HU184468B - Process for preparing immobilized cholinesterase enzyme preparation - Google Patents

Process for preparing immobilized cholinesterase enzyme preparation Download PDF

Info

Publication number
HU184468B
HU184468B HU812088A HU208881A HU184468B HU 184468 B HU184468 B HU 184468B HU 812088 A HU812088 A HU 812088A HU 208881 A HU208881 A HU 208881A HU 184468 B HU184468 B HU 184468B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cholinesterase
enzyme
cold
potassium phosphate
buffer
Prior art date
Application number
HU812088A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Laszlo Boros
Andrasne Kovacs
Bela Szajani
Original Assignee
Reanal Finomvegyszergyar
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Reanal Finomvegyszergyar filed Critical Reanal Finomvegyszergyar
Priority to HU812088A priority Critical patent/HU184468B/hu
Priority to PCT/HU1981/000047 priority patent/WO1983000345A1/en
Priority to AU79367/82A priority patent/AU7936782A/en
Priority to US06/486,286 priority patent/US4556637A/en
Priority to AT82900125T priority patent/ATE16405T1/de
Priority to DE8282900125T priority patent/DE3172855D1/de
Priority to EP82900125A priority patent/EP0083582B1/en
Priority to PL1982236995A priority patent/PL131208B1/pl
Priority to BG57087A priority patent/BG49165A3/xx
Priority to CS824911A priority patent/CS258449B2/cs
Priority to CU8235664A priority patent/CU21410A3/es
Priority to DD82241724A priority patent/DD263663A7/de
Priority to SU833565000A priority patent/SU1572418A3/ru
Publication of HU184468B publication Critical patent/HU184468B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • C12Q1/46—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase involving cholinesterase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/087—Acrylic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

