HU193905B - Process for preparing glycopeptide antibiotics by means of bioconversion - Google Patents
Process for preparing glycopeptide antibiotics by means of bioconversion Download PDFInfo
- Publication number
- HU193905B HU193905B HU843932A HU393284A HU193905B HU 193905 B HU193905 B HU 193905B HU 843932 A HU843932 A HU 843932A HU 393284 A HU393284 A HU 393284A HU 193905 B HU193905 B HU 193905B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- csv
- formula
- compound
- cuc
- bioconversion
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07G—COMPOUNDS OF UNKNOWN CONSTITUTION
- C07G11/00—Antibiotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/195—Antibiotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K9/006—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure
- C07K9/008—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure directly attached to a hetero atom of the saccharide radical, e.g. actaplanin, avoparcin, ristomycin, vancomycin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/045—Actinoplanes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/19—Antibiotic
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/27—Cyclic peptide or cyclic protein
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Feed For Specific Animals (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás új glikopeptid antibiotikumok előállítására. E vegyületeket aktaplanin faktorok biokonverziójával állítjuk elő az új Actinoplanes missouriensis CUC 014 vagy CSV 558 törzsek alkalmazásával. A biokonverzióval előállított vegyületek (1) általános képletűek, ahol
R, mannozil-glükozil-, rammozil-glükozilvagy glükozilcsoport,
R2 mannozilcsoport,
R3 hidrogénatom vagy mannozilcsoport, és R L-risztozaminilcsoport.
Az (I) általános képletű vegyületek hasznos új antibiotikumok. Hatásosak Gram-pozítív baktériumok ellen, fokozzák állatok táplálékhasznosítási képességét és kérődzőknél növelik a tejtermelést.
Az A. missouriensis CUC 014 és CSV 558 törzset deponálták és részét képezi a „Nort5 hera Régiónál Research Center, Agricultural Research (North Central Region, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604) törzs tenyészet-gyűjtemények, ahol a nyilvánosság számára az NRRL 15646 (CSV 558) és NRRL
15647 (CUC 014) nyilvántartási szám alatt áll rendelkezésre.
A találmány szerint előállított glikopeptid antibiotikumok az (I) általános képlettel írhatók le, ahol az egyes szubsztituensek jelentése:
No. | Vegyület | Rl | r2 | R3 |
1a | CUC/CSV | mannozil-glükozil | mannozil | mannozil |
1b | Bj/CSV | ramnozil-glükozil | mannozil | mannozil |
1 c | b2/csv | glükozil | mannozil | mannozil |
1d | B3/CSV | mannozil-glükozil | mannozil | H |
1 e | Cia/CSV | ramnozil-glükozil | mannozil | H |
1j | G/CSV | glükozil | mannozil | H |
Feltaláltuk, hogy a CUC/CSV antibiotikum az aktaplanin A-faktor biokonverziójá- 30 val állítható elő CUC 014 vagy CSV 558 tenyészetet használva, és hogy a többi aktaplanin faktor hasonló módon biokonvertálható és így hasonlóan módosított termékeket, azaz (I) általános képletű vegyületeket ered- 35 ményeznek.
Az (I) általános képletű vegyületet alkalmas hordozóanyaggal együtt tartalmazó készítmények bizonyos fertőzések kezelésére, 4θ táplálékhasznosítási hatásfok növelésére és tejelő kérődzők tejtermelésének fokozására alkalmazhatók.
Állandó igény mutatkozik új, tökéletesebb antibiotikumok iránt. Emberi betegségek kezelésére alkalmas antibiotikumok mellett az 45 állatgyógyászat területén is szükség van tökéletesebb antibiotikumokra. A fokozott hatékonyság, szélesebb baktériumellenes spektrum, fokozott in vivő hatásosság és jobb gyógyszerészeti tulajdonságok (mint nagyobb fokú orális felszívódás, magasabb vér- és szöveti koncentráció, hosszabb felezési idő a szervezetben, előnyösebb kiválasztási és metabolikus sebesség és út) részét képezik a tökéletesebb antibiotikumokkal szemben támasztott követelményeknek.
A sók különösen előnyös csoportját képezik a gyógyszerészetileg elfogadható savaddíciós SÓk. QQ
A találmány szerinti eljárásban az (I) általános képletű vegyületeket a megfelelő aktaplanin faktor biokonverziója útján állítjuk elő A. missouriensis CSV 558 (NRRL 15646) vagy CUC 014 (NRRL 15647) törzset süllyesztett, aerób körülmények közöli alkalmas táp2 közegben fermentálva, a kívánt termékké vadó átalakulás bekövetkezéséig.
