HU179936B - Diagnostic means for the detection of leucocythes in body fluids and process for preparing the proper chromogens - Google Patents

Diagnostic means for the detection of leucocythes in body fluids and process for preparing the proper chromogens Download PDF

Info

Publication number
HU179936B
HU179936B HU79BO1801A HUBO001801A HU179936B HU 179936 B HU179936 B HU 179936B HU 79BO1801 A HU79BO1801 A HU 79BO1801A HU BO001801 A HUBO001801 A HU BO001801A HU 179936 B HU179936 B HU 179936B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
azo
naphthalene
optionally substituted
benzyloxycarbonyl
group
Prior art date
Application number
HU79BO1801A
Other languages
English (en)
Inventor
Dieter Berger
Franz Braun
Guenter Frey
Werner Guethlein
Manfred Kuhr
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of HU179936B publication Critical patent/HU179936B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B43/00—Preparation of azo dyes from other azo compounds
    • C09B43/18—Preparation of azo dyes from other azo compounds by acylation of hydroxyl group or of mercapto group
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

A leukociták testfolyadékokban, különösen vizeletben való kimutatása lényeges helyet foglal el a vese és az urogenitalis traktus betegségeinek diagnosztikájában.
Ezt a kimutatást eddig a leukociták nem centrifugált vizeletben vagy vizeletüledékben való fáradságos számlálásával végezték. Természetszerűleg mindkét módszerben közös, hogy csak intakt leukocitákat vesz figyelembe. Másrészt ismeretes, hogy a leukocita-lízis sebességét a vizelet tulajdonságai erősen befolyásolják, így például erősen lúgos vizeletben körülbelül 60 perces leukocita felezési idővel kell számolni. Túl alacsony leukocitaszámoknak, illetve hosszabb vizelet-állásidőnek hamis negatív leletek lehetnek a következményei.
A lízis-hibától eltekintve a leukociták centrifugálatlan, homogenizált vizeletben való kvantitatív mikroszkópiás meghatározása számlálókamrában eléggé megbízható eredményeket szolgáltat. A gyakorlatban azonban ezt a módszert csak ritkán alkalmazzák, mivel fáradságos, kimerítő és időt rabló, és iskolázott személyzet alkalmazását igényli.
A vizeletből történő leukocitameghatározások túlnyomó többségét az orvosi gyakorlatban az úgynevezett látótér-módszerrel végzik a vizelet üledékből. Ehhez először centrifugálással vizsgálati anyagot (üledéket) kell nyerni. Ennek során azonban a vizelet más alkotórészei is feldúsulnak, amelyek — így például sók és hámsejtek — a leukociták mikroszkópiás számlálását lényegesen megnehezítik. Kisebb üledéktartalom, az üledék inhomogenitásai, valamint eltérő mikroszkópiás nagyítások vagy a mikroszkóp eltérő optikai felépítése azt eredmé2 nyezheti, hogy az itt szokásos, mikroszkóp látóterére megadott leukocitaszám többszáz százalékos hibákat is takarhat.
\ jelen találmány feladata ezért az volt, hogy olyan 5 diagnosztikai eszközt bocsásson rendelkezésre, amelylyel a leukociták testfolyadékokban egyszerű és könnyen kezelhető módon, valamint lehetőleg gyorsan és teljesen mutathatók ki.
Ilyen leukocitavizsgálat alapját egy enzimes reakció 10 szolgáltatja, mivel a leukociták széles enzimspektrummal rendelkeznek.
A 30 87 794 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban már közölnek és ajánlanak egy leukocita- neghatározást, amelyet a granulocita leukocitákban 15 jelenlevő peroxidáz aktivitással végeznek. Egy hidrogénperoxiddal és valamilyen szerves indikátorral, például o-tolidinnel impregnált szívóképes hordozó színes oxidációs termék képződésével mutatja a leukociták jelenlétét. Egy ilyen teszt azonban döntő hátrányokkal is ren20 delkezik. Egyrészt jelentős zavaró hatást jelentenek általában a vizeletben jelenlevő redukáló anyagokkal, például aszkorbinsavval végbemenő oxidációs reakciók. Másrészt több helyen található irodalmi hivatkozás [lásd például L. Mettler, Med. Welt 23, 399 (1972)] a leu25 kocita-peroxidáz instabilitására vizeletben, ami hamis negatív leleteket eredményezhet.
Néhány éve a hiszto- és citokémiai enzimológiában tartósan teret hódítottak olyan kolorimetriás meghatározási módszerek, amelyek a meghatározandó rendsze30 rekben jelenlevő enzimek észterolitikus aktivitásán ala179936
-1179936 púinak. (Lásd például A. G. E. Pearse, Histochemistry, Theoretical and Applied.) Lényegében színtelen vagy enyhén színes észtereket alkalmaznak, amelyek az enzimes hasítás során legtöbbnyire színtelen sav- és ugyancsak színtelen alkohol-(fenol)-komponensre esnek szét. Utóbbiakat azután az enzimes elszappanosítást követő reakcióban színes termékekké reagáltatják (például diazóniumsókkal való kapcsolással vagy oxidatív reakciókkal).
F. Schmalzl és H. Braunsteiner például a Kiin. Wschr. 46, 642 (1968)-ban leírtak egy specifikus citokémiai leukocita-észteráz kimutatást, ahol szubsztrátként Naphtol-AS-D-klór-acetátot és valamilyen diazóniumsót használtak a színes azovegyület képzéséhez.
Leukociták testfolyadékokban, így például vizeletben való gyors és egyszerű kimutatására szolgáló diagnosztikai eszközként ilyenfajta kétkomponensű rendszerek nem bizonyultak megfelelőnek, mivel a vizeletben előforduló sok egyéb vegyület, így urobilinogén, szterkobilinogén, bilirubin és egyebek szintén reagálnak diazóniumsókkal. Ebből eredően ez a kimutatási módszer túlságosan érzéketlen. Például 5000 leukocita/μΐ esetében semmilyen reakciót nem mutatnak a minták.
Meglepő módon azt találtuk, hogy stabil és gyorsan jelző diagnosztikai eszközt kapunk, amellyel leukociták testfolyadékokban jól kimutathatók, ha a neutrofil leukocita-granulocitákban előforduló észterázok kimutatására szubsztrátként azoszínezék-észtereket használunk.
A jelen találmány tárgya leukociták testfolyadékokban való kimutatására szolgáló olyan diagnosztikai eszköz, amely egy színképzővel (kromogénnel) és szokásos adalékanyagokkal impregnált szívóképes hordozóból áll, és az jellemzi, hogy a leukocitákban előforduló ész terázok kimutatására I általános képletü azoszínezék- 35 észtereket — a képletben
A jelentése 1 vagy 2 nitrogénatomot, kénatomot, oxigénatomot tartalmazó, öttagú vagy hattagú heterociklusos gyűrű, amely adott esetben halogénatommal vagy rövidszénláncú alkilcsoporttal egyszeresen 40 szubsztituált és amely egy, adott esetben rövidszénláncú alkil- vagy alkoxicsoporttal szubsztituált anellált benzolgyűrűt tartalmazhat, vagy rövidszénláncú alkilcsoporttal, rövidszénláncú alkoxicsoporttal, nitrocsoporttal, szulfonsav-, illetve alkálifém-szulfon- 45 sav-gyökkel és/vagy benzoil-amino-csoporttal egyszeresen, kétszeresen vagy háromszorosan szubsztituált fenilcsoport,