(57) KIVONAT
A találmány tárgya eljárás immobilizált kolin-észteráz enzimkészítmény előállítására akrilpolimerek felhasználásával. Az eljárást az jellemzi, hogy 0,1—10 mekv/g, célszerűen 2—8 mekv/g -COOH funkciós csoportot tartalmazó akrilamid-akrilsav-N,N-metilén-bisz-akrilamid kopolimert vízben oldható vagy 0 °C alatti hőmérsékleten szerves oldószerekben oldható karbodiimid-vegyülettel, célszerűen N-etil-N’-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidrokloriddal vagy N-ciklohexil-N’-(jS-) N-metil-morfolin(-etil)-karbodiimid-p-toluolszulfo- náttal 0—4 C° hőmérsékleten kezelik, mimellett a polimer és a karbodiimid-vegyület aránya 1—6: 1—11. Az így aktíváit hordozóra 4,5 és 8,5 közötti * pH-értékű oldatban egységnyi kolinészterázt visznek fel — mimellett a polimer, a karbodiimid és az enzim egymáshoz viszonyított aránya célszerűen 4—5:2,5—5:1—. A kapott terméket mossák, végül kívánt esetben szárítják.
184 468
A találmány tárgya eljárás új típusú, immobilizált kolinészteráz enzinkészítmény előállítására.
Ismeretes, hogy a kolinészteráz enzim, amelyet a leggyakrabban ló vérsavóból izolálnak, alkalmas foszforsav-észter-, karbamát- és szulfátészter-típusú idegmérgek kimutatására, valamint a levegőben vagy vízben előforduló idegmérgek mennyiségének meghatározására. A kimutatás és a mérés alapja ezeknek a mérgező anyagoknak az enzimre gyakorolt gátló hatása. Az immobilizált kolinészteráz-enzimkészítmények folyamatosan működő mérőrendszerek központi elemei lehetnek. Ilyen mérőrendszerek elvét ismerteti például az Anal. Chem. 37, 1378 (1965) és az Anal. Biochem. 51, 362 (1973) közlemény.
A ló vérsavójából elkülönített kolinészteráz immobilizálására több módszert ismertettek a szakirodalomban. Az enzim különböző gélekbe — elsősorban keményítőgélekbe — történő bezárását ismerteti az Anal. Chem. 37, 1378 (1965), Anal. Biochem. 19, 587 (1967) és Anal. Biochem. 33, 341 (1970) közlemény, valamint a 3 223 593 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás. Ez a szabadalmi leírás az enzim agar- és carrageengélekbe való bezárását is ismerteti. Bezáró közegként poliakrilamid használatát ajánlja a Biochim. Biophys. Acta 212, 362 (1970) és az Anal. Biochem. 33, 341 (1970) közlemény. Az enzim továbbá funkciós csoportokkal rendelkező, polimer makromolekulákhoz kapcsolható kovalens kötéseken keresztül. Így például a Biochim. Biophys. Acta 191, 478 (1969) közlemény szerint az enzimet előzetesen ciánbromiddal aktivált Sepharose 2B-n immobilizálják, míg a Biochim. Biophys. Acta 377, 297 (1975) közlemény szerint hordozóként polialeinsavenhidridet alkalmaznak. A Clin. Chim. Acta 121, 125 (1980) közlemény szerint az enzimet karbodiimides vagy glutárealdehides kapcsolással nem-porózus üvegen immobilizálják, míg a 707 923 sz. szovjet szabadalmi leírás szerint az enzimet aktivált porózus üveghez vagy szilika Síéihez kötik. Aktivizálószerként cianursav-kloridot használnak fel. A Can. J. Biochem. 48, 1314 (1970) közlemény szerint a ló vérsavó kolinészteráz Procion brilliant orange DEAE-cellulóz komnlexen is megköthető kovalens kötéseken keresztül.
Az ismert eljárásokkal előállított, gélbe zárt kolinészteráz-enzimkészítményekból az enzim folyamatosan kioldódik, ezért a készítmények hosszú idejű, tartós felhasználásra nem alkalmasak. A szubsztrátumon kovalens kötésekkel immobilizált kolinészteráz-enzimkészítmények átfolyási tulajdonságai kedvezőtlenek az automata rendszerekben történő alkalmazás szempontjából, ezen túlmenően egves hordozóanyagok (így a Sepharose 2B) mikrobiális behatásokra érzékenyek.
A találmány célja a fenti hiányosságok kiküszöbölése. A találmány értelmében olyan immobilizált kolinészteráz-enzimkészítményeket kívánunk előállítani, amelyek tartós felhasználásra alkalmasok, és az enzimet kémiailag ismert, mikroorganizmusok hatásának korlátlanul ellenálló, jó mechanikai tulajdonságokkal rendelkező, nagv átfolyási sebességet biztosító hordozóhoz kötött állapotban tartalmazzák. További követelmény, hogy az enzim eny2 he reakciókörülmények között kapcsolható legyen a hordozóanyaghoz.
Tapasztalataink szerint az akrilsav és/vagy metakrilsav, valamint akrilamid és/vagy metakrilamid monomerekből akril- vagy allil-típusú térhálósítószerrel (így Ν,Ν’-metilén-bisz-arkilamiddal, etilén-diakriláttal, vagy N,N’-diallil-borkősavamiddal) felépített, legalább 0,1 mekv/g (célszerűen 2—8 mekv/g) -COOH funkciós csoportot tartalmazó polimer gyanták teljes mértékben megfelelnek a hordozóanyagokkal szemben támasztott követelményeknek. Ezeket az enzimhordozókat önmagukban ismert módszerekkel állíthatjuk elő. Eljárhatunk például úgy, hogy akrilamidot és/vagy metakrilamidot térhálósító monomer jelenlétében akrilsawal és/vagy metakrilsawal kopolimerizálunk, míg egy másik lehetséges eljárásmód szerint először akrilamidból és/vagy metakrilamidból állítunk elő térhálós polimert a fenti térhálósítók segítségével, majd a kapott polimer savamid-csoportjainak részleges hidrolízisével alakítjuk ki a kívánt mennyiségű -COOH funkciós csoportot. Az utóbbi típusba tartoznak például a Reanal Finomvegyszergyár (Budapest) által forgalomba hozott, Akrilex P típusú akrilamid — Ν,Ν’-metilén-bisz-akrilamid kopolimer gyöngyök (Akrilex P—30, P—100 és P—
200) savval (például sósavval vagy egyéb erős savval) vagy lúggal (például nátriumhidroxiddal, nátriumkarbonáttal vagy egyéb erős bázissal) végzett részleges hidrolízise során képződő, Akrilex C típusú enzimhordozók. Ezekben az anyagokban a hidrolízis során -CO-NHa csoportok körülbelül 50 %-a alakul át karboxil-csoporttá, míg a -CO-NH2 csoportok fennmaradó része még erélyes reakciókörülmények között sem hidrolizál. A részlegesen hidrolizált kopolimerben tehát a karboxil-csoportok közé változatlan -CO-NHa csoportok ékelődnek, amelyek a karboxil-csoportok kedvező térbeli eloszlását biztosítják. Ha a kialakított karboxil-csoportokhoz önmagában ismert karbodiimides aktiválással enzimet kapcsolunk, az immobilizált enzim-molekulák a karboxil-csoportok kedvező térbeli elhelyezkedése következtében nem gátolják egymás működését; így az immobilizált enzimkészítmény fajlagos aktivitása igen nagy érték lehet. Ugyanezekkel az előnyös tulajdonságokkal rendelkeznek az egyéb módon előállított, akrilsav és/vagy metakrilsav, valamint akrilamid és/vagy metakril- '— amid monomereket térhálósító, bifunkciós monomerrel összekapcsolt állapotban tartalmazó, 0,1—8 mekv/g -COOH funkciós csoportot hordozó polimerek is. Ezek a polimerek gyöngyalakúak, így nagy átfolyási sebességet biztosítanak, ugyanakkor kémiailag ismertek, és a mikroorganizmusok hatásának teljes mértékben ellenállnak.
A felhasználandó enzimhordozók karboxil funkciós csoportjai az önmagában ismert karbodiinides aktiválással aktivizálhatók, és így alkalmassá válnak a kolinészteráz enzim megkötésére. Ez a reakció enyhe körülmények (0—4 C°, pH 7,0) között is végrehajtható.
A találmány tárgya tehát eljárás immobilizált kolinészteráz-enzimkészítmény előállítására. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy akrilsav és/vagy metakrilsav, valamint akrilamid és/vagy
184 468 metakrilamid részegységekből akril- vagy allil-típusú térhálósítószerrel felépített, 0,1—8 mekv/g -COOH funkciós csoportot tartalmazó polimer gyantát vízben oldható, vagy 0 C° alatti hőmérsékleteken szerves oldószerekben oldható karbodiimid vegyülettel kezelünk, az így aktivált hordozóra 4,5 és 8,5 közötti pH-értékű oldatban kolinészterázt viszünk fel, a kapott terméket mossuk, végül kívánt esetben szárítjuk.
Polimerként különösen előnyösen használhatjuk fel a korábban ismertetett Akrilax C típusú polimereket.
