HU184736B - Process for preparing anticarcinogenic immunoglobuline derivatives - Google Patents

Process for preparing anticarcinogenic immunoglobuline derivatives Download PDF

Info

Publication number
HU184736B
HU184736B HU80851A HU85180A HU184736B HU 184736 B HU184736 B HU 184736B HU 80851 A HU80851 A HU 80851A HU 85180 A HU85180 A HU 85180A HU 184736 B HU184736 B HU 184736B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
fragment
fab
immunoglobulin
antitumor
protein
Prior art date
Application number
HU80851A
Other languages
English (en)
Inventor
Yasuhiko Masuho
Takeshi Hara
Teruhisa Noguchi
Original Assignee
Teijin Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Teijin Ltd filed Critical Teijin Ltd
Publication of HU184736B publication Critical patent/HU184736B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/866—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fab, fv, fc, heavy chain or light chain

Description

A találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű Fab^1<X)n-S1-FA (I) új daganatellenes hatású immunoglobulin-származékék előállítására. A képletben
Fab egy daganatellenes immunoglobulin Fab fragmentuma,
FA egy diftéria toxin A fragmentuma,
X jelentése (A),
Sj és Sj egyaránt kénatomot jelent, ahol Sj egy immunoglobulin szulfid-kötéséből származó, S2 pedig egy diftéria toxin diszulfid kötéséből származó kénatom, n értéke 0 vagy 1.
Közelebbről a találmány olyan új protein előállítására vonatkozik, amely, miután molekulájának egyik része lényegében megfelel egy daganatellenes hatású immunoglobulin Fab fragmentumának (Fab = Fragment antigén binding), másik része pedig lényegében a diftéria toxin A fragmentumával egyezik meg, különösen jó hatást mutat rosszindulatú daganatokkal szemben.
Bár számos szer ismeretes rosszindulatú daganatok, így rák kezelésére, ezek közös hátránya, hogy általában nem alkalmazhatók olyan dózisokban, amelyek megsemmisítenék a daganatsejteket, mert a daganatsejteken kívül az egészséges sejtekre is számottevő toxikus hatást fejtenek ki. Több esetben ezt a súlyos problémát úgy kísérelték megoldani, hogy a tumor-ellenes szert vagy citotoxikus protein toxint egy specifikus vívőanyaggal kombinálták, annak érdekében, hogy a hatóanyag specifikusan a daganat-sejteken adszorbeálódjék. A rákos beteg vérében vagy a daganat sejtek felületén nagyon kis mennyiségben jelen van egy daganatellenes ellenanyag (daganatellenes immunoglobulin). Daganatellenes ellenanyaghoz juthatunk úgy is, hogy egy állatot daganatsejtekkel immunizálunk, és a kapott antiszérumot az egészséges embert sejteken abszorbeáljuk. A daganatellenes ellenanyagok nem mindig alkalmasak citotoxikus hatás kifejtésére daganatsejtekkel szemben, közös vonásuk azonban, hogy rendkívül nagy szelektivitást mutatva kötődnek a daganatsejtekhez. így a daganatellenes ellenanyagokat használták a tumor-ellenes szerek vagy protein toxinok vivőanyagaként, annak érdekében, hogy biztosítsák a szelektív kötődést a daganatsejtekhez.
így például a 4 093 607 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint egy ellenanyag és egy tumor-ellenes szer kombinációjából hoztak létre tumor-ellenes hatású gyógyszert. A készítményben a tumor-ellenes szer, például daunomicin kovalensen kötődik a tumor-ellenes immunoglobulin Fab dimeréhez. Ez a megoldás annyiban előnyös, hogy a tumorellenes szert szelektíven a kívánt helyre, a daganatsejtekhez juttatja, mivel azonban az ellenanyaghoz kötődő tumor-ellenes szer, így például a daunomicin nemcsak a daganatsejtekre, hanem a normál sejtekre is citotoxikus, a megoldás nem biztosítja, hogy csak a daganatsejtek károsodjanak, és az így kapott készítmények citotoxicitása sem mindig kielégítő. Például F.L. Moolten és munkatársai (Journal of the National Cancer Institute, 55. 473-477 /1975/) leírták, hogy nyulak anti-SV4Q-transzformált-hörcsög sarcoma vagy limfoma ellenanyagát diftéria toxinhoz kapcsolták, kapcsolószerként glutársav-aldehidet használva, és a kapott készítményt hörcsögök szervezetébe juttatva meg tudták védeni azokat az SV4-transzformált tumorral szemben.
P.E. Thorpe és munkatársai: (Natura, 271, 752754 /1978/) megfigyelték, hogy a diftéria toxin és antilimfocita ellenanyag klorambucil segítségével történő összekapcsolásából létrejövő konjugátum erősen csökkenti az emberi lomfoblasztoid sejtek (CLA4) protein szintézisét. E kísérletek eredményei azt mutatják, hogy a diftéria toxin ellenanyaggal létrehozott konjugátum szelektive toxicitást mutat a daganat-sejtekkel szemben. E konjugátumok daganat-ellenes gyógyszerként történő felhasználásának azonban van néhány hátránya. A henogén ellenanyag (immunoglobulin) az emberi szervezetben erős antigén hatást mutat, és így csökkenti a tumor-ellenes aktivitást, valamint anafilaxiás sokkot okoz. Másik hátránya, hogy nem szűnik meg a diftéria toxin nem specifikus toxicitása. Közelebbről, e módszerek célja, hogy a diftéria toxint tumor-ellenes ellenanyag segítségével a daganatsejtek felületéhez kössék, miután azonban a konjugátum a diftéria toxin teljes molekuláját tartalmazza, a normál sejtek felületén található diftéria toxin receptor helyekkel is képes kötődni, és így az egészséges sejtekkel szemben is vitotoxikus. A megoldás harmadik hátránya az antitest és a diftéria toxin térhálósításával kapcsolatos. Sok térhálósító szer, igy például a glutársav-aldehid, toluol-diizocianát, klorambucil, nemcsak az ellenanyagot és toxint térhálósltja egymással, hanem ellenanyag és ellenanyag és toxin és toxin között is létrehoz térhálós kötéseket, sőt, az ellenanyag és a toxin molekulájában intramolekuláris kötéseket is kialakít, így olyan nem kívánatos melléktermékek keletkezéséhez vezet, amelyek csökkentik a tumor-ellenes hatást.
A találmány célkitűzése a technika állása szerint ismert megoldások hátrányainak kiküszöbölése, és olyan tumor-ellenes szer létrehozása, amely jelentős szelektív citoxicitást mutat daganat-sejtekkel szemben.
A találmány tárgya eljárás olyan tumor-ellenes protein hibrid előállítására, amelynek egyik része lényegében megfelel egy tumor-ellenes immunoglobulin Fab fragmentumának, másik része pedig lényegéhen egy diftéria toxin A fragmentumával egyezik meg. A találmány szerint előállítható tumor-ellenes protein hibrid az (I) általános képlettel írható le
Fab-S,-(X) -Sa-Fa (I), ahol n
Fab olyan molekularészt jelöl, amely lényegében megegyezik egy tumor-ellenes immunoglobulin FAB fragmentumával,
FA olyan molekularészt jelöl, amely lényegében azonos egy diftéria toxin A fragmentumával,
X (A) képletű csoportot jelent,
Sj és Sj egyaránt kénatomot jelent, ahol Sj egy immunoglobulin -S-S- kötéséből származó kénatomot jelöl, míg S2 egy diftéria toxin -S-S- kötéséből származó kéntatomot képvisel, n értéke 0 vagy 1.
A találmány szerint az (I) általános képletű tumorellenes protein hibridet úgy állítjuk elő, hogy a Fab fragmentum kénatomját közvetlenül vagy közvetve összekapcsoljuk az A fragmentum kénatomjával.
Az 1 .(a) ábra az immunoglobulinok alapszerkezetének egy lehetséges felépítését mutatja, az 1 .(b) ábra pedig az emberi IgGl immunoglobulin szerkezetét szemlélteti. Az ábrán L-lel az úgynevezett könnyű láncokat, H-val pedig az úgynevezett nehéz láncokat jelöltük. Fc pedig a Fragment crystalline angol kifeje2
184.736 zés rövidítése, és a molekula nem specifikus részét jelöli.
A 2. ábrán a diftéria toxin alapszerkezetét szemléltetjük, ahol az (a) ábra mutatja az intakt toxin szerkezetét, a (b) ábra mutatja egy bemetszett toxin szerkezetét, a (c) ábra pedig az A és B fragmentum szerkezete látható.
A 3. ábra - . - vonallal jelölt görbéje anti L1210 immunoglobulin IgGl Fab2 fragmentuma és a diftéria toxin A fragmentuma reakciótermékének eluálási görbéjét mutatja, Sephadex F 150 superfine kromatográfiás oszlopon végzett etuálás után. A jelű görbe az EF-2 ADP ribóz transzferáz aktivitását és a ábra a Fab’ fragmentum koncentrációját mutatja.
A 4. ábrán az elektroforézis mozgási sebesség átalakulását ábrázoljuk, nátrium-dodecl-szulfát felhasználása esetén.
Az 5. ábrán ismét egy eluálási görbe szerepel. Közelebbről az Ll 210 immunoglobulin IgGl PDM maradéka Fab fragmentumának és a diftéria toxin A fragmentumának reakciójával létrejött termék Sephadex G150 superfine kromatográfiás oszlopon felvett eluálási görbéjét ábrázoljuk.