Az aktaplanin A-faktor a 4,115,552 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban, az aktaplanin B,, B2, B3, C10, C3 és E, faktor a 4,322,406 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban foglaltak szerint állítható elő. Aktaplanin pszeudo-aglükon a 4,029,769 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás szerint, aktaplanin G-faktor az 5507 számú európai szabadalmi leírás szerint, aktaplanin C2O, D,, D2, K, L, Μ, N és O faktor az EP 127434 számú, nyilvánosságra hozott európai szabadalmi leírása szerint állítható elő.
Az aktaplanin A, B,, B2, B3, C,o és G faktorok az la, lb, le, ld, le és lj; vegyületek (II) ált. képletű megfelelői. Az A. missouriensis törzsek számos tápközegben tenyészthetők (például a 4,322,406 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás több tápközeg-variációt ismertet a „szülő” A. missouriensis ATCC 31683 törzs számára). A biokinverzió végrehajtásakor a megfelelő szubsztrátot a növekedésben levő fermentációhoz adhatjuk hozzá, vagy a tápközeghez adjuk sterilezés után, de a beoltás előtt.
A biokonverziót a fermentáció folyamán a fermentlé mintáin végzett rétegkromatográfiával (TLC) követhetjük, az L példa D. része szerint.
Süllyesztett aerób fermentálási körülmények alkalmazása után az (I) általános képletű vegyület ismert eljárásokkal, például adszorbeiós és extrakciós módszerekkel nyerhető ki a fermentációs közegből.
Az (I) általános képletű vegyület forrásaként azonban a tenyészet szilárd részei — bele-2193905 értve a tápközeg komponenseit és a micéliumot — extrakció vagy szeparálás nélkül is használhatók, de előnyösen a víz eltávolítása után. Például a CUC/CSV antibiotikum képződését követően a teljes fermentlé megszárítható liofilizálással, dobszárítással, vagy azeotróp desztillációval és szárítással. A megszárított teljes fermentlé azután közvetlenül bekeverhető a táp-premixbe.
Az (1) általános képletű vegyületek kórokozó baktériumok, különösen Gram-pozítív baktériumok fejlődését gátolják. Az I. táblázat összegzi az egyes mikroorganizmusok növe5 kedését még gátló legkisebb CUC/CSV koncentrációkat (MIC-értékek), melyeket standard agar-hígítási próbában határoztunk meg.
1. táblázat
Biokonverziós termékek in vitro aktivitása
Organizmus | MIC /meg | per ml/ |
CUC/CSV | b2/csv | |
Staphylococcus aureus NRR1 V 313 | 8 | 4 |
' ” V41 | 8 | 8 |
X400 | 16 | 16 |
” S13E | 8 | 4 |
” epidermidis EPI1 | 16 | 16 |
222 | 8 | 2 |
Streptococcus pyogenes C203 | 1 | |
pneumoniae Park 1 | 0,5 | 1 |
faecium ATCC 9790 | 4 | 4 |
sp. group D 9960 | 4 | 4 |
Nem vizsgáltuk
A CUC/CSV antibiotikum anaerob bak- 35 tóriumok növekedését is gátolja. A II. táblázat különböző anaeróbb izolátumoknak a CUC/ /CSV-vel szembeni érzékenységét mutatja be.
II. táblázat
Anaeróbb baktérium-izolátumok CUC/CSV antibiotikummal szembeni érzékenysége Anaerob baktériumok MIC (pg per ml) Clostridium difficile 2994 1 perfringens 81 4 septicum 1128 4
Eubacterium aerofadiens 1235 2
Peptococcus asaccharolyticus 1302 4 ” prevoti 1281 8
Peptostreptococcus anaerobicus 1428 2 ” intermedium 1264 4
Propionibacterium acnes 79 1
Bacteroides fragilis 111 >128
1877 >128
1936B >128 ” thetaiotaomicron 1438>128 ’’ melaninogenicus 1856/28> 128
2736 16 ” vulgatis 1211 >128 ” corrodens 1874 >128
Fusobacterium symbiosum 1470 >128 ” necrophorum 6054A 2 “a MIC-értékeket agar-hígítási módszerrel határoztuk meg; a végpontokat 24 órás inkubálás után állapítottuk meg.