A találmány szerinti eljárásban enzimként tetszés szerinti eredetű, bármilyen ismert módon elkülönített kolinészteránzt felhasználhatunk.
Az enzimhordozó kopolimer aktiválására karbodiimid-vegyületként például N-ciklohexil-N’-(/>-/N-metil-morfilin/-etil)-karbodiimid-p-touolszulfonátot vagy N-etil-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidrokloridot használhatunk fel. Karbodiimid-vegyületként előnyösen vízben oldható anyagokat alkalmazunk. A csak szerves oldószerekben oldható karbodiimid-vegyületek közül a találmány szerinti eljárásban azok a származékok használhatók fel, amelyek az adott szerves oldószerben hidegen (azaz 0 C°-nál alacsonyabb hőmérsékleten) is megfelelően oldódnak.
Az aktivált hordozóra 4,5 és 8,5 közötti pH-értékű — előnyösen pH 7,0-es — oldatból visszük fel a kolinészterázt. A kolinészterázt célszerűen 0,1 mólos káliumfoszfát puffer-oldatban (pH 7,0) oldott állapotban használjuk fel.
A kapcsolási reakcióval kialakított immobilizált enzimkészítményt ismert módon mossuk, majd kívánt esetben szárítjuk. Az enzimkészítmény azonban — 0—4 C°-on — vizes szuszpenzióban is eltartható.
A találmány szerinti eljárással előállított immobilizált enzimkészítmények fajlagos aktivitása 100—120 egység/g xerogél, ami az Anal. Chem. 37, 1378 (1965), Anal. Biochem. 19, 587 (1967), Biochim. Biophys. Acta 212, 362 (1970) és Anal. Biochem. 51, 362 (1973) közlemények aktivitás-adataival összehasonlítva kedvezőnek tekinthető a gyakorlati felhasználás szempontjából.
Az eljárásunkkal előállított immobilizált kolinészteráz enyhén lúgos közegben, tehát alkalmazásának optimális pH-ján (pH 8,0) nagyobb stabilitást mutat, mint az oldható enzim. Ez jelentős .lőny a tartós használat szempontjából.
A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük.
1. példa
100,6 mg akrilamid-akrilsav-N,N-metilén-bisz-akrilamid (Akrilex C—100) xerogélt (3 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferoldatban (pH 7,0) szuszpendáltunk, majd 0 C°-on állandó keverés közben hozzáadtuk 102,5 mg N-etil-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidroklorid
2,5 ml hideg (4 C°-os) pufferoldattal készített oldatát. 10 perces keverés után a reakcióelegyhez 2,5 ml hideg (4 C°-os) pufferoldatban oldott 47,4 mg kolinészterázt adtunk. A teljes reakcióidő 0—4 C°on 48 óra volt, amelyből kétszer 6 órán át kevertük a szuszpenziót. Ezután a gélt szűréssel elválasztottuk, és háromszor 10 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferoldattal (pH 7,0), háromszor 10 ml, 0,5 mólos nátriumkloridot tartalmazó 0,1 mólos káliumfoszfát pufferoldattal (pH 7,0), majd háromszor 10 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferoldattal (pH 7,0) mostuk. Végül a gélt négyszer 25 ml desztillált vízzel sómentesre mostuk, majd liofilizáltuk. Kitermelés: 106,2 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 120 «mól butiril-tio-kolin-jodid hidrolízise/perc/gramm szárazanyag.
2. példa
102 mg Aklirex C—100 xerolgélt (2 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferoldatban (pH 7,0) szuszpendáltunk, majd 0 C°-on, állandó keverés közben 202 mg N-ciklohexil-N’-(/?-/Nmetil-morfilin/-etil)-karbodíimid-p-toluolszulfonát
2,5 ml hideg (4 C°-os) pufferoldattal készített oldatát adtuk a szuszpenzióhoz. 10 perces keverés után a reakcióelegyhez 2,5 ml hideg (4 C°-os) pufferoldatbari oldott 49 mg holinészterázt adtunk. A teljes reakcióidő 0—4 C°-on 48 óra volt, amelyből kétszer 6 órán át kevertük az elegyet. Ezután a gélt szűréssel elválasztottuk, és háromszor 10 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferoldattal (pH 7,0), háromszor 10 ml, 0,5 mól nátriumkloridot tartalmazó 0,1 mólos káliumfoszfát pufferoldattal (pH 7,0), majd háromszor 10 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferoldattal (pH 7,0) mostuk. Végül a gélt négyszer 25 ml desztillált vízzel sómentesre mostuk, majd liofilizáltuk. Kitermelés: 110 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás 110 .«mól butiril-tio-kolin-jodid hidrolízise/perc/gramm szárazanyag.
összehasonlító vizsgálatok és azok eredményei:
A találmány szerint előállított immobilizált enzimkészítmények aktivitását és fajlagos aktivitását egyéb hordozóanyagokon immobilizált enzimkészítmények megfelelő adataival hasonlítottuk össze. A következő összehasonlító anyagokat használtuk fel:
a) Enzacryl AA típusú hordozót (aromás amin funkciós csoportokat tartalmazó akrilamid — N,N’-metilén-bisz-akrilamid kopolimer, gyártja a KochLight Laboratories Ltd., Colnbrook, Bucks, NagyBritannia) a gyártó cég erőiratai szerint (KochLight Laboratories Ltd., KL 3, 343 oldal (1970)) diszoláltunk. Ezután 100 mg diszotált Enzacryl AA-t és 2,5 mg kolinészterázt 0,5 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferoldatban (pH 7,5) kevertettünk 0—4 C°-on kétszer 8 órán keresztül úgy, hogy a két keverési időszak között, valamint a keverési időszak végén a szuszpenziót 16—16 órán át hűtőszekrényben 4 C°-on állni hagytuk.
b) Enzakryl AH típusú hordozót (akrilamid-akrilsav-hidrazid-N,N’-metilén-bisz-akrilamid kopoli3
184 468 mer. gyártja a Koch-Light Laboratories Ltd., Colnbrook, Bucks, Nagy-Britannia) a gyártó cég előiratai szerint (Koch-Light Laboratories Ltd., KL 3, 344. oldal (1970)) savas közegben nátrium-nitrittel aktiváltunk. Ezután 100 mg aktivált hordozót, amely a funkciós csoportokat savazid csoportok formájában tartalmazta, és 2,5 mg kolinészterázt 0,1 mólos borát pufferoldatban (pH 8,0) kevertünk az a) pontban ismertetett körülmények között.
c) 93 mg, Reanal gyártmányú, 2,3 mekv/g kötőkapacitású (-COOH tartalmú) karboximetil-cellulózt 5 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferoldatban (pH 7,0) szuszpendáltunk, majd állandó keverés közben hozzáadtunk 50 mg N-etil-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidrokloridot 2,5 ml hideg (4 C°os) pufferoldatban oldva. 10 perces keverés után a reakcióelegyhez 25 mg kolinészterázt adtunk 2,5 ml hideg (4 C°-os) pufferoldatban oldva. Az enzimet összesen 48 órán át reagáltattuk 0—4 C°-on az aktivált hordozóval; ebből kétszer 6 órán át kevertük az elegyet.
d) Merck (Darmstadt, Német Szövetségi Köztársaság) gyártmányú polimaleinsav-anhidrid hordozót a gyártó cég előírásai szerint (Biochemics Merck: Poly/maleic anhydride/crosslinked enzyme support) kolinészterázzal kapcsoltunk: 1 g hordozót 25 ml 0 C°-os, 0,05 mólos káliumfoszfát pufferoldatban (pH 7,0) szuszpendáltunk, és 1 perces keverés után a szuszpenzióhoz 0, 5 g kolinészteráz 5 ml hideg (4 C°-os) pufferoldattal készített oldatát adtuk. A reakcióelegy pH-ját 1 n vizes nátriumhidroxid oldat folyamatos adagolásával 8 és 9 közötti értéken tartottuk. A lúgot addig adagoltuk, amíg az elegy pH-ja kb. 0,5 órán át tovább már nem változott.
Az a—d) pontban ismertetett immobilizálási reakciók lezajlása után az immobilizált enzimkészítményeket szűrtük vagy centrifugáltuk, majd az immobilizálásnál alkalmazott pufferoldattal, 0,5—
1,0 mólos, pufferoldattal készített nátriumklorid oldattal, végül ismét az immobilizálásánál alkalmazott pufferoldattal mostuk a nem kovalensen kötött fehérjék eltávolítására. Ezután a pufferoldat ionjait vizes mosással eltávolítottuk, és az immobi10 lizált enzimkészítményt liofilizáltuk. A liofilizált termékeket hűtőszekrényben 4 C°-on tároltuk.
Az immobilizált enzimkészítményeken megkötött fehérje mennyiségét közvetett úton, a reakcióelegybe bevitt és az immobilizálási eljárás után a felülúszóban és a mosófolyadékokban maradt fehérjemennyiség különbségeként határoztuk meg. A kolinészteráz-oldatok fehérjetartalmának meghatározására a biuret-módszert (A. C. Gornall, C. S. Bardswill, Μ. M. Dávid: J. Bioi. Chem. 177, 751 (1949)) alkalmaztuk.
