HU193504B - Process for preparing and applying recombinated plasmids containing basic phosphatase gens - Google Patents

Process for preparing and applying recombinated plasmids containing basic phosphatase gens Download PDF

Info

Publication number
HU193504B
HU193504B HU801932A HU193280A HU193504B HU 193504 B HU193504 B HU 193504B HU 801932 A HU801932 A HU 801932A HU 193280 A HU193280 A HU 193280A HU 193504 B HU193504 B HU 193504B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
plasmid
dna
coli
gene
phosphatase
Prior art date
Application number
HU801932A
Other languages
English (en)
Inventor
Gerhard Sievert
Werner Boidol
Joachim Daum
Original Assignee
Schering Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Schering Ag filed Critical Schering Ag
Publication of HU193504B publication Critical patent/HU193504B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/034—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a motif for targeting to the periplasmic space of Gram negative bacteria as a soluble protein, i.e. signal sequence should be cleaved
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/425—Serratia
    • C12R2001/43—Serratia marcescens
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/82—Subcellular parts of microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/848—Escherichia
    • Y10S435/849—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/88—Serratia
    • Y10S435/881—Serratia marcescens

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás olyan baktériumtörzsek előállítására, amelyek az azonos — vagy akár egy idegen — faj lúgos foszfatázát (a megfelelő vad típusra vonatkoztatva) igen magas kitermeléssel képezik és ezért különösen alkalmasak ennek az enzimnek fermentációs úton való termelésére.
Lúgos foszfatázok baktériumokból való előállítására már ismeretesek eljárások, a „The Enzymes. Ed. P.D. Boyer, Acad. Press 1971, Vol. IV., 373 —415.” monográfiából.
így pl. ismert egy E. coli foszfatáz gént tartalmazó plazmid; ennek esetében egy F’ faktorról van szó, amely egy fertilitási tényező és egy kromoszóma-DNS szakasz in vivő rekombinációjával keletkezett E. coli-ban (M. Bracha, E. Yagil, J. Bacteriol. 120, 970— 973, 1974). Ilyen plazmid elkülönítését mindeddig csak az E. coli foszfatáz gén esetében írták le, ezért ez nem jelent általános alkalmazható eljárást foszfatáz génekklónozására. Ily módon nem lehet pl. egészen különböző eredetű, pl. alacsonyabbrendű Eukaryotákból származó géneket klónozni. Az F’ 13 plazmid, mint sok más fertilitási tényező, sejtenként csak 1—2 példányban fordul elő, ennek következtében a foszfatáz-képződés csupán kismértékű fokozása érhető el.
A lúgos foszfatázok (EC3.1.3.1) olyan enzimek, amelyeket számos prokarióta és eukarióta szervezet előállít és amelyek a legkülönbözőbb foszforsav-monoésztereket szervetlen foszfáttá és a megfelelő alkoholokká tudják hidrolizálni (í. T.W.Reid és I.B. Wilson öszszefoglalását a következő helyen: The Enzymes, Ed. P.D.Boyer, Acad.Press 1971., Vol. IV., p. 373—415. Ezeket az enzimeket a biokémiában és a molekuláris biológiai kutatásban, valamint a klinikai diagnosztikában alkalmazzák preparatív és analitikai reagensként.
A 26 17 350 sz. NSZK-beli nyilvánosságrahozatali irat hordozón rögzített lúgos foszfatázt ismertet, amely meghatározott oligonukleotidek előállítására használható. A foszforsav-monoészterek kvantitatív meghatározása úgy végezhető, hogy mérik a lúgos foszfatázzal végzett hidrolízis során keletkezett szervetlen foszfát mennyiségét (Acta Chem. Scand. B31, 125—129, 1977). Fontos alkalmazási terület a különböző enzim-immuntesztekben könnyen kimutatható jelző enzimként való felhasználás, amelynek során a lúgos foszfatáz a meghatározás jellegétől függően akár egy antigénhez, akár egy antitesthez hozzákapcsolható. Az enzim-immuntesztek számos anyag (hormonok, vírus-fehérjék, a legkülönbözőbb sejtfal-antigének, antitestek stb.) igen kis mennyiségekben való specifikus és kvantitatív meghatározását teszik lehetővé). E. Engvall, A.J. Pesce, Quantitative Enzyme Immunoassay, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1978).
Számos ilyen alkalmazási területen kitüntetetten alkalmazzák az E. coli-ból származó lúgos foszfatázt, és ebben — egyebek kő2 zött — szerepe van annak is, hogy ennek az enzimnek, az emlősökből származó foszfatázokhoz képest, előnyösen magas a hőstabilítása (20 perc 85°C-on) (J5 2099—211 sz. japán szabadalmi leírás).
Számos baktérium, különösen az E. coli, egyes enzimeket erősen megnövekedett menynyiségben szintetizál, ha a megfelelő génből (amelyből a vad típusú baktériumokban sejtenként rendszerint csak 1 található) sejtenként több példány fordul elő (I.G. Young és társai, Gene 4, 25—36, 1978). Ez a magas gén-szám (kb. 10—20 db/sejt) azáltal érhető el, hogy a DNS in vitro rekombinációjához megfelelő megoldások segítségével a megfelelő gént hordozó DNS-fragmentumokat szelektive átvisszük baktériumokra.
Gének baktériumokra való célzott átvitelével kapcsolatban — amely átvitel DNS-klónozásnak is nevezhető — különböző eljárásokat ír le K.N. Timmis, S.N. Cohen. F.C. Caballo a következő helyen: Progress in Molecular and Subcellular Biology, F.E. Hahn ed., Vol. 6., p. 1—58, Springer Verlag 1978. Valamennyi ilyen eljárás alapja az, hogy egy, a megfelelő gént hordozó DNS-fragmentumot egy megfelelő vektor-DNS-sel kapcsolunk öszsze, ilyen formában beviszünk egy megfelelő befogadó sejtbe és ebben mint rekombinált DNS-t szaporítjuk. Vektorként plazmidok vagy baktériumfágok alkalmazhatók. A plazmidok gyűrűalakú, kétágú DNS-ből álló molekulák, amelyek sok baktériumtörzsben megtalálhatók és a baktériumokban a kromoszóma-DNS-től függetlenül (a kromoszómán kívül) szaporodni képesek. A DNS-klónozás elősegítésében lényeges szerep jut a restrikciós endonukleázoknak, amelyek a kétágú DNS-molekulát pontosan meghatározott helyeken kisebb fragmentumokká tudják felhasítani.
Az anyagcsere-enzimek génjeit hordozó DNS-fragmentumok klónozására egy gyakran alkalmazott eljárás pl. abból áll, hogy egy megfelelő donor szervezet kromoszóma-DNSét és egy plazmid-DNS-t egy megfelelő restrikciós endonukleázzal reagáltatunk, DNS-ligázzal való összekeverés után. Ennek során a DNS-fragmentumokból sok különböző lineáris és körkörös oligomer termék — többek között gyűrűalakú molekulák is — keletkezik, amelyek plazmid-molekulaként 1 molekula, a kívánt gént tartalmazó DNS-fragmentumot foglalnak magukba. A DNS-keveréket ezután, egy transzformációnak nevezett eljárás keretében átvisszük megfelelő befogadó baktériumokra és a teljes sejt-populációból kiválasztjuk azokat a sejteket, amelyek a keresett plazmid-DNS rekombinánst tartalmazzák. Ennek az eljárásnak a változatai azon alapulnak, hogy a kromoszóma-DNS felhasítását nyíróerő (ultrahang stb.) alkalmazásával érjük el és hogy a plazmiddal való összekapcsolás kopolimer egyágú DNS segítségével történik (L. Clarké és J. Carbon, Proc. Nat. Acad.Sci.) USA (72,
-2193504
4361—4365, 1975), amelyet terminális transzferáz enzimmel állítottak elő. Plazmidok helyett fág-DNS-t is sikeresen alkalmaztak már klónozásra.
A DNS-rekombináció során, különösen, ha kromoszóma-DNS fragmentumokat tartalmazó komplex keverékből indulunk ki, in vitro először nagyszámú különböző hibrid-molekula keletkezik. Meghatározott DNS-fragmentumok klónozásához'ezért egy szelekciós eljárásra van szükség, amely a transzformáció, illetve az átoltás után lehetővé teszi a keresett rekombináns DNS-t tartalmazó sejt-klónok elkülönítését. Ha a klónozásra kerülő frag-. mentum egy, a befogadó szervezetben hatóképes anyagcsere-gént hordoz, befogadóként jól transzformálható mutánsokat alkalmazunk, amelyekben a szóbanforgó' gén inaktiválódik, és amelyek a megfelelő anyagcsere-jellemzőt csak akkor mutatják ismét, amikor a gént, a rekombinált DNS-sel való transzformáció következtében, szaporodásra és ennek folytán átörökítésre képes alakban felvették.
A találmány tárgya mindenekelőtt az, hogy egy önmagában ismert mutációs eljárásnak egy jól transzformálható E. coli törzsre, az E. coli K12 HBlOl-re való alkalmazásával egy eddig ismeretlen mutánst állítunk elő, amelyben a lúgos foszfatáz strukturgénje (phoA) inaktivált alakban van jelen. Ezt a mutánst a DNS-klónozásra irányuló fent említett eljárás alkalmazásával in vitro rekombinált DNS-sel való transzformációnak teszszük ki és olyan sejt-klónok elkülönítésére használjuk fel, amelyek lúgos foszfatáz géneket hordozó rekombinált DNS-t tartalmaznak. A J. Bacteriol. 119, 583.592, 1974 helyén leírt foszfatáz-negatív E. coli mutánsok esetében ezzel szemben olyan törzsekről van szó, amelyek — az in vivő restrikcióra és rekombinációra irányuló, még fennálló képességük következtében — rosszul transzformálhatok és ezért nem alkalmasak foszfatáz gének klónozására.
Az említett mutációs eljárás során azokkal az N-nitrozo-vegyületekkel dolgozunk, amelyeket a mutációhoz általában alkalmaznak. N-nitrozo-vegyületként pl. nitrozo-karbamid és -guanidin vehető figyelembe. Különösen alkalmas vegyületnek bizonyul az 1-nitrozo-3-nitro-l -metil-guanidin.
A találmány tárgyát képezik olyan plazmid-vektorok is, amelyek lúgos foszfatázra jellemző DNS-s?ekvenciát tartalmaznak, valamint olyan DNS-szekvenciával rendelkező plazmidok, amelyek egy lúgos foszfatáz N-terminális aminosav-szekvenciáját kódolják.
A találmány szerinti, phoA géneket tartalmazó plazmidok úgy állíthatók elő, hogy vad típusú baktériumokból származó DNS-t és egy antibiotikum-rezisztens plazmidotolyan restrikciós endonukleázokkal reagáltatunk, amelyek számára a plazmid felhasítási helyekkel rendelkezik, a felhasítási helyekhez DNS ligázt kapcsolunk, majd az E. coli K12
HB101 -bői kapott E. coli SB44 phoA mutáns segítségével a fent leírt eljárás szerint lúgos foszfatáz strukturgéneket tartalmazó plazmidokat különítünk el. Ezekből a plazmidokból további, ugyancsak phoA géneket tartalmazó plazmidok állíthatók elő. Ezekből azután, restrikciós enzimek segítségével, a phoA géneket tartalmazó szub-fragmentumokaj vágunk ki és ezeket a szub-fragmentumokat antibiotikum-rezisztens vektor-plazmidokkal, DNS Iigáz jelenlétében rekombináljuk.