A CUC/CSV in vivő mikróbaellenes hatást is mutat kísérletileg indukált baktériumos fertőzésekkel szemben. Ha a vizsgálandó vegyület két dózisát kísérletileg megfertőzött egereknek adjuk be, a megfigyelt aktivitást ED50 értékként határozzuk meg [hatásos dózis mg/kg-ban, mely a kísérleti állatok 50%-át megvédi: lásd Wick és munkatársai, J. Bactericl. 81, 233-235 (1961)]. A CUC/CSV antibiotikumra kapott ED5u értékeket a III. táblázat mutatja.
Hl. táblázat
CUC/CSV antibiotikum ED50 értékei egéren Fertőző organizmus ÉD50 [mg(kg)2]a
Staphylococcus aureus 1,59
Streptococcus pyogenes 1,09
Streptococcus penumoniae 0,84 “szubkután beadva a fertőzés után 1 és 4 órával.
Az (1) általános képletű vegyület hatásos mennyiségét parenterálisan vagy orálisan adji k be a fertőzött vagy fogékony melegvérű á latoknak. A vegyület belégzés útján is alkalmazható például porkészítmény formájában, melyet az állatok vagy baromfik tartózkodási helyét képező zárt térbe vagy helyiségbe fajunk be. Az állatok, köztük a szárnyasok belelegzik a levegőben levő porkészítményt; a porkészítményt a szemen át is felveszi a szervezet (intraokuláris injekciónak nevezett eljárás) .
-3193905
A fertőzés leküzdésére hatásos dózis függ a fertőzés súlyosságától és az állat korától, tömegétől és állapotától. A védelemhez szükséges teljes- dózis azonban általában 0,1-100 mg/kg, előnyösen 0,5-50 mg/kg. Az orális dózis általában 1-300 mg/kg, előnyösen 1-100 mg/kg. Megfelelő adagolási tervek készíthetők.
A vegyületek gyakran a legcélszerűbben a táplálékban vagy ivóvízben alkalmazhatók. Ilyen célra számos táplálék használható, így szokványos száraz tápok, folyékony tápok és pelletezett tápok.
A gyógyszerkészítmények az (I) általános képletü vegyületet alkalmas vivőanyaggal együtt tartalmazzák. Orálisan és parenterálisan adagolható készítmények ismert gyógyszerészeti eljárásokkal állíthatók elő.
A találmány szerinti vegyületeket tartalmazó, hatásos befecskendezhető készítmények szuszpenziók vagy oldatok lehetnek.
Oldat készítéséhez a vegyületet fiziológiailag elfogadható vívőanyagban oldjuk. Az ilyen vívőanyagok alkalmas oldószert, kívánt esetben tartósítószereket, mint benzil-alkoholt, és puffereket tartalmaznak. Hasznos oldószer például a víz és vizes alkoholok, glikoiok, és karbonát-észterek, mint dietil-karbonát. Az ilyen vizes oldatok általában nem tartalmaznak 50 térfogat%-ná! több oldószert.
Az injekciós szuszpenzió készítmények vivőanyagként folyékony szuszpendáló közeget tartalmaznak adjuvánssal vagy anélkül- A szuszpendáló közeg például vizes polivinil-pirrolidon, közömbös olaj, mint növényi olaj vagy nagy tisztaságú ásványolaj, vagy vizes karboxi-metil-cellulóz-oidaí lehet.
Szuszpenzió készítmény esetében alkalmas, fiziológiailag elfogadható adjuvánsok szükségesek a vegyület szuszpenzióban tartásához. Az adjuvánsokat sűrítőanyagok, mint karboxi-metil-cellulóz, po lívinil - pirrolidon, zselatin, és az alginátok közül választjuk ki. Szuszpendálószerként számos felületaktív szer is használható. A lecitin, alkil-fenoi-polietilénoxid-adduktok, naftalinszulfonáiok, alkil-benzolszulfonátok és a polioxi-etilén-szorbitán-észterek hasznos szuszpendálószerek.
A 'folyékony szuszpendáló közeg hidrofil jellegét, sűrűségét és felületi feszültségét befolyásoló számos anyag adható egyes esetekben a befecskendezhető szuszpenziókhoz. Például szilikon habzásgátlók, szorbit és cukrok hasznos szuszpendálószerek lehetnek.
