HU182442B

HU182442B - Process for the determination of immunoglobulins

Info

Publication number: HU182442B
Application number: HU79AO483A
Authority: HU
Inventors: Willem Duermeyer
Original assignee: Akzo Nv
Priority date: 1978-08-24
Filing date: 1979-08-23
Publication date: 1984-01-30
Also published as: ES483606A1; EP0008473A1; FI792636A; CA1148858A; DE2965570D1; AU5009179A; AU527538B2; ZA794249B; JPS5531995A; EP0008473B1; DK354179A

Description

A találmány tárgya eljárás antigén-specifikus immunoglobulin kimutatására és/vagy meghatározására, egy új reagens valamint reagens-csomagok, amelyek fenti meghatározásokhoz használhatóak,

Az immunoglobulineket öt osztályba sorolják: G, A, M, D és E. Az ezekbe az osztályokba tartozó immunoglobulineket IgG, IgA, IgM, IgD, illetve IgE rövidítésekkel jelölik. A következőkben bizonyos immunoglobuliniket IgX-szel fogjuk jelölni, ahol X jelentése A, M, D és E.

Az immunoglobulinek szerkezetileg hasonlóak, és legalább két nehéz láncot (H-láncok) és két könnyű láncot (L-Iáncok) tartalmaznak, amelyek diszulfid hidakkal és néha addíciós polipeptideken át kölcsönösen kapcsolódnak egymáshoz. Valamennyi nehéz és könnyű lánc egy változtatható és egy állandó részt tartalmaz. Néhány immunoglobulin a két nehéz és két könnyű lánc összetett bázikus szerkezetéből épül fel.

Az antitestek immunogbulinek, amelyek az antigéneket specifikusan megkötik. Az antitest specifikussága a 4 peptid-lánc változtatható részéhez rendelhető, amely mind a molekula ugyanazon oldalán helyezkedik el (N-terminális oldal). Bizonyos antitestek számos biológiai hatása az érintett immunoglobulin molekula láncainak nem változó részein keresztül érvényesül.

Az antitesteket felhasíthatjuk olyan fragmensekre, amelyek még rendelkeznek az antigén specifikusságával, valamint olyan kristályosítható fragmensekre, amelyek ezen antigénmegkötő tulajdonsággal már nem rendelkeznek. Antigénmegkötő fragmens például a Fab-fragmens, Fab’-fragmens és F(ab’)2-fragmens. Antigénspecifikussággal nem rendelkező, kristályosítható fragmens például az Fc-fragmens és Fc’-fragmens.

Normál emberi szérumban levő különböző immunoglobulinek koncentrációi a következők: IgG 8 — 16 mg/ml, IgA 1,4 — 4 mg/ml, IgM 0,5 — 2,0 mg/ml, IgD 0,0 — 0,4 mg/ml és IgE 0,000017 — 0,000450 mg/ml.

Mennyiségileg ezért az IgG osztály antitestjei az antitesteknek a legfontosabb csoportját alkotják. Az IgM osztály antitestjei a fertőzés korai fázisában jelennek meg, így az IgM osztály antitestjeinek meghatározása a fertőzéses megbetegedések korai kimutatásában nagyon fontos szerepet játszik.

Az IgA, IgD és IgE osztályok antitestjei a szérumban bizonyos patológiás állapot esetén magasabb koncentrációkban lehetnek jelen. Például az IgE osztály antitestjei megnövekedett koncentrációban vannak jelen allergiás megbetegedések esetében és az IgD osztály antitestjei közreműködnek az auto-immun megbetegedéseknél.

Antigénspecifikus immunoglobulinok sajátos osztályának a meghatározása különleges klinikai jelentőséggel bír. Az antigénspecifikus immunoglobulinek meghatározhatók immunokémiai módszerekkel, ahol valamely immuno-kompo nensnek a kimutatni és/vagy meghatározni kívánt antitesthez mutatott kötődési affinitását hasznosítják. Az ismert eljárások szerint a meghatározandó antitesthez kötődési affinitással rendelkező immuno-komponenst egy szilárd hordozóra történő kapcsolással oldhatatlanná teszik, és a másik specifikus kötődésű anyagot például fluorescens-, kromofor- vagy radioaktív csoporttal vagy enzimmel jelzik. Ezeknek a módszereknek az a hátránya, hogy amikor reumatoid faktor (RF) van jelen, amely gyakori a szérumban, akkor hamis pozitív 'reakciót adnak.