Vad típusú baktériumokon olyan baktériumokat értünk, amelyeket a szakember a mikrobiológiai munkában rendszerint alkalmaz. Különösen alkalmasnak bizonyulnak az E. coli KI2 és a Serratia marcescens vad típusú törzsei.
A találmány szerinti plazmidokat úgy állítjuk elő, hogy pl. az E. coli K12 vad típusú baktériumokból származó teljes DNS-t és a pBR313 plazmidot — amely ampicillin-rezisztenciát közvetít — a BamHl restrikciós endonukleázzal felhasítjuk és DNS ligázzal •ekombináljuk. A fent említett foszfatáz-negatív mutánst (E. coli SB44) a ligázzal kezelt DNS-keverékkel transzformációs körülmények között inkubáljuk; ennek során a sejTek egy kis hányada (kb. 1/104) plazmid-DNSt vesz fel. Ampicillin-tartalmú közegben való szaporítás révén, amelyben az ampicillinérzékeny mutánsok nem képesek növekedni, szaporítjuk a transzformált sejteket. A feldúsúlt sejt-populációt nagyon alacsony foszfát-tartalmú agar lemezekre szélesztjük és 37°C-on inkubáljuk — ezzel maximális mértékben indukáljuk a foszfatáz-képződést —, majd az így kapott különálló telepekre p-nitrofenilfoszfát oldatot rétegezünk. A foszfatáz-pozitív telepek ezt az anyagot sárga p-nitrofenollá hidrolizáiják (K. Kreuzer et al., Genetics 81., 459—468., 1975). Átlagosan kb. 10000 színtelen telep között találunk egy sárga telepet. Ezekből a pho+ telepekből G.O. Humphreys et al. módszerével (Biochem. Biophys. Acta 383., 457—463., 1975) plazmid-DNS-t különítünk el. Az igy kapott és pSB47-tel jelölt plazmid elemzése — BamHl-vel végzett hasítással és a bomlástermékek géielektroforézisével — arra mutatott, hogy ez a kiindulási pBR313 plazmidból és egy további (kb. 11 milliárd mólsúlyú) DNS-fragmentumból áll. Annak bizonyítására, hogy a pSB47 egy foszfatáz gént tartalmaz, ismételten elvégeztük az E. coli SB44 foszfatáz mutánsnak a plazmiddal való transzformációját. Ennek során kimutatható volt, hogy valamennyi ampicillin-rezisztens telep egyben foszfatáz-pozitív. Mivel a pBR313 plazmid nem tartalmaz lúgos foszfatáz gént, ez a gén a 11 milliárd molekulasúlyú járulékos DNS fragmentumon kell, hogy megtalálható legyen.
A pSB51 plazmid előállítását a pSB47 plazmidéhoz teljesen hasonló módon végeztük azzal a különbséggel, hogy az E. coli DNS helyett Serratia marcescens-ből származó kromoszóma-DNS-t alkalmaztunk, vektorként
-3193504 pWB-2-t vettünk és mind a kromoszóma-DNS-t, mind a vektort a Hindii! restrikciós endonukleázzal hasítottuk. A plazmid (pSB51) a pWB2 vektoron kívül egy 2,5 milliárd molekulasúlyú DNS fragmentumot tartalmaz, amelyben a fentiekhez hasonlóan egy foszfatáz gént mutattunk ki. Ezenkívül az E. coli-ból és a S. marcescens-ből származó autentikus foszfatázokkal korong-elektroforézissel végzett összehasonlítás azzal az eredménnyel járt, hogy a pSB51 plazmidot hordozó E. coli sejtek a S. marcescens foszfatázzal azonos enzimet termelnek. Ez arra mutat, hogy a 2,5 milliárd molekulasúlyú DNS fragmentum, a pSB51 plazmidban a Serratia-DNS-ből származik és egy Serratia foszfatáz gént hordoz.
Sok esetben lehetőség nyílik a plazmid további módosítására is anélkül, hogy az elveszítené lényeges tuljdonságait. így pl. a pSB47 plazmidban a 11 milliárd molekulasúlyú fragmentum a HindlII restrikciós endonukleázzal végzett hasítással több rész-fragmentumra bontható fel, amelyek közül a második legnagyobb (3,1 milliárd molekulasúlyú) fragmentum hordozza a foszfatáz gént. Ezt ligáz-kapcsolással és ezt követő transzformációval és szelekcióval — a fentiek szerint — egy, a pBR322 plazmidból (F. Bolivár et al., Gene 2., 95—113., 1977) levezetett (pSB18) vektorhoz kapcsoljuk, amelyben hiányzik a pBR322 plazmidban rendelkezésre álló EcoRI hasítási hely. Ebből — HindlII-mal és BamHI-vel végzett kezeléssel — eltávolítunk egy 0,18 milliárd molekulasúlyú, a szaporolás és a szelekció szempontjából szükségtelen rész-fragmentumot és ezt a pSB47 plazmidból származó, a foszfatáz gént tartalmazó szub-fragmentummal helyettesítjük. Ily módon a pSB53 foszfatáz plazmidot kapjuk.
A pSB47 plazmidhoz hasonló módon állítható elő egy további plazmid, a pSB50 jelű. A különbség mindössze az, hogy kiindulási vektorként a pWB2 vektort alkalmazzuk, amelyet az E. coli-ból származó kromoszóma-DNS-sel együtt a HindlII restrikciós endo6 nukleázzal reagáltatunk. Az így kapott pSB50 plazmidot tartalmazó baktérium törzsek ugyanúgy, mint a pSB47 plazmidot tartalmazók, lúgos foszfatázt termelnek.
A találmány tárgya egyben eljárás új baktérium törzsek előállítására, amely abban áll, hogy a szóbanforgó baktérium törzs kompetens sejtjeit a íoszfatáz-plazmidokkal transzformációs körülmények között önmagában ismert módon inkubáljuk és a kapott sejt-populációból elkülönítjük az antibiotikum-rezisztens sejteket. Az így kapott baktérium törzsekkel, amelyek plazmidjaikban lúgos foszfatáz géneket tartalmaznak, nagyobb mennyi15 ségű lúgos foszfatáz állítható elő, mint korábban. A törzseket ezután minimális foszfatáz-tartalmú táptalajban tenyésztjük és a képződött foszfatázt önmagában ismert módon elkülönítjük. Ily módon állítunk elő lúgos foszfa20 tázt pl. S. marcescens-ből és E. coli-ból. A S. marcescens lúgos foszfatázát pl. E. coli SB44 segítségével állíthatjuk elő.
A következő táblázatban a lúgos foszfatáz koncentrációkat — egység/ml tenyészfo25 lyadék értékekben kifejezve —, amelyeket különböző, foszfatáz plazmidokat tartalmazó törzsek, valamint a megfelelő (kromoszóma foszfatáz gént tartalmazó vagy nem tartalmazó) kontroll törzsek esetében olyan körül30 menyek között kaptunk, amelyek a lúgos foszfatáz képződését lehetőleg erősen stimulálják (a közeg alacsony foszfát-tartalma következtében lép fel az indukció). Minden esetben bebizonyosodott, hogy egy foszfatáz plazmid jelenléte a foszfatáz koncentráció jelentős emelkedését eredményezte; maximálisan a csak 1 kromoszóma foszfatáz gént tartalmazó törzsekkel kapott értékek 11-szerese volt elérhető. Ez vonatkozik a S. marcescens-re is, mint olyan gazdasejtre, amely E. coli plazmidokat képes felvenni.
A J. Bacteriol. 120., 970—973., 1974 helyéről ismert, E. coli foszfatáz gént tartalmazó plazmid sejtenként csak 1—2 példányig bán, a találmány szerinti plazmidok ezzel szemben maximálisan sejtenként 20 példányban fordulnak elő.
Táblázat phoA plazmidokat tartalmazó baktériumok foszfatáz termelése*
Gazdasejt ] plazmid a plazmidban jelenlevő phoA gén ere- det·* foszfatáz aktivitás
E. coli SB44
/phoA mutáns/ - - 0
pSB47 E. coli n,o
pSB50 12,5
PSB53 20,0
pSB51 S. marcescens 19,5
pSB60 E. coli 20,1
E. coli 1ÍB101 pWB2 phoA gén nélküli vektor 5,0++
pSB47 E. coli 18,0
pSB50 13,0
E. coli K12
/vad típus/ - - 2,5
pSB47 E. coli 11,0
pSB50 X 13,6
PSB51 S. marcescens 19,5
S. marcescens
/vad típus/ - - 4,1
pSB51 S. marcescens 44,0
PSB53 E. coli 19,6
-4193504
-|- A 0,2% kazaminosavval dúsított LP táptalajt (K. Kreuzer et al., Genetics 81., 459—
468., 1975) 5%-nyi mennyiségben beoltjuk a plazmidot tartalmazó megfelelő törzs tenyészetével és 23 órán át 37°C-on rázatjuk a tenyészetet (E5oo=7,0). Ezután 1 ml fermentlevet 20 percen át 37°C-on 0,01 ml toluollal rázatunk. A toluollal kezelt sejtszuszpenzióban Kreuzer et al. szerint meghatározzuk a lúgos foszfatázt. A foszfatáz-aktivítást egység/ml fermentlé értékben adjuk meg. 1 egység az az enzim-mennyiség, amely a kísérleti körülmények között percenként E4I0=l,0 extinkció-növekedést idéz elő.
-)- + Az E. coli HB101 más vektorok nélkül, vagy azokkal együtt ugyanezt a foszfatáz-aktivítást mutatja.
A találmány szerinti eljárással előállítható rekombinált plazmidok új, szerkezetüket illetően egyértelműen meghatározható vegyi anyagok.
A találmány szerinti plazmidok ezenkívül különösen előnyösen alkalmazhatók plazmid-vektorként eukarióta fehérjék kifejlesztésére E. coli-ban és más baktériumokban annak következtében, hogy fúziós fehérjéket képeznek lúgos foszfatázok N-terminális rész-szekvenciáival. Az alábbiakban még részletesebben rámutatunk arra, hogy milyen előnyöket nyújtanak más plazmid-vektorokkal szemben.
A DNS in vitro, plazmid- vagy fág-vektorok alkalmazásával végzett rekombinációjára irányuló eljárás, és az ennek során keletkezett hibrid molekulák transzformáció vagy kereszt-fertőzés révén megfelelő gazdasejtekre való átvitele lehetővé teszi, hogy magasabb eukarióta sejtekből származó DNS-t is átvigyünk, szaporodásra képes alakban, baktériumokra (K.N. Timmis, Progress in Molecular and Subcellular Biology, F.E.Hanh ed., Vol.6., 1.1.—58., Springer Verlag, 1978). Az így transzformált baktériumsejtek azonban általában nem képesek az átvitt eukarióta DNS-ben található géneknek megfelelő fehérjék előállítására.
