Opis patentowy opublikowano: 1987 03 10 131208 Int. CL* C12N 11/08 Twórcy wynalazku: L&szló Boross, Kamilla Kovacs nce Szentes, Bcla Szajani Uprawniony z patentu: Reanal Finoi*ivegyszergysr, Budapeszt (Wegry) Sposób wytwarzania enzymatycznych preparatów ze zwiazana cholinoesteraza Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania no¬ wych enzymatycznych preparatów ze zwiazana cholinoesteraza.Wiadomo, ze do wykrywania zwiazków neuro- toksycznych jak estry fosforanowe, karbaminia- nowe i siarczanowe oraz do oznaczania ich za¬ wartosci w powietrzu i wodzie moze byc stoso¬ wany enzym cholinoesteraza, wydzielany najczes¬ ciej z surowicy konskiej.Podstawa omawianego sposobu wytwarzania i oznaczenia jest inhibitujacy wplyw zwiazków neurotoksycznych na ten enzym. Stad, w ukla¬ dach pomiarowych o dzialaniu ciaglym preparaty enzymatyczne z cholinoesterazy odgrywac moga istotna role. Zasady dzialania takich ukladów opi¬ sane sa miedzy innymi w Anal. Chem. 37, 1378 (1965) i Anal. Biochem. 51, 362 (1973).W literaturze opisano kilka metod wiazania cholinoesterazy wydzielonej z surowicy konskiej.Wykorzystanie do tego celu rozmaitych zeli, a prze¬ de wszystkim zelu skrobiowego przedstawiono w Anal. Chem. 37, 1378 (1965), Anal. Biochem. 19, 587 (1967), Anal. Biochem. 33, 341 (1970) i opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 3 223 593.Ten sam opis patentowy omawia równiez lacze¬ nie enzymu z zelami agarowym i karagenowym.Zastosowanie jako podloza wiazacego poliakrylo- amidu zaproponowano w Biochim. Biophys. Acta 212, 362 (1970) oraz AnaL Biochem. 33, 341 (1970). 10 15 20 30 Czasteczki enzymu moga byc równiez laczone wiazaniami kowalencyjnymi z odpowiednimi gru¬ pami funkcyjnymi makroczasteczek polimerów.Tak na przyklad w Biochem. Biophys. Acta 191, 478 (1969) opisano wiazanie enzymu na podlozu Sepharose 2B, uprzednio aktywowanym bromkiem cyjanu a w Biochim. Biophis. Acta 377, 297 (1975) podano zastosowanie jako podloza bezwodnika po- limaleinowego. W Clin. Chim. Acta 1Z1, 125 (1980) opisano wiazanie enzymu na nieporowatym szkle pod wplywem aldehydu glutarowego lub zwiaz¬ ków karbodwuimidowych, zas w radzieckim opi¬ sie patentowym nr 707 923 opisano laczenie enzy¬ mu ze szklem porowatym lub zelem krzemionko¬ wym aktywowanym chlorkiem kwasu cyjanuro- wego. W Can. J. Biochem. 48, 1314 (1970) podano, ze cholinoesteraze wydzielona z surowicy kon¬ skiej mozna laczyc poprzez wiazania kowalen¬ cyjne, z kompleksem oranz brylantowy Procion DEAE-celuloza.Znane enzymatyczne preparaty cholinoesterazy na podlozach zelowych posiadaja te wade, ze enzym wymywa sie w sposób ciagly z preparatu.Dlatego nie nadaja sie one do zastosowan ciag¬ lych lub dlugotrwalych. W aspekcie przydatnosci do stosowania w automatycznych syfetemach po¬ miarowych, znane enzymatyczne preparaty choli¬ noesterazy zwiazanej z podlozem wiazaniami ko¬ walencyjnymi posiadaja niekorzystne wlasciwosci przeplywowe. 