PL131208B1 - Process for preparing enzymatic preparations with bounded cholinesterase - Google Patents

Process for preparing enzymatic preparations with bounded cholinesterase Download PDF

Info

Publication number
PL131208B1
PL131208B1 PL1982236995A PL23699582A PL131208B1 PL 131208 B1 PL131208 B1 PL 131208B1 PL 1982236995 A PL1982236995 A PL 1982236995A PL 23699582 A PL23699582 A PL 23699582A PL 131208 B1 PL131208 B1 PL 131208B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
cholinesterase
enzyme
acrylamide
substrate
buffer
Prior art date
Application number
PL1982236995A
Other languages
English (en)
Other versions
PL236995A1 (en
Inventor
Laszlo Boross
Kamilla Kowacs
Bela Szajani
Original Assignee
Reanal Finomvegyszergyar
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Reanal Finomvegyszergyar filed Critical Reanal Finomvegyszergyar
Publication of PL236995A1 publication Critical patent/PL236995A1/xx
Publication of PL131208B1 publication Critical patent/PL131208B1/pl

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • C12Q1/46Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase involving cholinesterase
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/087Acrylic polymers
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis patentowy opublikowano: 1987 03 10 131208 Int. CL* C12N 11/08 Twórcy wynalazku: L&szló Boross, Kamilla Kovacs nce Szentes, Bcla Szajani Uprawniony z patentu: Reanal Finoi*ivegyszergysr, Budapeszt (Wegry) Sposób wytwarzania enzymatycznych preparatów ze zwiazana cholinoesteraza Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania no¬ wych enzymatycznych preparatów ze zwiazana cholinoesteraza.Wiadomo, ze do wykrywania zwiazków neuro- toksycznych jak estry fosforanowe, karbaminia- nowe i siarczanowe oraz do oznaczania ich za¬ wartosci w powietrzu i wodzie moze byc stoso¬ wany enzym cholinoesteraza, wydzielany najczes¬ ciej z surowicy konskiej.Podstawa omawianego sposobu wytwarzania i oznaczenia jest inhibitujacy wplyw zwiazków neurotoksycznych na ten enzym. Stad, w ukla¬ dach pomiarowych o dzialaniu ciaglym preparaty enzymatyczne z cholinoesterazy odgrywac moga istotna role. Zasady dzialania takich ukladów opi¬ sane sa miedzy innymi w Anal. Chem. 37, 1378 (1965) i Anal. Biochem. 51, 362 (1973).W literaturze opisano kilka metod wiazania cholinoesterazy wydzielonej z surowicy konskiej.Wykorzystanie do tego celu rozmaitych zeli, a prze¬ de wszystkim zelu skrobiowego przedstawiono w Anal. Chem. 37, 1378 (1965), Anal. Biochem. 19, 587 (1967), Anal. Biochem. 33, 341 (1970) i opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 3 223 593.Ten sam opis patentowy omawia równiez lacze¬ nie enzymu z zelami agarowym i karagenowym.Zastosowanie jako podloza wiazacego poliakrylo- amidu zaproponowano w Biochim. Biophys. Acta 212, 362 (1970) oraz AnaL Biochem. 33, 341 (1970). 10 15 20 30 Czasteczki enzymu moga byc równiez laczone wiazaniami kowalencyjnymi z odpowiednimi gru¬ pami funkcyjnymi makroczasteczek polimerów.Tak na przyklad w Biochem. Biophys. Acta 191, 478 (1969) opisano wiazanie enzymu na podlozu Sepharose 2B, uprzednio aktywowanym bromkiem cyjanu a w Biochim. Biophis. Acta 377, 297 (1975) podano zastosowanie jako podloza bezwodnika po- limaleinowego. W Clin. Chim. Acta 1Z1, 125 (1980) opisano wiazanie enzymu na nieporowatym szkle pod wplywem aldehydu glutarowego lub zwiaz¬ ków karbodwuimidowych, zas w radzieckim opi¬ sie patentowym nr 707 923 opisano laczenie enzy¬ mu ze szklem porowatym lub zelem krzemionko¬ wym aktywowanym chlorkiem kwasu cyjanuro- wego. W Can. J. Biochem. 