Magasabbrendű eukarióta sejtekből származó gének baktériumokban való kifejlesztése csak különleges plazmid-vektorok alkalmazásával válik lehetségessé, amelyek olyan szerkezetűek, hogy az eukarióta gén beépülhet a plazmidban jelenlevő bakteriális génbe, amely önmagában képes eredményezni egy megfelelő, jól jellemezhető bakteriális fehérje szintézisét. Ha az eukarióta DNS a megfelelő orientációval és a megfelelő triplett-rácsba épül be, az egy ilyen hibrid molekulával való transzformáció segítségével előállított baktériumsejtek olyan fúziós fehérjét termelnek, amely az amíno-terminálís részen a bakteriális aminosav-szekvencia egy részével kezdődik, és a karboxil terminális irányában a beépült eukarióta DNS-nek megfelelő aminosav-szekvenciával folytatódik. A fúziós fehérjéből megfelelő enzimológiai vagy proteinkémiai módszerekkel — pl. a kapcsoló8 dási helyen jelenlevő metionin brómcianiddal végzett elbontásával — az eukarióta fehérje nyerhető ki.
Egy ilyen polipeptid-szintézisre az első példát a (14 aminosavból álló) szomatosztatiri peptid-hormon mikrobiológiai úton végzett előállítása szolgáltatta, amelyet egy bakteriális enzimmel, a beta-galaktozidázzal alkotott fúziós fehérje alakjában kaptak meg (K- Itakura et al., Science 198., 1056—1063., 1977). Rövidesen hasonló módon sikerült az emberi inzulin A és B láncának mikrobiológiai szintézise, amelynek során — a szomatosztatin esetéhez hasonlóan — teljesen szintetikus DNS szekvenciákat vittek rá egy beta-galaktozidáz génre (28 48 051, 28 48 052, 28 48053 sz. NSZK-beli nyilvánosságrahozatali irat). Egy további példa olyan baktériumtörzsek előállítása, amelyek patkány-inzulint (a bakteriális beta-laktamáz enzimmel képezett fúziós fehérje alakjában) (L. Villa-Komaroff et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75., 3727—
3731., 1978) és egy beta-galaktozidáz szekvenciával rendelkező ovalbumin szerű fehérjét (O. Mercereau-Puijalon et al., Natúré 275., 505—510., 1978) termelnek. Ennek a mikrobiológiai polipeptid szintézis módszernek alkalmazhatónak kell lennie más eukarióta peptidek és fehérjék előállítására is, amelyek más módon részben csak nagyon nehezen férhetők hozzá (amilyen pl. az emberi növekedési hormon, az interferon, az aktív immunizáláshoz szükséges vírusfehérjék, specifikus antitestek stb.)
A rekombinált DNS alkalmazásával végzett mikrobiológiai polipeptid-szintézisek sikere igen jelentős mértékben függ az alkalmazott vektorok tulajdonságaitól. Az előbbi példákban olyan plazmid vektorokat alkalmaz'ak, amelyeknél az idegen DNS beta-galaktozidáz vagy beta-laktamáz génekbe épült be. Ez a két bakteriális fehérje mint fúziós partner azonban hátrányos is lehet az idegen DNS kifejlesztése szempontjából. A beta-galaktozidázokkal fúziós fehérjék — az eredeti enzimhez magához hasonlóan — megfelelő összetételű táptalajban (beta-galaktozidáz indukció) aránylag nagy mennyiségben (105 molekula/sejt) állíthatók elő, a fehérjéket azonban a sejtek pl. nem választják ki a közegbe és ezért ezek csak a sejt feltárása után különíthetők el. A beta-laktamáz és az ezzel képzett fúziós fehérjék a szintézis során a sejtmembránon keresztül a periplazmatikus térbe továbbítódnak, ami egyszerű elkülönítést tesz lehetővé (nincs ugyanis szükség sejt-feltárásra), a kitermelés azonban itt ismét alacsony (kb. 100 molekula/sejt).
A találmány tárgyát képezi olyan plazmid-vektorok előállítása is, amelyek lehetővé teszik az idegen DNS-nek a lúgos foszfatáz génbe való beépülését. Az ilyen plazmid-vektorokkal képezett hibrid-plazmidok vagy -fágok segítségével transzformált sejtek ezután olyan fúziós fehérjéket állítanak elő, amelyek aminosav-szekvenciáját egyrészt az alkálikus 5
-5193504 foszfatáz gén nukleotid-szekveneiája, másrészt a beépült idegen DNS nukleotid-szekvenciája határozza meg. Ezért ezeknek a vektoroknak az alkalmazása továbbfejlesztést jelent a fent idézett eljárásokhoz képest az eukarióta peptidek és fehérjék mikrobiológiai szintézise területén.
A lúgos foszfatázok mint fúziós partnerek az eukarióta gének kifejlesztése során egyesítik magukban a beta-galaktozidázok és a beta-laktamázok előnyeit. Mint a beta-galaktozidázok, megfelelő táptalaj-összetétellel (alacsony foszfát-koncentráció) nagymértékben indukálhatok és a beta-laktamázokhoz hasonlóan a sejtmembránon keresztül kikerülnek a periplazmatikus térbe (1. T.W. Reid és I.B. Wilson összefoglalóját: The Enzymes, Ed. P.D. Boyer, Acad. Press, 1971., Vol. IV., p. 373—415.).
Annak érdekében, hogy a foszfatáz-vektorok a fent leírt módon alkalmazhatók legyenek fúziós fehérjék előállítására, ezeket úgy kell felépíteni, hogy a restrikciós szekvencia, amelybe a kifejlesztendő idegen DNS-t be kell juttatni, a foszfatáz génen kívül a vektor fennmaradó részében lehetőleg ne forduljon elő mégegyszer, A 4. és a), példában leírt pSB53 és pSB87 plazmid teljesíti ezeket a feltételeket.
Már kimutatták, hogy az E. coli lúgos foszfatáz génje a pSB47 plazmidban egy 4600Bp molekulasúlyú DNS-fragmentumon fordul elő (Bp=bázispár), amely a BamHI és a HindlII restrikciós endonukleázokkal végzett egyidejű hasítás során szabadítható fel. Ezt a fragmentumot DNS ligázzal végzett reakcióban a pSB18 plazmidhoz kapcsoltuk, amely a pBR322-ből az EcoRI szekvencia eltávolításával volt előállítható és amely rezisztenciát vált ki ampicillinnel és tetraciklinnel szemben. A pSB18-at a ligázzal való reagáltatás előtt ugyancsak Hindfíf-mal és BamHÍ-vel kezeltük: ennek során egy kis rész-fragmentum távolítható el, amely részben felelős a teíraciklin-rezisztenciáért. A foszfatáz-negatív SB44 mutánsnak a DNS keverékkel végzett transzformálása után ampicillin-rezisztens, tetraciklinre érzékeny és foszfatáz-pozitív sejteket különítettünk el. Ezekből volt izolálható a pSB53 plazmid. Az ebben található phoA fragmentum közvetlenül is előállítható E. coli K12-ből származó kromoszóma-DNSből, HindlII-mal és BamHI-vel végzett hasítással. A pSB53 és a többi vektor előállításának fontos előfeltétele a foszfatáz-negatív E..coli SB44 mutáns alkalmazása.
A pSB53 restrikciós térképét — a HindlII, BamHI, EcoRI, PstI, Xhol és Sáli enzim vonatkozásában — az 1. ábrán mutatjuk be. Kimutatható volt, hogy ha a pSB53-ban a 330Bp molekulasúlyú EcoRI fragmentumot egy másik EcoRI fragmentumra cseréljük ki, a lúgos foszfatáz gén inaktiválódik. Ennek a génnek tehát az EcoRI restrikciós szekvencia tartományában kell elhelyezkednie. A pSB53 részleges elbontásával két fragmentumot kaptunk — ezek molekulasúlya 2157Bp és 6
2360Bp —, amelyek közül az egyik (2157Bp) az 1. ábrán bemutatott 787, 1040 és 330Bp molekulasúlyú szekvenciákat foglalja magában, míg a másik (2360Bp) a 330, 1210 és 820Bp molekulasúlyú szekvenciákból áll. Ezt a két fragmentumot pBR322 segítségével E. coli SB44-ben klónoztuk; ennek eredményeként az la illetve lb ábrán bemutatott pSB86 és pSB87 plazmidot kaptuk. Egyik plazmid sem rendelkezik ép lúgos foszfatáz génnel, amiből az következik, hogy mindkét, a pSB53-ban jelenlevő EcoRI restrukciós szekvencia ebben a génben helyezkedik el. A pSB53-ban előforduló PstI szekvenciák a phoA génen kívül vannak jelen.
Kimutatták, hogy a foszfatáz-képződésnek a közeg foszfát-koncentrációja által való befolyásolása pozitív, ellenőrzött folyamat, és hogy a phoA gén transzkripciójához egy aktivátorra van szükség, amely ennek a génnek egy promotor szakaszához kötődik. Az aktivátor egyik lényeges alkotóeleme a phoB gén terméke (H. Morris et al., J. Bacteriol. 119., 583—592., 1974; C. Pratt és A. Torriani, Genetics 85., 203—208., 1977).
A pSB86 és a pSB87 plazmid közül — amelyek nem rendelkeznek teljes foszfatáz génnel — az egyik kell, hogy tartalmazza az aktivátor kötési szekvenciáját, és egyben azt a gén-tartományt, amely a lúgos foszfatáz N-terminális végének felel meg. Egy sértetlen kromoszóma phoA génnel rendelkező törzsben ennek a plazmidnak csökkentenie kellene a foszfatáz-képzést, mivel konkurrál a kromoszóma-génnel az aktivátor megkötésében és az aktivátort részben megköti.
Most.azt találtuk, hogy a pSB87-tel transzformáit E. coli HB101 törzs ugyanolyan menynyiségű foszfatázt képez, mint a plazmidot nem tartalmazó E. coli HB101 (5,6 egység/ml fermenflé, az előzőekben leírt körülmények között meghatározva), míg a pSB86-tal kezelt E. coli HB101 ennek a mennyiségnek csak kb. 25—30%-át (1,5 egység/ml) termeli. Ennek alapján az a következtetés vonható le, hogy az aktivátor kötési szekvenciája és egyben a phoA gén transzkripciójának kezdete a pSB86 plazmidban található. A pSB53 plazmidban jelenlevő phoA gén transzkripciójának iránya ennélfogva a HindiiI-tól a BamHI szekvencia felé mutat (ez az 1. ábrán az óramutató irányának felel meg); a gén vége (amely a foszfatáz amino-terminálisának felel meg) a 330Bp molekulasúlyú EcoRI fragmentumtól balra, az EcoRI és a HindlII szekvencia között kezdődik és a két EcoRI szekvencián keresztül átnyúlik az I210Bp molekulasúlyú XhoI/EcoRI fragmentumba. A pSB53-ban jelenlevő 330Bp molekulasúlyú EcoRI fragmentum kicserélése egy másik DNS-fragmentumra ezért lehetővé teszi — megfelelő orientáció és helyes triplett-rács mellett — olyan fúziós fehérjék előállítását, amelyek az amino-terminálistól az E. coli-ból származó lúgos foszfatáz rész-szekvenciájával kezdődnek.
