養した。 この培養液全量を上記培地に消泡剤ァク トコ一ル 0.05% を添加した培地 3 0 β を含む容量 5 0 β のタンクに接種し、 2 4 °Cで通 気量 5 09. Z分，200回転 Z分の条件下で 4 8時間培養した。 22 Yokosaka containing 500 ml of medium containing 0.5% sedimentable calcium carbonate in an aqueous solution (PH7.0) containing 0.3%, Soluble starch, 3% raw soy flour, 1% raw soy flour, 0.5% polypeptone and 0.3% salt The flask was inoculated into a two-necked flask, and cultured with reciprocal shaking at 24 ° C for 48 hours. The entire amount of this culture solution was inoculated into a 50 β tank containing 30 β medium containing the antifoam agent, 0.05%, and added to the above medium, and the air flow at 24 ° C was 509. The culture was performed for 48 hours under the conditions of 200 rotations and Z minutes.
栄養寒天斜面上に生育させたァシネ トパクター ' エスピー Y K— 504( 1 F 0 14420, F E RM B P— 709)の菌株を、 グルコース 2 %，ソルブ ル · スターチ 3 % ,生大豆粉 1 % ,ポリぺプトン 0.5% ,食塩 0.3%を含有 する水溶液（PH7.0)に沈降性炭酸カルシウム 0.5%を添加した培地 5 0 0 mlを含む 2 J2 容坂ロフラスコに接種して、 2 4 °Cで 4 8時間往復振盪培 養した。 この培養液全量を上記培地に消泡剤ァク トコ一ル 0.05%を添加 した培地 3 0 J2 を含む容量 5 O J2 のタ ンクに接種し、 2 4 °Cで通気量 5 0 J2 Z分， 200回転 Z分の条件下で 4 8時間培養した。  A strain of acinopactor 'SP YK-504 (1 F 0 14420, FE RM BP- 709) grown on a nutrient agar slope was prepared using glucose 2%, soluble starch 3%, raw soy flour 1%, poly ぺInoculate a 2 J2 volumetric flask containing 500 ml of a medium containing 0.5% sedimentable calcium carbonate in an aqueous solution (PH 7.0) containing 0.5% ptone and 0.3% salt, and incubate at 24 ° C. The cells were cultivated with reciprocal shaking for hours. The whole amount of this culture solution was inoculated into a tank with a volume of 5 O J2 containing 30 J2 containing the above-mentioned medium supplemented with 0.05% of antifoaming agent, and the aeration volume at 24 ° C was 50 J2 min. The culture was performed for 48 hours under the conditions of 200 rpm and Z minutes.
このようにして得た二種類の培養液のそれぞれ 3 J2 を、 デキス トリ ン 3 J2 of each of the two types of culture solutions thus obtained was added to dextrin.
3 %，生大豆粉 1.5% ,コーン · グルテン · ミール 1.5% ,ポリペプトン 0.2 %，チォ硫酸ナトリゥム 0.1%を含有する水溶液（PH6.5)にァク トコール 0. 05%を添加した培地 120J2 を含む容量 200J2 のタンクに接種し、 通気量 20 U 分， 150回転 分の条件下で 2 4°Cで 2 4時間混合培養し、 2 0 °C に温度を変換し、 更に 4 2時間混合培養した。 3%, raw soy flour 1.5%, corn gluten meal 1.5%, polypeptone 0.2 %, Sodium thiosulfate 0.1% in an aqueous solution (PH6.5), and inoculated into a 200J2 tank containing 120J2 of a medium supplemented with 0.05% of agar, and subjected to aeration of 20 U and 150 revolutions. The mixed culture was performed at 24 ° C. for 24 hours, the temperature was changed to 20 ° C., and the mixed culture was further performed for 42 hours.