48, 1314 (1970) podano, ze cholinoesteraze wydzielona z surowicy kon¬ skiej mozna laczyc poprzez wiazania kowalen¬ cyjne, z kompleksem oranz brylantowy Procion DEAE-celuloza.Znane enzymatyczne preparaty cholinoesterazy na podlozach zelowych posiadaja te wade, ze enzym wymywa sie w sposób ciagly z preparatu.Dlatego nie nadaja sie one do zastosowan ciag¬ lych lub dlugotrwalych. W aspekcie przydatnosci do stosowania w automatycznych syfetemach po¬ miarowych, znane enzymatyczne preparaty choli¬ noesterazy zwiazanej z podlozem wiazaniami ko¬ walencyjnymi posiadaja niekorzystne wlasciwosci przeplywowe. 131208131 208 3 4 Ponadto, niektóre podloza takie jak Sepharose 2B sa wrazliwe na wplywy mikrobiologiczne.Celem wynalazku bylo wyeliminowanie poda¬ nych wyzej niekorzystnych cech preparatów. Spo¬ sobem wedlug wynalazku uzyskuje sie enzyma¬ tyczne preparaty cholinoesterazy, które spelniaja wymagania pozwalajace na ich dlugotrwale za¬ stosowanie. Zawieraja one enzym zwiazany che¬ micznie z mikrobiologicznie obojetnym podlozem o odpowiednich wlasciwosciach mechanicznych za¬ pewniajacych osiaganie duzych predkosci prze¬ plywu.Inna zaleta wynalazku jest fakt, ze reakcja la¬ czenia enzymu z podlozem odbywa sie w lagod¬ nych warunkach.Zaobserwowano, ze podane poprzednio wyma¬ gania dotyczace podloza calkowicie spelniaja zy¬ wice wielkoczasteczkowe zawierajace co najmniej 0,1 milirównowaznik (mR)/g, korzystnie 2 do 8 mR/g grup funkcyjnych —COOH, zbudowane z jednostek kwasu akrylowego i/lub kwasu meta¬ krylowego oraz akryloamidu iflub metakryloamidu usieciowane akrylowymi lub allilowymi zwiazka¬ mi sieciujacymi takimi jak N,N'-metyleno-bis (akryloamid), dwuakrylan etylenu lub N,N'-dwu- alliloamid kwasu winowego. Podloza takie moga byc otrzymywane znanymi metodami. Na przy¬ klad akryloamid i/lub metakryloamid kopolimery- zuje sie z kwasem akrylowym i/lub kwasem me¬ takrylowym w obecnosci monomeru siecdujacego.Inna mozliwa metoda polega na uzyskaniu naj¬ pierw usieciowanego polimeru z akryloamidu, ifliflb metakryloamidu stosujac podane wyzej substan¬ cje siediujace, a nastepnie otrzymaniu odpowied¬ niej ilosci grup funkcyjnych —COOH w wyniku czesciowej hydrolizy grup amidowokwasowych uzyskanego polimeru.Do tego typu podlozy wielkoczasteczkowych na¬ leza oferowane przez Reanal Finomvegyszergyar (Ijjidapeszt, Wegry), enzymatyczne podloza typu Akrilex C wytwarzane z perelkowego kopolimeru akryloamidu z N^-metyleno-bisCakryloainideni) typu Akrilex P — na przyklad Akrilex P-30, R-100 lub P-200 przez ich czesciowa hydrolize z kwasem (przykladowo z kwasem solnym lub z innym sil¬ nymi kwasem) albo z zasada (przykladowo z wo¬ dorotlenkiem sodu, weglanem sodu lub inna silna zasada).W substancjach tych, okolo 50*/o obecnych gruo —CONHj przeksztalca sie w grupy karboksylowe na drodze hydrolizy. Pozostale grupy —CONH2 nie ulegaja hydrolizie nawet w ostrych warun¬ kach reakcji. W rezultacie pomiedzy grupami karboksylowymii