-6193504
Egy másik vektor, amely ugyanolyan fúziós fehérjék előállítását teszi lehetővé, mint a pSB53 plazmid, a pSB86 plazmid (1/a ábra), amely még a phoA gén amino-terminális részét is tartalmazza. Ugyanilyen célból alkalmazhatók azok a plazmidok is, amelyek a pSB53 plazmidnak már csak az (1040Bp molekulasúlyú) EcoRI/HindlII fragmentumát tartalmazzák. A pSB53 vagy a pSB47 plazmidból további Pst-fragmentumokat állíthatnánk elő — amelyek a teljes phoA gént tartalmazzák — és használhatnánk fel új vektorok összeállítására, hogy a számos kombinációs lehetőség közül csak egyet említsünk. További restrikciós endonukleázok vizsgálata révén valószínűleg további kapcsolódási helyeket találhatnánk a lúgos foszfatáz gén rész-szekvenciájával rendelkező fúziós gének előállítására.
Hibrid gének és fúziós fehérjék előállítására szolgáló vektorok (expressziós vektorok) összeállítására további lehetőségeket nyújt a restrikciós szekvenciáknak a lúgos foszfatáz génbe való utólagos bevitele. Már leírtak különböző eljárásokat, amelyek ezt lehetővé teszik. így pl. EcoRI szekvenciák képződését váltották ki egy fág-vektorban metilezés után végzett in vitro mutációval (B. Gronenborn, I. Messing, Natúré 272., 375—377., 1978).
Sokkal szélesebb körben alkalmazható egy másik eljárás (F. Heffron, M. So, . B.I. McCarthy, Proc.Natl.Acad.Sei.USA 75., p. 6012—6016., 1978), amelynek során egy, a kívánt restrikciós szekvenciát tartalmazó szintetikus oligonukleotidot bevezetünk egy, a plazmid vektoron található génbe. Ezután a vektor-DNS-t egy megfelelő endonukleázzal, amely a gyűrűalakú kétágú DNS-t sok különböző helyen tudja hasítani, a nem teljes hasításnak megfelelő körülmények között reagáltatjuk, úgy, hogy zömmel teljes hosszúságú lineáris molekulák keletkezzenek. Ezeket egy megfelelő eljárással, pl. preparatív gélelektroforézissel elválasztjuk a többi reakcióterméktől és az esetleg jelenlevő egyágú láncokat DNS-polimeráz segítségével átalakítjuk teljes kétágú molekulákká. A DNS végeire T4 ligázzal felvisszük a szintetikus restrikciós szekvenciát. Komplementer egyágú láncok előállítására a megfelelő restrikciós endonukleázzal végzett hasítás után a gyűrű zárására ismét DNS ligázzal reagáltatunk. Ennek során olyan gyűrűs molekulák keletkeznek, amelyek a szintetikus restrikciós szekvenciát mindazokon a helyeken tartalmazhatják, amelyeken az endonukleázzal korábban hasítást végeztünk. Megfelelő gazdasejt — ebben az esetben az E. coli SB44 phoA mutánsa — transzformációja, és az olyan transzformánsok szelekciója után, amelyek nem váltak pozitívvá a szóbanforgó gén vonatkozásában) azaz a jelen esetben pho~ jellegűek maradtak) olyan sejtklónokat kapunk, amelyekből olyan plazmidok különíthetők el.
amelyek a szintetikus restrikciós szekvenciát különböző meghatározott helyeken beépítették a plazmid génbe (itt. a phoA génbe).
Heffron és társai a részleges hasításhoz hasnyálmirigy-dezoxiribonukleázt alkalmaztak. Ugyanígy alkalmazhatunk restrikciós endonukleázokat is, amelyek igen gyakran és ezért nagy valószínűséggel az átalakítandó génben végeznek hasítást. Mindenekelőtt ilyenek azok a restrikciós endonukleázok, amelyek 4 bázispár-szekvenciát ismernek fel. Ezek gyakran azzal a további előnnyel rendelkeznek a hasnyálmirigy-DNÁzzal szemben, hogy közvetlenül teljes kétágú molekulákat szolgáltatnak. Az ismert restrikciós endonukleázokra vonatkozóan egy új összefoglaló munka áll rendelkezésre (R.I. Roberts, Methods in Enzymology, Vol. 68., p. 27.; Colowick és Káplán Ed., Academic Press, New York, 1979.).
1979. július 16-án a következő plazmidokat és plazmid-tartalmú baktériumtörzseket helyeztünk letétbe az American Type Culture Collection-ben (ATCC, Rockville, Md., USA), az itt megadott letétbehelyezési számok alatt:
pWB2 plazmid (ATCC 40013) pBR313 ” (ATCC 40014) pBR322 ” (ATCC 40015) pSB18 ” (ATCC 40016) pSB47 (ATCC 40017) pSB50 (ATCC 40018) pSB51 ” (ATCC 40019) pSB53 (ATCC 40020) pSB87 ” (ATCC 40021) és
E. coli SB44 pSB47 plazmiddal (ATCC 31540) ” ” pSB51 (ATCC 31541) ” pSB53 (ATCC 31542)
S. marcescens vad típus, pSB51 plazmiddal (ATCC 31543).
Ezenkívül 1979. július 16-án a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen-nél (DSM, Göttingen, NSZK) a következő mikroorganizmusokat helyeztük letétbe, az itt megadott letétbehelyezési számok alatt:
E. coli SB44 (DSM 1606)
E. coli HB101 (DSM 1607)
S. marcescens vad típus (DSM 1608).
Az E. coli KI2 vadtípus letétbehelyezése már 1973. november 26-án megtörtént (DSM 408).
1. példa
Az E. coli SB44 phoA mutáns elkülönítése ml L táptalajt, amely 10 g/1 triptont (Difco), 5 g/1 élesztőkivonatot és 5 g/1 NaCl-t tartalmaz (E.S. Lennox, Virology 1., 190—
206., 1955), beoltunk 0,25 ml tenyészettel, amelyet úgy állítottunk elő, hogy E. coli K12 HBlOl-t L táptalajban egy éjszakán át tenyésztettünk (H.W. Boyer, D. Roulland-Dussoix, J. Mól. Bioi. 41., 459—472., 1969), és a tenyészetet 37°C-on szabályozható hőmérsékletű rázógépen rázatjuk. Az exponenciális növekedési fázis elérésekor (E500 kb. 1,5) a tenyészetből 5 ml-es mintákat veszünk és mindegyikhez hozzáadunk 0,1 ml megfelelő h'gítású oldatot — amelyet frissen készített, 7
-7193504 g/l töménységű l-nitrozo-3-nitro-l-metil-guanidin (NMG) oldatból kaptunk — olymódon, hogy 0 (kontroll), 10, 25, 50 és 100 pg/ml koncentrációt alakítsunk ki. A mintákat 10 percen át 37°C-on inkubáljuk, ezt követően azonnal centrifugáljuk -(-40C-on, az alsó fázist kétszer mossuk 5—5 ml hideg steril NaCl oldattal (9 g/l) és 5—5 ml NaCl oldatban újra szuszpendáljuk. A hígítási sor agar-lemezekre (1,5% agart tartalmazó L táptalaj) való szélesztésével meghatározzuk az élő sejtek számát. A NMG-t nem tartalmazó kontroll minta értékével való összehasonlítás arra mutat, hogy a 10 pg/ml NMG-t tartalmazó mutációs elegy a mutánsok szelektálása szempontjából különösen kedvező 0,5%-os túlélési arányt biztosítja.
Ennek az elegynek egy hígításából, amely kb. 1000/rnl sejtet tartalmaz, 0,1 ml-es mintákat viszünk át 0,15% agart tartalmazó olyan LP táptalajból (K. Kreuzer et al., Genetics
81., 459—468., 1975) álló agar lemezekre, amelyhez 20 mg/1 L-prolint és 20 mg/ml L-leucint adagoltunk. Ebben a táptalajban a lúgos foszfatáz szintézise az alacsony foszfát-tartalom következtében már nem gátolt.
órán át 37°C-on való tenyésztés után azokra a lemezekre, amelyeken egyedülálló telepek találhatók, 1M trisz-HCl pufferben 5 mg/ml p-nitrofenil-foszfátot tartalmazó (pH 8,0) oldatot rétegezünk. Azokat az egyes telepeket, amelyek néhány percen belül nem mutatnak sárga elszíneződést, átoltjuk és a táblázatban leírt módon tovább vizsgáljuk, a lúgos foszfatáz képzés kvantitatív meghatározásával.
foszfatáz-negatív mutánst találunk, amelyeket E. coli SB43-nak és SB44-nek nevezünk. Mint a 3. példában kimutatjuk, a pSB51 plazmid az E. coli SB44 mutánsban a S. marcescens lúgos foszfatázának képződését idézi elő. Ennélfogva a pSB51 plazmidnak egyrészt egy S. marcescens phoA gént kell tartalmaznia, és az E. coli SB44 mutánsnak phoA mutánsnak kell lennie. Mivel az SB43 mutáns a pSB51-gyel való transzformáció után nem lesz foszfatáz-pozítív, ennek phoB mutánsnak kell lennie. Ezt a rendszerezést megerősíti a hiteles phoA és phoB mutánsoknak a következő példákban leírt plazmidokkal végzett transzformációja.
2. példa
a.) A pSB47 plazmid előállítása
Vektorként a pBR313 plazmidot alkalmazzuk, amely rezisztenciát vált ki ampicillinnel és tetraciklinnel szemben (F. Bolivár et al., Gene 2., 75—93., 1977). A pBR313 plazmidot az ott leirt módszer szerint izoláljuk (ATCC 40014). A nagymolekulájú kromoszóma-DNS-t az E. coli K12 vad típusú baktériumokból Saito et al. fenol-extrakciós eljárása szerint (Biochem. Biophys. Acta 72., 619—629., 1963), de az RNÁzzal való lebontás mellőzésével különítjük el. Mindkét DNS-t DNS-pufferrel szemben (46 mM trisz-HCl, 8
0,1 mM EDTA, pH 7,9) dializáljuk és ilyen formában használjuk fel a továbbiakban. A BamHl-t és a T4 ligázt (1000 egység/ml) a Biolabs cégtől (Beverly, Maryland, USA) szereztük be. A plazmidot és a kromoszóma-DNS-t a BamHI restrikciós endonukleázzal Biolabs, 4000 egység/ml) reagáltatjuk. A BamHl-t tartalmazó reakcióelegy a következő összetételű:
μΙ pBR313 (250 pg/rnl DNS) μΐ kromoszóma-DNS E. coli KI2-ből (180 μβ/ιηΙ) μΙ BamHI reakció-puffer (20 mM trisz-HC1, 60 mM KC1, 20 mM MgCl2, 20 mM ditioeritrit, pH 7,5) μΙ BamHI (1:40 hígítás).
Az elegyet 60 percen át 37°C-on inkubáljuk és az enzim-reakció leállítására 10 percen át 65°C-on tartjuk. A kvantitatív átalakításhoz szükséges enzim-hígítást előkísérletben határoztuk meg, amelynek során a gyűrűalakú plazmid lineárissá való átalakulásának mértékét 0,7% agarózban végzett gélelektroforézissel mértük (J.F. Morrow et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71., 1743—1747., 1974).