131208131 208 3 4 Ponadto, niektóre podloza takie jak Sepharose 2B sa wrazliwe na wplywy mikrobiologiczne.Celem wynalazku bylo wyeliminowanie poda¬ nych wyzej niekorzystnych cech preparatów. Spo¬ sobem wedlug wynalazku uzyskuje sie enzyma¬ tyczne preparaty cholinoesterazy, które spelniaja wymagania pozwalajace na ich dlugotrwale za¬ stosowanie. Zawieraja one enzym zwiazany che¬ micznie z mikrobiologicznie obojetnym podlozem o odpowiednich wlasciwosciach mechanicznych za¬ pewniajacych osiaganie duzych predkosci prze¬ plywu.Inna zaleta wynalazku jest fakt, ze reakcja la¬ czenia enzymu z podlozem odbywa sie w lagod¬ nych warunkach.Zaobserwowano, ze podane poprzednio wyma¬ gania dotyczace podloza calkowicie spelniaja zy¬ wice wielkoczasteczkowe zawierajace co najmniej 0,1 milirównowaznik (mR)/g, korzystnie 2 do 8 mR/g grup funkcyjnych —COOH, zbudowane z jednostek kwasu akrylowego i/lub kwasu meta¬ krylowego oraz akryloamidu iflub metakryloamidu usieciowane akrylowymi lub allilowymi zwiazka¬ mi sieciujacymi takimi jak N,N'-metyleno-bis (akryloamid), dwuakrylan etylenu lub N,N'-dwu- alliloamid kwasu winowego. Podloza takie moga byc otrzymywane znanymi metodami. Na przy¬ klad akryloamid i/lub metakryloamid kopolimery- zuje sie z kwasem akrylowym i/lub kwasem me¬ takrylowym w obecnosci monomeru siecdujacego.Inna mozliwa metoda polega na uzyskaniu naj¬ pierw usieciowanego polimeru z akryloamidu, ifliflb metakryloamidu stosujac podane wyzej substan¬ cje siediujace, a nastepnie otrzymaniu odpowied¬ niej ilosci grup funkcyjnych —COOH w wyniku czesciowej hydrolizy grup amidowokwasowych uzyskanego polimeru.Do tego typu podlozy wielkoczasteczkowych na¬ leza oferowane przez Reanal Finomvegyszergyar (Ijjidapeszt, Wegry), enzymatyczne podloza typu Akrilex C wytwarzane z perelkowego kopolimeru akryloamidu z N^-metyleno-bisCakryloainideni) typu Akrilex P — na przyklad Akrilex P-30, R-100 lub P-200 przez ich czesciowa hydrolize z kwasem (przykladowo z kwasem solnym lub z innym sil¬ nymi kwasem) albo z zasada (przykladowo z wo¬ dorotlenkiem sodu, weglanem sodu lub inna silna zasada).W substancjach tych, okolo 50*/o obecnych gruo —CONHj przeksztalca sie w grupy karboksylowe na drodze hydrolizy. Pozostale grupy —CONH2 nie ulegaja hydrolizie nawet w ostrych warun¬ kach reakcji. W rezultacie pomiedzy grupami karboksylowymii zhydrólizowanego kopolimeru roz¬ mieszczone sa niezmienione grupy —CONH2.Utrzymuja one grupy karboksylowe w korzystnym polozeniu sterycznym. Jezeli sprzeganie enzymu z grupami karboksylowymi nastepuje w wyniku aktywacji pochodnymi karbodwuimidowymi me¬ toda znana jako taka, ich korzystne steryczne po¬ lozenie powoduje, ze grupy funkcyjne pojedyn¬ czych czasteczek przylaczanego enzymu nie od- dzialywuja ze soba. Stad preparaty ze zwiazanym enzymem moga miec bardzo silne specyficzne dzialanie.Otrzymane innymi metodami zwiazki polime- ryczne z kwasem akrylowym iAub kwasem meta¬ krylowym oraz monomerami