Baromfi, sertés, juh és marha táplálékhasznosításának fokozására és a tejelő kérődzők tejtermelésének növelésére az (I) általános képletü vegyületet orplisan adagoljuk valamely alkalmas táplálékban, körülbelül 2-200 g/t. mennyiségben. Tejelő kérődzők tejtermelésének fokozása céljából naponta orálisan mintegy 0,01-10 mg/kg testtömeg menynyiséget [vagy körülbelül 100-1600 mg/kérődző/nap] javasolunk.
Gyógyszereknek az állati eleségbe való bevitele jól ismert eljárás. Előnyösen a szerből tömény premixet készítünk, melyből azután előállítjuk a gyógyszertartalmú eleséget. Jellemzően 2,2-444 g szert tartalmaznak per kg premix. A premíxek szilárd vagy folyékony készítmények lehetnek.
Az állatok vagy szárnyasok végső eleségkészítménye függ az alkalmazandó szer menynyiségétől. Az (I) általános képletü vegyületet tartalmazó tápokat az ilyen célokra használatos keverő és pelletező eljárásokkal állítjuk elő.
A következő példák a találmány bemutatására szolgálnak.
1. példa
CUC/CSV antibiotikum előállítása aktaplanin A-faktor biokonverziójával, CUC 014 vagy CSV 558 tenyészetet alkalmazva
A.CUC 014 és CSV 558 tenyészetek rázott íombikos fermentálása
Actlnoplanes missouriensis CUC 014 törzsének (NRRL 15647) vagy CSV 558 törzsének (NRRL 15646) liofilizált pelletjét 1-2 ml steril vízben oldjuk. Ezt a szuszpenziót használjuk a következő összetételű ferde agar beoltására:
Mennyiség (t%)
6,0 0,1 0,25 0,5 2,5 100%-ig
Alkotórészek
Előfőzött zabliszt K2HPO4 Élesztő
Czapek-féle ásványi törzsoldat Aga?
lonmentesített víz
Beállítás előtti pH=6,2; beállítás pH 7,3-ra n NaOH-oldattal; sterilezés után a pH=6,7. Czapek-féle ásványi törzsoldat:
Alkotórészek | Mennyiség (t%) |
KC1 | 10,0 |
MgSO4-7H2O | 10,0 |
FeSO4-7H2O | 0,2 (2 mi tömény |
HCl-ban oldva) | |
Ionmentesített víz | 100%-ig. |
6Difco Laboratories |
A beoltott ferde agart 30°C-on 8-10 napig inkubáljuk. Az érett agartenyészetet steril oltókacs csipkézett élével kaparjuk a micéliumhálózat leválasztása és fellazítása céljából.
A fellazított hálózatnak körülbelül használjuk az alábbi összetételű vegetatív tápközeg beoltására:
Alkotórészek Mennyiség (t%)
Glükóz 2,0
Tripton0 0,5
Élesztőkivonat 0,5
Csapvíz 100%-íg.
Sterilezés előtt a pH=6,5; beállítás pH 7,2-re
5n NaOH-oldattal; sterilezés után a pH=6,9.
“Bacto Tryptone, Difco A beoltott vegetatív táptalajt 250 ml-es
Erlenmeyer-lombikban 30°C-on 72 óráig inkubáljuk, 5 cm kilengést és percenként 250 fordulatot végző forgó rázógépen.
-4193905
Vegetatív tenyészeteket ferde agar tenyészettel, a tenyészet liofilizált pelletjeivel (egy liofilizátum per 50 ml tápközeg, 250 ml-es lombikban) és folyékony nitrogénben tartott kultu rákkal (0,8% inokulum) indítunk.
Inkubált vegetatív táptalajt (5 térfogat%) használunk 50 ml szaporító táptalaj beoltására, melynek összetétele:
Alkotórészek Mennyiség (t%)
Glükóz 2,5
Kukoricakeményítő 3,5
Melasz 1,5
Glicerin 1,5
Élesztő 2,0
K2HPO4 0,05 (NH4)2SO4 0,025
CaCO3 0,2
Csapvíz 100%-ig
Sterilezés előtti pH=6,5; beállítás 6,8-ra; sterilezés után a PH=6,5.
A beoltott szaporító táptalajt 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban 30°C-on 72 óráig inkubáljuk 5 cm kilengést és percenként 250 fordulatot végző forgó rázógépen.