B jelentése adott esetben szulfonsav-, illetve alkálifém-szulfonsav-gyökkel, rövidszénláncú alkoxicsoporttal és/vagy rövidszénláncú alkoxi-2-4 tagszámú (rövidszénláncú alkilénoxi)-csoporttal egyszeresen vagy kétszeresen szubsztituált benzol-, naftalin-, vagy kinolin-maradék,
R jelentése benzoilcsoport vagy valamely 2—5 szénatomos alifás acilcsoport, vagy valamely, terc-butoxi-karbonil-, benziloxi-karbonil- vagy p-toluolszulfonil-védőcsoporttal védett, nem heterociklusos, élővilágban előforduló mono-amino-monokarbonsavgyök vagy valamely 2—6 tagszámú, nem heterociklusos élővilágban előforduló monoamino-monokarbonsavakból álló peptid-gyök, és n jelentése 1 vagy 2 —.
A találmány további tárgya eljárás az I általános képletű azoszínezék-észtereket tartalmazó, leukociták test- 65 folyadékokban való meghatározására szolgáló diagnosztikai eszközök előállítására.
Az összes I általános képletü azoszínezék-észter új vegyület.
A találmány tárgya továbbá eljárás az I általános képletű azoszínezék-észterek előállítására.
Az I általános képletü új azoszínezék-észtereket a fenilészterek szintézisére ismert módszerek szerint állíthatjuk elő. Előnyösen, önmagában ismert módon, vala10 mely II általános képletü megfelelő azoszínezéket — ahol A, B és n jelentése az előbb megadottakkal azonos —, egy III általános képletü savval — ahol R jelentése az előbb megadottakkal azonos —, illetve ennek megfelelő reakcióképes származékával reagáltatunk.
A karbonsavészterek előállításánál reakcióképes származékokként főleg a megfelelő karbonsavanhidrideket, illetve karbonsavkloridokat használjuk, adott esetben tercier aminok hozzáadásával. Az aminosav- és peptid-észterek előállítására a peptidkémiában szokásos szin20 tézismódszereket alkalmazzuk.
A II általános képletü azoszínezékek ismert anyagok [lásd például H. R. Hovind, The Analyst, 100, 769 (1975)], vagy ismert vegyületek analógiájára állíthatók elő.
Az A jelentésénél említett halogénatomon fluor-, klór- vagy brómatom, előnyösen brómatom értendő.
Az A jelentésénél említett „rövidszénláncú alkilcsoport” valamint az A és B jelentésénél említett „rövidszénláncú alkoxicsoport” 1—4, előnyösen 1—3 szénato30 mot tartalmaz. Különösen előnyös a metil-, metoxi- és etoxi-csoport.
A B jelentésénél említett „rövidszénláncú alkoxi-2-4 tagszámú (rövidszénláncú alkilénoxi)-csoport” 2—4, előnyösen 2—3 alkilén-oxi-csoportot tartalmaz, előnyösen etilénoxicsoportokat. Különösen előnyös „rövidszénláncú alkoxi-2-4 tagszámú (rövidszénláncú alkilénoxi)-csoport” a 3,6-dioxa-heptiloxi-csoport.
Az A és B jelentésénél megadott szulfonsavgyök vagy maga a szulfonsavgyök (—SO3H) vagy ennek valamilyen alkálifém-sója. Különösen előnyös a nátriumsó.
Az R szubsztituenseknél említett 2—5 szénatomos alifás acilcsoportok közül előnyösek a 2—3 szénatomosak.
Különösen előnyös az acetilcsoport.
Az R szubsztituens jelentésénél említett monoamino-monokarbonsav-gyökök természetes L-a-aminosavak savgyökei. Főként a glicin, L-alanin és L-fenilalanin savgyöke előnyös.
Az R szubsztituens jelentésénél említett peptidgyökön di-, tri-, tetra- és pentapeptidek, előnyösen di- és tripep50 tídek gyökei értendők, ahol amínosav-komponensekként az előbb említett aminosavak szerepelnek.
Az RO-oldalláncok bármely helyzetben kapcsolódhatnak a benzol-, naftalin-, illetve kinolin-gyűrűhöz. Az azocsoportok azonban az RO-szubsztituensekhez ké55 pest mindig orto- és/vagy para-helyzetben helyezkednek el.
A találmány szerint kromogénként használt I általános képletü azoszínezék-észtereket 10 4—10_1 mól/liter, előnyösen 10-3—102 mól/liter koncentrációban 60 alkalmazzuk az impregnáló oldatban.
A leukociták kimutatására szolgáló diagnosztikai eszköz további alkotórésze valamilyen megfelelő pufferrendszer. Például foszfát-, barbiturát-, borát-, trisz(hidroxi-metíl)-amino-metán- (TRIS), 2-amino-2-metil-1,3-propándiol- (Amediol) vagy aminosav-pufferek
-2179936 / jönnek számításba, amelyek pH-értékét és kapacitását úgy kell megválasztani, hogy a tesztcsíknak a testfolya• dékba való bemártása után ezen 6—10, előnyösen 7—9 közötti pH-érték álljon be.
Előnyös továbbá a leukociták testfolyadékokban való kimutatására szolgáló találmány szerinti diagnosztikai eszköz készítésénél adalékként tenzideket alkalmazni, mivel ezáltal rövidebb reakcióidők érhetők el. Előnyös kationaktív nedvesítőszereket, így például kvaterner ammónium-, piridinium- vagy imidazoliumsókat használni 0,05—2%, előnyösen 0,1—0,5% koncentrációban.
A leukocitakimutatásra szolgáló diagnosztikai eszköz további alkotórésze lehet valamilyen megfelelő komplexképző. Előnyösen fémsókat, például a vas, réz, króm, * kobalt, nikkel, mangán és cink sóit használjuk, amelyek a leukocita-észterázoknak az I általános képletű azoszínezék-észterekre való hatásakor keletkező o-hidroxiszínezékekkel színmélyülés közben megfelelő fémkelátkomplexokká reagálnak. Ezáltal rövidebb reakcióidők, és alacsonyabb kimutatási határok érhetők el. A komplexképzőket 10“ 4—10 1 mól/liter, előnyösen 10“3— 10~2 mól/liter koncentrációban adjuk az impregnáló oldathoz.
A találmány szerinti diagnosztikai szer készítéséhez előnyösen szívóképes hordozókat, így például szűrőpapírt, cellulózt vagy műszálfilcet impregnálunk a szükséges, szokásosan a tesztcsíkok készítéséhez használatos reagensek (szubsztrát, puffer, adott esetben tenzidek, komplexképzők stb.) könnyen illő oldószerekkel, így például vízzel, metanollal, etanollal vagy acetonnal készült oldataival. Ez célszerűen két külön lépésben történik: Először egy olyan vizes oldattal impregnálunk, amely a puffért és a többi vízoldható alkotórészeket tartalmazza. Utána az I általános képletű észteráz-szubsztrátok oldatával impregnálunk. Különleges esetekben fordított impregnálási sorrend is alkalmazható. A kész tesztpapírok önmagukban is használhatók vagy ismert módon fogókra ragasztva vagy előnyösen műanyagok és finomlyukú hálók közé hegesztve a 2 118 455 sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás szerint.
így olyan diagnosztikai eszközöket kapunk, amelyek a vizsgálandó testfolyadékba való bemártás után gyorsan és egyszerűen kiértékelhető módon színátcsapással mutatják a leukociták jelenlétét. Mivel a neutrofil leu. kocita-granulocitákban jelenlevő észterázok aktivitása a leukociták lízise után is teljesen megmarad, a találmány szerinti diagnosztikai eszközzel mind intakt mind lízist szenvedett leukociták kimutathatók. Lízis-hiba “ következésképp nem fordul elő.