Az előbbi reakcióelegyhez (180 μΙ) 40 μΙ T4 ligáz-puffert:
660 mM trisz-HCl, mM MgCI2,
100 mM ditioeritrit, pH 7,6, valamint μΙ ATP-t (4 mM), 2 μΐ T4 ligázt és 138 μΙ H2O-t adagolunk (az össztérfogat 400 μΐ). A keveréket 16 órán át 13°C-on inkubáljuk, kétszer extraháljuk 400—400 μΐ fenollal — amelyet előzetesen TES pufferrel (50 mM trisz-HC1, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8,0) telítettünk — és DNS pufferrel szemben fenol-mentesre dializáljuk.
b.) pho+ sejtek transzformációja és szelekciója
A ligázzal végzett átalakítással az E. coli SB44 phoA mutánsa kompetens sejtjeit transzformáljuk (1. az 1. példát).
Kompetens sejtek előállítására Lederberg et al. (J. Bacteriol. 119., 1072—1074., 1974) módosított eljárását alkalmazzuk. A sejteket az 1. példa szerint 100 ml L táptalajban Ε5οο=θ>8 optikai sűrűségig tenyésztjük, centrifugáljuk és 100 ml MgCl2 oldatban (100 mM) szuszpendáljuk. A szuszpenziót 20 percen át 0°C-on tartjuk, majd centrifugáljuk, a sejteket 50 ml 30 mM töménységű CaCl2 oldatban felvesszük és további 20 percen át 0°C-on való tartás után centrifugáljuk, 5 ml 30 mM töménységű CaCl2 oldatban szuszpendáljuk és további feldolgozásig jégen tartjuk.
A transzformációhoz (W. Goebel, R. Bonewald, J. Bacteriol. 123., 658—665., 1975) 200 μΐ jéghideg ligáz-reakcióterméket és 400μ1 kompetens sejt szuszpenziót összekeverünk, az elegyet 50 másodpercjen át 38°C hőmérsékletű vízfürdőben tartjuk es 60 percen át 0°C-on hagyjuk állni. 8 ml L táptalaj hoz-8193504 záadása után a sejteket 2 órán át 37°C-on inkubáljuk, majd 100 ml, 50 pg/ml ampicillint tartalmazó L táptalajba visszük át és további 16 órán át 37°C-on inkubáljuk. Ennek az ampicillines dúsításnak a reakcióelegyéből ugyanazzal a módszerrel különítünk el egyes foszfatáz-pozitív telepeket, mint amelyet az 1. példában a foszfatáz-negatív mutánsok izolálására alkalmaztunk. Kb. 10000 színtelen telep között mindig volt egy sárga.
c.) A pSB47 plazmid elkülönítése és jellemzése
A sárga telepek közül ismert eljárások szerint (G. O. Humphreys et al., Biochem. Biophys.Acta 383., 457—463., 1975) elkülönítünk egy 16,8 milliárd molekulasúlyú plazmidot, amelyet a pSB47 jelzéssel látunk el és amely BamHI-vel végzett hasítás után agaróz gélben 2 DNS sávot mutat, ezek: egy 5,8 milliárd molekulasúlyú termék (lineáris pBR313) és egy 11 milliárd molekulasúlyú termék (kromoszóma-pho fragmentum). Az 1. példában felsorolt mutánsok transzformációjával kimutattuk, hogy a pSB47 plazmid egy phoA gént tartalmaz.
3. példa
A pSB51 plazmid előállítása
Az irodalomban ismertetett eljárások szerint (G.O. Humphreys et al., Biochem. Biophys. Acta 383., 457—463., 1975) izoláljuk a pWB2 vektor-plazmidot, amely egy, a Hindlll restrikciós endonukleáz által megtámadható hasítási hellyel rendelkezik és az ampicillinnel és a kolicin El-gyei szembeni rezisztenciát közvetíti (W. Biodol et al., Molec.Gén.Génét.
152., 231—237., 1977). Az eljárás annyiban különbözik a 2. példában leírttól, hogy az E. coli DNS helyett 45 μΐ (135 pg/ml) S. marcescens vad típusból származó kromoszóma-DNS-t alkalmazunk és a pWB2 vektort, valamint a S. marcescens DNS-t a Hindlll restrikciós endonukleáZzal hasítjuk. Egy reakcióelegyet, amely μΐ pWB2-t (360 gg/ml DNS) μΐ kromoszóma-DNS-t (135 μg/ml) μΐ Hindlll reakciópuffert (20 mM trisz-HC1, 20 mM merkapto-etanol, 20 mM
MgCl2, 180 mM NaCl, pH 7,4) és 60 μΐ hígított Hindlll oldatot tartalmaz, a
2. példa szerint 60 percen át 37°C-on inkubáljuk és az enzim-reakció leállítására 10 percen át 65°C-on tartjuk. A további reakciókat a 2. példa szerint végezzük. A 2. példa szerint elkülönített foszfatáz-pozitív telepekből izolálható egy 9,6 milliárd molekulasúlyú, pSB51 jelzésű plazmid, amelyben HindlII-mal való reagáltatás után gélelektroforézissel 2 DNS sáv mutatható ki, mégpedig egy 7,1 milliárd molekulasúlyú (lineáris pWB2) és egy 2,5 milliárd molekulasúlyú (kromoszóma-fragmentum). Az 1, példa szerint végzett transzformációval kimutatható, hogy a pSB51 csak 1 phoA gént tartalmaz.
Az E. coli SB44 által előállított lúgos foszfatázt korongelektroforézissel összehasonlítjuk az E. coli K12 és a S. marcescens megfelelő enzimeivel. Ennek érdekében a nyers enzimeket ozmotikus sokkal izoláljuk az indukált sejtekből (A. Torriani, Procedures in Nucleic Acid Research, p. 224—235., G.L. Cantoni és D.R. Davies, Ed. Harper és Row, Publ., New York, 1966).
Közelebbről: 0,5 I, a táblázat szerint előállított rázott tenyészetből centrifugálással elkülönítjük a (kb. 1,5 g nedves súlyú) sejt-tömeget, háromszor mossuk 10 mM pH 7,7 trisz-HCf pufferrel és 30 ml szacharóz-oldatban (0,5 M szacharóz, 30 mM trisz-HCI, 0,5 mM EDTA, pH 8,0) szuszpendáljuk. A szuszpenziót 10 percen át szobahőmérsékleten kevertetjük. A sejteket centrifugáljuk, 30 ml 3—5°C hőmérsékletű vízben szuszpendáljuk, 10 percen át kevertetjük és ismét centrifugáljuk. A fel ii I úszóból ammóniumszulfáttat való 85%-os telítés mellett kicsapjuk a nyers enzimet, a fehérje-csapadékot 0,6 ml pH 8,5 37 mM trisz-HCI pufferben oldjuk és ugyanezzel a pufferrel szemben dializáljuk.
A nyers foszfatázok korong-elektroforéziséhez (H.R. Maurer, Disk-Elektrophorese, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, 1968) 10%os elválasztógélből — 0,185 M pH 8,5 triszHCl-ban — és 5%-os gyűjtőgél bői — 0,037 mM pH 8,5 trisz-HCl-ban — álló akrilamid gél lemezeket alkalmazunk és az elektroforézishez pufferként 0,037M pH 8,5 trisz-borát oldatot veszünk. Az elválasztást 450 V feszültség mellett (4 órán át) végezzük. A gélben a foszfatáz-sávokat jellegzetes színreakcióval mutatjuk ki (O. Gábriel, Methods in Enzymology Vol. 22., p. 590., W.B. Jakoby Ed., Academic Press, 1971.), amely az alía-nafto-I-foszfát a Ifa - π af tol I á való hidrolízisén és egy azofesték képződésén alapul.
A két vonatkozási törzsből származó enzim-preparátumok az ismert képet mutatják: ez 3 szorosan egymás mellett elhelyezkedő foszfatáz sávból áll, amelyek egyértelműen megkülönböztethetők (a S. marcescens enzim sávjai észrevehetően lassabban futnak, mint az E.. coli KI2. enziméi). Az E. coli SB44 (pSB51)-bői származó enzim a S.marcescens enzimével egyező sáv-képet mutat (1. a 2. ábrát) .
4. példa
A pSB53 plazmid előállítása
a.) A pSB18 enzim előállítása
A pSB18-at a pBR322 plazmidból állítjuk elő az EcoRI restrikciós szekvencia eltávolításával. A pBR322-t már leírták (Bolivár et al., Gene 2., 95—113. 1977); az e közleményben megadott módon végezzük az elkülönítést. A DNS-t DNS-pufferben (45 mM triszHCI, 0,1 mM EDTA, pH 7,9) oldjuk és ebben a formában használjuk fel.
Az EcoRI restrikciós endonukleázt az irodalomból ismert eljárások szerint (P.J. Greene 9
-9193504 et al., Methods in Molecular Biology Vol.7., p. 7., R.B. Wickner Ed., Marcel Dekker Inc., New York, 1974) állítjuk elő. A T4-DNS-polimerázt (5000 egység/ml) a PL-Biochemicals Inc. cégtől (Milwaukee, Wis., USA), a T4-DNS-ligázt (100 egység/ml) pedig a Biolabs cégtől (Beverly, Maryland, USA) szereztük be.
Egy következő összetételű reakcióelegyet:
μΙ pBR322 (620 pg/ml), μΐ EcoRI-reakciópuffer (300 mM trisz-HCl, 30 mM MgCl2, pH 7,5) és μΐ hígított EcoRI-oldat percen át 37°C-on inkubálunk és az enzim-reakció leállítására 10 percen át 65°C-on tartjuk. A kvantitatív átalakításhoz szükséges enzim-hígítást előkísérletben határozzuk meg, amelynek során gélelektroforézissel, 0,7% agarózban (J.F. Morow et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 71., 1743—1747., 1974) mérjük a gyürüalakú plazmid-DNS lineárissá való átalakulás mértékét.
A (30 μΙ térfogatú) reakcióelegyhez a következőket adjuk hozzá:
μΙ polimeráz-puffer (600 mM trisz-HCl, 80 mM MgCI2, 100 mM merkaptoetanol, pH 7,5), μΙ 500 mM 2’-dezoxi-adenozin-5’-trifoszfát (dATP) -oldat, μΙ 500 mM 2’-dezoxi-guanozin-5’-trifoszfát (dGTP) -oldat, μΙ 500 mM 2'-dezoxi-timidin-5’-trifoszfát (dTTP)-oldat, μΙ 500 mM 2’-dezoxi-citidin-5’-trifoszfát (dCTP)-oIdat, μΙ T4-DNS-polimeráz (1:2000 hígítás) és 10 pl víz.
A (100 μΙ térfogatú) keveréket 30 percen át 37°C-on tartjuk, majd a reakció leállítására 10 percen át 70°C-on tartjuk. Ezután μΙ ligáz-puffert (660 mM trisz-HCl, 66 mM MgCI2, 100 mM ditiotreit, pH 7,6) μΙ (4 mM) ATP-t, ' μΙ T4-DNS-ligázt és μΐ H2O-t adagolunk. A (150 μΐ térfogatú) keveréket 16 órán át 13°C-on, majd 10 percen át 65°C-on tartjuk.