Továbbá különböző osztályú immunoglobulinek és különösen különböző osztályú antigénspecifikus immunoglobulinek elválasztási módszerei munka- és időigényes műveletek és általában csak kvalitatív vagy szemi-kvantitatív eredményeket adnak. Ilyen módszerek például az immundiffúzió, immuno-elektroforézis és sűrűség-gradiens elvén végzett centrifugálás.

A reumatoid faktor — amely gyakran ad hamis eredményeket — maga is egy immunoglobulin, amely többnyire az IgM osztályhoz tartozik. A reumatoid faktor (RF) affinitással rendelkezik az IgG osztályhoz tartozó antitestre. Az RF és IgG molekula nehéz láncainak a nem változó részén át kötődik, főleg azon a részén, amely az antigénkötő fragmensektől az antitest hasadásakor elkülönül. Mivel a reumatoid faktor rendszerint IgM osztályhoz tartozik, am 1 i-IgM immunoglobulinekkel azt szintén megkötik.

A találmány az IgX osztály valamely antigénspecifikus immunoglobulinjének meghatározási módszerére vonatkozik, amelyben a reumatoid faktor zavaró hatása elkerülhető.

A találmány szerinti eljárásban a szérumot — amelyben az IgX osztály antigénspecifikus immunoglobulinjét kívánjuk kimutatni és/vagy meghatározni — kapcsolatba hozzuk az érintett antigénspecifikus IgX elleni inszolubilizált antitesttel vagy ennek az anti-IgX-nek az inszolubizált antigénmegkötő fragmensévél. Ezután inkubáljuk egy olyan antigénnel, amelyre az immunoglobulinnek specifikus affinitása van, majd tovább inkubáljuk a fentiekben említett antigén elleni antitestek jelzett antigénmegkötő fragmensével.

Az antitest fragmentációja — kristályosítható és antigénmegkötő fragmensre vagy fragmensekre — a nehéz láncok enzimatikus hasításával, vagy ezeknek a láncoknak enzimatikus hasításával és a nyert antigénmegkötő fragmenseknek két kisebb antigénmegkötő fragmensre történő utólagos kémiai hasításával végezhető el.

Például a papainnal végzett enzimatikus hasítással két egyforma monovalens antigénmegkötő Fab-fragmenst és antigénmegkötő tulajdonsággal nem rendelkező, kristályosítható Fcfragmenst kaptunk. A pepszinnel végzett enziraatikus hasítás révén egy bivalens antigénmegkötő F(ab’)₂-fragmenst kaptunk, amely kémiailag két Fab-fragmensre hasítható.

182 442

Bár az RF-t lehetséges az inszolubilizált anti-IgX-szel megkötni, és ennek az anti-IgXnek inszolubilizált antigénmegkötő fragmensével közvetlenül, vagy közvetve is megköthetjük, de az antitest jelzett antigénmegkötő fragmense RF-fel nem működik. Ily módon az RF-nek tulajdonítható hamis pozitív reakciók elkerülhetőek. Az antigénnel végzett inkubálás és a jelzett antitesttel végzett kövekező inkubálás egy lépésben is megtörténhet úgy, hogy reagensként egy előzőleg jelzett antigént használunk, és a jelzést ennek az antigénnek a jelzett antitest fragmenséhez történő kapcsolásával végezzük. Ez a reagens új, és éppen ezért a találmány ezekre az új reagensekre is vonatkozik, amelyek tartalmazzák az antigén kapcsolási termékét ugyanezen antigén elleni antitestnek jelzett antigénmegkötő részével. Ennek az új reagensnek a felhasználásánál az antigén intenzív tisztítása nem szükséges, amely lényeges előnyt jelent.

Amint a fentiekben is megállapítottuk, a találmány szerinti eljárás négy IgX osztály valamelyikéhez tartozó antigénspecifikus immunoglobulin kvalitatív és kvantitatív meghatározására alkalmas, anélkül, hogy a reumatoid faktornak tulajdonítható hamis reakció lejátszódna.

Szilárd hordozó, amelyre az anti-IgX-et vagy ennek az anti-IgX-nek antigénmegkötő fragmensét kapcsoljuk, bármely vízoldhatatlan szilárd hordozó lehet, ha a kapcsolás kovalens kötésekkel vagy adszorpcióval elvégezhető. A szilárd hordozó lehet szemcse vagy különböző alakú és méretű lemezke, sőt cső vagy mikro-titráló lemez, amelyben az immunokémiai reakció történik és ahol az anti-IgX komponenst a reakcióedényeknek a belső falához kapcsoljuk.