zhydrólizowanego kopolimeru roz¬ mieszczone sa niezmienione grupy —CONH2.Utrzymuja one grupy karboksylowe w korzystnym polozeniu sterycznym. Jezeli sprzeganie enzymu z grupami karboksylowymi nastepuje w wyniku aktywacji pochodnymi karbodwuimidowymi me¬ toda znana jako taka, ich korzystne steryczne po¬ lozenie powoduje, ze grupy funkcyjne pojedyn¬ czych czasteczek przylaczanego enzymu nie od- dzialywuja ze soba. Stad preparaty ze zwiazanym enzymem moga miec bardzo silne specyficzne dzialanie.Otrzymane innymi metodami zwiazki polime- ryczne z kwasem akrylowym iAub kwasem meta¬ krylowym oraz monomerami akryloamidowymi iAub metakryloamidowymi polaczonymi ze soba 5 dwufunkcyjnym monomerem sieciujacym i zawie¬ rajace co najmniej 0,1 mR/g grup funkcyjnych —COOH posiadaja podobne korzystne wlasciwosci.Wystepuja one jako granulaty perelkowe umozli¬ wiajace duza predkosc przeplywu a jednoczesnie sa chemicznie obojetne i calkowicie odporne na dzialanie mikroorganizmów.Funkcyjne grupy karboksylowe tych podlozy moga byc aktywowane dobrze znana metoda z po¬ chodnymi karbodwuimidowymi. Uzyskiwane akty¬ wowane podloza moga wiazac enzym cholinoeste- raze. Reakcja ta moze byc przeprowadzana na¬ wet w lagodnych warunkach przy temperaturze od 0 do 4°C w srodowisku o pH okolo 7,0.W sposobie wedlug wynalazku zywice wielko¬ czasteczkowa zawierajaca co najmniej 0,1 mR/g grup funkcyjnych —COOH, korzystnie 2—8 mR/g zlozona z jednostek kwasu akrylowego iAub kwa¬ su metakrylowego oraz akryloamidu i/lub meta¬ kryloamidu usieciowana allilowym lub akrylowym zwiazkiem sieciujacym, poddaje sie dzialaniu po¬ chodnej karbodwuimidowej rozpuszczalnej w tem¬ peraturze ponizej 0°C w wodzie lub rozpuszczal¬ niku organicznym. Roztwór cholinoesterazy o pH od 4,5 do 8,5 nanosi sie na uzyskane aktywowane podloze, po czym otrzymany produkt przemywa sie i suszy, jezeli zachodzi potrzeba.Szczególnie korzystnymi podlozami cholinoeste¬ razy moga byc omówione wyzej polimery typu Akrilex C.W sposobie wedlug wynalazku mozna stosowac cholinoesteraze niezaleznie od jej pochodzenia i metody wydzielania.Jako pochodne karbodwuimidowe do aktywacji podloza polimerycznego moga byc zastosowane na przyklad p-toluenosulfonian N-cykloheksylo-N'-[P- - rowodorek N-etylo-N'-(3-dwumetyloaminopropylo)- 4tarbodwuimidu. Do zastosowan tych zaleca sie uzywanie karbodwuimidów rozpuszczalnych w wo¬ dzie. Z pochodnych karbodwuimidowych rozpusz¬ czajacych sie tylko w rozpuszczalnikach organicz¬ nych, w sposobie wedlug wynalazku moga byc uzywane tylko te, które nawet w niskiej tempe¬ raturze, to jest ponizej 0°C wykazuja odpowied¬ nia rozpuszczalnosc w danym rozpuszczalniku.Cholinoesteraze nanosi sie z roztworu o pH od 4,5 do 8,5, korzystnie z roztworu prawie obojet¬ nego p pH okolo 7,0. Korzystnie wykorzystuje sie srodowisko 0,1 molowego buforu na bazie fosfo¬ ranu potasu o pH =7,0. j Preparat ze zwiazanym enzymem otrzymany w reakcji sprzegania przemywa sie i jezeli zachodzi potrzeba suszy sie. Preparat ten mozna równiez przechowywac w postaci wodnej zawiesiny w tem¬ peraturze od 0 do 4°C.Preparaty enzymatyczne wytwarzane sposobem wedlug wynalazku posiadaja aktywnosc wlasciwa wynoszaca 100—200 jednostek (1 g kserozelu, co w porównaniu z danymi o aktywnosciach poda¬ nymi w Anal. Chem. 37, 1378 (1965), Anal. Biochem. 