Az oldott és az immobilizált kolinészterázok aktivitását a butiril-tio-kolin-jodid szubsztrátum bontása során felszabaduló szulfhidril-csoportok meghatározásával mértük. A szulfhidril-csoportokat 25 bisz(5-karboxi-4-nitro-fenil)-di-szulfiddal határoztuk meg (G. L. Ellman, K. D. Courtney, V. Andres Jr., R. M. Featherstone: Biochem. Pharmacol, 7, 88 (1961)). Egy aktivitási egységnek azt az enzimmennyiséget tekintettük, amely 1 mikromól bu3Q tiril-tio-kolin-jodid átalakulását katalizálja percenként 25 C°-on, a katalitikus aktivitás optimális pH-értékén (oldott enzim esetén: pH = 7,6; immobilizált enzim esetén: pH = 8,0).
A végzett kísérletek eredményeit az 1. táblázat35 bán közöljük.
1. táblázat
Hordozó Immobilizált fehérje, % Immobilizált aktivitás, % Oldott állapotban visszanyert aktivitás, % Aktivitás- veszteség % A termék* aktivitása Fajlagos** aktivitás, %
Enzacryl AA 100 0 0 100 0 0
Enzacryl AH 61,8 0,2 60,7 39,1 0,2 0,3
Akrilex C—100 24,5 7,5 60 32,5 120 30,6
(1. példa) Karboximetil-cellulóz 5,5 0,2 3,5 96,3 2 3,6
Polimaleinsav-anhidrid 23,3 7,5 31,3 61,2 106 32,2
* egység/mg szárazanyag.
** Az oldott enzim fajlagos aktivitását tekintettük 100%-nak.
Az 1. táblázat adataiból megállapítható, hogy száraz súlyra (fehérje+hordozó), illetve fehérjetartalomra vonatkoztatva a legnagyobb aktivitású terméket a találmány szerinti eljárással kapjuk. A polimaleinsav-anhidrid hordozó felhasználásával kapott termék aktivitási adatai közel esnek a találmány szerint előállított termékéhez; ez a hordozóanyag azonban tömbpolimerizációval készült, így az immobilizált enzimkészítményből előállított oszlop átfolyási jellemzői lényegesen rosszabbak a talál4 mány szerint előállított, gyöngyhordozón immobilizált termékénél.
3. példa
99,8 mg Akrilex S—100 xerogélt (0,8 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos, pH = 7,0 kálum-foszfát pufferben szuszpendáltunk, majd 0 C°-on állandó keverés mellett hozzáadtunk 108,6 mg N-etil-N’-(3-41
184 468 vábbiakban megegyezett az előzőekben (3.) leírtakkal. A kitermelés 340 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 215 ,«mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízise 'perc/gramm szárazanyag.
-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidroklorid 2,5 ml hideg (4 C°-os) pufferoldattal készített oldatát. 10 perces keverés után az elegyhez 2,5 ml hideg (4 C°-os) pufferben oldott 60,1 mg kolinészterázt adtunk. A teljes reakcióidő 0—4 C°-on 48 óra volt, amelyből kétszer hat órát kevertük a szuszpenziót. Ezután szűrtük a gélt és háromszor 10 ml 0,1 mólos kálium-foszfát (pH = 7,0) pufferoldattal, majd háromszor 10 ml 0,5 mól nátrium-kloridot tartalmazó pufferoldattal (pH = 7,0), majd háromszor 10 ml 0,1 mólos káluim-foszfát (pH = 7,0) pufferoldattal mostuk. A gélt ezután négyszer 25 ml hideg desztillált vízzel sómentesre mostuk, majd liofilizáltuk. A kitermelés 144,7 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 80 «mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízise/perc/gramm szárazanyag.
4. példa
200 mg Akrilex C—100 xerogélt (4 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos, hideg kálium-foszfát (pH — 7,0) pufferben szuszpendáltunk. 0 C°-on, állandó keverés mellett 200 mg N-etil-N’-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidroklorid 2,5 ml hideg (4 C°-os) pufferben készült oldatát adtuk. 10 perces keverés után 2,5 ml hideg (4 C°-os) kálium-foszfát pufferben oldott 50 mg kolinészterázt adtunk. A teljes reakcióidő 0—4 C°-on 48 óra volt, melyből kétszer hat órát kevertettünk. A továbbiakban a mosás megegyezett a fent (3.) leírtakkal. A kitermelés 220 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 240 .«mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízise/perc/gramm szárazanyag.
5. példa
249,8 mg Akrilex C—100 xerogélt (6,5 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos, hideg kálium-foszfát pufferben (pH — 7,0) szuszpendáltunk. 0 C°-on, állandó keverés mellett 250 mg N-etil-N’-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidroklorid 2,5 ml hideg kálium-foszfát pufferben készült oldatát adtuk. 10 perc kevertetés után 50 mg kolinészterázt adtunk az elegyhez, melyet előzőleg 2,5 ml hideg pufferben oldottunk. A teljes reakcióidő 48 óra volt, melyből kétszer hat órát kevertettünk. A mosás megegyezett az előzőekben (3.) leírtakkal. A kitermelés 321 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 240 mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízise'perc/gramm szárazanyag.
6. példa
300 mg Akrilex C—100 xerogélt (5,7 mekv/g -COOH) 5,0 ml hideg 0,1 mólos pufferben (pH = 7,0) szuszpendáltunk. Állandó keverés mellett 0 C°on 300 mg N-etil-N’-3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidroklorid 2,5 ml hideg pufferben készült oldatát adtuk hozzá. 10 pere keverés után 2,5 ml hideg pufferben oldott 50 mg kolinészterázt tettünk hozzá. A teljes reakcióidő 48 óra volt, melyből kétszer hat órát kevertettünk. A mosás a to7. példa
253,4 mg Akrilex C—100 xerogélt ( 7 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos, hideg kálium-foszfát pufferben (pH = 7,0) szuszpendáltunk. 2,5 ml hideg pufferben oldott 130,8 mg N-etil-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidrokloridot adtunk hozzá. 10 perces kevertetés után 50,2 mg kolinészterázt adtunk az elegyhez, melyet előzőleg 2,5 ml hideg (4 C°-os) kálium-foszfát pufferben (pH = 7,0) oldottunk. A teljes reakcióidő 48 óra volt, melyből kétszer hat órát kevertettünk. A mosás megegyezett a fent (3.) leírtakkal. A kitermelés 355,9 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 252 «mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízise/perc gramm szárazanyag.
8. példa
251,7 mg Akrilex C—100 xerogélt (3,5 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferben (pH = 7,0) szuszpendáltunk. 381,1 mg N-etil-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidroklorid 2,5 ml hideg (4 C°-os) pufferben készült oldatát adtuk hozzá. 10 perc keverés után 50,2 mg kolinészteráz
2,5 ml hideg (4 C°-os) pufferben (pH — 7,0) készült oldatát tettük hozzá. A teljes reakcióidő 48 óra volt, ebből kétszer hat órát kevertettünk. A mosás megegyezett az előző példákban leírtakkal. A kitermelés 334,2 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 137 .«mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízise,'perc,'gramm szárazanyag.
9. példa
256,1 mg Akrilex C—190 xerogélt (0,5 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferben (pH = 7,0) szuszpendáltunk. 518,3 mg N-etil-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidroklorid 2,5 ml hideg pufferben készült oldatát adtuk hozzá. 10 perc keverés után 2,5 ml hideg pufferben oldott 49,3 mg kolinészterázt adtunk az elegyhez. A teljes reakcióidő 48 óra volt, melyből kétszer hat órát kevertettünk. A gél mosása megegyezett az előzőekben leírtakkal. A kitermelés 298,8 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 45,6 «mól butiril-tiokolin-jodid hidrolíziseperc/gramm szárazanyag.
10. példa
256,7 mg Akrilex C—100 xerogélt (3,5 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos, hideg kálium-foszfát oldatban (pH = 3,6) szuszpendáltunk. 131,8 mg N-etil-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimni-hidroklorid 2,5 ml hideg pufferben (pH = 3,6) készült oldatát adtuk az elegyhez. 10 perc keverés után
184 468