Az antitestnek antigénmegkötő fragmensét, amely a felhasználandó antigénre affinitást mutat, jelezhetjük enzimmel vagy fluorescens-, kromofor- vagy radioaktív csoportokkal, illetve atomokkal. Előnyösen az enzimmel történő jelzést használjuk. Ezek az enzimek'a következő típusokat foglalják magukba: kataláz, peroxidáz, ureáz, glükoz-oxidáz és foszfatáz, de egyéb enzimek is használhatók. Az immunokémiai reakció ismeretében egy enzim-szubsztrátot adunk a nyert reakciókeverék folyékony és/vagy szilárd fázisához, majd az enzim meghatározását elvégezzük például kolorimetrikus, fluorometrikus vagy spektrofotometrikus módszer segítségével.

A találmány reagens-csomagra is vonatkozik, amelyeket az eljárás szerinti meghatározásokhoz használunk.

A reagens-csomag főleg az alábbi komponensekből áll:

a.) Meghatározott mennyiségű inszolubilizált anti-IgX-nek antigénmegkötő fragmense

b. ) Meghatározott mennyiségű antigén, amely ellen a meghatározandó IgX irányul

c. ) a b.) pont alatt leírt antigén elleni an- titest jelzett antigénmegkötő fragmensének bizonyos mennyisége.

A c.) pontban említett jelzett antitest fragmens jelzése enzimmel is történhet.

Bizonyos esetben a reagens-csomag az alkalmazott enzim mennyiségének a meghatározásához szubsztrátumot is alkalmazhat.

A b.) és c.) külön komponensek helyett a reagens-csomag tartalmazhat egyetlen reagenst is, nevezetesen az antigén kapcsolási termékét ugyanezen antigén elleni antitestnek a jelzett fragmensével.

A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg:

I. példa

Hepatitisz A vírus/antigén elleni IgM antitestek meghatározása.

A. Állati anti-human IgM készítése

A nyúl anti-human IgM-t R. Gispen, I. Nagel, B. Brand-Saathof és S. de Graaf által leírt módszer szerint készítettük (Clin. Exp. Immunoi. 22, 1975, 431—437).

Az anti-IgM specifikusságát anti-IgM szérum abszorbeáltatásával növeltük — emberi köldökzsinór-szérum alkalmazásával — az anti-IgG eltávolítása mellett.

0,05 ml emberi köldökzsinór^szérumot adtunk 0,2 ml anti-IgM szérumhoz, és a keveréket 1 órán át 37 °C-on inkubáltuk. Ezt követően 20 percig 14 000 g értéknél centrifugáltuk. A szupernaitánst 4 °C-on tartottuk.

B. A hepatitisz A vírus/antigén készítése %-os kivonatot készítettünk hepatitisz A-t tartalmazó székletmintából. 1 g székletet 4 ml 0,005 mólos foszfátpufferrel (pH = — 7,2) és 4 ml kloroformmal összekevertük, és az egészet 5 percig erélyesen ráztuk. Ezután a szuszpenziót 3000 g értéknél 30 percig 4 °C-on centrifugáltuk. A vizes fázist kipipettáztuk, és —20 °C-on tartottuk. Szükséges esetben a 20 %-os kivonat bizonyos mennyiségét foszfátpufferben úgy hígítottuk, hogy az extinkció kb. 1,00 legyen a hígított extraktumban, amelyet W. Duermeyer, I. v. d. Venn és B. Kosfer (Láncét 1978, I, 823) által leírt hepatitisz A antigén-meghatározás szerint szendvics enzim-iimmuno vizsgálathoz felhasználtunk.

C. Hepatitisz A elleni IgG F(ab’)₂-fragmensek készítése

Az IgG-t heípatitisz A-val fertőzött beteg teljes szérumából izoláltuk DEAE-Sephandex-en, 0,0175 mólos foszfátpufferben (pH = 6,3) végzett frakcionálással.

Az IgG Walpole-féle acetát-pufferben (nátrium-acetát 0,1 mólos vizes oldata, amelynek pHja ecetsavval 4,3-re van beállítva) levő oldatát (1 %—3 %) 37 °C-ra előmelegítettük, mintegy 20 órán át.