A 6. ábra az 5. ábra 1, 2 és 3 csúcsain található protein analízis eredményeit mutatja, Uchterlony módszerrrel meghatározva tengeri malacot nyúl Fab’ fragmentumával immunizálva előállított ellenanyagot és ló anti-diftéria toxin ellenanyagot használva,
A 7. ábrán az antitumor protein hibrid citotoxicitásának mérési eredményeit mutatja L1210-eI szemben, az idő függvényében.
A jelen találmányban tumor-ellenes immunoglobulinnak nevezett anyag egy olyan protein (immunoglobulin), amely ellenanyag hatással rendelkezik (azaz olyan természetű, hogy felismeri a tumor antigéneket és hozzájuk kapcsolódik). Előállítása például egy rákos beteg szérumából vagy majmok, lovak, tehenek, birkák, nyulak szérumából történik, ahol a felsorolt állatokat ráksejtekkel vagy rák antigénnel Cohn etanol frakcionálási módszerével, ammónium-szulfát frakcionálási módszerrel, ion-cserés kromatográfiával vagy bármely más közismert módon hiperimmunizálták. Vagy olyan proteinről van szó, amely hybridomákból vagy hybridomákkal inokulált állatok szérumából vagy hasvízéből kapott rák antigénnel szemben erősen szelektív antitest hatással rendelkezik, ahol az alapanyag előállítása úgy történik, hogy ellenanyagot termelő limfocitákat, amelyeket úgy nyertünk, hogy állatokat rák sejtekkel vagy rák antigénnel immunizáltunk, például myelomával kapcsoljuk (lásd például H. Koprowski és mtsai: Prox. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 7, 3405-3409 /1978/), K.E. Hellström és mtsai: Proc. Natl. Acad, Sci, USA, 76, 6 2927-2931 /1979/, R.H. Kennett és mtsai: Science 2Ó3,1120-2212/1979/).
Az immunoglobulinoknak jól ismert módon különböző főbb csoportjai ismertek. Ilyenek például az IgG, IgA, IgD és IgE. Valemennyire jellemző, hogy alapszerkezete, amint az l.(a) ábrán látható, két L láncot és két H láncot tartalmaz, és a láncokat legalább három diszulfid-kötés köti össze. így például az 1 (a) ábrán látható immunoglobulin két Fab részből áll. és Fc részt tartalmaz. A Fab részek ellenanyagként hatnak, azaz szelektív antigén-kötő képességgel rendelkeznek, az Fc rész a komplementerekhez vagy a sejtfalon levő Fc receptorokhoz kötődik.
Az a molekularész, amely lényegében a Fab frag5 mentumból áll - amely a találmány szerinti tumorellenes hibrid egyik molekularésze is - annak a molekularésznek felel meg, amely az ellenanyag hatású, az immunoglobulin említett Fab részéből származó fragmentumot tartalmazza. így például, ismert, hogy az IgGl, amely tipikus emberi immunoglobulin, az l.(b) ábrán bemutatott vázlatos alapszerkezettel rendelkezik. Ismert az is, hogy ez az immunoglobulin a cisztin jelenlétében végrehajtott papain emésztés hatására az A-A’ szaggatott vonal mentén két Fab fragmentumra és egy Fc fragmentumra hasad (lásd az u e 1 .(b) ábrát), és az így kapott Fab fragmentumok fel0 használhatók a jelen találmány céljára. Ha az IgGl-t pepszinnel, kezelj ük, az l.(b) ábrán bemutatott módon a B-B’ szaggatott vonal mentén felhasad, és egy (F(ab')j) dimer jön létre, amely két Fab’ részből épül fel, ahol a Fab’ rész egy Fab fragmentumból és
2Q az ábrán satirozással jelölt csuklórészből épül fel. A Fab’ fragmentumhoz úgy is eljuthatunk, hogy a csuklórészben levő diszulfid-kötést reduktiven hasítjuk, például egy tiol-reagens felhasználásval, vagy szulfit-ionokkal szulfonáljuk. Miután a Fab’ fragmentum a Fab fragmetumhoz hasonlóan ellenanyagként hat (bár nem hajlamos komplementekhez való kapcsolódásra), a találmány szerinti eljárásban szintén felhasználható Fab fragmentumként. A találmány szerint tehát, ha a Fabt fragmentum ellenanyag hatást mutat, a Fab és Fab fragmentumok egyaránt felhasználhatók.
Az így kapott, általános értelemben vett Fab frag30 mentumot közvetlenül felhasználhatjuk a találmány szerinti tumor-ellenes protein hibrid előállítására, feltéve, hogy legalább egy tiol-gyököt (-SH) és/vagy S-szulfo-gyököt (-S-SO,-) tartalmaz. Ha ezt a feltételt nem teljesíti, úgy járhatunkel, hogy a kiindulási anyagé got legalább egy tiol-gyököt és/vagy S-szulfo-gyököt tartalmazó fragmentummá alakítjuk úgy, hogy a láncokon (H vagy L láncokon) lévő és a láncok közötti (a H láncok és az L láncok közötti) diszulfid kötések legalább egyikét lehasítjuk, általános ismert módszerekkel. A tiol-gyökök és/vagy S-szulfo-gyökök száma a Fab fragmentumban előnyösen 1-5, különösen előnyös pedig, ha a láncok közötti kötések felhasadáséval keletkező tiol- és/vagy S-szulfo-gyökök száma 1 vagy 2.
A bejelentésben diftéria toxinnak nevezett anyag egy protein toxin, amelyet a Crynebacterium diphte45 riae vagy mutánsa termel. így például a Corynebacterium diphteriae által termel diftéria toxin egy polipeptid láncból áll, amelynek molekulasúlya körülbelül 62 000—63 000. Ezt a toxint intakt toxinnak nevezzük. Az intakt toxin molekulája, a 2.(a) ábrán bemutatott módon két diszulfid-kötést tartalmaz.
Ha ezt az intakt toxint enyhe körülmények között egy proteolitikus enzimmel, például tripszinnel kezeljük, az amino-terminális véghez közelebb, egy meghatározott ponton elkülönülés történik, és egy úgynevezett bemetszett toxin jön létre (lásd 2.(b) ábra), cc Ha ezt a bemetszett toxint redukálószerrel kezeljük, szétbomlik egy A fragmentumra, amelynek molekulasúlya körülbelül 24 000 és egy B fragmentumra, amelynek molekulasúlya körülbelül 38 000-39 000 (lásd 2.(c) ábra). Az intakt toxin állatokkal szemben erősen toxikus, az A és B fragmentum külön-külön
6Q azonban nem toxikus. Másrészt, az intakt toxin nem rendelkezik adenozin-difoszfát (ADP)-robóz transzfe-31 ráz aktivitással, míg az A fragmentum rendelkezik ezzel az aktivitással. Bár a B fragmentum nem mutatja ezt az aktivitást, alkalmas arra, hogy egy sejt receptorhoz kapcsolódjon szemben az A fragmentummal, amely nem rendelkezik ezzel a tulajdonsággal.
A találmány szerinti tumorellenes protein hibrid egyik molekularésze az A fragmentumnak felel meg. Ez a fragmentum a diftéria toxin A fragmentuma, és rendelkezik az előzőekben megadott tulajdonságokkal, amelyek a következőképpen foglalhatók öszsze:
(1) ADP-ribóz-transzferáz aktivitás EF-2-η (ahol EF-2 az elongation factor 2 angol kifejezés rövidítése), (2) nem kapcsolódik sejt receptorokhoz, és önmagában nem citotoxikus.
Ha a fenti két feltétel teljesül, a találmány szerinti értelmezésben az A fragmentum felöleli azokat a nem toxikus proteineket, amelyeket egy mutáns termel, így például CRM 30 és CRM 45 proteineket, amelyeket a Crynebacterium diphteriae mutánsa, így a C7 (β 30) és C-j (β 47) termeli, és azokat a fragmentumokat is, amelyekhez úgy jutunk, hogy mérsékelt körülmények között tripszinnel reagáltatunk proteineket, redukálószer, így egy tiol-reagens jelenlétében.
Az így kapott A fragmentumot használjuk fel a találmány szerinti tumorellenes hatású protein hibrid előállítására, változatlan formában, minden további kezelés nélkül, ha legalább egy tiol-gyököt tartalmaz,, vagy tiol-gyökének S-szu!fo-gyökké alakítása után, szulfit-ionokkal végzett kezeléssel. Ha a fragmentum egy diszulfid kötést tartalmaz, előzetesen olyen fragmentummá alakítjuk, amely legalább egy tiol-gyököt és/vagy S-szulfo-gyököt tartalmaz, a diszulfid kötés ismert módon végzett felhasításával.
A találmány szerinti eljárásban A fragmentumként különösen előnyösen alkalmazható egy olyan fragmentum, amely egy tiol-gyököt vagy S-szulfo-gyököt tartalmaz molekulájában.
Az EF-2-η kifejtett ADP-ribóz transzferáz aktivitást a következőképpen definiáljuk.
Az EF-2 protein elongációs faktor, amely a sejtek protein szintézisével áll kapcsolatban, és a diftéria toxin A fragmentuma dezaktiválja az EF-2-t, katalitikusán elősegítve az EF-2 és nikotin-amid-adenin-dinukleotid (NAD) alábbi reakcióját:
EF-2*NAD -> (ADP ribóz)-(EF-2)’-nikotin-amid+H+ Azt a tulajdonságot, hogy egy anyag képes elősegíteni ezt a reakciót, az EF-2-re gyakorolt ADP-ribóz transzferáz aktivitásnak nevezzük.
Az EF-2-re gyakorolt ADP-ribóz transzferáz aktivitás a protein szintézis ellen hat, és az állatokra gyakorolt letális toxicitás egyik okozója, azonban ahhoz, hogy a diftéria toxin A fragmentuma kifejtse ezt az ADP-ribóz-transzferáz aktivitást az EF-2-re, szükség van a B fragmentumra is, amely képes a sejt receptorokhoz kapcsolódni, mert csak így juthat .be az A fragmentum a sejtbe és fejtheti ki citotoxikus hatását. Az A fragmentum egyedül nem vezet az állatok elhullásához.
A találmány szerint, ha a tumorellenes immunoglobulin Fab fragmentumát, amely legalább egy tiol-gyököt és/vagy S-szulfo-gyököt tartalmaz, közvetlenül a diftéria toxin A fragmentumával reagáltatjuk, amely legalább egy tiol-gyököt és/vagy S-szulfo-gyököt tartalmaz, a később részletezésre kerülő reakciókörülmények között egy (I») általános képletű Fab-St-S3FA (I) .