49,8 mg kolinészteráz 2,5 ml hideg kálium-foszfát pufferben (pH = 3,6) készült oldatát adtuk hozzá. A teljes reakcióidő 48 óra volt. Ebből a keverés ideje kétszer hat óra. A gélt ezután háromszor 10 ml hideg (4 C°-os) 0,1 mólos kálium-foszfát pufferral (pH = 3,6), majd háromszor 10 ml 0,5 mól nátriumkloridot tartalmazó pufferoldattal (pH =3,6) mostuk. Háromszor 10 ml kálium-foszfát pufferrel, majd négyszer 25 ml desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofizáltuk. A kitermelés 182,5 mg immobolizált kolinészteráz. Aktivitás: 0,0 «mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízise/perc-'gramm szárazanyag.
11. példa
259,1 mg Akrilex C—100 xerogélt (4,7 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos, hideg kálium-foszfát oldatban (pH = 4,0) szuszpendáltunk. 126,9 mg N-et’l-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid~hidroklorid 2,5 ml hideg pufferben (pH = 4,0) készült oldatát adtuk az elegyhez. 10 perc keverés után 49,6 mg kolinészteráz 2,5 ml hideg kálium-foszfát pufferben (pH = 4,0) készült oldatát adtuk hozzá. A teljes reakcióidő 48 óra volt. Ebből a keverés ideje kétszer hat óra. A gélt ezután háromszor 10 ml hideg, 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel (pH = 4,0), majd háromszor 10 ml 0,5 mól nátriumkloridot tartalmazó pufferoldattal (pH = 4,0) mostuk. Háromszor 10 ml kálium-foszfát pufferrel, majd négyszer 25 ml hideg desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofilizáltuk. A kitermelés 168,0 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 13 «mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízise/perc/gramm szárazanyag.
12. példa
252,5 mg Akrilex C—100 xerogélt (2,5 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos, hideg kálium-foszfát oldatban (pH = 4,6) szuszpendáltunk. 124,2 mg Netil-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidroklorid 2,5 ml hideg pufferben (pH = 4,6) készült oldatát adtuk az elegyhez. 10 perc keverés után
52,9 mg kolinészteráz 2,5 ml hideg kálium-foszfát pufferben (pH = 4,6) készült oldatát adtuk hozzá. A teljes reakcióidő 48 óra volt. Ebből a keverés ideje kétszer hat óra. A gélt ezután háromszor 10 ml hideg, 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel (pH = 4,6), majd háromszor 10 ml 0,5 mól nátrium-kloridot tartalmazó pufferoldattal mostuk. Háromszor 10 ml kálium-foszfát pufferrel, majd négyszer 25 ml hideg desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofili záltuk. A kitermelés 280,8 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 101,7 ,«mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízise/perc/garmm szárazanyag.
13. példa <
252,6 mg Akrilex C—100 xerogélt (7,8 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos, hideg kálium-foszfát ol- '· datban (pH = 5,0) szuszpendáltunk. 125,0 mg N-etil-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidro- t klorid 2,5 ml hideg pufferben (pH = 5,0) készült oldatát adtuk az elegyhez. 10 perc keverés után
50,5 mg kolinészteráz 2,5 ml hideg kálium-foszfát pufferben (pH = 5,0) készült oldatát adtuk hozzá.
A teljes reakcióidő 48 óra volt. Ebből a keverés ideje kétszer hat óra. A gélt ezután háromszor 10 ml hideg, 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel (pH = 5,0), majd háromszor 10 ml 0,5 mól nátrium-kloridot tartalmazó pufferoldattal (pH — 5,0) mostuk. 10 Háromszor 10 ml kálium-foszfát pufferrel, majd négyszer 25 ml hideg desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofilizáltuk. A kitermelés 239,9 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 163,2 .«mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízise/perc/gramm száraz5 anyag.
14. példa
249,2 mg Akrilex C—100 xerogélt (6,9 mekv/g
-COOH) 5,0 ml 0,1 mólos, hideg kálium-foszfát pufferben (pH = 6,0) szuszpendáltunk. 127,2 mg N-etil-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidroklorid 2,5 ml hideg pufferben (pH = 6,0) készült oldatát adtuk az elegyhez. 10 perc keverés után
51,9 mg kolinészteráz 2,5 ml hideg kálium-foszfát pufferben (pH = 6,0) készült oldatát adtuk hozzá.
A teljes reakcióidő 48 óra volt, ebből a keverés ideje kétszer hat óra. A gélt ezután háromszor 10 ml hideg, 0,1 mólos kálium-szulfát pufferrel (pH =
6,0), majd háromszor 10 ml 0,5 mól nátrium-kloridot tartalmazó pufferoldattal (pH = 6,0) mostuk. Háromszor 10 ml kálium-foszfát pufferrel, majd négyszer 25 ml hideg desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofilizáltuk. A kitermelés 277,8 mg im> mobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 252 «mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízise/perc/gramm szárazanyag.
S
15. példa )
257,4 mg Akrilex C—100 xerogélt (0,7 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos, hideg kálium-foszfát pufferben (pH = 7,0) szuszpendáltunk. 127,8 mg N-etil-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidro> klorid 2,5 ml hideg pufferben (pH — 7,0) készült oldatát adtuk a reakcióelegyhez. 10 perc keverés után 51,9 mg kolinészteráz 2,5 ml hideg kálium-foszfát pufferben (pH = 7,0) készült oldatát adtuk hozzá. A teljes reakcióidő 48 óra volt, ebből a keve» rés ideje kétszer hat óra. A gélt ezután háromszor 10 ml hideg, 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel (pH = 7,0), majd háromszor 10 ml 0,5 mól nátrium-kloridot tartalmazó pufferoldattal (pH = 7,0) mostuk. Háromszor 10 ml kálium-foszfát pufferrel, i majd négyszer 25 ml hideg desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofilizáltuk. A kitermelés 292,9 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 107,6 ,«mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízise/perc/gramm szárazanyag.
I
16. példa
250,6 mg Akrilex C—100 xerogélt (0,2 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos, hideg kálium-foszfát oldatban (pH = 8,0) szuszpendáltunk, 122,7 mg N-61
184 468
-etil-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidroklorid 2,5 ml hideg pufferben (pH = 8,0) készült oldatát adtuk hozzá. 10 perc keverés után 58 mg kolinészteráz 2,5 ml hideg kalcium-foszfát pufferben (pH = 7,0) készült oldatát adtuk hozzá. A teljes reakcióidő 48 óra volt, ebből a keverés ideje kétszer 6 óra. A gélt ezután háromszor 10 ml hideg, 0,1 mólos kálium-foszfát oldattal (pH = 8,0), majd hároszor 10 ml 0,5 mól nátrium-kloridot tartalmazó pufferoldattal (pH = 8,0) mostuk. Háromszor 10 ml kálium-foszfát oldattal, majd négyszer 25 ml hideg desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofilizáltuk. A kitermelés 300,3 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 29,4 mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízise/perc/gramm szárazanyag.
17. példa
252,7 mg Akrilex C—100 xerogélt (10 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos,hideg kálium-foszfát oldatban (pH = 9,0) szuszpendáltunk. 125,3 mg N-etiI-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidroklorid 2,5 ml hideg pufferben (pH = 9,0) készült oldatát adtuk hozzá. 10 perc keverés után 60 mg kolinészteráz 2,5 ml hideg kalcium-foszfát pufferben (pH = 7) készült oldatát adtuk hozzá. A teljes reakcióidő 48 óra volt, ebből a keverés ideje kétr 5 szer 6 óra. A gélt ezután háromszor 10 ml hideg, LL, 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel (pH = 9,0), majd Ki háromszor 10 ml 0,5 mól nátrium-kloridot tartal mázó pufferoldattal (pH = 9,0) mostuk. Háromszor ? 10 ml kálium-foszfát pufferrel, majd négyszer 25 ml hideg desztillált vízzel sómentesre mostuk és li.. ofilizáltuk. A kitermelés 361,9 mg immobilizált ko£ linészteráz. Aktivitás: 6,8 .«mól butiril-tiokolin-jof did hidrolízise/perc'gramm szárazanyag.