182 442

Ugyanebben az oldatban feloldott pepszint adtunk hozzá úgy, hogy az enzim és a szubsztrát arány 1:100 között legyen

A keveréket 37 °C-on 20—24 órán át inkubáltuk.

A reakciót TRIS-só hozzáadásával leállítottuk, és a pH-t ezzel 8-ra állítottuk.

A frangenseket Sephadex G 150 oszlopon 0,1 mólos TRIS/HC1 (pH = 7,7), 0,2 mólos NaCI és 2 m mólos EDTA felhasználásával elkülönítettük.

D. Az enzim-jelzett F(ab’)₂ konjugát készítése

A hepatitisz A vírus/antigén elleni F(ab’)2 konjugátot Ρ. K. Nakane és A, Kawaoi eljárása (J. Histochem. Cytodh., 22 (12), 1974, 1084—1901) szerint készítettük.

mg torma-peroxidázt oldottunk fel 8,1 pHju 1 ml 0,3 mólos karbonát-pufferben és 1 % abszolút alkoholt tartalmazó, 0,1 ml fluoro-dinitrobenzolt, majd 1 ml 0,08 mólos nátrium-perjodádot adtunk hozzá.

A reakciót 1 ml 0,1 mólos etilénglikol-oldattal állítottuk le.

9,5-ös pH-ju 0,01 mólos karbonát-pufferrel szemben végzett dialízis után 5 mg F(ab’)₂-t adtunk az oldathoz. A F(ab’)₂-t előzőleg 8,0-as pHju 0,05 mólos foszfátpufferrel szemben dializáltuk.

Szobahőmérsékleten, 2 1/2 órán át történő reakció lejárta után az oldatot 4 °C-on, egy éjszakán át, 8,0-as pH-ju, 0,05 mólos foszfátpufferrel szemben dializáltuk.

A konjugátot 4 °C-on tároltuk.

E. Hepatitisz A elleni IgM antitestek meghatározása

A következő vizsgálati rendszert alakítottuk ki:

I. Bevonás

A mikroelemző lemezek mélyedéseit bevontuk 5 /zg IgG (anti-IgM)/ml oldattal (0,05 mólos, 7,2 pH-ju foszfátpufferben (FP), majd szobahőmérsékleten 16 órán át inkubáltuk.

A lemezeket ezt követően háromszor átmostuk FP és 0,05 % Tween 20 (FP/Tween) oldatával.

II. Vizsgálandó szérum

FP/Tween-ben levő 1,25 ml szérumhígítást a mélyedésekbe pipettáztuk, és 37 °C-on 4 órán át inkubáltuk, majd FP/Tweeen oldattal háromszor átmostuk.

III. Antigén

0,1 ml antigén oldatot vittünk valamennyi mélyedésbe. A lemezt egy éjszakán át, szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd FP/Tween-nel négyszer átmostuk.

IV. Konjugát

FP/Tween-ben hígított, 0,1 ml anti-hepatitisz A—F(ab’)2 konjugátot és 5 % negatív humán szérumot pipettáztunk a mélyedésekbe és az egészet 37 °C-on 1 óráig inkubáltuk, majd FP/Tween-nel ötször átmostuk.

V. Szubsztrát tabletta orto-fenilén-diamint (1 tabletta 12 mg-ot tartalmaz) 30 ml desztillált vízben oldottunk (A).

tabletta karbamid-peroxidot (1 tabletta 4 mg-ot tartalmaz a karbamid és hidrogén-peroxid közötti abszorpciós folyamat útján képződő karbamid-peroxidból) 7,5 ml desztillált vízben oldottunk (B).

0,5 ml B oldatot adtunk 30 ml A oldathoz.

Ennek a keveréknek 0,1 ml-ét a mélyedésbe pipettáztuk, és sötétben 45 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk.

Az enzim-szubsztrát reakcióját 0,05 ml 4 n kénsavval állítottuk le.

Az orto-fenilén-diamint és karbamid-peroxidot abból a Hepanostika reagens-csomagból vettük, amelyet a hepatitisz B antigén meghatározásához használnak (Organon Teknika, Oss, Holland).

VI. Színváltozás mérése

A szubsztrát színváltozása jól mérhető 492 nm-nél, Vitatron (fotométer segítségével.

VII. Értékelés negatív kontrollt határoztunk meg a fentiek alapján. Ennek az 5 kontrollnak az átlag extinkciója -|- a standard deviáció ötszöröse volt a határérték a negatív és pozitív szérumok között.

