HRP980224A2 - Vitamin d3 analogs with bis c-20 side chains - Google Patents

Description

Ovaj izum odnosi se na analoge vitamina D3, intermedijate i metode za pripravljanje tih analoga, na farmaceutske sastave koji sadrže te analoge i na upotrebu tih analoga za za liječenje osteoporoze, primarnog i sekundarnog hiperparatiroidizma, autoimunosnih bolesti i za liječenje i prevenciju neoplastičnih bolesti.

Osteoporoza je najopćenitiji oblik metaboličke bolesti kostiju i može se smatrati simptomatičnim, lomljivim stupnjem gubitka kosti (osteopenija). Iako osteoporoza može biti posljedica niza drugih primarnih bolesti, čini se da su 90% od svih slučajeva idiopatski. Žene u postmenopauzi predstavljaju rizičnu skupinu za idiopatsku osteoporozu (tip I osteoporoze u postmenopauzi); drugu skupinu posebno visokog rizika za idiopatsku osteoporozu čine starije osobe obaju spolova (senilna ili tip II osteoporoze). Osteoporoza je također bila dovedena u svezu s uzimanjem kortikostereoida, imobilizacijom ili duljim ležanjem u krevetu, alkoholizmom, dijabetesom, gonadotoksičnom kemoterapijom, hiperprolaktinemijom, anoreksijom nervoza, primarnom i sekundarnom amenorejom, imunosupresijom transplantata i ooforektomijom. Osteoporozu postmenomauze karakteriziraju pucanja kičme, dok su frakture bedrene kosti dominantni oblici senilne osteoporoze.

Vjeruje se da mehanizam kojim se kost gubi kod osteoporoze uključuje neravnotežu u procesu kojim se obnavlja sam kostur. Taj proces je bio nazvan remodeliranje kostiju. On se zbiva u nizu diskretnih džepova djelovanja. Ti džepovi se pojavljuju spontano unutar koštane matrice na datoj površini kosti kao bočna koštana resorpcija. Osteoklasti (stanice koje otapaju ili resorbiraju kost) su odgovorni za resorpciju dijela kosti općenito konstantne dimenzije. Taj proces resorpcije prati pojava osteoblasta (stanice koje oblikuju kost) koji zatim popunjavaju s novom kosti gnijezdo koje su napustili osteoklasti.

Kod zdravih osoba, osteoklasti i osteoblasti funkcioniraju tako da je formiranje kosti u ravnoteži s resorpcijom kosti. Međutim, kod osteoporoze se razvija neravnoteža u procesu remodeliranja kosti koja ima za posljedicu da se kost nadomješta sporije nego što se gubi. Iako se ta neravnoteža zbiva u nekom opsegu najčešće u pojedinaca jer oni stare, ona je mnogo ozbiljnija i pojavljuje se u mlađoj dobi u osoba s osteoporozm u postmenopauzi, nakon ooforektomije, ili i jatrogenskim situacijama kao što su one koje su posljedica terapije s kortikosteroidima ili imunosupresije koja se prakticira kod presađivanja organa.

Za povećanje koštane mase u ljudi pogođenih s osteoporozom bili su preporučeni razni pristupi, uključiv davanje androgena, fluoridnih soli i paratiroidnog hormona, te modificiranih verzija paratiroidnog hormona. Također je ukazano da za očuvanje postojeće koštane mase mogu biti korisni bisfosfonati, kalcitonin, kalcij, 1,25-dihidroksi vitamin D3 i neki njegovi analozi, i/ili estrogeni, sami ili u kombinaciji.

Vitamin D3 je kritičan element u metabolizmu kalcija, koji pospješuje intestinalnu apsorpciju kalcija i fosfora, održavanje adekvatnih razima kalcija i fosfora u serumu i stimulaciju fluksa kalcija u kosti i iz kosti. Vitamin D3 se hidroksilira in vivo, čime se dobije 1 α,25-dihidroksi metabolit koji je aktivan materijal. Proučavanja na životinjama s 1,25-(OH)2 vitaminom D3 sugerirala su anaboličko djelovanje kosti. Aerssens et al. u Calcif Tussue Int, 55:443-450 (1994) opisuju učinak 1 α-hidroksi vitamina D3 na čvrstoću kosti i sastav u rastućim štakorima i bez kortikostereoidnog liječenja. Međutim, upotreba kod ljudi je ograničena na antireseorpciju zbog skromnog terapeutskog omjera (hiperkalciurija i hiperkalcemija kao i nefrotoksičnost).

Dechant i Goa, u “Calcitriol. A review of its use in the treatment of postmenopausal osteoporosis and its potentioal in corticosteroid-induced osteoporosis”, Drugs Aging [NEW ZEALAND 5(4):300-17(1994)], govore da je 1,25-dihidroksivitamin D3 (kalcitriol) pokazao učinkovitost u liječenju osteoporoze u postmenopauzi (a očekuje se i u osteoporozi induciranoj kortikosteroidima) na temelju kliničkih pokusa kod 622 žene s osteoporozom u postmenopauzi. U usporedbi s pacijentima koji su primili elementarni kalcij 1000 mg/dnevno, pacijenti s blagom do umjerenom bolešću (ali ne i oni s ozbiljnijom bolešću) koji su primili kalcitriol (0,25 mikrograma dva puta dnevno) imali su, 3 godine nakon liječenja, značajnu, trostruko manju brzinu novih vertebralnih fraktura. U pacijenata koji su dugotrajno liječeni s prednisonom ili prednisolonom, kalcitriolom 0,5 do 1,0 mikrograma dnevno plus kalcij 1000 mg/dnevno, datog sa ili bez intranazalnog kalcitonin 400 IU/dnevno, bio je spriječen gubitak kosti izazvan steroidom. Općenito, kalcitrol se je dobro podnosio. U preporučenom doziranju hiperkalcemija je bila rjeđa i blaga, koja općenito odgovara smanjenju uzimanja kalcija i/ili doziranju kalcitriola. Međutim, uski okvir terapije kalcitriola zahtjeva njegovo korištenje pod adekvatnim nadzorom, s periodičkim promatranjem razina kalcija i kreatinina u serumu. Ta studija jasno identificira ključno ograničenje terapije kalcitriolom zbog male blizine terapeutskih i toksičnih doza.

Baggiolini et al. u Europskoj patentnoj publikaciji br. 580,968 obznanjuju fluorirane analoge vitamina D3, uključiv 1α-fluor-25-hidroksi-16-en-23-in-26,27-heksafluor-kolekalciferol, koji se može upotrijebiti za liječenje hiperproliferativnih zdravstvenih poremećaja kože, na primjer za liječenje raka i leukemije, i za liječenje bolesti lojnih žlijezda.

U US patentnoj prijavi serijskog broja 08/560,080 obznanjena i zaštićena upotreba tog spoja za obnavljanje koštane mase i/ili gustoće kod osteoporoze. Tekuća US patentna prijava serijskog broja 60/018,219 i US patentna prijava “Fluorirani analozi vitamina D2”, uložena 19. svibnja 1997.g., također obznanjuje upotrebu određenih analoga vitamina D3 za liječenje osteoporoze.

Sekundarni hiperparatiroidizam se općenito nalazi u pacijenata s kroničnim zakazivanjem bubrega. Utvrđeno je da smanjenje sinteze bubrežnog 1,25(OH)2 vitamina D3 (kalcitriola) osnovni mehanizam koji dovodi do sekundarnog hiperparatoroidizma u tih pacijenata i pokazano je da kalcitriol ima izravno supresivno djelovanje na sintezu PTH. Zbog toga je davanje kalcitriola bilo preporučeno za liječenje sekundarnog hiperparatiroidizma u tih pacijenata. Međutim, kako je gore opisano, kalcitriol ima jake hiperkalcemijske učinke, dajući mu uski okvir terapeutskog djelovanja koji ograničava njegovu upotrebu, posebno pri višim dozama. Zbog toga bi bilo poželjno imati alternativna sredstva za liječenje hiperparatiroidizma koje ne uzrokuje te neželjene hiperkalcemijske efekte.

Epidemiološke studije su bile povezane s izlaganjem suncu ili UV svjetlu, s nižom pojavom različitih malignacija, uključiv rak dojke, debelog crijeva i prostate. Dokaz iz proučavanja receptora pokazuja da su osim u klasičnim ciljnim organima, kao što je intestin, bubrezi i kosti, vitamin D3 receptori (VDR) prisutnu u velikom mnoštvu ljudskih normalnih i staničnih linija raka i svježeg tkiva. Inhibicija rasta s vitaminom D ili 1,25-dihidroksikolekalciferolom ne prenosi se uvijek in vivo u mogućoj terapeutskoj učinkovitosti. Rana proučavanja in vivo, fokusirana su na anti-proliferativne učinke 1,25-dihidroksikolekalciferola i njegovih analoga u sistemima modela leukemije murine, pokazala su da 1,25-dihidroksi-kolekalciferol i njegovi analozi induciraju ne samo anti-proliferativan učinak, već također učinak diferencijecije. Terapeutska učinkovitost in vivo ima svoja ograničenja zbog hiperkalcemije opažene kod liječenja s visokom dozom izvornog 1,25-dihidroksikolekalciferola. To je imalo za posljedicu da su razvijeni brojni analozi koji proizvode značajne antitumorske učinke bez hiperkalcemije.