A fennmaradó pBR322-nek a rosszul transzformálható lineáris formában való átalakítására a keveréket a fent léírt módon mégegyszer reagáltatjuk EcoRl-vel (reakciótérfogat 250 pl), majd kétszer extraháljuk 250—250 μΐ fenollal — amelyet előzetesen DNS pufferrel telítünk — és DNS pufferrel szemben fenolmentesre dializáljuk (végtérfogat: 300 μΙ).
Az E. coli K12 HB101 törzsből (H.W. Boyer, D. Roulland-Dussoix, J. Mól. Bioi. 41., 459—472., 1969) kompetens sejteket állítunk elő. Kompetens sejtek előállítására Lederberg et al. módosított eljárását alkalmazzuk (J. Bacteriol. 119., 1072—1074., 1974). A sejteket az 1. példa szerint 100 ml L-táptalajban E500=0,8 optikai sűrűségig tenyésztjük, centri10 fugáljuk és 100 ml (100 mM) MgCl2 oldatban szuszpendáljuk. A szuszpenziót 20 percen át 0°C-on tartjuk, majd centrifugáljuk, a sejteket 50 ml 30 mM töménységű CaCl2 oldatban felvesszük és további 20 percen át 0°C-on való tartás után centrifugáljuk, 5 ml 30 mM töménységű CaCl2 oldatban szuszpendáljuk és további feldolgozásig jégen tartjuk. A transzformációhoz 200 μΙ, a ligázzal végzett átalakítás után kapott DNS oldatot és 400 μΙ kompetens sejt szuszpenziót összekeverünk, az elegyet 50 másodpercen át 38°Con, vízfürdőben tartjuk és 60 percen át 0°C-on hagyjuk állni. 8 ml L táptalaj hozzáadása után) 10 g/l tripton (Difco), 5 g/l élesztőkivonat, 5 g/1 NaCl; E.S. Lennox, Virology 1., 190—206., 1955) a sejteket 2 órán át 37°C-on ínkubáljuk, majd 100 ml, 50 pg/ml ampicillint tartalmazó L táptalajba visszük át és további 16 órán át 37°C-on Ínkubáljuk. Ennek az ampicillines dúsításnak a termékéből a szokásos módon agar-lemezeken olyan különálló telepeket különítünk el, amelyek 100 pg/ /ml ampicillinnel és 25 pg/ml tetraciklinnel szemben rezisztensek. 4 különálló telepből ismert eljárások szerint (G.O. Humphreys et al., Biochem.Biophys.Acta 383., 457—463., 1975) izoláljuk a plazmid-DNS-t. Mind a 4 esetben olyan plazmidot kapunk, amely a kiindulási pBR322 plazmidtól csak az EcoRI reakció-szekvencia hiánya tekintetében különbözik. Ezt a plazmidot a pSB18 jellel látjuk el.
b.) A pSB53 plazmid előállítása
A HindlII restrikciós endonukleáz elkülönítését ismert eljárások szerint (H.O. Smith,
K.W. Wilcox, J. Mól. Bioi. 51., 379—391., 1970 és P. Philippsen, R.E. Streek, H.G. Zachau, Eur.J.Biochem. 45., 479—488-., 1974) végezzük. A BamHI restrikciós endonukleázt a Biolabs cégtől szerezzük be.
Egy reakcióelegyet, amely a következő őszszét été 1 íí * pl pSB18 (350 pg/ml) pl pSB47 (40 pg/ml) pl HindlII reakciópuffer (20 mM trisz-HC1, 20 mM merkaptoetanol, 20 mM MgCl2, 180 mM NaCl, pH 7,4) pl hígított HindlII oldat és 5 pl BamHI oldat percen át 37°C-on és 10 percen át 65°C-on tartunk. A kvantitatív hasításhoz szükséges enzim-hígítást előzetesen az 1. példa szerinti eljáráshoz hasonlóan, gélelektroforézissel határozzuk meg.
A keverékhez hozzáadunk 10 pl ligáz puffért, 10 pl ATP-t (4 mM), 1 pl T4 ligázt és 50 pl H2O-t. Ezután az elegyet 16 órán át 13°Con ínkubáljuk, kétszer extraháljuk fenollal és DNS pufferrel szemben dializáljuk.
A foszfatáz-negatív SB44 mutánsnak a DNS oldattal való transzformációját és az ampicillin-rezisztens, foszfatáz-pozítív telepek szelektálását a 2b. példa szerint végezzük.
-10193504
Néhány ilyen telepből elkülöníthető egy 8600Bp molekulasúlyú, pSB53 jelű plazmid, amely HindlII és BamHI restrikciós endonukleázzal végzett egyidejű hasítással 2, 4020Bp és 4600Bp molekulasúlyú fragmentumra bontható. A nagyobb fragmentum gélelektroforézíssel végzett elemzés alapján azonosnak bizonyul egy olyan fragmentummal, amely a pSB47 és a pSB18 Hindlll-mal és BamHI-gyel végzett elbontása során egyaránt keletkezik és amelyről ezért feltehető, hogy az alkálikus foszfatáz gént hordozza. A pSB53-ból kapott második iragmentum (4020Bp) azonos a pSB18-ból kettős elbontással előállított nagyobb fragmentummal.
5. példa
A pSB53 tulajdonságai
A restrikciós térkép előállítására a pSB53ból kapott plazmidot az EcoRI, HindlII, BamHI, Pstl, Sáli, Bglll, Kpnl, Xhol és Xbal restrikciós endonukleázzal reagáltatjuk. Az EcoRI-t, HindIII-t és BamHI-t ugyanabból a tételből vesszük, amelyet az I. példában használtunk; a többi enzimet a Biolabs cégtől szerezzük be. A standard reakcióelegy 10 μΐ pSB53-t (170 pg/ml), 10 μΐ reakciópuffert és 10 μΙ enzim-hígítást tartalmaz. A reakcióhoz a 4. példa szerinti ill. az enzim előállítója által megadott puffereket alkalmazzuk. A kombinált átalakításhoz szükséges enzim-hígításokat előkísérletben határozzuk meg, a lambda bakteriofág DNS-ének hasításával. A reakcióelegyet 60 percen át 37°C-on és 10 μΐ leállító oldat hozzáadása után további 30 percen át 37°C-on inkubáljuk. A leállító oldat 100 mM EDTA-t, 400 mg/ml szacharózt és 0,5 mg/ml proteináz K-t (Merck, Darmstadt) tartalmaz. A reakcióelegyet 0,7% agarózt (J.F Morrow et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 71., 1743—1747., 1974 (vagy 3,5% poliakrilamidot) T. Maniatis et al., Biochemistry 14., 3787—3794., 1975) tartalmazó gél-lemezen elektroforézissel elemezzük. A DNS-fragmen, tumok molekulasúlyának meghatározását olyan, kalibrációs célokra használható fragmentumokkal való összehasonlítás útján határozzuk meg, amelyeket J. G. Sutcliffe szerint (Nucl. Acid Rés. 5., 2721—2728., 1978) pBR322-ből állíthatunk elő.
A HindlII, BamHI, Sáli és Xhol enzim mindig ugyanazt a molekulasúlyú lineáris sávot szolgáltatja, míg az EcoRI és a Pstl hatására 2 ill. 3 kisebb sáv keletkezik. A Bglll, Kpnl és az Xbaf nem bontja el a pSB53-t.
A 4b. példa szerint, a Hindlll-mal és BamHI-gyel végzett egyidejű hasítással kapott sávok közül a 4020Bp molekulasúlyú a pBR322-ből ismert Pstl és Sáli hasítási helyeket tartalmazza, míg az E. coli K12 kromoszóma-SDNS-éből származó 4600Bp molekulasúlyú sávot az Xhol 2 fragmentumra (ezek molekulasúlya: 2580Bp és 2020Bp) bontja. A 2580Bp molekulasúlyú fragmentumot az EcoRI 3 szubfragmentumra (ezek molekulasúlya: 1210, 1040 és 330Bp) bontja, míg a
2020Bp molekulasúlyú fragmentum Pstl-gyel 3 szubfragmentumra (molekulasúlyuk: 820, 740 és 460Bp) bontható. Ezekből az adatokból, valamint további, HindlH/EcoRI-gyel, valamint BamHI/Pstl-gyel végzett összehasonlító kettős átalakítások alapján vezethető le a pSB53-ra az 1. ábrán bemutatott restrikciós térkép.
A phoA génnek pSB53 EcoRI-hasítási helye tartományában való kimutatására a 330Bp molekulasúlyú EcoRI fragmentumot egy másik, 3600Bp molekulasúlyú EcoRI-fragmentummal cseréljük ki, amely az E. coli K12 phoA génjét hordozza. Ez a fragmentum a pSB37 plazmidból állítható elő, amelyben a pBR313-mal alkotott hibrid plazmidként fordul elő (F. Bolivár et al., Gene 2., 75—93., 1977). A pSB37 felvétele következtében az É. coli KI2 HB101 prolin-deficiens törzs és az ebből levezetett foszfatáz-negativ E. coli SB44 mutáns prolin-prototróf, valamint ampicillinés tetraciklin-rezisztens, míg a pSB53 csak ampicillin-rezisztenciát vált ki.
Egy keveréket, amely 5 μΙ pSB53-t (170 pg/ml), 5 μΙ pSB37-t (90 pg/ml), 10 μΙ reakciópuffert és 10 μΐ EcoRI-oldatot tartalmaz, a 4a. példa szerint reagáltatunk és a reakciót melegítéssel állítjuk le. A DNS-keverék T4 ligázzal való további átalakítását, az E. coli SB44 törzs transzformációját és az ampicillin-rezisztens sejtek dúsítását a 4b. példa szerint végezzük. Az ezen tenyészet 2 ml-ében jelenlevő sejteket centrifugálással elkülönítjük, 2 ml steril NaCl oldatban (9 g/1) szuszpendáljuk, NaCl oldattal hígítjuk, különböző hígítási lépcsőkben prolint nem tartalmazó minimális agar táptalajra szélesztjük — amelynek összetétele:
1,0 g/1 NH4C1
0,25 g/1 MgSO4-7H2O
3,0 g/I KH2PO4
7,0 g/1 Na2HPO4-2H2O
4,0 g/1 glukóz
0,5 g/1 NaCl mg/1 leucin mg/1 B, vitamin pH 7,0 (M9 táptalaj) — és 37°C-on egyes telepek megjelenéséig tenyésztjük. A tetracikiin-érzékeny telepeket bélyegző-technika segítségével 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó agar-lemezekre való átvitellel azonosítjuk. Megvizsgáljuk a telepek lúgos foszfatáz képzési képességét és azt tapasztaljuk, hogy minden ilyen telep foszfatáz-negatív.
A plazmid-DNS-t, amelyet a Pro+,Pho~, Ap+,Tc~ fenotípusú telepekből izolálunk és amelyet a pSB54 jelzéssel látunk el, az előbbiek szerint EcoRI-gyel hasítjuk és gélelektroforézissel elemezzük. 2, 8290Bp és 3600Bp molekulasúlyú DNS-sáv mutatható ki, amelyek azonosak a pSB53-ból és a pSB37-ből származó megfelelő sávokkal. A pSB53-ban jelenlevő 330Bp molekulasúlyú fragmentum azonban a pSB54-ben már nem található meg.