培養液にハイフロスーパーセルを加え、 ろ過し、 ろ液（100£ )を得た。 ろ液を ΡΗ 5に調整し、 アンバーライ ト I 1 八ー402 (〇1-型， 1 0 J2 )の カラムクロマトグラフィ一に付し、 水洗後 2 %食塩水（5 09. )で溶出し た。 溶出液中には T AN— 588が 3 2 gノ mlの濃度で含有されていた。 通過液（100J2 )をダウエックス 5 0 WX 2 CH + , 1 02 )のカラムクロ マトグラフィ一に付し、 T AN— 588の N—デァセチル体を吸着させた。 水溶出液と 0.2Nアンモニア溶出液（5 0 ί )を濃縮し、 濃縮液（ 1 3 H ) を pH 5に調整後活性炭（2 β )のクロマ トグラフィ一に付した。 8 %ィ ソブタノ一ル溶出液（2 £ )を濃縮し、 濃縮液（1 β )を再度ダウエツクス δ 0 WX 2 (Η+型， 50〜100メ ヅ シ ュ，0.4β )のカラムクロマ トグラフィ —に付した。 活性区分を 0.2Νアンモニア水で溶出，分画した。 有効区分Hyflo supercell was added to the culture solution, and the mixture was filtered to obtain a filtrate (100 L). The filtrate was adjusted to ΡΗ5, subjected to column chromatography using Amberlite I18-402 (〇1-type, 10 J2), washed with water and eluted with 2% saline (509.). . The eluate contained TAN-588 at a concentration of 32 g / ml. The passing solution (100J2) was subjected to column chromatography on Dowex 50 WX 2 CH + , 102) to adsorb the N-deacetyl compound of TAN-588. The water eluate and the 0.2N ammonia eluate (50 ml) were concentrated, the concentrated solution (13H) was adjusted to pH 5, and then subjected to activated carbon (2β) chromatography. Concentrate the 8% isobutanol eluate (2 £) and reconcentrate the concentrate (1 β) to column chromatography of Dowex δ 0 WX 2 (Η + type, 50-100 mesh, 0.4β). Attached. The active fraction was eluted with 0.2% aqueous ammonia and fractionated. Effective classification
(ι. )を活性炭クロマ トグラフィ ーで脱塩し、 除去液を濃縮し、 濃縮 液にアセ ト ンを加えて、 粗粉末を得た。 この粗粉末を分取用逆層系高速 クロマ トグラフィ一 [担体： YMC -Pack, 0 D S , S H— 343,山村化学研 究所製，日本，移動層： 0.02Mリ ン酸緩衝液（PH6.3)]に付し、活性を示すピ ーク部分を採取し、溶出液中の無機塩を活性炭ク口マ トグラフィ一で除 去した。抗生物質を含む画分を濃縮，凍結乾燥し、ァセ ト ンを加えて、 T AN— 588の N—デァセチル体の粉末（5 0 mg)を得た。 この粉末は T L Cバイオオートグラム， H P L Cバイオヒス トグラム， I Rおよび P M R で標品（T A 一 588の N—デァセチル体， A型および B型の混合物）と同 定された。 (ι.) was desalted by activated carbon chromatography, the removed solution was concentrated, and acetate was added to the concentrated solution to obtain a coarse powder. This coarse powder was separated by preparative reversed-phase high-performance chromatography (carrier: YMC-Pack, 0DS, SH-343, manufactured by Yamamura Chemical Laboratory, Japan, moving bed: 0.02M phosphate buffer (PH6. 3)], peaks showing activity were collected, and inorganic salts in the eluate were removed by activated carbon mouth chromatography. The fraction containing the antibiotic was concentrated, freeze-dried, and added with acetone to obtain a powder (50 mg) of N-deacetyl derivative of TAN-588. This powder was identified by TLC bioautogram, HPLC biohistogram, IR and PMR as a standard (a mixture of N-deacetyl, A and B forms of TA-588).