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60131 208 5 19, 587 (1967), Biochim. Biophys. Acta 212, 362 (1970) i Anal. Biochem. 51, 362 (1973) potwierdza korzysc w ich praktycznych zastosowaniach.W optymalnych warunkach stosowania, to jest w srodowisku lekfeo alkalicznym przy pH = 8, preparaty enzymatyczne wytworzone sposobem wedlug wynalazku sa bardziej stabilne niz sam rozpuszczalny enzym. Jest to istotna zaleta przy ich dlugotrwalych zastosowaniach.Badania porównawcze i wyniki. Aktywnosc oraz aktywnosc wlasciwa preparatów enzymatycznych otrzymanych sposobem wedlug wynalazku porów¬ nywano z odpowiednimi danymi dla preparatów cholinoesterazy na innych podlozach. Badania te wykonano z nastepujacymi substancjami opisany¬ mi w literaturze: a. Podloze typu Enzacryl AA — kopolimer akry- loamidu i N^-metyleno-bis-akryloamidu, zawie¬ rajacy jako grupy funkcyjne aromatyczne grupy aminowe, wytwarzany przez Koch-Light Labora¬ tories Ltd. Colnbrock, Bucks, Wielka Brytania.Zgodnie z receptura firmy wytwarzajacej, Koch- -Light Laboratories Ltd., KL 3, strona 343 (1970), kopolimer poddawano reakcji dwuazanowania.Mieszanine 100 mg zdwuazowanego Enzacrylu AA i 2,5 mg cholinoesterazy rozprowadzono w 0,5 ml buforu o pH = 7,5 0,1 molowego w stosun¬ ku do fosforanu potasowego i mieszano przez 8 godzin w temperaturze od 0 do 4°C, zawiesine odstawiono do lodówki na 16 godzin utrzymujac temperature 4°C, po czym mieszano ponownie przez 8 godzin w temperaturze od 0 do 4°C i po¬ nownie przechowywano w lodówce, w temperatu¬ rze 4°C, przez 16 godzin. b. Podloze typu Enzacryl AH — kopolimer akry- loamidu, hydrazydu kwasu akrylowego i N,N'- -metyleno-bis(akryloamidu) wytwarzane przez Koch-Light Laboratories Ltd., Clonbrock, Bucks, Wielka Brytania. Zgodnie z receptura producenta Koch-Light Laboratories Ltd., KL 3 strona 344 (1970) podloze aktywowano azotynem sodu w sro¬ dowisku kwasnym. Do 100 mg aktywowanego po¬ dloza zawierajacego grupy funkcyjne w postaci azydków kwasowych dodano 2,5 mg enzymu cho¬ linoesterazy w 0,1 molowym buforze boranowym o pH = 8. Otrzymana zawiesine mieszano w wa¬ runkach opisanych wyzej, w ,punkcie a. c. Podloze z karboksymetylocelulozy o zdolnosci wiazania odpowiadajacej zawartosci 2,3 mR/g grup —COOH, wytwarzany przez Reanal Finomvegy- szergyar, Budapeszt, Wegry. Do zawiesiny 93 mg karboksymetylocelulozy w 5 ml buforu o pH = 7,0 0,1 molowego w stosunku do fosforanu potasowe¬ go dodawano, ciagle mieszajac, 50 mg chlorowo¬ dorku N-etylo-N,-(3-dwumetyloaminopropylo)-kar- bodwuimidu rozpuszczonego w 2,5 ml oziebionego do temperatury .+4°C roztworu buforowego. Po 10 minutach mieszania dodano do zawiesiny 25 mg cholinoeterazy rozpuszczonej w 2,5 ml oziebionego do temperatury +4°C roztworu buforowego. Re¬ akcje enzymu z aktywowanym podlozem prowa¬ dzono w temperaturze od 0 do 4°C w przeciagu 48 godzin. W tym czasie mieszanine dwukrotnie mieszano przez 6 godzin za kazdym razem. d. Podloze z bezwodnika polimaleinowego wy- f twarzane przez firme Merck w Darmstadt, RFN.Cholinoesteraze polaczono z bezwodnikiem roli- maleinowym postepujac zgodnie z instrukcja pro¬ ducenta, Biochemics Merck, dotyczaca podloza dla 5 enzymu z bezwodnika polimaleinowego poprzecz¬ nie sieciowanego. 