tumorellenes protein Iiibridet kapunk, amely megfelel egy olyan (I) általános képletű protein hibridnek, amelynek képletében n = 0. A képletben Fab, FA, Sj és S2 a korábban, az (I) általános képlettel kapcsolatban megadott jelentésű. Egyszerű előállíthatósága miatt különösen előnyös a (II) általános képletű
Fab<S,-S2-FA) (II) protein hibrid, ahol Fab, FA,^2 és S2 a fenti jelentésű, míg p jelentése 1 vagy 2, mely azonban nem képezi a találmány tárgyát, ha p jelentése 2.
A találmány szerinti protein hibridben az X-el jelölt kétvegyértékű szerves gyök η = 1 esetben egy olyan térhálósító reagensből származó szerves gyök, amely legalább két funkciós csoportot tartalmaz, és egy toluollal reagálva alkalmas egy szulfit-kötés (-S-) létrehozására. Ilyen térhálósító reagens például a (III) általános képletű bisz-meleinimid-szerkezetű molekula, -halogénkarbonil-vegyület, ahol Y jelentése feniléncsoport.
Hasonló, a találmány oltalmi körébe nem tartozó protein hibridek hozhatók létre olyan (III) általános képletű térhálósító szerekkel, amelyek képletében Y jelentése 4,4-bisz(karbonil-amino)-azobenzol vagy -CH2 Ό-CHj - képletű csoport, vagy olyan (IV) általános képletű bisz-halogén-karbonil-származékokkal, amelyek képletében Z jelentése -NH-(CH2)_-NHképletű csoport, ahol m értéke 2—15, Xj és X2 azonos vagy különböző, és jelentése bróm- vagy jódatom.
A (III) általános képletű bisz-maleinimid-származékok például a követkc/.ύ vegyületek: N,N’-(l,2-fenilén)-dimafeinimid, N,N’-(1,3-fenilén)-dimaIeinimid,
N, N’-(l,4-fenilén)-dimaleimid, 4,4 -bisz-(maleoil-amino)-azobenzol, és bisz(N-maleinimid-metil)-éter.
A (IV) általános képletű bisz-halogénkarbonil-vegyületek például a következők: N,N-a!kilén-bisz (bróm-acetamid) és N,N’-alkilén-bisz,(jód-acetamid) (ahol az alkilén-gyök 2-15 szénatomos).
A három funkciós csoportot tartalmazó térhálósító reagensek közé tartozik például az 1,2,4-trisz(maleoil-amino)-benzol és az l,3,5-bisz(maleoil-amino)-benzol
A találmány szerint a tumorellenes hatású protein hibrid a következő módszerekkel állítható elő.
(1) Az egyik lehetőség, hogy egy Fab fragmentumot, amely legalább egy S-szulfo-gyököt tartalmaz, reagáltatunk egy A fragmentummal, amely legalább egy tiol-gyöKöt tartalmaz, vagy egy legalább egy tiolgyököt tartalmazó Fab fragmentumot reagáltatunk egy legalább egy S-szulfo-gyököt tartalmazó A fragmentummal.
Ennél a módszernél az A fragmentumot előnyösen
O, 3-3 mól mennyiségben használjuk a Fab fragmenSum egy móljára számítva. A reagáltatást úgy végeztetjük, hogy a Fab fragmentumot és az A fragmentumot 6-10 pH-értékű puffer-oldatban elkeverjük, úgy, togy a teljes protein koncentráció 0,5-100 mg/ml, Inég előnyösebben 1-20 mg/ml legyen, és az elegyet 0-60 °C-on állni hagyjuk, vagy a reakcióeleggyel azonos pH-értékű puffer elegybe dializáljuk. A reakcióidő 4 óra és három nap között van, a reakciókörülményektől és az előállítás volumenétől függően. Az így kapott hibrid szokásos módon különíthető el a reakcióelegyből és tisztítható, például dialízissel vagy kromatográfiás oszlopon vagy molekula szűrőn.
A fenti módszer szerint a reakció igen mérsékelt körülmények között simán lezajlik, és igen nagytisztaságü hibridet kapunk. A módszer lehetővé teszi a Fab és A fragmentumokból felépülő hibrid szelektív kialakítását, szemben a Fab fragmentumok egymáshoz kapcsolódásából, illetve az A fragmentumok egymáshoz kapcsolódásából kialakult hibridekkel, amelyeket diszulfid kötések kapcsolnak össze.
(2) Egy másik módszer szerint egy legalább egy tiol-gyököt tartalmazó Fab fragmentumot egy legalább egy tiol-gyököt tartalmazó A fragmentummal kapcsolunk össze, bármely korábban ismertetett (III) vagy (IV) általános képletű térhálósító reagens segítségével.
A reagáltatást úgy végezhetjük, hogy három Fab fragmentumot, a térhálósító szert és az A fragmentumot egyidejűleg érintkezésbe hozzuk egymással, előnyösen azonban úgy állítjuk elő a protein· hibridet, hogy az A fragmentumot a Fab-fragmentum és a térhálósító reagens megelőző reakciójának termékével reagáltatjuk. Úgy is eljárhatunk, hogy a Fab fragmentumot az A fragmentum és a tárhálósító szert reakciójának termékével reagáltatjuk. Az első esetben előnyösen 0,8—6 mól térhálósító reagenst, illetve A fragmentumot használunk 1 mól Fab fragmentumra. Az utóbbi esetben előnyösen 0,8-3 mól térhálósító szert és 0,2-3 mól Fab fragmentumot használunk 1 mól A fragmentumra. A reagáltatást 0 és 60 °C hőmérsékletei. kezdjük. A térhálósító reagenst keverés közben, kis mennyiségű oldószerben, például N,N-dimetil-formamidban, dimetil-szulfoxidban, 1,2-dimetoxi-etánban, metanolban, etanolban, acetonban feloldva adagoljuk a Fab fragmentum oldatához. A pufferelés 6-10-re történik. A protein koncentráció előnyösen 0,5—100 mg/ml, vagy még előnyösebben 1-20 mg/ml. A térhálósítószer feleslege például dialízissel, oszlop kromatográfiában vagy molekulaszitával távolítható el. Ezután egy másik fragmentum oldatot 6-10-re pufferelünk (a protein koncentráció előnyösen a fent megadott), és ennek segítségével 0-60 °C-on folytatjuk a reagáltatást. A kapott protein hibrid elkülönítése a reagkcióelegyből és tisztítása szokásos módszerekkel, például oszlop kromatográfiásan vagy molekulaszitával történhet.
(3) további lehetőség, hogy egy legalább egy tiol-gyököt tartalmazó tumorellenes immunoglobulin Fab fragmentumát és egy legalább egy tiol-gyököt tartalmazó diftéria toxin A fragmentumát együttesen oxidáljuk úgy, hogy diszulfid kötéssel kössük össze őket. Az oxidálást végezhetjük a levegő oxigénjével vagy o-jód-benzoesavval vagy o-fenantrolinnal és rézSZulfáttal, (4) úgy is eljárhatunk, hogy akár Fab, akár az A fragmentumot először az 5,5 -ditio-bisz(2-nitro-benzocsavval) (Éllman reagens), 2,2 -dipiridil-diszulfiddal. 4,4 -dipiridil-diszulfiddal vagy tetrationáttal reagáltatjuk, és a kapott reakcióterméket reagáltatjuk a másik (A vagy Fab) fragmentummal.
Különösen előnyösek az (1) és (2) eljárások.
A találmány szerint előállított tumorellenes protein hibrid egyik molekularésze lényegében az A fragmentumnak felel meg, amely toxikus a daganatsejlekkel szemben míg másik molekularésze lényegében Fab fragmentummal azonos, amely specifikusan felismeri a daganatsejteket és olyan speciális hordozóként működik, amely az A fragmentumot a daganatsejtekben irányítja és lehetővé teszi az A fragmentum behatolását a sejtekbe. E tulajdonságok összessége folytán a találmány szerint előállított protein hibrid kiváló jellemzőkkel rendelkezik. Ezek a következők:
1) Miután a találmány szerinti hibrid nem tartalmazza az immunoglobulin Fc részét, elkerülhető az Fc részen keresztül történő kötődés sejtmembránban található Fc receptorokhoz és ennek következtében lehetővé válik az ellenanyaghatás szelektív érvényesítése.
2) Ismert, hogy ha egy xenogén immunoglobulint használunk, az Fc rész mutatja a legerősebb antigén hatást. A találmány szerinti hibrid esetében, miután nem tartalmaz Fc részt, a xenogén immunoglobulin antigén hatása jelentősen csökken.
3) Ismert, hogy a diftéria toxinnak a B fragmentuma képes a sejtek (normál és daganatsejtek) receptoraihoz kapcsolódni, és az A fragmentum, a B fragmentum kapcsolódása révén juthat el a sejthártyába, és csak így fejheti ki citotoxicitását. Miután a találmány szerinti protein hibrid nem tartalmazza a B fragmentumot, nem fejt ki citotoxikus hatás az egészséges sejtekre. Ezen kívül, miután nincs jelen a B fragmentum, a diftéria toxinhoz hasonlítva az antigén hatás is csökken.
4) a találmány szerinti hibrid egy lényegében a Fab fragmentumnak megfelelő molekularészt tartalmaz, amelyet egy tumorellenes immunoglobulinból állíthatunk elő, ez a molekularész pedig specifikusan felismeri a daganatsejteket, és ezáltal lehetővé teszi, hogy az A molekularész kizárólag a daganatsejtekre hasson. Az így sepcifikusan ható A fragmentum igen nagyfokú citotoxicitást mutat a daganatsejtekkel szemben.
Találmányunk további részleteit a következő példákkal szemléltetjük. A példákban hivatkozott két mérést, nevezetesen az EF-2-re gyakorolt ADP-ribóz-transzferáz aktivitás mérését, illetve a Fab’ fragmentum koncentrációjának meghatározását egyszeri gyök immunodiffúziós módszerrel a következőképpen hajtottuk végre.
Az EF-2-re gykorolt ADP-ribóz-transzferáz aktivitás