実施例 1 3 栄養寒天斜面上に生育させたリゾパクター ' アルブス sp. nov. YExample 13 Lysopattor grown on nutrient agar slope '' Arbus sp. Nov. Y
K - 422( I F 0 14384, F E RM B P— 698)の菌株を、グルコース 2 % ,ソルブル · スターチ 3 % ,生大豆扮 1 % ,ポリペプトン 0.5% ,食塩 0.3 %を含有する水溶液（PH7.0)に沈降性炭酸カルシウム 0.5%を添加した培 地 500mlを含む 2 J2 容坂ロフラスコに接種して、 2 4 で4 8時間往復 振盪培養した。 この培養液全量を上記培地に消泡剤ァク トコール 0.05% を添加した培地 3 0 £ を含む容量 5 0 J2 のタンクに接種し、 2 4°Cで通 気量 5 02 Z分， 200回転ノ分の条件下で 4 8時間培養した。 K-422 (IF 0 14384, FE RM BP-698) strain was converted to an aqueous solution containing 2% glucose, 3% solvable starch, 1% raw soybean, 1% polypeptone, 0.3% salt and 0.3% salt (PH7.0) The mixture was inoculated into a 2J2 volume flask containing 500 ml of a medium to which 0.5% of sedimentable calcium carbonate was added, and cultured with reciprocal shaking at 24 for 48 hours. The entire amount of this culture was inoculated into a 50 J2 tank containing 30 £ of medium containing the above-mentioned medium supplemented with 0.05% of the antifoaming agent Actcol. The cells were cultured for 48 hours under the same conditions.
栄養寒天斜面上に生育させたァシネ トパクター ·エスピー YK— 50 4(1 F O 14420, FERM B P— 709)の菌株を、 グルコース 2 %,ソ ルブル . スターチ 3 % ,生大豆粉 1 % ,ポリペプトン 0.5% ,食塩 3%を 含有する水溶液（pH7.0)に沈降性炭酸力ルシゥム 0.5%を添加した培地 50 Qmlを含む 2 J2 容坂ロフラスコに接種して、 2 '4 °Cで 4 8時間往復振盪 培養した。 この培養液全量を上記培地に消泡剤ァク トコール 0.05%を添 加した培地 3 0 £ を含む容量 5 0 J2 のタ ンクに接種し、 2 4 °Cで通気量 5 05 分， 200回転 分の条件下で 4 8時間培養した。  A strain of Acinetobacter sp. YK-504 (1 FO 14420, FERM BP- 709) grown on a nutrient agar slope was prepared using glucose 2%, Soluble starch 3%, raw soy flour 1%, polypeptone 0.5%. Inoculate a 2J2 volumetric flask containing 50 Qml of a medium containing 0.5% of sedimentary carbon dioxide in an aqueous solution (pH 7.0) containing 3% salt, and shake back and forth at 2'4 ° C for 48 hours. Cultured. The entire volume of this culture was inoculated into a tank of 50 J2 containing 30 £ of medium supplemented with 0.05% of the antifoaming agent Actcol to the above medium, and aerated at 504 ° C for 505 minutes at 200 rpm. The culture was performed for 48 hours under the conditions of minutes.
このようにして得た二種類の培養液のそれぞれ 32 を、 デキストリ ン 3 %，生大豆粉し 5%，コーン ♦ グルテン ' ミール 1.5% ,ポリペプトン 0.2 %，チォ硫酸ナトリゥム 0.1%を含有する水溶液（PH6.5)にァク トコール 0. 05%を添加した培地 120β を含む容量 200£ のタンクに接種し、 通気量 20 分，150回転 Ζ分の条件下で 2 4°Cで 2 4時間混合培養し、 2 0 °Cに 温度を変換し、 更に、 4 2時間混合培養した。 得られた培地中には、 T AN- 588の N—デァセチル体（ A型および B型の混合物）が含まれてい ることが、 シュ一ドモナス . エルギノ一ザ C— 1 を試験菌とする T L Cバイオオー トグラフィ一法により確認された。  An aqueous solution containing 3% of dextrin 3%, raw soybean meal 5%, corn グ ル gluten 'meal 1.5%, polypeptone 0.2%, sodium thiosulfate 0.1% PH6.5) was inoculated into a 200-pound tank containing a medium 120β supplemented with 0.05% of actcol, and mixed at 24 ° C for 24 hours under the conditions of aeration of 20 minutes and 150 rpm. After culturing, the temperature was changed to 20 ° C., and mixed culture was further performed for 42 hours. The obtained medium contains the N-deacetyl form of TAN-588 (mixture of A-type and B-type), indicating that TLC using Pseudomonas aeruginosa C-1 as a test bacterium. It was confirmed by one method of bioautography.