1. példa
Szűrőpapírt (például Schleicher & Schüll 23 SL) egymásután a következő oldatokkal impregnálunk, és utána 60 °C-on megszárítjuk.
1. oldat:
Trisz(hidroxi-metil)-amino-metán 0,61 g,
Desztillált víz körülbelül 30 ml, az oldatot 0,1 n sósavoldattal pH 7,0-re állítjuk, majd desztillált vízzel feltöltjük 100,0 ml-re.
2. oldat:
Tiazol-2-azo-l'-{2'-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxiJ-naftalin} 46,1 mg, s Aceton, kiegészítve 100,0 ml-re.
így gyengén rózsaszín tesztpapírt kapunk, amely leukocitatartalmú vizeletbe merítéskor erősen vörösre színeződik10 A kimutatási idő a következő;
000 leukocita/μΐ vizelet, körülbelül 1 perc;
000 leukocita/μΐ vizelet, körülbelül 2 perc;
000 leukocita/μΐ vizelet, körülbelül 5 perc.
A teszt érzékenysége körülbelül 2000 leukocita/μΐ.
Hasonló tulajdonságokkal (érzékenység: 2000— 10 000 leukocita/μΐ) rendelkező tesztpapírokat kapunk, ha tiazol-2-azo-l '-{2'-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxij-naftalin} helyett a következő szubsztrátokat használjuk, ahol a leukocitatartalmú vizeletbe való bemár20 tűskor a tesztpapírokon az alább megadott színátcsapás észlelhető.
1.1. Tiazol-2-azo-2'-(l '-acetoxi-4'-metoxi-benzol). Színátcsapás: halvány rózsaszínből ibolyába.
1.2. Tiazol-2-azo-2'-{l'-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniIoxiJ-4 '-metoxi-benzol}.
Színátcsapás: halvány rózsaszínből ibolyába.
1.3. Tiazol-2-azo-l '-(2',4'-diacetoxi-benzol). Színátcsapás: halvány rózsaszínből vöröses ibo- lyába.
1.4. Tiazol-2-azo-4'-{l ',3 '-di[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxij-benzol}.
Színátcsapás: halvány rózsaszínből vöröses ibolyába.
1.5. Tiazol-2-azo-l'-(2'-acetoxi-naftalin). Színátcsapás: halvány rózsaszínből vörösbe.
1.6. Tiazol-2-azo-l '-{2'-[N-(terc-butoxi-karbonil)-L-alaniloxij-naftalin}.
Színátcsapás: halvány rózsaszínből vörösbe.
1.7. Tiazol-2-azo-2'-)l'-acetoxi-naftalin).
Színátcsapás: halvány rózsaszínből vöröses ibolyába.
1.8. Tiazol-2-azo-2'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxij-naftalin}.
Színátcsapás: rózsaszínből vöröses ibolyába.
1.9. Tiazol-2-azo-l '-{2 '-iN-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-7 '-(nátrium-szulfonáto)-naftalin }-dihidrát.
Színátcsapás: rózsaszínből vörösbe.
1.10. 5-Bróm-tiazol-2-azo-l'-{2'-Í.N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin).
Színátcsapás: halvány rózsaszínből vörösbe.
1.11. Benzotiazol-2-azo-l '-{2'-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
Színátcsapás: rózsaszínből vörösbe.
1.12. Benzotiazol-2-azo-2'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
Színátcsapás: halvány rózsaszínből vörösbe.
1.13. 6-Metoxi-benzotiazol-2-azo-2'-{l '-[N-(benzíloxi-
-karbonil)-L-alaniloxí]-naftalin}.
Színátcsapás: rózsaszínből vörösbe.
1.14. Piridin-2-azo-4'-{l ',3'-di[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-benzol}.
Színátcsapás: sárgás rózsaszínből vöröses ibolyá65 ba.
-3179936
1.15. Piridin-2-azo-l'-(2’-acetoxi-naftalin).
Szinátcsapás: sárgás rózsaszínből vörösbe.
1.16. Piridin-2-azo-l '-(2'-benzoiloxi-naftalin).
Szinátcsapás: rózsaszínből vörösbe.
1.17. Piridin-2-azo-l'-{2'-[N-(benziloxi-karbonil)-L- 5 -alaniloxi]-naftalin}.
Szinátcsapás: sárgás rózsaszínből vörösbe.
1.18. 2,4-Dinitro-benzol-azo-2'-[l'-benzoiloxi-3',6'-di-(nátrium-szulfonáto)-naftalin].
Szinátcsapás: sárgás rózsaszínből kékbe. 10
1.19. Tiazol-2-azo-l'-{2'-[N-(benziloxi-karbonil)-gliciloxi]-naftalin}.
Szinátcsapás: halvány rózsaszínből vörösbe.
1.20. Tiazol-2-azo-l '-{2'-[N-(benziloxi-karbonil)-L-
-fenilalaniloxi]-naftalin}. 15
Szinátcsapás: halvány rózsaszínből vörösbe.
2. példa
2.6. Benzotiazol-2-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
Szinátcsapás: rózsaszínből lilába.
2.7. 6-Metoxi-benzotiazol-2-azo-4'-(l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
Szinátcsapás: rózsaszínből lilába.
2.8. Tiazol-2-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alanil-L-alaniloxi]-naftalin}.
Szinátcsapás: halvány rózsaszínből lilába.
2.9. Tiazol-2-azo-4'-(l '-|N-(benziloxi-karbonil)-L-alanil-L-alanil-L-alaniloxi]-naftalin}. Szinátcsapás: rózsaszínből lilába.
2.10. 5-Metil-tiazol-2-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
Szinátcsapás: rózsaszínből lilába.
2.11. 6-Metil-benzotiazol-2-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin).
Szinátcsapás: rózsaszínből lilába.
Szűrőpapírt (például Schleicher & Schüll 23 SL) egy- 20 másután impregnálunk a következő oldatokkal, és utána 60 °C-on megszárítjuk.
3. példa
1. oldat:
Trisz(hidroxi-metil)-amino-metán 0,61 g,
Desztillált víz körülbelül 30 ml, az oldatot 0,1 n sósavoldattal pH 7,0-re beállítjuk, utána desztillált vízzel feltöltjük 100,0 ml-re.
2. oldat:
Tiazol-2-azo-4 '-{1 '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin} Aceton feltöltve
46,1 mg, 100,0 ml-re.
így rózsaszínre színeződött tesztpapírt kapunk, amely leukocitatartalmú vizeletben erősen lilára színeződik.
A kimutatási idő a következő:
5000 leukocita/μΐ vizelet, körülbelül 1 perc;
2000 leukocita/μΐ vizelet, körülbelül 3 perc; 40
1000 leukocita/μΐ vizelet, körülbelül 6 perc;
500 leukocita/μΐ vizelet, körülbelül 10 perc.
A teszt érzékenysége körülbelül 500 leukocita/μΐ.
Hasonló tulajdonságokkal (érzékenység: 500—5000 leukocita/μΐ rendelkező tesztpapírokat kapunk, ha ti- 45 azol-2-azo-4'-(l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin) helyett a következő szubsztrátokat használjuk, ahol a tesztpapírokon leukocitatartalmú vizeletbe való bemártáskor az alább megadott színátcsapások észlelhetők. 50
2.1. Tiazol-2-azo-4'-(l '-acetoxi-naftalin). Szinátcsapás: halvány rózsaszínből lilába.
2.2. Tiazol-2-azo-5 '-{8 '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-
-alaniloxij-kinolin}. 55
Szinátcsapás: rózsaszínből vörösbe.
2.3. Tiazol-2-azo-4’-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-5 '-metoxi-naftalin). Szinátcsapás: rózsaszínből vörösbe.
2.4. Tiazol-2-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L- 60 -alaniloxi]-5'-(3*,6',-di-oxa-heptiloxí)-naftalin}. Szinátcsapás: rózsaszínből vörösbe.
2.5. 5-Bróm-tiazol-l-2-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
Szinátcsapás: halvány rózsaszínből lilába. 65