Az EF-2-t patkány máj homogenizátumból különítettük el, és centrifugálással (12000 g, felülúszó frakció 20 perc után), ammónium-szulfát frakcionálással (40%-os telítettségű felülúszó és 60%-os telítettségű csapadék) és DEAE Sephadex oszlopon végzett kromatografálással (10 mmólos TRIS HC1 és 50 mmól kálium-klorid elegyével és 2 merkapto-etanol 1 mólos oldatával kiegyenlítve /pH = 7,6/) részlegesen tisztítva használtuk fel.
0,5 mól TRIS HC1, 20 mmól ditio-treitol (képlete: HSCHjíCHOHjjCHjSH) és 2 mmól etilén-diamin-tetraecetsav 0,1 mólos vizes oldatához (pH = 7,6) 80 junól EF-2-t, 45 mmól 14C- izotóppal jelzett NAD'-t (6550 cpm) és 30 μΐ vizsgálati mintát (amelyet úgy készítettünk, hogy az oszlopkromatografálással kapott frakciók mindegyikét 10—100-szorosra hígítottuk) adtunk, és az elegyet 10 percen át 37 °C. on tartottuk. Közvetlenül a reagáltatás befejezése után 0,5 ml 5%-os triklór-ecetsavat adtunk a reakcióelegyhez jégfürdőn végzett hűtés közben, és a kivált csapadékot/savban oldhatatlan/összegyűjtöttük egy 0,45 μ-os Millipore szűrőn. Az így kapott csapadék (savban oldhatatlan) radioaktivitását folyadék szcin-51 tillációs számlálóval mértük, hogy meghatározzuk, hogy a vizsgált minta mennyire segíti elő az EF-2-re gyakorolt ADP-ribóz transzferáz aktivitásként jelölt, korábban részletezett reakciót. (A csapadék radioaktivitásának erőssége arányos a dezaktivált EF-2 menynyiségével.) A kiértékeléshez előzetesen kalibrációs görbét készítettünk:
EF-2-NAD* -» (ADP ribóz)-(EF-2>nikotin-amid*H+ savban oldhatatlan
A FAB fragment koncentrációjának meghatározása egyszeri gyök immundiffúzióval A Sephadex kromatográfiás oszlopról nyert frakciók 50 jul-nyi mennyiségéhez ditio-treitolt adtunk olyan mennyiségben, hogy koncentrációja 20 mmól legyen. A redukciót 37 °C-on, 30 percen át hajtottuk végre (annak érdekében, hogy a diszulfid kötés két tiol-gyökre hasadjon). Ezután jód-acetamidot adtunk egy elegyhez olyan mennyiségben, hogy koncentrációja 50 mmól legyen, és a reagáltatást 20 °C-on, 30 percen keresztül folytattuk (a tiol-gyököket védtük). Az így előkezelt minta oldatát kecske nyúl-ellenes IgG szérumot tartalmazó agarra helyeztük és két napon keresztül állni hagytuk. Az antigén-ellenanyag reakció következtében kialakult csapadék gyűrű átmérőjét meghatároztuk és a Fab’ fragmentum koncentrációját egy előzőleg felvett kalibáricós görbe segítségével határoztuk meg. A 3—9, példák esetében azonban nem végeztünk előkezelést, és vizsgálati mintaként a kromatográfiás frakciók 50 μΐ-es mennyiségeit használtuk. Ezekben az esetekben nehezen lehet pontos kvantitatív eredményekhez jutni, de a kapott Kvalitatív adatok kielégítőek,
1. példa (a) A tumorellenes immunoglobulin Fab’ fragmentumok előállítása
DBA/2Cr egerek hasvízéből L 1210 egér leukémia sejteket különítettünk el, amelyeket fokozatosan transzplantáltunk az egerekbe. 106 ilyen sejtből és Freund-fé]e teljes adjuvánsból (immuno adjuváns) készült emulziót intravénásán nyúlba injektáltunk Ezután az adjuvánssal együtt 10® L 1210 sejtet Injektáltunk szubkután úton, egy héten keresztül három alkalommal, és az adagolás befejezése után hét nappal és tíz nappal vért vettünk a kezelt nyúltok Az így kapott vérmintákat egyesítettünk, majd az egyesített mintából elkülönítettük a szérumot, és 56 °C-on 30 percen át ínaktiváltuk. Az így kapott szérum (anti L 1210 szérum) 200 ml-éhez 200 ml telített vizes ammónium-szulfát oldatot adtunk 4 °C hőmérsékleten, és a kivált csapadékot (anti L 1210 immunoglibulin) centrifugálással elkülönítettük. Az így kapott csapadékot feloldottuk 50 ml 0,01 mólos foszfát-puffer (pH = 7,6) oldatban és ugyanebbe a puffer oldatba történő dialízissel tisztítottuk. így az anti-L 1210 immunoglobulin oldatához jutottunk. Az oldatot felvittük egy DEAE cellulóz kromatográfiás oszlopra (hosszúság: 94 cm, szélesség: 3 cm), amelyet ugyanezzel a foszfát-puffer oldattal egyenlítettünk ki. így olyan oldatot kaptunk, amely nem-adszorbeált frakcióként IgG-t tartalmazott. A kapott anti-L 1210 IgG oldat (30 mg/ml) 40 ml-nyi mennyiségéhez, amelyet a kromatografálással kapott oldat 0,1 mólos acetát pufferbe (pH = 4,5) dializálva kaptunk, 24 ml peps/int adtunk. A pepszin emésztést 37 °C-on, körülbelül 18 órán keresztül végeztük, majd a kapott terméket felvittük egy 140 cm hosszú 3,5 cm átmérőjű,
Sephadex G200 kromatográfiás oszlopra. A körülbelül 100 000 molekulasúlyú proteint telített vizes konyhasó-oldat segítségével eluáltuk. Az elektroforézises vizsgálatok (nátrium-dodecil-szulfáttal) azt igazolták, hogy, ez tisztán a Fab’ fragmentum dimerje volt. A Fab fragmentum dimerjének izotóniás nátrium-klorid oldatát 0,01 mólos TRIS.HC1-O,14 mólos nátrium-klorid — 2 mmólos etiléndiamin-tetraecetsav elegy vizes oldatába (pH - 8,3) dializáltuk, majd a kapott termék (7,3 mg/ml% 2,0 ml-éhez 0,04 ml 100 mmólos 2-merkapto-etanolt adtunk. A 2-merkapto-etanollal végzett redukciót 37 °C-on egy órán keresztül hajtottuk végre, majd a kis molekulasúlyú anyagot telített vizes konyhasó oldatba dializálva különítettük el. Az L 1210 tumorellenes immunoglobulin Fab’ fragmentumának oldatát kaptuk, ahol a fragmentum egy tiol-gyököt tartalmazott (vagy egy a hajlatban elhelyezkedő diszulfid kötésből származó tiol-gyököt).
(b) A diftéría toxin A fragmentumának előállítása
18,5 ml vizes (pH = 8,3) 0,05 mólos TRIS.Hcl és 2 mmólos etilén-diamin-tetraecetsav oldathoz, amely 210 mg diftéría toxint tartalmazott, hozzáadtunk 0,15 ml 0,1 mg/ml koncentrációjú tripszin-oldatot. Az emésztést 25 “C, 50 percen át folytattuk. Ezután a reakció leállítása céljából 0,3 ml, 0,5 ml/ml koncentrációjú szójabab tripszin inhibitor oldatot adtunk hozzá. A kapott termékhez karbamidot (végkoncentráció 6 mól), nátrium-szulfátot (végkoncentráció 0,168 mól) és nátrium-tetrationátot (végkoncentráció 0,041 mól) adtunk, és az elegyet 37 °C-on, órán keresztül S-szulfonáló bomlásnak vetettük alá. A kapott oldatot felvittük Sephadex G 150 (112 cm hosszú, 3,5 cm átmérőjű) kromatográfiás oszlopra, amelyet 6 mólos karbamis és 0,03 mólos ecetsav oldat elegyéből készített, 5,3 pH-értékű puffer oldattal kezeltünk. Az A fragmentumot tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük. A frakciókat desztillált vízbe dializálva a tiszta A fragmentumhoz jutottunk (amely egy S-szulfo gyököt tartalmazott).
(c) Tumorellenes protein hibrid előállítása
Az anti-L 1210 immunoglobulin IgG (a) lépésben leírt módon előállított Fab’ fragmentumának 7,3 mgnyi mennyiségét tartalmazó 2,5 ml vizes oldatot elkevertük az diftéría toxin (b) lépésben előállított A fragmentumának (amely egy S-szulfo gyököt tartalmaz) 4,0 mg-nyi mennyiségével. A kapott oldatot 4 °C-on, napon keresztül 1 liter 0,05 mól glicin-puffert,0,10 mól nátrium-kloridot és 2 mmól etilén-diamin-tetraecetsavat tartalmazó, 9,15 pH-értékű vizes oldatba dializáltuk, hogy a Fab’ fragmentumot összekapcsoljuk az A fragmentummal. A kapott terméket felvittük egy 93 cm hosszú, 1,6 cm átmérőjű Sephandex 0,150 kromatográfiás oszlopra, amelyet 5 mmól foszfát-puffért és 0,154 mól nátrium-kloridot tartalmaz, 7,0 pH-értékű vizes oldattal eluáltuk. 60, egyenként
2,1 ml-es frakciót gyűjtöttünk. A 280 mp hullámhosszon mutatott abszorpciót minden frakció esetében meghatároztuk, hogy megállapítsuk a protein koncentrációját. A kapott eredményeket a 3. ábrán ábrázoltuk. Amint a 3. ábráról világosan látható, a protein eluálási diagramja négy csúcsot mutatott, amelyeket 1, 2, 3 illetve 4 csúcsként jelöltünk, a molekulasúly szerint növekvő sorrendben.
Megmértük az egyes csúcsoknak megfelelő frakciók ADP-ribóz-transzferáz aktivitását EF-2-vei szemben. A kapott eredményeket szintén a 3, ábra mutat6
184.736 ja. A csúcsoknak megfelelő frakciók kecske anti-nyúl IgG anyaggal szemben mutatott antigén-ellenanyag reakcióját is mértük, hogy meghatározzuk a Fab’ fragmentum koncentrációját a csúcsoknak megfelelő frakciókban. A kapott eredményeket a 3. ábrán a szaggatott-pontozott vonal mutatja.
A 3. ábrából a következő következtetés vonható íe.