akryloamidowymi iAub metakryloamidowymi polaczonymi ze soba 5 dwufunkcyjnym monomerem sieciujacym i zawie¬ rajace co najmniej 0,1 mR/g grup funkcyjnych —COOH posiadaja podobne korzystne wlasciwosci.Wystepuja one jako granulaty perelkowe umozli¬ wiajace duza predkosc przeplywu a jednoczesnie sa chemicznie obojetne i calkowicie odporne na dzialanie mikroorganizmów.Funkcyjne grupy karboksylowe tych podlozy moga byc aktywowane dobrze znana metoda z po¬ chodnymi karbodwuimidowymi. Uzyskiwane akty¬ wowane podloza moga wiazac enzym cholinoeste- raze. Reakcja ta moze byc przeprowadzana na¬ wet w lagodnych warunkach przy temperaturze od 0 do 4°C w srodowisku o pH okolo 7,0.W sposobie wedlug wynalazku zywice wielko¬ czasteczkowa zawierajaca co najmniej 0,1 mR/g grup funkcyjnych —COOH, korzystnie 2—8 mR/g zlozona z jednostek kwasu akrylowego iAub kwa¬ su metakrylowego oraz akryloamidu i/lub meta¬ kryloamidu usieciowana allilowym lub akrylowym zwiazkiem sieciujacym, poddaje sie dzialaniu po¬ chodnej karbodwuimidowej rozpuszczalnej w tem¬ peraturze ponizej 0°C w wodzie lub rozpuszczal¬ niku organicznym. Roztwór cholinoesterazy o pH od 4,5 do 8,5 nanosi sie na uzyskane aktywowane podloze, po czym otrzymany produkt przemywa sie i suszy, jezeli zachodzi potrzeba.Szczególnie korzystnymi podlozami cholinoeste¬ razy moga byc omówione wyzej polimery typu Akrilex C.W sposobie wedlug wynalazku mozna stosowac cholinoesteraze niezaleznie od jej pochodzenia i metody wydzielania.Jako pochodne karbodwuimidowe do aktywacji podloza polimerycznego moga byc zastosowane na przyklad p-toluenosulfonian N-cykloheksylo-N'-[P- - rowodorek N-etylo-N'-(3-dwumetyloaminopropylo)- 4tarbodwuimidu. Do zastosowan tych zaleca sie uzywanie karbodwuimidów rozpuszczalnych w wo¬ dzie. Z pochodnych karbodwuimidowych rozpusz¬ czajacych sie tylko w rozpuszczalnikach organicz¬ nych, w sposobie wedlug wynalazku moga byc uzywane tylko te, które nawet w niskiej tempe¬ raturze, to jest ponizej 0°C wykazuja odpowied¬ nia rozpuszczalnosc w danym rozpuszczalniku.Cholinoesteraze nanosi sie z roztworu o pH od 4,5 do 8,5, korzystnie z roztworu prawie obojet¬ nego p pH okolo 7,0. Korzystnie wykorzystuje sie srodowisko 0,1 molowego buforu na bazie fosfo¬ ranu potasu o pH =7,0. j Preparat ze zwiazanym enzymem otrzymany w reakcji sprzegania przemywa sie i jezeli zachodzi potrzeba suszy sie. Preparat ten mozna równiez przechowywac w postaci wodnej zawiesiny w tem¬ peraturze od 0 do 4°C.Preparaty enzymatyczne wytwarzane sposobem wedlug wynalazku posiadaja aktywnosc wlasciwa wynoszaca 100—200 jednostek (1 g kserozelu, co w porównaniu z danymi o aktywnosciach poda¬ nymi w Anal. Chem. 37, 1378 (1965), Anal. Biochem. 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60131 208 5 19, 587 (1967), Biochim. Biophys. Acta 212, 362 (1970) i Anal. Biochem. 