B. A. biokonverzió
Aktaplanin A-faktort (100 mg) szűrés útján sterilezett vízben oldunk és hozzáadjuk (0,3 mg per ml végkoncentrációban) az átalakító A.missouriensis CSV 558 (NRRL 15646) A. pontszerinti tenyészet 5 napos, 1 liter térfogatú fermentációjához. A fermentációt további 48 óráig inkubáljuk.
C. CUC/CSV izolálása
A fenti B. rész szerint biokonverziót hajtunk végre. A fermentlevet leszűrjük és a micéliumot vízzel extraháljuk pH 10,5-nél. E kivonatot (550 ml) 100 ml HP-20 gyantával töltött oszlopon tisztítjuk, vízzel mossuk, majd CH3OH/H2O-CH3OH gradienssel eluáljuk. A frakciókat egyesítve liofilizált nyersterméket (190 mg) állítunk elő. E termék egy részét (100 mg) 5 ml CH3CN/pirOAc (36:64; pH 3,6) elegyben oldjuk és Lichroprep RP-8 gyantával (25-40 pm) töltött 300 ml-es üvegoszlopra visszük fel. Az oszlopot CH3CN/0,5% piridil-acetát (1:4; pH 3,6) eleggyel eluáljuk 8 ml/min átfolyási sebességgel. A terméket 280 nm-nél UV abszorbancia alapján, B. subtilis biológiai próbával és analitikai HPLC-vel detektáljuk. A kívánt aktivitást tartalmazó frakciókat egyesítjük, In NaOH-oldattal pH 6,5-re állítjuk be és bepároljuk az acetonitril eltávolítása céljából. A képződött vizes oldatot (50 ml) 12 ml LP1-C18 gyantával (lásd 4,293,482 számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírás, 7. példa) töltött 4 ml-es oszlopra visszük fel. Az oszlopot vízzel (100 ml) mossuk a só eltávolítása céljából, és az aktív anyagot CH3CN/H2O (7:3) eleggyel eluáljuk. Az eiuátumot bepárolva és liofilizálva 10 mg tisztított CUC/CSV antibiotikumot kapunk.
D. CUC/CSV antibiotikum aktivitásának vizsgálata
A teljes fermentlevet (pH 10,5-re beállítva) lecentrifugáljuk. A felüluszó pH-ját 7,0-re állítjuk be. Az így előkészített mintákat Bacillus subtilis lemezpróbával és.vékonyrétegkromatográfiával (TLC) vizsgáljuk szilikagél-lemezeket (Merck, előrebevont plasztik Lapok; sziliksgél 60, fluoreszcens indikátor nélkül) és aceton (víz) ammónia (160:40:1) oldószerrendszert használva. A detektálást biokromatográf iával hajtjuk végre kevés táptalajban B. subtilist használva és a lemezeket 37°C-on körülbelül 18 óráig inkubálva.
A CUC/CSV antibiotikum jellemzői a következők:
(Elemi analízis (%)
Számított Talált
C-90 | 49,46 | 49,28 |
H-98 | 5,65 | 3,35 |
N-7 | 4,49 | 4,55 |
0-41 | 38,80 | 39,82 (különbségből) |
Cl-1 | 1,62 | 2,00 |
<’C90H98N7O41 | C1.12H2O-ra |
Ultraibolya abszorpció (metanolban): kmaX 278 nm, sav (ε~ 17000). kmax 277 nm, 361 nm, semleges (ε 18500, 9000) kmax 295 nm, 340 nm, bázis (ε-21000, 14500)
1200-as molekulatömeg alapján számítva. A vegyület 230 nm-nél mutat végabszorpciót. Oldhatóság: oldódik dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban, acetonitril/víz elegyben és alkohol/víz elegyekben.
Tömegspektrometria: (gyors atombombázás): FAB MS alapján a molekulasúly 1968.
2. példa
CUC/CSV előállítása aktaplanin A-faktornak CUC 014 tenyészettel való biokonverziója útján
Az 1. példa eljárását követve, de CSV 558 tenyészet helyett CUC 014 (NRRL 15647) tenyészetet használva az aktaplanin A-faktort CtJC-CSV antibiotikummá alakítjuk át.
3. példa
A CUC/CSV antibiotikumhoz használt analitikai HPLC rendszer
Oszlop: 4,6 x 250 mm rozsdamentes acél Töltet: Shandon ODS Hypersil-5 mikron Oldószer: CH3CN/0,5M KH2PO4, H3PO4-gyel pH 3,2-re beállítva (21:79) Átfolyási sebesség: 1,0 ml/min De tektális: UV fényben 220 nm-nél Papírsebesség: 20 cm/h Retenciós idő: 9,3 min.