II. példa

A reumatoid faktor (RF) zavaró hatását az anti-hepatitisz-A-vírus IgM antitestek (rövidítve: anti-HAV-IgM) meghatározására szolgáló összehasonlító kísérletben vizsgáljuk. 20 mintából álló HF-pozitív szérumsorozatot — melyek közül néhány anti-hepatitisz-A-vírus IgM antitesteket (rövidítve: anti-HAV-IgG) is tartalmazott — vizsgálunk meg az I. példa E. részében ismertetett módon, azonban azzal a különbséggel, hogy az ott említett torma-peroxidázzal jelzett anti-HAV-F(ab¹)2 konjugát mellett tormaperoxidázzal jelzett anti-HAV-össz lg konjugátot, továbbá torma-peroxidázzal jelzett anti-HAVIgX konjugátot is alkalmazunk párhuzamos kísérletekben. Az utóbbi két konjugátot a tormaperoxidázzal jelzett anti-HAV-F(ab¹)2 előállítására az (I. példa D. részében leírt módszerrel analóg módon állítjuk elő.

A találmány szerinti, torma-peroxidázzal jelzett anti-HAV-F/ab¹^ konjugát alkalmazása mellett végrehajtott kísérletsorozatban nem volt kimutatható IgM antitest. A torma-peroxidázzal jelzett anti-HAV-össz lg és anti-HAV-IgG konjugátok számos esetben hamis pozitív eredményt adnak.

A továbbiakban az RF pozitív szérumok lg frakcióiból az IgG és IgM frakciókat gradienscentrifugálással elkülönítettük és ezeket a frakciókat, külön-külön anti-HAV-enzim immunovizsgálat (olyan immunovizsgálat, amelynél az enzimet alkalmazzuk a hepatitisz A vírus elleni antitestek meghatározására) alapján megvizsgáltuk. Megerősíthettük, hogy anti-HAV IgM antitestek nem voltak jelen. Az eredményeket az alábbi táblázatban szemléltetjük. A mintát az esetben minősítettük pozitívnak, ha a szubsztrát hozzáadása után a 492 nm-nél mért abszorpció nagyobb, mint a negatív kontroll 2,.1-szeres ab5

182 442

Anti-HAV-IgM vizsgálati eredmények ____(ELISA (+))_____ lg—HRP IgG HRP F(ab’)₂-HRP

Sorszám

Reciprok RF-Teljes anti-HAV-ELISA (+) eredmények cukorfrakciók

IgG IgM trter ,(Roo.seWaaler)

1	16	—	—	—	—	—
2	32	+	—	—	+	—
3	32	.—	—	—	—	—
4	64	+	—	—	+	—
5	64	+	—	+	+	—
6	64	+	—	—	+	—
7	128	—	—	—	+	—
8	128	—	—	—	+	—
9	128	+	—	—	+	—
10	256	+	—	+	+	—
11	256	+	—	—	+	—
12	512	+	—	+	+	—
13	512	+	—	+	+	—
14	512	—	—	—	+	—
15	1024	—	—	—	+	—
16	1024	+	—	+	+	—
17 .	2048	—	—	—	+	—
18	2048	.—		+	+	—
19	2048	—	—	+	+	—
20	2048	+	—	+	+	—
Póz. kontroll			+	+
Neg. kontroll 1				—	—	—
Neg. kontroll 2				—	—	—

(+) enzimhez ikötött immunoszorbens-vizsgálat szorpciója. Az RF tartalmat az RF ti tér reciprokával jelöltük, amelyet Rose-Waaler-Ale vizsgálat (olyan vizsgálat, amelynek során a reumatóid faktorra vizsgált szérumnak nyúl antiAbárány eritrocita szérummal bevont bárány-eritrociták agglutinációját előidéző képességét vizsgáljuk az agglutinációt éppen csak előidézni nem tudó koncentrációban, itt tehát a nyúl-immunoglobulin specifikusan kötődik a bárány-eritrocitákhoz és reumatoid Ifaktorral szemben antigénként (hat) szerint határoztuk meg.

III. példa

Enzim immuno-vizsgálat humán toxoplazma IgM-antitestek kimutatására és meghatározására.