51, 362 (1973) potwierdza korzysc w ich praktycznych zastosowaniach.W optymalnych warunkach stosowania, to jest w srodowisku lekfeo alkalicznym przy pH = 8, preparaty enzymatyczne wytworzone sposobem wedlug wynalazku sa bardziej stabilne niz sam rozpuszczalny enzym. Jest to istotna zaleta przy ich dlugotrwalych zastosowaniach.Badania porównawcze i wyniki. Aktywnosc oraz aktywnosc wlasciwa preparatów enzymatycznych otrzymanych sposobem wedlug wynalazku porów¬ nywano z odpowiednimi danymi dla preparatów cholinoesterazy na innych podlozach. Badania te wykonano z nastepujacymi substancjami opisany¬ mi w literaturze: a. Podloze typu Enzacryl AA — kopolimer akry- loamidu i N^-metyleno-bis-akryloamidu, zawie¬ rajacy jako grupy funkcyjne aromatyczne grupy aminowe, wytwarzany przez Koch-Light Labora¬ tories Ltd. Colnbrock, Bucks, Wielka Brytania.Zgodnie z receptura firmy wytwarzajacej, Koch- -Light Laboratories Ltd., KL 3, strona 343 (1970), kopolimer poddawano reakcji dwuazanowania.Mieszanine 100 mg zdwuazowanego Enzacrylu AA i 2,5 mg cholinoesterazy rozprowadzono w 0,5 ml buforu o pH = 7,5 0,1 molowego w stosun¬ ku do fosforanu potasowego i mieszano przez 8 godzin w temperaturze od 0 do 4°C, zawiesine odstawiono do lodówki na 16 godzin utrzymujac temperature 4°C, po czym mieszano ponownie przez 8 godzin w temperaturze od 0 do 4°C i po¬ nownie przechowywano w lodówce, w temperatu¬ rze 4°C, przez 16 godzin. b. Podloze typu Enzacryl AH — kopolimer akry- loamidu, hydrazydu kwasu akrylowego i N,N'- -metyleno-bis(akryloamidu) wytwarzane przez Koch-Light Laboratories Ltd., Clonbrock, Bucks, Wielka Brytania. Zgodnie z receptura producenta Koch-Light Laboratories Ltd., KL 3 strona 344 (1970) podloze aktywowano azotynem sodu w sro¬ dowisku kwasnym. Do 100 mg aktywowanego po¬ dloza zawierajacego grupy funkcyjne w postaci azydków kwasowych dodano 2,5 mg enzymu cho¬ linoesterazy w 0,1 molowym buforze boranowym o pH = 8. Otrzymana zawiesine mieszano w wa¬ runkach opisanych wyzej, w ,punkcie a. c. Podloze z karboksymetylocelulozy o zdolnosci wiazania odpowiadajacej zawartosci 2,3 mR/g grup —COOH, wytwarzany przez Reanal Finomvegy- szergyar, Budapeszt, Wegry. Do zawiesiny 93 mg karboksymetylocelulozy w 5 ml buforu o pH = 7,0 0,1 molowego w stosunku do fosforanu potasowe¬ go dodawano, ciagle mieszajac, 50 mg chlorowo¬ dorku N-etylo-N,-(3-dwumetyloaminopropylo)-kar- bodwuimidu rozpuszczonego w 2,5 ml oziebionego do temperatury .+4°C roztworu buforowego. Po 10 minutach mieszania dodano do zawiesiny 25 mg cholinoeterazy rozpuszczonej w 2,5 ml oziebionego do temperatury +4°C roztworu buforowego. Re¬ akcje enzymu z aktywowanym podlozem prowa¬ dzono w temperaturze od 0 do 4°C w przeciagu 48 godzin. W tym czasie mieszanine dwukrotnie mieszano przez 6 godzin za kazdym razem. d. Podloze z bezwodnika polimaleinowego wy- f twarzane przez firme Merck w Darmstadt, RFN.Cholinoesteraze polaczono z bezwodnikiem roli- maleinowym postepujac zgodnie z instrukcja pro¬ ducenta, Biochemics Merck, dotyczaca podloza dla 5 enzymu z bezwodnika polimaleinowego poprzecz¬ nie sieciowanego. 