Az 1. csúcsnak megfelelő, legnagyobb molekulasúlyú protein nem mutat ADP-ribóz-transzferáz aktivitást EF-2-vel szemben, és csak a Fab’ fragmentumot tartalmazza, következésképpen feltehetően ez a csúcs felel meg a Fab’ fragmentum dimerjének. A 2. csúcsnak megfelelő protein rendelkezik transzferáz aktivitással, és szintén tartalmaz Fab fragmentumot, ennek alapján feltehetőleg ez a csúcs felel meg a Fab fragmentum és az A fragmentum reakciótermékének. A 4. csúcsnak megfelelő protein egy csupán Fab fragmentumot tartalmazó protein és egy Fab’ fragmentumot nem tartalmazó protein elegyéből áll, transzferáz aktivitással rendelkezik, ezért feltehetően a Fab fragmentum és az A fragmentum dimerjének elegye. A 4. csúcsnak megfelelő protein, amely a legkisebb molekulasúlyú, nem tartalmaz Fab’ fragmentumot, de rendelkezik transzferáz aktivitással, ennek .következtében feltételezhető, hogy az A fragmentummal azonos.
E feltételezéseket támogatták a nátrium-dodecil-szulfát elektroforézises vizsgálatok, amelyek során a 2. csúcsnak megfelelő dimer (a 37. vagy 38. frakció), az A fragmentum dimerje, a Fab’ fragmentum és az A framentum mozgékonyságát vizsgáltuk. A 4. ábrán a 2. csúcsnak megfelelő F(ab'j) protein, az A fragmentum dimere, a Fab’ és az A fragmentum mozgékonyságát mutatjuk be, a kisebb mozgékonyság vagy a növekvő molekulasúly sorrendjében. Ez a sorrend megfelelő az 1., 2., 3. és 4. csúcsok sorrendjének, azaz a 3. ábrán követett sorrendnek.
A 4. ábrán látható, hogy a 2. csúcsnak megfelelő protein molekulasúlya körülbelül 7-szer 104, ami jól megfelel a Fab’ fragmentum körülbelül 46 000 és az A fragmentum körülbelül 24 000 molekulasúlya őszszegének. Ez igazolja, hogy a 2. csúcsnak megfelelő protein a találmány szerinti protein hibrid, amely egy diszulfid-kötéssel összekötött Fab’ és A fragmentumból épül fel.
(d) A tumorellenes protein hibrid citotoxicitásának mérése 1. lépés
A korábban említett 2. csúcsnak megfelelő 37. és 38. frakciók elegyítésével vizes oldatot készítettünk úgy, hogy az a protein hibridet 0,84 mg/ml koncentrációban tartalmazza. Az oldat arra szolgált, hogy segítségével meghatározzuk a találmány szerinti protein hibrid citotoxicitását L 1210 egér leukémia sejtekkel szemben.
Ötször 10* L 1210 sejtet RPMI 1640 táptalajban (10% magzati boíjú szérumot, 20 pmól 2-merkapto-etanolt és 100 Mg/ml kanamicin-szulfátot tartalmaz) szuszpendálva folyékony kultúrát állítottunk elő. Ugyanezt a folyékony kultúrát öt elkülönített edényben elkészítettük, és az elegyet 37 °C-on 5% COj-ot tartalmazó levegőn 42 órán át inkubáltuk úgy, hogy az egyik adaghoz semmit sem adtunk, a másik adaghoz diftéria toxint adtunk, míg a fennmaradó három adaghoz a találmány szerinti, a (c) lépés szerint elő10 állított protein hibridet adtuk.
A tenyésztés befejeztével az egyes adagokban levő sejteket Trypan Blue festéssel megszíneztük. Miután így megfestettük a halott sejteket, mikroszkóppal megtudtuk számolni az élő sejtek számát. A kapott eredményeket az 1. táblázatban foglaltuk össze:
az élő L 1210 sejtek száma 42 órás inkubálás után (%) nem kezelt 8xl0s(100) diftéria toxin 5 x 105 (63) jug/ml tumorellenes 0,5 x 10s (6,3) protein hibrid
0,5 Mg/ml tumorellenes 0,03 x 1OS (0,4) protein hibrid jug/ml tumorellenes <0,01 x 10s (< 0,1) protein hibrid
Mg/ml
Az 1. táblázatból világosan látható, hogy a kezdeti 5 x 104 sejtszám jelentősen nőtt (8-szor 105-re),haa folyékony kultúrához semmit nem adtunk, ugyanígy jelentős volt a növekedés (5-ször 10s -re), ha diftéria toxint adagoltunk, míg a sejtek száma lényegesen csökkent, ha a találmány szerinti protein hibridet adtuk a kultúrához (1000-nél kisebb sejtszám mérése nem lehetséges). Ismert, hogy az egérsejtek nem érzékenyek diftéria toxinra.
2. lépés
A minták citotoxicitásának mérésére ugyanazt a módszert alkalmaztuk, mint az 1. lépésben 2 x 10* L 1210 egér leukémia sejtet tenyésztettünk 48 órán keresztül RPMI 1640 táptalajon, amely 10% magzati borjúk szérumát, 20 mmól 2-merkapto-etanolt és 100 Mg/ml koncentrációban kanamicin-szulfátot tartalmazott. A tenyészethez különböző, a 2. táblázatban megadott mintákat adtunk. Az összehasonlítás kedvéért olyan rendszerben is tenyésztettünk L 1210 sejteket, amelyhez nem adtunk további anyagot (kezeletlen), majd 42 óra elteltével meghatároztuk az élő sejtek számát. A kapott eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze:
koncentrá- Az élő L 1210 sejtek ció Mg/ml száma 42 órás inkubálás után (%) kezeletlen diftéria toxin 40,000
Fab’ 34,000
A fragmentum 18,000
Fab’ + A fragmentum 51,000 mólarány 1:1 5,600 tumorellenes protein hibrid protein 51,000 hibrid protein 5,100 hibrid protein 0,560 hibrid protein 0,056
3,07 x 105 (100)
1,71 x 105 (56) 1,07 x 10s (35) 1,50 x 10s (49)
1,43 x 10s (47) 2,00 x 10’ (65) <0,01 x 10’ (<03) <0,01 x 10s (<0,3)
0,17 x 10* (5,5)
1,60 x 10’ (52)
Azokban az esetekben, amelyekben a találmány szerinti tumor-ellenes protein hibridet adtuk a tenyészethez, mégha csak 0,56 Mg/ml koncentrációban is, az élő sejtek száma lényegesen lecsökkent, a fenti koncentrációnál 1,7-szer 10*-re, ami a kontrolinál mért értéknek csupán 5,5%-a. Ha a hibrid koncentrációja 5,1 Mg/ml volt, az élősejtek száma kisebb volt, mint ]03, azaz kisebb, mint a kontroll 0,3%-a, Ha a szám kisebb, mint 103, nincs lehetőség az összeszámlálásra. Amint a 2. táblázat adatai mutatják, sem a Fab’ fragmentum, sem az A fragmentum esetében nem volt megfigyelhető ilyen erős fitotoxicitás. Ugyanígy a Fab fragmentum és az A fragmentum ekvimoláris oldatainak elegye is alig fejtett ki hatást az élő sejtek számára, a kontrollal összehasonlítva. Ez azt mutatja, hogy a tumorellenes protein hibrid citotoxicitása nem a Fab’ és az A fragmentum egyszerű együttes hatásának tulajdonítható.
3. lépés
DBA/2 Cr egerekbe hármas csoportokbanintraperitoneálisan 1-szer 104 L 1210 sejtet inokuáltunk. A következő napon a (c) lépésben leírt módon előállított tumorellenes protein hibrid előre meghatározott dózisát adagoltuk intraperitoneálisan, hogy megvizsgáljuk hatását az élettartamra. Az egerek kontroll csoportjának nem adtunk tumorellenes proteinhibridet. A kapott ereaményeket a 3. táblázatban foglaltuk össze, dózis μ/egér túlélési idő (%)
30,0 . 142
6,0 138
1,2 125 kontroll* 100 x valamennyi a kontroll csoportba tartozó egér 8 napon belül elpusztult.
A 3. táblázat adataiból világosan látható, hogy az 1, 2, 6 és 30 pg/egér dózisban tumorellenes protein hibriddel kezelt egerek a kontroll csoporttal összehasonlítva (100%), 125,138 és 142% túlélést mutattak, ami jelentős élettartam meghosszabodásnak fogadható el.
Miután a (c) lépésben használt anti-L 1210 immunoglobulin nem abszorbeálódott az egerek egészséges sejtjein, tartalmaz egy olyan ellenanyagot, amely felismeri az egerek egészséges sejtjeit. így a toxicítás az egér gazdaállatokra is kifejtette hatását, és ezért a túlélés még akkor is csak 142%-ra növekedett, ha az egereket tumorellenes protein hibriddel kezeltük. Világos, hogy ha lejátszódna a fentemlített abszorpció, a találmány szerinti tumorellenes protein hibrid megnövekedett szelektív toxicítást mutatna a daganatsejtekkel szemben, és így javulna a gyógyhatás. Ha az anti-L 1210 ellenanyag adszorbedálódik a daganatsejteken vagy daganat antigéneken, a daganat-specifikus ellenanyag mennyisége nőhet, azonban, miután ez a folyamat nem lépett fel a mintában, feltételezzük, hogy az (a) lépésben kapott immunoglobulinban a daganat-specifikus ellenanyag mennyisége 1%-náI kisebb volt. Ennek megfelelően nyilvánvaló, hogy ha az említett adszorpciós eljárással több daganat-specifikus ellenanyagot tartalmazó immunoglobulint állítunk elő, és ezt használjuk a tumorellenes protein hibrid felhasználásához, kisebb dózissal nagyobb gyógyhatás érhető el.
2. példa (a) A tumorellenes immunoglobulín Fab’fragmentumának előállítása ml vizes konyhasó-oldathoz, amely 29 mg az 1. példa (a) lépése szerint előállított, L 1210 egér leukémia elleni nyúl ellenanyag (immunoglobulín IgG) Fab’ dirpeijét tartalmazta, 21 mg nátrium-szulfitot és 13 mg Áátrium-tetrationátot adtunk, majd az elegyet 37 °C-on, egy órán keresztül S-szulfonatív hasításnak vetettük alá. így egy S-szulfo-csoportot tartalmazó Fab’ fragmentumot kaptunk, amely mellől a reagenseket dialízissel távolítottuk el.
(b) A diftéria toxin A fragmentumának előállítása
Az 1. példa (b) lépésben kapott egy szulfo gyököt tartalmazó diftéria toxin A fragmentum oldatának dialízisével előállított 4,8 mg/ml koncentrációjú A fragmentum oldat 1 ml-nyi mennyiségéhez 0,05 ml 0,5 mólos vizes 2-merkapto-etanolt adtunk. Az A fragmentum előállításánál a dialízist 0,01 mól TRIS. HcCl 0,14 mól nátrium-klorid és 2 mmól etilén-dia min-tetraecetsav 9,3 pH-értékű vizes oldatával szemben végeztük. Az elegyet 37 °C-on egy órán át redukáltuk. Ezután a 2-merkapto-etanolt dialízissel eltávolítottuk és így elkülönítettük az egy tiol-gyököt tartalmazó A fragmentumot.