Szűrőpapírt (például Schleicher & Schüll 23 SL) egymásután impregnálunk a következő oldatokkal, és utána 60 °C-on megszárítjuk.
1. oldat:
Dinátrium-tetraborát-dekahidrát 1,91 g.
Desztillált víz körülbelül 30 ml,
az oldatot 0,1 n sósavoldattal pH 8,0-ra állítjuk, és desztillált vízzel feltöltjük 100,0 ml-re.
2. oldat: 2-Metoxi-4-nitro-benzol-azo-4'-{1 '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin} 52,9 mg,
Aceton kiegészítve 100,0 ml-re.
így világos narancssárga színű tesztpapírt kapunk, amely leukocitatartalmú vizeletbe való bemártáskor erősen vörösre színeződik. A kimutatási idő az alábbi:
5000 leukocita/μΐ vizelet, körülbelül 1 perc, 2000 leukocita/μΐ vizelet, körülbelül 3 perc, 1000 leukocita/μΐ vizelet, körülbelül 5 perc.
A teszt érzékenysége körülbelül 1000 leukocita/μΐ.
Hasonló tulajdonságú tesztpapírokat (érzékenység: 1000—5000 leukocita/μΐ kapunk, ha 2-metoxi-4-nitro-benzol-azo-4'-{1'-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin) helyett a következő szubsztrátokat használjuk, ahol a tesztpapírok leukocitatartalmú vizeletbe való bemártáskor az alább megadott színátcsapásokat mutatják.
3.1. 4-(Nátrium-szulfonáto)-benzol-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}. Szinátcsapás: sárgából vörösbe.
3.2. 4-Nitro-benzol-azo-4'-(l '-acetoxi-naftalin). Szinátcsapás: sárgából vörösbe.
3.3. 4-Nitro-benzol-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin).
Szinátcsapás: sárgából vörösbe.
3.4. 2,4-Dinitro-benzol-azo-4'-(l '-acetoxi-benzol).
Szinátcsapás: sárgából vöröses lilába.
y /
3.5. 2,4-Dinitro-benzol-azo-4'-(l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-benzol}.
Szlnátcsapás: sárgából vöröses lilába.
3.6. 2,4-Dinitro-benzol-azo-4'-(l '-acetoxi-naftalin).
, Szlnátcsapás: sárgából lilába.
3.7. 2,4-Dinitro-benzol-azo-4'-(l '-(N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
Szlnátcsapás: sárgából lilába.
3.8. 2-Metoxi-4-nitro-benzol-azo-4'-(l'-acetoxi-benzol).
Szlnátcsapás: világos narancssárgából vörösbe.
3.9. 2-Metoxi-4-nitro-benzol-azo-4'-(l '-acetoxi-naftalin).
Szlnátcsapás: világos narancssárgából vörösbe.
3.10. 2-Metoxi-4-nitro-benzol-azo-5'-{8'-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-kinolin}.
Szlnátcsapás: világos narancssárgából vöröses lilába.
3.11. 2-Metoxi-4-nitro-benzol-azo-4'-{l '-[N-(benzíloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-5 '-metoxi-naftalin}. Szlnátcsapás: világos narancssárgából vörösbe.
3.12. 2-Metoxi-4-nitro-benzol-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-5 '-(3 ,6 -di-oxa-hept iloxi)-naftalin}.
Szlnátcsapás: világos narancssárgából vörösbe.
3.13. 4-Metoxi-2-nitro-benzol-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
Szlnátcsapás: világos narancssárgából lilába.
3.14. 2,5-Dimetoxi-4-nitro-benzol-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin). Szlnátcsapás: világos narancssárgából lilába.
3.15. 2,5-Dimetoxi-benzol-azo-4'-{l'-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi}-naftalin}.
Szlnátcsapás: világos narancssárgából vörösbe.
. 3.16. 2-Metoxi-4-(benzoil-amino)-5-metil-benzol-azo-4'-{l'-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}. Szlnátcsapás: rózsaszínből vörösbe.
3.17. 2,5-Dimetoxi-4-(benzoil-amino)-benzol-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi)-naftalin}. Szlnátcsapás: narancssárgából vörösbe.
3.18. 2,5-Dimetoxi-4-(benzoil-amino)-benzol-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil>L-alaniloxi]-naftalin}. Szlnátcsapás: rózsaszínből vörösbe.
3.19. 2-Metoxi-4-nitro-benzol-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-gliciloxi]-naftalin}. Szlnátcsapás: világos narancssárgából vörösbe.
3.20. 2-Metoxi-4-nitro-benzol-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi- “ -karbonil)-L-fenilalaniloxi]-naftalin).
Szlnátcsapás: világos narancssárgából vörösbe.
3.21. 2-Metoxi-4-nitro-benzol-azo-4'-(l '-[N-(p-toluol- „ szulfonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
Szlnátcsapás: narancssárgából vörösbe.
3.22. 2-Metoxi-4-nitro-benzol-azo-4'-{l '-[N-(p-toluolszulfonil)-L-alaniloxi]-5 '-(3 *,6 ’-di-oxa-heptiloxi)-naftalin}.
Szlnátcsapás: világos narancssárgából vörösbe.
1. oldat:
Trisz(hidroxi-metil)-amino-metán 0,61 g.
Desztillált víz körülbelül 30 ml,
Lauril-piridinrum-klorid 0,2 g, az oldat pH-ját 0,1 n sósavoldattaí
7,0-re állítjuk, desztillált vízzel feltöltjük 100 ml-re.
2. oldat:
Tiazol-2-azo-4'-{l'-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin} 46,1 mg
Aceton kiegészítve 100 ml-re.
így rózsaszín tesztpapírt kapunk, amely leukocitatartalmú vizeletbe merítve erősen lilára szineződik. Emellett a 2. példában megadott recepthez képest körülbelül a felére lerövidült reakcióidők adódnak.
Az 1., 2. és 3. példa más szubsztrátjaival is készítünk nedvesítőszerekkel, így például az előbb alkalmazott lauril-piridinium-kloriddal, vagy például (benzil-trimetil-ammónium)-kloriddal vagy N-palmitil-N-metil-benzimidazolium-kloriddal tesztpapirokat, amelyeknél a nedvesítőszerek nélküli hasonló tesztpapírokhoz képest körülbelül felére lerövidült reakcióidők adódnak.
5. példa
Szűrőpapírt (például Schleicher & Schüll 23 SL) egymásután a következő oldatokkal impregnálunk, és utána 60 °C-on megszárítjuk.
1. oldat:
Trisz(hidroxi-metil)-amino-metán 0,61 g,
Desztillált víz körülbelül 30 ml, az oldat pH-ját 0,1 n sósavoldattal
7,0-re állítjuk, és desztillált vízzel kiegészítjük 100 ml-re.
2. oldat:
Tiazol-2-azo-l'-{2'-[N-(benziloxi-karbonilj-L-alaniloxiJ-naftalin) 46,1 mg,
Cink(II)-acetát-dihidrát 21,9 mg,
Aceton, feltöltve 100 mLre.
így halvány rózsaszínű tesztpapírt kapunk, amely leukocitatartalmú vizeletbe mártva erősen kékeslilára szineződik. Az 1. példa receptjében megadottakhoz képest körülbelül felére lerövidült reakcióidők adódnak, továbbá a teszt érzékenysége körülbelül 1000 leukocita/p.l-re javul.
Az 1. példa más szubsztrátjaival is készítünk fémsókkal, így például az előbb alkalmazott cink(II)-acetáttal vagy például réz(II>kloriddal vagy vas(III)-kloriddal is, tesztpapírokat, amelyeknél a fémsók nélkül készült analóg tesztpapírokhoz képest jelentősen lerövidült reakcióidők és körülbelül 2—3-szor érzékenyebb kimutatási határidők adódnak.
4. példa
Szűrőpapírt (például Schleicher & Schüll 23 SL) egymásután a következő oldatokkal impregnálunk, és utána 60 °C-on megszárítjuk.
6. példa
Tiazol-2-azo-4'-(l'-acetoxi-naftalin).
2,55 g (0,01 mól) 4-(2'-tiazolil-azo)-l-naftolt 100 ml ecetsavanhidriddel 1 ml piridin jelenlétében 1 órán át 80 °C-on melegítjük. Utána a fölöslegben levő ecet5