1 g materialu podloza rozpro¬ wadzono na zawiesine w 25 ml buforu o pH = 7,0 0,05 molowego w stosunku do fosforanu potaso¬ wego o temperaturze 0°C. 10 Zawiesine mieszano przez 1 minute, po czym dodawano do niej roztwór 0,5 g cholinoesterazy w 5 ml roztworu buforowego, oziebiony do tem¬ peratury +4°C. Wartosc pH mieszaniny reakcyj¬ nej utrzymywano w granicach od 8 do 9 dodajac 15 w sposób ciagly 1 N wodny roztwór wodorotlenku sodowego. Dodawanie zasady kontynuowano do momentu, kiedy pH mieszaniny pozostawalo nie¬ zmienione przez okolo 0,5 godziny.W celu usuniecia protein nie zwiazanych wia- 20 zaniami kowalencyjnymi, otrzymane w reakcjach opisanych wyzej, w punktach od a do d, prepa¬ raty enzymatyczne filtrowano lub odwirowywano i przemyto kolejno buforem stosowanym w re¬ akcji wiazania enzyimu, 0,&—1 molowym roztwo- 25 rem chlorku sodowego w tym samym buforze i ponownie buforem stosowanym w reakcji. Jony roztworu buforowego usuwano nastepnie przemy¬ wajac stale preparaty woda. Otrzymane prepa¬ raty ze zwiazanym enzymem liofilizowano. Pro- 30 dukty przechowywano w lodówce w temperatu¬ rze 4°C.Zawartosc protein zwiazanych, w preparacie enzymatycznym okreslano metoda posrednia jako róznice ilosci protein wprowadzonych do miesza- 35 niny reakcyjnej i pozostalych w roztworze po re¬ akcji oraz w roztworach przemywajacych. Zawar¬ tosc protein w roztworach cholinoesterazy ozna¬ czano metoda biuretowa podana przez A. G. Gor- nell, C. S. Bardwaill, M. M. David w Bid. Chem. 40 177, 751 (1949).Aktywnosc rozpuszczonej i zwiazanej cholino¬ esterazy okreslano oznaczajac zawartosc grup sulf- hydrylowych uwalnianych przy rozkladzie jodku butyrylotiocholiny. Zawartosc grup sulfhydrylo- 45 wych oznaczano z dwusiarczkiem bis-(5-karboksy- -4-nitrofenylu) wedlug G. L. Ellmana, K. D. Court- ney, V. Andres Jr., R. M. Featherstone: w Biochem.Pharmacol. 7, 88 (1961). Jako jednostke aktyw¬ nosci przyjeto ilosi enzymu katalizujaca przemia- 50 ne 1 |i mola jodku butyrylotiocholiny w tempe¬ raturze 25°C, w przeciagu 1 minuty w optymal¬ nych dla katalitycznej aktywnosci warunkach pH, to jest 7,6 dla enzymu rozpuszczonego i 8,0 dla enzymu zwiazanego. 55 Wyniki badan zebrano w Tablicy 1.Z danych w Tablicy 1 wynika, ze preparaty wedlug wynalazku posiadaja najwieksza aktyw¬ nosc zarówno w przeliczeniu na sucha mase pod¬ loza i proteiny jak i w przeliczeniu na zawartosc 60 proteiny. Aktywnosc preparatu enzymatycznego z podlozem z bezwodnika polimaleinowego jest zbli¬ zona do aktywnosci nowego produktu. Jednak ze wzgledu na to,, ze podloze z bezwodnika polima¬ leinowego wytwarzane jest metoda polimeryzacji •5 blokowej charakterystyka przeplywowa kolumny131 208 Podloze Enzacryl AA Enzacryl AH Akrilex C-100 (przyklad I) Karboksymetyloceluloza | Bezwodnik polimaleinowy Proteiny zwiazane % 100 61,8 24,5 5,5 23,3 Tablica Aktywnosc wiazana % 0 0,2 7,5 0,2 7,5 1 Aktywnosc w stanie rozpuszczo¬ nym % 0 60,7 60 3,5 31,3 Ubytek aktywnosci % 103 39,1 32,5 96,3 61,2 Aktywnosc produktu # 0 0,2 120 2 106 Aktywnosc wlasciwa % ¦ **} 0 0,3 30,6 3,6 32,2 *) jednostka/mg suchej masy **) aktywnosc wlasciwa enzymu rozpuszczonego przyjeto za 100%. z preparatem na tym podlozu jest "znacznie gor¬ sza niz kolumn z produktem wytworzonym spo¬ sobem wedlug