4. példa .
A 4696 B2 konverziós termék előállítása (le vegyület)
Az 1. példa eljárását alkalmazva, aktaplaniu (A 4696) B2-faktort (200 mg) adunk az A.
-5193905 missouriensis CSV 558 konvertáló tenyészet növekedő kultúrájához. A biokonverziót TLCvel követjük. Amikor a biokonverzió teljes, a fermentlevet szűréssel szeparáljuk. Az elválasztott micéliumokat vízzel extraháljuk pH 10,5-nél (NaOH-dal beállítva). E kivonatot HP-20 gyantával (185 ml) töltött oszlopon az 1. példában leírtak szerint tisztítva liofilizált terméket kapunk. E termék egy részét' (160 mg) 170 ml Fractogel TSK HW-40S gyantával (32-63 μ, E. Merck, Darmstadt, NSZK) töltött üvegoszlopra visszük fel, eluensként 3,3 liter vizet, majd 700 ml CH3OH/HjO (1:1) elegyet alkalmazva 3 ml/min átfolyási sebességgel. A termék a CH3OH/H2O frakcióban jelenik meg; e frakciót bepároljuk és liofilizáljuk, majd egy hasonlóan előállított termékkel egyesítjük. Az egyesített terméket a fenti gyantán ujrakromatografáljuk a következő lépcsős gradienst használva: CH3OH/ H2O gradiens (1:3) —150 ml; (2:3)—350 ml; (3:2)-550 ml; és (4:1)-470 ml. A frakciókat analitikai HPLC-vel ellenőrizzük és a kívánt terméket tartalmazó frakciókat egyesítve, bepárolva és liofilizálva 20,3 g A 4696 B2 biokonverziós terméket kapunk.
UV-abszorpciós spektrum: Kmax 278 nm, sav (ε~15000)
Ámox 355 nm, bázis (ε-45000).
Oldhatóság: jól oldódik dimetil-formamidban, dimetil-szulfoxidban, acetonitril-víz és alkohol-víz elegyekben.
HPLC: megegyezik az 5. példa termékével, azonban a reakciós idő 10,4 perc.
5. példa
A 4696 Cia konverziós termék (le vegyület)
Az 1. példában leírt eljárást alkalmazva aktaplanin Cia-faktort (240 mg) adunk az A. missouriensis NRRL 15646 konvertáló tenyészet növekedő kultúrájához. Teljes biokonverzió után a fermentlevet leszűrjük és.az elválasztott micéliumokat vízzel extraháljuk pH 10,5-nél (NaOH-dal beállítva). E kivonatot (650 ml) 100 ml HP-20 gyantával töltött oszlopon tisztítjuk az 1. példában leírtak szerint; így 187 mg liofilizált terméket kapunk.
E termék (185 mg)J3 ml CH3OH/H2O (7:3) elegyben oldjuk, átszűrjük és Fractogel TSK HW-40S gyantával töltött 170 ml-es oszlopra visszük fel.
Tömegspektrometria (gyors atombombázás): mólsúly 1805.
HPLC: oszlop: 4,6x250 mm rozsdamentes acél.
töltet: Shandon ODS Hypersil - 5 μ.
oldószer: CH3CN: 0,5 M (KH2PO4; 21:
:79), pH 3,2-re állítva Η3ΡΟ4* 'gyeitérfogatsebesség: 1,0 ml/perc. detektálás: 220 nm (UV).
frontsebesség: 20 cm/óra.
retenciós idő: 11,4 perc (CUC/CSV esetén
5,9).
Az oszlopot CH3OH/H2O (2:3) eleggyel eluáljuk 2 ml/min átfolyási sebesség mellett. A frakciókat B. subtilis-szel beoltott agarlemezeken papírkorongos módszerrel és analitikai HPLC-vel ellenőrizzük. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és Lichroprep RP 8 gyantával (25-40 μ) töltött 300 ml-es oszlop'a visszük fel,CH3CN/0,05% vizes pirOAc (1:4 pH 3,5 re beállítva) eleggyel eluálva. A frakciókat analitikai HPLC-vel egyesítjük, pH 6,5-re állítjuk be és bepároljuk. E vizes oldatot 60 ml HP-20 gyantával töltött oszlopra visszük fel, és az oszlopot vízzel mossuk a só eltávolítása céljából. Az aktív anyagot CH3CN/H2O (4:1) eleggyel eluálva és az eluátumot bepárolva és liofilizálva 5,9 mg A 4696 C|a konverziós terméket kapunk. UV-abszorpciós spektrum (metanol):
Amax 278 nm, sav (ε~15000) hmax 355 nm, bázis (ε~15000).