-511 savanhidridet és a keletkezett ecetsavat vákuumban eldesztilláljuk, a desztillációs maradékhoz 50 ml metanolt adunk, és szárazra pároljuk. A maradékot 15 ml toluolból átkristályositjuk, így 2,0 g (67%) tiazol-2-azo-4'-(l'-acetoxi-naftalin)-t kapunk világosbarna kristályos anyagként, amelynek olvadáspontja 137 °C.
A megfelelően szubsztituált azoszínezékeket ecetsavanhidriddel reagáltatva hasonló módon nyerjük a következő vegyületeket.
6.1. Tiazol-2-azo-2'-(l '-acetoxi-4'-metoxi-benzol).
Narancssárga, kristályos anyag. Olvadáspont: 111—113 °C.
6.2. Tiazol-2-azo-l '-(2',4'-diacetoxi-benzol). Okkerszínű kristályok. Olvadáspont: 101 °C.
6.3. Tiazol-2-azo-l'-(2'-acetoxi-naftalin).
Sötétszínű, amorf por. Vékonyrétegkromatográfiás adatok: réteg: Fertigplatte Kieselgel, futtatószer: n-butanol: ecetsav: víz=2: 1: 1, detektálás: ultraibolya fény, saját szín,
Rf-érték: 0,50.
6.4. Tíazol-2-azo-2'-(l '-acetoxi-naftalin).
Barna, kristályos anyag. Olvadáspont: 122 °C.
6.5. Piridin-2-azo-l '-(2'-acetoxi-naftalin).
Sötétszínű, amorf por. Vékonyrétegkromatográfiás adatok: réteg: Fertigplatte Kieselgel, futtatószer: n-butanol: ecetsav: víz=2: 1: 1, detektálás: ultraibolya fény, saját szín.
Rf-érték: 0,72.
6.6. 4-Nitro-benzol-azo-4'-(l '-acetoxi-naftalin). Barnás kristályos anyag. Olvadáspont: 160—162 °C.
6.7. 2,4-Dinitro-benzol-azo-4'-(l '-acetoxi-benzol). Vörösesbarna kristályos anyag. Olvadáspont: 132 °C.
6.8. 2,4-Dinitro-benzol-azo-4'-(l-acetoxi-naftalin). Okkerszínű kristályos anyag. Olvadáspont: 173 °C.
6.9. 2-Metoxi-4-nitro-benzol-azo-4'-(l '-acetoxi-benzol).
Narancssárga színű kristályos anyag. Olvadáspont: 135 °C.
6.10. 2-Metoxi-4-nitro-benzol-azo-4'-(l'-acetoxi-naftalin).
Narancssárga színű kristályos anyag. Olvadáspont: 174—178 °C.
7. példa
Piridin-2-azo-l'-(2'-benzoiloxi-naftalin).
2,50 g (0,01 mól) l-(2'-piridilazo)-2-naftolt feloldunk 50 ml vízmentes piridinben, 5,5 ml (0,05 mól) benzoil-kloriddal elegyítjük, és 1 órán át kevertetjük 70 °C-on nedvesség kizárása mellett. Utána lehűtjük szobahőmérsékletre, hozzáadunk 3 ml metanolt, és vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot 100 ml metanolból átkristályosítjuk. így 2,54 g (72%) piridin-2-azo-l'-(2'-benzoiloxi-naftalin)-t kapunk vörös kristályos anyagként, amelynek olvadáspontja 153 °C.
Hasonló módon keletkezik 2,4-dinitro-benzol-azo-2'-[1 '-hidroxi-3',6'-di(nátrium-szulfonáto)-naftalin] és benzoil-klorid reagáltatásával:
7.1. 2,4-Dinitro-benzol-azo-2'-[l '-benzoiloxi-3',6'-di- (nátrium-szulfonáto)-naftalin].
Világosbarna kristályok; olvadáspont >250 °C. Vékonyrétegkromatográfiás adatok: réteg: Fertigplatte Kieselgel, futtatószer: izopropanol: butil-acetát: víz= =5:3:2, detektálás: ultraibolya fény, saját szín, Rf-érték: 0,43.
8. példa
Tiazol-2-azo-l'-{2'-[N-(benziloxi-karbonil)-L-ala15 niloxi]-naftalin}.
1. oldat:
A savklorid egylépéses módszer szerinti előállítása céljából 6,70 g (0,03 mól) N-(benziloxi-karbonil)-L20 -alanint feloldunk 50 ml vízmentes dimetil-formamidban, és lehűtjük —30 °C-ra. Utána keverés és hűtés közben hozzápipettázunk 2,4 ml (0,033 mól) tionil-kloridot, és a reakcióelegyet nedvesség kizárása mellett hűtőfürdőben —30 °C-on hagyjuk állni.
2. oldat:
3,83 g (0,015 mól) l-(2'-tiazolilazo)-2-naftolt feloldunk 75 ml vízmentes dimetil-formamidban, és —30C- ° ra hűtjük.
Reakció:
A 2. oldatot az 1. oldathoz öntjük, hozzáadunk sósavmegkötőként 4,8 ml (0,034 mól) trietil-amint, és hűtés nélkül 6 órát kevertetjük, miközben a hőmérsékletet 1,5 óra alatt hagyjuk 20 °C-ra emelkedni. Utána a reak35 cióelegyet ismét — 30 °C-ra hűtjük, és ugyanilyen menynyiségű frissen készített savklorid-oldatot (1. oldat), valamint 4,8 ml trietil-amint adunk hozzá. A hőmérsékletet 1,5 óra alatt hagyjuk ismét 20 °C-ra emelkedni, és utána a reakcióelegyet 18 órán át szobahőmérsékleten 40 reagáltatjuk. A reakciót célszerűen kromatográfiásan követjük, és a szükséges, fölös mennyiségű savklorid és trietil-amin hozzáadását ennek megfelelően végezzük.
Feldolgozás:
A reakcióelegyet vákuumban szárazra pároljuk (leg45 feljebb 50 °C fürdőhőmérsékleten). A maradékot 100 ml etil-acetáttal oldjuk, és egymásután kétszer 30 ml 1 n citromsavoldattal, 20 ml vízzel, 50 ml 5—10%-os nátrium-hidrogén-karbonát oldattal és kétszer 25 ml vízzel mossuk. Az etil-acetátos fázist nátrium-szulfáton való 50 szárítás után vákuumban bepároljuk. A maradékot oszlopkromatográfiásan tisztítjuk szilikagélen toluol : dioxán (9: 1) eleggyel eluálva. Az oldószerelegy vákuumban történt eldesztillálása és a maradék etil-acetáttal végzett eldörzsölése után 4,9 g (70,5%) tiazol-255 -azo-1 '-{2'-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalint} kapunk sárga, kristályos anyagként, amelynek olvadáspontja 162 °C.
Hasonló módon kapjuk a megfelelően szubsztituált azoszínezékekből és N-védett aminosavakból, illetve 60 peptidekből a következő vegyületeket.
8.1. Tiazol-2-azo-2 '-{1 '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-4 '-metoxi-benzol}.
Narancssárga kristályok, olvadáspont 148—150 65 °C.
-613
8.2. Tiazol-2-azo-4'-{l ',3 '-di[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-benzol}.
Sárgás narancsszínű kristályok, olvadáspont 133— 135 °C.
8.3. Tiazol-2-azo-2'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxij-naftalin}.
Narancssárga kristályok, olvadáspont 174—
175 °C.
8.4. Tiazol-2-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxij-naftalin}.
Narancssárga kristályok, olvadáspont 132 °C.
8.5. Tiazol-2-azo-5'-{8'-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxij-kinolin}.
Sárga kristályok, olvadáspont 134 °C.
8.6. Tiazol-2-azo-l'-{2'-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-7'-(nátrium-szulfonáto)-naftalin}-dihidrát.
Narancssárga színű por. Vékonyrétegkromatográfiás adatok: réteg: Fertigplatte Kieselgel, futtatószer: izopropanol: butil-acetát: víz= = 5:3:2, detektálás: ultraibolya fény, saját szín, Rf-érték: 0,49.
8.7. Tiazol-2-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-5'-metoxi-naftalin}.
Narancssárga kristályok, olvadáspont 127 °C.
8.8. Tiazol-2-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-5 '-(3 ,6 -di-oxa-heptiloxi)-naftalinj. Vörösesbarna, amorf anyag.
Vékonyrétegkromatográfiás adatok: réteg: Fertigplatte, Kieselgel, futtatószer: kloroform: metanol=50: 1; detektálás: ultraibolya fény, saját szín, Rf-érték: 0,41.
8.9. 5-Bróm-tiazol-2-azo-l '-{2'-[N-(benziloxi-karbobonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