-11193504
6. példa
A pSB86 és a pSB87 plazmid előállítása reakcióelegyet, amelyek összetétele:
μΙ pSB53 (170 pg/ml) μΐ VÍZ μΐ EcoRI reakciópuffer és μΐ különböző EcoRI hígítás 60 percen át 37°C-on inkubálunk és a reakció leállítására 10 percen át 65°C-on tartunk. 1:200, 1:250, 1:320, 1:400 és 1:500 enzim-hígításokat alkalmazunk. Előkísérletben meghatároztuk, hogy az 1:200 hígítás még éppen elegendő a kvantitatív bontáshoz, míg a többi hígítás csak részleges átalakítást eredményez.
A reakcióelegyhez hozzáadunk 30 μΙ következő összetételű oldatot:
μΙ PstI reakciópuffer (30 mM trisz-HCI, 150 mM NaCl, 30 mM NaCl, 30 mM MgCI2, pH 7,0) μΐ PstI oldat (Biolabs, 1:20 hígítás). Előkísérletben meghatároztuk, hogy a PstI mennyisége a kvantitatív átalakításhoz megfelelő. A keverékeket 60 percen át 37°C-on inkubáljuk, majd a reakció leállítására hozzáadunk egy — 15 μΐ térfogatú — EDTA-t (100 mM) és szacharózt (400 mg/ml) tartalmazó oldatot és a terméket 0,7% agarózon végzett gélelektroforézissel (1. az 5. példát) elbontjuk.
Míg az 1:200 hígítású EcoRI hígítást tartalmazó reakcióelegy 5 DNS sávot mutat (ezek molekulasúlya: 3980, 2030, 1827, 460 és 330Bp), a többi keverék 2 ill. 3 további sávot (ezek molekulasúlya: 2157, 2360 és 4180Bp) eredményez.
A 2157 és 2360Bp molekulasúlyú kettős sávot hidroxilapatiton H.F. Tabak, R.A. Flavell módszere szerint (Nucleic Acid Rés. 5., 2321—2332., 1978) végzett elektroforetikus abszorpcióval izoláljuk a gélből. Végül a DNSt a hidroxilapatitról 1M nátriumíoszfát-pufferrel eluáljuk, dializáljuk, 2 térfogat etanollal kicsapjuk és a DNS pufferben feloldjuk.
A pBR322 plazmidot ugyanígy reagáltatjuk EcoRI-gyel és Pstl-gyel, de olyan körülmények között, amelyek kvantitatív bontáshoz vezetnek. Az ennek során keletkező két DNS Fragmentum közül a nagyobb molekulasúlyú (3610Bp) a fent leírt módon, hidroxilapatiton végzett elektroforetikus adszorpcióval különítjük el.
A pSB53-ból és pBR322-ből elkülönített fragmentumok keverékét a 4b. példa szerint T4 ligázzal reagáltatjuk. A reakció termékével transzformáljuk a foszfatáz-negatív E. coli SB44 törzset és a transzformációs keverékből 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó L táptalajban dúsítjuk a rezisztens sejteket.
A tetraciklin-rezisztens egyes telepeket bélyegzővel átvisszük 50 pg/ml ampicillint tartalmazó L táptalajra ill. LP táptalajra (K. Kreuzer et al., Genetics 81., 459—468., 1975) és megvizsgáljuk ezek ampicillin-rezisztenciáját és foszfatáz-képzését. Minden sejt 30%-uk ampicillin-érzékeny.
Az ampicillin-rezisztens sejtek közül ismert eljárásokkal elkülöníthető egy pSB86 jelű plazmid, amely EcoRI-gyel és Pstl-gyel végzett bontás után 3 sávot eredményez; ezek molekulasúlya: 3610Bp (a pBR322-ből), valamint 1827 és 330Bp (a pSB53-ból). Az ampicillin-érzékeny sejtekből elkülönítjük a pSB87-t, amely EcoRI-gyel és Pstl-gyel végzett elbontás után 3 sávot eredményez; ezek molekulasúlya: 3610, 2030 és 330Bp. A pSB86 és a pSB87 restrikciós térképét az la) illetve lb.) ábrán mutatjuk be.
7. példa
A pSB50 plazmid előállítása a.) In vitro DNS-kapcsolás
A pWB2 vektor-plazmidot, amely egy, a HindlII restrikciós endonukleáz számára hozzáférhető hasítási helyet tartalmaz, és ampicillin- és kolicin-El-rezisztenciát közvetít (W. Boidol, O. Siewert et al., Molec.Gén.Génét. 152., 231—237., 1977), az irodalomból ismert eljárások szerint (G.O. Humphreys et al., Biochem.Biophys.Acta 383., 457—463., 1975) különítjük el. Az E. coli K.12 típusú baktériumokból Saito et al. fenol-extrakciós eljárása szerint (Biochem.Biophys.Acta 72., 619—629., 1963), de az RNÁzzal végzett elbontás kiiktatásával különítjük el a nagymolekulájú kromoszóma-DNS-t. A két DNS-féleséget DNS-pufferrel szemben (45 mM trisz-HC1, 0,1 mM EDTA, pH 7,9) dializáljuk és ebben a formában alkalmazzuk tovább. A HindlII restrikciós endonukleáz elkülönítését az irodalomból ismert módon (J.Mól.Bioi.
51., 379—391., 1970 és Eur.J.Biochem. 45., 479—488., 1974) végezzük. A T4 ligázt (100 egység/ml) a Biolabs cégtől (Beverly, Maryland, USA) szerezzük be.
Egy reakcióelegyet, amelynek összetétele:
μΐ pWB2 (360 pg/ml DNS) μΐ kromoszóma-DNS (180 μg/ml) μΐ HindlII reakciópuffer (20 mM trisz-HC1, 20 mM merkaptoetanol, 20 mM MgCI2, 180 mM NaCl, pH 7,4) és μΙ hígított HindlII oldat percen át 37°C-on inkubálunk és az enzim-reakció leállítására 10 percen át 65°C-on tartunk. A kvantitatív átalakításhoz szükséges enzim-hígítást előkísérletben határozzuk meg oly módon, hogy mérjük — 0,7%-os agarózban végzett gélelektroforézissel (J.F. Morrow et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 71., 1743—1747., 1974) — a gyürüalakú plazmid-DNS lineárissá való átalakulása mértékét.
A fenti (180 μΐ térfogatú) reakcióelegyhez hozzáadunk μΐ T4 ligáz-puffert (660 mM trisz-HCI, 66 mM MgCl2, 100 mM ditiotreit, pH 7,6) μΐ ATP-t (4 mM) μΐ T4 ligázt és
138 μΐ H2O-t (össztérfogat 400 μΐ). A keveréket 16 órán át 13°C-on inkubáljuk, kétszer mossuk 400— 400 μΐ fenollal — amelyet előzetesen TES pufferrel (50 mM trisz-HCI, 50 mM NaCl, 5 mM
-12193504
EDTA, pH 8,0) telítettünk — és DNS pufferrel szemben fenolmentesre dializáljuk.
b. ) A pho+ sejtek transzformációja és szelekciója
Az E. coli phoA mutánsa (SB44 törzs) (1. példa) kompetens sejtjeit a ligációs reakciótermékével reagáltatva transzformáljuk.
A kompetens sejtek előállítására Lederberg et al. (J. Bacteriol. 119., 1072—1074,, 1974) módosított eljárását alkalmazzuk. A sejteket az 1. példa szerint 100 ml L táptalajban E5oo=O,8 optikai sűrűségig tenyésztjük, centrifugáljuk és 100 ml MgCI2 oldatban (100 mM) szuszpendáljuk. A szuszpenziót 20 percen át 0°C-on tartjuk, centrifugáljuk, a sejteket 50 mM CaCl2 oldatban (30 mM) felvesszük, a szuszpenziót 20 percen át ismét 0°C-on tartjuk, centrifugáljuk, a sejteket 5 ml CaCl2-ban (30 mM) szuszpendáljuk és a további feldolgozásig jégen tartjuk.
A transzformációhoz (W. Goebel, R. Bonewald, J. Bacteriol. 123., 658—665., 1975) 200 μΐ jégbehűtött ligáz reakcióelegyet és 400 μΐ kompetens sejt-elegyet összekeverünk, majd a keveréket 50 másodpercen át 38°C hőmérsékletű vízfürdőben és 60 percen át 0°C-on tartjuk. 8 ml L táptalaj hozzáadása után a sejteket 2 órán át 37°C-on tartjuk, majd 50 pg/ /ml ampicillint tartalmazó L táptalajba (100 ml) visszük át és további 16 órán át 37°Con tartjuk. Ebből az ampicíHines dúsítási elegyből ugyanazzal a módszerrel különítjük el a foszfatáz-pozitív egyes telepeket, amelyet az 1. példa szerint foszfatáz-negatív mutánsok elkülönítésére alkalmazunk. Kb. 10.000 színtelen telep között mindig egy sárga található.
c. ) A pSB50 elkülönítése és jellemzése
A sárga telepekből egy ismert eljárás (G. O. Humphreys et al., Biochem.Biophys. Acta 383., 457—463., 1975) szerint elkülöníthető egy 22 milliárd molekulasúlyú plazmid, amelyet pSB50-nek nevezünk. Ezt a fentiek szerint reagáltatjuk a HindlII restrikciós endonukleázzal és 0,7% agarózban végzett gélelektroforézissel (J.F. Morrow et al., Proc. Natl.Acad.Sci. USA 71., 1743—1747., 1974) elemezzük. Két DNS-sáv mutatható ki, amelyek közül a gyorsabban vándorló (7,1 milliárd molekulasúlyú) azonos a lineáris pWB2vel. A második sáv molekulasúlya kb. 15 milliárd. A pSB50 plazmiddal végzett transzformáció eredményeként valamennyi, az 1. példában említett mtítáns foszfatáz-pozitív lesz. A plazmidnak ezért mind egy phoA, mind egy phoB gént hordoznia kell; ezek az E. coli kromoszómán szorosan egymás közelében helyezkednek el.
8. példa
A phoA plazmidok bevitele baktériumtörzsekbe
A 2.,3.,4. és 7. példában leírt plazmidokat — pSB47, pSB51, pSB53 és pSB50 — bevisszük foszfatáz-pozitív E. coli K12, E. coli
HB101 és S. marcescens, valamint az E. coli SB44 törzsekbe. Ennek érdekében a sejteket a 2. példa szerint kompetenssé tesszük és az izolált DNS-sel transzformáljuk. Az így kapott plazmid-tartalmú törzseket a táblázatban foglaljuk össze, amelyben megadjuk a dereprimált körülmények között fellépő foszfatáz-termelést és összehasonlítjuk ezt a kiindulási törzsek megfelelő értékeivel.