wynalazku zawierajacym enzym zwiazany z podlozem otrzymanym w wyniku po¬ limeryzacji perelkowej.Wynalazek jest szczególowo wyjasniony w ni¬ zej podanych przykladach.Przyklad I. Przygotowano zawiesine 100,6 mg kserozelu Akrilex C-100 w 5 ml buforu o pH = 7,0 zawierajacego 0,1 mola fosforanu potasowego. Mie¬ szajac ciagle zawiesine dodawano do niej oziebio¬ ny do temperatury +4°C roztwór 102,5 mg chloro¬ wodorku N-etylo-N'-(3-dwumetyloaminopropylo)- -karbodwuimidu w roztworze buforowym. Po 10 minutach mieszania dodano roztwór 47,4 mg cholinoesterazy rozpuszczonej w 2,5 ml roztworu buforowego. Mieszanine utrzymywano w tempe¬ raturze 0—4°C przez 48 godzin.W tym czasie zawiesine mieszano dwukrotnie przez 6 godzin za kazdym razem. Zel odfiltro¬ wano i przemyto trzykrotnie 10 ml porcjami bu¬ foru o pH = 7,0 0,1 molowego w stosunku do fos¬ foranu potasowego, trzykrotnie 10 ml porcjami buforu o pH = 7,0 0,1 molowego w stosunku do fosforanu potasowego i 0,5 molowego w stosunku dp chlorku sodowego i ponownie trzykrotnie 10 ml porcjami buloru o pH 7,0 0,1 molowego w sto¬ sunku do fosforanu potasu.Dalej przemywano cztery razy 25 ml porcjami wody destylowanej, a otrzymany wolny od soli zel podano liofilizacji. Uzyskano 106,2 mg prepa¬ ratu ze ^wiazana cholinoesleraza o aktywnosci: hydroliza 120 y moli jodku butyrylotiocholiny/mi- nute/gram suchej substancji.Przykladu. Przygotowano zawiesine 102 mg kserozelu Akrilex C-100 w 5 ml buforu o pH = 7,0 0,1 molowego w stosunku do fosforanu potasowe¬ go. Oziebiono ja 0°C i ciagle mieszajac doda¬ wano oziebiony do temperatury H-4PC roztwór 202 ing p-toluenosulfonianu N-cykloheksylo-N,- (- forze. Po 10 minutach mieszania dodano do mie¬ szaniny reakcyjnej oziebiony do temperatury +4°C roztwór 49 mg cholinoesterazy w 2,5 ml roztworu buforowego* Mieszanine utrzymywano w tempe¬ raturze od 0 do 4°C przez 48 godzin.W tym czasie zawiesine mieszano dwukrotnie 20 25 30 35 45 50 przez 6 godzin za kazdym razem. Zel odfiltrowa¬ no i przemyto trzykrotnie 10 ml porcjami buforu o pH = 7,0 0,1 molowego w stosunku do fosforanu potasowego, trzykrotnie 10 ml porcjami buforu o pH = 7,0 0,1 molowego w stosunku do fosforanu potasowego oraz 0,5 molowego w stosunku do chlorku sodowego, trzykrotnie 10 ml porcjami bu¬ foru o pH = 7,0 0,1 molowego w stosunku do fos¬ foranu potasowego. Dalej zel przemywano cztery razy 25 ml porcjami wody destylowanej, a otrzy¬ many wolny od soli zel liofilizowano. Uzyskano 110 mg cholinoesterazy o aktywnosci: hydroliza 110 ^i moli butyTylotiocholiny/minute/gram suchej substancji. PL PL

Claims (5)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania enzymatycznych prepa¬ ratów ze zwiazana cholinoesteraza, znamienny tym, ze zywice polimeryczna zawierajaca co naj¬ mniej 0,1 mR/g grup funkcyjnych —COOH, zlo¬ zona z jednostek kwasu akrylowego i/lub kwasu 40 metakrylowego oraz akryloarnidu i/lub metakrylo- amidu usieciowana allilowymi lub akrylowymi zwiazkami sieciujacymi, poddaje sie dzialaniu po¬ chodnej karbodwuimidowej rozpuszczalnej w wo¬ dzie lub rozpuszczalniku organicznym w tempe¬ raturze ponizej 0°C a na otrzymane, zaktywowa- ne podloze nanosi sie roztwór enzymu cholino¬ esterazy o pH od 4,5 do 8,5, a otrzymany produkt przemywa sie i suszy jezeli zachodzi potrzeba.