Narancssárga színű kristályok, olvadáspont: 192 CC.
8.10 5-Bróm-tiazol-2-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
Narancssárga kristályok, olvadáspont: 162 °C.
8.11. Benzotiazol-2-azo-l'-{2'-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin }.
Narancssárga kristályok, olvadáspont : 190 °C.
8.12. Benzotiazol-2-azo-2'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
Narancssárga színű kristályok, olvadáspont: 148— 150 °C.
8.13. Benzotiazol-2-azo-4{1 '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
Narancssárga kristályok, olvadáspont: 180— 182 °C.
8.14. 6-Metoxi-benzotiazol-2-azo-2'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
Narancssárga kristályok, olvadáspont: 148— 150 °C.
8.15. 6-Metoxi-benzotiazol-2-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
Sárgás narancsszínű kristályok, olvadáspont: 194—196 °C.
8.16. Piridin-2-azo-4'-{l ',3'-di[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-benzol}.
Barnás, amorf por.
Vékonyrétegkromatográfiás adatok:
réteg: Fertigplatte Kieselgel, futtatószer: toluol: dioxán (5 :1) ecetsav atmoszférában, detektálás: ultraibolya fény, réz(II)-acetát és ammónia,
Rf-érték: 0,34.
8.17. Piridin-2-azo-l '-{2'-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxij-naftalin}.
Barnás kristályok, olvadáspont: 117 °C.
8.18. 4-(Nátrium-szulfonáto)-benzol-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}. Narancssárga kristályok, olvadáspont: 264 °C.
8.19. 4-Nitro-benzol-azo-4'-{l'-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
Vörösbarna kristályok, olvadáspont: 145 °C.
8.20. 2,4-Dinitro-benzol-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-benzol}.
Okkerszínű kristályok, olvadáspont: 110 °C.
8.21. 2,4-Dinitro-benzol-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
Narancssárga kristályok, olvadáspont: 154 °C.
8.22. 2-Metoxi-4-nitro-benzol-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbon l)-L-alaniloxi]-naftalin}.
Vörösesbarna kristályok, olvadáspont: 186— 187 °C.
8-23. 2-Metoxi-4-nitro-benzol-azo-5'-{8'-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-kinolin).
Narancssárga színű kristályok, olvadáspont: 225— 230 °C.
8.24. 2-Metoxi-4-nitro-benzol-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-5'-metoxi-naftalin}. Narancssárga színű kristályok; olvadáspont: 165—167 °C.
8.25. 2-Metoxi-4-nitro-benzol-azo-4'-(l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-5'-(3,6-di-oxa-heptiloxi)-naftalin).
Narancssárga színű kristályok; olvadáspont: 118—120 °C.
8.26. 4-Metoxi-2-nitro-benzol-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin).
Vörösesbarna kristályok; olvadáspont: 140 CC.
8.27. 2,5-Dimetoxi-4-nitro-benzol-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
Narancssárga kristályok; olvadáspont: 198— 201 °C.
8.28. 2,5-Dimetoxi-benzol-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
Narancssárga kristályok; olvadáspont: 145 °C.
8.29. 2-Metoxl-4-(benzoil-amino)-5-metil-benzol-azo-4'-{l'-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniIoxi]-naftalin}. Vörösesbarna kristályok; olvadáspont: 128— 130 °C.
8.30. 2,5-Dimetoxi-4-(benzoil-amino)-benzol-azo-4'-{l'-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}. Narancssárga kristályok; olvadáspont: 141— 143 °C.
8.31. 2,5-Dietoxi-4-(benzoil-amino)-benzol-azo-4'-
-(1 '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}. Vörösesbarna kristályok; olvadáspont; 173— 174 °C.
8.32. Tiazol-2-azo-l '-{2'-[N-(benziloxi-karbonil)-L-fenilalaniloxij-naftalin).
Narancssárga kristályok; olvadáspont: 169 CC.
-715
8.33. 2-Metoxi-4-nitro-benzol-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-fenilalaniloxi]-naftalin).
Vörösesbarna kristályok; olvadáspont: 205— 207 °C.
8.34. Tiazol-2-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alanil-L-alaniloxi]-naftalin}.
Narancssárga kristályok; olvadáspont: 175 ’JC.
8.35. Tiazol-2-azo-4'-(l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alanil-L-alanil-L-alaniloxi]-naftalin}.
Világos narancssárga kristályok; olvadáspont: 201 °C.
8.36. 5-Metil-tiazol-2-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
8.37. 6-Metil-benzotiazol-2-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
8.38. 2-Metoxi-4-nitro-benzol-azo-4'-(l '-[N-(p-toluolszulfonil)-L-alaniloxi]-naftalin}.
Vékonyrétegkromatográfiás adatok: réteg: Fertigplatte Kieselgel, futtatószer: toluol: dioxán=6: 1, detektálás: ultraibolya fény, saját szín, Rf-érték: 0,38.
8.39. 2-Metoxi-4-nitro-benzol-azo-4'-{l '-[N-(p-toluolszulfonil)-L-alaniloxi]-5'-(3,6-di-oxa-heptiloxi)-naftil}.
Narancssárga kristályok; olvadáspont: 61—63 °C.
9. példa
Tiazol-2-azo-l'-{2'-[N-(terc-butoxi-karbonil)-L-alaniloxij-naftalin}.
1,89 g (0,01 mól) N-(terc-butoxi-karbonil)-L-alanint és 2,55 g (0,01 mól) l-(2'-tiazolil-azo)-2-naftolt (TAN) feloldunk szobahőmérsékleten 50 ml vízmentes piridinben, és 2,2 g (0,0107 mól) diciklohexil-karbodiimid (DCC) 20 ml piridinnel készült oldatával elegyítjük. Nedvesség kizárása mellett körülbelül 24 órát keverjük szobahőmérsékleten, utána mégegyszer 1,89 g (0,01 mól) N-(terc-butoxi-karbonil)-L-alanint és 2,2 g (0,0107 mól) diciklohexil-karbodiimidet adunk a reakcióelegyhez, és további 24 órát kevertetjük szobahőmérsékleten. A már rövid idő elteltével kiváló Ν,Ν'-diciklohexil-karbamidot kiszűrjük, az oldószert vákuumban eldesztilláljuk, és a maradékot 100 ml etil-acetáttal oldjuk. A további kiváló Ν,Ν'-diciklohexil-karbamidot kiszűrjük, és a tiszta etil-acetátos oldatot egymásután kétszer 30 ml 1 n citromsavoldattal, 20 ml vízzel, 50 ml 5—10%-os nátrium-hidrogén-karbonát oldattal és 25 ml vízzel mossuk. Nátrium-szulfáton való szárítás után az etil-acetátos fázist vákuumban bepároljuk. A ragacsos maradékot szilikagéllel töltött oszlopon toluol: dioxán (9: 1) elegygyel eluálva tisztítjuk. így 2,65 g (62%) tiazol-2-azo-l'-{2'-[N-(terc-butoxi-karbonil)-L-alaniloxi]-naftalin}-t kapunk narancssárga színű, kristályos anyagként, amelynek olvadáspontja: 142—144 °C.
Hasonló módon kapjuk a megfelelő aminosavakból, a megfelelően szubsztituált azoszínezékekből és diciklohexil-karbodiimidből a következő vegyületeket.
9.1. Tiazol-2-azo-l '-{2'-[N-(benziloxi-karbonil)-gliciloxi]-naftalin}.
Narancssárga kristályok; olvadáspont: 166 °C.
9.2. 2-Metoxi-4-nitro-benzol-azo-4'-{l '-[N-(benziloxi-karbonil)-gliciloxi]-naftalin}.
Sárgás narancsszínű kristályok; olvadáspont: 185—189 °C.