産業上の利用可能性 抗生物質 T A N— 588 ,そのパラ二トロべンジルーもし く はベンツヒ ド リルエステル体，またはこれらの N—デァセチル体またはそれらの塩は、 グラム陽性菌および陰性菌に対し抗菌作用を有し、 哺乳動物，家禽等の 細菌感染症の治療剤として用いることができる。 Industrial applicability The antibiotic TAN-588, its para-nitrobenzene or benzhydryl ester form, or their N-deacetyl form or salts thereof have antibacterial activity against Gram-positive and negative bacteria, It can be used as a therapeutic agent for bacterial infections such as poultry.

Claims

請 求 の 範 囲 I . カルボキシ基におけるナトリゥム塩として次の物理化学的性状を有 する抗生物質 T AN— 588; Scope of Claim I. Antibiotic having the following physicochemical properties as a sodium salt at the carboxy group: TAN-588;
(1 ) 外観：白色粉末  (1) Appearance: white powder
(2) 構成元素が C,H，N,ひおよび Naからなる元素分析値（％：)、 五 塩化リ ン上で 40°C、 6時間乾燥した試料：  (2) Elemental analysis value (% :) consisting of C, H, N, H, and Na as constituent elements. Samples dried on phosphorus pentachloride at 40 ° C for 6 hours:
実 測 値 計 算 値※  Measured value Calculated value *
C ,38.5±2.0 C ,39.61  C, 38.5 ± 2.0 C, 39.61
H, 4.5±1.0 H, 3.99 H, 4.5 ± 1.0 H, 3.99
, 9.1±1.5 N, 9.24  , 9.1 ± 1.5 N, 9.24
0 ,39.58  0, 39.58
Na,.6.9±1.5 Na.7.58  Na, .6.9 ± 1.5 Na.7.58
(x 0.5モルの付着水を含むとして計算） (Calculated as containing x 0.5 mol of attached water)
(3) 分子式： C ^H NsOvNa  (3) Molecular formula: C ^ H NsOvNa
(4) S I MS法による分子イオンピークは次のとおりである。  (4) The molecular ion peaks by the SIMS method are as follows.
m/z 611(2 M + Na)+ ' ,317(M+ Na)+ ,295(M+ H) + m / z 611 (2 M + Na) + ', 317 (M + Na) + , 295 (M + H) +
(5) 紫外部吸収スぺク トル（水中）： 216nm付近に肩を示す。 (5) Ultraviolet absorption spectrum (in water): Shows shoulder near 216 nm.
(6) 赤外部吸収スぺク トル：臭化力リゥム錠による主な吸収。  (6) Infrared absorption spectrum: The main absorption by bromide reammable tablets.
3450, 1780, 1730, 1660, 1550, 1385， 1320, 1290, 1260, 1200, 1120, 1040, 980, 910, 810, 770,
Figure imgf000058_0001
3450, 1780, 1730, 1660, 1550, 1385, 1320, 1290, 1260, 1200, 1120, 1040, 980, 910, 810, 770,
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(7) 溶解性：水，ジメチルスルフオキサイ ドに可溶。 酢酸ェチル，ク 口口ホルム，ジェチルエーテルに難溶。  (7) Solubility: Soluble in water and dimethyl sulfoxide. Poorly soluble in ethyl acetate, kokuguchi form, and getyl ether.
(8) 呈色反応：ニンヒ ドリ ン反応に陽性。 グレイグ ' リーバック， i 坂口，エールリ ツヒ，バー トン， ドラ—ゲン ドルフ反応に陰性。(8) Color reaction: positive for ninhydrin reaction. Greig's Leeback, i Negative for Sakaguchi, Ehrlich, Burton, and Dragendorf reactions.