Számított móltömeg: 1200. Végabszorpció 230 nm-nél.
O dhatóság: jól oldódik dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban, acetonitríl-víz és alkohol-víz elegyekben.
HPLC: oszlop: 4,6 x 250 mm rozsdamentes acél.
töltet: Shandon ODS Hypersil — 5 μ.
oldószer: CH3CN: 5 M KH2PO4 (21:79), pH 3,2-re állítva H3PO4gyel.
térfogatsebesség: 1,0 ml/perc. detektálás: 220 mm (UV). frontsebesség: 20 cm/óra. retenciós idő: 13,2 perc (CUC/ /CSV esetén 5,9).
Claims (5)
1. Eljárás (I) általános képletü vegyületek előállítására, ahol
R, mannozil-glükozil-, ramnozil-glükozilvagy glükozilcsoport,
R2 mannozilcsoport,
R3 hidrogénatom vagy mannozilcsoport és R L-risztozaminilcsoport, azzal jellemezve, hogy egy (II) általános képletü aktaplanin faktor — ahol R, R,, R2 és R3 a fenti — Actinoplanes missouriensis NRRL 15646 vagy NRRL 15647 süllyesztett, levegőztetett tenyészetével fermentálunk, célszerűen asszimilálható szén- és nitrogénforrást és ásványi sókat tartalmazó táptalajban.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletü vegyület előállítására, ahol R, mannozil-glükozilcsoport, R2 és R3 mannozicilcsoport és R L-risztozaminilcsoport, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletü vegyületből indulunk ki, ahol R, R,, R2 és R3 a fenti.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletü vegyület előállítására, ahol
-6193905
R, glükozilcsoport, R2 és R3 mannozilcsoport és R L-risztozaminilcsoport, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletü vegyületből indulunk ki, ahol R, R,, R2 és R3 a fenti.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, olyan (I) általános képletü vegyület előállítására, ahol R, ramnozil-glükozilcsoport, R2 mannozücsoport, R3 hidrogénatom és R L-risztozaminiicsoport, azzal jellemezve, hogy olyan (II) általános képletü vegyületből indulunk
5 ki, ahol R, R,, R2 és R3 a fenti.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US54433283A | 1983-10-21 | 1983-10-21 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUT39781A HUT39781A (en) | 1986-10-29 |
HU193905B true HU193905B (en) | 1987-12-28 |
Family
ID=24171749
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU843932A HU193905B (en) | 1983-10-21 | 1984-10-19 | Process for preparing glycopeptide antibiotics by means of bioconversion |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4563442A (hu) |
EP (1) | EP0142285A3 (hu) |
JP (1) | JPS60133000A (hu) |
KR (1) | KR860001281B1 (hu) |
CA (1) | CA1210722A (hu) |
DK (1) | DK501184A (hu) |
GB (1) | GB2148305B (hu) |
GR (1) | GR80691B (hu) |
HU (1) | HU193905B (hu) |
IL (1) | IL73248A0 (hu) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4939244A (en) * | 1987-01-30 | 1990-07-03 | American Cyanamid Company | Pseudoaglycones of LL-E33288 antibiotics |
JPH0725699B2 (ja) * | 1988-11-01 | 1995-03-22 | ジェィムス・バーバー・ロウ | 馬類家畜における蹄葉炎治療用薬剤 |
DE69031721T2 (de) * | 1989-07-18 | 1998-03-19 | Biosearch Italia Spa | Aus Dalbaheptide hergestellte Pentapeptid-Antibiotika |
KR100430202B1 (ko) * | 1995-07-05 | 2004-09-18 | 아벤티스 벌크 에스.피.에이. | 등전성 집속에 의한 달바 헵티드 항생제의 정제 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3952095A (en) * | 1972-06-02 | 1976-04-20 | Eli Lilly And Company | Novel antibiotic and a process for the production thereof |
US3928571A (en) * | 1972-12-15 | 1975-12-23 | Lilly Co Eli | Ruminant feed utilization improvement |
US4064233A (en) * | 1974-12-17 | 1977-12-20 | Eli Lilly And Company | Antibiotic A-4696 |