Claims (5)

Szabadalmi igénypontok
1. Kromogénnel és megfelelő pufferanyaggal, valamint adott esetben további, szokásosan alkalmazott segédanyaggal impregnált szívóképes hordozóból álló diagnosztikai eszköz leukociták kimutatására testfolyadékokban, azzal jellemezve, hogy kromogénként I általános képletű azoszínezék-csztcrt —a képletben
A jelentése 1 vagy 2 nitrogénatomot, kénatomot, oxigénatomot tartalmazó, öttagú vagy hattagú heterociklusos gyűrű, amely adott esetben halogénatommal vagy rövidszénláncú alkilcsoporttal egyszeresen szubsztituált és amely egy, adott esetben rövidszénláncú alkil- vagy alkoxi-csoporttal szubsztituált anellált benzolgyűrűt tartalmazhat, vagy rövidszénláncú alkilcsoporttal, rövidszénláncú alkoxicsoporttal, nitrocsoporttal, szulfonsav-, illetve alkálifém-szulfonsavgyökkel és/vagy benzoil-amino-csoporttal egyszeresen, kétszeresen vagy háromszorosan szubsztituált fenilcsoport,
B jelentése adott esetben szulfonsav-, illetve alkálifém-szulfonsav-gyökkel-, rövidszénláncú alkoxicsoporttal és/vagy rövidszénláncú alkoxi-2-4 tagszám (rövidszénláncú alkilénoxi)-csoporttal egyszeresen vagy kétszeresen szubsztituált benzol-, naftalin- vagy kinolin-maradék,
R jelentése benzoiicsoport vagy valamely 2—5 szénatomos alifás acilcsoport, vagy valamely, terc-butoxi-karbonil-, benziloxi-karbonil vagy p-toluolszulfonil-védőcsoporttal védett, nem heterociklusos, élővilágban előforduló monoamino-monokarbonsav-gyök vagy valamely 2—6 tagszámú, nem heterociklusos, élővilágban előforduló monoamino-monokarbonsavakból álló peptid-gyök, és n jelentése 1 vagy 2 — tartalmaz.
2. Az 1. igénypont szerinti diagnosztikai eszköz kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy a hordozó további segédanyagként valamilyen nedvesítőszert és/vagy valamilyen komplexképzőt tartalmaz.
3. Eljárás leukociták testfolyadékokban való kimutatására szolgáló diagnosztikai eszköz előállítására, azzal jellemezve, hogy alkalmas szívóképes hordozót valamilyen I általános képletű azoszínezék-észterrel — a képletben
A jelentése 1 vagy 2 nitrogénatomot, kénatomot, oxigénatomot tartalmazó, öttagú vagy hattagú heterociklusos gyűrű, amely adott esetben halogénatommal vagy rövidszénláncú alkilcsoporttal egyszeresen szubsztituált és amely egy, adott esetben rövidszénláncú alkil- vagy alkoxi-csoporttal szubsztituált anellált benzolgyűrűt tartalmazhat, vagy rövidszénláncú alkilcsoporttal, rövidszénláncú alkoxicsoporttal, nitrocsoporttal, szulfonsav-, illetve alkálifémszulfonsavgyökkel és/vagy benzoil-amino-csoporttal egyszeresen, kétszeresen vagy háromszorosan szubsztituált fenilcsoport,
B jelentése adott esetben szulfonsav-, illetve alkálifém-szulfonsav-gyökkel, rövidszénláncú alkoxicsoporttal és/vagy rövidszénláncú alkoxi-2-4 tagszámú (rövidszénláncú alkilénoxi)-csoporttal egyszeresen vagy kétszeresen szubsztituált benzol-, naftalin- vagy kinolinmaradék,
R jelentése benzoiicsoport vagy valamely 2—5 szénatomos alifás acilcsoport, vagy valamely, terc-butoxi-karbonil- benziloxi-karbonil vagy p-toluol-817 szulfonil-védőcsoporttal védett, nem heterociklusos monoamino-monokarbonsav-gyök vagy valamely 2— 6, nem heterociklusos, élővilágban előforduló monoamino-monokarbonsavakból álló peptid-gyök, és n jelentése 1 vagy 2 — és megfelelő pufferanyaggal és adott esetben egyéb segédanyagokkal impregnálunk.
4. Eljárás az I általános képletű azoszínezék-észterek — a képletben
A jelentése a nitrogénatomot, kénatomot, oxigénatomot tartalmazó, öttagú vagy hattagú heterociklusos gyűrű, amely adott esetben halogénatommal vagy rövidszénláncú alkilcsoporttal egyszeresen szubsztituált és amely egy, adott esetben rövidszénláncú alkil- vagy alkoxi-csoporttal szubsztituált anellált benzolgyűrűt tartalmazhat, vagy rövidszénláncú alkilcsoporttal, rövidszénláncú alkoxicsoporttal, nitrocsoporttal, szulfonsav-, illetve alkálifém-szulfonsav-gyökkel és/vagy benzoil-amino-csoporttal egyszeresen, kétszeresen vagy háromszorosan szubsztituált fenilcsoport,
B jelentése adott esetben szulfonsav-, illetve alkálifém-szulfonsav-gyökkel-, rövidszénláncú alkoxicso porttal és/vagy rövidszénláncú alkoxi-2-4 tagszámú (rövidszénláncú alkilénoxi)-csoporttal egyszeresen vagy kétszeresen szubsztituált benzol-, naftalin- vagy kinolin-maradék,
5 R jelentése benzoilcsoport vagy valamely 2—5 szénatomos alifás acilcsoport, vagy valamely, terc-butoxi-karbonil-benziloxi-karbonil vagy p-toluolszulfonil-védőcsoporttal védett, nem heterociklusos élővilágban előforduló monoamino-monokarbonsav10 gyök vagy valamely 2—6 tagszámú, nem heterociklusos monoamino-minokarbonsavakból álló peptidgyök, és n jelentése 1, vagy 2 — előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely II általá15 nos képletű vegyületet — ahol A, B és n jelentése az előbb megadottakkal azonos — előnyösen —30 és 80 °C közötti hőmérsékleten, adott esetben valamely bázis, előnyösen piridin vagy trietil-amin jelenlétében, egy III általános képletű savval — ahol R jelentése az előbb 20 megadottakkal azonos — illetve ennek megfelelő reakcióképes származékával — előnyösen karbonsavanhidridjével, illetve karbonsavkloridjával — reagáltatunk.
HU79BO1801A 1978-08-22 1979-08-21 Diagnostic means for the detection of leucocythes in body fluids and process for preparing the proper chromogens HU179936B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19782836644 DE2836644A1 (de) 1978-08-22 1978-08-22 Diagnostisches mittel zum nachweis von leukozyten in koerperfluessigkeiten und dafuer geeignete chromogene