(c) 2 ml vizes oldatot állítottunkelő, amely 5,8 mg az (a) lépés szerint előállított Fab’ fragmentumot és
3,2 mg a (b) lépés szerint előállított A fragmentumot tartalmazott. A kapott oldatot 4 °C-on három napon át dializáltuk 0,05 mól glicin-puffer, 0,10 mól nátrium-klorid és 2 mmól etilén-diamin-tetraeacetát 9,15 pH-értékű vizes oldatának 1 liternyi mennyiségével szemben, hogy összekapcsoljuk a két fragmentumot. A reagáltatást követően az 1. példa szerint jártunk el, és így olyan protein hibridhez jutottunk, amelyben az A és Fab’ fragmentum egy diszulfid-kötés köti össze.
3. példa (a) Tumorellenes protein hibrid előállítása mmól acetát puffer, 0,14 mól nátrium-klorid és 1 mmól etilén-diamín-tetraecetsav 5,5 pH-értékű vizes oldatának 1 ml-éhez, amely 36,8 mg, egy tiol-gyököt tartalmazó, az 1. példa (a) lépése szerint előállított anti-L 1210 immunoglobulín Fab ’ fragmentumot tartalmazott, hozzáadtuk -fenilén-dimaleimid (PDM) Ν,Ν-dimetil-formamiddal készült, 20 mmólos oldatának JD,05 ml-nyi mennyiségét. Az elegyet 30 percen át 30 °C-on tartottuk. Ezután a reakcióelegyet 35 cm magas, 0,7 cm átmérőjű Sphadex G25 oszlopon gélszűrésnek vetettük alá, a reagensek eltávolítására 5 mmól ecetsav puffer, 0,14 mól nátrium-klorid és 1 mmól etilén-diamin-tetraecetsav (pH 5,5) elegyét használva.
A diftéria toxin egy tiol gyököt tartalmazó A fragmentumának, a 2. példa (b) lépése szerint állítottunk elő, 2,15 mg/ml koncentrációjú vizes oldatából 1,0 ml-t hozzáadtunk az anti-L 1210 immunoglobulín PDM maradékát tartalmazó Fab’ fragmentum 4,29 mg/ml koncentrációjú vizes oldatának 1,04 ml-nyi mennyiségéhez, majd az elegyet egy éjszakán át 4 °C-on tartottuk. A reakcióelegyet ezután felvittük 93 cm hosszú, 1,6 cm átmérőjű Sphadex G150 superftne kromatográfiás oszlopra, az eluálást pedig 0,9%os vizes nátrium-klorid oldattal végeztük. A 38—42. frakciók összegyűjtésével olyan oldathoz jutottunk, amely 4,4 mg tumorellenes protein hibridet tartalmazott.
Azt, hogy az említett frakciók valóban tumorellenes protein hibridet tartalmaztak, a következő módon igazoltuk. Az oszlopkromatográfiásan kapott különböző frakciók protein-koncentrációjának meghatározása érdekében megmértük 280 τημ hullámhosszon mutatott abszorpciójukat. Az így felvett görbe három csúcsot tartalmazott, amelyeket sorrendben 1., 2. és 3. csúcsként jelölünk. A görbét az 5. ábra mutatja. A csúcsoknak megfelelő helyeken a proteineket Ouchterlony módszerével analizáltuk, tengeri malac nyúl-ellenes Fab’ ellenanyagát és ló diftéria-ellenes ellenanyagát használva. A kapott eredményeket a 6. ábrán mutatjuk be. Az 1. és 2. csúcsoknak megfelelő proteinke a nyúl-ellenes Fab’ ellenanyaggal csapadékot képeztek, míg az 1. és 3. csúcsoknak megfelelő proteinek a diftériaellenes toxin ellenanyaggal adtak csapadékot. így világos, hogy az 1. csúcs Fab’ és A fragmentumot egyaránt tartalmaz. Az eluálási pontból az is megállapítható, hogy az 1. csúcsnak megfelelő protein molekulasúlya körülbelül 70,000 ami megfelel a Fab fragmentum 46000 körüli és az A fragmentum 24 0000 körüli molekulasúlya összegének. Az eredményekből levonható a következtetés, hogy az 1, csúcsnak megfelelő protein a találmány szerint tuinorellenes hibrid, amely 1 molakula Fab’ fragmentumot és 1 molekula A fragmentumot tartalmaz, amelyeket PDM köt össze. A 2. illetve 3. csúcsokkal jelzett proteinek az el nem reagált Fab’ fragmentumnak és a diftéria toxin el nem reagált A fragmentumának felelnek meg, és lehetnek PDM-mel módosítottak vagy nem módosítottak.
(b) A tumorellenes protein hibrid citotoxicitásának mérése
3-szor 104 L-l 210 egér leukémia sejtet 5% széndioxidot tartalmazó levegőn, 37 °C-on 1, 2, 3 illetve 4 napig tenyésztettünk, 1-1 ml RPMI táptalajban, amely 10% magzati borjúszérumot, 20 μτηόΐ 2-merkapto-etanolt és 100 pg/ml kanamicin-szulfátot tartalmazott. Ezután 30, 6 illetve 1,2 jug/mi végkoncentrációban hozzáadtuk az (a) lépés szerint előállított tumorellenes pritein hibridet. Az összehasonlítás kedvéért olyan táptalajban is tenyésztettünk L-1210 sejteket, amelyhez 20 pg/nil Fab’ fragmentumot és 10 ítg/tnl A fragmentumot adtunk (1:1 mólarányban), a tumorellenes protein hibrid helyett. Kontrollként L-1210 sejteket tenyésztettünk azonos táptalajban, amely sem tumorellenes protein hibridet, sem Fab fragmentumot, sem a diftéria toxin A fragmentumát nem tartalmazta. A tenyésztés befejeztével pipetta segítségével a sejtek egységes szuszpenzióját készítettük el, majd megszíneztük 0,3%-os Trypan Bluefosz.fát puffereit konyhasó-oldattal, és mikroszkóp alatt megszámoltuk az élő sejteket. Az eredményeket a 6. ábrán szemléltetjük.
A 7. ábrából világosan látható, hogy a tumorellencs protein hibrid jelentős citotoxikus hatást fejt ki 30 és 6 jug/ml koncentrációban. A hatás különösen jelentős volt a tenyésztés második napjától kezdve. Másrészt, a Fab’ fragmentum és a diftéria toxin A fragmentuma keveréke esetében (1:1 mólarány) egyáltalán nem lehetett citotoxicitást megfigyelni. Levonható tehát a következtetés, hogy ahhoz, hogy a toxicitás fellépjen, a két fragmentumnak feltétlenül kovalens kötéssel hibriddé kell összekapcsolódnia.
4. példa
A 3. példa szerinti eljárással tumor-ellenes protein hibridet állítottunk elő, amelyben a Fab’fragmentum és az A fragmentum összekapcsolása az N,N’-(1,3-fenilcn)-dimaleinimid térhálósító szer segítségével, a megfelelő kénatomokon keresztül történt. Az N,N -(1,3-fenilén)-dimaleinimidet a 3. példában használt PDM helyett alkalmaztuk.
5. példa
A 3. példa szerinti eljárással tumorellenes protein hibridet állítottunk elő, amelyben a Fab fragmentum és az A fragmentum összekapcsolása a PDM helyett 4,4’-bisz(maleoil-amino)azobenzol térhálósító reagens segítségével történt, a megfelelő kénatomokon keresztül.
6. példa
Az 1. példa (a) lépésben előállított anti-L 1210 immunoglobulin IgG Fab’ fragmentumot, amely egy tiol gyököt tartalmazott, feldoldottuk 3 térfogatrész 0,1 mólos nátrium-foszfát puffer (pH = 6,0) és 1 térfogatrész Ν,Ν-dimetil-formamid elegyében úgy, hogy 7 mg/ml koncentrációjú oldatot kapjunk, N,N -etilén-bisz(jód-acetamid)térhálósító reagenst 6 ml/ml menynyiségben feloldottunk N,N-dimetil-formamidban.
A reagáltatás szobahőmérsékleten, egy órán,át végeztük úgy, hogy a fenti módon előállított Fab -oldat 1,0 ml-éhez 0,1 ml N,N-etilén-bisz(jód-acetamid) oldatot csepegtettünk, majd a reakcióelegyhez 0,05 ml 0,07 mólos vizes 2-merkapto-etil-amin oldatot adtunk. Az elegyet szobahőmérsékleten egy órán át állni hagytuk. Az oldatot Sephadex G25 oszlopon kromatográfiás úton tisztítottuk, az oszlopot pedig 0,1 mólos nátrium-foszfát pufferrel (pH = 6,0) egyenlítettük ki. így a Fab’ fragmentum oldatát kaptuk, amely az N,N -etilén-bisz(jód-acetamid) maradékát is tartalmazta.
A kapott oldathoz a 2. (b) példa szerint előállított A fragmentumot adtuk úgy, hogy az N,N’-etilén-bisz(jód-acetamid) maradékot tartalmazó Fab’ fragmentum és az A fragmentum aránya 1:2 legyen. Ezután a 3. példában leírt módon jártunk el, és így olyan protein hibridet állíotttunk elő, amelyben a Fab fragmentumot és az A fragmentumot az N,N -etilén-bisz(jód-acetamid) tárhálósító reagens segítségével a megfelelő kénatomokon keresztül kapcsoltuk össze. Ez a protein hibrid csaknem ugyanolyan kiváló citotoxicitást mutatott az L-1210-el szemben, mint az 1. példa szerint előállított hibrid.
7. példa
A 6. példa szerinti eljárással tumorellenes protein hibridet állítottunk elő, amelyben a Fab fragmentumot, és az A fragmentumot a 6.,példában használt Ν,Ν -ctilén-bisz(jód-acetamid) térhálósító reagens helyett N,N -hexametilén-bisz(jód-acetamid) térhálósító szer segítségével kapcsoltuk össze egymással, a megfelelő kénatomokon keresztül.
8. példa
A 6. példa szerinti eljárással tumorellenes protein hibridet állítottunk elő, amelyben a Fab fragmentumot, és az A fragmentumot a 6, példában használt Ν,Ν -etilén-biszQód-acetamid) térhálósító reagens helyett N,N’-undexametilén-bisz(jód-acetamid) térhálósító szer segítségével kapcsoltuk össze egymással, a megfelelő kénatomokon keresztül.
9. példa
A 6. példa szerinti eljárással tumorellenes protein hibridet állítottunk elő, amelyben a Fab fragmentumot, és az A fragmentumot a 6. példában használt Ν,Ν -etilén-biszQód-acetamid) tárhálósító reagens helyett bisz(N-maleinimid-metil)-éter térhálósító szerrel kapcsoltuk össze egymással, a megfelelő kénatomo9 kon keresztül.