1 g materialu podloza rozpro¬ wadzono na zawiesine w 25 ml buforu o pH = 7,0 0,05 molowego w stosunku do fosforanu potaso¬ wego o temperaturze 0°C. 10 Zawiesine mieszano przez 1 minute, po czym dodawano do niej roztwór 0,5 g cholinoesterazy w 5 ml roztworu buforowego, oziebiony do tem¬ peratury +4°C. Wartosc pH mieszaniny reakcyj¬ nej utrzymywano w granicach od 8 do 9 dodajac 15 w sposób ciagly 1 N wodny roztwór wodorotlenku sodowego. Dodawanie zasady kontynuowano do momentu, kiedy pH mieszaniny pozostawalo nie¬ zmienione przez okolo 0,5 godziny.W celu usuniecia protein nie zwiazanych wia- 20 zaniami kowalencyjnymi, otrzymane w reakcjach opisanych wyzej, w punktach od a do d, prepa¬ raty enzymatyczne filtrowano lub odwirowywano i przemyto kolejno buforem stosowanym w re¬ akcji wiazania enzyimu, 0,&—1 molowym roztwo- 25 rem chlorku sodowego w tym samym buforze i ponownie buforem stosowanym w reakcji. Jony roztworu buforowego usuwano nastepnie przemy¬ wajac stale preparaty woda. Otrzymane prepa¬ raty ze zwiazanym enzymem liofilizowano. Pro- 30 dukty przechowywano w lodówce w temperatu¬ rze 4°C.Zawartosc protein zwiazanych, w preparacie enzymatycznym okreslano metoda posrednia jako róznice ilosci protein wprowadzonych do miesza- 35 niny reakcyjnej i pozostalych w roztworze po re¬ akcji oraz w roztworach przemywajacych. Zawar¬ tosc protein w roztworach cholinoesterazy ozna¬ czano metoda biuretowa podana przez A. G. Gor- nell, C. S. Bardwaill, M. M. David w Bid. Chem. 40 177, 751 (1949).Aktywnosc rozpuszczonej i zwiazanej cholino¬ esterazy okreslano oznaczajac zawartosc grup sulf- hydrylowych uwalnianych przy rozkladzie jodku butyrylotiocholiny. Zawartosc grup sulfhydrylo- 45 wych oznaczano z dwusiarczkiem bis-(5-karboksy- -4-nitrofenylu) wedlug G. L. Ellmana, K. D. Court- ney, V. Andres Jr., R. M. Featherstone: w Biochem.Pharmacol. 7, 88 (1961). Jako jednostke aktyw¬ nosci przyjeto ilosi enzymu katalizujaca przemia- 50 ne 1 |i mola jodku butyrylotiocholiny w tempe¬ raturze 25°C, w przeciagu 1 minuty w optymal¬ nych dla katalitycznej aktywnosci warunkach pH, to jest 7,6 dla enzymu rozpuszczonego i 8,0 dla enzymu zwiazanego. 55 Wyniki badan zebrano w Tablicy 1.Z danych w Tablicy 1 wynika, ze preparaty wedlug wynalazku posiadaja najwieksza aktyw¬ nosc zarówno w przeliczeniu na sucha mase pod¬ loza i proteiny jak i w przeliczeniu na zawartosc 60 proteiny. Aktywnosc preparatu enzymatycznego z podlozem z bezwodnika polimaleinowego jest zbli¬ zona do aktywnosci nowego produktu. Jednak ze wzgledu na to,, ze podloze z bezwodnika polima¬ leinowego wytwarzane jest metoda polimeryzacji •5 blokowej charakterystyka przeplywowa kolumny131 208 Podloze Enzacryl AA Enzacryl AH Akrilex C-100 (przyklad I) Karboksymetyloceluloza | Bezwodnik polimaleinowy Proteiny zwiazane % 100 61,8 24,5 5,5 23,3 Tablica Aktywnosc wiazana % 0 0,2 7,5 0,2 7,5 1 Aktywnosc