Ovdje obznanjeni analozi vitamina D3, koji nose dva bočna lanca na na C20, ranije nisu bili opisani, niti je bila prepoznata njihova upotreba u liječenju osteoporoze primarnog i sekundarnog paratiroidizma, autoimunosnih bolesti i liječenju i prevenciji neuroplastičnih bolesti kao leukemije i raka.

Predloženim izumom dati su analozi vitamina D3 formule I

[image]

u kojoj

X je H2 ili CH2;

Y je vodik, hidroksi ili fluor;

Z je hidroksi;

R1 i R2 predstavljaju (C1-C4)alkil ili fluoralkil, ili R1 i R2 zajedno sa C25 tvore (C3-C6)cikloalkil ili ciklofluoralkil;

R3 i R4 predstavljaju (C1-C4)alkil ili fluoralkil, ili R3 i R4 zajedno sa C25’ tvore (C3-C6)cikloalkil ili ciklofluoralkil;

A je jednostruka veza ili dvostruka veza;

B1 je jednostruka veza, E-dvostruka veza, Z-dvostruka veza ili trostruka veza; i

B2 je jednostruka veza, E-dvostruka veza, Z-dvostruka veza ili trostruka veza.

Ovaj izum također osigurava sastave koji uključuju farmaceutski prihvatljiv nosač i analog vitamina D3 formule I, kako je gore definiran.

Predloženi izum odnosi se nadalje na upotrebu spoja formule I za liječenje osteoporoze, hiperparatiroidizma, autoimunosnih bolesti i za prevenciju i liječenje neuroplastičnih bolesti.

Kako se ovdje rabi, pojam “(C1-C4)alkil” označava linearni potpuno zasićen ugljikovodični radikal koji ima od jednog do četiri ugljikova atoma ili razgranati potpuno zasićen ugljikovodični radikal koji ima tri do četiri ugljikova atoma; “(C1-C4)fluoralkil” je alkilni radikal, definiran kao gore, u kojem je jedan ili više vodikovih atoma, povezanih na ugljikov kostur, nadomješteno s jednim ili više fluorovih atoma.

Kako se ovdje rabi, pojam “(C3-C6)cikloalkil” označava potpuno zasićen ciklički ugljikovodični radikal koji ima od tri do šest ugljikovih atoma u prstenu, npr. ciklopropil, ciklopentil, i slično; pojam “(C3-C6)ciklofluoralkil” odnosi se na cikloalkilni radikal, definiran kao gore, u kojem je jedan ili više vodikovih atoma povezanih na ugljikov kostur nadomješteno s jednim ili više fluorovih atoma.

Kako se ovdje rabi, pojam “E” označava sterokemijsku konfiguraciju dvostruke veze ugljik-ugljik, tako da dva vodikova atoma dodiruju različite ugljikove atome i oni su na suprotnim strana dvostruke veze ugljik-ugljik; pojam “Z” označava sterokemijsku konfiguraciju na dvostrukoj vezi ugljik-ugljik, tako da dva vodikova atoma dodiruju različite ugljikove atome i oni su na istoj strani dvostruke veze ugljik-ugljik.

“Pred-lijek” znači bilo koji spoj koji oslobađa aktivan izvorni lijek formule (I) in vivo kad se takav predlijek dade liječenom sisavcu. Predlijekovi spoja formule (I) proizvode se modificiranjem funkcionalnih skupina prisutnih u spoju formule (I) na takav način da se modifikacija može odcijepiti in vivo čime se oslobađa izvorni spoj. Predlijekovi uključuju spojeve formule (I) u kojima je hidroksi skupina u spoju (I) povezana na bilo koju skupinu koju se može odcijepiti in vivo tako da se ponovno dobije slobodnu hidroksilnu skupinu. Primjeri predlijekova uključuju ali nisu ograničeni samo na estere (npr. acetatne, formatne i benzoatne derivate), karbamate (npr. N,N-dimetilaminokarbonil) i estere hidroksi funkcionalnih skupina u spojevima formule (I) i slično. Stručnjak može proizvesti takove spojeve rutinskim postupcima aciliranjem ili eterifikacijom hidroksi skupine u polaznoj molekuli.

“Terapeutski učinkovita količina” označava količinu spoja koja je data sisavcu za liječenje ili prevenciju bolesti dovoljna za učinak takovog liječenja ili prevencije bolesti. “Terapeutski učinkovita količina” se veoma mijenja ovisno o spoju, bolesti i njenoj ozbiljnosti, te o starosti, težini, itd. sisavca kojeg se želi liječiti.

Spojevi ovog izuma mogu se općenito proizvesti reakcijom i kombiniranjem fragmenata molekula vitamina D3. [to se toga tiče, za pripravljanje i kombiniranje fragmenata vitamina D3 može se primijeniti postupak sinteze kojeg su opisali Shiueny et al., J Org. Chem, 55:243(1990). Pripravljanje spojeva formule I i intermedijata za njihovo pripravljanje prikazano je u slijedećim reakcijskim shemama.

Spojevi formule I proizvedeni su iz spojeva formule II

[image]

u kojoj su

R1, R2, R3, R4, A, B1 i B2 kao gore opisani, a

R5 je vodik ili trimetilsilil,

reakcijom sa spojevima formule III,

[image]

gdje je X kao gore opisani, Y je vodik, fluor ili terc-butildimetilsililoksi skupina, a Z je terc-butil-dimetil-sililoksi skupina, zatim odstranjivanjem sililnih zaštitnih skupina.

Općenito, spoj formule III reagira s n-butil-litijem, a spoj formule II u mješavini heksana i tetrahidrofurana pri temperaturi od –78ºC daje spoj formule I nakon odstranjivanja sililnih zaštitnih skupina s tetrabutil-amonijevim fluoridom u otapalu tetrahidrofuranu.

Treba primijetiti, da iako prikazani intermedijati imaju hidroksi skupine tipično zaštićene kao sililne etere, svrha izuma uključuje upotrebu alternativnih hidroksi zaštitnih skupina poznatih u struci, kao što su one opisane u T.W. Green, “Protective Groups in Organic Synthesis”, Wiley, New York (1991) i J.F. McOmie, “Protective Groups in Organic Chemistry”, Plenum Press, London (1973) zajedno s alternativnim metodama za zaštitu.

Sinteza i čišćenje spojeva formule III su poznati i uobičajeni u struci. Vidi, na primjer, US patente br. 5,086,191 i 5,616,759 od DeLuca et al., 5,087,619 od Baggiolini et al., 5,384,314 od Doran et al., 5,428,029 od Doran et al., 5,451,574 od Baggiolini et al.; Europsku patentnu pblikaciju EP 0 808,832 A2, patentnu publikaciju WO 96/31216 od Brasitus et al.; Shiuey et al., J. Org. Chem., 55:243-247 (1990), Kiegel, J. et al. i Tetr. Lett., 32:6057-6060 (1991), Perlman, K.L., et al., Tetr.Lett., 32:7663-7666(1991).

Reakcijska shema 1 prikazuje postupak za pripravljanje spoja formule I u kojoj B1 i B2 predstavljaju jednostruke veze; svaki od R1-R4 predstavlja CH3; X je CH2; Y i Z predstavljaju OH.

[image]

U reakcijskoj shemi 1 spoj formule IV je poznati spoj proizveden dehidratacijom odgovarajućeg prekurzorskog alkohola. Vidi, na primjer, Wovkulich, P.M. et al., Tetrahedron, 40:2283 (1984). Spoj formule IV pretvoren je u spoj formule V reakcijom s etil propionatom u prisutnosti Lewisove kiseline, kao što je etilaluminijev diklorid. Reakcija se provodi u kloriranom ugljikovodičnom otapalu kao što je diklormetan, pri sobnoj temperaturi. Spoj formule V pretvoren je u spoj formule VI hidrogeniranjem u prisutnosti katalizatora kao što je 10%-tni paladij na ugljenu. Reakcija se provodi u esterskom otapalu kao što je etil acetat, pod tlakom od jedne atmosfere, pri sobnoj temperaturi. Spoj formule VI je pretvoren u spoj formule VII reakcijom s metilmagnezijevim bromidom u otapalu kao što je mješavina dietil etera i tetrahidrofurana, pri sobnoj temperaturi. Spoj formule VII pretvori se u spoj formule VIII reakcijom s vodenom 30%-tnom fluorovodičnom kiselinom, u mješavini acetonitrila i tetrahidrofurana kao otapala, pri sobnoj temperaturi. Spoj formule VIII se oksidira u spoj formule IX s piridinijevim diklormatom u kloriranom ugljikovodičnom otapalu, kao što je diklormatan, pri sobnoj temperaturi. Spoj formule IX reagira s trimetil-sililimidazolom u diklormetanu kao otapalu, čime se dobije spoj formule IIa. Spoj formule IIIa reagira s n-butil-litijem, a spoj formule IIa u mješavini heksana i tetrahidrofurana pri temperaturi od -78ºC daje spoj formule Ia nakon odstranjivanja sililnih zaštitnih skupina s tetrabutilamonijevim fluoridom u tetrahirofuranu kao otapalu.

Spojevi formule I, u kojoj A predstavlja jednostruku vezu ili dvostruku vezu, a B1 i B2 su dvostruke i trostruke veze, proizvedeni su reakcijom odgovarajućih prekurzora, analognih formuli II, sa spojevima formule III. Odgovarajući prekurzori analogni formuli II proizvedeni su metodama koje su stručnjacima poznate. Primjer puta sinteze prikazan je na reakcijskoj shemi 2.

[image]

Spojevi formule II, u kojoj su B1 i B2 trans dvostruke veze (E), proizvedeni su pretvorbom spoja formule VI u odgovarajući bis-nezasićeni ester X, obradom s litijevim diizopropilamidom i fenilselenil kloridom i zatim oksidacijom s vodikovim peroksidom i eliminacijom selen oksida. Taj bis-nezasićen ester X pretvoren je u prekurzor analogan s IIa, gdje su B1 i B2 trans dvostruke veze (E) reakcijama prikazanim u shemi 1.

Spojevi formule II, u kojoj su B1 i B2 cis dvostruke veze (Z), mogu se dobiti oksidacijskim cijepanjem dvostruke veze spojeva formule X s reagentima kao što je ozon ili osmijev tetroksid/natrijev metaperjodat, čime se dobije aldehid formule XI. Aldehid XI se zatim kondenzira primjenom po Stillu modificirane Wittig-Hornerove reakcije s fosfonat ilidom (CF3CH2O)2P(O)CH2C(O)OEt, čime se dobije bis-nezasićeni ester XII, u kojem je dvostruka veza stereo-specifična cis (Z). Taj bis-nezasićeni ester XII pretvori se u prekurzor anlogan s IIa, u kojoj su B1 i B2 cis dvostruke veze (Z), reakcijom prikazanom u shemi 1.

Spojevi formule II u kojoj su B1 i B2 trostruke veze mogu se proizvesti dehidrogeniranjem nezasićenih estera formule X ili XII u odgovarajuću trostruku vezu koja sadrži ester, zatim kondenzacijom s organometalnim reagentom, kako je prikazano u reakcijskoj shemi 1, čime se dobije spoj analogan onom formule IIa. Tvorba trostruke veze može se također izvršiti bromiranjem/dehidrobromiranjem dvostruke veze u spojevima formule X i XII.

Alternativno, aldehid formule XI može se obraditi s butil-litijem i trifenil-fosfin/ugljikovim tetrabromidom primjenom Corey-Fuchsove reakcije, čime se dobije acetilidni anion XIII koji se kondenzira s ketonom da se dobije odgovarajući acetilenski alkohol XIV analogan spoju VII.

Slično, počevši od analognog spoja formule VI, u kojoj A predstavlja dvostruku vezu, može se dobiti prekurzor analogan spoju IIa, u kojem A predstavlja dvostruku vezu.

Spojevi formule II s različitim alkilnim i fluor-alkilnim skupinama R1-R4 mogu se proizvesti kondenzacijom odgovarajućih organometalnih reagenata, npr. s alkil-litijem ili Grignardovim reagentom sa C-25 esterom kao u V, VI, X i XII. Alternativno, te skupine se mogu uvesti kondenzacijom acetilidnog aniona deriviranog od intermedijata kao što je XIII s odgovarajućim ketonom ili fluorketonom (npr. heksafluoracetonom).

U određenim prednosnim izvedbama, B1 i B2 su dvostruke veze ili trostruke veze.

U drugim prednosnim izvedbama A je dvostruka veza.

U ostalim prednosnim izvedbama A je jednostruka veza.

Prednosne izvedbe također uključuju one u kojima X predstavlja CH2, a Y je fluor ili hidroksi.

Druge prednosne izvedbe su one u kojima R1-R4 predstavljaju alkil ili fluralkil, ponajprije trifluor-metil.

Drugi aspekt izuma uključuje predlijekove spoja formule I.

Gore su dati brojni različiti prednosni supstituenti i uvođenjem bilo kojeg od tih prednosnih supstituenata dobije se spoj prema izumu kojem se daje veću prednost nego onom u kojem nema tog posebnog prednosnog supstituenta. Međutim, ti prednosni supstituenti općenito su neovisni, i premda se u nekim slučajevima međusobno isključuju, nakon uvođenja jednog ili više tih prednosnih supstituenata može se dobiti spoj kojem se daje veću prednost od spoja koji ima manje prednosnih supstituenata.

Spojevi ovog izuma mogu se upotrijebiti za prevenciju i liječenje raznih stanja u sisavaca, koja se manifestiraju gubitkom koštane mase. Posebno, spojevi ovog izuma indikativni su za profilaksu i terapeutsko liječenje osteoporoze i osteopenije u sisavaca, pri čemu oni ne induciraju hiperkalciuriju, hiperkalcemiju ili nefrotoksičnost. Kako se ovdje rabi, “hiperkalciurija” je prekomjeran kalcij u urinu, što kod ljudi odgovara izlučivanju većem od 4 mg/kg/dnevno. To često ima za posljedicu nefrolitijazu (renal calculi). “Hiperkalcemija” je prekomjerna koncentracija kalcija u serumu; kod ljudi (i štakora) to odgovara količini većoj od 10,5 mg/dl. “Intolerantna hiperkalcemija”, koja obično nastaje kod koncentracije kalcija u serumu veće od pribl. 12 mg/dl, popraćena je s emocionalnom labilnošću, konfuzijom, delirijem, psihozama, stuporom i komom.

Očekuje se da spojevi ovog izuma budu upotrebljivi u liječenju tipa I (post menopauza), tipa II (senilna) i tipa III (jatrogena) osteoporoze, uključiv one koje su povezane s upotrebom imunosupresivnih lijekova koji se koriste pri transplantaciji organa, kao i u liječenju osteodistrofije zbog bubrežne dijalize i hiperparatiroidizma.

Spojevi ovog izuma mogu se također upotrijebit za liječenje bolesti uzrokovanih povišenim razinama para-tiroidnog hormona. U jednom aspektu, spojevi izuma upotrebljavaju se za liječenje sekundarnog hiperpara-tiroidizma povezanog s otkazivanjem bubrega i posebno s gubitkom ili smanjenjem koštane mase poveznim s renalnom insuficijencijom. Drugi aspekti uključuju liječenje renalne osteodistrofije povezane s kasnim stanjem sekundarnog hiperparatiroidizma. Ostali aspekti uključuju liječenje primarnog hiperparatiroidizma.

Spojevi formule I također se mogu upotrijebiti za liječenje neoplastičnih bolesti kao što je leukemija, rak debelog crijeva, rak dojke i rak prostate.

Spojevi formule I također se mogu upotrijebiti za liječenje imunosupresivnih i autoimunosnih bolesti. Takove bolesti uključuju, ali nisu ograničene samo na multiplu sklerozu, sistemski eritematozni lupus, dijabetes, tiroiditis i odbacijvanje alografta. Posebno, spojevi formule I mogu se upotrijebiti za liječenje bolesti putem moduliranja djelovanja vitamin D3 receptora (VDR). Upotrebljivost tih spojeva pokazana je in vivo primjenom modela murine za te bolesti, koji model je dobro poznat u struci. Vidi, npr. Lemire et al., Autoimmunity, 12:143-148(1942); Lemire et al., J. Clin. Invest., 87:1103-1107(1991), Lemire et al., Endocrinology, 135:2818(1994) i Lemire et al., J. Cellular Biochem., 49:26-31(1992).

Općenito, spojevi ovog izuma ne uzrokuju povišene razine kalcija opažene s drugim analozima vitamina D3 kao što je 1,25 (OH)2 vitamin D3, pa tako osiguravaju daju bolji terapeutski omjer i bolje liječenje gornjih bolesti.

Općenito, spoj ovog izuma može se dati količinama između otprilike 0,0002 i 0,5 mg spoja/kg/tjelesne težine dnevno, ponajprije od pribl. 0,001 do pribl. 0,1 mg/kg/tjelesne težine dnevno, najbolje od pribl. 0,002 do pribl. 0,02 mg/kg/tjelesne težine dnevno. Za čovjeka teškog 50 kg, dnevna doza aktivnog sastojka može biti od pribl. 0,01 do pribl. 25 µg, ponajprije od pribl. 0,05 do pribl. 10 µg, najbolje od pribl. 1,0 µg do pribl. 10 µg dnevno. To doziranje se može dati u uobičajenom farmaceutskom sastavu jednostrukim davanjem, višestrukim aplikacijama ili kontroliranim oslobađanjem ako se želi postići najučinkovitiji rezultati, ponajprije jednom ili dva puta dnevno na usta. U određenim situacijama, za postizanje željene terapeutske reakcije, može biti prikladno i drugačije dnevno doziranja.

Odabir točne doze i sastava, te naprikladniji režim davanja ovisi, između ostalog, o farmakološkim svojstvima formulacije, naravi i ozbiljnosti stanja koje se liječi, te o fizičkim stanju i mentalnoj bistrini primaoca. Kod liječenja osteoporoze inducirane s kortikostereoidom, očekuje se da će potrebna doza biti veća kod većih doza kortikostereoida.

Tipični režini davanja uključuju oralno, parenteralno (uključiv subkutano, intramuskularno i intravensko), rektalno, preko jezika (uključiv i ispod jezika), pulmonalno, transdermalno i intranazalno, najbolje oralno. Davanje može biti kontinuirano ili intermitentno (npr. bolusnom injekcijom).

Daljnji aspekt predloženog izuma odnosi se na farmaceutske sastave, koji kao aktivan sastojak sadrže spoj predloženog izuma pomiješan s farmaceutski prihvatljivim netoksičnim nosačem. Kako je gore spomenuto, takovi sastavi mogu se pripraviti za parenteralno (subkutano ili intravensko) davanje, naročito u obliku tekućih otopina ili suspenzija; za oralno ili za davanje preko jezika, naročito u obliku tableta ili kapsula; za pulmonalno ili intranazalno davanje, posebno u obliku pudera, nazalnih kapljica ili aerosola; te za rektalno ili transdermalno davanje.

Spojevi se obično mogu dati u obliku jedinačnih doziranja i mogu se pripraviti bilo kojom od metoda dobro poznatih u farmaceutskoj struci, na primjer, kako je opisano u Remington’s Pharmaceutical Science, 17. izdanje, Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985). Formulacije za parenteralno davanje kao pomoćne tvari mogu sadržavati sterilnu vodu ili otopinu soli, alkilen glikole kao što je propilen glikol, polialkilen glikole kao polietilen glikol, ulja biljnog podrijetla, hidrogenirane naftalene i slično. Formulacije za nazalno davanje mogu biti krute i mogu sadržavati pomoćne tvari, kao na primjer laktozu ili dekstran, ili to mogu biti vodene ili uljne otopine za upotrebu u obliku nazalnih kapljica ili odmjernog spreja. Za davanje preko jezika tipične pomoćne tvari uključuju šećere, kalcijev stearat, magnezijev stearat, predželatinirani škrob i slično.

Sastavi za oralno davanje mogu sadržavati jedan ili više farmaceutski podnošljivih nosača i/ili pomoćnih tvari i mogu biti u krutom ili tekućem obliku. Tablete i kapsule mogu biti pripravljene s veznim sredstvima, na primjer, sa sirupom, akacijom, želatinom, sorbitolom, tragakantom ili poli-vinilpirolidonom; s punilom kao što je laktoza, saharoza, kukuruzni škrob, kalcijev fosfat, sorbitol ili glicin; s lubrikantima kao što je magnezijev stearat, talk, polietieln glikol, ili silicijev dioksid; i s površinski aktivnim tvarima kao što je natrijev lauril sulfat. Tekući sastavi mogu sadržavati uobičajene dodatke kao što su sredstva za suspendiranje, na primjer sorbitol sirup, metil celuloza, šećerni sirup, želatina, karboksimetilceluloza, ili jestive masti; emulgatore kao što je lecitin ili akacija; biljna ulja kao što je bademovo ulje, kokosovo ulje, riblje ulje ili kikirikijevo ulje; konzervanse kao butilirani hidroksianisol (BHA) i butilirani hidroksitoluen (BHT). Da se dobije jediničnu dozu, tekući sastavi se mogu ukapsulirati, na primjer, u želatinu.

Prednosni kruti oralni oblici doziranja uključuju tablete, kapsule s dvodjelnom krutom ljuskom i kapsule od meke elastične želatine (SEG). SEG kapsule su posebno zanimljive, jer one osiguravaju jasne prednosti u odnosu prema drugim oblicima (vidi Seager, H., “Soft gelatin capsules: a solution to many tableting problems”; Pharmaceutical Technology, 9, (1985). Neke od prednosti upotrebe SEG kapsula jesu: a) ujednačenost sadržaja doze je optimirana u SEG kapsulama, jer je lijek otopljen ili dispergiran u tekućini koju se može točno dozirati u kapsule, b) lijek formuliran kao SEG kapsule pokazuje dobru biološku raspoloživost, jer je lijek otopljen, solubiliziran ili dispergiran u tekućini koja se miješa s vodom, ili u ulju, i stoga, kad se oslobode u tijelu, otpine se otapaju ili emulgiraju dajući disperziju lijeka velike površine i c) degradacija lijekova osjetljivih prema oksidaciji tijekom dugotrajnog skladišenja je spriječena, jer suha ljuska meke želatine sprečava difuziju kisika.

Formulacije sa suhom ljuskom tipično uključuju koncentraciju od pribl. 40% do 60% želatine, koncentraciju od pribl. 20% do 30% plastifikatora (kao što je glicerin, sorbitol ili propilen glikol) i koncentraciju od pribl. 30 do 40% vode. Također mogu biti prisutni i drugi materijali, kao konzervansi, sredstva protiv prozirnosti i sredstva za korekciju okisa. Tekuća punila uključuju kruti lijek otopljen, solubiliziran ili dispergiran (sa sredstvom za suspendiranje kao što je pčelinji vosak, hidrogenirano ricinusovo ulje ili polietilen glikol 4000), ili tekući lijek u vehiklu, ili u kombinacijama vehikla, kao što su mineralno ulje, biljna ulja, trigliceridi, glikoli, polioli i površinski aktivna sredstva.

Slijedeći primjeri dati su da stručnjacima omoguće jasnije razumijevanje i praktičnu provedbu izuma. Njih se ne smije smatrati ograničenjem svrhe izuma, već su dati za ilustraciju i prikaz izuma.

EKSPERIMENTALNI DIO

Primjer 1

[1R-[1α(2E,4E,7E),3aβ,4α,7aα]]-5-[4-[[(1,1-dimetiletil)-dimetilsilil]oksi]oktahidro-7a-metil-1H-inden-1

-il]-2,4,7-nonatriendionska kiselina dietil ester (V)

K miješanoj otopini od 3,08 g (10,0 mmolova) [1R-(1α,3aβ,4α,7aα)]-(1,1-dimetiletil)dimetil[[oktahidro-7a-metiletenil)-1H-inden-4-il]oksi]silana i 3,92 g (40,0 mmolova) etil propionata u 20 ml diklormetana doda se 40 ml (40,0 mmolova) 1,0 M otopine etilaluminijevog diklorida u heksanu. Smjesu se miješa u argonu 24 sata pri sobnoj temperaturi, pomiješa se s 981 mg (10 mmolova) etil propionata i 7,5 ml (7,5 mmolova) 1,0 M otopine etil-aluminijevog diklorida u heksanu i miješa se još 18 sati. Dobivenu narančasto-crvenu otopinu doda se u obrocima k mješavini od 200 ml etil acetata i 100 ml 50%-tne otopine soli, i, po prestanku pjenjenja, organsku fazu se skupi i vodenu fazu se ponovno ekstrahira s 3 x 100 ml etil acetata. Sjedinjeni organski ekstrakti se isperu s 2 x 100 ml 50%-tne otopine soli, osuše (Na2SO4) i ispare, čime se dobije 5,76 g crvenkaste gume, koju se podvrgne vakuumskoj kromatografiji na 120 g silika gela (40-45 µm miješa, promjer kolone 3,5 cm) s 10%-tnim etil acetatom u heksanu kao sredstvom za ispiranje, pri čemu se skupljaju frakcije po 20 ml. Frakcije 21-32 se sjedine i ispare, čime se dobije 2,18 g sirovog proizvoda. Daljnjim čišćenjem pomoću HPLC (15-30 µm miješa, silika gel, kolona 50 cm x 50 cm, brzina protoka 70 ml/min) sa 7,5%-tnim etil acetatom u heksanu kao sredstvu za ispiranje, dobije se 1,62 g (32%) naslovnog spoja, RT 25 minuta, kao blijedo žute gume:

[α]25D + 83,50º (EtOH, c = 0,98); UV (MeOH) 284 (ε = 28,173), 207 (ε = 16,884) nm; IR (CHCl3) 1708, 1651, 1628 cm-1;

1H NMR (CDCl3) δ 0,006 (6H, s); 0,80 (3H, s); 0,88 (9H, s); 1,16 (1H, t, J=7,6 Hz), 1,28 (6H, preklapanje t, J=7 Hz), 1,67-1,78 (6H, m); 2,16 (1H, t, J=9 Hz), 3,00 (1H, dd, J=6, 16 Hz); 3,35 (1H, dd, J=16,4 Hz); 4,02 (1H, s); 4,16 (4H, preklapanje q, J=7 Hz); 5,75 (1H, d, J=16 Hz), 5,84 (1H, d, J=15 Hz); 6,17 (1H, d, J=11 Hz); 6,88 (1H, dt, J=16,6 Hz), 7,50 (1H, dd, J=11,15 HZ); MS (EI) m/z 504 (M+, 23).

Analitički proračun za C29H48O5Si:

C, 69,00; H, 9,58; Si, 5,56.

Nađeno: C, 68,94; H, 9,69; Si, 5,67.

Primjer 2

[1R-(1α,3aβ,4α,7aα)]-5-[4-[[(1,1-dimetiletil)dimetil-silil]oksi]oktahidro-7a-metil-1H-inden-1-il]

-nonandionska kiselina dietil ester (VI)

Miješanu otopinu od 1,009 g (2,0 mmola) [1R-(1α(2E,4E,7E),3aβ,4α,7aα)]-5-[4-[[(1,1-dimetiletil)dimetil-silil]oksi]oktahidro-7a-metil-1H-inden-1-il]-2,4,7-nona-triendionska kiselina dietil estera u 50 ml etil acetata hidrogenira se preko 200 mg 10%-tnog paladija na ugljenu pri sobnoj temperaturi i pod atmosferskim tlakom do prestanka apsorpcije vodika (140 ml vodika apsorbira se tijekom 2,5 sata). Smjesu se filtrira preko Celite filtra, koji se ispere 4 puta sa po 50 ml etil acetata, sjedinjeni filtrati i eluati se ispare i dobije se 1,07 g bezbojnog ulja. Ono se očisti vakuumskom kromatografijom na 60 g silika gela (40-45 µm meša, promjer kolone 3,5 cm) s 12%-tnim etil acetatom u heksanu kao sredstvom za ispiranje, pri čemu se skupljaju frakcije po 20 ml. Frakcije 7-12 se sjedine i ispare, čime se dobije 964 mg (94%) naslovnog spoja kao bezbojnog ulja:

[α]25D + 32,1º (CHCl3, c = 1,04); IR (CHCl3) 1726 cm-1;

1H NMR (CDCl3) δ 0,00 (3H, s); 0,01 (3H, s); 0,87 (9H, s); 0,88 (3H, s); 1,27 (6H, t, J=7 Hz), 1,28-1,90 (21H, m); 2,25 (4H, široki t); 3,98 (1H, s); 4,11 (4H, q, J=7 Hz);

MS (FAB) m/z 511 (M+ + 1, 100).

Analitički proračun za C29H54O5Si:

C, 68,11; H, 10,66; Si, 5,50.

Nađeno: C, 68,21; H, 10,85; Si, 5,43.

Primjer 3

[1R-(1α,3aβ,4α,7aα)]-6-[4-[[(1,1-dimetiletil)dimetilsilil]-oksi]oktahidro-7a-metil-1H-inden-1-il]-2,10-dimetil-2,10-undekandiol (VII)

K miješanoj otopini od 868 mg (1,7 mmola) [1R-(1α,3aβ,4α,7aα)]-5-[4-[[(1,1-dimetiletil)dimetilsilil]-oksi]oktahidro-7a-metil-1H-inden-1-il]-nonan-dionska kiselina etil estera u 12 ml bezvodnog THF-a doda se kap po kap, uz hlađenje (ledena kupelj), 5,0 ml (15 mmolova) 3,0 M otopine metilmagnezijevog bromida u eteru. Smjesu se miješa 45 minuta pri sobnoj temperaturi, ohladi se na 5ºC, i pogasi dodatkom, kap po kap, 3,0 ml zasićene otopine NH4Cl. Po prestanku pjenjenja doda se 15 ml etil acetata i 15 ml zasićenog NH4Cl, miješa se još 20 minuta i smjesu se prelije u 100 ml etil acetata i 50 ml zasićenog NH4Cl. Organsku fazu se skupi i vodenu fazu se ponovno esktrahira s 3 x 60 ml etil acetata. Sjedinjeni organski ekstrakti se isperu s 2 x 100 ml 50%-tne otopine soli, osuše (Na2SO4) i ispare, čime se dobije 814 mg bezbojne gume, koju se očisti vakuumskom kromatografijom na 100 g silika gela (40-65 µm meša, promjer kolone 3,5 cm) s 50%-tnim etil acetatom u heksanu kao sredstvom za ispiranje, pri čemu se skupe frakcije po 20 ml. Frakcije 19-20 se sjedine i ispare čime se nakon sušenja u vakuumu (17 sati) dobije 763 mg (93%) naslovnog spoja kao bezbojne pjene.

[α]25D + 35,8º (EtOH, c = 1,02); IR (CHCl3) 3608 cm-1;

1H NMR (CDCl3) δ 0,00 (6H, s); 0,88 (9H, s); 0,90 (3H, s); 1,20 (12H, s); 1,23-1,90 (27H, m); 3,99 (1H, s);

MS (EI) m/z 482 (3, M+).

Analitički proračun za C29H58O3Si:

C, 72,14; H, 12,11; Si, 5,82.

Nađeno: C, 72,18; H, 11,99; Si, 5,69.

Primjer 4

[1S-(1α,3aβ,4α,7aα)]oktahidro-1-[5-hidroksi-1-(4-hidroksi-4-metilpentil)-5-metilheksil]-7a-metil-4H-inden-4

-ol (VIII)

K miješanoj otopini od 700 mg (1,45 mmola) [1R-(1α,3aβ,4α,7aα)]-6-[4-[[(1,1-dimetiletil)dimetilsilil]-oksi]oktahidro-7a-metil-1H-inden-1-il]-2,10-dimetil-2,10-undekandiola u 5 ml THF-a i 15 ml CH3CN koju se drži u teflonskoj boci doda se 3,0 ml približno 30%-tne vodene otopine fluorsilicijeve kiseline (proizvedene prema A.S. Pilcher i P. DeShong, J. Org. Chem., 1993, 58, 5130) i smjesu se miješa u argonu 1,0 sat pri sobnoj temperaturi. Zatim se u intervalima po jedan sat dodaju 4 obroka po 2,0 ml fluorsilicijeve kiseline, s ukupno 11 ml reagenta i vremenom reakcije od 5 sati. Reakcijsku smjesu se oprezno prelije u smjesu od 125 ml etil acetata i 75 ml zasićene vodene otopine KHCO3. Po prestanku pjenjenja, organsku fazu se skupi i vodenu fazu se ponovno ekstrahira s 3 x 75 ml etil acetata. Sjedinjeni organski ekstrakti se isperu sa 125 ml 50%-tne otopine soli, osuše (Na2SO4) i ispare, čime se dobije 534 mg gume, koju se očisti vakuumskom kromatografijom na 70 g silika gela (40-45 µm meša, promjer kolone 3,5 cm) sa 70%-tnim etil acetatom kao sredstvom za ispiranje, uzimajući frakcije po 20 ml. Frakcije od 17-30 ml se sjedine, profiltriraju i ispare, a ostatak se drži 4 sata u visokom vakuumu, čime se dobije 458 mg (85%) naslovnog spoja, kao bezbojne pjene.

[α]25D + 26,2º (CHCl3, c = 0,76); IR (CHCl3) 3608 cm-1;

1H NMR (CDCl3) δ 0,93 (3H, s); 1,21 (12H, s); 1,24-1,60 (24H, m); 1,79-1,95 (4H, m); 4,07 (1H, s);

MS (FAB) m/z 369 (M+ + H).

Primjer 5

[1S-(1α,3aβ,4α,7aα)]oktahidro-1-[5-hidroksi-1-(4-hidroksi-4-metilpentil)-5-metilheksil]-7a-metil-4H-inden-4

-ol (IX)

K miješanoj otopini od 400 mg (1,08 mmola) [1S-(1α,3aβ,4α,7aα)]oktahidro-1-[5-hidroksi-1-(4-hidroksi-4-metilpentil)-5-metilheksil]-7a-metil-4H-inden-4-ola u 8,0 ml diklormetana doda se 1,30 mg (3,45 mmola) piridinijevog dikromata i smjesu se miješa 4,75 sata pri sobnoj temperaturi. Razrijedi se s 20 ml diizopropil etera, miješa se još 15 minuta i profiltrira kroz filtar Celite. Celite se ispere 4 puta sa po 40 ml diizopropil etera i sjedinjeni filtrat i eluati se ispare, čime se dobije 405 mg blijedo žute gume, koju se očisti vakuumskom kromatografijom na 70 g silika gela (40-45 µm meša, promjer kolone 3,5 cm) sa 75%-tnim etil acetatom u heksanu kao sredstvom za ispiranje uzimanjem frakcija po 20 ml. Frakcije od 17-30 se sjedine i ispare, čime se dobije bezbojnu gumu koju se drži 4,5 sata u visokom vakuumu, nakon čega se dobije 372 mg (94%) naslovnog spoja kao bezbojne gume.

[α]25D 0,45º (EtOH, c = 0,92); IR (CHCl3) 3608, 1706 cm-1;

1H NMR (CDCl3) δ 0,63 (3H, s); 1,22 (12H, s); 1,30-2,10 (22H, m); 2,20-2,28 (2H, m); 2,45 (1H, dd, J=7,6, 11Hz);

MS m/z 348 (M+ - 18).

Primjer 6

[1S-(1α,3aβ,4α,7aα)]oktahidro-7a-metil-1-[5-metil-1-[4-metil-4-[(trimetilsilil)oksi]pentil]-5-[(trimetilsilil)

-oksi]heksil]-4H-inden-4-on (IIa)

K miješanoj otopini od 366,6 mg (1,0 mmola) [1S-(1α,3aβ,4α,7aα)]oktahidro-1-[5-hidroksi-1-(4-hidroksi-4-metilpentil)-5-metilheksil]-7a-metil-4H-inden-4-ola u 10,0 ml diklormetana doda se 1,25 ml (8,5 mmolova) 1-(trimetil-silil)imidazola i smjesu se miješa u argonu 4,75 sata pri sobnoj temperaturi. Razrijedi se s 7,0 ml vode, miješa se još 15 minuta i prelije u mješavinu od 75 ml etil acetata i 50 ml 50%-tne otopine soli. Organsku fazu se skupi i vodenu fazu se ponovno ekstrahira s 3 x 50 ml etil acetata. Sjedinjeni organski ekstrakti se isperu s 3 x 75 ml 50%-tne otopine soli, osuše (Na2SO4) i ispare, čime se dobije bezbojno ulje, koje se očisti vakuumskom kromatografijom na 65 g silika gela (40-45 µm meša, promjer kolone 3,5 cm) sa 20%-tnim etil acetatom u heksanu kao sredstvom za ispiranje uzimanjem frakcija po 20 ml. Frakcije 5-7 se sjedine, zgusnu na pribl. 5 ml, profiltriraju kroz 0,45 µm filter (Milles-HV) i ispare, čime se dobije bezbojno ulje, koje se drži 18 sati u visokom vakuumu, nakon čega se dobije 469 mg (91%) naslovnog spoja.

[α]25D -3,21º (CHCl3, c = 0,87); IR (CHCl3) 1706 cm-1;

1H NMR (CDCl3) δ 0,01 (18H, s); 0,63 (3H, s); 1,20 (6H, s); 1,21 (6H, s); 1,26-1,49 (14H, m); 1,50-2,10 (8H, m); 2,21-2,31 (2H, m); 2,46 (1H, dd, J=12,11 Hz);

MS (EI) m/z 495 (M+ - 15).

Analitički proračun za C29H58O3Si2:

C, 68,17; H, 11,44; Si, 10,99.

Nađeno: C, 68,19; H, 11,41; Si, 11,07.

Primjer 7

(1α,3β,5Z,7E)-21-(3-hidroksi-3-metilbutil)-9,10-seko-kolesta-5,7,10(19)-trien-1,2,25-triol (Ia)

K miješanoj i na -78ºC ohlađenoj otopini od 466 mg reagenta [3S-(1Z,3α,5β)]-[2-[3,5-bis[[(1,1-dimetiletil)-di-metilsilil]oksi]-2-metilencikloheksiliden]etil]difenil-fosfin oksida u 4,0 ml bezvodnog THF-a doda se 0,5 ml 1,6 M otopine n-butil-litija u heksanu. Dobivenu tamno crvenu otopinu miješa se 7 minuta pri -78ºC, pomiješa se s 204 mg (0,40 mmolova) [1S-(1α,3aβ,4α,7aα)]oktahidro-7a-metil-1-[5-metil-1-[4-metil-4-[(trimetilsilil)oksi]pentil]-5-[(trimetil silil)oksi]heksil]-4H-inden-4-ona u 3,0 ml bezvodnog THF-a i miješa se 3 sata pri -78ºC. Smjesu se pusti zagrijati na sobnu temperaturu, pogasi se s 5 ml 1:1 mješavine 2N Rochelleve otopine soli i 2N otopine KHCO3, miješa se još 15 minuta i prelije se u mješavinu od 80 ml etil acetata i 50 ml 1:1 2N Rochelleve otopine soli i 2N otopine KHCO3. Organsku fazu se skupi i vodenu fazu se ponovno ekstrahira s 3 x 60 ml etil acetata. Sjedinjeni organski ekstrakti se isperu s 3 x 75 ml 50%-tne otopine soli, osuše (Na2SO4) i ispare, čime se dobije 1,29 g gume, koju se očisti vakuumskom kromatografijom na 60 g silika gela (40-45 µm meša, promjer kolone 3,5 cm) s 8%-tnim etil acetatom u heksanu kao sredstvom za ispiranje uzimanjem frakcija po 20 ml. Frakcije od 5 i 6 se sjedine i ispare, čime se dobije 208 mg bezbojne gume. Potonju se otopi u 4,0 ml THF-a, pomiješa se sa 4,0 ml 1,0 M otopine tetrabutil-amonijevog fluorida u THF-u i otopinu se miješa 17 sati u argonu. To se razrijedi s 5,0 ml vode, miješa se još 15 minuta i prelije se u mješavinu od 80 ml 80%-tnog etil acetata u heksanu i 50 ml vode. Organsku fazu se skupi i vodenu fazu se ponovno ekstrahira s 4 x 80 ml 80%-tnog etil acetata u heksanu. Sjedinjeni organski ekstrakti se isperu sa 4 x 80 ml 50%-tne otopine soli, osuše (Na2SO4) i ispare, čime se dobije 139 g polukrute tvari, koju se očisti vakuumskom kromatografijom na 60 g silika gela (40-45 µm meša, promjer kolone 3,5 cm) sa 6%-tnim 2-propanolom u etil acetatu kao sredstvom za ispiranje uzimanjem frakcija po 20 ml. Frakcije 17-25 se sjedine i ispare, čime se dobije 108 mg bezbojne pjene. To se dalje očisti pomoću HPLC (15-30 µm meša silika gel, 50 x 50 mm kolona; brzina protoka 70 ml/min) s 3%-tnim 2-propanolom u etil acetatu kao sredstvom za ispiranje. Eluat s RT od 35 minuta se skupi i otapala se ispare, čime se dobije bezbojnu polukrutu tvar. Nju se otopi u 15 ml bezvodnog metil formata, profiltrira kroz 0,45 µm filtar (Millex-HV), zgusne i drži se 4 sata u visokom vakuumu, čime se dobije 82 mg naslovnog spoja kao bezbojne amorfne krute tvari.

[α]25D +13,8º (EtOH, c = 0,5); UV (MeOH) 2,63 (ε = 17,545), 212 (ε = 14,702) nm; IR (CHCl3) 3608 cm-1;

1H NMR (CDCl3) δ 0,53 (3H, s); 1,21 (12H, s); 1,26-2,17 (32H, m); 2,30 (1H, dd, J=10,7 Hz); 2,59 (1H, d, J=11 Hz), 2,83 (1H, d, J=13 Hz); 5,00 (1H, s); 5,33 (1H, s); 6,02 (1H, d, J=11Hz); 6,37 (1H, d, J=11 Hz); HRMS (EI): izračunato za C32H54O2: m/z 502,4022; nađeno m/z: 502,4024.

Primjer 8

21-(3-hidrokdi-3-metilbutil)-1α-fluor-25-hidroksikole-kalciferol

K miješanoj i na -78ºC ohlađenoj otopini od 320 mg (0,67 mmolova) reagenta (S-trans-1-fluor-5-[[dimetil(1,1-dimetiletil)silil]oksi-2-metenil-3-[difenil-fosfinil)-etiliden]cikloheksana u 4,0 ml benzvodnog THF-a doda se 0,42 ml (0,67 mmola) 1,6 M otopine n-butil-litija u heksanu. Dobivenu tamno crvenu otopinu miješa se 7 minuta pri -78ºC, pomiješa se sa 118 mg (0,23 mmola) [1R-(1α,3aβ,4α,7aα)]oktahidro-7a-metil-1-[5-metil-1-[4-metil-4-[(trimetil silil) oksi]pentil]-5-[(trimetilsilil)oksi]-heksil]-4H-inden-4-ona u 2,0 ml bezvodnog THF-a i miješa se 4,5 sata pri -78ºC. Smjesu se pusti zagrijati na sobnu temperaturu, miješa se još 20 minuta, pogasi se s 5 ml 1:1 mješavine 1N Rochelleve otopine soli i 1N otopine KHCO3, miješa se još 15 minuta i prelije se u mješavinu od 50 ml etil acetata i 50 ml 1:1 1N Rochelleve otopine soli i 1N otopine KHCO3. Organsku fazu se odvoji i vodenu fazu se ponovno ekstrahira s 3 x 40 ml etil acetata. Sjedinjeni organski ekstrakti se isperu sa 100 ml 10%-tne otopine soli, osuše (Na2SO4) i ispare, čime se dobije 426 mg bezbojne gume, koju se očisti vakuumskom kromatografijom na 40 g silika gela (40-45 µm meša, promjer kolone 3,5 cm) s 5%-tnim etil acetatom u heksanu kao sredstvom za ispiranje uzimanjem frakcija po 15 ml. Frakcije od 5-7 se sjedine i ispare, čime se dobije 144 mg bezbojne gume. Potonju se otopi u 3,0 ml THF-a, pomiješa se s 2,0 ml 1,0 M otopine tetra-n-butilamonijevog fluorida u THF-u, i otopinu se miješa 17 sati u argonu. To se razrijedi s 5,0 ml vode, miješa se još 10 minuta i prelije se u mješavinu od 50 ml etil acetata i 40 ml vode. Organsku fazu se skupi i vodenu fazu se ponovno ekstrahira s 3 x 50 ml etil acetata. Sjedinjeni organski ekstrakti se isperu s 5 x 100 ml vode, osuše (Na2SO4) i ispare, čime se dobije 78 mg gume, koju se očisti vakuumskom kromatografijom na 40 g silika gela (40-45 µm meša, promjer kolone 3,5 cm) s 90%-tnim etil acetatom u heksanu kao sredstvom za ispiranje uzimanjem frakcija po 15 ml. Frakcije 14-20 se sjedine i ispare, čime se dobije 57 mg bezbojne polukrute tvari, koju se otopi u 20 ml bezvodnog metil formata i profiltrira kroz 0,4 µm filtar. Filtrat se zgusne na 1,0 ml, drži se 1,0 sat pri 0ºC i kristali se skupe filtracijom, čime se dobije 42 mg naslovnog spoja, talište 96-98ºC.

[α]25D +13,8º (MeOH, c = 0,5); UV (MeOH) 270 (ε = 14,136), 242 (ε = 14,350), 210 (ε = 13,564) nm; IR (CHCl3) 3610 cm-1;

1H NMR (CDCl3) δ 0,54 (3H, s); 1,21 (12H, s); 1,22-1,60 (21H, m); 1,69 (2H, m); 1,80 (1H, m); 2,0 (3H, m); 2,17 (1H, m); 2,31 (1H, m); 2,62 (1H, d, J=12 Hz), 2,82 (1H, d, J=12 Hz); 4,22 (1H, široki t); 5,07 (1H, široki t); 5,10 (1H, s); 5,19 (1H, široki t); 5,39 (1H, s); 6,02 (1H, d, J=11 Hz); 6,40 (1H, d, J=11 Hz);

MS (FAB) m/z 504,5 (M+, 60).

Primjer 9

21-(3-hidrokdi-3-metilbutil)-1,25-hidroksi-19-nor-kole-kalciferol

K otopini od 571 mg (1,0 mmola) reagenta [3R-(3α,5β,Z)-bis-[[(1,1-dimetiletil)dimetilsilil]oksi]-ciklo-heksiliden]etil]difenil-fosfin oksida, u 6,0 ml bezvodnog THF-a, ohlađenoj na -78ºC, doda se 0,65 ml (1,04 mmola) 1,6 M otopine n-butil-litija u heksanu. Dobivenu tamno crvenu otopinu drži se 10 minuta pri -78ºC, pomiješa se s 204,4 mg (0,4 mmola) [1R-(1α,3aβ,4α,7aα)]oktahidro-7a-metil-1-[5-metil-1-[4-metil-4-[(trimetilsilil)oksi]pentil]-5-[(trimetil silil) oksi]heksil]-4H-inden-4-ona u 2,5 ml bezvodnog THF-a i miješa se 3,0 sata pri -78ºC. Smjesu se pusti zagrijati na sobnu temperaturu, miješa se još 15 minuta, pogasi se s 15 ml 1:1 mješavine 1N Rochelleve otopine soli i 1N KHCO3. Miješa se još 10 minuta i zatim se prelije u mješavinu od 70 ml etil acetata i 40 ml 1:1 1N Rochelleve otopine soli i 1N otopine KHCO3. Organsku fazu se odvoji i vodenu fazu se ponovno ekstrahira s 3 x 70 ml etil acetata. Sjedinjeni organski ekstrakti se isperu sa 100 ml 10%-tne otopine soli, osuše (Na2SO4) i ispare, čime se dobije 760 mg bezbojne gume, koju se očisti vakuumskom kromatografijom na 60 g silika gela (40-45 µm meša, promjer kolone 3,5 cm) s 5%-tnim etil acetatom u heksanu kao sredstvom za ispiranje uzimanjem frakcija po 15 ml. Frakcije 5-10 se sjedine i ispare, čime se dobije 304 mg bezbojne gume. Potonju se otopi u 4,0 ml THF-a, pomiješa se s 5,0 ml 1,0 M otopine tetra-n-butilamonijevog fluorida u THF-u i otopinu se miješa 42 sati pri sobnoj temperaturi u argonu. To se razrijedi s 15,0 ml vode, miješa se još 15 minuta i prelije se u mješavinu od 75 ml etil acetata i 50 ml 10%-tne otopine soli. Organsku fazu se odvoji i vodenu fazu se ponovno ekstrahira s 3 x 70 ml etil acetata. Sjedinjeni organski ekstrakti se isperu sa 5 x 100 ml vode, osuše (Na2SO4) i ispare, čime se dobije 186 mg pokukrute tvari, koju se očisti vakuumskom kromatografijom na 50 g silika gela (40-45 µm meša, promjer kolone 3,5 cm) sa 7,5%-tnim 2-propanolom u etil acetatu kao sredstvom za ispiranje uzimanjem frakcija po 15 ml. Frakcije 11-29 se sjedine i ispare. Ostatak se otopi u 20 ml bezvodnog metil formata i profiltrira kroz 0,4 µm filtar. Isparavanjem filtrata dobije se 154 mg naslovnog spoja kao bezbojne krute tvari.

[α]25D +50,93º (MeOH, c = 0,32);

1H NMR (CDCl3) δ 0,54 (3H, s); 1,21 (12H, s); 1,2-2,0 (27H, m); 2,20 (2H, m); 2,48 (1H, d, J=12 Hz); 2,25 (2H, m); 2,82 (1H, s); 2,82 (1H, s); 4,06 (1H, široki s); 5,85 (1H, d, J=12 Hz); 6,30 (1H, d, J=12 Hz);

MS (FAB) m/z 490,4 (M+, 30).

Primjer 10

Učinak analoga vitamina D3 na sekundarni hiperparatiroidizam u modelu bubrežne insuficijencije u štakora

Djelovanje analoga vitamina D3 što se tiče supresije paratiroidnog hormona pokazano je na štakorima sa sekundarnim hiperparatiroidizmom zbog otkazivanja bubrega primjenom modela otkazivanja bubrega kod 7/8 nefrektomije inducirane u štakora (Kidney International, M. Fukugawa et al., 39;874-881 (1991).

Ispitni materijali:

spoj formule Ia

1,25(OH)2 vitamin D3 (kontrola)

vehikl - Miglyol 812

Ženke Sprague Dawley štakora su anestezirane, odstranjen im je desni bubreg i 2-3 grane lijeve renalne arterije su podvezane tako da je dobivena 7/8 nefrektomija. Stavljene su na visoku fosfornu dijetu (0,6% Ca i 0,8 fosfora). Otprilike 3-6 tjedana nakon operacije štakorima je uzeta krv da se vide razine PHT u serumu i za proučavanje su odabrani štakori s PHT razinama između 100-500 pg/ml.

Štakori su podijeljeni u pet skupina koje su liječene kako je prikazano u dolnjoj tablici.

[image]

Jednoj skupini krv je uzeta prije liječenja (T = 0) i svaka skupina primila je tijekom sedam dana oralnu dnevnu dozu spoja formule Ia (10,1 ili 0,1 µg/kg/dnevno), kontrolni vehikl ili 1,25(OH)25 vitamin D3 kao pozitivnu kontrolu. Spojevi su prethodno otopljeni u etanolu i razrijeđeni s vehiklom (Miglyol 812) i zatim je etanol isparen.

Nakon posljednjeg dana doziranja životinjama je ponovno uzeta krv (T=1) nakon čega su žrtvovane. Određivanje PHT u serumu izvršeno je s dijagnostičkim kompletom #40-2240 Instituta Nichols. Određivanje kalcija u serumu izvršeno je s dijagnostičkim kompletom #587 Sigma s o-krezoftaleinom. Ispitivanje kreatinina u serumu izvršeno je s dijagnostičkim kompletom #1600-320 Sigma s amonijevim molibdatom.

[image]

Rezultati pokazuju da je spoj formule I učinkovitiji od 1,25(OH)25 vitamin D3 u potiskivanju povišenih razina paratiroidnog hormona, pri čemu on ne uzrokuje povišene razine kalcija.

Primjer 11

Koštani anabolizam u štakora

Tri mjeseca starim štakorima odstranjeni su jajnici (Ovx) i jednom dnevno, počevši tri tjedna nakon ovariektomije, dat im na usta ili 1,25-dihidroksi vitamin D3 (vit. D u tablici) ili jedan od spojeva predloženog izuma. Davanje je nastavljeno do krajnjeg žrtvovanja 6 tjedana nakon ovariektomije. Kontrolne skupine, od kojih u jednoj nije izvršena ovariektomija, i jedna skupina Ovx, primile su samo vehikl. Uzorci krvi i urina skupljani su dva puta, 4 tjedna nakon ovariektomije i ponovno 6 tjedana kasnije i određena je količina kalcija u serumu i urinu. Krajnja količina kalcija u bedrenoj kosti određena je nakon žrtvovanja 6 tjedana nakon ovariektomije.

Koštana mineralna gustoća desnog femura određena je upotrebom High Resolution Software Package na QDR-1000 W Bone DenzitometruTM (Hologic, Waltham, MA). Životinje su ispitanje stavljanjem na blok za pretraživanje položene na leđa, tako da je desna noga bila okomita prema tijelu, a cjevanica je bila okomita prema bedrenoj kosti.

Pri srašćivanju kosti, spojevi predloženog izuma mnogo su učinkovitiji nego 1,25-dihidroksi vitamin D3 i u terapeutski učinkovitim dozama oni ne uzrokuju hiperkalciuriju, nefrotoksičnost ili hiperkalcemiju

Primjer 12

Autoimunost u EAE modelu na štakoru

Sposobnost analoga vitamina D3 u liječenju autoimunosnih bolesti pokazana je in vivo u modelu eksperimentalnog encefalomijelitisa (EAE).

Ženke štakora Lewis su imunizirane s 1:1 mješavinom homogenata spinalne žile zamorca i modificiranog Freundovog dodatka (4 mg/ml M. tuberculosis u nepotpunom Freundovom dodatku) injekcijom u jastučić šape. Spojevi ili vehikl dati su subkutano ili per os kroz 12 dana počevši petog dana nakon imunizacije. Životinje su promatrane s obzirom na pojavu simptoma EAE-gubitka jačine repa, slabljenja stražnjeg limba, teturajućeg hoda, paralize itd.

Spojevi formule I učinkoviti su u smanjenju simptoma EAE u modelu na štakoru.

Primjer 13

Pokus proliferacije stanica MCF-7 raka dojke

Stanice MCF-7 su stanice raka humane dojke koje su pozitivne na receptor estrogena. Moguće djelovanje analoga vitamina D3 protiv raka ispitano je inhibicijom stanica MCF-7 u kulturi.

MCF-7 stanice gustoće od 5000 stanica po zdjelici stavljene su ploče s 96 jamica i inkubirane pri 37ºC u 5% CO2/95% zraka u Dulbecco’s Modified Eagle Medium-u koji je sadržavao 10% telećeg fetalnog seruma, 700 nM inzulina, 2 mM glutamina, 0,1 mM MEM ne-esencijalnih amino kiselina i 1mM natrijevog piruvata. Pripravljena je zaliha otopine analoga vitamina D3 koncentracije 10 mM u apsolutnom etanolu i pohranjena u argonu pri -20ºC. Dan nakom premazivanja, MCF-7 stanice su nadopunjene s kontrolnim medijem ili s medijem koji je sadržavao različite koncentracije analoga vitamina D3. Nakon daljnjih 7 dana uzgajanja, ispitan je broj MCF-7 stanica u svakoj jamici pomoću smanjenja boje MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid), kako su opisali F. Denizot i R. Lang, J. Immunological Methods, Vol. 89:271-277(1986). MTT je dodat u svaku jamici do krajnje koncentracije od 1 mg/ml i stanice u inkubirane 3 sata, nakon čega se MTT ekstrahiran upotrebom 95%-tnog etanola i izmjerena je optička gustoća pri valnoj duljini od 570 nm.

Iz dijagrama koji se odnosi na optičku gustoću pri 570 nm za upotrijebljenu koncentraciju određena je vrijednost IC50 za svaki analog vitamina D3. Vrijednost IC50 definirana je kao koncentracija analoga vitamina D3 koja odgovara polovici od maksimalnog smanjenja apsorbancije pri 570 nm.

Analozi vitamina D3 IC50 nM

1,25-dihidroksi-kolekalciferol 40

21-(3-hidroksi-3-metil)butil-1,25-dihidroksi-kolekalciferol 0,8

Rezultati gornjeg ispitivanja pokazuju da je 21-(3-hidroksi-3-metil)butil-1,25-dihidroksikolekalciferol približno 50 puta jači od 1,25-dihidroksi-kolekalciferola u inhibiciji rasta stanica MCF-7 dojke u kulturi.

Primjer 14

Pokus proliferacije stanica ZR-75 raka dojke

ZR-75 stanice su stanice raka ljudske dojke koje su pozitivne na estrogen receptor. Moguće djelovanje analoga vitamina D3 protiv raka dojke ispitano je inhibicijom proliferacije stanica ZR-75 u kulturi.

Stanice ZR-75 premazane su koncentracijom od 12.500 stanica/jamici u ploče s 24 jamice i inkubirane pri 37ºC u 5% CO2/95% zraka u RPMI mediju koji je sadržavao 10% fetalnog telećeg seruma i 2 mM glutamina. Pripravljena je zaliha otopine analoga vitamna D3 koncentracije 10 mM u apsolutnom alkoholu i odložena pri -20ºC u argonu. Jedan dan nakon premazivanja stanice ZR-75 su ponovno nadopunjene s kontrolnim medijem ili s medijem koji je sadržavao različite koncentracije analoga vitamina D3. Nakon 10 dana daljnjeg uzgajanja ispitan je broj ZR-75 stanica pomoću smanjenja boje MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolijev bromid), kako su opisali F. Denizot i R. Lang, J. Immunological Methods, Vol. 89:271-277(1986). MTT je dodat u svaku jamicu do krajnje koncentracije od 1 mg/ml i stanice su inkubirane 3 sata, nakon čega se MTT ekstrahiran upotrebom 95%-tnog etanola i izmjerena je optička gustoća pri valnoj duljini od 570 nm.

Za svaki analog vitamina D3 određena je vrijednost IC50 iz dijagrama koji se odnosi na optičku gustoću pri 570 nm za upotrijebljenu koncentraciju. Vrijednost IC50 definirana je kao koncentracija analoga vitamina D3 koja odgovara polovici od maksimalnog smanjenja apsorbancije pri 570 nm.

Analozi vitamina D3 IC50 nM

1,25-dihidroksi-kolekalciferol 13

21-(3-hidroksi-3-metil)butil-1,25-dihidroksi-kolekalciferol 0,3

Rezultati gornjeg ispitivanja pokazuju da je 21-(3-hidroksi-3-metil)butil-1,25-dihidroksikolekalciferol približno 40 puta jači od 1,25-dihidroksi-kolekalciferola u inhibiciji rasta stanica MCF-7 dojke u kulturi.

Primjer 15

Kapsula od meke želatine za oralni oblik doziranja

Kapsula za oralno davanje formulirana je u argonu pod jantarnim svjetlom od 0,01 do 25,0 mg jednog od spoja predloženog izuma u 150 mg frakcioniranog kokosovog ulja, s 0,015 mg butiliranog hidroksitoluena (BHT) i 0,015 mg butiliranog hidroksianisola (BHA), punjenog u kapsulu od meke želatine.

Prethodni izum opisan je u nekim pojedinostima pomoću primjera zbog jasnoće i razumijevanja. Stručnjaku je očigledno da se mogu izvršiti izmjene i modifikacije u okviru smisla priloženih patentnih zahtjeva. Zbog toga se podrazumijeva da je gornji opis namijenjen ilustraciji, a ne ograničenju izuma. Svrhu izuma treba stoga odrediti s obzirom na slijedeće priložene patentne zahtjeve, samo s punim smislom ekvivalenata na koje se odnose patentni zahtjevi.

Patenti, patentne prijave i publikacije, citirane u ovoj patentnoj prijavi, ugrađene su ovdje kao literaturni izvori njihovom cjelokupnošću za sve namjene u istom opsegu kao da su pojedinačno navedeni svaki patent, patentna prijava ili publikacija.

Claims (20)

1. Spoj formule I [image] naznačen time, da X je H2 ili CH2; Y je vodik, hidroksi ili fluor; Z je hidroksi; R1 i R2 predstavljaju (C1-C4)alkil ili fluoralkil, ili R1 i R2 zajedno sa C25 tvore (C3-C6)cikloalkil ili ciklofluoralkil; R3 i R4 predstavljaju (C1-C4)alkil ili fluoralkil, ili R3 i R4 zajedno sa C25’ tvore (C3-C6)cikloalkil ili ciklofluoralkil; A je jednostruka veza ili dvostruka veza; B1 je jednostruka veza, E-dvostruka veza, Z-dvostruka veza ili trostruka veza; i B2 je jednostruka veza, E-dvostruka veza, Z-dvostruka veza ili trostruka veza.

2. Spoj prema zahtjevu 1, naznačen time, da A predstavlja jednostruku vezu.

3. Spoj prema zahtjevu 1, naznačen time, da Y predstavlja fluor.

4. Spoj prema zahtjevu 1, naznačen time, da Y predstavlja hidroksi.

5. Spoj prema zahtjevu 1, naznačen time, da B1 i B2 predstavljaju dvostruke veze.

6. Spoj prema zahtjevu 1, naznačen time, da B1 i B2 predstavljaju trostruke veze.

7. Spoj prema zahtjevu 1, naznačen time, da R1-R4 predstavljaju fluoralkil.

8. Predlijek, naznačen time, da sadrži spoj formule I kako je definiran u zahtjevu 1.

9. Lijek, naznačen time, da sadrži spoj prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 8 i terapeutski inertan nosač.

10. Spojevi prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 8, naznačeni time, da se upotrebljavaju kao terapeutski aktivne tvari za liječenje i prevenciju bolesti.

11. Spojevi prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 8, naznačeni time, da se upotrebljavaju kao terapeutski aktivne tvari za liječenje primarnog i sekundarnog hiperparatiroidizma, renalne osteodistrofije i autoimunosnih bolesti.

12. Spojevi prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 8, naznačeni time, da se upotrebljavaju kao terapeutski aktivne tvari za liječenje multiple skleroze ili lupusa.

13. Spojevi prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 8, naznačeni time, da se upotrebljavaju kao terapeutski aktivne tvari za liječenje neoplastičnih bolesti.

14. Spoj formule II [image] naznačen time, da R1 i R2 predstavljaju (C1-C4)alkil ili fluoralkil, ili R1 i R2 zajedno sa C25 tvore (C3-C6)cikloalkil ili ciklofluoralkil; R3 i R4 predstavljaju (C1-C4)alkil ili fluoralkil, ili R3 i R4 zajedno sa C25’ tvore (C3-C6)cikloalkil ili ciklofluoralkil; A je jednostruka veza ili dvostruka veza; B1 je jednostruka veza, E-dvostruka veza, Z-dvostruka veza ili trostruka veza; B2 je jednostruka veza, E-dvostruka veza, Z-dvostruka veza ili trostruka veza, i R5 je hidroksilna zaštitna skupina.

15. Metoda za pripravljanje spoja formule I definiranog u zahtjevu 1, naznačena time, da uključuje reakciju spoja formule II [image] u kojoj su R1, R2, R3, R4, A, B1 i B2 definirani kao u zahtjevu 14, a R5 je vodik ili hidroksi zaštitna skupina, sa spojem formule III, [image] u kojoj je X kao gore opisani, Y je vodik, fluor ili hidroksi zaštitna skupina, a Z je hidroksi zaštitna skupina, i zatim odstranjivanje hidroksi zaštitnih skupina.

16. Upotreba spojeva prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 8, naznačena time, da se oni koriste za pripravljanje lijeka za liječenje primarnog i sekundarnog hiperparatiroidizma, renalne osteodistrofije i autoimunosnih bolesti.

17. Upotreba spojeva prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 8, naznačena time, da se koriste za pripravljanje lijeka za liječenje multiple skleroze ili lupusa.

18. Upotreba spojeva prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 8, naznačena time, da se oni koriste za pripravljanje lijeka za prevenciju i liječenje neoplastičnih bolesti.

19. Spojevi prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 8, naznačeni time, da su proizvedeni u skladu s postupkom prema zahtjevu 14 ili njemu očigledno kemijski ekvivalentnim postupkom.

20. Novi spojevi, formulacije, postupci i metode, naznačeni time, da su uglavnom kao ovdje opisani.