Claims (1)

  1. Szabadalmi igénypont
    Eljárás az (1) általános képletű Fab-S^^-Sj-FA (I) daganatellenes hatású immunoglobulin-származékok előállítására, a képletben
    Fab egy daganatellenes immunoglobulin Fab fragmentuma,
    FA egy diftéria toxin A fragmentuma,
    X jelentése egy (A), képletű csoport,
    Sj és S3 egyaránt kénatomot jelent, ahol St egy immunoglobulin diszulfid kötéséből származó, S2 pedig egy diftéria toxin diszulfid kötéséből származó kénatom, n értéke 0 vagy 1, azzal jellemezve, hogy
    a) az (I) általános képletű immunoglobulin-származékok szűkebb körébe tartozó (II*) általános képletű
    Fab-Si-Sj-FA (ll) immunoglobulin-származékok előállítására, a képletben Fab, S,, S2 és FA a tárgyi körben megadott jelentésű, egy daganatellenes immunoglobulin a fragmentum5 bán legalább egy S-szulfo-gyököt tartalmazó Fab fragmentumát egy diftéria toxin a fragmentumban legalább egy tiol-gyököt tartalmazó A fragmentumával reagáltatjuk, vagy egy daganatellenes immunoglobulin a fragmentumbán legalább egy tiol-gyököt tartalmazó Fab fragmentumát egy diftéria toxin a fragmentumban legalább egy S-szulfo-gyököt tartalmazó A fragmentumával reagáltatjuk, vagy
    b) az (I) általános képletű daganatellenes immunoglobulin-származékok szűkebb körébe tartozó (I*) < c általános képletű 10 Fab-Si-X-Sj-FA (í') immunoglobulin-származékok előállítására, a képletben Fab, Sj, S2, X és FA a tárgyi körben megadott jelentésű, egy daganatellenes umminoglobulin a fragmentumban legalább egy tiol-gyököt tartalmazó Fab
    20 fragmentumát egy diftéria toxin a fragmentumban legalább egy tiol-gyököt tartalmazó A fragmentumával reagáltatjuk, egy legalább két, a tiol-gyökkel reagálni képes funkciós csoportot tartalmazó térhálósító reagens — előnyösen N.N -fenilén-dimaleinimid — jelenlétében.
HU80851A 1979-04-09 1980-04-09 Process for preparing anticarcinogenic immunoglobuline derivatives HU184736B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP4191979A JPS55136235A (en) 1979-04-09 1979-04-09 Antitumor protein complex and its preparation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU184736B true HU184736B (en) 1984-10-29