2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako substancje wyjsciowa stosuje sie zywice po- limeryczna zawierajaca od 2 do 8 mR/g grup funkcyjnych —COOH.
3. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze jako substancje wyjsciowa stosuje sie po- 55 limer otrzymany w wyniku czesciowej kwasnej lub zasadowej hydrolizy perelkowego kopolimeru akryloarnidu z N,N'-metyleno-bis(akryloamidem).
4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze reakcje cholinoesterazy z podlozem prowadzi 60 sie stosujac roztwór enzymu w buforze o pH = 7,0 i stezeniu 0,1 molowym w stosunku do fosforanu potasowego.
5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze reakcje cholinoesterazy z aktywowanym podlozem 65 prowadzi sie w temperaturze od 0 do 4°C. Cena 100 zl WZGraf. Z-d 2 — 546/86 — PL PL
PL1982236995A 1981-07-17 1982-06-18 Process for preparing enzymatic preparations with bounded cholinesterase PL131208B1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU812088A HU184468B (en) 1981-07-17 1981-07-17 Process for preparing immobilized cholinesterase enzyme preparation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL236995A1 PL236995A1 (en) 1983-06-06
PL131208B1 true PL131208B1 (en) 1984-10-31

Family

ID=10957702

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL1982236995A PL131208B1 (en) 1981-07-17 1982-06-18 Process for preparing enzymatic preparations with bounded cholinesterase

Country Status (10)

Country Link
US (1) US4556637A (pl)
EP (1) EP0083582B1 (pl)
BG (1) BG49165A3 (pl)
CS (1) CS258449B2 (pl)
CU (1) CU21410A3 (pl)
DD (1) DD263663A7 (pl)
HU (1) HU184468B (pl)
PL (1) PL131208B1 (pl)
SU (1) SU1572418A3 (pl)
WO (1) WO1983000345A1 (pl)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3872999T2 (de) * 1987-09-18 1993-03-11 Eastman Kodak Co Verknuepfung von verbindungen mit polymeren teilchen unter verwendung von carbamoyloniumvebindungen.
US4923810A (en) * 1988-08-24 1990-05-08 Genzyme Corporation Resolution of glycidyl esters to high enantiomeric excess
PL211815B1 (pl) 2007-11-19 2012-06-29 Inst Chemii Organicznej Polska Akademia Nauk Enzym esteraza lowastatyny osadzony na nośniku nierozpuszczalnym w wodzie, sposób osadzania enzymu, zastosowanie enzymu esterazy lowastatyny osadzonego na nosniku nierozpuszczalnym w wodzie, przepływowy reaktor biokatalityczny ze złożem oraz sposób wytwarzania i/lub oczyszczania symwastatyny
RU2546245C1 (ru) * 2013-10-14 2015-04-10 Федеральное Государственное Автономное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Сибирский Федеральный Университет" (Сфу) Ферментный препарат на основе иммобилизованной бутирилхолинэстеразы и способ его приготовления
PL3196315T3 (pl) 2016-01-19 2020-07-13 Oritest Spol. S R.O. Kuliste pelety, proces produkcyjny takich peletów, zastosowanie oraz rurka detekcyjna zawierająca takie pelety
CN109187386A (zh) * 2018-08-23 2019-01-11 成都众粒生物科技有限公司 用于检测有机磷和氨基甲酸酯类农药含量的凝胶及其应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3223593A (en) * 1963-08-14 1965-12-14 Melpar Inc Method of preparing immobilized serum cholinesterase and product thereof
SU586182A1 (ru) * 1974-08-30 1977-12-30 Предприятие П/Я А-7815 Способ получени иммобилизованной амилазы
SE7712058L (sv) * 1976-11-12 1978-05-13 Ceskoslovenska Akademie Ved Tredimensionell berare av oorganiskt, porost material och en reaktiv polymer och ett forfarande for framstellning derav
SU707923A1 (ru) * 1977-09-27 1980-01-05 Институт Кибернетики Ан Эстонской Сср Способ получени иммобилизованных холинэстераз