Az 1. és 3. ábra jelölései:
A restrikciós enzimek által felismerhető szekvenciák jelölésére a következő jeleket alkalmazzuk:
EcoRI
Φ HindlII
T BamHI
T Sáli
PstL t XhoL
További alkalmazott rövidítések:
Ap+ill. Ap“ ampicillin-rezisztencia ill., -érzékenység
Tc+ill. Te” tetraciklin-rezisztencia ill. -érzékenység
Pho+ ill. Pho lúgos foszfatáz szintézisére való képesség ill. ennek hiánya
Bp bázispár
A plazmidok jellemzésében megadott számok bázispárban /Bp/kifejezett molekulasúlyokat jelentenek.

Claims (6)

1. Eljárás phoA-gént tartalmazó plazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) antibiotikum-rezisztens plazmidot és vad típusú baktériumokból származó kromoszóma DNS-t restrikciós endonukleázzal reagáltatunk, az így létrejött hasítási termékek DNS ligázzal ligáljuk, majd azzal E. coli KI2 HB101 (DSM 1607) törzsből l-nitrozo-3-nitro-1-metil-guanidinos kezeléssel nyert E. coli SB 44 (DSM 1606) phoA~-mutánst transznormálunk, és a strukturgént tartalmazó plazmidokat alkalikus foszfatáz-aktivitás alapján zoláljuk, vagy
b) az a) eljárás szerint előállított plazmátokból phoA-gént tartalmazó frakciókat hasítunk ki restrikciós enzimekkel, és valamely antibiotikum-rezisztens vektorpl az midokkal rekombináljuk, DNS-ligáz alkalmazásával.
2. Az 1. igénypont szerinti b) eljárás pSB53 (ATCC 40020) jelű plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy pSB18 (ATCC 40016) jelű antibiotikum-rezisztens plazmid vektort és pSB47 (ATCC 40057) vagy pSB50 (ATCC 40018) phoA-plazmidokat BamHI és HindlII restrikciós endonukleázokkal reagáltatunk, és az így kapott fragmenseket egymással kapcsoljuk.
3. Eljárás pSB86 (DSM 1874) plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypont szerint előállított pSB53 (ATCC 40020) plazmidot Pstl-el, majd részlegesen EcoRI-el
-13193504 hasítjuk, majd a termékből izoláljuk a phoA-gén N-terminális végét tartalmazó 2157 Bp-s DNS-írakciót, és ezt az 1. igénypont szerinti b) eljárással pBR322 (ATCC 40015) plazmid vektorral kapcsoljuk.
4. Eljárás phoA-gént tartalmazó E. coli és S. marcescens törzsek előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely kompetenssé tett fenti törzset az alkalikus foszfatázt (phoA) kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó, az 1—3. igénypontok bármelyike szerint előállított plazmid vektorral transzformálunk, majd a sejttenyészetekből izoláljuk az antibiotikum-rezisztens törzseket.
5 5. Eljárás alkalikus foszfatáz előállítására, azzal jellemezve, hogy S. marcescens ATCC 31543, 31540, 31542, DSM 1873 vagy E. coli ATCC 31541 törzseket minimális foszfáttartalmú táptalajon tenyésztünk, és a keletke
10 zett foszfatázt önmagában ismert módon elválasztjuk.
HU801932A 1979-08-03 1980-08-01 Process for preparing and applying recombinated plasmids containing basic phosphatase gens HU193504B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19792931999 DE2931999A1 (de) 1979-08-03 1979-08-03 Herstellung und anwendung von neukombinierten plasmiden mit genen fuer alkalische phosphatasen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU193504B true HU193504B (en) 1987-10-28

Family

ID=6077852

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU801932A HU193504B (en) 1979-08-03 1980-08-01 Process for preparing and applying recombinated plasmids containing basic phosphatase gens

Country Status (8)

Country Link
US (1) US4375514A (hu)
EP (1) EP0023882B1 (hu)
JP (2) JPS5648884A (hu)
AT (1) ATE32101T1 (hu)
DE (2) DE2931999A1 (hu)
DK (1) DK329480A (hu)
HU (1) HU193504B (hu)
IL (1) IL60714A (hu)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK582381A (da) * 1981-01-02 1982-07-03 Univ New York Remkombinat plasmid til anvendelse ved bakteriel kloning
JPS5869897A (ja) * 1981-10-20 1983-04-26 Gakuzo Tamura Ｄｎａ遺伝子
US4532207A (en) * 1982-03-19 1985-07-30 G. D. Searle & Co. Process for the preparation of polypeptides utilizing a charged amino acid polymer and exopeptidase
US4880911A (en) * 1982-03-19 1989-11-14 G. D. Searle & Co. Fused polypeptides and methods for their detection
US5252482A (en) * 1982-05-20 1993-10-12 Suntory Limited Precursor of a C-terminal amidated calcitonin
JPS592689A (ja) * 1982-06-04 1984-01-09 Handai Biseibutsubiyou Kenkyukai 強力な遺伝子発現能を有する新規レプリコンの作成法
JPS60145685A (ja) 1984-01-09 1985-08-01 Nec Corp 分布帰還型半導体レ−ザ
JPS5939899A (ja) * 1982-08-27 1984-03-05 Gakuzo Tamura 新規ベクタ−
JPS59198979A (ja) * 1983-04-28 1984-11-10 Agency Of Ind Science & Technol 特定プラスミドを含む宿主菌体の安定化
US4963495A (en) * 1984-10-05 1990-10-16 Genentech, Inc. Secretion of heterologous proteins
FR2575760A1 (fr) * 1985-01-04 1986-07-11 Merieux Inst Nouvelles souches d'escherichia coli excretrices de phosphatase alcaline, procede d'obtention de ces souches, procede de production de phosphatase alcaline et de proteines hybrides derivees
US5047334A (en) * 1987-06-30 1991-09-10 Repligen Corporation Novel prokaryotic expression and secretion system
DE3731875A1 (de) * 1987-09-18 1989-03-30 Schering Ag Gentechnische herstellung von neukombinierten plasmiden fuer die produktion von humanem adrenocorticotropen horman (acth) und davon abgeleiteten derivaten durch enzymatische spaltung primaer synthetisierter fusionsproteine
WO1989008254A1 (en) * 1988-03-04 1989-09-08 La Jolla Cancer Research Foundation Germ cell alkaline phosphatase gene and protein produced thereby
US5081227A (en) * 1988-03-04 1992-01-14 La Jolla Cancer Research Foundation Germ cell alkaline phosphatase
FR2648713B1 (fr) * 1989-06-26 1994-06-10 Commissariat Energie Atomique Proteines hybrides entre une enzyme extracytoplasmique et une autre proteine, leur procede de preparation, ainsi que leur application comme agent de diagnostic
US6451572B1 (en) 1998-06-25 2002-09-17 Cornell Research Foundation, Inc. Overexpression of phytase genes in yeast systems
DE60021715T2 (de) * 1999-03-31 2006-06-01 Cornell Research Foundation, Inc. Phospahatasen mit verbesserter phytase-aktivität
US6841370B1 (en) * 1999-11-18 2005-01-11 Cornell Research Foundation, Inc. Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase
US7320876B2 (en) * 2001-10-31 2008-01-22 Phytex, Llc Phytase-containing animal food and method
AU2003272410A1 (en) * 2002-09-13 2004-04-30 Cornell Research Foundation, Inc. Using mutations to improve aspergillus phytases
US7919297B2 (en) 2006-02-21 2011-04-05 Cornell Research Foundation, Inc. Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase
US8540984B2 (en) * 2006-08-03 2013-09-24 Cornell Research Foundation, Inc. Phytases with improved thermal stability
US20080239709A1 (en) * 2007-03-29 2008-10-02 Thomas & Betts International, Inc. Concealed Emergency Lighting Fixture with Full Rotation of Door
US8192734B2 (en) 2007-07-09 2012-06-05 Cornell University Compositions and methods for bone strengthening
CN116640742A (zh) * 2018-08-17 2023-08-25 邦泰生物工程(深圳)有限公司 一种酸性磷酸酶突变体、其应用及其制备烟酰胺核糖的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4237224A (en) * 1974-11-04 1980-12-02 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Process for producing biologically functional molecular chimeras
US4190495A (en) * 1976-09-27 1980-02-26 Research Corporation Modified microorganisms and method of preparing and using same

Also Published As

Publication number Publication date
EP0023882A2 (de) 1981-02-11
IL60714A (en) 1983-12-30
DK329480A (da) 1981-02-04
DE3072070D1 (en) 1988-02-25
EP0023882A3 (en) 1981-12-09
JPS5648884A (hu) 1981-05-02
EP0023882B1 (de) 1988-01-20
ATE32101T1 (de) 1988-02-15
US4375514A (en) 1983-03-01
DE2931999A1 (de) 1981-02-26
JPS6229966A (ja) 1987-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU193504B (en) Process for preparing and applying recombinated plasmids containing basic phosphatase gens
Weiss et al. Localization of the Escherichia coli cell division protein FtsI (PBP3) to the division site and cell pole
US4500640A (en) Plasmids
US4914025A (en) Export of intra-cellular substances
WO2021179860A1 (zh) 利用枯草芽孢杆菌和核酸内切酶制备人碱性成纤维细胞生长因子
US4956296A (en) Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G
US5024943A (en) Regulatory region cloning and analysis plasmid for bacillus
FI79139B (fi) Foerfarande foer klonande av en gen, som kodar foer ett vaermebestaendigt -amylas, in i escherichia coli och bacillus subtilis.
Pohlner et al. Neisseria gonorrhoeae IgA protease. Secretion and implications for pathogenesis
US4954618A (en) Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G
US5082773A (en) Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G
US5312901A (en) Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G
EP0293391A1 (en) Cloned streptococcal genes encoding protein g and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein g
US4717666A (en) Cloned streptomycete lividans excretable β-galactosidase gene
JP2540039B2 (ja) プラスミドベクタ−
EP0190119A1 (en) Chimeric plasmids that replicate in bacteria and yeast and microorganisms transformed therewith
Müller et al. Cloning of mglB, the structural gene for the galactose-binding protein of Salmonella typhimurium and Escherichia coli
US5229492A (en) Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G
SK278079B6 (en) Microorganism of race escherichia coli or pseudomonas putida, method of its growing and recombinant dna
JPH11514527A (ja) バキルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）用の陽性選択ベクター
RU2593172C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-TA1 GyrA-AcSer, КОДИРУЮЩАЯ СЕРИНОВУЮ АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗУ, СПОСОБНУЮ in vivo АЦЕТИЛИРОВАТЬ N-КОНЦЕВОЙ СЕРИН ДЕЗАЦЕТИЛТИМОЗИНА α1 И ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ ТИМОЗИНА α1 ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ Eschrichia coli C3030/pER-TA1GyrA-AcSer - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННЫХ БЕЛКОВ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ТИМОЗИНА α1 ЧЕЛОВЕКА
Park et al. Genetic screen to dissect protein–protein interactions: ribonuclease inhibitor–ribonuclease A as a model system
US4865982A (en) Cloned streptomycete gene
JPS5921389A (ja) クロ−ン化ストレプトマイセス属菌遺伝子
KR100365492B1 (ko) 방어항원유전자가도입된재조합벡터,형질전환균주와이를이용한신규한재조합방어항원의제조방법