w stanie rozpuszczo¬ nym % 0 60,7 60 3,5 31,3 Ubytek aktywnosci % 103 39,1 32,5 96,3 61,2 Aktywnosc produktu # 0 0,2 120 2 106 Aktywnosc wlasciwa % ¦ **} 0 0,3 30,6 3,6 32,2 *) jednostka/mg suchej masy **) aktywnosc wlasciwa enzymu rozpuszczonego przyjeto za 100%. z preparatem na tym podlozu jest "znacznie gor¬ sza niz kolumn z produktem wytworzonym spo¬ sobem wedlug wynalazku zawierajacym enzym zwiazany z podlozem otrzymanym w wyniku po¬ limeryzacji perelkowej.Wynalazek jest szczególowo wyjasniony w ni¬ zej podanych przykladach.Przyklad I. Przygotowano zawiesine 100,6 mg kserozelu Akrilex C-100 w 5 ml buforu o pH = 7,0 zawierajacego 0,1 mola fosforanu potasowego. Mie¬ szajac ciagle zawiesine dodawano do niej oziebio¬ ny do temperatury +4°C roztwór 102,5 mg chloro¬ wodorku N-etylo-N'-(3-dwumetyloaminopropylo)- -karbodwuimidu w roztworze buforowym. Po 10 minutach mieszania dodano roztwór 47,4 mg cholinoesterazy rozpuszczonej w 2,5 ml roztworu buforowego. Mieszanine utrzymywano w tempe¬ raturze 0—4°C przez 48 godzin.W tym czasie zawiesine mieszano dwukrotnie przez 6 godzin za kazdym razem. Zel odfiltro¬ wano i przemyto trzykrotnie 10 ml porcjami bu¬ foru o pH = 7,0 0,1 molowego w stosunku do fos¬ foranu potasowego, trzykrotnie 10 ml porcjami buforu o pH = 7,0 0,1 molowego w stosunku do fosforanu potasowego i 0,5 molowego w stosunku dp chlorku sodowego i ponownie trzykrotnie 10 ml porcjami buloru o pH 7,0 0,1 molowego w sto¬ sunku do fosforanu potasu.Dalej przemywano cztery razy 25 ml porcjami wody destylowanej, a otrzymany wolny od soli zel podano liofilizacji. Uzyskano 106,2 mg prepa¬ ratu ze ^wiazana cholinoesleraza o aktywnosci: hydroliza 120 y moli jodku butyrylotiocholiny/mi- nute/gram suchej substancji.Przykladu. Przygotowano zawiesine 102 mg kserozelu Akrilex C-100 w 5 ml buforu o pH = 7,0 0,1 molowego w stosunku do fosforanu potasowe¬ go. Oziebiono ja 0°C i ciagle mieszajac doda¬ wano oziebiony do temperatury H-4PC roztwór 202 ing p-toluenosulfonianu N-cykloheksylo-N,- (- forze. Po 10 minutach mieszania dodano do mie¬ szaniny reakcyjnej oziebiony do temperatury +4°C roztwór 49 mg cholinoesterazy w 2,5 ml roztworu buforowego* Mieszanine utrzymywano w tempe¬ raturze od 0 do 4°C przez 48 godzin.W tym czasie zawiesine mieszano dwukrotnie 20 25 30 35 45 50 przez 6 godzin za kazdym razem. Zel odfiltrowa¬ no i przemyto trzykrotnie 10 ml porcjami buforu o pH = 7,0 0,1 molowego w stosunku do fosforanu potasowego, trzykrotnie 10 ml porcjami buforu o pH = 7,0 0,1 molowego w stosunku do fosforanu potasowego oraz 0,5 molowego w stosunku do chlorku sodowego, trzykrotnie 10 ml porcjami bu¬ foru o pH = 7,0 0,1 molowego w stosunku do fos¬ foranu potasowego. Dalej zel przemywano cztery razy 25 ml porcjami wody destylowanej, a otrzy¬ many wolny od soli zel liofilizowano. Uzyskano 110 mg cholinoesterazy o aktywnosci: hydroliza 110 ^i moli butyTylotiocholiny/minute/gram suchej substancji. PL PL