SU1022988A1 (ru) * 1979-09-28 1983-06-15 Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР Стабилизированна урокиназа,обладающа тромболитической активностью,и способ ее получени
EP0029411B1 (fr) * 1979-11-15 1984-05-30 Battelle Memorial Institute Composition adhésive pour le dépôt d'un revêtement adhésif fixateur de molécules biofonctionnelles, revêtement obtenu et procédé pour sa préparation, substrat recouvert du revêtement et son utilisation comme biocatalyseur
HU182171B (en) * 1980-07-17 1983-12-28 Reanal Finomvegyszergyar Process for isolating aminoacylase enzyme from kidney of mammalians

Also Published As

Publication number Publication date
CS491182A2 (en) 1987-07-16
EP0083582A4 (en) 1984-01-31
SU1572418A3 (ru) 1990-06-15
BG49165A3 (en) 1991-08-15
EP0083582A1 (en) 1983-07-20
US4556637A (en) 1985-12-03
DD263663A7 (de) 1989-01-11
CU21410A3 (en) 1988-02-15
CS258449B2 (en) 1988-08-16
PL236995A1 (en) 1983-06-06
WO1983000345A1 (en) 1983-02-03
HU184468B (en) 1984-08-28
EP0083582B1 (en) 1985-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4070246A (en) Reactive matrices
Pereira et al. Kinetic studies of lipase from Candida rugosa: a comparative study between free and immobilized enzyme onto porous chitosan beads
Tuncel et al. Cibacron Blue F3G-A-attached monosize poly (vinyl alcohol)-coated polystyrene microspheres for specific albumin adsorption
US4737560A (en) Polymer beads
US5079155A (en) Fluorocarbon polymer support for chromatographic separations, diagnostic assays and enzyme immobilization
Horák et al. Properties of RNase A immobilized on magnetic poly (2‐hydroxyethyl methacrylate) microspheres
Ivanov et al. Conjugation of penicillin acylase with the reactive copolymer of N‐isopropylacrylamide: A step toward a thermosensitive industrial biocatalyst
US3959079A (en) Insolubilization of proteins by chemical activation of a polymerized support and crosslinking of the protein to the support
Fernández-Lafuente et al. Additional stabilization of penicillin G acylase-agarose derivatives by controlled chemical modification with formaldehyde
JPS638749B2 (pl)
KR940005581B1 (ko) 효소의 고정화방법 및 고정화 효소
PL131208B1 (en) Process for preparing enzymatic preparations with bounded cholinesterase
Yavuz et al. Concanavalin A immobilized affinity adsorbents for reversible use in yeast invertase adsorption
Ohtsuka et al. Immobilization of α‐amylase on polymeric carriers having different structures
US4279998A (en) Regenerable insoluble support for protein immobilization
Rejikumar et al. Immobilization of β‐galactosidase onto polymeric supports
Valentova et al. Pepsin immobilized by covalent fixation to hydroxyalkyl methacrylate gels: preparation and characterization
Minamoto et al. Polymethylglutamate as a new matrix for covalently immobilized enzymes: preparation and properties of urease and uricase
Rexová-Benková et al. Endo-D-galacturonanase immobilized by adsorption on porous polyethyleneterephthalate
Li et al. Chitosaneous hydrogel beads for immobilizing neutral protease for application in the preparation of low molecular weight chitosan and chito‐oligomers
Kamra et al. Crosslinked concanavalin AO-(diethylaminoethyl)-cellulose—an affinity medium for concanavalin A-interacting glycoproteins
Chase et al. Immobilization of enzymes on poly (vinyl alcohol)‐coated perfluorocarbon supports: comparison of techniques for the immobilization of trypsin and α‐amylase on poly (vinyl alcohol)‐coated solid and liquid perfluorocarbons
Zhang et al. Immobilization of hemoglobin on chitosan films as mimetic peroxidase
Yusof et al. Carrier-free enzyme immobilization by cross-linked enzyme aggregates (CLEA) technology
JPH034575B2 (pl)