Claims (2)

. j Szabadalmi igénypontok
1· (mg) AC—100 (súlyrész) 2· (mg) EDAPC (súlyrész) (mg) 3‘ ChE (súlyrész) (egység/gramm szárazanyag) 99,8 1,66 108,6 1,81 60,1 1 80 100,6 2,12 102,5 2,16 47,4 1 120 253,4 5,04 130,8 2,6 50,2 1 252 200 4 200 4 50 1 240 249,8 5 250 5 50 1 240 300 6 300 6 50 1 215 251,7 5,01 381,1 7,59 50,2 1 137 256,1 5,19 518,3 10,5 49,3 1 45,6
l* AC—100, Akrilex C—100 2* EDAPC, N-etil-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbo diimid- hidroklorid 3* ChE, ló vérsavó kolinészteráz 4* Egy egység az az enzimmennyiség, amely 1 «mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízisét katalizálja perce nként, 25 C°-on.
3. táblázat
A rekacióelegy pH-jának hatása a ló vérsavó kolinészteráz immobilizálására
A reakcíóelegy pH-ja ** A termék aktivitása (egység/gramm szárazanyag) 4,6 101,7 5,0 163,2 6,0 252 7,0 107,6 8,0 2,94
Egy egység az az enzimmennyiség amely 1 mól butiril-tiokolin-jodid hidrolíziést katalizálja percenként, 25 C°-on.
szerves oldószerekben oldható karbodiimid-vegyü50 lettel, célszerűen N-etil-N’-(3-dimetilamido-propil)-karbodiimid-hidrokloriddal vagy N-ciklohexil-N’-(/?)N-metil-morfolin(-etil)-karbodiimid-p-toluol-szulfonáttal 0—4 C° hőmérsékleten kezelünk, mimellett a polimer és a karbodiimid-vegyület aránya
55 1—6:1—11, az így aktivált hordozóra 4,5 és 8,5 közötti pH-értékű oldatban egységnyi kolinészterázt viszünk fel — mimellett a polimer, a karbodiimid és az enzim egymáshoz viszonyított aránya 4—5: 2,5—5:1 —, a kapott terméket mossuk, végül kíóO vánt esetben szárítjuk.
1.Élj árás immobolizált kolinészteráz enzimkészít20 mény előállítására akrilpolimerek felhasználásával, azzal jellemezve, hogy 0,1—10 mekv/g, célszerűen 2—8 mekv/g -COOH funkciós csoportot tartalmazó akrilamid-akrilsav-N,N-metilén-bisz-akrilamid kopolimert vízben oldható 0 C° alatti hőmérsékleten
2. táblázat
A reakcíóelegy összetételének hatása a ló vérsavó kolinészteráz immobilizálására, pH = 7,0-nél __A reakcíóelegy összetétele__4. A terméR aktivitága
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja, azzal jellemezve, hogy a kolinészterázt 0,1 mólos kálium-foszfát pufferoldatban pH = 7,0) old65 va visszük fel az aktivált hordozóra.
Ábra nélkül
HU812088A 1981-07-17 1981-07-17 Process for preparing immobilized cholinesterase enzyme preparation HU184468B (en)