Juhot humán IgM-mel immunizáltunk, amelyet Waldenström-féle makroglobulinémiás szérumból készítettek. Az így nyert antiszérumnak a specifikusságát emberi köldökzsinór szérumának a felhasználásával, abszorpciós úton növeltük, mely eljárással az antiszérum anti-IgG-aktivitását eltávolítottuk. A juh anti-human IgM szérum 1 ml-ét összekevertük 0,5 ml emberi köldökzsinór-szérummal, és 1 éráig 37 °C-on inkubáltuk. A szupernatánst használtuk fel mint anti-IgM szérumot; 4 °C-on tároltuk.

B. A toxoplazma antigén készítése Toxoplazma gondii parazitákat tenyésztettünk napig az egér intraperitoneális üregében. A 65 fejteket az egér megölése után összegyűjtöttük oly módon, hogy a hasüreget 1 ml foszfátpufferrel (FP, pH = 7,2) kiöblítettük. Az FP-ben levő sejtek szuszpenzióját kis intenzitású ultrahanggal kezeltük 5 percen át. Az ép parazitasejte40 két centrifugiálással tömörítettük, és 7,2-es pHju FP-ben reszuszpendáltuk, majd 10 percig nagy intenzitású ultrahanggal kezeltük. Ezt a szuszpenziót alkalmaztuk mint antigén készítményt, amelyet lefagyasztottunk és —20 °C-on 45 tároltuk.

C. Toxoplazma antigén elleni IgG F(ab’)2-fragmensek készítése

Juhot immunizáltunk 1 mg fentiekben emií5θ tett toxoplazma antigén készítménnyel. A szérumot összegyűjtöttük, és az IgG-t M. Steinbuch és R. Audran kaprilsavas módszere (Ardh. Biochem. and Biophysicg 134, 279—284 (1969)) alapján elkülönítettük.

F(ab’)₂-fragmenseket az IgG oldatnak 4,3 pH-ju 0,1 mólos acetát-pufferben 8 óráig 37 °C-on végzett ipepszines (ahol a ipepszin és az IgG aránya 1:50) inkubálásával állítottuk élő. A reakciót megfelelő mennyiségű szilárd trisz60 (hidroximetil)-amino metán hozzáadásával (miközben a pH értéke 8-ra emelkedik) leállítottuk. A fragmenseket Sephacryl S 200 oszlopon végzett (0,1 mólos TRIS/HCl, pH 7,5 -]- 0,2 mólos NaCl + 0,002 mólos EDTA) gélkromatográfiával tisztítottuk.

-511

182 442 ’ D. Az enzim-jelzett F/ab’/i-fragmens (konjugát) készítése

Az F(ab’)₂-konjugát készítését az I. példa D pontjában leírt módszer szerint végeztük.

E. Toxoplazma gondii elleni IgM antitestek kimutatása; mérési módszer

I. Bevonás

Polivinilklorid mikroelemző lemezek mélyedéseit oly módon vontuk be, hogy hozzáadtunk 9,0-es pH-ju 0,05 mólos Na₂CO3/HCl fufferben levő juh anti-human IgM szérum 1/10 000-szeres hígítását és ,16 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. ,

Ezek után a mélyedéseket 7,2 pH-ju FP-rel, amely 0,05% Tween 20-at tartalmazott (FPTween)· háromszor átmostuk.

II. Szérum

Ezt követően az FP-Tween-ben megfelelő hígításban levő vizsgálandó szérum 0,1 ml-ét hozzáadtuk, és a mélyedéseket 4 óráig 37 °C-on inkubáltuk, majd a mélyedéseket FP-Tween oldattal háromszor (átmostuk.

III. Antigén

A mélyedéseket ;16 órán át, szobahőmérsékleten FP-Tween-ben levő antigén oldat megfelelő hígításának 0,1 ml-ével inkubáltuk, majd ezeket négyszer átmostuk FP-Tween-nel.

IV. Konjugát

Ezután megfelelő hígítású FP-ben anti-toxoplazma F(ab’)2-konjugát 0,1 ml-ét vittük a mélyedésbe, ezeket 1 óráig 37 °C-on inkubáltuk, majd a mélyedéseket FP-Tween-nel ötször átmostuk.

V. Szubsztrát

A szubsztrát oldatot <az I. példa V. pontjában leírt módszer alapján készítettük.

0,1 ml szubsztrát oldatot pipettáztunk valamennyi nyílásba, és 30 percig szobahőmérsékleten sötétben inkubáltuk. A reakciót úgy állítottuk le, hogy valamennyi mélyedésbe 0,1 ml 4 n H2SO₄-et cseppentettünk.