US4115552A (en) * | 1976-04-19 | 1978-09-19 | Eli Lilly And Company | Factor A and B of antibiotic A-4696 |
US4322343A (en) * | 1980-12-18 | 1982-03-30 | Eli Lilly And Company | Pseudo-aglycone of actaplanin |
US4322406A (en) * | 1980-12-18 | 1982-03-30 | Eli Lilly And Company | Antibiotic A-4696 factors B1, B2, B3, C1a, C3 and E1 |
US4461723A (en) * | 1980-12-18 | 1984-07-24 | Eli Lilly And Company | Antibiotic A-4696 factor G |
-
1984
- 1984-09-24 US US06/653,259 patent/US4563442A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-10-15 IL IL73248A patent/IL73248A0/xx unknown
- 1984-10-17 GB GB08426211A patent/GB2148305B/en not_active Expired
- 1984-10-17 CA CA000465632A patent/CA1210722A/en not_active Expired
- 1984-10-17 EP EP84307131A patent/EP0142285A3/en not_active Ceased
- 1984-10-17 GR GR80691A patent/GR80691B/el unknown
- 1984-10-19 KR KR1019840006507A patent/KR860001281B1/ko active
- 1984-10-19 HU HU843932A patent/HU193905B/hu unknown
- 1984-10-19 DK DK501184A patent/DK501184A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-10-20 JP JP59221119A patent/JPS60133000A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US4563442A (en) | 1986-01-07 |
KR850003411A (ko) | 1985-06-17 |
DK501184D0 (da) | 1984-10-19 |
KR860001281B1 (ko) | 1986-09-05 |
EP0142285A2 (en) | 1985-05-22 |
GB2148305B (en) | 1987-07-08 |
CA1210722A (en) | 1986-09-02 |
EP0142285A3 (en) | 1985-07-10 |
DK501184A (da) | 1985-04-22 |
GR80691B (en) | 1985-02-20 |
JPS60133000A (ja) | 1985-07-16 |
GB2148305A (en) | 1985-05-30 |
HUT39781A (en) | 1986-10-29 |
IL73248A0 (en) | 1985-01-31 |
GB8426211D0 (en) | 1984-11-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0055069B1 (en) | Derivatives of actaplanin | |
US4115552A (en) | Factor A and B of antibiotic A-4696 | |
CS228909B2 (en) | Method of preparing antibioticum a-4696 in complex form, or in the form of factor b1,b2,b3,c1a,c3 and e1 | |
HU194317B (en) | Process for production of a 40926 antibioticum-complex and its clean components, pa, pb,a,b and b under o factor and medical compounds containing thereof | |
US4064233A (en) | Antibiotic A-4696 | |
US5322777A (en) | Antibiotic GE 2270 | |
CA1297825C (en) | Antibiotics called "chloropolysporins b and c" a process for their preparation, and their therapeutic and veterinary use | |
KR960012063B1 (ko) | 글리콜펩티드 항생물질 pa-45052 및 그의 제조방법 | |
HU179463B (en) | Process for preparing deoxy-narasin antibiotic complex | |
JP3122248B2 (ja) | 抗生物質GE2270因子C2a | |
HU193905B (en) | Process for preparing glycopeptide antibiotics by means of bioconversion | |
US4742045A (en) | Glycopeptide antibiotics | |
US4537715A (en) | Glycopeptide antibiotic CUC/CSV and process for its production | |
AU679202B2 (en) | Antibiotics GE 37468 A, B and C | |
EP0359062B1 (en) | Antibiotic GE 2270 | |
JPH07114704B2 (ja) | 抗生物質a42867およびその付加塩 | |
US4663282A (en) | Glycopeptide antibiotic CUC/CSV and process for its production | |
EP0369503B1 (en) | Method for the control of pneumocystis carinii | |
CS248021B2 (en) | Agent for encreasing the utilization of fodder with ruminants | |
JPH01240196A (ja) | 新規グリコペプチド系抗生物質pa−45052 | |
EP0601187A1 (en) | Novel antibiotic and production and use thereof | |
CS228936B2 (cs) | Předběžné, respektive doplňkové krmivo pra vytvoření krmivá pro hospodářská zvířata, zvláště přežvýkavco | |
GB2271355A (en) | Novel antibiotic and production thereof | |
JPH03197489A (ja) | 抗生物質tan―1171およびその製造法 |