Priority Applications (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU812088A HU184468B (en) 1981-07-17 1981-07-17 Process for preparing immobilized cholinesterase enzyme preparation
PCT/HU1981/000047 WO1983000345A1 (en) 1981-07-17 1981-12-23 Immobilized cholinesterase enzyme preparations and a process for the preparation thereof
AU79367/82A AU7936782A (en) 1981-07-17 1981-12-23 Immobilized cholinesterase enzyme preparations and a process for the preparation thereof
US06/486,286 US4556637A (en) 1981-07-17 1981-12-23 Immobilized cholinesterase enzyme preparations and a process for the preparation thereof
AT82900125T ATE16405T1 (de) 1981-07-17 1981-12-23 Immobilisierte cholinesterase enzymzusammensetzungen sowie verfahren zu deren herstellung.
DE8282900125T DE3172855D1 (en) 1981-07-17 1981-12-23 Immobilized cholinesterase enzyme preparations and a process for the preparation thereof
EP82900125A EP0083582B1 (en) 1981-07-17 1981-12-23 Immobilized cholinesterase enzyme preparations and a process for the preparation thereof
PL1982236995A PL131208B1 (en) 1981-07-17 1982-06-18 Process for preparing enzymatic preparations with bounded cholinesterase
BG57087A BG49165A3 (en) 1981-07-17 1982-06-22 Method for obtaining preparations on the basis of the fixed cholinesterase enzyme
CS824911A CS258449B2 (en) 1981-07-17 1982-06-29 Immobile cholinesterase agent and method of its production
CU8235664A CU21410A3 (en) 1981-07-17 1982-07-14 Preparation of inmovilized colinesterase enzymes and its obtainment procedure
DD82241724A DD263663A7 (de) 1981-07-17 1982-07-16 Verfahren zur herstellung eines immobilisierten cholinestetase-praeparates
SU833565000A SU1572418A3 (ru) 1981-07-17 1983-03-16 Способ получени иммобилизованной холинэстеразы