VI. Színváltozás mérése

A mélyedésekben történő színváltozás mint a szubsztrát oldat extinkcióját 492 nm-nél Vitatron fotométerrel mértük.

VII. Az eredmények kiértékelése negatív kontrollt egyidejűleg vizsgáltunk meg a fentiek szerint. Ezeknek a negatív kontrolioknak 2,1-szeres átlagos extinkciós értékét találtuk határértéknek a pozitív és negatív eredmények között.

IV. példa

Toxoplasma gondii elleni IgM antitestek kimutatására szolgáló; módszer az antigén és jelzett antitest-firagmens alkotta konjugát alkalmazásával.

A) A III. példa E. I. részében ismertetett módon polisztirolból készült mikroelemző lemezeket a III. példa A. részében ismertetett módon előállított juh anti-human IgM immunoglobulin oldatával vonunk be.

Β) A III. példa B. részében ismertetett módon olyan Toxoplasma gondii antigén-oldatot készí tünk, amely milliliterenként 10 mikrogramm antigént tartalmaz. Ugyanakkor a III. példa C. részében ismertetett módon juh anti-toxoplazma készítményt, azaz F(ab’)2-fragmenseket készítünk, és az I. példa D. részében ismertetett módon torma-peroxidázzal jelezzük.

Az, így kapott oldatot ezután ezerszeresére hígítjuk.

Elkészítjük ezt követően az antigén és a jelzett F(ab’)2-fragmens konjugátját úgy, hogy az antigén-oldatból 1 ml-t és a jelzett antitest-fragmens oldatából ,1 ml-t összekeverünk. Néhány peroen belül végbemegy a két komponens kapcsolódása. A reakcióelegyet ezután fagyasztva szárítjuk, és az így .kapott terméket felhasználásig tároljuk, illetve közvetlenül felhasználás előtt visszük oldatba.

C) A bevonatos mikroelemző lemezek mélyedéseit ezután feltöltjük 100—,100 mikroliter olyan humán vérszérummal, amelyet előzetesen százszorosára hígítottunk a korábban már többször említett, 7,2-es pH-ju FP-Tween pufferrel. 1 órán át 37 °C-on végzett inkubálást követően a mélyedéseket kiürítjük, majd négyszer FP-Tween pufferrel mossuk.

D) A B. rész szerint előállított és újraoldott 100 mikroliter konjugátot adagolunk minden egyes mélyedésbe, majd 37 °C-on 1 órán át inkubálást végzünk.

E) A mélyedéseket kiürítjük, majd FP-Tween pufferrel négyszer átmossuk.

F) A mélyedésekbe tetrametil-benzidin és hidrogén-peroxid elegyéből álló szubsztrátumot adunk. 30 perc elteltével a reakciót 4 mikroliter 4 n kénsavoldat adagolásával megállítjuk. A mélyedésekben elszíneződés — ami kétszerese a negatív kontrollal inkubált mélyedésekben észlelhetőnek — jelzi a specifikus, Toxoplasma gondii elleni IgM antitestek jelenlétét.

V. példa

Reagens csomag anti-HAV-IgM meghatározására.

Az anti-HAV-IgM meghatározására alkalmas reagens csomag 10x12 vizsgálatra (beleértve a kontrollszérumok meghatározását is) alkalmas és az alábbi komponensekből áll:

— 2 tartó egyenként 8 mikro ELISA csíkokkal. A csíkok mindegyike 12 tesztmélyedést tartalmaz, amelyeket juh anti-humán IgMel vontunk be.

— 16 ampulla, amelyek torma-peroxidázzal jelzett humán anti-<HAV-F(ab’)2-t tartalmaznak fagyasztva szárított állapotban.

— 1 fiola, amely 5 ml koncentrál HAV antigént tartalmaz — 1 palack, amely 100 ml koncentrál foszfátpuffért tartalmaz — 1 fiola, amely 8 db karbamid-peroxid tablettát tartalmaz — 1 fiola, amely 20 db O-fenilén-diamin-hidroklorid tablettát tartalmaz — 1 fiola, amely 0,25 ml negatív kontrollt

-613

182 442 (humán anti-HAV-IgM negatív szérum) tartalmaz — 1 fiola, amely 0,25 ml pozitív kontrollt (humán anti-HAV-IgM pozitív szérum) tartalmaz — használati utasítás — ragasztószalag.