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU179936B true HU179936B (en) 1983-01-28

Family

ID=6047622

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU79BO1801A HU179936B (en) 1978-08-22 1979-08-21 Diagnostic means for the detection of leucocythes in body fluids and process for preparing the proper chromogens

Country Status (10)

Country Link
US (2) US4296202A (hu)
EP (1) EP0008428B1 (hu)
JP (1) JPS5529590A (hu)
AT (1) ATE10139T1 (hu)
CA (1) CA1134351A (hu)
CS (1) CS220793B2 (hu)
DE (2) DE2836644A1 (hu)
HU (1) HU179936B (hu)
YU (1) YU206279A (hu)
ZA (1) ZA794383B (hu)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2836644A1 (de) * 1978-08-22 1980-03-06 Boehringer Mannheim Gmbh Diagnostisches mittel zum nachweis von leukozyten in koerperfluessigkeiten und dafuer geeignete chromogene
DE3017721A1 (de) * 1980-05-09 1981-11-26 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme und dafuer geeignete substrate
JPS6035117B2 (ja) * 1980-10-28 1985-08-13 富士写真フイルム株式会社 リパ−ゼ活性測定用試薬
US4610961A (en) * 1982-12-27 1986-09-09 Eastman Kodak Company Inhibition of reduction activities of leukocytes
DE3413118A1 (de) * 1984-04-06 1985-10-24 Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. Analysenverfahren und mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme
DE3413120A1 (de) * 1984-04-06 1985-10-24 Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. Analysenverfahren und mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme
US4637979A (en) * 1984-04-06 1987-01-20 Miles Laboratories, Inc. Composition and test device for determining the presence of leukocytes containing a zwitterion coupling agent
DE3413078A1 (de) * 1984-04-06 1985-10-24 Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. Chromogene aminosaeure- und peptidester, verfahren zu deren herstellung, verwendung dieser verbindungen in analysenverfahren sowie mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme
US5051358A (en) * 1987-05-07 1991-09-24 The Procter & Gamble Company Diagnostic methods for detecting periodontal diseases
DE3732871A1 (de) * 1987-09-30 1989-04-20 Behringwerke Ag Chromogene substrate
DE3814811A1 (de) * 1988-05-02 1989-11-16 Merck Patent Gmbh Verfahren und mittel zur differenzierung und bestimmung von leukozyten
DE4406665A1 (de) * 1994-03-01 1995-09-07 Biosynth Ag Enzymsubstrate mit 2-(2-Thiazolylazo)-p-kresol als chromogener Gruppe
US5464739A (en) * 1994-08-22 1995-11-07 Bayer Corporation Composition method for determining the presence of leukocyte cells, esterase or protease in a test sample
US6528652B1 (en) * 1999-01-21 2003-03-04 Chronimed Composition and device for detecting leukocytes in urine
US6348324B1 (en) 1999-01-21 2002-02-19 Hypoguard America Limited Composition and device for detecting leukocytes in urine

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2170262A (en) * 1935-08-17 1939-08-22 Soc Of Chemical Ind Derivatives of dyestuffs containing hydroxyl groups and process of making same
US2332666A (en) * 1942-01-07 1943-10-26 Pfizer Charles & Co Acetylated sugar compound
US2870137A (en) * 1956-04-27 1959-01-20 Sandoz Ag Water-insoluble monoazo dyestuffs
US3068072A (en) * 1960-04-08 1962-12-11 Mary M Demek Hydroxamic acid catalyzed hydrolysis
US3190876A (en) * 1962-04-19 1965-06-22 Nat Starch Chem Corp Ethylenically unsaturated azobenzene derivatives
DE1619408A1 (de) * 1965-11-12 1972-03-16 Sandoz Ag Verfahren zum Faerben und Bedrucken von Gebilden aus metallmodifizierten Polymeren ungesaettigter Kohlenwasserstoffe
CH523957A (de) * 1966-12-27 1972-06-15 Ciba Geigy Ag Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen Azofarbstoffen
US3840517A (en) * 1968-12-16 1974-10-08 Eastman Kodak Co Phenylazo-n-heterothioalkylaniline compounds
BE758449A (fr) * 1970-03-28 1971-04-16 Merck Patent Gmbh Substances nematiques
BE786306A (fr) * 1971-07-15 1973-01-15 Ciba Geigy Procede de teinture et d'impression de matieres en polyester
US3822246A (en) * 1972-05-15 1974-07-02 Eastman Kodak Co Azo compounds containing an imidoalkanoylamino group
DE2836644A1 (de) * 1978-08-22 1980-03-06 Boehringer Mannheim Gmbh Diagnostisches mittel zum nachweis von leukozyten in koerperfluessigkeiten und dafuer geeignete chromogene
US4225669A (en) * 1979-04-27 1980-09-30 Melnick Joseph L Staining and analysis of bacteria

Also Published As

Publication number Publication date
JPS5529590A (en) 1980-03-01
YU206279A (en) 1983-04-30
EP0008428B1 (de) 1984-10-31
DE2967283D1 (en) 1984-12-06
DE2836644A1 (de) 1980-03-06
EP0008428A2 (de) 1980-03-05
CS220793B2 (en) 1983-04-29
EP0008428A3 (en) 1981-04-15
US4442033A (en) 1984-04-10
ZA794383B (en) 1980-09-24
CA1134351A (en) 1982-10-26
US4296202A (en) 1981-10-20
JPS6142749B2 (hu) 1986-09-24
ATE10139T1 (de) 1984-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU179936B (en) Diagnostic means for the detection of leucocythes in body fluids and process for preparing the proper chromogens
EP0853647B2 (en) Fluorinated xanthene derivatives
CA1186201A (en) Agent for the detection of esterolytic and/or proteolytic enzymes and with substrates suitable for this purpose
US4299917A (en) Diagnostic agents for the detection of leukocytes in body fluids
KR100231078B1 (ko) 단백질 검출용 분석 시험 스트립 및 이를 사용하는 단백질 검출방법
US7709653B2 (en) Asymmetric cyanine compounds, their preparation methods and their uses
US7972789B2 (en) Dye compounds
US3850576A (en) Diagnostic composition for the detection of urobilinogen
AU617097B2 (en) Compounds, reagents and procedures for determining cations
HU180211B (en) Process for preparing a-guaiaconic acid and diagnostic composition containing thereof
JPS60227698A (ja) 白血球、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在を測定するための組成物及び試験具
US5981747A (en) Monomethine cyanines rigidized by a two-carbon chain
US4331760A (en) Diagnostic agent for the detection of leukocytes and chromogens useful therein
US3880588A (en) Diagnostic agent for detecting bilirubin
EP3391056B1 (en) Chromogenic peroxidase substrates
NO171072B (no) Middel for paavisning av esterolytiske eller proteolytiskeenzymer samt anvendelse av midlet
US4469789A (en) Amino acid and peptide esters of leuko-indoaniline compounds and compositions for the detection of proteolytic enzymes
EP0152274B1 (en) Method for the determination of leucine aminopeptidase (lap)
GB2095666A (en) N-acetyl- -d-glucosaminides
CA2042416C (en) Method for the determination of an ion with increased sensitivity, use of substances which are suitable for this and a corresponding agent
EP0158224A2 (de) Analysenverfahren und Mittel zum Nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer Enzyme
US5646295A (en) Diazapentalene derivatives as a specific reagent for thiol compounds
JPH04103568A (ja) チオフェノールエステル及びこれを用いた加水分解酵素の測定器具

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628