( 9 ) 酸性，中性，塩基性の区別：中性物質 (遊離体は酸性物質）， そのパラニ トロべンジルーもし く はべンッヒ ドリルエステル体，または これらの N—デァセチル体またはそれらの塩。 (9) Distinguishing between acidic, neutral, and basic: neutral substances (free substances are acidic substances), their paranitrobenzilyl or Bench drillyl esters, or their N-deacetyl derivatives or their salts.
5 2 . ェンぺドバクタ—属またはリゾバクタ—属に属し抗生物質 T A N—5 2. The antibiotic T A N— belonging to the genus Bacterium or Rhizobacta
588および/またはその N—デァセチル体を生産する能力を有する微生 物を培地に培養し、 培養物中に抗生物質 T A N - 588および/またはそ の N—デァセチル体を生成蓄積せしめ、 これを採取することを特徵とす る抗生物質 T A N— 588および/またはその N—デァセチル体またはそ 0 の（それらの）塩の製造法。 A microorganism having the ability to produce 588 and / or its N-deacetyl form is cultured in a medium, and the antibiotic TAN-588 and / or its N-deacetyl form is produced and accumulated in the culture, and collected. A method for producing TAN-588 and / or its N-deacetyl derivative or a salt thereof (these).
3 . D N Aの G C (グァニン +シ トシン）含量が 70 %をこえるェンぺドバ クタ一 · ラクタムゲヌス。  3. Endobacteria and lactamgenus whose DNA (GC + guanine + cytosine) content exceeds 70%.
4 . 白色のコロニーを形成し、 0— F (ォキシダティブ'ーフアーメ ンタ ティブ）テストが非分解型でかつ無機窒素源の資化性を有さないリゾバ 5 クタ一 ♦ アルブス。 .  4. Rizova ♦ Arbus that forms white colonies and is non-degradable in the 0-F (oxidative) test and has no assimilation of inorganic nitrogen sources. .
5 . 抗生物質 T A N— 588またはその塩を脱ァセチル化することを特徵 とする抗生物質 T A N— 588のデァセチル体またはその塩の製造法， 5. A method for producing a deacetyl form of the antibiotic TAN-588 or a salt thereof, which comprises deacetylating the antibiotic TAN-588 or a salt thereof;
6 . 抗生物質 T A — 588またはその塩にベンツヒ ドリル基を導入し得 る化合物を反応させ、 抗生物質 T A N— 588のベンツヒ ドリルエステル 0 体とし、 次いでこれを脱ァセチル化反応に付すことを特徵とする抗生物 質 T A N— 588のデァセチル体のベンツヒ ドリルエステル体の製造法。 7 . ェンぺドバクター属またはリゾバクター属に属し抗生物質 T A - 588および/またはその N—デァセチル体を生産する能力を有する微生 物と、 微生物と混合培養することにより該微生物に抗生物質 T A N— 58 5 8の N—デァセチル体を蓄積させる能力を有するァシネ トパクター属に 属する微生物とを培地に混合培養し、 培養物中に、 抗生物質 T A N - 58 8の N デァセチル体を生成蓄積せしめ、 これを採取することを特徵と する抗生物質 T A N— 588の N デァセチル体またはその塩の製造法。 6. It is characterized in that a compound capable of introducing a benzhydryl group is reacted with the antibiotic TA-588 or a salt thereof to form zero benzhydryl ester of the antibiotic TAN-588, which is then subjected to a deacetylation reaction. A method for producing the decetyl-form benzhydryl ester form of TAN-588. 7. Microorganisms belonging to the genus Endobacter or Rhizobacta and capable of producing the antibiotic TA-588 and / or its N-deacetyl form, and the microorganism TAN- 58 5 A mixture of the microorganism belonging to the genus Acinetobacter, which has the ability to accumulate the N-deacetyl body, is cultured in the medium, and the antibiotic TAN-58 is added to the culture. 8. A method for producing an N-deacetyl derivative of TAN-588 or a salt thereof, which comprises producing, accumulating, and collecting the N-deacetyl derivative of 8.
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Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Shadan Hojin Yukugakkai Pharmacia Review Henshu Iinkai "Pharmacia Review No.7, Kosei Busshitsu" (1981-10-15) Shadan Hojin Nippon Yakugakkai P.2-5 *

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