Claims

Szabadalmi igénypontok:

1. Eljárás valamely IgX osztályba tartozó — ahol X jelentése M, A, D vagy E — antigénspecifikus immunoglobulin kimutatására és/vagy meghatározására, ahol a vizsgálandó közeget az antigénspecifikus immunoglobulinra érzékeny és oldhatatlanná tett anti-IgX-el, vagy ezen anti-IgX enzimatikus hasításával előállított és oldhatatlanná tett, antigénmegkötő fragmensével hozunk érintkezésbe, azzal j ellemezve, hogy a vizsgálandó közeget először egy antigénnel — amire. a meghatározandó immunoglobulin specifikus affinitású —, majd egy, a fent említett antigén elleni antitest enzimatikus hasításával előállított és jelzett, antigénmegkötő fragmenssel inkubáljuk, ezután a jelző anyagot kimutatjuk és/vagy meghatározzuk, és ezáltal kvalitatív és/vagy kvantitatív információt .kapunk a meghatározandó antigénspecifikus immunoglobulin ról.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja az IgM osztály valamely antigénspecifikus immunoglobulinjának a kimutatására és/vagy meghatározására, ahol a vizsgálandó közeget az IgM osztály antigénspecifikus immunoglobulin javai szemben érzékeny és oldhatatlanná tett anti IgM-cl hozunk érintkezésbe, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó közeget először egy antigénnel — amire a meghatározandó immunoglobulin specifikus affinitású —, majd egy, a fent említett antigén elleni antitest enzimatikus hasításával előállított és jelzett, antigénmegkötő fragmenssel inkubáljuk, ezután a jelző anyagot kimutatjuk és/vagy meghatározzuk, és ezáltal kvalitatív és/vagy kvantitatív információt kapunk a meghatározandó antigénspecifikus immunoglobulinról.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó közegnek az inszolubilizált anti-IgX-szel vagy ennek az anti-IgX-nek antigén-megkötő fragmensével érintkezésbe hozás után szeparálást végzünk.
4. Az .1. vagy 3. igénypont szerinti eljárás fdganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó közegnek az inszolubilizált anti-“ IgX-szel, vagy ennek az anti-IgX-nek antigén
5 megkötő fragmensével történő érintkezése után az antigénnek és az antitest egy jelzett antigénmegkötő fragmensének valamely kapcsolási termékét adjuk a vizsgálandó közeghez vagy az inszolubilizált fázishoz.

1θ 5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezv e, hogy a jelzett antitest fragmensként egy jelzett F(ab’)2 fragmenst használunk. '
6. A 4—5. igénypontok bármelyike szerinti el- ^l járás foganatosítási módja, azzal j ellem ezv e, hogy a jelzett, antitest fragmens jelzését va- _h mely enzimmel végezzük.
7. Reagens-csomag, amely a speciális IgX osz-

2θ tályha tartozó valamely antigénspecifikus immunoglobulin — ahol X jelentése az 1. igénypontban megadott — meghatározásához alkalmazható, azzal jellemezve, hogy

a) a meghatározandó, speciális IgX osztályba tartozó antigénspecifikus immunoglobulin elleni inszolubilizált IgX-et vagy ennek az anti- ''

IgX-nek egy antigénmegkötő fragmensét.

b) egy antigént, amelyre a meghatározandó immunoglobulin specifikus affinitással rendel-

30 ^ezik.

c) az antigén elleni valamely antitest egy jelzett antigénmegkötő fragmensét tartalmazza.
8. Reagens-csomag, amely a speciális IgX osztályba tartozó valamely antigénspecifikus im-

22 munoglobulin — ahol X jelentése az 1. igénypontban megadott — meghatározásához alkalmazható,, azzal jellemezve, hogy

a) a meghatározandó, speciális IgX osztályba tartozó antigénspecifikus immunoglobulin elle-

4q ni inszolubilizált anti-Ig-X-et, vagy ennek az anti-IgX-nek egy antigénmegkötő fragmensét,

b) egy antigénnek (amelyre a meghatározandó immun oglobulinnek specifikus affinitása van) az antigén elleni antitest valamely jelzett

42 antigénmegkötő fragmensével alkotott kapcsolási termékét tartalmazza.
9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti reagenscsomag kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy jelző komponense egy enzim.

50 10. A 9. igénypont szerinti reagens-csomag kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy egy, a jelző enzimhez tartozó szubsztrátot is tartalmaz.