Family

ID=12621650

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU80851A HU184736B (en) 1979-04-09 1980-04-09 Process for preparing anticarcinogenic immunoglobuline derivatives

Country Status (9)

Country Link
US (1) US4638049A (hu)
EP (1) EP0017507B1 (hu)
JP (1) JPS55136235A (hu)
AT (1) ATE6937T1 (hu)
AU (1) AU533861B2 (hu)
DE (1) DE3067313D1 (hu)
FI (1) FI801108A (hu)
HU (1) HU184736B (hu)
IL (1) IL59727A (hu)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5616417A (en) * 1979-07-19 1981-02-17 Teijin Ltd Antitumor protein complex and its preparation
JPS5686121A (en) * 1979-12-14 1981-07-13 Teijin Ltd Antitumor proten complex and its preparation
EP0044167A3 (en) * 1980-07-14 1982-04-21 The Regents Of The University Of California Antibody targeted cytotoxic agent
JPS57106625A (en) * 1980-12-22 1982-07-02 Teijin Ltd Cytotoxic protein complex and its preparation
JPS57106626A (en) * 1980-12-22 1982-07-02 Teijin Ltd Cytotoxic protein complex and its preparation
FI820020L (fi) * 1981-01-12 1982-07-13 Lilly Industries Ltd Immunoglobulinkonjugater
SE8102194L (sv) * 1981-04-06 1982-10-07 Pharmacia Ab Terapeutiskt aktiv organisk forening och farmaceutisk beredning innehallande denna
JPS5843926A (ja) * 1981-09-08 1983-03-14 Suntory Ltd 選択性制癌剤
US4664911A (en) * 1983-06-21 1987-05-12 Board Of Regents, University Of Texas System Immunotoxin conjugates employing toxin B chain moieties
US5260203A (en) * 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
JPS63290824A (ja) * 1987-05-22 1988-11-28 Sumitomo Chem Co Ltd ウイルス感染症治療剤
US5241078A (en) * 1988-06-14 1993-08-31 Cetus Oncology Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
EP0527755A4 (en) * 1990-05-07 1995-04-19 Immunomedics Inc Improved method for radiolabeling monovalent antibody fragments
US5612034A (en) * 1990-10-03 1997-03-18 Redcell, Inc. Super-globuling for in vivo extended lifetimes
WO2007106435A2 (en) * 2006-03-10 2007-09-20 University Of California Cleavable vaccines compositions and methods of making and using the same

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4201770A (en) * 1973-05-07 1980-05-06 The Ohio State University Antigenic modification of polypeptides
US4160018A (en) * 1973-06-25 1979-07-03 Bjorklund Knut B Stabilized cancer associated polypeptide antigen and preparation thereof
DE2456224A1 (de) * 1974-11-28 1976-08-12 Karl Dr Med Theurer Verwendung von nativen antikoerpern oder von antikoerper-fragmenten mit kovalent gebundenen oder konjugierten zytostatisch und/bzw. oder zytotoxisch wirkenden substanzen fuer die krebstherapie
IL47372A (en) * 1975-05-27 1979-10-31 Yeda Res & Dev Fab'dimers bound to daunomycin or adriamycin,their preparation and pharmaceutical compositions containing same
US4174385A (en) * 1976-10-08 1979-11-13 Robert Reid Method of identification of surface proteins of cancer cells, clinical test and method of immunization
IT1107772B (it) * 1977-08-22 1985-11-25 Cancer Res Inst Royal Procedimento per la produzione di complessi macromolecolari prodotto ottenuto e composizioni farmaceutiche che lo contengono come ingrediente attivo
JPS54145655A (en) * 1978-05-06 1979-11-14 Asahi Chem Ind Co Ltd Imidate derivative and its salt

Also Published As

Publication number Publication date
ATE6937T1 (de) 1984-04-15
FI801108A (fi) 1980-10-10
US4638049A (en) 1987-01-20
EP0017507B1 (en) 1984-04-04
JPH02328B2 (hu) 1990-01-08
DE3067313D1 (en) 1984-05-10
IL59727A0 (en) 1980-06-30
AU533861B2 (en) 1983-12-15
EP0017507A3 (en) 1981-08-05
EP0017507A2 (en) 1980-10-15
IL59727A (en) 1983-03-31
JPS55136235A (en) 1980-10-23
AU5722880A (en) 1980-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0115171B1 (en) Conjugate having cytotoxicity and process for the preparation thereof
EP0031999B1 (en) Antitumor protein hybrid and process for the preparation thereof
US4350626A (en) Antitumor hybrid and process for the preparation thereof
EP0055575B1 (en) Protein hybrid having cytotoxicity and process for the preparation thereof
EP0112720B1 (en) Conjugate having cytotoxicity and process for the preparation thereof
EP0055115B1 (en) Cytotoxic protein hybrid and process for the preparation thereof
HU184736B (en) Process for preparing anticarcinogenic immunoglobuline derivatives
AU659427B2 (en) Site-specific conjugation of immunoglobulins and detectable labels
CA1209472A (en) Anti-cancer drugs for the treatment of leukaemias t constituted by the chain a of ricin and a specific monoclonal antibody
US5241078A (en) Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
IE52239B1 (en) Conjugates of vindesine with immunoglobulin or fragments thereof
US4357273A (en) Antitumor protein hybrid and process for the preparation thereof
CA1264667A (en) Process for the preparation of prolonged-action immunotoxins containing a glycopeptide constituent which inactivates ribosomes, modified on its polysaccharide units
EP0114730B1 (en) Cytocidal modified immunoglobulin and process for the preparation thereof
JPS58167519A (ja) 細胞毒性複合体及びその製造法
JPH0428720B2 (hu)
JPS62190200A (ja) 抗腫瘍蛋白複合体およびその製造方法
JPS611622A (ja) 細胞毒性複合体及びその製造法
JPH06312942A (ja) α−フェトプロテインを産生するヒト肝癌細胞に対する抗癌剤
JPS62116522A (ja) 抗腫瘍剤