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU812088A HU184468B (en) 1981-07-17 1981-07-17 Process for preparing immobilized cholinesterase enzyme preparation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU184468B true HU184468B (en) 1984-08-28

Family

ID=10957702

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU812088A HU184468B (en) 1981-07-17 1981-07-17 Process for preparing immobilized cholinesterase enzyme preparation

Country Status (10)

Country Link
US (1) US4556637A (hu)
EP (1) EP0083582B1 (hu)
BG (1) BG49165A3 (hu)
CS (1) CS258449B2 (hu)
CU (1) CU21410A3 (hu)
DD (1) DD263663A7 (hu)
HU (1) HU184468B (hu)
PL (1) PL131208B1 (hu)
SU (1) SU1572418A3 (hu)
WO (1) WO1983000345A1 (hu)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3872999T2 (de) * 1987-09-18 1993-03-11 Eastman Kodak Co Verknuepfung von verbindungen mit polymeren teilchen unter verwendung von carbamoyloniumvebindungen.
US4923810A (en) * 1988-08-24 1990-05-08 Genzyme Corporation Resolution of glycidyl esters to high enantiomeric excess
PL211815B1 (pl) 2007-11-19 2012-06-29 Inst Chemii Organicznej Polska Akademia Nauk Enzym esteraza lowastatyny osadzony na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, sposób osadzania enzymu, zastosowanie enzymu esterazy lowastatyny osadzonego na nosniku nierozpuszczalnym w wodzie, przepływowy reaktor biokatalityczny ze złożem oraz sposób wytwarzania i/lub oczyszczania symwastatyny
RU2546245C1 (ru) * 2013-10-14 2015-04-10 Федеральное Государственное Автономное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Сибирский Федеральный Университет" (Сфу) Ферментный препарат на основе иммобилизованной бутирилхолинэстеразы и способ его приготовления
EP3196315B1 (en) * 2016-01-19 2020-02-05 ORITEST spol. s r.o. Spherical pellets, manufacturing process of such pellets, use, and a detection tube comprising such pellets
CN109187386A (zh) * 2018-08-23 2019-01-11 成都众粒生物科技有限公司 用于检测有机磷和氨基甲酸酯类农药含量的凝胶及其应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3223593A (en) * 1963-08-14 1965-12-14 Melpar Inc Method of preparing immobilized serum cholinesterase and product thereof
SU586182A1 (ru) * 1974-08-30 1977-12-30 Предприятие П/Я А-7815 Способ получени иммобилизованной амилазы
SE7712058L (sv) * 1976-11-12 1978-05-13 Ceskoslovenska Akademie Ved Tredimensionell berare av oorganiskt, porost material och en reaktiv polymer och ett forfarande for framstellning derav
SU707923A1 (ru) * 1977-09-27 1980-01-05 Институт Кибернетики Ан Эстонской Сср Способ получени иммобилизованных холинэстераз
SU1022988A1 (ru) * 1979-09-28 1983-06-15 Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР Стабилизированна урокиназа,обладающа тромболитической активностью,и способ ее получени
JPS56501510A (hu) * 1979-11-15 1981-10-22
HU182171B (en) * 1980-07-17 1983-12-28 Reanal Finomvegyszergyar Process for isolating aminoacylase enzyme from kidney of mammalians

Also Published As

Publication number Publication date
BG49165A3 (en) 1991-08-15
CS258449B2 (en) 1988-08-16
CS491182A2 (en) 1987-07-16
PL131208B1 (en) 1984-10-31
CU21410A3 (en) 1988-02-15
EP0083582A1 (en) 1983-07-20
EP0083582B1 (en) 1985-11-06
PL236995A1 (en) 1983-06-06
EP0083582A4 (en) 1984-01-31
SU1572418A3 (ru) 1990-06-15
US4556637A (en) 1985-12-03
WO1983000345A1 (en) 1983-02-03
DD263663A7 (de) 1989-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. Preparation and properties of thermoreversible, phase-separating enzyme-oligo (N-isopropylacrylamide) conjugates
US4141857A (en) Support matrices for immobilized enzymes
US3969287A (en) Carrier-bound protein prepared by reacting the protein with an acylating or alkylating compound having a carrier-bonding group and reacting the product with a carrier
US4038140A (en) Process for binding biologically active proteins
US4229536A (en) Process for preparing immobilized enzymes
JPH0412952B2 (hu)
EP0104571B1 (en) Immobilization of biocatalysts on granular carbon
Ayhan et al. Highly biocompatible enzyme aggregates crosslinked by L-lysine
HU184468B (en) Process for preparing immobilized cholinesterase enzyme preparation
Rehman et al. Encapsulation of pectinase within polyacrylamide gel: Characterization of its catalytic properties for continuous industrial uses
US3794563A (en) Preparation of immobilized enzymes
US4593004A (en) Process for the immobilization of cyclodextrine glycosyltransferase enzyme
Bryjak et al. Application and properties of butyl acrylate/pentaerythrite triacrylate copolymers and cellulose-based Granocel as carriers for trypsin immobilization
US8753856B2 (en) Stable biocatalysts of penicillin acylase as gel aggregates and the process of manufacture thereof
US4218363A (en) Preparation of support matrices for immobilized enzymes
Li et al. Chitosaneous hydrogel beads for immobilizing neutral protease for application in the preparation of low molecular weight chitosan and chito‐oligomers
Valentova et al. Pepsin immobilized by covalent fixation to hydroxyalkyl methacrylate gels: preparation and characterization
US4929556A (en) Enzyme immobilization with polysulfonium salts
Epton et al. [7] Enzymes covalently bound to polyacrylic and polymethacrylic copolymers
George et al. Flow rate dependent kinetics of urease immobilized onto diverse matrices
JP2824902B2 (ja) 酵素固定化用担体の製造方法
US3745088A (en) Active water-insoluble enzymes
Temoçin et al. Use of chemically modified poly (ethylene terephthalate)-g-(acryl amide) fibers for α-amylase immobilization
JP2727219B2 (ja) 固定化酵素の製造方法
PL79702B1 (hu)

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee