HRP940440A2 - Hybride proteins - Google Patents

Description

Izum odnosi se na plazminogenske aktivatore, DNA, koji kodiraju takove hibridne plazminogenske aktivatore, hibridne vektore, koji sadrže takove DNA, domaćine, transformirane s takovim hibridnim vektorima, postupke za pripremanje takovih hibridnih plazminogenskih aktivatora DNA, hibridne vektore i domaćine, i na farmaceutske sastave, koji sadrže takove hibridne plazminogenske aktivatore.

Krvni ugrušci su glavni uzrok bolesti i smrtnosti ljudi u razvijenom svijetu. Krvni ugrušci su sastavni dio fibrina, koji se stvara iz svog topivog prethodnika fibrogena djelovanjem enzima trombina. Vrsta enzima i drugih tvari osigurava da se ugrušci normalno stvaraju samo ako su i kad su potrebni za sprječavanje gubitka krvi.

Plazma sisavaca sadrži enzimski sistem, fibrinolitićki sistem, koji može otapati krvne ugruške. Jedna komponenta fibrinolitičkog sistema je skupina enzima, nazvana plazminogeni, koji pretvaraju plazminogen (neaktivan proenzimski oblik plazmina) u proteolitički enzim plazmin. Zatim plazmin razgrađuje fibrinsko umreženje ugrušaka tako da nastaju topivi proizvodi. U slučajevima, gdje je trombolitička sposobnost nedovoljna za uklanjanje intravaskularnih trombova, npr. kod pacijenata koji boluju od tromboemboliznih ili postoperativnih komplikacija, može biti nužna upotreba vanjskih trombolitičkih sredstava.

Iz čovječjih tjelesnih tekućina ili stanica mogu se izolirati dvije vrste plazminogenskih aktivatora (u nastavku navedeni kao "PA"): urokinaza ili plazminogenski aktivator tipa urokinaze (u nastavku se navodi kao "u-PA"), serin proteaza, koja se nalazi npr. u čovječjem urinu i stanicama bubrega te plazminogenski aktivator tkivne vrste (u nastavku se navodi kao "t-PA"), kojeg proizvode endotelne stanice i nalazi se u mnogim endokrinim tkivima.

Oba, t-Pa i n-PA, postoje u dva molekularna oblika: u obliku jednostrukog lanca (obično se označava kao "sc-t-PA" odnosno "sc-u-PA") i u obliku dvaju (tc) lanaca. Jednostruki lanac ili oblik proenzima pretvara se u oblik dvaju lanaca djelovanjem proteolitičkih enzima na točno određenim položajima u polipeptidnom lancu. Nastala dva lanca obrađenog PA proteina ostaju pričvršćeni jedan na drugom preko S-S mosta. Krajnji karboksi dio ili B-lanac posreduju enzimatsku aktivnost Pa-a, dok krajnja amino skupina A-lanca sadrži regulacijske jedinice, kao što su mjesta za vezanje fibrina. Specifično vezanje neaktivnog sc-PA na sastojke krvnog ugruška, kao što je fibrin, nakon čega slijedi pretvorba u aktivni tc-PA uz katalitičku količinu proteolitičkih enzirna prisutnih na tom mjestu, daje na kraju položajno specifičan učinkovit lijek. t-Pa i u-PA, koji su kodirani s dva različita gena, mogu se razlikovati imunološki i enzimski te imaju različit profil odgovora na inhibitore, stirnulatore i aktivatore. Tako je samo t-PA jako inhibiran s proteaznim inhibitorom iz Erytrina latissima (DE-3). Aktivnost t-PA jako stimuliraju fibrin i fibrinski fragmenti, dok je aktivnost u-PA neosjetljiva na stimulaciju s fibrinom i njegovim fragmentima. Posljednje svojstvo, za razlikovanje dvaju PA enzima, je to da tc-t-PA ima visok afinitet za fibrin i fibrinske fragmente, dok tc-u-PA nema značajnog fibrinskog afiniteta.

S obzirom na nedovoljnu serumsku postojanost injiciranih t-PA, niski afinitet tc-t-PA za fibrin, i što znači da je fibrinski afinitet sc-u-PA inidirektan, tj. on zahtjeva dodatan krvni. faktor (cf . D. J. Binnema et al., 8th Int. Congress of Fibrinolysis, Vienna, 1986), postoji stalna potreba za poboljšanim plazminogenskim aktivatorima visokog afiniteta prema fibrinu, boljim odgovorom na stimulatore, manje inaktivacije s inhibitorima i duljim raspoloživim vremenom poluraspada u krvnom toku.

Stoga, predmet predloženog izuma je stvaranje novih hibridnih plazminogenskih aktivatora, koji će zadržati korisna svojstva t-PA, dok će izgubiti neželjena svojstva prvotnih enzima.

Iznenađujuće smo utvrdili da pri liječenju tromboza i drugih stanja gdje je poželjno prouzročiti fibrinolizu preko plazmogenske aktivacije, jednolančani hibridni PA proteini pokazuju bolja biološka svojstva u usporedbi s jednolančanim t-PA i u-PA. Još specifičnije, u usporedbi s nativnim PA za liziranje krvnih ugrušaka in vivo potrebne su manje količine novih PA molekula u smislu predloženog izuma. Hibridne jednolančane PA molekule u smislu izuma mogu se proizvesti u velikim količinama rekobinantnom DNA tehnologijom, i nakon inficiranja, one će se u pacijentu pretvoriti u dvolančani oblik pod utjecajem fibrina na mjestu liziranja krvnog ugruška. Dvolančane hibridne PA molekule opisane su u literaturi (Europska patentna prijava br. 155,387; K.C. Robbins, 8th International Congress of Fibrinolysis, Beč, 1986), međutim ugodniji jednolančani oblici hibridnih PA molekula ne mogu se proizvesti na razini proteina, kako je navedeno u citiranoj literaturi, ali se oni mogu proizvesti u većim količinama i u industrijskom opsegu rekombinantnom DNA tehnologijom.

Daljnji predmet predloženog izuma je dakle stvaranje sredstava i metoda za proizvodnju navedenih jednolančanih u-PA/t-PA hibridnih proteina. Takova sredstva uključuju DNA, koja se kodiraju spomenute u-PA/t-PA hibridne proteine, hibridne vektore, koji sadrže navedene DNA, i domaćine, transformirane s navedenim hibridnim vektorima. Ostvarene su također metode za dobivanje spomenutih jednolančanih u-PA/t-PA hibridnih proteina, spomenutih DNA, spomenutih hibridnih vektora i spomenutih domaćina.

Predloženi izum također daje bolji postupak dobivanja dvolančanih hibridnih PA molekula, jer se mogu cijepiti jednolančani proizvodi rekombinantne DNA in vitro s prikladnim proteolitičkirn enzimima, kao što je plazmin.

Podroban opis izuma

Izum se odnosi posebice na jednolančani hibridni PA, koji ima niz amino kiselina sastavljen od najmanje dvije podjedinice, koji istovrsnošću amino kiselina i brojem podjedinica odgovara humanom t-PA i humanom u-PA. Slično kao druge serinske proteaze, uključene u fibrinolitićkim i koagulacijskim sistemima krvi, u-PA i t-PA imaju velike, nekatalitičke segmente, sabrane u lancu A, koji je pričvršćen na katalitičku regiju (lanac B). Nekatalitićki A-lanac može se najprije podijeliti u diskretne domene: domenu "finger", domenu "faktor rasta" i dvije strukture "kringle", dok je A lanac u-PA sastavljen od domene "faktora rasta" i jedne "kringle" strukture /za referencu pogledaj L. Patthy, Cell 41, 657-663 (1985)/. Katalitićko mjesto B-lanaca sastavljeno je od His, Asp i Ser ostataka na položajima 322, 371 i 478 (t-PA) odnosno 204, 255 i 356 (u-PA) i bitno je za fibriolitičku aktivnost.

Proteinska domena je strukturna i/ili funkcionalna jedinica u cjelokupnoj strukturi čitavog proteina. Npr. u t-PA lanca A nalaze se četiri domene ("finger", faktor rasta i dvije domene "kringle") raspoređene u nizu. Granice domena su najbolje definirane položajima ekson-intron veza u odgovarajućem DNA nizu (L. Patthy, gore). Ipak je iz svrhovitih razloga bila definirana minimalna veličina svake domene u slijedu amino kiselina između prvog i posljednjeg cisteinskog ostatka unutar svake domene, koje se vjerojatno uključuju u tvorbu S-S mosta. Amino kiseline ispred i iza tih domena, susjednih cisteinskim ostacima, definirane su kao vezni nizovi (J.). Položaji veza eksonitron (vidi gore) su u tim regijama.

Tako se može predstaviti jednolančani t-PA slijedeće formule : T - F - Jl - G - J2 - Kl - J3 - K2 - J4 - TPAB, gdje T predstavlja N-krajnji dio koji obuhvaća amino kiseline 1 do 5, F je domena "finger", koja obuhvaća kiseline 6 do 43, G je domena faktora rasta, koja obuhvaća amino kiseline 51 do 84, K1 je "kringle" 1 struktura koja obuhvaća amino kiseline 92 do 173, K2 je "kringle" 2 struktura, koja obuhvaća amino kiseline 180 do 261, TPAB je područje katalitićke serin proteaze, koje obuhvaća amino kiseline 307 do 527 i J1 (amino kiseline 44 do 50), J2 (amino kiseline 85 do 91), J3 (amino kiseline 174 do 179) i J4 (amino kiseline 262 do 306) su vezni nizovi koji povezuju segmente domena.

Jednolančani U-PA može se prikazati slijedećom formulom:

T‘ - U - J5 - K - J6 - UPAB

gdje T’ predstavlja N-krajnji dio koji obuhvaća amino kiseline 1 do 12, U je domena faktora rasta koja obuhvaća amino kiseline 13 do 42, K je struktura "kringle" koja obuhvaća amino kiseline 50 do 131, UPAB je područje katalitičke serin proteaze, koje obuhvaća amino kiseline 189 do 411, a J5 (amino kiseline 43 do 49) i J6 (amino kiseline 132 do 188) su vezni nizovi koji povezuju segmente domena.

Svaki od veznih nizova J4 i J6 sadrži aktivacijsko mjesto (mjesto kemijske pretvorbe) i još N-krajnji cisteinski ostatak, koji je uključen u S-S most u katalitičkom (B-lanac) području.

Iznenađujuće smo utvrdili da jednolančani hibridni PA-i, koji sadrže katalitičko područje serin proteaze jednog od PA (TPAB ili UPAB), pričvršćeno na niz amino kiselina, koji sadrži sve ili diskretne domene A-lanaca drugih PA, ili diskretne domene obaju PA, pokazuju korisna farmakološka svojstva.

Izum se dakle odnosi na jednolančani hibridni PA koji obuhvaća .slijed amino kiselina koji sadrži sve ili diskretne domene A-lanca humanog u-PA ili diskretne domene A-lanca humanog u-PA i humanog t-PA, vezane uzastopno na katalitičko područje humanog t-PA (TPAB) i na jednolančani hibridni PA, koji obuhvaća slijed amino kiselina, koji sadrži sve ili diskretne domene humanog t-PA ili diskretne domene A-lanca humanog t-PA i u-PA, vezane uzastopce na katalitičko područje humanog u-PA (UPAB). U izvedbi s prednošću hibridni PA u smislu izuma sadrže katalitičko područje humanog u-PA (UPAB).

Izum se osobito odnosi na jednolančane PA, koji sadrže slijed amino kiselina, odabran iz skupine koja se sastoji od niza amino kiselina, koji sadrži sve domene A-lanca humanog t-PA, niza amino kiselina. koji sadrži diskretne domene A-lanca humanog t-PA, kao što su domene "finger" ili "kringle", osobito domena "kringle 2" humanog t-PA i niza amino kiselina koji sadrži dvije, tri ili četiri domene A-lanca humanog t-PA i/ili humanog u-PA, osobito dvije ili tri domene humanog t-PA, ili dvije, ili tri domene humanog u-PA i humanog t-PA, kao što su domene "finger", faktor rasta i " kringle 2" humanog t-PA, domene " finger" i "kringle 2" humanog t-PA ili domena faktora rasta u-PA i "kringle 2" t-PA, čiji slijed amino kiselina je vezan uzastopce na katalitičko područje humanog u-PA i na jednolančani PA, koji obuhvaća slijed amino kiselina koji sadrži faktor rasta u-PA i "kringle" t-PA, čiji niz amino kiselina je vezan uzastopce na katalitičko područje humanog t-PA.

Prednost imaju rečeni sljedovi amino kiselina hibridnog PA s N-krajnjim nizom t-PA (T, amino kiseline 1 do S) ili u-PA (T’, amino kiseline 1 do 12) ili se započne s bilo kojim veznim nizom koji je naravno N-krajnje vezan na prvu domenu hibridnog PA, ili s fragmentom takovog veznog niza, čiji fragment ima ponajprije najmanje pet amino kiselinskih ostataka.

U hibridnim PA u smislu izuma domene su na A-lancu povezane preko nativnih veznih nizova (npr. J1, J2, J3 i J5), fuzioniranih veznih nizova, ili hibridnih veznih nizova ili njihovih fragmenata.

Domene A-lanca hibridnih PA u smislu izuma povezane su s B-lancem serin proteaznog područja (TPAB ili UPAB) s veznim nizom odabranim iz skupine koja se sastoji od veznog niza Ja, koji povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, veznog slijeda J6, koji povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA i hibridnog niza sastavljenog od podjedinica navedenih veznih nizova, pri čemu navedeni vezni niz uključuje aktivacijsko mjesto koje može rascijepiti plazmin i još N-krajnji cisteinski ostatak, koji može sudjelovati u mostu sumpor-sumpor do katalitičkog područja B-lanca, gdje vezni niz ima ponajprije najmanje četrdeset i čak do 60 amino kiselinskih ostataka.

Od najveće prednosti je povezivanje domena na položaju koji je definiran vezama ekson-intron na odgovarajuću DNA. Veza A-lanca s B-lancem je prije svega od prednosti na aktivacijskorn mjestu.

Tako je prva domena vezana na drugu domenu s veznim nizom, koji se naravno pojavljuje u C-krajnjem dijelu prve domene, s veznim nizom, koji se naravno pojavljuje u N-krajnjem dijelu prve domene, s veznim slijedom, koji se naravno pojavljuje na N-krajnjem dijelu druge domene, s fuzioniranim veznim nizom, koji je sastavljen od navedenih veznih nizova ili od njihovih fragmenata.

Izum se osobito odnosi na jednolančani hibridni plazminogeskni aktivator, odabran iz skupine koja se sastoji od takovog hibridnog plazminogenskog aktivatora koji obuhvaća A-lanac u-PA, ili A-lanac sastavljen na karakterističan način od domena faktora rasta u-PA i "kringle 2" t-PA, vezanih uzastopce na katalitičko područje (B-lanac) t-PA, te na hibridni plazminogenski aktivator, koji obuhvaća A-lanac t-PA, A-lanac sastavljen na karakterističan način od domene "finger" t-PA, A-lanac sastavljen na karakterističan način od domena faktora rasta u-PA i "kringle 2" t-PA, A-lanac, sastavljen na karakterističan način od domene "finger" t-PA i "kringle 2" ili A-lanac, sastavljen na karakterističan način od domena "finger" t-PA, faktora rasta i "kringle 2" navedenog A-lanca, koji je vezan uzastopce na katalitičko područje (B-lanac) u-PA, pri čemu je A-lanac vezan na B-lanac preko veznog niza koji sadrži aktivacijsko mjesto i cisteinski ostatak koji se sposoban stvoriti S-S vezu do B-lanca.

Izum se osobito odnosi također na jednolančani hibridni plazminogenski aktivator, koji obuhvaća A-lanac sastavljen na karakterističan način od domene "kringle 2" t-PA, vezane na katalitičko područje (B-lanac) u-PA na aktivacijskom mjestu.

Od posebne prednosti je jednolančani hibridni plazminogenski aktivator odabran iz skupine, koja se sastoji od takovog hibridnog plazminogenskog aktivatora, koji obuhvaća A-lanac, sastavljen na karakterističan način od domene faktora rasta u-PA i domene "kringle 2" t-PA, vezane uzastopce na katalitičko područje (B-lanac) t-PA i na hibridni plazminogenski aktivator, koji obuhvaća A-lanac, sastavljen na karakterističan način od domene " kringle 2" t-PA ili domene " finger" i " kringle 2" t-PA, vezane uzastopce na katalitičko područje (B-lanac) u-PA, pri čemu je povezivanje između domene (domena) A-lanca i B-lanca na aktivacijskorn mjestu.

Hibridni PA-i u smislu izuma, kojima se daje prednost, jesu:

UPAATPAB(BC) = [uPA(1-158)-tPA(276-527)],

UPAATPAB(BR) = [uPA(1-131)-tPA(263-527)],

UPAATPAB(BC) = [tPA(1-275)-uPA(159-411)],

UPAATPAB(BR) = [tPA(1-262)-uPA(132-411)],

UK2UPAB(BR) = [uPA(1-44)-tPA(176-261)-uPA(134-411)],

FUPAB(BC) = [uPA(1-49)-tPA(262-275)-uPA(159-411)],

FUPAB(BR) = [tPA(1-49)-uPA(134-411)],

FK2UPAB(BC) = [tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411)],

FK2UPAB(BR) = [tPA(1-49)-tPA(176-262)-uPA(132-411)],

UK2TPA(BC) = [tPA(1-44)-tPA(176-527)],

K2UPAB(BC) = [tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411)],

FGK2UPAB(BC) = [tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411)], i

FGK2UPAB(BR) = [tPA(1-86)-tPA(176-262)-uPA(132-411)],

kod kojih UPAA je A-lanac u-PA, TPAA je u A-lancu t-PA, UPAB je B-lanac u u-PA, TPAB je B-lanac t-PA, U se odnosi na domenu faktora rasta u-PA, K2 se odnosi na domenu "kringle 2" t-PA, F se odnosi na domenu "finger" t-PA, G se odnosi na domenu faktora rasta t-PA, (BC) označava da je veza između domena A-lanca i B-lanca na aktivacijskom mjestu, a (BR) označava da je (jesu) domena (domene) A-lanca vezane na B-lanac preko veznog niza, prirodno pričvršćenog na B-lanac, koji uključuje aktivacijsko mjesto, i nadalje, N-krajnji, cisteinski ostatak, koji je uključen u S-S most do B-lanca. Brojevi se odnose na nizove amino kiselina uzetih iz u-PA, odnosno t-PA. Npr. UK2UPAB(BR) - /uPA(1-44)-tPA(176-261)-uPA(134-411/ označava jednolančani hibridni plazminogenski aktivator, koji se sastoji od amino kiselina 1-44 (domena faktora rasta; U), u-PA i amino kiselina 176261 (domena "kringle 2", K2) t-PA, vezanih na linearan način na amino kiseline 134-411 (B-lanac, UPAB) u-PA.

Od osobite prednosti su hibridni plazminogenski aktivatori TPAAUPAB(BC), FUPAB(BC), FGK2UPAB(BC) i osobito UK2TPAB(BC) , FK2UPAB(BC) i K2UPAB(BC).

Izum se nadalje odnosi na mutante hibridnih PA-a, u smislu izuma, kod kojih je (jesu) najmanje jedno, a ponajprije sva, N-glikozilacijsko mjesto modificirano tako, da se glikozilacija ne može odvijati na tom (tim) mjestu (mjestima). Dobro je poznato da je prvi uvjet za N-vezanu glikozilaciju, u stanicama sisavaca, prisutnost tri-peptidnog slijeda -Asn-L-Ser-(ili Thr)-, pri čemu je Asn akceptor, a L može biti bilo koja genetički kodirana amino kiselina, osim prolina ili asparaginske kiseline, koja sprečava glikolizaciju. U t-PA molekuli ta tri mjesta za N-glikozidno povezivanje (brojevi se odnose na položaj Asn u slijedu amino kiselina t-PA, usporedi sliku 1, priloženih crteža): -Asn117-Ser-Ser- (prisutno u " kringle 1") , Asn184-Gly-Ser (prisutno u "kringle" 2) i Asn448-Arg-Thr (prisutno u t-PA B-lanca). Jedino N-vezno mjesto glikozilacije u-PA je u B-lancu (Asn302-Ser-Thr, usporedi sliku 3) . Jasno je da hibridni PA, koji obuhvaća t-PA " kringle" 1, t-PA " kringle" 2, B-lanca t-PA i/ili B-lanac u-PA, također uključuju pojedinačna N-vezna mjesta glikozilacije.

Stoga, da spriječimo glikozilaciju na pojedinačnim (jednom ili više) mjestima glikozilacije, moraju se promijeniti nizovi u tripeptidima, poznati kao signali za N-glikozilaciju. Zamjena Asn i/ili Ser (ili Thr) ostataka u gornjim tripeptidnim nizovima u bilo koju drugu amino kiselinu, spriječila bi tvorbu glikozidnih veza na tim mjestima. Zbog prikladnosti modifikacija N-glikozilacijskih mjesta nije izvršena na proteinskoj razini. Umjesto toga korisno je modificirati gen koji kodira hibridni PA na takav način da se nakon ekspresije spomenutog modificiranog gena u domaćinu proizvede mutant hibridnog PA, u kojem je jedno ili više mjesta N-glikozilacije promijenjeno na takav način, da se na tim mjestima ne može odvijati glikozilacija. Od prednosti je modificirati sva mjesta Nglikozilacije koja se pojavljuju u hibridnim PA u smislu izuma.

Prije svega asparagin je zamijenjen s valinom, leucinom, izoleucinom, alaninom ili osobito glutaminom, a serin ili treonin s valinom, metioninom ili osobito alaninom.

Prije svega prednost se daje modificiranim hibridnima

PA:

FUPAB(G1n302)(BC) = [tPA(1-49)-tPA(262-275)-uPA(159-301, Gln, 303-411)],

FK2(A1a186)UPAB(G1n302)(BC) = [tPA(1-49)-tPA(176-185, Ala, 187-275)- uPA(159-301, Gln, 303-411)],

UK2(Ala186)TPAB(Ala450)(BC) = [uPA(1-44)-tPA(176-185, Ala, 187-449, Ala, 451-527)],

K2(Ala186)UPAB(G1n302)(BC) = [tPA(1-3)-tPA(176-185, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gln, 303-411)],

FGK2(Ala186)UPAB(Gln302)(BC) = [tPA(1-86)-tPA(176-185, Ala, 187-275)-uPA(I59-301, Gln, 303-411)],

i nadalje

FK2UPAB(Gln302)(BC) = [tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-301, Gln, 303-411)],

K2UPAB(G1n302)(BC) = [tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-301, Gln, 303-411)],

UK2TPAB(Ala450)(BC) = [uPA(1-44)-tPA(176-449, Ala, 451-527)], i

FGK2UPAB(Gln302)(BC) = [tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-301, Gln, 303-411)].

Hibridni PA i njegovi mutanti u smislu izuma mogu se pripremiti rekombinantnom DNA tehnikom, koja obuhvaća npr. uzgoj transformiranog domaćina, koji pokazuje hibridni PA protein ili njegov mutant, pod uvjetima koji dozvoljavaju njihovu ekspresiju i izolaciju hibridnog PA proteina, odnosno mutante hibridnog PA proteina. Određenije, željeni spojevi proizvode se:

a) dobivanjem DNA koja kodira hibridni PA protein i njegov mutant, ili kemijskom sintezom takove DNA,

b) uključenje DNA u prikladan ekspresijski vektor,

c) prenašanje dobivenog hibridnog vektora u prihvatnog domaćina,

d) selektiranje transformiranog domaćina od netransformiranih domaćina, npr. uzgojem pod uvjetima pod kojima preživi samo transformirani domaćin,

e) uzgoj transformiranog domaćina pod uvjetima koji omogućuju ekspresiju hibridnog PA proteina i

f) izolacija hibridnog PA proteina ili njegovog mutanta.

Stupnjevi koji su uključeni u pripremanje hibridnih PA proteina po rekombinantnoj tehnici bit će podrobno opisani u nastavku.

DNA koja kodira hibridne PA proteine

Izum se odnosi na DNA koja ima slijed koji kodira hibridni PA, koji je sastavljen od najmanje dvaju podjedinica koje identitetom i brojem amino kiselina odgovaraju podjedinicama humanog u-PA i humanog t-PA, ili koji kodira njegov mutant. Izum se osobito odnosi na DNA koja ima slijed koji kodira svaki od hibridnih PA proteina i njegove mutante već spomenute kao one s prednošću.

Prednost imaju DNA u smislu izuma prileženog niza na svojim krajevima. Osobito ti priležni nizovi uključuju prikladna restrikcijska mjesta koja omogućuju integriranje DNA u prikladne vektore.

Nadalje DNA u smislu izuma uključuje signalni slijed za u-PA ili t-PA, pričvršćen na prvi kodon slijeda, koji kodira zreli hibridni PA. Ako se izražavaju u stanicama kvasca, DNA u smislu izuma može sadržavati alternativni signalni slijed kvasca kao signalni slijed prirodno povezan s upotrijebljenim promotorom kvasaca, osobito PHO5 ili invertazni signalni slijed.

Od prednosti su sljedovi nukleotida u podjedinicama DNA identični sa sljedovima nukleotida u cDNA u-PA, odnosno cDNA t-PA. Ipak zbog degeneracije genetičkog koda sljedovi nukleotida se mogu razlikovati ako dobiveni slijed amino kiselina ostane nepromijenjen. U DNA, koje kodiraju mutant hibridnog PA, najmanje jedan kodonm koji kodira amino kiselinu bitnu za N-glikozilaciju u hibridnom PA proteinu, nadomješten je s drugim kodonom, koji kodira drugu amino kiselinu koja sprečava prepoznavanje mjesta za N-glikozilaciju.

Slijedovi nukleotida za u-PA cDNA i t-PA cDNA su poznati (cf. W.E. Holmes et al., Biotechnology 3, 923-929 (1985); D. Pennica et al., Nature 301, 214-221 (1983)/. Nadalje, bili su utvrđeni svi slijedovi nukleotida u genomu za gene u-PA i t-PA, uključiv u smjesi introna i eksona (cf. A. Ricco et al., Nucl. Acids Res. 13, 2759-2771 (1985); S.J. Friezner-Degen et al., J. Biol. Chem. 261, 6972-6985 (1986) /.

Kod poznavanja slijeda cDNA i genomske DNA za u-PA i t-PA možemo izraditi DNA u smislu izuma po metodama poznatim u struci. Metode za izradu tih DNA uključuju kemijsku sintezu DNA ili pripremanje fragmenata, koji kodiraju podjedinice polinukleotida za u-PA i t-PA cDNA i njihovo ponovno povezivanje u prethodno utvrđen niz po izboru, koji uključuje jedan ili više, kao dva ili tri stupnja mutacije.

DNA koje kodiraju mutante hibridnih PA, u smislu izuma, mogu se izraditi po metodama poznatim u struci. Metode za izradu tih DNA uključuju izrezivanje dijela DNA, koji sadrži kodon za neželjeni amino kiselinski ostatak, iz gena za parentalni hibridni PA i njegovu zamjenu s DNA segrnentom, u čemu je spomenuti kodon bio nadomješten s dezoksiribonukleotidnim tripletom, koji kodira željeni amino kiselinski ostatak ili upravljanje dezoksiribo-nukleotidne zamjene mutagenezom usmjerenom na mjesto.

Kemijska sinteza DNA dobro je poznata u struci i koristi uobičajene tehnike. Prikladne tehnike sabrao je S.A. Narang /Tetrahedron 39, 3 (1983)/. Osobite metode, opisane u Europskoj patentnoj prijavi br. 146,785 mogu se koristiti i uključene su kao reference.

Drugi pristup sintezi DNA u smislu izuma sastoji se od izrezivanja prikladnih restrikcijskih fragmenata, koji kodiraju polinukleotidne sljedove za u-PA i t-PA, iz u-PA cDNA i t-PA c-DNA (ili genomske u-PA DNA ili t-PA DNA) i upotrebe tih fragmenata za pripravu strukturnog gena za cjelokupan hibridni PA. U obje strategije mora se paziti da dođe do fuzije fragmenata na mjestima između domena, zato da se posljednje očuvaju neoštećene. Prva strategija koristi prikladna restrikcijska mjesta. Ako je prikladno restrikcijsko mjesto raspoloživo na prethodno određenom veznom mjestu (mjestima) u obje u-PA i t-PA DNA, DNA se probavi s odgovarajućom restrikcijskom endonukleazom i fragmenti se povežu s tupim ili otvorenim krajevima (bez nasuprotnih baza) (ovisno 0 odabranoj restrikcijskoj endonukleazi). Druga mogućnost je da se uporabna restrikcijska mjesta uvedu npr. na mjesto usmjerenom mutagenozem /cf. M.J. Zoller et al., Methods Enzymol 100, 468 (1983)/, i pazi se, da mutirana DNA ne rezultira promijenjenim slijedom amino kiselina. Od posebne prednosti su ona prirodna ili umjetno uvedena restrikcijska mjesta, koja odvajaju DNA, koje kodiraju A- ili B-lance ili DNA koje kodiraju diskretne domene, koje sadrže A-lanci: Na taj način mogu se proizvesti hibridne DNA, koje kodiraju hibridne PA, koje imaju željenu povezanost između domena A-lanca i katalitičkog serinproteaznog poručja.

Druga strategija polazi od hipoteze, da su granice domena najbolje definirane s položajem ekson-intron povezivanja u DNA-genomima /cf. L. Patthy, Cell 41, 657-663 (1985)/, tj. položaja cDNA, gdje su se povezali introni. Budući da se ti položaji rijetko podudaraju s restrikcijskim mjestima, prihvaćena je shema koju se može slijediti za svaku novu konstrukciju; u prvom stupnju pripreme se restrikcijski fragmenti koji kodiraju specifičnu domenu (e), te također sadrže dodatne DNA nizove, osim očekivane točke fuzije (do više od 100 baznih parova), povežu se i subkloniraju u bakteriofagu m13. U drugom stupnju se prekomjerni nizovi rasformiraju mutagenezom in vitro (Zoller et al., gore). Taj postupak omogućuje fuziju u točno određenom okviru na svaki prethodno određeni položaj nukleotida i stoga ima prednost.

Za pripravu mutanata hibridnih PA može se izrezati dio zrele hibridne DNA upotrebom restrikcijskih enzima. Prvi uvjet te metode je mogućnost da se promijenimo prikladna restrikcijska mjesta u blizini kododna. Mali restrikcijski fragment, koji sadrži kodon za neželjenu amino kiselinu, uklonimo se cijepanjem s endonukleazom. Pripremi se odgovarajući niz dvojno vlaknaste DNA, npr. kemijskom sintezom, u kojoj se upotrebljavaju tripleti koji kodiraju željenu amino kiselinu. DNA fragment poveže se u prikladnoj orijentaciji na ostatak velikog fragmenta, da se dobije slijed dvojne vlaknaste DNA, koji kodira mutant hibrida. Zbog udobnosti i zbog lakšeg rada s hibridnim genom, prikladno je da se nalazi u većem DNA segmentu, što se ostvaruje s prikladnim linkerima, koji dozvoljavaju uključenje i kloniranje segmenta u vektoru za kloniranje.

U izvedbi predloženog izuma, kojoj se daje prednost, vršimo pripravu DNA, koja kodira mutantn hibridnog PA mutagenezom usmjerenom na mjesto. Ta metoda je mutanogeneza in vitro, kojom se može promijeniti određeno mjesto unutar regije klonirane DNA /usporedi slijedeće članke: M.J. Zoller, M. Smith, Methods Enzymol. 100, 468 (1983); D. Botstein, D. Shortle, Science 229, 1193 (1985)/. Mutagenezu se može provesti ili na cjelokupnom genu hibridnog PA ili na njegovom funkcionalnom dijelu, koji sadrži kodon za neželjenu amino kiselinu (e). Nakon mutageneze poveže se mutirani funkcionalni dio s drugim dijelom hibridnog PA, da dobijemo mutant hibridnog PA.

Metoda mutiranja hibridnog PA gena ili njegovog funkcionalnog dijela karakteristična je po tome, da se jednovlaknasti gen ili jednovlaknasta DNA koja sadrži PA gen ili njegov dio, hibridizira s oligogezoksiribo-nukleotidnim primjerom, koji je komplementaran regiji hibridnog gena, koji će se mutirati, osim kod loše sparenih (sparivanja), koji usmjeravaju mutaciju; hibridiziran oligodezoksiribonukleotid upotrebljavamo kao primjer, da započne sintezu komplementarnog DNA vlakna, nastala (djelomično) dvovlaknasta DNA se transformira u prihvatnu vrstu mikroorganizma, i njega se uzgaja, a selektiraju se transformanti koji sadrže DNA s modificiranim (mutiranim) genom za hibridni PA.

Hibridni vektori koji sadrže DNA hibridnog PA

Izum se odnosi na hibridne vektore, koji sadrže DNA koja kodira hibridni PA, koji je sastavljen od najmanje dvije podjedinice, koje identitetom i brojem amino kiselina odgovaraju podjedinicama humanog u-PA i humanog t-PA, ili kodiraju njegov mutant, i na postupke za njihovu pripravu.

Vektor se bira ovisno o stanicama domaćina, planiranim za transformaciju. Načelno, prikladni su svi vektori koji se podvajaju i izražavaju željeni polipeptidni gen, u smislu izuma, u odabranom domaćinu. Primjeri odgovarajućih domaćina su eukarioti, koji su bez ili s malo restrikcijskih enzima ili modificirani enzimi kao kvašćeve gljivice, npr. Saccharomyces cerevisiae, npr. S. cervisiae GRF18 i nadalje stanice sisavaca, osobito spomenute humane ili životinjske stanične linije, npr. mijeloma stanice, humani embrionalni plućni fibroplasti L-132, COS stanice, LTK stanice, humane stanice melanoma Bowes poput raka, HeLa stanice, bubrežne stanice afričke zelene majmunice COS-7 transformirane s virusom SV-40 ili stanice ovarija kineskog hrčka (CHO) i njihove varijante. Kao domaćinski mikroorganizmi prednost imaju gornje stanice sisavaca i vrste Saccharomyces cerevisiae, npr. S. cerevisiae GRF18.

a. Vektori za upotrebu u kvascu

Vektori, koji su prikladni za podvajanje i ekspresiju u kvascu, sadrže podvojni začetak kvasca i selektivni genetički marker za kvasac. Hibridni vektori, koji sadrže podvojni začetak kvasca, npr. kromosomski segment (lokus) koji se neovisno podvaja, ostaju unutar kromosoma u stanici kvasca nakon transformacije i neovisno se podvajaju. Mogu se nadalje upotrijebiti hibridni vektori, koji sadrže slijedove homologne 2µ plazmidnoj DNA kvasca. Takovi hibridni vektori integrirat će se rekombinacijom u 2µ plazmide, koji već postoje u stanici, ili su se neovisno podvojili. 2µ sljedovi su osobito prikladni za plazmide, koji imaju visoku frekvenciju transformacije i dozvoljavaju visoke brojeve kopija.

Prikladni genski markeri za kvasac su osobito oni, koji domaćinu podaju otpornost prema antibioticima, ili u slučaju auksotrofnih mutantnih kvasaca, geni, koji popravljaju oštećenja domaćina. Odgovarajući geni daju npr. otpornost prema antibiotiku G418 ili osiguravaju mogućnost fotosinteze u auksotrofnim mutantima kvasca, npr. URA3, LEV2, HIS3 ili TRP1 gen. Nadalje, hibridni vektori kvasca ponajprije sadrže podvojni začetak i genski marker za bakterijskog domaćina, osobito E. coli, tako da se konstrukcija i kloniranje hibridnih vektora i njihovih intermedijata može odvijati u bakterijskom domaćinu.

Ekspresijski kontrolni nizovi, koji su prikladni za ekspresiju u kvascu, jesu npr. oni između dobro izraženih gena kvasca. Tako se mogu upotrijebiti promotori TRPI gena, ADHI ili ADHII gena, geni kisele fosfataze (PHO3 ili PHO5), gen izocitokroma ili promotor za gene glikolize, kao što je promotor gena enolaze, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH), 3-fosfoglicerat kinaze (PGK), heksokinaze, piruvat dekarboksilaze, fosforfruktokinaze, glukoza-6-fosfat izomeraze, 3-fosfoglicerat mutaze, piruvat kinaze, trioza fostat izomeraze, fosfoglukoza izomeraze, invertaze i glukokinaze. Vektori predloženog izuma, kojima se daje prednost, sadrže promotore s kontrolom prepisivanja, npr. a promotore PHO5 i ADHII gena, koji se mogu uključiti ili isključiti pri mijenjanju uvjeta rasta. Npr. PHO5 promotor možemo zaustaviti ili osloboditi isključivo s povećanjem ili smanjenjem koncentracije anorganskog fosfata u mediju. Ponajprije hibridni vektori kvasca, u smislu predloženog izuma, obuhvaćaju također 3 priležni slijed gena kvasca, koji sadrže prikladan signal za prestanak prepisivanja i , poliadenilaciju. Odgovarajući 3 priležni sljedovi su npr. oni koji su u genu prirodno vezani na upotrijebljeni promotor, kao što je 3 priležni slijed u genu PHO5 kvasca.

b.Vektori za upotrebu u stanicama sisavaca

Vektori za podvajanje i ekspresiju u stanicama sisavaca često imaju DNA s virusnog izvora, npr. iz majmunskog virusa 40 (SV40), virusa Rousovog sarkoma (RSV), adeno-virusa 2, volovskog papiloma virusa (BPV), mutantne papova-virusa (BK BKV) ili mišjeg ili humanog citomegalo-virusa (MCMV odnosno HCMV).

Ekspresijski kontrolni nizovi, koji su prikladni za upotrebu u stanicama sisavaca, uključuju, između ostalih, rane i kasne promotore SV40, veći kasni promotor adeno virusa, promotor metalotioneinskog gena glodavaca i područje uvećavajućeg promotora u mišjem ili humanom citomegalo virusnom većem iznenadno-ranom genu, područje uvećavajućeg promotora humanog imunoglobulina, promotor humanog α-globina, po izbori u kombinaciji sa uvećavajućim promotorom za SV40, i promotore izvedene od toplinski šokiranih gena.

Prikladni markirni geni za stanice sisavaca su npr. neo i ble geni transpozona Tn5, koji podaju otpornost prema antibiotiku G418, odnosno antibiotiku vrste bleomicin, gen E.coli, otpornost prema higromicinu B, gen za dihidrofolat reduktazu (dhfr) iz stanica sisavaca ili E.coli, koji mijenja fenotip DHFR- stanica u DHFR+ stanica i/ili. podaje otpornost protiv metotreksata i gen timidin kinaze virusa Herpes simplex, koji stanice TK- čini fenotipićnim TK+.

Ponajprije, hibridni vektori sadrže dio gena sisavaca neprobavljiv za stanice sisavaca 3’, koji sadrži signale za sličan zaključak prepisivanja i poliadenilacije, kao npr. 3’ priležni dio gena za β-globin. Ugodnije, priležni na području, koje kodira polipeptid, uključuju jedan ili više nativnih introna, koji imaju prikladne signale za vezanje na svojim krajevima. Ti dodaci se smatraju potrebnim, jer cDNA i prokariotske DNA, kao gornji selekcijski geni, često nemaju takovih procesnih i signala prepisivanja.

Za razmnožavanje u E. coli vektori ponajprije imaju začetak prepisivanja i antibiotički otporan gen. Začetak podvajanja kod sisavaca možemo proizvesti ili uključenjem eukarionskog začetka u konstrukciju vektora, onog koji izlazi iz SV40 ili drugog virusnog izvora, ili ga možemo proizvesti s kromozonom stanice domaćina nakon integracije vektora u kromozom stanice domaćina.

Ponajprije, hibridni vektori koje upotrebljavamo u stanicama sisavaca, obuhvaćaju cDNA hibridnog PA ili mutanta hibridnog PA, djelomično priležno okruženog, na prema gore okrenutoj strani, s citomegalovirusnim glodajućim iznenadno-ranim genskim promotorm i, na prema dolje okrenutoj strani, s 3’-krajem β-globinskog gena kunića, koji uključuje drugi intron s njegovim prikladnim signalima za vezanje i poliadenilacijski slijed. Nadalje, sadrže slijedove kojiekodiraju gen rezistentan na neomicin iz transposona Tn5, ili u danom slučaju iz Tn9, ili sekvence koje kodiraju higromicin fosfotransferazu, priležno okruženu, na prema gore usmjerenoj strani slijeda, s ranim promotorom iz SV40 virusa, koji uključuje također i SC40 začetak replikacije, i nativni promotor Tn5 neo gena, te, po prema dolje usmjerenoj strani, sa segmentirna SV40 ranog gena, koji uključuje male t-antigenske vezne i poliadenilacijske signale. Cjelokupnu konstrukciju se klonira u fragmentu plazmida E.coli pBR322, koji uključuje plazmidni začetak podvajanja, gen rezistentan na ampicilin, ali mu nedostaju tim trujući nizovi, koji inhibiraju SV40-način DNA podvajanja u stanicama sisavaca. Po izboru u vektor uključimo gen, koji kodira dihidrofolat reduktazu (DHFR); ponajprije se upotrebljava modularni DHFR gen, opisan u R.F. Kaufman et al., /Mol. Cell. Bio. 2, 1304-1319 (1982)/. Taj modularni DHFR gen sastoji se od sljedova još većeg kasnog promotora adenovirusa tipa 2, fragmenta gena za imunoglobulin, CDNA, koji kodira dio DHFR glodača i SV40 začetno poliadenilacijsko mjesto.

Novi hibridni vektori, kojima se daje prednost za upotrebu u stanicama sisavaca, predstavljaju napredak u struci. Bolji su u usporedbi s dosada poznatim vektorima time što sadrže jak ekspresijski signal za kloniranu cDNA, koji se nalazi u mišjem iznenadno-ranom promotoru i u (β-globin nizovima za vezanje/poliadenilaciju u okruženju koje dopušta ekspresiju na visokoj razini u ekstremno širokoj količini staničnih vrsta kralježnjaka. Podrobnije, vektori se mogu upotrijebiti (a) da se izrazi cDNA privremeno u normalnim tj. SV40-netransformiranim staničnim linijama kulture tkiva, ali (b), još bolje, s većim brojem kopija u stanicama primata, koji pokazuju SV40-antigen, da dopuštaju vektoru podvajanje preko svog SV40 začetka podvajanja, ali također (c) da se izrazi takova klonirana cDNA stabilno u staničnim linijama normalne kulture tkiva, gdje se vektor može integrirati u kromozom stanice domaćina i (d) još bolje, zbog većeg broja kopija, ako uvedemo u SV40T-antigen, kojeg proizvode stanične linije primata, gdje se vektor može podvajati episomalno.

Uvećavajući-promotorski dio MCMV obuhvaća npr. DNA sa začetkom kod nukleotida -835 do -443 i kraj kod nukleotida +50 (broj od mRNA začetka) na 5’ dijelu MCMV većeg iznenadnog ranog gena. Ponajprije, pospješavajući promotorski dio MCMV obuhvaća nukleotide -542 do +50.

3’, priležni dio gena za β-globin zeca sastoji se od druge polovice gena za β-globin zeca /P. Dierks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1411-1415 (1981); A. van Ooyen et al., Sciens 206, 337-344 (1979) /, začne se u drugom eksonu, ponajprije na BamHI mjestu, tako uključuje drugi intron sa signalima za vezanje na svoje priležne nizove, i zaključi se s poliadenilacijskirn signalima, ponajprije na BglII mjestu, koje se nalazi 1.2 kb iza gornjeg BamHI mjesta.

SV40 izvor podvajanja nalazi se npr. u HindIII-SphI fragmentu virusne DNA /nukleotidi 5171 do 128, začetak = položaj 1; Tooze J. (ed.) DNA Tumor Viruses, Part. 2, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y. 1982/. Izvedba s prednošću je bilo koji HindIII-HpaII fragment (nukleotidi 5171 do 346), koji pored začetka podvajanja sadrže još i virusni promotor, upotrijebljen za pospješivanje prepisivanja selekcijskog gena vektora.

Neomicinski gen se klonira iza promotora, koji je aktivan u stanicama kulture tkiva, ponajprije SV40 rani promotor, npr. namješten na HpaII-HindIII fragmentu, spomenuto gore. Kodni nizovi neomicinskog gena nalaze se npr. na Bg1II-SmaI fragmentu iz transpozona Tn5 /E. Beck et al., Gene 19, 327-336 (1982); P. Southern et al., J. Mol. Appl. Genet. l, 327-341 (1982); F. Colbere-Garapin et al., J. Mol. Bio. 150, 1-14 (1981/. Od prednosti je opremiti neomicinski gen s drugim promotorom, koji takoder dopušta prepisivanje u E.coli. Npr., nativni promotor Tn5 neomicinskog gena, koji se ponajprije nalazi na HindIII-BglII fragmentu, možemo namjestiti iza eukariotskog promotora ispred neo kodirnog niza (Southern et al., gore), ili nadalje, prema gore, ispred eukariotskog promotara (Colbere-Garapin et al., gore). Da se izrazi u stanicama kulture tkiva iza bakterijskog neo gena mora slijediti poliadenilacijski signal, ponajprije dio SV40t antigenskog gena, koji također sadrži vezne signale. Slijed koji kodira neomicin fosfotransferazu, osobito BflII-SmaI dio Tn5 fragrnenta, spomenutog gore, također možemo nadomjestiti sa slijedom koji kodira hidromicin B fosfotransferazu, ponajprije u obliku BarnHI fragmenta plazrnida pLG89 /L. Gritz et al., Gene 25, 179-188 (18983)/, kojeg je još bolje uključiti u pSVd /Luedin et al., EMBO-J. 6, 109-114 (1987), derivat iz pSV2811 neo, u koji je uveden BglII linker na SmaI mjestu u vektoru.

Slijedeći selekcijski gen, kojem se daje prednost, uključuje slijed za kodiranje enzima dihidrofolat reduktaze, kao u pSV2dhfr ATCC 37145), koji ne dopušta samo selekcije transformiranih staničnih vrsta, već također pojačanje s plazmidom združenog DNA slijeda, često s proporcionalnim povećanjem produkcije proteina u smislu izuma, kodiranih u plazrnidu.

Fragment koji izlazi iz plazmida pBR322 E.coli, uključuje pBR322 začetak podvajanja i gen rezistentan na ampicilin. Fragment je ponajprije uzet iz pBR322 derivata, kao što je pSVOd /P. Mellon et al., Cell 27, 279-288 (1981)/, u kojem je odstranjen tim. trujući niz, koji bi inhibirao SV40T antigen-vodeno podvajanje vektora.

U izvedbi s prednošću predloženi izum se odnosi na hibridne vektore, koji se mogu podvajati i fenotipične selekcije u eukariotskom domaćinu vrste koja obuhvaća promotor i DNA, koji kodiraju hibridni PA ili mutante hibridnog PA; spomenuta DNA nalazi se, zajedno sa signalima za prepisivanje i terminaciju, kao također A signali za začetak i kraj translacije u spomenutom hibridnom vektoru pod kontrolom spomenutog promotora; kao oni u transformiranom domaćinu, izražava se u proizvodnji proteina.

Hibridni vektori u smislu izuma pripremaju se po metodama poznatim u struci, npr. s povezivanjem DNA segmenata koji sadrže promotor, područja za kodiranje, hibridnog PA ili mutante hibridnog PA, 3’ priležnim slijedom i vektorskom DNA.

Za povezivanje DNA segmenata in vitro mogu se primijeniti različiti postupci. Tupi krajevi (potpuno komplementarni DNA dupleks), koje tvore određene restrikcijske endonukleaze, mogu se neposredno povezati s T4 DNA ligazom. Uobičajenije je DNA segmente povezati preko njihovih jednovlaknastih kohezivnih krajeva i kovelantno zatvoriti s DNA ligazom npr. T4DNA ligazom. Takovi jednovlakansti "kohezivni krajevi" mogu nastati pri cijepanju DNA s drugom vrstom endonukleaza, koje proizvode otvorene krajeve (dva vlakna DNA dupleksa se cijepaju na različitim točkama u razmaku od nekoliko nukleotida). Jednostruka vlakna mogu također nastati i dodavanjem nukleotida k tupim krajevima ili otvorenim krajevima upotrebom terminalnih transferaza ("homopolimerni repovi") ili jednostavnom digestijom jednog vlakna na DNA segmentu s tupim krajem s prikladnom eksonukleazom, kao λ-eksonukleazom. Slijedeći pristup k tvorbi otvorenih krajeva sastoji se od povezivanja segmenata DNA, s tupim krajevima, s kemijski sintetički povezanom DNA, koja sadrži mjesto prepoznavanja za endonukleazu, koja tvori otvoren kraj, i digestije dobivene DNA s odgovarajućom endonukleazom. Komponente hibridnih vektora u smislu izuma povezujemo zajedno u prethodno odredenom nizu, tako da se dobije pravilno djelovanje.

Domaćini, transformirani s hibridnim vektorima koji sadrže DNA za hibridni PA

Daljnji aspekt predloženog izuma uključuje eukariotske organizme domaćina, transformirane s hibridnim vektorima, koji obuhvaćaju DNA, koja kodira hibridni PA, koji je sastavljen od najmanje dvije podjedinice, koje identitetom i brojem aminokisleina odgovaraju podjedinicama humanog uPA i humanog t-PA, ili koji kodiraju njegov mutant i mutante spomenutog domaćina, i na postupke za njihovu pripravu.

Primjeri odgovarajućih eukariotskih domaćina su oni navedeni gore, osobito vrste kvasca i stanice sisavaca. Mutanti transformiranih organizama domaćina uključuju osobito mutante koji imaju malo proteaza koje razgrađuju hibride PA ili mutante hibridnog PA, te daju viši prinos hibridnog PA, odnosno mutanta hibridnog PA.

Postupak pripremanja transformiranih eukariotskih domaćina obuhvaća transformiranje ili transfekciju eukariotskog domaćina s ekspresijskim vektorom, koji obuhvaća DNA izuma, reguliranu s ekspresijskim kontrolnim slijedom.

Transformacija eukariotskih stanica domaćina provedena je metodama poznatim u struci. Npr. transformacija kvasca s hibridnim vektorima može se provesti metodom koju su opisali Hinnen i suradnici /Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1919 (1978)/. Ta metoda se može podijeliti u tri stupnja:

1) Uklanjanje stanične membrane kvasaca ili njenih dijelova.

2) Obrada "golih" kvasaca (sferoplasta) s transformirajućorn DNA u prisutnosti PEG-a (polietilenglikola) i Ca2+ iona.

3) Regeneracija stanične membrane i selekcija transformiranih stanica u čvrsti sloj agara.

Metode kojima se daje prednost:

ad (1): Staničnu membranu kvasaca ukloni se enzimatski upotrebom različitih pripremaka glikozidaza, kao što su sokovi crijeva puža (npr. Glusulase® ili Helicase®) ili enzirnatskih mješavina dobivenih iz mikroorganizama (npr. Zymolyase®) u osmotski stabiliziranim otopinama (npr. 1 sorbitol).

ad (2): Sferoplasti kvasca se gomilaju u prisutnosti PEG-a, što dovodi do lokalnih fuzija citoplazmičkih membrana. Nastajanje uvjeta "pogodnih za fuziju" je odlučujuće i tijekom procesa transformacije mnoge transformirane stanice kvasca postaju diploidne ili čak triploidne. Postupci koji dopuštaju selekciju fuzioniranih sferoplasta mogu se koristiti za obogaćivanje transformanata, npr. transformirane stanice mogu se beG teškoća odvojiti od predselekcioniranih proizvoda fuzije.

ad (3): Budući da se kvasci bez stanične membrane ne dijele, stanična stijenka se mora obnoviti. To obnavljanje provodi se prikladno uklapanjem sferoplasta u agar. Npr. rastaljen agar (pribl. 50ºC) pomiješa se sa sferoplastima. Pri hlađenju taline do temperature rasta kvasca (otprilike 30ºC) dobije se čvrst sloj. Taj sloj agara sprečava brzu difuziju i gubitak bitnih makromolekula iz sferoplasta i stoga pospješuje obnavljanje stanične membrane. Ipak, obnavljanje stanične membrane postiže se također (doduše s manjim iskorištenjem) nasađivanjem sferoplasta na površinu prethodno oblikovanih slojeva agara.

Ponajprije, regeneracijski agar priprema se na način koji dopušta istovremeno obnovu i selekciju transformiranih stanica. Budući da se geni kvasca, koji kodiraju enzime amino kiselina kiselinskih biosintetičkih puteva, uglavnom upotrebljavaju kao selektivni markeri (supra), regenaracija se ponajprije provodi u minimalnom agarnom mediju za kvasac. Ako su potrebni vrlo visoki učinci regeneracije, koristan je slijedeći postupak u dva stupnja:

(1) regeneracija stanične membrane u bogatom kompleksnom mediju i

(2) selekcija transformiranih stanica replikacijskim nasadivanjem staničnog sloja u selektivna uzgajališta od agara.

Uvođenje hibridnih vektora u stanice sisavaca provodi se transformacijom u prisutnosti pomoćnih spojeva, npr. dietilaminoetildekstrana, dimetil sulfoksida, glicerola, polietilenglikola ilia sličnih, ili neke koprecipitatorske vektorske DNA, i kalcijevog fosfata. Slijedeće prikladne metode uključuju neposredno mikroinjiciranje vektorske DNA u staničnu jezgru i elektro-unašanjem, npr. uvođenjem DNA kratkim električnim impulsima, koji povećavaju permeabilnost staničnih membrana. Slijedeća selekcija transformiraniri stanica može se provesti upotrjebom selekcijskog markera, koji je ili kovalentno integriran u ekspresijski vektor, ili je dodan kao odvojena jedinica. Selekcijski markeri uključuju gene koji daju otpornost prema antibioticima, ili gene koji popravljaju genetičko oštećenje stanice domaćina (supra). Ponajprije, selekcijski sistem upotrebljava stanice kojima nedostaje dihidrofolat reduktaza (DHRF-), npr. CHO stanice koje, za rast apsolutno zahtijevaju timidin, glicin i purine, osim ako je dodan eksogeni DHFR gen. Uz uvođenje vektora, koji sadrži gen hibridnog PA, i dodatno DHFR- gen, u odgovarajuće DHFR stanice, npr. CHO stanice, transformirane stanice odvajamo povećanjem koncentracije antifolatnog lijeka metotreksata u mediju.

Od posebne prednosti je metoda selekcije po kojoj odgovarajuće stanice sisavaca, npr. CHO stanice, obradimo s ko-precipitatima vektorske DNA, koja sadrži gen hibridnog PA, i gen koji kodira antibiotičku otpornost, npr. otpornost na G-418 i kalcijev fosfat. Transformirane stanice odvajamo uzgajanjem u prisutnosti odgovarajućih antibiotika, npr. G-418 i/ili prekrivanjem ekspresije hibridnog PA.

Transformirane organizme domaćina u smislu izuma možemo poboljšati. u proizvodnji hibridnih PA ili mutanata hibridnih PA primjenskim metodama mutacije i selekcije, poznatim u struci. Mutaciju možemo provesti npr. UV-obasjavanjem ili s prikladnim kemijskim tvarima. Od osobite prednosti je izrada proteazno-manjkavih mutanata, osobito mutanata kvasca, zato da izbjegnemo proteolitičku razgradnju proizvedenog hibridnog PA, odnosno mutanta hibridnog PA.

Uzgoj transformiranih stanica domaćina

Izum se nadalje odnosi na metodu dobivanja jednolančanih hibridnih PA, koji imaju amino kiselinski slijed sastavljen od najmanje dvije podjedinice, koje identitetom i brojem amino kiselina odgovaraju podjedinicama humanog t-PA i humanog u-PA ili njihovim mutantima, koja uključuje uzgoj transformiranog eukariotskog domaćina pod prikladnim uvjetima hranjenja, koji sadrži DNA sljedove koji kodiraju spomenuti hibridni FA ili mutant hibridnog PA, i na izolaciju spomenutog hibridnog PA ili njegove mutante. Transformirane stanice domaćina uzgajamo po metodama poznatim u struci, u tekućem mediju, koji sadrži izvore ugljika i dušika, koji se mogu asimilirati, te anorganske soli.

Za uzgoj transformiranih kvasaca, u smislu izuma, mogu se upotrijebiti različiti izvori ugljika. Primjeri izvora ugljika, kojima se daje prednost, su ugljikohidrati koji se mogu asimilirati, kao što su glukoza, maltoza, manitol ili laktoza ili acetat, koji se može upotrijebiti ili sam ili u prikladnim smjesama. Primjeri prikladnih izvora dušika su amino kiseline kao što su kezamino kiseline, peptidi i proteini, te proizvodi njihove razgradnje, kao što su tripton, pepton ili mesni ekstrakti, ekstrakti kvasca, ekstrakti slada i također amonijeve soli, npr. amonijev klorid, sulfat ili nitrat, koji se mogu upotrijebiti kao takovi ili u prikladnim mješavinama. Anorganske soli, koje se također mogu upotrijebiti, su npr. sulfati, kloridi, fosfati i karbonati natrija, kalija, magnezija i kalcija. Medij nadalje sadrži npr. tvari koje pospješuju rast, kao što su nizovi elemenata npr. željezo, cink, mangan itd., i ponajprije, tvari koje stvaraju selekcijski pritisak i sprečavaju rast stanica koje su izgubile ekspresiju plazmida. Tako npr. ako se kao mikroorganizam domaćina upotrebljava vrsta kvasca koji je auksotrofan u npr. esencijalnoj amino kiselini, plazmid sadrži ponajprije gen za kodiranje enzima, koji popunjava nedostatak domaćina. Uzgoj vrste kvasaca odvija se u minimalnom mediju nepopunjenom sa spomenutim amino kiselinama.

Uzgoj se provodi postupcima koji su poznati u struci. Uvjeti uzgoja, kao što je temperatura, pH vrijednost medija i vrijeme fermentacije, odabrani su tako da se dobije maksimalan titar PA proteina izuma. Takva vrsta kvasaca ponajprije se uzgaja pod aerobnim uvjetima s kulturom koja se može potopiti, uz potresanje ili miješanje, pri temperaturi otprilike 20 do 40°C, ponajprije pribl. 30°C i pH vrijednosti od 5 do 8, ponajprije pH 7, tijekom otprilike 4 do 30 sati, ponajprije dok se dosegne maksimalan prinos proteina izuma.

Stanice sisavaca rastu pod uvjetima kulture tkiva u medijima koji su komercijalno dostupni, po izboru nadopunjeni s tvarima koje pospješuju rast i/ili serumima sisavaca. Stanice rastu ili pričvršćene na čvrstu podlogu npr. mikro-nosioce ili porozna staklena vlakna, ili slobodno plivajući u odgovarajućim posudama za uzgoj. Medij za uzgoj bira se na taj način da se dobije selekcijski pritisak i da prežive samo one stanice koje još posjeduju hibridni vektor DNA, koji uključuje genetički marker. Tako npr., ako vektor uključuje odgovarajući gen za otpornost prema antiobioticima, u medij se doda antibiotik. Kad se dosegne zadovoljavajuća vrijednost gustoće stanica uzgoj se prekida i protein se izolira. Ako upotrebljavamo stanice sisavaca, hibridni PA ili mutant hibridnog PA obično se izluči u medij. Medij, koji sadrži proizvod, odvaja se od stanica, koje, -opskrbljene sa svježim medijem - upotrebljavamo za kontinuiranu proizvodnju. Ako upotrebljavamo kvasce, protein se može akumulirati također unutar stanica, posebno u periplazmatskorn prostoru. U tom slučaju prvi stupanj dobivanja PA proteina sastoji se od oslobađanja proteina iz unutrašnjosti stanica. U većini postupaka najprije se ukloni stanična membrana enzimatskom razgradnjom stanične membrane s glukozidazama (supra). Alternativno, stanična membrana može se ukloniti obradom s kemijskim sredstvima, npr. tiolnim reagensima ili EDTA, koja uzrokuju oštećenje stanične membrane, a to omogućuje oslobađanje proizvedenog hibridnog PA ili njegovog mutanta. Dobivenu mješavinu obogatimo hibridima PA ili s njegovim mutantima na uobičajen način, kao što je uklanjanje većine neproteinskog materijala obradom s polietilenaminom, precipitacijom proteina s amonijevim sulfatom, gel elektroforezom, dijalizom, kromatografijom, npr. kromatografijom na osnovi ionske izmjene, kromatografijom na osnovi razdvajanja po veličini, HPLC ili HPLC s reverznom fazom, molekularnim sortiranjem na odgovarajućoj Sephadex koloni ili slično. Konačno čišćenje, prethodno očišćenog proizvoda, postižemo npr. afinitetnom kromatografijom, npr.nafinitetnom kromatografijom na načelu antitijela, osobito afinitetnom kromatografijom na načelu monoklonalnih antitijela, koja koristi monoklonalna anti-t-FA ili anti-u-PA antitijela, pričvršćena na netopivu matricu, po metodama poznatim u struci, ili u 'slučaju hibridnih PA, koji sadrže katalitički B-lanac t-PA, DE-3 afinitetnu kromatografiju (DE-3 je proteazni inhibitor, izoliran iz Erytrina latissima) i slično. Predmet izuma su takoder hibridne stanične linije, koje proizvode monoklonalna antitijela, usrnjerena na specifične domene t-PA ili u-PA, i spomenuta monoklonalna antitijela.

U odgovarajućoj pripravi jednolančanog hibridnog PA ili mutanta hibridnog PA, koji je uglavnom bez dvolančanog oblika, korisno je uključiti proteazni inhibitor, kao što je aprotinin Trasylol®ili bazični tripsin inhibitor iz pankreasa, tijekom postupka čišćenja, zato da se inhibiraju slijedovi proteaza koji mogu biti prisutni u uzgojnom rnediju i 'koji mogu prouzročiti (djelomičnu) pretvorbu jednolančanog oblika u dvolančani oblik. Konačno čišćenje postižemo zatim kromatografijom u koloni, koja sadrži reagens selektivnog afiniteta.

5. Farmaceutski pripremci

Novi jednolančani PA proteini i njihovi mutanti, koje smo dobili u skladu s predloženim izumom, pokazuju dragocjena farmakološka svojstva. Mogu se upotrijebiti analogno kao poznati plazminogenski aktivatori kod ljudi za sprečavanje ili liječenje tromboza i drugih stanja, gdje je poželjno stvoriti lokalnu fibrinolitičku ili proteolitičku aktivnost preko mehanizma plazrninogenske aktivacije, kao npr. arteroskleroze, miokardijalnog ili cerebralnog infarkta, venoznoj trombozi, tromboemboliji, postoperativnih tromboza, tromboflebitisa i dijabetskih vaskulopatija.

Iznenađujuće smo utvrdili da novi hibridni PA proteini i njihovi mutanti u smislu predloženog izuma združuju korisna svojstva nativnog t-PA i u-PA. Tako su novi hibridni PA proteini i njihovi mutanti fibrinolitički aktivni. Jedinstvena svojstva usmjerena na fibrin, npr. sposobnost aktiviranja plazminogena, ponajprije u prisutnosti fibrina, su očuvana. Nadalje, novi proteini imaju dulju in vivo stabilnost u usporedbi s autentičnim t-PA.

Izum se također odnosi na farmaceutske sastave koji obuhvaćaju terapeutski učinkovitu količinu aktivnog sastojka (hibridnog PA ili njegovog mutanta), zajedno s organskim ili anorganskim čvrstim ili tekućim farmaceutski prihvatljivim nosiocima, koji su prikladni za parenteralno, tj. intramuskularno, subkutano ili intraperitonealno davanje i koji ne utječu štetno na druge aktivne sastojke.

Prikladne su infuzijske otopine, ponajprije vodene otopine ili suspenzije koje se mogu pripremiti prije upotrebe npr. iz liofiliziranih preparata koji sadrže aktivan sastojak sam ili zajedno s nosiocem, kao što je manitol, laktoza, glukoza, albunim itd. Farmaceutski sastavi su sterilizirani i, ako je poželjno, dopunjeni npr. s konzervansima, stabilizatorima, emulgatorima, sredstvima za povećanje topivosti, puferima i/ili solima za regulaciju osmotskog tlaka. Sterilzaciju se može postići sterilnom filtracijom kroz filtre malih pora (promjera 0,45 µm ili manjim), nakon čega se sastav može liofilizirati, ako je poželjno. Mogu se također dodati antibiotici zato da pomognu Pri očuvanju sterilnosti.

Farmaceutski sastavi u smislu predloženog izuma izdaju se u obliku dozirnih jedinica, npr. u ampulama koje. sadrže 1 do 2000 mg farmaceutski prihvatljivog nosioca na jediničnu dozu i otprilike 1 do 200 mg, ponajprije 5 do 100 mg aktivne tvari na dozirnu jedinicu.

Ovisno o vrsti bolesti i starosti, te stanja pacijenta, dnevna doza, ako ju dajemo kod liječenja pacijenta težine približno 70 kg, kreće se, u području od 3 do 100 mg, ponajprije 5 do 50 mg u 24 sata. U slučaju miokardijalnog infarkta, daje se dnevna doza od otprilike 30 do 80 mg između 60 i 120 minuta, ponajprije u tri alikvota unutar otprilike 90 minuta. Cjelokupna količina hibridnog PA ili mutanta hibridnog PA može se također dati i. kao jedna injekcija.

Izum također daje metode za proizvodnju farmaceutskog sastava karakterističnog time da se biološki aktivni protein u smislu predloženog izuma doda k farmaceutski prihvatljivom nosiocu.

Upotreba novih proteina na profilaktičku i terapeutsku obradu ljudskog tijela također je predmet predloženog izuma.

Izum se također odnosi posebno na DNA, hibridne vektore, transformirane vrste domaćina, hibridne PA proteine, mutante hibridnih PA proteina, hibridne stanične linije, monoklonalna antitijela i na postupke za njihovo pripremanje, kao što je opisano u primjerima.

Kratak opis crteža

U slijedećem eksperimentalnom dijelu opisane su razne izvedbe predloženog izuma u svezi s priloženim crtežima, na kojima:

Slika 1 i slika 3 prikazuju nukleotidne sljedove i izvedene sljedove amino kiselina humane t-PA cDNA, odnosno humane u-PA cDNA. Prve amino kiseline zrelih proteina su podcrtane.

Slika 2 i slika 4 su karte restrikcijskih endonukleaza humane t-PA cDNA, odnosno u-PA cDNA.

Slika 5 shematski prikazuje upotrijebljenu tehniku konstruiranja plazmida pEcoO.47ΔScaI.

Slika 6 shematski prikazuje konstrukciju plazmida ph.tPAΔScaI, kojeg sadrži mutirana t-PA cDNA.

Slika 7 shematski prikazuje konstrukciju plazmida pUNC.tc, koji sadrži uključak cDNA, koji obuhvaća A-lanac domena u-PA i B-lanac t-PA.

Slika 8 shematski prikazuje konstrukciju plazmida ptNC-UC, koji sadrži cDNA uključak koji obuhvaća A-lanac domena t-PA i B-lanac u-PA.

Slika 9 shematski prikazuje konstrukciju plazmida pD02. Slika 10 shematski prikazuje konstrukciju plazmida

Slika 10 koji sadrži t-PA cDNA, kombinirano s fragmentom β-globina.

Slika 11 shematski prikazuje konstrukciju plazmida pCGA26, koji sadrži t-PA cDNA pod kontrolom MCMV IE promotora i fragment β-globina.

Slika 12 shematski prikazuje konstrukciju t-PA ekspresijskog plazmida pCGA28 i općeg ekspresijskog plazmida pCGA44; oba plazmida uključuju gen rezisten prema neomicinu.

Slika 13 shematski prikazuje konstrukciju t-PA ekspresijskog plazmida pCGA42 i općeg ekspresijskog plazmida pCGA44d; oba plazmida uključuju gen rezisten prema higromicinu.

Slika 14 shematski prikazuje konstrukciju t-PA ekspresijskog plazmida pCGA2B, koji uključuje gen rezisten prema neomicinu i DHFR gen.

Slika 15 shematski prikazuje konstrukciju ekspresijskog plazmida pBRla, koji uključuje mutirani t-PA cDNA uključak plazmida ph.tPAΔScaI.

Slika 16 shematski prikazuje konstrukciju ekspresijskog plazmida pBR2a, koji sadrži hibridni PA cDNA uključak, koji obuhvaća A-lanac domena u-PA i B-lanac t-PA.

Slika 17 shematski prikazuje konstrukciju ekspresijskog plazmida pBR3a.

Slika 18 shematski prikazuje konstrukciju ekspresijskog plazmida pBR4a, koji sadrži hibridni PA cDNA uključak, koji obuhvaća domene t-PA A-lanca i B-lanac u-PA.

Slika. 19 shematski prikazuje konstrukciju ekspresijskog vektora kvasca pJDB207/PH05-I-TPA, koji sadrži PH05 promotor, invertazni signalni slijed i t-PA cDNA.

Slika 20 shematski prikazuje konstrukciju plazmida pCS16.

Slika 21 shematski Prikazuje konstrukciju plazmida pCS16/UPA, koji obuhvaća u-PA cDNA.

Slika 22 shematski prikazuje konstrukciju plazrnida pJDB207/PH05-I-UPA.

Slike 23-26 shematski prikazuju postupke primijenjene za pretvorbu konstrukcija primarnih hibridnih PA, koji uključuju domene A-lanca i katalitičko područje B-lanca u-PA ili t-PA u krajnju konstrukciju u kojoj je sveza domena u aktivacijskom mjestu i/ili u nativnim veznim mjestima ekson-intron.

Slika 23 prikazuje konstrukciju gena koji kodira hibridni PA koji, obuhvaća domene A-lanca t-PA i B-lanca u-PA.

Slika 24 prikazuje konstrukciju gena koji kodira hibridni PA, koji obuhvaća domene A-lanca u-PA i B-lanca t-PA.

Slika 25 prikazuje konstrukciju gena koji kodira hibridni PA, koji obuhvaća faktor rasta u-PA, domenu "kringle 2" t-PA 7. B-lanac t-PA.

Slika 26 prikazuje konstrukciju gena koji kodira hibridni PA, koji obuhvaća faktor rasta u-PA, domenu "kringle 2" t-PA i B-lanac u-PA.

Slika 27 prikazuje sastavljanje hibridnih PA i mutantnih hibridnih PA, prema primjerima u eksperimentalnom dijelu.

Simboli upotrijebljeni na priloženim slikama imaju slijedeća značenja:

AMP; AMPR gen rezistentan na ampicilin (β-laktamaza)

TET, TetR gen rezistentan na tetraciklin

NEO TN5 neomicin fosfotransferaza

TN5PR bakterijski promotor transpozona TN5

HPH higromicin fosfotransferaza

pBRori začetak podvajanja plazmida pBR322

pOIS trujući slijed, pBR322 slijed, koji inhibira SV40 podvajanje

SV40ori začetak podvajanja SV40, koji se poklapa s ranim i kasnim promotorima

5V40enh, SV40E 72 bp uvećavajući dio SV40 ranog promotora

HCMVE uvečivač humanog citomegalovirusnog (HCMV) većeg, nativnog ranog gena

MCMVP promotor/mRNA začetno mjesto mišjeg citomegalovirusnog (MCMC) većeg iznenadnog ranog gena

RSV Rous sarcoma virus LTR (promotor)

CAP položaj 5. m7Gp " cap" eukariotske mRNA

polyA poliadenilacijsko mjesto mRNA

SPLD vezno donorsko mjesto, 5. kraj introna

SPLA vezno akceptorsko mjesto, 3. kraj introna

BAP bakterijska alkalna fosfataza

CIP teleća crijevna fosfataza

(RamH1/Bg12) Sau3a mjesto koje je rezultat povezivanja BamHI i BglII mjesta

ScaI(del) mutirano ScaI mjesto

x < y mjesto x restrikcijskog enzima, koje se nalazi u smjeru kazaljke na satu prema y

p promotor

inv.SS invertazni signalni slijed

t prepisni terminator

L linker DNA

DHFR dihidrofolat reduktaza

mtPA t-PA Bowes melanoma

Eksperimentalni dio

Primjer 1

Uvođenje ScaI mjesta na vezu između struktura "kringle" i enzimske domene u hurnanoj t-PA cDNA

Načelo, primijenjeno za konstrukciju himeričkih i hibridnih molekula, koje sadrže domene obaju t-PA i u-PA, sastoji se od pripremanja željenih restrikcijskih fragmenata koji izlaze iz pojedinih klona, njihovog ponovnog sastavljanja u otopini, i zatim kloniranja izlaznih konstrukcija. Nakon kloniranja provjerimo strukturu himeričkih molekula restrikcijskim mapiranjem i analizom DNA slijeda.

Da dobijemo hibridne molekule obaju t-PA i u-PA CDNA, na svezama između pojedinih struktura cijepamo "kringle" i enzimatske domene. To postižemo s u-PA tako, da provedemo djelomičnu probavu s restrikcijskom endonukleazom MstI, koja razdvaja nekatalitičku domenu od enzimatske domene i priključenih sljedova na 3’ kraju. Ni jedno prikladno upotrebljivo mjesto nije prisutno u t-PA, i zato uvodimo jedno, kao što je opisano dolje:

A) konstrukcija plazmida pEcoO.47ΔScaI (vidi sliku 5)

U toj konstrukciji jedino ScaI mjesto (AGTACT) na nukleotidnom položaju 940-945 t-PA cDNA razgradimo (AGTACT → AGTATT) i uvedemo drugo ScaI mjesto na nukleotidnim položajima 963-968 (ACCACC → AGTACT) na 3’ kraju "kringle 2" (usporedi slike 1 i 2). Kodiranje ni jedne od amino kiselina nije pogođeno s tim promjenama.

Sve restrikcijske probave vršimo se u sladu s uputama proizvođača (New England Biolabs, Bethesda Research Labs) i nastale probavke analiziramo elektroforezom na 3,5% poliakrilamidnorn gelu. Gel obojimo s homidijevim bromidom (1,0 µg,/ml) i osvijetlimo s ultraljubičastim svjetlom. Izrežemo prikladan pojas i elektroeluiramo u 0,5 x TBE (1 x TBE = 90 mM Tris-borata, pH 8, 3; 2, 5 mM EDTA). Flektroeluirani materijal se aplicira na Elutip-d kolonu (Schleicher and Schuell), vezanu DNA eluira se u jako slanom i precipitira s dodatkom etanola. Talog se ispere s etanolom, osuši i otopi u vodi.

Plazmid pW349F (Europska patentna prijava br. 143,081), koji sadrži humanu t-PA cDNA (sintetizirana iz mRNA, izolirana iz HeLaS3 stanica i klonirana u PstI mjestu plazmida pBR322) probavi se s EcoRI i fragment od 470 baznih parova (bp) se izolira (usporedi sliku 2). Probavom 470 bp EcoRI fragmenta sa ScaI, obzirom na HaeIII, dobiju se 150 bp EcoRI, ScaI i 290 bp EcoRI, HaeIII fragmenti. Dva vlakna 470 bp EcoRI fragmenta odvaje se denaturiranjem DNA u DMSO puferu (30% DMSO, 1 mM EDTA, 0,5% ksilen cijanol, 0,05% bromfenol plavo) i vrši se elektroforezu na 5% poliakrilamidnom gelu u 0,5 x TBE kod 8 volti na centimetar /Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982/. Odvojena vlakna dobiju se elektroeluiranjem za kojim slijedi precipitacija s etanolom. 31-merni dezoksioligonukleotid (koji ima uključenih 5 željenih nukleotidnih promjena, usporedi sliku 5) sintetizira se primjenom fosfotriesterske metode. Pedeset pmolova 31-mera označavamo s 32P na 5’ kraju u 20 µl reakcije, koja sadrži 1 x kinazni pufer (10 x kinazni pufer = 0, 5 M TriS-HCl, pH 7, 5; 0, 1 M MgCl2, 50 mM DTT, 1 mM spermidina, 1 mM EDTA), 30 µCi/α32P/ATP (Amersham, ~ 3000 Ci/mmol) i 10 jedinica T, polinukeotid kinaze (Hethesda Research Labs.). Reakciju inkubiramo 30 minuta pri 37°C, zatim slijedi dodatak 1 µl 10 mM ATP, 10 jedinica T4 kinaze i daljnjih 30 minuta inkubacije pri 37°C. Reakciju se završava grijanjem 10 minuta pri 68°C. Karakterističan 31-mer, čiji slijed je onaj ne-prepisanog vlakna, provjeri se "dot blot" analizom /provođena prema Zoller and Smith, Nucl. Acids Res., 10, 6487-6500 (1982); osim što su prethodna hibridizacija, i hibridizacija, provedene pri 50°C, a ispiranje pri 60°C/ da se odredi koje od dva vlakna se s njim hibridizira, tj. koje predstavlja prepisano vlakno. Četiri DNA pomiješaju se zajedno u 20 µl renaturirane reakcije koja se sastoji od 0,3 pmola prepisanog vlakna, 2 pmola svakog od 150 bp EcoRI i 290 bp, EcoRI, HaeIII fragmenta, 25 pmola fosforilirnog 31-mera i 1 x renat. pufera (5 x renat. pufer = 0,5 m NaCl, 32,5 mM Tris-HCl, pH 7,5; 40 mM MgCl2 i 5 mM β-merkaptoetanola). Mješavinu inkubiramo 3 minute pri 100°C, 30 minuta pri 30°C, 30 minuta pri 4°C i zatim 10 minuta na ledu, a zatim se doda 400 jedinica T4 DNA ligaze (New England Biolabs) i reakciju inkubiramo preko noći pri 12,5°C, 470 bp renaturirani fragment dobije se iz 3,5%-tnog poliakrilamidnog gela, kao što je gore opisano, i veže se na pBR322 DNA probavljenu s EcoRI i defosforiliziranu (New England Biolabs) u 50 ml Tris-HCl pH 7,5; 10 mM MgCl2. 10 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM spermidina, 0,1 mg/ml goveđeg seruma albumina i inkubacijom kroz noć pri 12°C. Mješavinu za povezivanje upotrebljava se da se transformira prikladna E.coli vrsta HB101 (Maniatis et al., supra). Kolonije otporne na ampicilin odvajaju se na L-agaru koji, sadrži 50 µg/ml ampicilina, a kolonije, koje sadrže 470 bp fragment identificiraju se hibridizacijom kolonije s upotrijebljenim 31-merom kao ispitanikom /D. Woods, Focus 6, 1-3, (1984)/. Plazmid DNA izolira se iz pojedinačnih hibridizacijskih kolonija u maloj mjeri /Holmes et al., Analyt. Biochem. 114, 193-197 (1981)/, a stvaranje novog ScaI mjesta potvrdi se s kombiniranom EcoRI i ScaI probavom. Da se dobije čistoća koristi se plazmid DNA iz pozitivnih kolonija u drugom krugu transformacije E.coli HB101. Priprema plazmida u velikoj mjeri vrši se iz druge generacije jedne od takovih pozitivnih kolonija /Katz et al., J. Bacteriol. 144, 577-591 (1973); Biochemistry 16, 1677-1683 (1977)/, a anuliranje prvobitnog ScaI mjesta i stvaranje novog ScaI mjesta potvrđuje se analizom DNA slijeda primjenom metode Maxam and Gilbert /Methods Enzym. 65, 499-560 (1980)/. Taj plazmid označavamo pEco0.47ΔScaI.

B) Rekonstrukcija humanog t-PA s mutiranim ScaI mjestom

(vidi sliku 6)

U toj konstrukciji fragment 470 bp EcoRI, prisutan u dvije vrste humanog t-PA, zamijeni se sa fragmentom 470 bp EcoRI, koji sadrži mutirano ScaI mjesto. Plazmid aW349F, koji sadrži humanu t-PA cDNA (vidi gore) probavi se sa ClaI i nastale ljepljive krajeve učini se tupim dodatkom 50 µm svakog od dCTP, dGTP i 10 jedinica DNA polimeraze I, Klenow fragment (Boehringer, Mannheim). Reakciju se inkubira 30 minuta pri. sobnoj temperaturi, zatim slijedi ekstrakcija s fenolom i eterom i precipitacija s etanolom. Talog se otopi u vodi, probavi s EcoRI i ScaI i 1, 5 kb EcoRI, ScaI i 4, 3 kb ClaI (s tupim krajevima). EcoRI fragment se izolira. Ta dva fragmenta pomiješaju se s fragmentom 470 bp, koji se dobije iz plaznida pEco0.47ΔScaI nakon probave s ECoRI i poveže se kako je opisano gore, kroz noć pri 12°C. Prikladne E.coli HB101 stanice transformiramo s mješavinom za povezivanje i kolonije otporne na tetraciklin odvojimo na L-agaru, koji sadrži 12,5 µg/ml tetraciklina. Kolonije koje sadrže mutirani fragment 470 bp identificiraju se hibridizacijom kolonije upotrebom prethodno opisanog 31-mera kao ispitanika. DNA se pripremi iz manilizata pojedinačnih pozitivno hibridiziranih kolonija i konstrukciju se točno potvrdi tako da se provedu prikladne restrikcijske probave (digests). Jedan takav plazmid sa željenim promjenama nazivamo ph.tPAΔScaI.

Primjer 2

Konstrukcija u-PA/t-PA hibridne molekule; plazmid pUNC.tc (vidi sliku 7)

Ova konstrukcija je hibrid između nekatalitičkog područja u-PA (koja sadrži 5’ nekodno područje, signalni, faktor rasta i slijed "kringle") i katalitičke ili enzimske domene humanog t-PA.

Urokinaznu cDNA pripremi se iz mRNA, dobivene iz humanih Hep3 stanica /cf. T. Maniatis et al., Molecular Cloning (1982), str. 188-246/. 1,3 kb SmaI-BarnHI fragment i 1 kb BamHI-EcoRI fragment u-PA cDNA klonira se u SmaI, EcoRI mjestima pUN121 /B. Nilsson et al., Nucl. Acids Res. 11, 8019-8030 (1983)/, da se dobije plazmid pcUK176. Crtež restrikcijske endonuleaze uključka humanog u-PA cDNA prikazan je na slici 4. Slijed nukleotida i izveden slijed amino kiselina u-PA uključka prikazan je na slici 3.

Plazmid pcUK176 probavi se sa XmaI (usporedi sliku 4; XmaI je izoshizomer SmaI) i MstI i izolira se fragment 521 bp. Restrikcijski enzim MstI prepoznaje DNA slijed TGC T GCA (strelice pokazuju mjesta cijepanja) i nakon probave kraj se učini tupim; taj enzim zatim veže u-PA cDNA kod nukleotida 520-525, tj. ravno na zadnjem cisteinskorn ostatku (amino kiselina 131) koji obuhvaća "kringle" /Holmes et al., Biotechnology 3, 923-929 (1985) /, i tako se čisto odvoje slijedovi za kodiranje nekatalitičkog i katalitićkog područja.

Plazmid ph.tPAΔScaI probavi se sa ScaI i HindIII (HindIII je prisutan u vektoru) i dobije se fragment 1,8 kb. Restrikcijski enzim ScaI prepoznaje DNA slijed ATG T ACT (strelice pokazuju mjesto cijepanja) i također daje tupi kraj nakon probave. ScaI će rezati ph.tPAΔScaI DNA nakon serinskog ostatka 262 /1 amino kiselina nakon zadnjeg cisteina "kringle 2"; Pennica et al., Nature 301, 214-221 (1983)/, zato razdvaja nekatalitičku i katalitičku domenu.

Dva fragmenta pomiješamo i vežemo na XmaI, HindIII cijepljenu pUC18 vektorsku DNA. Nakon transformacije E.coli HB101, kolonije koje imaju pravilan uključak, identificiramo hibridizacijom kolonija upotrebom 2,0 kb BgIII fragmenta humanog t-PA (usporedi sliku 2) kao ispitanika, koji je karakterističan po metodi slučajnog predobojenja, /Feinberg et al., Analyt. Biochem. 132, 6-13 (1983)/. DNA slijed na svezi povezivanja u-PA i t-PA fragmenata potvrdimo analizom DNA slijeda. Pravilan klon označavamo pUNC.tc.

Primjer 3

Konstrukcija t-PA/u-PA hibridne molekule:

plazmid pUNC.UC (vidi sliku 8)

Ova konstrukcija je upravo suprotna pUNC.tc time što je nekatalitičko područje ph.tPAΔScaI (koji sadrži 5’ nekodirajuče područje, vodene, "finger", faktor rasta, "kringle 1" i "kringle 2" domene) fuzionirano s katalitičkom domenom humanog u-PA. Plazmid ph.tPAΔScaI probavi se sa SacI i ScaI (usporedi sliku 8) i izolira se otprilike 1,0 kb fragmenta. Plazmid pcUK176 se najprije probavi s BamHI i zatim se djelomično cijepa s MstI i dobije se fragment s otprilike 800 bp. Slijedi dakle da se BamHI probavak reže s EcoRI i izoliramo otprilike 1,0 kb fragment. Ta tri fragmenta se pomiješaju s pUC19 vektorom probavljenim sa SacI, EcoRI i povežemo. E.coli HB101 transformiramo s mješavinom za povezivanje, a kolonije koje imaju pravilan uključak, identificiramo hibridizacijom kolonije upotrebom istog 20 kb BgIII ispitanika, kako je opisano gore. DNA slijed na svezi t-PA i u-PA DNA potvrdimo analizom DNA slijeda. Jedan pravilan klon nazivamo pt.NC.UC.

Primjer 4

Konstrukcija ekspresijskog vektora za upotrebu u stanicama sisavca

A) Pretvorba HgiAI mjesta u t-PA cDNA u HindIII mjesto

To se postiže u pet stupnjeva (slika 9).

Plazmid pW349F (Europska patentna prijava br. 143,081) djelomično. cijepamo s restrikcijskim enzimom HgiAI inkubacijom 20 µg/ml DNA 1 sat pri 37°C s 12 U/ml enzima u puferu kojeg preporuča proizvođač (Bethesda Research Laboratories), osim što je nadopunjen s 10 µg/ml homidijevog bromida, da zadrži drugo rezanje plazmida. Plazmid DNA u linearnim oblicima položi se zatim na 0,8%-tni agarozni gel u TBE puferu /TBE: 89 mM Tris-borat, pH 8,9, koji sadrži 1 mM EDTA), eluira se elektroforezom u istom puferu, dva puta se ekstrahira s fenolom, dva puta s kloroformom i konačno se precipitira s alkoholom pri -20°C nakon dodatka 0,1 vol. 3 M natrijevog acetata, pH 5,2. Istaloženu DNA otopi se pri 0,2 mg/ml u TE (TE: 10 ml Tris-HCl pH 7,2 s 0,1 mM EDTA).

63 µl DNA u linearnim oblicima inkubiramo zatim 30 minuta pri 37°C s 15 U T4 DNA polimeraze u ligaznom puferu /33 mM Tris-acetat (pH 7,9), 66 mM kalijev acetat, 10 mM magnezijev acetat, 0,5 mM ditiotreitol i 0,1 mg/ml goveđi serum albumin/; slijedi 10 minuta grijanja pri 60°C da se enzim inaktivira. Cilj te inkubacije je primjena eksonukleolitičke aktivnosti T4 polimeraze za uklanjanje preostalih van stršećih četiriju nukleotida nakon probave s HgiAI, da se dobiju DNA molekule s tupim krajevima.

Zatim, da se povežu HindIII linkeri (CAAGCTTG) s tupim krajem DNA, dodamo 6 µl (300 ng) kinaznih linkera gornjoj otopini sa 4 µl 10 mM ATP i 3 µl 4T DNA ligaze (New England Biolabs, 400 U/µl), slijedi 16-satna inkubacija pri 16°C. Povezivanje je završeno grijanjem mješavine 10 minuta pri 68°C, nakon koje se DNA probavi s HindIII i BglII, tj. 15 µl (135 U) HindIII doda se 1,5 µl 4M NaCl, 0,2 µl i 1M MgCl2 i 11 µl 1 mg/ml goveđeg seruma albumina, inkubira se 1 sat pri 37°C, zatim slijedi dodatak 40 U HglII, zatim još jedan sat inkubacije pri 37°C. Nastali fragment sa 177 baznih parova čistimo na 6%-tnom poliakrilamidnom gelu, tekućem u TBE, eluiramo u TNE (TNE: 10 mM Tris-HCl pH 8, 8, koji sadrži 100 mM NaCl i 1 mM EDTA), apsorbira se na DEAE celulozu (Whatman DE52), eluira s 1M NaCl u TNE, razrijedi sa 4 volumena vode, precipitira pri -20°C nakon dodatka 2,5 volumena etanola i konačno se otopi u 17 µl TE (TE: 10 mM Tris-HCl pH 8,0, koja sadrži 1 mM EDTA).

Plazmid pRSVneo je izvedenica plazmida pSV2neo /P.J. Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet. l, 327-341 (1982)/ u kojem je SV40-izveden fragment PvuII-Hind nadomješten s fragmentom PvuII-HindIII, koji sadrži LTR promotor iz virusa Rousovog sarkoma, na isti način, kao što je bio konstruiran pRSVcat i.z pSV2cat /C.M. Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777-6781 (1982)/. 5 µg tog plazmida reže se u 50 µl volumena s 24 U BgIII u skladu s uputama proizvođača. Nakon 1 sata inkubacije pri 37°C doda se 40 U HindIII i inkubaciju se nastavlja 1,5 sata, a zatim se fragment velik 5,4 kb očisti kao što je gore opisano.

17 µl očišćenog 177 bp fragmenta veže se 18 sati pri 16°C na 2 µl (20 ng) pSRVneo fragmenta uz upotrebu 0, 25 µl (100 U) T4 ligaze u cjelokupnom volumenu 22 µl ligaznog pufera, zatim se plazmid DNA upotrijebit za transformaciju E.coli sukladno D. Hanahan /J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983)/. Od dobivenih vrsta otpornih na ampicilin odabere se jedna koji sadrži plazmid označen s ptPAL sa 177 bp HindIII-BgIII fragmentom, kao što je vidljivo kod restrikcijske analize. 0,1 µg tog plazmida reže se u 16 µl sa 16 U HgIII, kao što preporuča proizvođač 1,5 sata pri 37°C. Zatim se k toj otopini doda 20 U goveđe crijevne alkalne fosfataze (Boehringer Mannheim) i nastavi inkubaciju još 30 minuta, nakon čega se DNA ekstrahira dva puta s fenolom, dva puta s kloroformom i precipitira nakon dodatka 0,1 volumena 3,0 M natrijevog acetata pH 5,2 i 0,6 volumena izopropanola, otopi se u TE, čisti dalje elektroforezom na agaroznom gelu, kao što je gore opisano, dva puta se ekstrahira s fenolom, dva puta s kloroformom, precipitira pri -20°C nakon dodatka 2, 5 volumena etanola i 0,1 vol. 3M natrijevog acetata pH 5, 2 i konačno otopi u 30 µl TE. 2,1 kb tPA BglII fragment se zatim izreže iz 5 µg pW349F u 25 µl reakcije upotrebom 20 U BrlII 2 sata pri 37°C, očisti se na 0,8%-tnom agaroznom gelu, eluira elektroforezom, kao što je opisano gore, ekstrahira dva puta s fenolom, dva puta s kloroformom, precipitira pri -20°C nakon dodatka 2,5 volumena etanola i 0,1 vol. 3 M natrijevog acetata pH 5,2 i otopi pri koncentraciji 8 ng/µl u TE. 1 µl t-PA fragmenta vežemo zatim u 10 µl reakcije na 7,5 ng BgIII rez vektorske DNA upotrebom 100 U T4 ligaze (Biolabs) 17 sati pri 16°C i zatim se transformira u E.coli. Jedan od izlaznih klonova, označen s pDO2, sadrži t-PA BgIII fragment, uključen na takav način da sadrži plazmid kontinuirano otvoren čitajući okvir za humani t-PA.

B) Kombinacija t-PA cDNA s fragmentom beta-globina

Plazmid pDO10 (slika 10) konstruira se povezivanjem triju fragmenata DNA: (i) 2,1 kb fragment, koji započinje s HindIII mjestom i završava s BglII mjestom, te sadrži cjelokupan t-PA kodni slijed izoliran iz agaroznog gela, na kojeg se stavi 10 µg pDO2 DNA djelomično rezane s BglII i potpuno s HindIII. (ii) pUB je plazmid koji sadrži zečji gen beta-globina /A. Van Ooyen et al., Science 206, 337 (1979)/, subkloniran kao BgIII djelomični probavak u BamHI mjestu plazmida pUC9 /J. Vieira and J. Messing, Gene 19, 259-268 (1982); ibid. 19, 269-276 (1982)/. Iz tog plazmida izreže se 1,2 kb BamHI-HindIII fragment koji sadrži drugi intron i poliadenilacijsko mjesto i očistimo ga elektroforezom na agaroznom gelu. (iii) Vektor pDO1 je ugrađen u smjeru suprotnom kazaljkama na satu, iz Hind III mjesta (slika 10) HindIII-AccI fragmenta pBR322, koji uključuje začetak podvajanja, 0,3 kb fragmenta koji sadrži uvečivač humanog citomegalovirusa (HCMV), koji završava u sintetičkom XbaI mjestu i iza njega slijedi druga kopija tog uvečivača, pričvršćenog na homologni promotor, koji se završava na sintetičkom HindIII mjestu. Taj vektor DNA režemo s HindIII i 6,3 kb linearni plazmid očistimo elektroforezom na agaroznom gelu.

C) Umetanje tPA/globin kombinacije u pSP62Pst33 (vidi sliku 11)

pSP62Pst33 (slika 11) je plazmid koji sadrži 2,1 kb PstI fragment DNA citomegalovirusa (MCMV), koji uključuje virusni, neposredni rani (IE) promotor, umetnut u PstI mjesto plazmida pSP62 (Boehringer Mannheirn), kao što je naznačeno na slici. U HindIII mjesto pSP62Pst33 umetnut je HindIII fragment pDl0. Odabran je plazmid pCGA26 u kojem je t-PA kodni slijed umetnut tako da se može prepisati u "smislenoj" orijentaciji od MCMV IE promotora.

D) Umetanje MCMV/tPA/globin jedinice u pFASV2911neo (vidi sliku 12)

Plazmid pSV2911neo /F. Asselbergs et al., J. Mol. Biol. 189, 401-411 (1986)/ sadrži neomicin (neo) fosfo-transferazni gen iz transpozona TN5 i SV40 ekspresijskoj kazeti (slika 12). Uveden u stanice kulture tkiva sisavaca on podaje otpornost prema neomicinu i kanamicinu. pSV2911neo DNA pripremi se za kloniranje rezanjem s BaMHI obradom s govedom crijevnom alkalnorn fosfatazom, dvjema ekstrakcijama s fenolom, dvjema s kloroformom, precipitacijom s alkoholom i konačno se otopi u TE. Plazmid pCGA26 režemo s restrikcijskim enzimom AccI, koji reže slijed GT/ACAC na položaju 345 u području MCMV uvečivač/promotor /K. Doersch-Haessler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 8325-8329 (1985)/ i slijed GT/CGAC (može se rezati također sa SaII) iza globinskog dijela. Preko stršećih ostataka iz dviju baza, koji izlaze nakon rezanja, popuni se s E.coli (velik fragment) DNA polimerazom I, sada se tupe krajeve poveže s BamHI linkerima (CGGATCCG) i njih režemo s BamHI enzimom. 3,8 kb fragment koji nosi MCMV/tPA/globin jedinicu, sada s krajevima BamHI, očistimo preko agaroznog gela i zatim povežemo na pSV2911neo DNA, dobivenu kao što je gore opisano, da dobijemo ekspresijski plazmid pCGA28.

E) Ekspresijski vektori izvedeni od pCGA28

pCGA42 je izvedenica pCGA28, u kojoj je neo kodni slijed (između BgIII mjesta i SmaI mjesta) nadomješten s kodnim slijedom gena otpornog na higromicin. To se postiže (vidi sliku 13) rezanjem plazmida pSV2911neo na njegovom jedinom SmaI mjestu, povezivanjem BglII linkera (CAGATCTG) na DNA, slijedi rezanje s BgIII. Izlazni veliki DNA fragment, .koji se sastoji od vektora minus neo kodni niz, čistimo na agaroznom gelu i povežemo na manji BamHI fragment iz plazmida pLG89 /L. Gritz et al., Gene 25, 179-188 (1983)/, jednako očišćenom na agaroznom gelu, i vodimo ga u. plazmide pCGA25c i pCGA25d, koji sadrže higromicin fosfotranferazni gen u smislenoj prema nesmislenoj orijentaciji. Ako se tranficira u CHO DUKXB1 stanice pod standardnim uvjetima (vidi primjer 16), dade pCGA25C 60 kolonija/µg DNA otpornih na 0,2 µg/ml higromicina B, koncentracija koja ubije CHO stanice, koje sadrže plazmid, koji ne kodira higromicin otpornosti, npr. pCGA28. U pCGA25c se sljedovi koji kodiraju higromicin-B otpornosti nalaze tako da se u E.coli prepisuju od Tn5 promotora (koji u transpozonu Tn5 prepiše gen otporan prema kanamicinu). Tako 2,5 ml kulture Luria broth (LB), koja sadrži 40 mg/1 higromicina-B, inokulirane s 0,05 ml, uzgojene preko noći, tj. zasićene kulture E.coli DH1 bakterije (koja raste pod 50 mg/1 amicilinskom selekcijom) postiže nakon 3 sata izlaganja zraku pri 37°C najmanje deseterostruko veću gustoću bakterija, nego kad se bakterije ispituju s plazmidima, koji ne sadrže higromicinski gen, koji djeluje u E.coli, kao pCGA25d, pCGA2B ili pAT153 /A.J. Twigg et al., Nature 283, 216-218 (1980)/. Funkcionalnost gena otpornog na higromicin-B u obje, u stanicama kulture životinjskog tkiva i u E.coli, jako olakšava upotreba plazmida pCGA2Sc i njegovih izvedenica. Plazmid pCGA42 konstruiramo zatim umetanjem BamHI fragmenta iz pCGA28, koji sadrži MCMV/t-PA/beta-globin kazetu u pCGA25c. On se upotrebljava da prenesemo t-PA izražavajući gen u stanice koje ne možemo transformirati otporne prema geneticinu ili koje su već otporne na geneticin. Također pCGA42 je sposoban za ekspresiju svojeg higromicinskog gena u E.coli, koju dopušta pCGA42, koji sadrži E.coli DHl, da raste do gustoće od najmanje deseterostruko veće nego npr. E.coli koja sadrži pCGA2B, ako se ispita kao što je gore opisano.

Plazmid pCGA2B sadrži dva SacI mjesta, jedno u začetku linkera neposredno iza MCMV promotora, a drugo u t-PA cDNA. Slijed između SacI mjesta izbrisan je najprije rezanjem s restrikcijskim enzimom, čišćenjem fragmenta preko agaroznog gela i cirkularizacijom te linearne DNA upotrebom T4 DNA ligaze, koja tvori plazmid pCGA44 (vidi sliku 12). Svaka cDNA, klonirana u pravilnoj orijentaciji u sada jedinom SacI mjestu pCGA44, učinkovito nadomješta t-PA kodni slijed u pCGA28 i učinkovito je izražena.

pCGA42d je izveden iz pCGA42 uništenjem 1,4 kb SacI fragmenta (vidi sliku 13). U sada jedinom ScaI mjestu cDNA možemo umetnuti kao t-PA cDNA i on se izražava na visokim razinama u stanicama kulture tkiva.

Primjer 5

Umetanje cDNA, u-PA, t-PA i hibridnog PA u ekspresijski vektor pCGA2B

A) Umetanje t-PA cDNA (vidi sliku 15)

U toj konstrukciji umetnemo t-PA cDNA fragment iz plazmida ph.tPAΔScaI, i ta konstrukcija služi kao kontrola za svaku promjenu koja bi se mogla neprimjetno desiti tijekom restrukturiranja ScaI mjesta. 1,4 kb SacI fragment dobije se iz plazmida nakon ph.tPAΔScaI probave. Ekspresijski vektor pCGA28 također cijepamo sa ScaI i 8,2 kb vektorski fragment se izolira i defosforilizira u 100 µl reakcijske smjese koja sadrži 0, 1 mM Tris pH 8, 0, 0, 1% SDS i 0,02 jedinice bakterijske alkalne fosfataze. Nakon inkubacije. 30 minuta pri 60°C reakcijsku smjesu ekstrahiramo dva puta s fenolom i eterom i zatim precipitiramo s etanolom. Talog se otopi u vodi i njegov alikvot se upotrebljava za povezanje na 1,4 kb SacI fragmente iz ph.tPA ScaI. Smjesu za vezanje upotrebljavamo za transformaciju E.coli HB101, i minimizirana DNA, pripremljena iz kolonija otpornih na ampicilin probavi se s prikladnim restrikcijskim, da se utvrdi jeli ScaI uključen u željenoj orijentaciji. Plazmid koji ima željenu orijentaciju nazivamo pBRlA. Plazmid sa ScaI fragmentom suprotne orijentacije nazvan je pBRlB.

B) Umetanje hibridne UPAATPAB cDNA (vidi sliku 16)

U toj konstrukciji umećemo hibridni UPAATPAB cDNA fragment iz plazmida pUNC.tc u ekspresijski vektor pCGA28. pUNC.tc DNA se probavi sa SmaI (usporedi sliku 7), 1,24 kb fragment se izolira i poveže na SacI probavljenu, defosforiliziranu 8,2 kb pCGA2B vektorsku DNA. E.coli HB101 stanice tranformiramo s mješavinom za povezivanje i kolonije koje sadrže SacI uključak u željenoj orijentaciji identificiramo tako da napravimo restrikcijske probavke na miniliziranoj DNA. Plazmid s pUNC.tc DNA uključkom u željenoj orijentaciji označen je s pBR2A, a onaj suprotne orijentacije s pBR2B.

C) Umetanje u-PA cDNA tvidi sliku 17

U toj konstrukciji umećemo humanu u-PA DNA u ekspresijski vektor pCGA28 i zajedno s pBRI taj plazmid služi kao roditeljska plazmidna kontrola i potvrđuje upotrebljivost vektora vrste pCGA28... Plazmid pcUK176 probavi se sa SmaI, AhaIII (usporedi sliku 4), 2,25 kb fragment izoliramo i vežemo na fosforiliran SacI linker. kao što je gore opisano. Nakon SacI probave dobijemo 2,25 kb fragment i vežemo na SacI probavljen defosforiliran 8,2 kb pCGA2B DNA fragment. E.coli HB101 se transformira i kolonije koje čuvaju željeni plazmid identificirarno probavom minilizirane DNA s restrikcijskim enzimima.

Plazmid s humanom u-PA DNA pravilne orijentacije označen je s pBR23A, a onaj suprotne orijentacije s pBR3B.

D) Umetanje hibridne TPAAUPAB cDNA (vidi sliku 18)

Umećemo hibridnu TPAAUPAB cDNA iz plazmida ptNC.UC u ekspresijski vektor pCGA28. 2,75 kb SmaI (prisutan u vektoru), AhaIII fragment izoliramo iz ptNC.UC DNA, vežemo na fosforilirani ScaI linker, linker veže 2,75 kb fragment i vezan na SacI probavljen, defosforiliran vektor DNA i željene kolonije identificiramo kao što je gore opisano. Plazmid s ptNC.UC DNA uključkom pravilne orijentacije nazivamo pBR4A.

Primjer 6

Konstrukcija ekspresijskog vektora kvasca, koji sadrži promotor pHO5, invertazni signalni slijed i t-PA kodno područje

A) Sinteza oligodezoksiribonukleotida za invertazni signalni slijed:

Četiri oligodezoksiribonukleotida: I-l, I-2, I-3, I-4 sintetiziramo s DNA sintetizatorom (model 380B Applied Biosystems). Nakon deblokiranja sintetičke fragmente očistimo na 12%-tnom poliakrilamidnom gelu koji sadrži 8 M ureu. Bez soli, čiste oligodezoksiribonukleotide dobijemo upotrebom Sep. Pak (Waters Associates). Ti fragmenti predstavljaju dvojni heliks, koji kodira invertazni signalni slijed sa često upotrijebljenim kodonima kvasca.

HindIII

EcoRI,.:MetLeuLeuGlnAlaPheLeuPheLeuLeu

I-1. 5'AATTCATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTT 3'

I-2 3'GTACCAAAACGTTCGAAAGGAAAAGGAAAACCGAC 5'

AlaGlyPheAlaAlaLysIleSerAla

I-3 5'GGCTGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCATCTTAGCGTC 3'

I-4 3' CAAAACGTCGGTTTTATAGACGTAGAATCGCAGAGCT 5'

Hga I

XhoI

B) Subkloniranje invertaznog signalnog slijeda u plazmidu p31

a) Priprava vektora:

1,5 µg p31R/SS-TPA 2 (Europska patentna prijava br. 143,081) probavi se sa 10 U EcoRI (Boehringer) u 50 µl 10 mM Tris-HCl pH 7, 5, 6 mM MgCl2, 100 mM NdCl, 6 mM merkaptoetanola 1 sat pri 37°C. Nakon dodatka 1 µl 2,5 M NaCl doda se 10 U XhoI (Boehringer) i inkubira jedan sat pri 37°C. 4, 2 kb vektor izolirarno na 0,8 % preparativnom agaroznom gelu. Režanj gela prenesemo na cijev Micro Collodor (Sartorius GrnbH), prekrivenu s 200 µl TE i elektroeluiramo (elektroforezom 50 minuta pri 90 mA). Skupimo TE otopinu i precipitiramo u 2,5 volumena apsolutnog etanola nakon dodatka 0,1 volumena 10 x TNE. DNA talog se ispere s 80%-tnim etanolom i osuši u vakuumu. DNA se resuspendira u 6 µl TE (40 pmola/µl).

b) Renaturiranje (annealing) oligodezoksiribonukleotida (I-l, I-2, I-3, I-4), kinacija i vezanje s vektorom

Otopinu koja sadrži 10 pmola svakog od četiri dezoksiribonukleotida u 10 µl 0,5 M Tris-HCl pH 8, inkubiramo 90 minuta pri 95°C na vodenoj kupelji. Vodenu kupelj polako ohladimo kroz 5 sati do 30°C. K toj renaturacijskoj mješavini dodamo 2 µ1 svakog od 0,1 M MgCl2, 0,1 M NaCl, 30 mM DTT, 4 mM ATP i 8 U (1 µl) polinukleotid kinaze (Boehringer). Kinacija se odvija jedan sat pri 37°C. Renaturirane, kinazirane oligodezoksi-ribonukleotide i 60 pmolova p31R/SS-TPAΔ2 rezanog vektora (1,5 µl) povežemo sa 400 U (1 µl) T4 DNA ligaze (Biolabs) 17 sati pri 14°C. Reakciju se zaustavi inkubacijom 10 minuta pri 65°C. 10 µl te vezne mješavine upotrebljavamo za transformiranje E.coli HB101 Ca++ stanica /M. Dagert and S.D. Ehrlich, Gene 56, 23-28 (1979)/. Odaberemo 20 ampR kolonija. DNA pripremimo brzim izolacijskim postupkom (D.S. Holmes and M. Quigley, Anal. Biochem. 114, 193-197 (1981)/. DNA se probavi s EcoRI i XhoI, radiomarkira na EcoRI kraju i analizira na 6%-tnorn poliakrilamidnorn gelu, koji sadrži 8 M ureu, upotrebom radiomarkirnog pBR322 HaeIII reza DNA, kao markera. Vide se pojasevi pravilne veličine za DNA, dobivene iz svih 20 klonova. Jedan klon raste u 100 ml LB medija, koji sadrži 100 µg/ml ampicilina. Plazmid DNA izoliramo i označavamo kao p31RIT-12.

C) Konstrukcija pJDB207/PHO5-I-TPA (vidi sliku 19)

a) Priprava vektora:

Tri µg pJDB207/PHO5-TPA18 (Europska patentna prijava br. 143,081) inkubiramo jedan sat pri 37°C s 10 U BamHI u 50 µl 10 mM Tris-HCl pH 7, 5, 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanola. Alikvot pregledamo na 1%-tnom agaroznom gelu u TBE puferu da potvrdimo potpuno probavu. Probavak inkubiramo 10 minuta pri 65°C. Zatim dodamo 0,5 µl 5 M NaCl, zatim 15 U XhoI (Boehringer). To se inkubira jedan sat pri 37°C. 6,8 kb vektor izoliramo na 0,8% preparativnom agaroznom gelu. DNA ekstrahiramo elektroeluiranjem i nakon precipitacije otopimo u TE.

b) XhoI probvak p31/PHO5-TPA18:

30 ELg p31/PH05-TPA 18 (Europska patentna prijava br. 143,081) inkubirarno jedan sat pri 37°C sa 60 U XhoI (15 U/µl) u 200 µl 10 mM Tris-HCl pH 8, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanola, ekstrahiramo s jednakim volumenom fenolkloroforma i precipitiramo u etanolu.

c) Djelomični PstI probavak XHOII reza p31/PHO5-TPA18

Precipitirani .aXhoI rez p31/PHO5-TPA18 DNA resuspendiramo u 250 µl 10 mM Tris-HCl pH 7, 5, 6 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanola, 2,5 mg homidijevog bromida, inkubiramo 35 minuta pri 37°C sa 22,5 U.PstI i ekstrahiramo s jednakim volumenom fenola i zatim s jednakim volumenom kloroform-izoamilalkohola (50:1). 1,6 kb fragment izoliramo na 1% preparativnom agaroznom gelu. DNA ekstrahiramo elektroeluiranjem i precipitiramo (uključak 1).

d) SalI-XhoI probavak p31RIT-12:

Trideset µg p31RIT-12 inkubiramo jedan sat pri 37°C s 60 U SaII (Boehringer 12 U/µl) i 60 U XhoI (15 U/µl) u 200 µl 10 mM Tris-HCl pH 8, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanola, ekstrahiramo s jednakim volumenom fenol-kloroforma i precipitiramo u etanolu. 869 bp fragment izoliramo na 1,2 % preparativnom agaroznom gelu. DNA ekstrahiramo elektroeluiranjem, odsoljenim preko DE-52, i precipiriramo u etanolu.

e) Hgal probavak Sa1I-XohI reza p31RIT-12

SalI-XhoI rez p31RIT-12 resuspendiramo u 100 µl 6 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM ditiotrietola, 10 mg goveđeg serum albumina i inkubiramo jedan sat pri 37°C s 6 U HgaI (Biolabs, 0, 5 U/µl). 600 bp fragment izoliramo na 1,2 % agaroznom gelu. DNA ekstrahiramo elektroeluiranjem i precipiriramo u etanolu.

f) Renaturiranje veznih oligonukleotida

90 pmola dviju oligodezoksiribonukleotida koji imaju slijed

HgaI PstI

5' CTGCATCTTACCAAGTGATCTGCA 3'

3' AGAATGGTTCACTAG 5'

suspendira se u 10 µl 0,5 mM Tris-HCl pH 8 u silikoniziranoj Eppendorfovoj epruveti. Otopinu se inkubira 5 minuta pri 95°C i zatim polako kroz noć ohladi na sobnu temperaturu.

g) Kincija linkera

Gornjoj otopini dodamo 2 µl 0,1 M KCl, 2 µl 0,1 M MgCl2, 3 µl 30 mM DTT, 1 µl 200 mM ATP, 8 U polinukleotida (8 U/µl). To se inkubira jedan sat pri 37°C.

h) Vezanje HgaI fragmenta iz p31RIT-12 s kinaziranim,

Otopinu kinaziranog linkera prenesemo u epruvetu koja sadrži suhi HgaI fragment i dodamo 400 U T4 DNA ligaze. Otopinu inkubiramo 90 minuta pri sobnoj temperaturi (21 do 22°C). razrijedimo na 100 µl s TE i ekstrahiramo s jednakim volumenom fenol/kloroforma. Fragment precipitiramo dodatkom 0,6 volumena izopropanola i 0,1 volumena 3 M natrijevog acetata k otopini pri sobnoj temperaturi.

i) BamHI-PstI probavak gornjega

Gornja suha DNA probavlja se u 10 U BamHI i 10 U PstI u 20 µl 10 mM Tris-HCl pH 7, 5, 100 mM MgCl2, 6 mM merkaptoetanola jedan sat pri 37°C. Nakon razrjeđenja na 100 µl otopinu se ekstrahira s jednakim volumenom fenol/kloroforma i vodeni sloj se precipitira u izopropanolu (uključak 2).

j) Povezivanje triju fragmenata

100 fmolova pJDB207/PHO5-TPA18 BamHI-XhoI reza vektorskog fragmenta, 200 fmolova svakog od druga dva umetnuta fragmenta (1 i 2) vežemo u 10 µl 50 mM Tris-HCl pH 7, 5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 µg želatine sa 400 U T4 DNA ligaze 16 sati pri 15°C. Reakciju se zaustavi inkubiranjem 10 minuta pri 65°C. 5 µl te vezne mješavine upotrebljava se za transformiranje stanica E.coli HB101 CA++. 10 ampR kolonija pobere se i DNA se pripremi po brzom postupku izolacije. Kod analize s EcoRI, PstI i BamHI-HindIII vidimo fragmente pravilne veličine. Jedan klon raste u 100 ml LB medija, koji sadrži 100 µg/ml ampicilina. Plazmid DNA izoliramo i imenujemo kao pJDB 207/PHO5-I-TPA.

Primjer 7

Konstrukcija plazmida pC516/UPA koji obuhvaća kodno područje u-PA

A) Konstrukcija plazmida pCS16 (vidi sliku 20)

1,5 kb PstI-BamHI fragmet plazmida pUN121 /B. Nilsson et al., Nucl. Acids Res. 11, 8019-8030 (1983)/ koji obuhvaća cI gen faga lambda i dio gena otpornog na tetraciklin kloniramo u pUC18 /J. Norrander et al., Gene 26, 101-106 (1983)/, režemo sa PstI i BamHI. Dobiveni klon, se probavi s PstI. Krajeve koji vise preko 3’ uklonimo u reakciji s T4 DNA polimerazom i XhoI linkere vežemo na tupe krajeve. Nakon probave sa XhoI molekulu povezivanjem opet promijenimo u kružni oblik. Alikvot vezne mješavine upotrijebi se za tranformaciju Ca++ obrađene E.coli HB101 stanice. Analiziramo DNA pojedinačnih, tranformiranih kolonija otpornih na ampicilin. Odabiremo jedan od više klonova i imenujemo kao pCS16.

B) Konstrukcija plazmida pCS16/UPA (vidi sliku 21)

Urokinaznu cDNA, koja se nalazi u plazmidu pcUK176 (vidi primjer 2), subkloniramo u plazmidu pCS16. Subklonirana cDNA doseže od mjesta SmaI u području 5 neprobavljenom području (slika 4) do mjesta PvuII kod položaja nukleotida 1439-1444 u 3 neprobavljenom području (brojčane oznake u skladu sa slikom 3).

15 µg plazmida pcUK176 se probavi s PvuII. 379 bp PvuII fragment se izolira od drugih fragmenata na 1,5 % agaroznom gelu u Tris-boratnom EDTA puferu pH 8,3. DNA elektroeluiramo, čistimo s DES2 (Whatman) kromatografijom ionske izmjene i precipitiramo s etanolom. 1,2 µg jednovlaknastih XhoI linkera (5’-CCTCGAGG-3’) fosforiliramo na 5’ krajevima, grijemo 10 minuta pri 75°C, tijekom hlađenja na sobnu temperaturu sami se renaturiraju i pohranimo pri -20°C. 0,9 µg kinaznih, dvostruko vlaknastih XhoI linkera vežemo pri 80-strukom molarnom suvišku na tupe krajeve 379 bp PvuII fragmenta pcUK176 (vidi gore) u 20 µl 60 Tris-HCl pH 7, 5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3, 5 mM ATP i 400 jedinica T4 DNA ligaze (Biolabs) 16 sati pri 15°C. Mješavinu grije 10 minuta pri 85°C. Suvišak veznih molekula ukloni se precipitacijom s 0,54 volumena izopropanola u prisutnosti 10 mM EDTA i 300 mM natrijevog acetata pH 6,0, 30 minuta pri sobnoj temperaturi. DNA se probavi sa XhoI i BamHI. 121 bp BamHI-XhoI fragment izoliramo na 1,5% agaroznom gelu u Tris-borat-EDTA puferu pH 8,3. 6 µg plazmida pcUK176 se probavi sa SmaI i BamHI. Izoliramo 1,3 kb SmaI-BamHI fragment koji obuhvaća većinu u-PA kodnog slijeda. 6 µg plazmida pCS16 se probavi sa SmaI i XhoI. Izoliramo 2,7 kb vektorski fragment. DNA fragmente elektroeluiramo iz gela i precipitiramo s etanolom. 0,2 pmolova 1,3 kb SmaI-BamHI fragmenta, 0,2 pmolova 121 bp BamHI-XhoI fragmenta (oba fragmena zajedno obuhvaćaju cjelokupni u-PA kodni slijed) i 0, 1 pmol 2, 7 kb vektorskog fragmenta povežemo u 10 µl 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP i 400 jedinica T4 DNA ligaze pri 15°C. Jedno i 3 µl-ske alikvote vezne mješavine dodamo k 100 µl Ca++ obrađenih E.coli HB101 stanica. Transformiranje se odvija kao što je opisano /A. Hinnen et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)/. 12 kolonija otpornih na ampicilin raste u LB mediju koji sadrži 100 ml/1 ampicilina. DNA izoliramo prema Holmes et al., Anal. Biochem. 114, 193 (1981) i analiziramo nakon EcoRI, PvuII i Xhol restrikcijske probave. Jedan klon s očekivanim restrikcijskirn fragmentima zovemo pCS16/UPA.

Primjer 8

Konstrukcija plazmida pJDB207/PHO5-I-UPA (slika 22)

pJDB2O7/PHO5-I-UPA sadrži PHO5 promotor, invertazni signalni slijed, kodni slijed zrele urokinaze i PHO5 prepisni terminator u nizu, raspoređene jednog za drugim, klonirano u pJD8207 ekspresijskom vektoru kvasca.

20 µg plazmida pCS16/UPA probavi se do kraja sa 40 jedinica EcoRI. Nakon fenolne ekstrakcije i etanolne precipitacije sa DNA probavljenu s EcoRI režemo dalje s TaqI pri 65°C. Dobivene fragmente odvajamo na preparativnom 1,2% agaroznom gelu. 462 bp TaqI-EcoRI fragment izoliramo elektroeluiranjem iz gela i precipitiramo s etanolom.

Oligodezoksiribonukleotidni linker formule

(I) 5'-CTGCAAGCAATGAACTTCATCAAGTTCCAT-3'

(II) 3'-TCGTTACTTGAAGTAGTTCAAGGTAGC-5'

vežemo na TaqI mjesto fragmenta DNA. Linker obnavlja 5’ kraj kodnog slijeda zrelog u-PA (nukleotidi 130-154, slika 3) i uvodi fuziju u okviru s invertaznim signalnim slijedom. 5’-CTGCA slijed linkera popunjava odgovarajući 3 izgubljeni dio invertaznog signalnog slijeda, dobivenog cijepanjem s HgaI.

300 pmolova svakog od oligodezoksinukleotida I i II fosforiliramo i renaturiramo. 5,25 µg (600 pmolova) fosfolirane dvostruko-vlaknaste vezne DNA vežemo na 1,7 µg (5,6 pmolova) 462 bp TaqI-EcoRI fragmenta (vidi gore) u 175 µl 60 mM TriS-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 5 mM DTT i 800 jedinica T4 DNA ligaze 16 sati pri 15°C. T4 DNA ligazu inaktiviramo 10 minuta pri 85°C. Suvišak linkera ukloni se precipitacijom u prisutnosti 10 mM EDTA 300 mM natrijevog acetata pH 6,0 i 0,54 volumena izopropanola. DNA se probavi s PstI. Izolira se jedini 312 bp fragmenti koji sadrži linker, pričvršćen na DNA slijedu, koji kodira u-PA do nukleotida 436 (PstI mjesto, vidi sliku 3). DNA fragment očistimo elektroeluiranjem i precipitacijom s metanolom.

Plazmid pCS16/UPA probavi se sa XhoI i PstI. 1007 bp PstI-XhoI fragment izoliramo i očistimo. Taj fragment sadrži većinu kodnog slijeda za urokinazu.

Plazmid p31RIT-12 (vidi primjer 6B) probavi se sa Sa1I i XhoI. 882 bp Sa1I-XhoI fragment izoliramo iz gela elektroeluiranjem i etanolnom precipitacijom. Fragment se nadalje probavi s BamHI i HgaI. Izoliza se 591 bp BamHI-Ggai fragment, koji sadrže PHO5 promotorsko područje i invertazni signalni slijed.

Plazmid pJDB207/PHO5-TPA 18 (vidi europsku patentnu prijavu br. 143,081) probavi se s BamHI i XhoI. 6,8 kb vektorski fragment izoliramo na preparativnom 0,6 % agaroznom gelu u Tris-acetatnom puferu, pH 8,2. DNA elektroeluiramo i precipitiramo s etanolom.

Sve DNA fragmente resuspendiramo u vodi pri koncentraciji 0,1 pmol/µl. 0,2 pmola 591 bp BamHI-HgaI fragmenta, 0,2 pmola 312 bp HgaI-PstI fragmenta, 0,2 pmola 1007 bp PstI-XhoI fragmenta i 0, 1 pmola 6, 8 kb BamHI-XhoI vektorskog fragmenta vežemo 15 sati pri 15°C u 10 µl 50 mM Tris-HCl pH 7, 5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1mM ATP i 400 jedinica .T4 DNA ligaze. Jednu µl vezne mješavine upotrebljavamo za transformiranje E.coli HB101 Ca++ stanica. 12 ampR kolonija pokupimo i uzgajamo u LB mediju, koji sadrži 100 mg/1 ampicilina. DNA pripremimo brzim postupkom izolacije /D.S. Holmes et al., Anal. Biochem. 114, 193 (1981). Na restrikcijskim probavcima plazmida DNA s HindII i EcoRI vidimo očekivane restrikcijske fragmente. Odabiremo plazmid DNA pojedinačnog klona i imenujemo ga kao pJDB207/PHO5-I-UPA.

Primjer 9

t-PA/u-PA hibridni plazminogeni aktivator s t-PA domenama A-lanca i u-PA B-lanca (primarna DNA konstrukcija)

Drugi pristup konstrukciji u okviru fuzije DNA slijedova koji kodiraju A-lanac t-PA i B-lanac u-PA u prethodno određenom položaju, sastoji se od dva stupnja: Prvo, povežemo odgovarajuće restrikcijske fragmente s kodnim sljedovima. DNA pripremimo u E.coli i subkloniramo u M13 da dobijemo jednovlaknate šablone (template). U drugom stupnju suvišak nukleotidnih sljedova uklonimo mutagenezom in vitro. Točna, uokvirena sveza između t-PA A-lanca i u-PA B-lanca je na aktivacijskom mjestu. Mutiranu DNA subkloniramo u prikladnom ekspresijskom vektoru za kvasac i stanične linije sisavaca.

a) Izolacija DNA fragmenta koji kodira t-PA A-lanca:

10 µg plazmida pJDB207/PHO5-I-TPA (vidi primjer 6) dobije se s BamHI i PvuII. 1,7 kb BamHI-PvuII fragment odvajamo na 0,8% agaroznom gelu u tris-borat-EDTA puferu, pH 8,3. DNA fragment sadrži PHO5 promotor, invertazni signalni slijed i kodni slijed zrelog t-PA do PvuII restrikcijskog mjesta (usporedi sliku 1; položaji nukleotida 1305-1310). DNA se elektroeluira, precipitira s etanolom i resuspendira u H2O pri koncentraciji 0,1 pmola/µl.

b) Izolacija DNA fragmenta koji kodira u-PA B-lanca

Plazmid pCS16/UPA (vidi primjer 7B) probavi se sa BaIII (usporedi slike 3 i 4, položaje nukleotida 573-578) i XhoI. 868 bp BaII-XhoI fragment izoliramo kao gore i resuspendiramo u vodi pri koncentraciji 0,1 pmol/µl.

c) Povezivanje fragmenata na vektorski fragment

Plazmid pJDB207/PHO5-TPA 18 (Europska patentna prijava br. 143,081) probavi se s BamHI i XhoI. 678 kb vektorski fragment izoliramo na preparativnom 0,8 % agaroznom gelu u Tris-acetatnorn puferu, pH 8,2. DNA elektroeluiramo i precipitiramo s etanolom i resuspendiramo u vodi pri koncentraciji 0,1 pmol/µl.

0,2 pmola 1,7 bp BamHI-HgaI fragmenta, 0,2 pmola 868 bp BalII-XhoI fragmenta i 0,1 pmola 6,7 kb BamHI-XhoI vektorskog fragmenta vežemo 16 sati pri 15°C u 10 µl 60 mM Tris-HCl pH 7, 5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1mM DTT, 3, 5 mM ATP i 400 jedinica T4 DNA ligaze (Biolabs). Jedno i 3 µl-ske alikvotne mješavine dodamo k 100 µl stanica E.coli HB101 obrađenih sa Ca++. Transformiranje se provodi kao obično.

Šest transformiranih kolonija otpornih na ampicilin raste u mediju LB koji sadrži 100 mg/l ampicilina. Plazmid DNA pripremimo metodom po Holmesu et al.,/Analyt. Biochem. 114, 193 (1981)/ i analiziramo nakon restrikcijskih probava s BamHI -i PstI. Odabiremo jedan klon s očekivanim restrikcijskim fragmentima i imenujemo ga kao pJDB207/PHO5-TPAAUPAB.

Primjer 10

u-PA/t-PA hibridni plazminogeni aktivator s domenama u-PA A-lanca i t-PA B-lanca (primarna DNA konstrukcija)

Primarna hibridna DNA konstrukcija obuhvaća u-PA nukleotidne sljedove od SmaI mjesta do EcoRI mjesta (vidi sliku 4) vezane na t-PA nukleotidne slijedove od ScaI mjesta (položaji 940-945) do XhoI mjesta, uvedena na položaju 1800 preko XhoI linkera. Izlazni sljedovi hibridne DNA sadrže suvišak nukleotida koje uklanjamo mutagenezom in vitro. Točna, uokvirena Sveza u-PA A-lanca i t-PA B-lanca nalazi se na aktivacijskom mjestu.

a) Izolacija DNA fragmenta koji kodira u-PA A-lance:

7 N.g plazmida pCS16/UPA probavi se s EcoRI. Ljepljive krajeve dobivenih 3 fragmenata pretvorimo u tupe krajeve reakcijom umetanja sa 7,5 jedinicama Klenowe DNA polimeraze (BRL) u prisutnosti 60 mM Tris-HCl pH 7, 5, 10 mM MgCl2, 0, 1 mM dATP i 0,1 mM dTTP 30 minuta pri 25°C. Reakciju zaustavimo dodatkom EDTA u konačnoj koncentraciji 12,5 mM. DNA se dalje probavi s KpnI. Fragment 619 bp KpnI s tupim (EcoRI) krajem izoliramo na 1,5% agaroznom gelu u Trisborat-EDTA puferu, pH 8,3, elektroeluiramo i precipitiramo u etanolu.

b) Izolacija DNA fraqmenta koji kodira t-PA B-lance:

6 µg plazmida pJDB207/PHO5-TPA18 probavi se sa ScaI i XhoI. Fragment 860 bp izoliramo na 1,2% agaroznom gelu u Tris-borat-EDTA puferu, pH 8,3, elektroeluiramo i precipitiramo u etanolu.

c) Povezivanje DNA fragmenata na pUC18 izveden vektor:

5 µg plazmida pCS16/UPA (vidi primjer 7) probavi se sa KpnI i XhoI. Izlazni 2,7 kb fragment izoliramo na 0,8% agaroznom gelu u Tris-borat-EDTA puferu, pH 8,3. DNA elektroeluiramo i precipitiramo u etanolu. Sve DNA fragmente resuspendiramo u vodi pri koncentraciji 0,1 pmo1 a /µl.

0,2 pmola 619 bp Kpn-tupih krajeva u-PA fragmenata, 0,2 pmola 860 bp Scal-XhoI t-PA fragmenata i 0,1 pmola 2,7 kb KpnI-XhoI vektorskog fragmenta povežemo kao što je opisano gore (primjer 9). Ca++ obrađene E.coli HB101, stanice se transformiraju. 12 transformiranih kolonija otpornih na ampicilin raste u LB mediju koji je nadopunjen s ampicilinom (100 mg/1). DNA pripremimo prema Holmsu (vidi gore) i analiziramo nakon restrikcijskih probava s EcoRI i PstI. Pojedinačni klon s očekivanim restrikcijskim fragmentima označavamo kao pCS16/UPAA/TPAB.

Primjer 11

u-PA/t-PA hibridni plazminogeni aktivator s drugim “kringle” i katalitčkim B-lancem t-PA (primarna konstrukcija)

Gen hibridnog plazrninogenog aktivatora koji obuhvaća DNA sljedove "slične faktoru rasta" (U)-domene urokinaze, drugu "kringle" domenu (K2) t-PA i katalitički B-lanac t-PA, konstruiramo na slijedeći način: Dva DNA restrikcijska fragmenta koji kodiraju faktor rasta u-PA domene i t-PA K2 "kringle" s obzirom na e-lanac, povežemo i umetnemo u plazmid pCS16. Dobiven klon zovemo pCS16/UK2TPAB. Fragment koji sadrži sljedove koji kodiraju u-PA i t-PA subkloniramo u M13. Mutageneza in vitro odvija se na jedno-vlaknatoj DNA da se ukloni suvišak DNA sljedova kod sveze između sljedova u-PA i t-PA.

5 µg plazmida pSC16/UPA probavi se s NcoI (položaji nukleotida 326-331, vidi sliku 4). Ljepljive krajeve restrikcijskih fragmenata popunimo reakcijom s 5 jedinica Klenowe DNA polimeraze I (BRL) u prisutnosti 0,1 mM svakoga od dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 60 mM Tris-HCl pH 7, 5, 10 rnM MgCl2 u 50 µl 30 minuta pri sobnoj temperaturi. Reakciju zaustavimo dodatkom EDTA u konačnoj koncentraciji 12,5 mM. DNA precipitiramo u etanolu i dalje se probavi sa XhoI. 3 kb fragment XhoI s tupim krajem /NcoI/ izoliramo na 0,8% agaroznom gelu u Tris-borat-EDTA, ph 8,3, elektroeluiramo i precipitiramo u etanolu. Taj fragment sadrži vektor pCS16 i kodni slijed za faktor rasta u-PA domene. 10 µg plazmida pJBD207/PHO5-TPA18 (Europska patentna prijava broj 143,081) se probavi s BstXI / položaji nukleotida 577-588/. Linearni DPdA fragment s krajevima koji vise preko 3’ inkubiramo s 10 jedinica T4 DNA polimeraze (BRL) u 100 µl 33 mM Trisacetata pH 7,9, 66 mM kalijevog acetata, 10 mM magnezijevog acetata, 0, 5 mM DTT i 0,1 mg/ml goveđeg serum albumina 2, 5 min pri 37°C. Inkubaciju nastavljamo 35 minuta pri 37°C u prisutnosti 0,1 mM svakog od dATP, dCTP. dTTP, dGTP u cjelokupnom volumenu 200 µl. DNA precipitiramo u etanolu i dalje se probavlja s XhoI. Fragment 1,2 kb s tupim krajem /BStXI/-XhoI odvajamo na 0,8% agaroznom gelu, elektroeluiramo i precipitiramo u etanolu. Taj fragment ima kodni slijed za K2 i B-lanac t-PA.

0,2 pmola l,2 kb t-PA fragmenta i 0,1 pmola 3 kb u-PA7vektorskog fragmenta (vidi gore) vežemo, kao što je opisano. Alikvotne vezne mješavine upotrebljavamo za transformiranje primarnih E.coli HB101 stanica. Odabiremo kolonije otporne na ampicilin na LB pločama agara koje sadrže 100 mg/1 ampicilina. DNA pripremimo iz pojedinačnih transformanata i analiziramo nakon ScaI i SmaI restrikcijskih probava. Odabiremo klon koji sadrži 0,5 kb Scal i 1,55 SmaI vezne fragmente i imenujemo ga kao pCS16/UK2TPAB.

Primjer 12

t-PA/u-PA hibridni plazmogeni aktivator s drugim “kringle” t-PA i katalitičkim B-lancem u-PA (primarna konstrukcija)

Gen hibridnog plazminogenog aktivatora koji obuhvaća DNA slijedove "slične faktoru rasta" (U)-domene urokinaze, drugu "kringle" domenu (K2) t-PA i katalitički B-lanac u-PA, konstruiramo metodom analognom onoj koja je opisana u primjeru 11.

Konstrukcija plazmida pCS16/UK2UPAB:

5 µg plazmida pSC16/UPA probavi se s BglII i NcoI (položaji nukleotida 391-396 s obzirom na 326-331, vidi sliku 4). Ljepljive krajeve restrikcijskih fragmenata popunimo reakcijom s Klenowom DNA polimerazom I (BRL) kao što je opisano gore. 4,2 kb DNA s tupim krajevima izoliramo na 0,8% agaroznom gelu u Tris-borat-EDTA, pH 8,2. DNA elektreeluiramo i precipitiramo u etanolu. Taj fragment sadrži u-PA G-domenu i u-PA B-lanac povezane na vektorsku molekulu.

10 µg plazmida p31/PHO5-TPA18 (Europska patentna prijava broj 143,081) se probavi s AluI. 447 bp AIuI fragment koji sadrži cjelokupnu domenu t-PA izoliramo na 1,5% agaroznom gelu u Tris-borat-EDTA puferu, pH 8,3. DNA fragment elektroeluiramo i precipitiramo u etanolu.

0,2 pmola 447 kb fragmenta i 0,1 pmola 4,2 kb fragmenta. Alikvotne vezne mješavine upotrebljavamo za transformiranje primarnih E.coli HB101 stanica. Odabiremo transformirane stanice na LB agar pločama sa 100 mg/1 ampicilina. DNA pripremimo iz stanica otpornih na ampicilin i analiziramo nakon EcoRI i ScaI probava. Pojedinačni klon koji pokazuje 551 kb EcoRI fragment i 403 bp ScaI fragment ima AIuI fragment umetnut u pravilnoj orijentaciji. Taj klon nazivamo pCS16/UK2UPAB.

Primjer 13

Kloniranje primarnih hibridnih DNA konstrukcija u M13mp18

A) Kloniranje pJDB207/PHO5-I-TPAAUPAB HamHI fragmenta u M13mp18

1,5 µg pJDB207 /PHO5-I-TPAAUPAB (usporedi primjer 9) dobiven brzom DNA pripravom, probavi se s 9 U BamHI (Boehringer) u 20 µl 10 mM Tris-HCl pH 7, 5, 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanola jedan sat pri 37°C. Nakon dodatka 1 µl RNaze (Serva, 1 mg/ml), inkubacije 15 minuta pri 37°C i fenolizacije izolira se 2, 5 kb uključak na 0, 8% preparativnom agaroznom gelu. DNA se ekstrahira elektroeluiranjem i precipitira.

1 µg 31mp18 (RF) režemo sa BamHI, obradimo s telećom crijevnom alkalnom fosfatazom i izoliramo 7,3 kb vektorski fragment na 0,7% preparativnom agaroznom gelu. DNA se elektroeluira i precipitira.

100 pmolova M13mp18 BamHI rezanog vektora i 200 pmolova BamHI TPAUPAB uključka povežemo u 10 µl 50 mM Tris-HCl pH 7, 5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 µg želatine sa 400 u T4 DNA ligaze 7 sati pri 15°C. Nakon inkubacije 10 minuta pri 65°C upotrebljavamo 5 µl te vezne mješavine za transformaciju E.coli JM101 primarnih stanica prema priručniku "M13 Cloning and Sequencing Handbook", izdavač Amersham. Poberemo 36 bezbojnih plakova i pripremimo jednovlakni replikatni oblik (RF) DNA. Kod analize FR-DNA svi klonovi pokazuju uključke pravilne veličine nakon probave s BarnHI. Fragmenti pravilne veličine nakon probave s EcoRI i PstI pokazuju da su DNA uključci u svim klonovima obrnute orijentacije (jednovlaknata šablona DNA je ne-kodirajuče vlakno). Jednog od tih klona imenujemo kao mp18/BamHI/-TPAA/UPAB i upotrebljavamo ga za delecijsku mutagenezu.

B) Kloniranje pCS16/UPAA/TPAB KpnI-HindIII fragmenta u M13mp18

l,5 µg pCS16/UPAA/TPAB (usporedi primjer 10) dobiven brzom DNA pripravom, probavi se s 12 U KpnI u 20 µl 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 6 mM merkaptoetanola jedan sat pri 37°C. Nakon dodatka 1 µl 1 M NaCl DNA se probavi s 12 U HindIII jedan sat pri 37°C. Izoliramo 1,5 kb fragment na 0,8% preparativnom agaroznom gelu. DNA se ekstrahira elektroeluiranjem i precipitira.

0,5 µg M13mp18 (RF) probavi se s KpnI i HindIII . Izoliramo 7,3 kb vektorski fragment na 0,7% preparativnom agaroznom gelu. DNA se elektroeluira i precipitira.

100 pmolova M13mp18 KpnI-HindIII rezanog vektora i 200 pmolova KpnI-HindIII uključka povežemo u 10 µl 50 mM Tris-HCl pH 7, 5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 µg želatine sa 400 u T4 DNA ligaze 7 sati pri 15°C. Reakciju se zaustavi inkubacijom 10 minuta pri 65°C. 5 µl te vezne mješavine upotrebljavamo za transformaciju E.coli JM101 primarnih stanica. Poberemo 10 bezbojnih plakova i pripremimo jednovlakni replikatni oblik (RF) DNA. Kod analize RF-DNA svi klonovi pokazuju uključke pravilne veličine i pravilnu veličinu fragmenata. Jednog od tih klonova imenujemo kao mp18/KpnI-HindIII/-UPAA/TPAB i upotrebljavamo ga za................

C) Kloniranje pCS16/UK2TPAB KpnI-HindIII fragmenta u M13mp18

l,5 µg pCS16/UK2TPAB (usporedi primjer 11) dobiven iz brze DNA priprave, probavi se s 12 U KpnI (Boehringer) u 20 µl 10 mM Tris-HCl pH 7, 5, 6 mM MgCl2, 6 mM merkaptoetanola jedan sat pri 37°C. Nakon dodatka 1 µl 1 M NaCl DNA se probavi s 12 U HindIII jedan sat pri 37°C. Izoliramo 1,5 kb fragment na 0,8% preparativnom agaroznom gelu. DNA se ekstrahira elektroeluiranjem i precipitira.

0,5 µg M13mp18 (RF) probavi se s KpnI i HindIII . Izoliramo 7,3 kb vektorski fragment na 0,7% preparativnom agaroznom gelu. DNA se elektroeluira i precipitira.

100 pmolova M13mp18 KpnI-HindIII reza vektora i 200 pmolova KpnI-HindIII uključka povežemo u 10 µl 50 mM Tris-HCl pH 7, 5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0, 5 želatine sa 400 u T4 DNA ligaze 7 sati pri 15°C. Reakciju se zaustavi inkubacijom 10 minuta pri 65°C. 5 µl te vezne mješavine upotrebljavamo za transformaciju E.coli JM101 primarnih stanica. Poberemo 10 bezbojnih plakova i pripremimo jednovlaknati replikatni oblik (RF) DNA. Kod analize RF-DNA svi klonovi pokazuju uključke pravilne veličine i pravilnu veličinu fragmenata. Jednog od tih klonova imenujemo kao mp18/KpnI-HindIII/UK2TPAB i upotrebljavamo ga za delecijsku mutagenezu.

D) Kloniranje pCS16/UK2UPAB KpnI-HindIII fragmenta u M13mp18

1,5 µg pC516/UK2UPAB (usporedi primjer 12) dobiven brzom DNA pripravom, probavi se s 12 U KpnI (Boehringer) u 20 µl 10 mM Tris-HCl pH 7, 5, 6 mM MgCl2, 6 mM merkaptoetanola jedanfi sat pri 37°C. Nakon dodatka 1 µl 1 M NaCl DNA se probavi s 12 U HindIII jedan sat pri 37°C. Izoliramo 1,7 kb fragment na 0,8% preparativnom agaroznom gelu. DNA se ekstrahira elektroeluiranjem i precipitira.

0,5 µg M13mp18 (RF) probavi se s KpnI i HindIII. Izoliramo 7,3 kb vektorski fragment na 0,7% preparativnom agaroznom gelu. DNA se elektroeluira i precipitira.

100 fmolova M13mp18 KpnI-HindIII reza vektora i 200 fmolova KpnI-HindIII uključka povežemo u 10 µl 50 mM Tris-HCl pH 7, 5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 µg želatine sa 400 u T4 DNA ligaze 7 sati pri 15°C. Reakciju se zaustavi inkubacijom 10 minuta pri 65°C. 5 µl te vezne mješavine upotrebljavamo za transformaciju E.coli JM101 primarnih stanica. Poberemo 10 bezbojnih plakova i pripremimo jednovlaknati replikatni oblik (RF) DNA. Kod analize RF-DNA pokazuju svi klonovi uključke pravilne veličine i pravilnu veličinu fragmenata. Jednog od tih klonova imenujemo kao mp18/KpnI-HindIII/UK2UPAB i upotrebljavamo ga za delecijsku mutagenezu.

Primjer 14

Delecijska mutageneza primarnih hibridnih DNA konstrukcija

A) Opći protokol delecijske mutageneze

a) Fosforilacija mutantnog primjera:

Za mutanogenezu fosforiliramo 200 pmolova mutagenog primjera u 20 µl 50 mM Tris-HCl pH 7, 5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,1 Spermidina, 0,1 mM EDTA koja Sadrži 1 µl 10 mM ATP i koristi 8 U T4 DNA polinukleotid kinaze (Boehringer. 8 U/µl).Nakon inkubacije jedan sat pri 37°C reakciju se zaustavi grijanjem 10 minuta pri 65°C.

Za hibridizacijsko prekrivanje 20 pmolova mutagenog primjera fosforilira se kao gore upotrebom 30 µCi γ32-P-ATP (3000 Ci/mmol): Amersham International; kao jedini izvor ATP). Primjer razrijedimo s 3, 5 ml 6 x SSC i upotrijebimo izravno kao uzorak.

b) Renaturiranje mutagenog primjera i općeg sekventnog primjera s jednovlaknatom šablonom

0,2 pmola jedno-vlaknate šablone inkubiramo s 20 pmolova fosforiliranog mutagenog oligodezoksiribo-nukleotidnog primjera (10 pmolava/µl) i 10 pmolova općeg M13 sekventnog primjera u 10 µ1 20 mM Tris-HCl pH 7, 5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT 5 minuta pri 95°C. Pustimo da se otopina kroz 30 minuta polako ohladi na sobnu temperaturu.

c) Reakcija produljenog vezanja

Gornjoj renaturacijskoj mješavini dodamo 10 µl enzimske dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) otopine koja sadrži 1 µl pufera (0,2 M Tris-HCl pH 7,5, 0,1 MgCl2, 0,1 M DTT), 4 µl 2,5 mM dNTP mješavine, 1 µl 10 mM ATP, 0,5 µl T4 DNA ligaze (Biolabs. 400 U/µl), 0,67 µl Klenowe DNA polimeraze (BRL, 2,99 U/µl). Mješavinu inkubiramo jedan sat pri 15°C i zatim 16 sati pri 8 - 9°C. Reakciju se zaustavi inkubacijom 10 minuta pri 65°C.

d) Transformacija vezne mješavine

Veznu mješavinu razrijedimo na 1:20 i 1:200 s TE: po 1 µl i 5 µl svake od tih razrijeđenih otopina upotrebljavamo za transformiranje 0,2 ml ne-reparacijskog soja E.coli BMH 71-18mutS /BMH71-I8 (δ(lac-proAB), thi, SupE, F’laCiq, ZδM15, proA+B+/ primarnih stanica. Konstrukciju E.coli BMH71-18mutS (BMH71-18, mut S215::Tnio) opisao je Kramer sa sur. /Cell 38, 879-887 (1984)/. Nakon transfekcije stanice "trate" su oskubljene s reparacijskirn sojem E.coli JM 101 zato da se do krajnosti smanji uspostavljanje faga mutatorskom fenotipu nereparacijskih sojeva /P. Carter, H. Bedouelle and G. Winter, Nucl. Acids Res. 13, 4431-4443 (1985)/.

e) Prekrivanje faga

100 plakova koji izlaze iz transficirane DNA prenesemo sa čačkalicom u YT ploče i izrastu kao kolonije .inficiranih bakterija za 15 - 18 sati. Sušenje kolonija prilagođeno je prema Grunsteinu i Hognessu /Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961-3965 (1985)/. Nitrocelulozni filtar (Millipore S.A., Cat. No. HAWP 090, veličina pora 0,45 µm) namjestimo na ploču kolonije 10 minuta pri sobnoj temperaturi. Filtere denaturiramo s 0,5 N NaOH, neutraliziramo s 1 M Tris-HCl pH 7,5 i zatim obradimo s jako slanom otopinom (0,5 M Tris-HCl pH 7,5 + 1,5 M NaCl) . Filtere pečemo u vakuumu 30 minuta pri 80°C, predhibridiziramo u 100 ml x 10 Denhardtove otopine (D.T. Denhardt, Biochem. Biophys. Res. Commun. 23, 641-646), 6 x SSC i 0,2 % SDS u zatvorenoj plastičnoj vreći 15 minuta.

Za hibridizacijsko prekrivanje predhibridizirane filtere ispiremo u 50 ml 6 x SSC 1 minutu i zatim hibridiziramo u 3,5 ml uzorka koji sadrži 32P-označen primjer, 30 minuta. Hibridizirane filtere isperemo u 100 ml 6 x SSC pri sobnoj temperaturi u cijelosti 2 minute i zatim autoradiografiramo. Dobro razlikovanje između divljih tipova i mutiranog faga dobijemo nakon kratkog ispiranja (5 minuta) pri 60°C u 100 ml 0,1 x SSC + 0,1% SDS.

f) Potvrda delecijske mutacije u pozitivnim klonima dobivenim iz hibridizacije

Fage iz pozitivnih kolonova prenesemo sa čačkalicom u 1 ml 2 x YT, grijemo 20 minuta pri 70°C da ubijemo bakterije i zatim 100 µl te suspenzije faga inokuliramo u1, 5 ml svježe rastuće E. coli JM101 kulture (OD600 ~ 0,45). Kulture jako tresemo (300 okr./min) 4 sata pri 37°C. Zalihu fage i replikatni oblik DNA pripremimo iz pozitivnih klona /J. Messing, Methods in Enzymology, 101, 21-78 (1983)/. DNA iz mutanata (nakon delecijske mutageneze) analiziramo s prikladnim restrikcijskim enzimima i usporedimo ih s restrikcijskim fragmentima divljeg tipa (prije delecijske mutageneze) DNA. Nakon potvrde restrikcijskom analizom, DNA iz jedne pravilne mutante čistimo plakom. Mutacije nadalje potvrđujemo nakon restrikcijske analize i sekvenciranjem primjenom metode lančanog ključa /F. Sanger, S. Niclen and A.R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)/.

B) Delecijska mutageneza na mp18/BamHI/TPAAUPAB (vidi sliku 23)

Delecijsku mutagenezu vršimo kao što je opisano u općem protokolu. Pozitivne klone koje dobijemo iz hibridizacije potvrdimo restrikcijskom analizom. 333 bp uklonimo pri delecijskoj mutagenezi iz BamHI fragmenta. Restrikcijska analiza s BamHI potvrđuje 2150 bp fragment. Daljnja restrikcijska analiza s EcoRI daje 660, 416, 287, 230 bp fragmente na mutantima umjesto 660, 472, 416 i 287 fragmenata, koji se vide na divljem tipu. Analiza sa PstI pokazuje dva fragmenta veličine 611 i 414 bp za mutante. Divlji tip DNA pokazuje tri fragmenta 622, 611 i 414 bsp. Jedan mutirani klon koji ima pravilnu strukturu imenujemo mp18/BamHI/MOTPAAUPAB.

DNA slijed kod sveze između t-PA A-lanca i u-PA B-lanca potvrdimo metodom sekvencnog ključa lanca, koji ima primjer slijeda sekvence 5'CAGAGCCCCCCCGGTGC3'. Taj primjer je komplementaran kodnom vlaknu u-PA (682-666).

C) Delecijska muta eneza na mp18/KpI-HindIII/UPAATPAB (vidi sliku 24)

Delecijsku mutagenezu vršimo kao što je opisano u općem protokolu. Pozitivne klone koje dobijemo iz hibridizacije potvrdimo restrikcijskom analizom sa PstI. Kod mutanata opažamo 467 bs pojas u usporedbi s divljim tipom koji. daje 544 bp fragment. Jedan mutirani klon koji ima pravilnu strukturu imenujemo mpl1/KpnI-HindIII/MOUPAATPAB. Deleciju potvrdimo metodom sekvencnog ključa lanca primjenom slijeda 5'CAAAGATGGCAGCCTGC3'. Taj primjer je komplementaran kodnom vlaknu t-PA (1062-1046).

D) Delecijska mutageneza na mp18/KpnI-HindIII/UK2TPAB (vidi sliku 25)

Delecijsku mutagenezu vršimo kao što je opisano u općem protokolu. Pozitivne klone koje dobijemo iz hibridizacije potvrdimo restrikcijskom analizom s KpnI-Hindl:Il, EcoRI i PstI. Fragmente koje dobijemo jesu

KpnI-HindIII EcoRI PstI

divlji mutant divlji mutant divlji mutant

tip tip tip

1475 bp 1284 bp 542 bp 351 bp 622 bp bez 622

bp trake

Za mutante utvrdimo pravilnu veličinu inserta i fragmenata. Jednog od mutantnih klona pravilne strukture navodimo kao mp18/KpnI-HindIII/MOUK2TPAB. Ispuštanje verificiramo metodom lančano-terminatorskog sekvenciranja primjenom sekvencne usporedbe sa sekvencom (slijedom)

5'CCCAGTGCCTGGGCACTGGGGTTCTGTGCTGTG3'

Taj primjer je komplementaran kodnom lancu t-PA (853-821).

E) Delecijska mutageneza na mp18/KpnI-HindIII/UK2UPAB (vidi sliku 26)

U konstrukciji UK2UPAB sudjeluju dvije odvojene delecijske mutacije:

Prvu delecijsku mutagenezu vršimo kao što je opisano u općem protokolu. Pozitivni klone, dobiveni kod hibridizacije, potvrđeni su restrikcijskom analizom s EcoRI. Kod mutanata opažamo trake 549, 416, 431 bp, u usporedbi s divljim tipom koji daje fragmente 549, 452 i 416. Jedan mutantni klon pravilne strukture navodimo kao mp18/KpnI-HindIII/MOUK2UPAB-l. Deleciju verificiramo metodom lančano-terminatorskog sekvenciranja .primjenom sekvencne usporedbe sa sekvencom

5'CCCAGTGCCTGGGCACTGGGGTTCTGTGCTGTG3'

Taj primjer je komplementaran kodnom lancu t-PA (853-821).

U drugom Stupnju delecijske mutageneze vršimo deleciju istovremeno s uvođenjem točkaste mutacije. Delecijsku mutaciju vršimo kao što je opisano u općem .protokolu. Pozitivni kloni dobiveni kod hibridizacije potvrđeni su restrikcijskom analizom sa EcoRI. Kod mutanata opažamo trake 416, 315. 259 bp, u usporedbi s divljim tipom koji daje fragmente 549, 416 i 351 bp. Jedan mutirani klon pravilne strukture navodimo kao mp18/KpnI-HindIII/MOUK2UPAB. Deleciju potvrdimo metodom lančano-terminatorskog sekvenciranja primjenom sekvencne usporedbe sa sekvencom

5'CAGAGCCCCCCCGGTGC3'.

Taj primjer je komplementaran kodnom LANCU U-PA (682-666).

Primjer 15

Kloniranje hibridnih t-PA/u-PA cDNA konstrukcija u kvasni ekspresijski vektor pJDB207

A) Kloniranje TPAAUPAB hibridnog gena u pJDB207

RF-DNA pripremimo za mp18/BamHI/MOTPAUPAB brzim postupkom izolacije DNA /D.S. Holmes i M. Quingley, Anal. Biochem. 114, 192-197 (1981)/.

RF-DNA (1,5 (g) probavi se sa 9 U BamHI u 20 (l 10 mM Tris-HCl ph 7,5, 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanola jedan sat pri 37°C. Nakon dodatka 1 (l RNaze (1 mg/ml) i 10 minutne inkubacije pri 37°C izoliramo 2,1 kb insert na 0,7% preparativnog agaroznog gela. DNA insert ekstrahiramo elektroeluiranjem i istaložimo etanolu.

l,5 µg pPDB207 /PHO5-I-TPAAUPAB razređemo s BamHI, obradimo s alkalnom fosfatazom telećeg crijeva i izoliramo 6,7 kb vektor. Nakon elektroeluiranja istaložimo vektor DNA.

100 fmolova pJDB207/PHO5-I-TPAAUPAB BamHI razrezanog vektora, 200 fmolova TPAAUPAB inserta povežemo u 10 (l 50 mM Tris-HC1 pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 (g želatine sa 400 U T4 DNA ligaze tijekom 8 sati pri 15°C. Reakcija se zaustavlja inkubacijom 10 minuta pri 65°C. 5 (l te vezne smjese upotrijebi se za transformaciju E.coli HB101 Ca++ stanica /M. Dagert i S.D. Ehrlich, Gene, 6, 23-28 (1979)/. 12 ampR kolonija se pokupi i pripremi DNA brzim postupkom izolacije. Analiza DNA 5 klona pokazuje pravilnu veličinu inserata kao također i pravilnu orijentaciju. Jedan klon uzgajamo na 100 ml LB medija koji sadrži 100 mg/ml ampicilina. Izoliramo plazmid DNA i označimo ga kao pJDB207/PHO5-I-MOTPAAUPAB.

B) Kloniranje MOUPAATPAB, MOUK2TPAB i MOUK2UPAB genskih inserata u plazmid pCS16

RF-DNA pripremimo za mp18/KpnI-HindIII/MOUPAATPAB, mp18/KpnI-HindIII/MOUK2TPAB, mp18/KpnI-HindIII/MOUK2UPAB brzim postupkom izolacije DNA.

Tri RF-DNA (~1,5 (g) probavi se sa 12 U s KpnI i 12 U HindIII u 20 (l Tris-HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 6 mM merkaptoetanola tijekom 1 sata pri 37°C. Doda se 1 (l 1 M. NaCl te se sve DNA nadalje probave s 12 U HindIII. Nakon dodatka 1 ml RNaze/1mg/ml) i inkubacije 10 minuta pri 37°C izolira se 1,4 kb inserte na 0,8% preparativnog agaroznog gela. DNA inserte ekstrahiramo elektroeluiranjem i istaložimo u etanolu.

Tri (g pCS16/UPA probavi se s KpnI i HindIII i izolira se 2,7 vektorski fragment. Nakon elektroeluiranja vektor DNA se istaloži u etanolu.

100 fmolova pCS16 KpnI-HindIII razrezanog vektora, 200 fmolova KpnI-HindIII razrezanih insertnih fragmenata povežemo u 10 (l 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 (g želatine sa 400 U T4 DNA ligaze tijekom 8 sati pri 15°C. Reakcija se zaustavlja inkubacijom 10 minuta pri 65°C. 5 (l te vezne smjese upotrebljavamo za transformaciju stanica E.coli H8101 Ca2+.

Šest ampR kolonija pokupimo od svakog od triju povezivanja. DNA pripremimo postupkom brze izolacije. Kod analize DNA s KpnI-HindIII opažamo insertne trake pravilne veličine. Jedan klon između svakog od triju povezivanja uzgajamo u 100 ml LB mediju koji sadrži 100 mg/ml ampicilina. Plazmidne DNA izvedene iz mp18/KpnI-HindIII/MOUPAATPAB, mp18/KpnI-HindIII/MOUK2TPAB i mp18/KpnI-HindIII/MOUK2UPAB, izoliramo i označimo kao pCS16/MOUPAATPAB, pCS16/MOUK2TPAB i pCS16/MOUK2UPAB.

C) Kloniranje MOUPAATPAA, MOUK2TPAB i MOUK2UPAB genskih inserata u plazmid pJDB207

5 (g pJDB207/PHO5-I-UPA probavi se s 15 U ScaI i 15 U XhoI (Boehringer u 50 (l 10 mM Tris-HC1 pH 7,5, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 6 mM merkatoetanola tijekom 1 sata pri 37°C. Nakon dodatka 1 (l RNaze (1 mg/ml) izoliramo 6, 7 kb vektorski fragment. Nakon elektroeluiranja istaložimo vektor DNA.

Nakon 15 (g pCS16/MOUPAATPAB, pCS16/MOUK2TPAB i pCS16/MOUK2UPAB inkubiramo pri 37°C tijekom 1 sata u XhoI u 200 (l 10 mM Tris-HCl pH 8, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanola, ekstrahiramo s jednakim volumenom fenolkloroforma, te istaložimo u etanolu. Istaložene, razrezane sa XhoI, pCS16/MOUPAATPAB, pCS16/MOUK2TPAB i pCS16/MOUK2UPAB DNA, resuspendiramo, u 150 (l 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanola, 1,5 homidijevog (etidijevog) bromida, inkubiramo 40 minuta pri 37°C sa 12 U ScaI (djelomična probava) i ekstrahiramo s jednakim volumenom fenola, zatim još s jednakim volumenom kloroform-izoamilalkohola (50:1). 1,2 kb fragmente izoliramo na 1% preparativnog agaroznog gela. DNA pkstrahiramo elektroeluiranjem i istaložimo.

100 fmolova pJDB207/PHO5-I-UPA ScaI-XhoI razrezanog vektora i 200 fmolova Xho-ScaI razrezanog pCS16/MOUPAATPAB, pCS16/MOUK2TPAB, odnosno pCS16/MOUK2UPAB l,2 kb inserata, povežemo u 10 (l 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 (g želatine sa 400 U T4 DNA ligaze tijekom 16 sati pri 15°C. Reakciju se zaustavi inkubacijom 10 minuta pri 65°C. 5 (l te vezivne smjese upotrebljavamo za transformaciju stanica E.coli H8101 Ca2+.

Šest ampR kolonija pokupimo od svakog između tih triju povezivanja. DNA pripremimo postupkom brze izolacije. Restrikcijska liza DNA pokazuje pravilnu veličinu insertnih traka. Jedan klon od svakog između triju povezivanja uzgajamo u 100 ml LB medija, koji sadrži 100 (g/ml ampicilina. Plazmide DNA, izvedene od pCS16/MOUPAATPAB, pCS16/MOUK2TPAB, odnosno pCS16/MOUK2UPAB označavamo kao pJDB207/PHO5-I-MOUPAATPAB, pJDB207/PHO5-I-MOUK2TPAB, odnosno pJDB207/PHO5-I-MOUK2UPAB.

Primjer 16

Transformacija Saccharomyces cerevisiae GRF18 i priprava ekstrakata stanica kvasaca

Plazmide pJDB207/PHO5-I-MOUK2UPAB, pJDB207/PHO5-IMOUPAATPAB, pJDB207/PHO5-I-MOUK2TPAB, i pJDB207/PHO5-I-MOUK2UPAB uvedemo u Saccharomyces cerevisiae soj GRF18, upotrebom transformacijskog protokola, koji su opisali Hinnen et al. /Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)/. Po 5 (lg svake od plazmidnih DNA dodamo k 100 (l sferoplastne suspenzije te smjesu obradimo s polietilenglikolom. Sferoplaste pomiješamo s 10 ml regeneracijskog agara i sadimo ih u ploču s minimalnim medijem kvasca bez leucina. Nakon trodnevne inkubacije pri 30°C dobijemo pribl. 200 transformiranih stanica.

Pokupimo po jednu koloniju od svake između transformacija kvasca.

Različite kolonije označavamo kao:

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDH207/PHO5-I-MOTPAAUPAB,

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-I-MOUPAATPAB,

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-I-MOUK2TPAB,

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-I-MOUK2UPAB.

Stanice kvasca uzgajamo 24 sata uz potresanje pri 30°C u 20 ml HE.17 medija (8,4 g Yeast Nitrogen Base (Difco), 10 g L-aspariga (Sigma), 1 g L-histidina (Sigma), 40 ml 50%-tne glukoze na 1 1 otopine), u Erlenmayerovoj tikvici od 50 ml, dok se postigne gustoću od 8-10x107 stanica/ml. Stanice centrifugiramo i ponovno suspendiramo u 10 ml 0,9 % NaCl. 2 ml ponovno suspendiranih stanica koristimo za inokulaciju 50 ml slabo P1 minimalnog medija (kao što je opisano u europskoj patentnoj prijavi br. 143081), k čemu dodamo 10 g/1 L-asparagina i 10 g/1 L-histidina (Sigma), u Erlenmayerovim tikvicama od 250 ml. Inkubacija je pri 30°C i 250 okr./min.

Stanice iz 10 ml slabo Pi minimalnog medija pokupimo nakon 48 sati centrifugiranjem pri 3000 okr./min. tijekom 10 minuta u Falcon 2070 epruvetama. Stanice jednom isperemo sa 10 ml slabo Pi medija i centrifugiramo. Stanični pelet suspendiramo u liznom puferu /66 mM kalijevog fosfata s pH 7,4, 4 mM Zwittergent (Calbiochem)/. K staničnoj suspenziji dodamo 8 g staklenih kuglica (promjera 0,5-0,75 mm) i Stakleni štapić, nakon toga protresemo suspenziju u Vortex miješalici (Scientific Instruments Inc., USA) s pola brzine 4 x 2 minute u intervalima po 2 minute na ledu. Više od 90% stanica rasprsne se pri ovom postupku. Komadiće stanica i staklene kuglice sedimentiramo centrifugiranjem tijekom 5 minuta pri 3000 okr./min pri 4°C. Gornji sloj (supernatant) koristimo za određivanje PA aktivnosti i za čišćenje i izolaciju PA.

Primjer 17

Uvođenje hibridnih PA kodnih sekvenci u stanični ekspresijski vektor sisavaca

A) Uvođenje (insert) UPAATPAB, potpune, hibridne kodne sekvance

RF DNA mp18/KpnI-HindIII/MUPAATPAB narežemo na SmaI mjestu, koje se nalazi ravno iznad početno kodne sekvence i povežemo na SacI linker (CGAGCTCG). Zatim plazmid razrežemo sa SacI, koji zareže u položaju vezanih linkera i na nativnom ScaI mjestu u t-PA-izvedenom dijelu sekvence, koji kodira za hibrid PA. Manjeg od dvaju nastalih fragmenata očistimo preko agaroznog gela i povežemo ga na SacI-razrezan pCGA44 (vidi primjer 4), transformiran u E.coli HB101, i DNA iz kandidatnih klona ispitamo s EcoRI. Klon s očekivanim restrikcijskim uzorkom navodimo kao pCGCI i UPAATPAB.

B) Uvođenje UK2TPAB hibridne kodne sekvence

RF DNA mp18/KpnI-HindIII/MOUK2TPAB narežemo na SmaI mjestu, koje se nalazi ravno iznad početno kodirane sekvence i povežemo na SacI kao gore. Nakon razrezivanja sa SacI kloniramo nastali manji fragment u SacI-razrezani pCGA44, kao što je opisano gore, te klon s očekivanim restrikcijskim uzorkom navodimo kao pCGC2/UK2TPAB.

C) Uvođenje UK2UPAB hibridne kodne sekvence

RF DNA mp18/KpnI-HindIII/MOUK2UPAB narežemo na SmaI mjestu, koje se nalazi iznad u-PA kodne sekvence te pri Xhoi mjestu ispod kodne sekvence (u vektor DNA). Ljepljiv kraj DNA fragmenta popunimo upotrebom E.coli DNA polimeraze I (vidi primjer 5D). SacI linkere povežemo na tupe krajeve, DNA razrežemo sa Sacl, manjeg dvaju od nastalih fragmenata očistimo preko agaroznog gela i kloniramo u SacI-razrezani pCGA44. Klon s očekivanim EcoRI restrikcijskim uzorkom navodimo kao pCGC3/LTK2TPAB.

D) Uvođenje TPAAUPAB, potpune kodne sekvence

Stupanj 1: RF DNA mp18/BamHI/MOTPAAUPAB razrežemo s BamHI i manjeg (približno 2.1 kb) između fragmenata kloniramo u BamHI narezan pJDB207/PHO5-I-TPAAUPAB, (vidi primjer 9) vektor. Pravilnu orijentaciju odaberemo probavom s Hind-III i jedan pravilan plazmid imenujemo pJDB207/PHO5-I -MOTPAAUPAB.

Stupanj 2: ~ 600 bp SacI-NarI fragment iz ptNC.UC (vidi primjer 3) i ~ 1350 bp NarI-XhoI fragment iz pJDB207/PHO5-I-TPAAUPAB izoliramo i kloniramo u SacI-XhoI razrezan pCS16 (vidi primjer 7) vektor ~ 1.9 kb insert potvrdimo probavom sa SacI-XhoI i EcoRI. Jedan pravilan plazmid imenujemo pCS16/MOTPAAUPAB.

Stupanj 3: Plazmid pCSl6/MOTPAAUPAB razrežemo na mjestu Xhoi, lociranom ispod u-PA kodne sekvence, te ljepljive krajeve popunimo upotrebom E.coli DNA polimeraze I. SacI linkere povežemo na tupe krajeve i DNA razrežemo sa SacI. Manjeg od dvaju fragmenata očistimo preko agaroznog gela i kloniramo u SacI-razrezan pBR4a (vidi primjer 5) vektorski fragment. Pravilna orijentacija i pravilna veličina inserata potvrđeni su probavom s BamHI odnosno SacI. Jedan pravilan plazmid označavamo kao pCGC4a/TPAAUPAB.

Primjer 18

Konstrukcija slijedećih hibridnih PA kodnih sekvenci i njihovo uvođenje u ekspresijski vektor stanice sisavca

A) Kloniranje pCGC4a/TPAAUPAB fragmenta u M13mp18

3 (g pCGC4a/TPAAUPAB (vidi primjer 17) probavi se s 12 U SacI (Bohringer) u 20 (l 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 6 mM merkaptoetanola jedan sat pri 37°C. ~ 1,9 kb fragment izoliramo na 0,7% preparativnog agaroznog gela. DNA ekstrahiramo elektroeluiranjem i istaložimo.

0,5 (g M13mp19 (RF) probavi se sa SacI. 7.3 kb vektorski fragment izoliramo na 0,7% preparativnog agaroznog gela. DNA elektroeluiramo i istaložimo.

100 fmolova M13mp18 SacI razrezanog vektora i 200 fmolova SacI inserta vežemo u 10 (l 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 (g želatine sa 400 U T4 DNA ligaze tijekom 7 sati pri 15°C. Reakciju zaustavimo inkubacijom 10 minuta pri 65°C. 5 (l te vezne smjese upotrijebimo za transformaciju E.coli JM101 kompententnih stanica. Pokupimo šest bezbojnih plakova (pločica) i pripremimo jednovlaknati i replikatni oblik (RF) DNA. Pri analizi R-DNA četiri klona pokazuju pravilnu veličinu inserata i pravilnu orijentaciju. Jednog od tih klonova navodimo kao mp18/SacI/TPAAUPAB (BC).

B) Kloniranje pBR4a Sacl fragmenta u M13mp18

pBR4a (vidi primjer 5) SacI fragmenta u M13mp18. Jedan od klonova ima pravilnu veličinu inserta i orijentaciju i navodimo ga kao mp18/SacI/TPAAUPAB (BR).

C) Delecijska mutageneza na TPA-UPA hibrid-konstrukata

1) Konstrukcija K2UPAB (BC) /npr. tPA (1-3)-tPA (176-275)-uPA (159-411)/

Delecijsku mutagenezu vršimo kao što je opisano u općem protokolu (vidi primjer 4) na mp18/SacI/TPAAUPAB (BC). Pozitivne klone dobivene pri hibridizaciji potvrdimo restrikcijskom analizom sa SacI. Kod mutanata opažamo ~ 1380 bp traku, us usporedbi s divljim tipom koji daje ~ 1900 bp fragment. Mutanti su nadalje potvrđeni s probavnim EcoRI. Jedan mutantni klon pravilne strukture navodimo kao SacI/K2UPAB(BC). Ispuštanje verificiramo metodom lančano-termonatorskog sekvenciranja primjenom sekvencne usporedbe sa sekvencom

5'CCCAGTGCCTGGGCATTGGGGTTCTGTGCTGTG3'

Taj primjer je komplemantaran kodnom vlaknu t-PA(853-821) s pogrešnim vezanjem u položaju 838 (t-PA).

2) Konstrukcija FUPAB(BC) /npr. tPA(1-49)-tPA(262-275)-uPA(159-411)

Leiecijsku mutagenezu vršimo kao što je opisano u općem protokolu (vidi primjer 14) na mp18/SacI/TPAAUPAB-(BC). Pozitivne klone dobivene pri hibridizaciji potvrdimo restrikcijskom analizom sa SacI. Kod mutanata koristimo ~ 1200 bp traku u usporedbi s divljim tipom koji daje ~ 1900 bp fragment. Mutanti su nadalje potvrđeni s probavnim EcoRI. Jedan mutantni klon pravilne strukture navodimo kao mp18/SacI/FUPAB(BC). Deleciju verificiramo metodom lančano-termonatorskog sekvenciranja primjenom sekvenene usporedbe sa sekvencom

5'CAGAGCCCCCCCGGTGC3'.

Taj primjer je komplementaran kodnom vlaknu u-PA(666-682).

3) Konstrukcija FK2UPAB(BC) /npr. tPA (1-49) -tPA (176-275) -uPA(159-411)

Delecijsku mutagenezu vršimo kao što je opisano u općem protokolu (vidi primjer 14) na mp18/SacI/TPAAUPAB(BC). Pozitivni kloni dobiveni pri hibridizaciji potvrđeni su restrikcijskom analizom sa SacI. Kod mutanata opažamo ~ 1470 bp traku u usporedbi s divljim tipom koji daje ~ 1900 bp fragment. Mutanti se nadalje potvrđuju s probavnim EcoRI. Jedan mutantni klon .pravilne strukture navodimo kao mp18/SaeI/KF2UPAB(BC). Deleciju verificiramo metodom lančano-termonatorskog sekvenciranja primjenom sekvencne usporedbe sa sekvencom,

5' CCCAGTGCCTGGGCATTGGGGTTCTGTGCTGTG 3'.

Taj primjer je komplemantaran kodnom vlaknu T-PA(853-821) s pogrešnim vezanjem u položaju 838 (t-PA).

4) Konstrukcija FGK2UPAB(BC) /npr. tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411)

Delecijsku mutagenezu vršimo kao što je opisano u općem protokolu (vidi primjer 14) na mp18/SacI/TPAAUPAB(HC). Pozitivni kloni dobiveni pri hibridizaciji potvrđeni su restrikcijskom analizom sa SacI. Kod mutanata opažamo ~ 1580 bp traku u usporedbi s divljim tipom koji daje ~ 1900 bp fragment. Mutanti se nadalje potvrđuju s probavnim EcoRI. Jedan mutantni klon pravilne strukture navodimo kao mp18/SacI/FGK2UPAB(BC). Deleciju verificiramo metodom lančano-termonatorskog sekvenciranja primjenom sekvencne usporedbe sa sekvencom

5' CCCAGTGCCTGGGCATTGGGGTTCTGTGCTGTG 3'.

Taj primjer je komplemantaran kodnom vlaknu T-PA(853-821) s pogrešnim povezivanjem u položaju 838 (t-PA).

5) Slične delecijske protokole mutageneze koristimo za stvaranje

K2UPAB(BR) (tPA(1-3)-tPA(176-262)-uPA(132-411)(

FUPAB(BR) (tPA(1-49)-uPA(134-411)(

FK2UPAB(BR) (tPA(1-49)-tPA(176-262)-uPA(132-411)( i

FGK2UPAB(BR) (tPA(1-86)-tPA(176-262)-uPA(132-411)(.

D) uvođenje hibridnih kodnih sekvenci u ekspresijski vektor stanica sisavaca

1) Uvođenje FUPAB(BC), K2UPAB (BC), FK2UPAB (BC) i FGK2UPAB (BC)

RF DNA iz mp18/Sacl/K2UPAB(BC), mp18/SacI/FUPAB(BC), mp18/SacI/FK2UPAB(BC), mp18/SacI/TGK2UPAB(BC) razrežemo sa SacI. Manjeg od dvaju nastalih fragmenata izoliramo i vežemo na SacI-razrezan pBR4a (vidi primjer 5) vektorski fragment, transformiran u E.coli HB101, i pravilnu orijentaciju i pravilnu veličinu inserata potvrdimo probavljanjem s BamHI odnosno SacI. Nastale plazmide označavamo kao pCGC5/K2UPAB, pCGC6/FUPAB(BC), pCGC7/FK2UPAB(BC) odnosno pCGC8/FGK2UPAB (BC).

2) Slično K2UPAB(BR), FUPAB (BR), FK2UPAB (BC) i FGK2UPAB (BR) DNA (vidi gore) uvodimo u pBR4a. Dobivene plazmide označavamo kao pBR5, pBR6, pBR7 odnosno pBR8.

Primjer 19

Ekspresijski vektori sisavaca koji obuhvaćaju gen DHFR

Plazmid pSV2dhfr (ATCC 37145) je plazmid koji dopušta selekciju stanica koje sadrže transformante DHFR selekcijom upotrebom antifolatnog lijeka metotreksata ili selekciju DHFR+ transformanata DHFR- CHO stanica /DUKXBI stanice; G. Urlaub, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220 (1989)/.

Samo na jedno BamHI mjesto tog plazmida dade se klonirati BamHI fragment pCGA28 koji sadrži modularni t-PA gen. Plazmide koji sadrže bilo koju od dviju mogućih orijentacija označavamo kao pCGA700a/tPA i pCGA700b/tPA. Obje možemo upotrijebiti za ekspresiju t-PA u stanicama kulture tkiva, iako prednost ima pCGAa/tPA, gdje je transkripcija t-PA gena istog smjera kao transkripcija DHFR gena, jer ta orijentacija često vodi do blago viših ekspresijskih razina nego s plazmidima koji se konvergentno transkribiraju.

Na analogan način možemo kombinirati modularne gene koji kodiraju za hibridne plazminogenske aktivatore (dolje) iz plazmida pBRla/tPA, pBR2a/UPAATPAB, pCGC1/UPAATPAB i pCGC2/UK2TPAB, kao BamHI fragmente s DHFR genom pCGA700a/tPA, da se stvore plazmidi pCGA70la/tPA, pCGA702a /UPAATPAB, pCGC705a/UPAATPAB odnosno pCGA707a/UK2TPAB, gdje se modularni plazminogenski aktivatorski gen transkribira u istom smjeru kao DHFR gen, te pCGA701b/tPA, pCGA702b /UPAATPAB, pCGC705b/UPAATPAB, pCGA707b/UK2TPAB, gdje se oba gena transkribiraju u suprotnim smjerovima. Zbog prisutnosti BamHI sekvence u dijelu koji kodira za u-PA B-lance modularni plazminogenski aktivatorski gen dade se izolirati samo s razdjelnim rezom (2 između 3 BamHI položaja) neoR plazmida, nakon čega slijedi izolacija prikladnog fragmenta (vidi slike) elektreforezom na agarorznom gelu.

Tako iz pBR3a/uPA, pBR4a/UPAATPAB, pBR5/K2UPAB, pBR6/FUPAB, pBR7/FK2UPAB, pBRB/FGK2UPAB, pCGC3/UK2UPAB, pCGC4a/TPAAUPAB, pCGC/K2UPAB, pCGC6/FUPAB, pCGC7/FK2UPAB i pCGC8/FGK2UPAB možemo konstruirati pCGC703a/uPA, pCGC704a/TPAAUPAB, pCGA705a/K2UPAB, pCGC708a/FUPAB, pCGA706a/FK2UPAB, pCGA707a/FGK2UPAB, pCGA709a/UK2UPAB, pCGA711a/TPAAUPAB, pCGA712a/K2UPAB, pCGA713a/FUPAB, pCGA714a/FK2UPAB odnosno pCGA715a/FGK2UPAB, gdje se svi plazminogenski aktivatorski geni transkribiraju (prepišu) u istom smjeru kao DHER gen i nadalje pCGA703b/uPA, pCGA704b/TPAAUPAB, pCGA708b/FUPAB, pCGA705b/K2UPAB, pCGA706a/FK2UPAB, pCGA707b/FGK2UPAB, pCGA709b/UK2UPAB, pCGA711b/TPAAUPAB, pCGA712b/K2UPAB, pCGA713b/FUPAB, pCGA714b/FK2UPAB i pCGA715b/FGK2UPAB, gdje se oba gena transkribiraju nekonvergentno.

Primjer 20

Priprava hibridnih plazminogenskih aktivatora s transformiranim stanicama sisavaca

A) Održavanje i DNA transfekcija stanica kultura tkiva; opći postupak

DNA konstrukte izrazimo u DUKXBI, mutantu ovarijskih stanica kineskog hrčka (CHO) koje nemaju enzima dihidrofolat-reduktaze /G. Urlaub et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220 (1980)/. DUKXBI stanice uzgajamo u alfa-MEM mediju koji sadrži nukleozide (GIBCO) kojima smo dodali 5% fetusnog telećeg seruma.

Stanice nasadimo s gustoćom 10.000/cm u multi-ploče sa 6 utora (promjera 3,4 cm) i transformiramo sa 4 (g DNA: DNA otopimo u količini 50 (g/ml u 10 ml Tric-HCl pH 7,0, koja sadrži 0, 1 mM EDTA, hlađeno na ledu tijekom 5 minuta, doda se 0,25 volumena 1 M CaCl2 i inkubiramo 10 minuta na ledu. Zatim smjesu pomiješamo s jednakim volumenom 2 x HBS (50 mM Hepes, 280 mM NaCl, 0,75 mM Na2HPO4, 0,75 mM NaH2PO4, pH 7,12, nakon čega slijedi još jedna desetminutna inkubacija na ledu. Konačno taj zajednički talog DNA-Ca-fosfata dodamo u uzgojni medij i stanice s DNA inkubiramo 16-18 sati, nakon čega slijedi glicerolni šok, tj. stanice isperemo s TBS (80 g/1 NaCl, 3, 8 g/1 KCl, 1 g/1 Na2HPO4 (2H2O, 0,114 g/1 CaCl2 (2H2O, 0,11 g/1 MgCl2 ( 6H2O, 25 mM Tris-HCl pH 7, 5) , inkubiramo 1 minutu s 20% (vol./vol.) glicerola u TBS, ponovno isperemo s TBS i uzgajamo 24 sata u mediju kulture tkiva. Stanice zatim tripsiniziramo i prenesemo ih u Petrijeve zdjelice promjera 8 cm. Slijedeći dan nadomjestimo prvobitni uzgojni medij bez selektivnog a sredstva s medijem koji sadrži 1 mg/1 geneticina. Medij nadomještamo svaki treći ili četvrti dan. Kolonije možemo vidjeti otprilike 14. dana. Stanice iz individualnih kolonija izoliramo struganjem s koničnom pipetom, pri čemu ih istovremeno usisamo u konus napunjen otopinom tripsina, te svaku prenesemo u utor multiploče s 24 utora, u koju dovodimo medij koji sadrži geneticin. Ako su kofluentne te kulture cijepimo na multiploče sa 6 utora i zatim u Petrijeve zdjelice promjera 8 cm.

B) pokusi na agaroznoj ploči za plazminogenske aktivatore

Za te osjetljive pokuse za plazminogenske aktivatore koriste se agarozni geli kojima je dodan plazminogen (ishodna otopina je pripremljena otapanjem plazminogena Sigma A-6877 u količini 1 mg/ml te dvostrukom dijalizom prema 100 volumnom 50 mM Tris-HCl pH 8,0), ili kazein (dodan kao nemasno mlijeko) ili fibrin (dodan kao fibrogen plus trombin). Uzorak koji sadrži plazminogenski aktivator, unesemo u rupice izdubljene u 4 mm debelom sloju agaroze, te gel zatim inkubiramo pri 37°C. Zatim enzimatsku aktivnost osiguramo time da plazminogenski aktivator radijalno difundira od utora s uzorkom, pretvara plazminogen u gelu u plazmin koji probavi kazein ili fibrin, čime se stvara jasan obruč u neprozirnom gelu oko utora s uzorkom. Radius obruča mjeren od ruba utora s uzorkom je mjerilo za količinu aktivacijskog plazminogena. Pokus ne pokazuje linearni odziv na količinu dodanog plazminogenskog aktivatora. Za predpokus manjih količina plazminogenskog aktivatora inkubaciju možemo produljiti na više dana. Način rada i kalibriranje kazeinskog pokusa su kao koji koje su opisali Tang et al., /Anal. N.Y. Acad. Sci. 434, 536-540 (1984)/, samo što umjesto 2% (masa/volumen) Carnation nemasnog mliječnog praha upotrebljavamo 12,5% (vol./vol.) steriliziranog (UHT) nemasnog mlijeka Migros Corp. (Švicarska). Ako koristimo fibrin /Granelli-Piperno i Reich, J. Exp. Med. 148, 223-234 (1978) / kao supstrat, otopimo 0,2 g agaroze u 15 ml 0,9% NaCl i ohladimo na 42°C. U toj točki dodamo 5 ml 0, 9% NaCl koji sadrži 80 mg govedeg fibrinogena (Sigma F-8630), 0,1 ml plazminogenske otopine (gore) i 0,1 ml 100 mg/ml natrijevog azida pri 42°C. Konačno dodamo 0,2 ml goveđeg trombina (Sigma T-6634), otopljenog u količini 16,6 NIH jedinica/ml u 0,9%-tnom NaCl), nakon čega smjesu brzo izlijemo u Petrijeve zdjelice (promjera 8 cm) i pustimo ohladiti na sobnu temperaturu tijekom 1 sata. Nastali gel debljine pribl. 4 mm možemo pohraniti pri 4°C nekoliko dana, ili se odmah koristi na isti način kao gornji gel, koji sadrži kazein.

C) priprava hibridnih PA proteina u stanicama hrčka

CHO DUKXB1 stanice transformiramo s DNA plazmida pBRIA, pBRlB, pBR2B, pBR3A, pBR3B, pBR5, pBR7, pBRB, pCGC1, pCGC2, pCGC3, pCGC4a, pCGC5, pCGC6, pCGC7 odnosno pCGC8, kao što je gore opisano (primjer 20A). Kolonije se pojave otprilike desetog dana, pokupimo ih otprilike petnaestog dana, kao što je gore opisano i 2 tjedna kasnije se broj stanica dovoljno poveća da možemo izmjeriti PA, kao što je gore opisano. Netransformirane stanice i stanične linije tranformirane s pBRlB, pBR2B, pBR3B; one koje sadrže uključeni SacI fragment suprotne orijentacije ne proizvode dokazive količine PA.

D) Enzimska aktivnost u medijima kondicioniranim s transformiranirn CHO stanicama

Kondicioniran medij iz stanica transformiranih s plazmidom i kontrolnih CHO stanica pripremimo uzgojem 200,000-500,000 stanica/ml tijekom 24 sata u Alpha-MEM s nuklezidima te 5%-tnim fetusnim telećim serumom i 0,03 ml inkubiramo na agaroznim pločama koje sadrže kazein ili fibrin, u dolje navedenom vremenskom razdoblju. Na fibrinskoj ploči utvrdimo minimalnu aktivnost pozadine, vjerojatno zbog jednog t-PA hrčka u mediju kondicioniranom s DUKXBI. Na kazeinskim pločama ne pojavljuje se obruč ako uzorke hibridnog proteina pomiješamo s 3 (l kunićevih anti-PA antitijela (uzgojenih prema očišćenim Bowes melanomskim t-PA) ili s anti-urokinaznim antitijelima (uzgojenim prema Serono urokinazi).

Anti-tPA antitijelo ne inhibira u-PA enzim niti antiurokinazno antitijelo ne inhibira t-PA u signifikantnoj mjeri. Rezultati su prikazani u tablici 1.

Tablica 1: Učinkovitost različitih plazminogenskih aktivatora.

[image]

Primjer 21

Priprava hibridomskih stanica i izolacija monoklonalnih antitijela

a) Izvor imunogena: Uzorak poluočišćenog nativnog humanog melanoma t-PA s ocjenom čistoće iznad 90%.

b) Imunizacijski protokol: Tri skupine BALB/c miševa (Tierfarm Sisseln, Švicarska), stare 10 do 14 tjedana, imuniziramo injekcijom u oba zadnja potplata te subkutano sa 100 (g melanoma t-PA, emulgiranog u potpunom Freundovom adjuvantu (Difco). Zatim prva skupina (br. 405) dobije 10 (g t-PA u nepotpunom adjuvantu svaki tjedan tijekom 6 tjedana, dok druga skupina (406) dobije istu količinu svaka 2 tjedna. Trećoj skupini (407) damo dva puta po 50 (g t-PA u intervalima po 3 tjedna. Svim životinjama uzimamo krv četvrtog i osmog tjedna. Za posljednju injekciju damo 100 (g t-PA u PBS i.p. i 4 dana kasnije vršimo fuziju stanica slezene sa SP2/o mielomskom linijom u skladu sa standardnim postupkom. Za fuziju upotrebljavamo samo one miševe koji imaju anti-tPA-titar antitijela.

c) Stanična fuzija: Sve pokuse fuzije vršimo u skladu s postupkom prema G. Kohler i C. Milstein /Nature 256, 495 (1975) upotrebom neizlučive Sp 2/O-Ag14 mielomske vrste /M. Shulman, C.D. Wilde i G. Kohler, Nature 276, 269 (1978)/. 108 stanica slezene pomiješamo s 107 mielomskih stanica u prisutnosti 1 ml 50% polietilenglikola (PEG 1500, Serva). Nakon ispiranja stanice resuspendiramo u 48 ml standardnog Dulbecco minimalnog esencijalnog medija (Gibco No. 0422501). 3x106 normalnih mišjih peritonealnih eksudatnih stanica fuzijom dodamo kao hranjive stanice. Stanice podijelimo u 48x1 ml " costar" utore i hranimo ih tri puta tjedno sa standardnim HAT selekcijskim medijem tijekom 3 do 6 tjedana. Kad rast hibridomskih stanica postane vidljiv, provede se prekrivanje supernatanata s pokusom izravnog antigenskog povezivanja (ELISA) i neutralizacijom (kazein) (vidi dolje) . Rezultati 4 fuzijska pokusa su slijedeći: od 192 cijepljena utora dobijemo 192 hibridoma. Od njih 24 proizvode anti-PA antitijelo. Od 24 pozitivna hibridoma njih 14 klonirarno i od dobivena 574 klona utvrdimo da njih 31 stabilno proizvode anti-t-PA mAB. Tri od njih (klone 405B.33.3, 406A.23.7 i 407A.15.27) injiciramo u miševe te proizvedemo ascites tekućine za daljnje proučavanje.

d) Izolacija i čišćenje monoklonarnog antitijela:

BALB/c miševe, stare 8 do 10 tjedana (Tierfarm Sisseln, Švicarska) intraperitonealno prethodno obradimo s 0,3 ml pristana (Aldrich). 2 do 3 tjedna kasnije intraperitonealno inokuliramo im 2 do 5x106 kloniranih hibridomskih stanica 405B.33.3, 406A.23.7 i 407A.15.27 i 0,2 ml pristana. Nakon 8 do 10 dana pokupimo ascites tekućinu, centrifugiramo pri 800 g i pohranimo pri -20°.

Odleđenu ascites tekućinu centrifugiramo pro 50.000 g 60 minuta. Sloj masti koji pliva na površini pažljivo uklonimo i namjestimo koncentraciju proteina na 10 do 12 mg/ml.

Sirovi imunoglobulin istaložimo dokapavanjem 0,9 volumnih ekvivalenata zasićenog amonijevog sulfata pri 0°C, zatim otopimo u 20 mM Tric-HCl/50 mM NaCl. (pH 7,9) i dijaliziramo prema istom puferu. Imunoglobulinsku frakciju s DEAE D52 dobijemo celuloznom (Whatman) kromatografijom, uz upotrebu puferskog gradijentnog sistema 20 mM TrisHCl/25-400 mM NaCl, pH 7,9. Imunoglobulin ponovno istaložimo s amonijevim sulfatom i otopimo u PBS u koncentraciji 10 mg/ml.

Gelna elektroforeza s natrijevim dodecilsulfat-poliakrilamidom (SDS-PAGE) pokazuje stupanj čistoće iznad 95% za monoklonalna antitijela.

e) Određivanje razreda i podrazreda monoklonalnih antitijela

Razred i podrazred monoklonalnih antitijela proizvedenih s kloniranim hibridomskim stanicama odredimo poznatim imunodifuzijskim postupkom Ouchterlonyja (agarozno-gelna imunodifuzijska metoda) uz upotrebu razredno i podrazredno specifičnih antitijela kunića (Bionetics).

Podrazredi mAb su slijedeći:

405B.33.3 : γlk

406A.23.7 : γ2bk

407A.15.27 : δ2ak

f) Enzimski imuno pokus (ELISA):

Mikrotitarske ploče prekrijemo s 0,5 µg na utor s t-PA pripremkom (čistoća iznad 95%) u 100 µl PBS. Slobodni vezivni kapacitet ploče namjestimo s puferom s 0,2% želatine u PBS koji sadrži uzorke 0,2% NaN3 (m/v), pH 7,4 100 µl, koji sadrže monoklonalna antitijela 405B.33.3, 406A.23.7 odnosno 407A.15.2, inkubirarno u utorima 2 sata pri 37°C. Ploče isperemo s PBS koji sadrži 0,05% Tween 20, zatim inkubiramo 2 sata pri 37°C s anti-mišjim imunoglobulinskim pripremkom kunića, konjugiranim s fosfatazom. Fiksirani enzim razvijemo inkubiranjem (37°C, 30 do 60 minuta) s otopinom enzimskog substrata pnitrofenilfosfata (1 mg/ml u dietanolarninskom puferu, 10%, koji sadrži 0,5 mM MgCl2 i 0,02 % (masa/volumen) NaN3, pH 9,8) te izmjerimo optičku gustoću pri 405 nm.

Jednak pokus ELISA izvršimo također upotrebom urokinaze. Nijedan od mAb ne veže se na urokinazu. Svi mAb su t-PA specifični.

g) Pokus s kazeinskom lizom (neutralizacijski test):

Da bi odradili inhibitorski učinak MAbs, najprije t-PA pomiješamo s mAbs 405B.33.3, 406A.23.7 odnosno 407A.15.2, te inkubiramo 30 do 60 minuta pri 4°C, nakon čega izvršimo uobičajen pokus kazein/plazminogenski agar (vidi primjer 20B). Ni jedan od mAb ne inhibira t-PA aktivnost, samo mAb 405B.33.3 uzrokuje kašnjenje (više. od 6 sati) kazeinskoi lizi.

Primjer 22

Čišćenje hibridnog plazminogenskog aktivatora; opći postupak

Ekstrakte iz transformiranih kvasnih stanica pripremimo kao što je opisano u primjeru 16. Ekstrakte iz stanica sisavaca, transformiranih s plazmidom, kao CHO stanica, pripremimo kako slijedi:

Stanice najprije uzgojimo do 70 do 80%-tne konfluence. Zatim stanični monosloj isperemo s medijem, kao što je gore opisano, samo da ispustimo serum, nakon čega slijedi uzgoj stanica u dodatnom razdoblju 5 do 7 dana. Medij pospremamo svakih 24 sata, a istovremeno k stanicama dovodimo svjež medij. Tako dobiven kondicionirani medij zatim centrifugiramo pri 5000 g tijekom 30 minuta i filtriramo kroz filtar 0,45 µm da uklonimo neželjene komadiće stanica prije afinitetne krornatografije. Kao afinitetnu matriu upotrebljavamo ili imobilizirani proteazni inhibitor DE-3 iz Erythrina latissima ili imobilizirana antitijela na u-PA ili t-PA.

Iz hibridnih PA koji sadrže katalitički B-lanac t-PA, očistimo kondicionirani medij, pripremljen tako kao što je gore opisano, ili ekstrakte kvasnih stanica uz upotrebi protokola, izvorno razvijenog za čišćenje medija, kondicivniranog s melanomskim stanicama, iz t-PA /vidi C, rieussen et al., J. Biol. Chem. 259, 11635-11638 (1984)/.

Sve hibridne PA očistimo koristeći poliklonalna antitijela uzgojena u kunićima ili kozama, prema parenteralnim u-PA i t-PA enzimima, ili upotrebom monoklonalnih antitijela (mišjeg izvora) uzgojenih prema parenteralnim enzimima, uz ogradu, da samo oni raspoznaju epitop prisutan u proučavanom hibridnom PA (vidi primjer 21). Odabrano antitijelo imobiliziramo na netopivoj matrici kao Affigelu ili Sepharosi-4B. Kondicionirani medij pripremljen kao što je gore opisano, ili kvasni stanični ekstrakt, nanesemo zatim na kolonu afinitetne matrice, a neželjene proteine isperemo upotrebom prikladnog pufera, npr. Dulbecco’s PBS /0,1 g/1 CaCl2, 0,2 g/1 KCl, 0,2 g/1 KH2PO4, 0,047 g/1 MgCl2, 8,0 g/1 NaCl, l, 15 g/1 Na2HPO4; J. Exp. Med. 99, 167 (1954)/, zatim eluiramo PA iz kolone upotrebom kaostropnog sredstva kalijevog tiocijanata /usporedi M. Erinarsson et al., Biochim. Biophys. Acta 830, 1-10 (1985) / ili u slabom pH puferu kao 0,1-0,2 M glicin-HCl (pH 2,1).

Nakon čišćenje uz upotrebu monoklonalnih antitijela hibridni PA imaju čistoću iznad 90%.

Primjer 23

Čišćenje UK2TPAB(BC)

a) Priprava DE-3 Sepharose® kolone

Na 1 ml Sepharose 4B® (Pharmacia) aktivirane sa cijanogenbromidom dodamo 5 mg očišćenog inhibitora iz Erythrina latissima /F.J. Joubert et al., Hoppe-Seyler’ Zeitsch. Pfysiol. Chem. 302, 531 (1981)/, u skladu uputama proizvođača. Matricu uravnotežimo s 0,2 amonijevim acetatnim puferom s pH 7,0, koji sadrži 0,2 N NaCl % Synperonic® i 0,02 % natrijevog azida.

b) Kromatografsko čišćenje UK2TPBB(BC) na Sepharose 4B®

Kondicionirani medij (vidi primjer 22) pripremimo 0,1% s obzirom na Synperonic® i zatim nanesemo na DE-3 Sepharosu®. Nakon blagog miješanja tijekom 1 sata pri 4°C izlijemo DE-3 Sepharosu 4B® u kolonu i ispiremo s 0,2 M NaCl, 0,1 % Synperonic®, dok UV apsorpcija pri 280 nm dosegne razine bazične linije, što označava. odsutnost proteina u eluatu. Ispiranje zatim nastavljamo s 0,2 M amonijevim acetatnim puferom s pH 7,0 koji sadrži 0,2 M amonijev tiocijanat, te 0,1 % Synperonic®. Zatim kad UV apsorpcija pri 280 nm označi odsutnost proteina u eluatu, kolonu eluiramo s 0,2 M amonijevim acetatnim puferorn s pH 7,0 koji sadrži 1,6 M amonijevog tiocijanata i 0,1% Synperonic®. Saberemo frakcije koje sadrže najviše amidolitičke aktivnosti izmjerene upotrebom fluorometričkog pokusa sa Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC kao substrata /M. Zimmermann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 750 (1978)/. Najmanje 80% aktivnosti, unešene u materijal DE-3 Sepharose 4B®, dobijemo u samo jednoj vršnoj vrijednosti.

Sabrane aktivne frakcije dijaliziramo prema 0,2 M amonijevom acetatnom puferu s pH 7,0, koji sadrži 0,1 % Synperonic®, te nanesemo na kolonu koja sadrži monoklonalno antitijelo 407A.15.27, usmjerimo prema prvoj "kringle" domeni t-PA, dovedemo na Sepharosu 4B®, uravnotežimo u 0, 2 M acetatnom puferu s pH 7, 0, koji sadrži 0, 1% Synperonic®, da se ukloni endogeni t-PA. Saberemo efluent koji sadrži UK2TPAB (BC).

Reverzna faza HPLC očišćenog UK2TPAB(BC) na koloni Nucleosil® 300-5-C18, s dimenzijama 4 x 110 mm, pokazuje samo jednu vršnu vrijednost s linearnim gradijentom tijekom 30 minuta, izlazeći iz 70%-tne otopine A, koja se sastoji od vode koja sadrži 0,1% trifluoroctene kiseline, i 30 % otopine B koja se sastoji od acetonitrila koji sadrži 0,08% trifluoroctene kiseline, te završimo sa 40% A i 60% B. Očišćeni protein, kod N-terminalne sekvence analize prvih deset aminokiselinskih ostataka, pokazuje sekvencu SNELHQVPSN, koja je identična sa sekvencom koju bi očekivali iz DNA sekvence koja kodira molekulu.

Primjer 24

Čišćenje FK2UPAB (BC) i K2UPAB (BC)

a) Priprava kolona s afinitetom prema antitijelima

Antitijela anti-UPA kunića, očišćena iz anti-uPA seruma kunića, monoklonalna antitijela 405B.33.3 i 4U6A.23.7, dovodimo na Sepharosu 4B® (Pharmacia) aktiviranu s cijanogenbromidom, u skladu s uputama proizvođača, uz upotrebu 6 mg antitijela/ml aktivirane Sepharose. Gelnu matricu uravnotežimo s PBS koji sadrži 0,1% Synperonic® i 0,1% natrijevog azida.

b) Kromatografsko čišćenje FK2UPAB (BC) i K2UPAB (BC) na antitijelu/Sepharosa 4B

Kondicionirani medij (vidi primjer 22) napravimo 0,1% s obzirom na Synperonic® i nanesemo ga na anti-uPA Sepharosu-4B ili na 405B.33.3 ili na 406.23.7 Sepharosu 4B. Zadnja dva antitijela usmjerimo prema drugoj "kringle" domeni t-PA. Nakon blagog miješanja tijekom 2 sata pri 4°C antitijelo/Sepharosu izlijemo u kolonu i ispiremo s PBS koji sadrži 1 M NaCl i 0,1% Synperonic®, dok UV apsorpcija pri 28G nm označi odsutnost proteina u koloni: Kolonu zatim eluiramo s 0,2 M glicin-HCl puferom s pH 2,5. Frakcije sakupimo u epruvetama koje sadrže nautraliziranu količinu 1 M Tris. Prikupimo frakcije koje sadrže najviše amidolitične aktivnosti izmjerene primjenom fluorometričkog pokusa sa Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC kao supstratom /M. Zimmermann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 750 (1978)/.

Rezervna faza HPLC očišćenih FK2UPAB(BC) i K2UPAB(BC) na Nucleosil® 300-5-C18 koloni s dimenzijama 4 x 110 mm, pokazuje uvijek po jednu vršnu vrijednost pri eluiranju s linearnim gradijentom tijekom 30 minuta, izlazeći iz 70 %-tne otopine A koja se sastoji od vode, koja sadrži 0,1% trifluoroctene kiseline i 30%-tne otopine B koja se sastoji od acetonitrila koji sadrži 0,08% trifluoroctene kiseline, te završimo sa 40% A i 60% B. N-krajnja sekvencna analiza prvih pet ostataka očišćenih proteina pokazuje sekvencu SYQGN za i K2UPAB (BC) i SYQVI za FK2UPAB (BC) koja je identična sa sekvencama koje bi očekivali za DNA sekvence koje kodiraju svaku molekulu.

Primjer 25

Pokus aktivnosti hibridnih plazminogenskih aktivatora u prisutnosti i osdutnosti fibrinogenskih fragmenata

Koristimo dvojni pokus kako su ga opisali Verheyen et al., /Thromb. Haemost. 48, 266 (1982)/, koji se oslanja na konverziju plazminogena u plazmin s plazminogenskim aktivatorm, nakon čega slijedi reakcija plazmina s kromogenskim plazminskim substratom H-D-valil-L-leucil-Llizil-p-nitro-anilid diklorid. Pokus vršimo na mikrotitarskoj ploči s 96 utora, te čitačem Titertek® mikrotitarskih ploča. Utori sadrže 120-X µl 0,1 mol/1 Tris-HCl pufer s ph 7,5, koji sadrži 0,1% Tween 80, 20 µl Glu-plazminogen kod 1,3 µmol/l, u gore spomenutom Tris puferu, 100 µl plazminskog substrata s 0,7 mmola/1 u Tris puferu, X µl uzorak poznate koncentracije (X odgovara 10, 20, 40 odnosno 60 µl) ili urokinazni standard definirane aktivnosti, izraženo u internacionalnim jedinicama (INT.U) te 10 µl stimulatora (fibrinogenski fragmenti) s 3 mg/ml u destiliranoj vodi ili u 10 µl destilirane vode, ako se pokusi izvode bez-stimulatora. Povećana apsorpcija svjetla podijeljena s kvadratom vremena inkubacije srazmjerna je aktivatorskoj aktivnosti plazminogena kod poznate koncentracije aktivatora, te ju izražavamo u međunarodnim jedinicama. Kao standard koristimo urokinazu visoke molekulske mase i definirane aktivnosti, izraženo u međunarodnim jedinicama (tj. INT.U; American Diagnostics). Svaki od plazminogenskih aktivatora ispita se pod jednakim uvjetima, u odsutnosti, odnosno prisutnosti fibrinogenskih fragmenata. Pod tim uvjetima dobivena razlika aktivnosti je mjerilo za stimulaciju plazminogenskih aktivatora s fibrinogenskim fragmentima. Tablica 2 prikazuje rezultate analize koja označava odsutnost stimulacije za urokinazni standard suprotno stimulaciji koju vrše fibrinogenski fragmenti na molekule novog plazminogenskog aktivatora koji sadrži katalitičku domenu urokinaze. Bez obzira na odsutnost jedne ili više nekatalitičkih domena F, G, Kl ili K2 tkivnog plazminogenskog aktivatora, opažamo stimulaciju

fibrinogenskim fragmentima za sve ispitane hibridne molekule.

Tablica 2.

[image] Primjer 26

Aktivnost mutantnih plazminogenskih aktivatora na lizu ugrušaka

Aktivnosti na lizu ugrušaka utvrđujemo primjenom pokusa kako su ga opisali R.D. Philo i P.J. Gaffney /Thromb. Haemost. 45, 107-108 (1971)/. Logaritamski iznos liznog vremena prema koncentraciji plazminogenskog aktivatora izražen je u ravnoj liniji. Specifična aktivnost plazminogenskog aktivatora odredi se usporedbom krivulja dobivenih za standardni pripremak tkivnog plazminogenskog aktivatora ili urokinaze.

Krivulje svih izmjerenih aktivatora imaju približno jednak nagib koji omogućuje izravnu vezu s vremenom potrebnim za lizu ugrušaka i njihovom specifičnom aktivnošću. Budući da različiti plazminogenski aktivatori nemaju iste molekulske mase, da se dobiju smisleni kriteriji učinkovitosti različitih molekula specifične aktivnosti moraju biti izražene u molekulskoj koncentraciji umjesto u uobičajenoj masenoj koncentraciji. Utvrdili smo da je UK2TPAB(BC) najmanje tako aktivan kao standardni t-PA, dok FGK2UPAB (BC) i FK2UPAB (BC) pokazuju aktivnosti koje su skoro jednake t-PA, iako znatno više nego kod u-PA standarda. Utvrdili smo da K2UPAB(BC) ima aktivnost koja je gotovo identična u-PA standardu. Aktivnosti pokusa prikazane su u tablici.

Tablica 3.

[image]

*) Jedinice za lizu ugrušaka izražavamo u pikomolima t-PA korištenjem molekulske mase t-PA na osnovi njene aminokiselinske sekvence te specifične aktivnosti 400.000 jedinica za lizu ugrušaka na mg.

Primjer 27

Pražnjenje plazminogenskih aktivatorskih mutantnih molekula iz optoka kunića

1. Markiranje

Sve mutantne molekule radio-markiramo sa l25J primjenom jodogenske metode /P.J. Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80, 849-857 (1978)/.

Da se ukloni suvišak slobodnog 125J mutantne molekule afinitetno se očiste ili primjenom metode opisane u primjeru 23 (PA imaju t-PA B-lanac) ili prema metodi opisanoj u primjeru 24 (PA imaju u-PA B-lanac).

Obično dobijemo specifične radioaktivnosti 2-20 µCi/g proteina. Homogenost markiranih molekula odredimo pomoću SDS elektroforeze nakon koje slijedi rendgenska autoradiografija. U svim primjerima mutantne molekule migriraju u nereduciranim uvjetima kao jednostruke trake i s Mr, koji su identični kao kod nemarkiranih proteina.

2) Proučavanje pražnjenja (Clearing)

Pokuse vršimo na novozelandskim bijelim kunićima mase 1,8 do 2,4 kg. Životinje anesteziramo subkutano s 1750 mg/kg Urethan® (Merck, Darmstadt, SRN). .Izvrši se traheotomija i cijev od plastike uvede se u vanjsku vratnu venu i zajedničku karotidnu arteriju. 0, 5 ml slane otopine puferirane s fosfatom koja sadrži otprilike 300 do 500 ng mutanta PA injiciramo u vratnu venu i preko karotidne arterije uzastopce serijski uzimamo uzorke krvi (svaki puta po 2 ml) sve vrijeme u intervalima po 60 minuta.

Uzorke krvi skupimo na citratu, odmah centrifugiramo s 3000 okretaja u minuti tijekom 15 minuta i plazmu dekantiramo. Alikvote taložimo u 10%-tnoj trikloroctenoj kiselini i prebrojimo pelete u γ-brojaču.

U usporedbi s t-PA, izoliranom iz stanične linije Bowes melanoma, mutantne molekule u optoku pokazuju slijedeće vrijeme poluraspada.

Tablica 4.

[image]

Uzorak pražnjenja t-PA signifikantno je bieksponencijalan s vrlo brzom α-fazom, nakon čega slijedi sporija β-faza eliminacije. Eliminacija UK2TPAB(BC) i K2UPAB(BC) je gotovo monofazna, iz čega zaključujemo da je razdioba u drugi odjeljak zakrenuta.

3) Razdioba u organima

Kuniće obradimo kao gore. 20 minuta nakon injekcije jodiranih mutantnih molekula kuniće žrtvujemo, oduzmemo im glavne organe, izmjerimo njihovu masu i nakon homogenizacije prebrojimo alikvot na γ-brojaču.

Tablica 5.

[image]

Mutantni PA pokazuju veću frakciju radioaktivnih molekula, koje još uvijek ostaju u optoku (supra), što se poklapa s jako smanjenim pražnjenjem iz jetre. Smanjeno uzimanje u jetri je stoga pojasnilo dulje vrijeme poluraspada i monofazan eliminacijeki uzorak mutantnih molekula, osobito UK2TPAB (BC) i K2UPAB (BC).

U primjerima 28-34 za konstrukciju kvasnih ekspresijskih plazmida koristimo plazmide pCGC5/K2UPAB, pCGC6/FUPAB, pCGC7/FK2UPAB i pCGC8/FGK2UPAB, (vidi primjer 18). Kvasna invertazna signalna sekvenca se u okviru fuzionira s različitim kodnim sekvencama. Izražene su ispod kontrole induciranog PHO5 promotora. Međutim kod nekih konstrukata mutirana su glikozilacijska mjesta.

Primjer 28

Kloniranje izvora podvajanja faga F1 u ekspresijski vektor pJDB207

Plazmidi porodice pEMBL /Dente et al., Nucl. Acid: Res. 11, 1645-55 (-983)/ imaju područja genoma faga F1 koji nudi sve cis-djelujuće elemente za DNA podvajanje morfonogenezu. Samo nakon superinfekcije s fagom F1 (pomoćni) izlučuju se velike količine jednovlaknate plazmidne DNA u medij.

Plazmid peEMBL19(+) probavi se sa ScaI i EcoRI. Izolira se 2.2 kb fragment, koji sadrži dio gena pBR32: restistentnog na ampicilin (mjesto ScaI), F1 intergensko područje i div β-galaktozidaznog gena do polilinkerskog područja (mjesto EcoRI).

Plazmid pJDB207 lineariziramo rezanjem s HpaI. 10 µu lineariziranog plazmida djelomično probavimo sa 7,5 jedinica EcoRI u prisutnosti 0,1 mg/ml homidijevog bromida tijekom 40 minuta pri 37°C. Reakciju zaustavimo dodatkom 11 mM EDTA. Izoliramo 1.8 kb EcoRI-HpaI fragment m preparativnom 0,8% agaroznom gelu.

3 µg HpaI razrezanog pJDB207 dalje probavimo sa ScaI Izoliramo 4.8 kb HpaI-ScaI fragment. DNA fragmente elektroeluiramo sa blokova agaroznog gela, očistimo DE52 kromatografijom i taloženjem s etanolom.

Povežemo 0,2 pmola svakog od 2.2 kb ScaI-EcoR: fragmenta i 1.8 kb EcoU-HpaI fragmenta i 0,1 pmola HpaI ScaI vektorskog fragmenta. Veznu smjesu koristimo za transformaciju kompetentnih stanica E.coli HB101 Ca2+.

Plazmidnu DNA 12 kolonija rezistentnih na ampicilin, analiziramo dvostrukom probavom s EcoRI/PstI. Odaberemo DNA samo jednog klona s pravilnim restrikcijskim fragmentima i nju označimo kao pJDB207FlLac.

Primjer 29

Konstrukcija plazmida pJDB207/PHO5-I-FK2UPAB

Kodnu sekvencu FK2UPAB, prisutnu u plazmidu pJDB7/FK2UPAB, pripremimo za izražavanje u kvascu fuzijom kvasne invertazne signalne sekvence i izražavanjem gena pod kontrolom PHO5 promotora.

Plazmid pCGC7/FK2UPAB (vidi primjer 18D) probavimo s PstI i BamHI. 1147 bp PstI-BamHI fragment sadrži FK2UPAB koji kodira sekvencu PstI mjesta na nukleotidnom položaju 199 t-PA (slika 1) na BamHI mjesto u položaju 1322 u-PA (slika 3).

Plazmid jPDB207/PHO5-I-TPA (vidi primjer 6c) razrežemo sa SaII i PstI. Izoliramo fragment 891 bp. Sadrži PHO5 promotor, invertaznu signalnu sekvencu i 19 baza t-PA (PstI mjesto).

Plazmidi pJDB207/PHO5-I-UPA (vidi primjer 8) probavimo , sa Sail i BamHI. 6.6 vektorski fragment sadrži 3’ dio u-PA gena iz BamHI mjesta u nukleotidnom položaju 1323 (slika 3) premaa položaju 1441 (PvuII mjesto s dodanim XhoI linkerom) i PHO5 trasnkripcijske krajnje signale.

0,2 pmola svakog od 891 bp SaII-PstI fragmenta i 1147 bp PstI-BamHI fragmenta i 0,1 pmola 6.6 kb SaII-BamHI vektroskog fragmenta povežemo i upotrijebimo za transformaciju E.coli HB101 Ca2+ stanica.

8 kolonija rezistentnih na ampicilin uzgojimo u LB mediju koji sadrži ampicilin (100 ml/1). Izoliramo plazmid DNA i analiziramo s restrikcijskom probavom s EcoRi i HindIII. Odaberemo jedan plazmid s očekivanim restrikcijskim fragmentima i označimo ga kao pJDB207/PHO5-I-FK2UPAB.

Plazmide pCGC6/FUPAB i pCGC8/FGK2UPAB može se upotrijebiti na jednak način kao pCGC7/FK2UPAB. Nastali kvasni ekspresijski plazmidi označeni su kao pJDB207/PHO5-I-FUPAB odnosno pJDB207/PHO5-I-FGK2UPAB.

Primjer 30

Mutacija glikozilacijskog mjesta kod /Asn 302/ urokinaze B-lanca

a) kloniranje PstI-BamHI fragmenta u-PA u m13mp18:

Plazmid pJDB207/PHO5-I-UPA (vidi primjer 8) sadrži potpuno kodno područje urokinaze. DNA razrežemo s PstI i BamHT. 866 bp Pstl-BamHI fragment iz urokinaznog gena sadrži glikozilacajsko mjesto (Asn 302) u nukleotidnim položajima 1033-1041. Slijedeći fragment jednake veličine dalje razrežemo s BstEII. Izoliramo 886 bp PstI-BamHI fragment na preparativnom 0,8% agaroznom gelu.

M13mp18 RF-DNA razrežemo s PstI i BamHI. 7.3 kb fragment izoliramo na preparativnom 0,8% agaroznom gelu. DNA fragmente elektroeluiramo s agaroznog gela i očistimo DE52 kromatografijom i taloženjem s etanolom.

0,1 pmola 7.3 kb PstI-BamHI razrezanog vektora i 0,2 pmola 886 kb PstI-BamHI u-PA fragmenta povežemo. Jednu µl i 3 µl vezne smjese upotrijebimo za transformaciju stanica E.coli JM108 Ca2+ u skladu s priručnikom "M13 cloning and sequencinq handbook" izdavač Amersham. Pokupimo 12 bezbojnih plakova i pripremimo jednovlakatu DNA /J. Messing, Methods in Enzymology 101, 21-78 (1983)/.

Jednovlaknatu DNA upotrijebimo za pripravu djelomično dvovlaknate DNA fuzijom i produljenjem M13 univerzalnog promjera Klenowom polimerazom. Reakcijski proizvod ekstrahiramo s fenol/kloroformom i DNA istaložimo s etanolom. DNA razrežemo s PstI i BamHI. Fragment 866 označava da se je u-Pa fragment klonirao u M13mp18 vektoru. Jedan klon dalje analiziramo i pravilan insert potvrdimo sekvenciranjem. Klon označavamo kao M13mp18/UPA.

b) Mutacija glikozilacijskog mjesta kod Asn302:

302,

(F) Ser Thr

M13mp18 insert: 3'...AAA CCT TTT CTC TTA AGA TGG CTG ATA...5'

(lanac suprotnog

smjeru) 5’-GGA AAA GAG CAA TCT ACC GAC-3’

mutagenski primjer W:

lanac mutiranog 5’….TTT GGA AAA GAG CAA TCT ACC GAC TAT…3’

smjera (F)

Primjer sekvence: CTGCCCTCGATGATAACG

• •

967 985

Mutagenske i sekvencne primjere sintetiziramo primjenom fosforamiditne metode prema /M.H. Caruthers u: Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments, (ed. H.G. Gassen and A. Zang) Verlag Chemie, Weinheirn, SRN/ na sintetizatoru Applied Biosystem Model 380B.

Mutagenezu in vitro na jednovlaknatoj šabloni vršimo kao što je opisao T.A. Kunkel /Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 448-492 (1985)/. Proizvedemo jednovlaknatu šablonu DNA koja sadrži uracil, s jednim ciklusom rasta na E.coli soju RZ1032 (dut-, ung-).

100 pmolova mutagenetskog oligonukleotidnog primjera W fosforilirarno u 20 µl 50 Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2 5 mM DTT, 0,5 mM ATP i 20 jedinica T4 polinukleotidne kinaze (Boehringer). Nakon 30 minuta pri 37°C reakciju zaustavimo grijanjem 10 minuta pri 70°C.

0,3 pmola M13mp18/UPA šablone DNA, koja sadrži uracil, inkubiramo s 10 pmola fosforiliranog mutagenetskog oligodezoksiribonukletidnog primjera W i 10 pmola M13 uraiverzalnog sekvencnog primjera u 30 µl 10 Tris-HCl pH 8,0 i 10 mM MgCl2. Uzorak zagrijemo na 80°C i pustimo ga ohladiti na sobnu temperaturu na maloj vodenoj kupelji.

c) Produžena reakcija povezivanja:

Gornjem renaturiranom uzorku dodamo 10 µl smjese enzima-D-NTP koja sadrži 1 mM dNTP, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1 mM ATP, 400 jedinica T4 DNA ligaze (Biolabs, 400 U/ µl) i 6 jedinica Klenowe DNA polimeraze (Boehringer, 6 U/µl). Inkubacija se odvija tijekom noći pri 15°C.

d) Transformacija stanica E.coli BMH7l:

Smjesu za povezivanje razrijedimo na 200 µl s TE. Po u, 0,1 µl, 1 µl i 10 µl smjese za produženo povezivanje dodamo Kompetentnima E.Coli BMH71 Ca2+ stanicama (Kunkel, supra). Nakon 30 minuta na ledu stanice toplinski šokiramo 3 minute pri 42°C i zatim ih držimo na ledu. Stanice pokrijemo s agarom i indikatorskim stanicama E.coli JM101.

Pokupimo 6 plakova i koristimo ih za inficiranje E.coli JM109. Fage izoliramo iz gornjeg sloja (supernatanta) taloženjem s PEG. Jednovlaknatu DNA pripremimo ekstrakcijom s fenolom i taloženjem s etanolom. Šablone DNA ponovno suspendiramo u TE.

Mutaciju AAT kodona (Asn302) do CAA kodona (G1n302) potvrdimo za jedan klon određivanjem DNA sekvence pomoću gore spomenutog sekvencnog uspoređivanja primjenom metode za završenje lanca /F. Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 5463-67 (1977)/. Mutacija izaziva promjenu Asn → Gln u aminokisselinskom području 302 u-PA i time eliminira samo jedno glikozilacijsko mjesto u urokinazi. W označava mutaciju glikozilacijskog mjesta u uPA B-lanca (Asn302 → G1n302). Pozitivni klon označavamo kao M13mp18/UPA-W.

Primjer 31

Transfer mutacije /G1n302/ u urokinaznom B-lancu na FK2UPAB hibrid

Plazmid pJDB207/PHO5-I-FK2UPAB probavimo sa SaII i XhoI. Izoliramo fragment 2.2 kb SalI-XhoI, elektroeluiramo iz agaroznog gela, očistimo DE52 kromatografijom i istaložimo u etanolu. Fragment DNA sadrži dva mjesta MstI u PHO5 promotoru i sekvencu u-PA. 3 u.g fragmenta 2.2 kb SalI-XhoI djelomično probavimo s 3 jedinice MstI tijekom 10 minuta pri 37°C. Reakcijske proizvode odvajamo na preparativnom 0,8%-tnom agaroznom gelu i izoliramo fragment 1.651 bp SalI-MstI i eluiramo ga iz gela. DNA fragment sadrži SalI-BamHI sekvencu pBR322, PHO5 promotor, invertaznu signalnu sekvencu i FK2UPAB kodnu sekvencu do mjesta MstI u u-PA dijelu u nukleotidnom položaju 935.

RF-DNA pripremimo za M13mp18/UPA-W (vidi primjer 30) postupkom brze izolacije DNA /D.S. Holmes et al., Analyt. Dioc iem. 114, 193-97 (1981)/. 5 µg DNA probavimo s BamHI i MstI. Nakon dodatka 2 µg RNaze (Serva) i inkubacije 5 minuta pri 37°C izoliramo fragment 387 bp MstI-BamHI na preparativnom 0,8%-tnom agaroznom gelu. DNA fragment elektroeluiramo i istaložimo u etanolu. Fragment sadrži mutaciju AAT → CAA kod nukleotidnih položaja 1033-1035 (Asn302 → Gln) u urokinaznom B-lancu.

Plazmid pJDB207/PHO5-I-UPA razrežemo sa SalI i BamHI. Izoliramo 6,6 kb vektorski fragment (vidi primjer 29). Povežemo 0,2 pmol 1651 bp SalI-MstI fragmenta, 0,2 pmola 387 bp Mstll-13amHI fragmenta i 0,1 pmola 6.6 kb SaII-BamHI vektorskog fragmenta. Transformiramo kompetentne E.coli H8101 Ca2+ stanice.

Uzgojima 12 transfornanata rezistentnih na ampicilin. Plazmid DNA izoliramo i analiziramo s restrikcijskim rezovima EcoRI i HindIII. Mutacija (W) na glikozilacijskon mjestu uništava EcoRI mjesto u nukletidnim položajima 1032-1037. Prisutnost mutacije potvrđena je DNA sekvenciranjem. Jednu plazmidnu DNA s mutacijom u u-PA B-lancu navodimo kac pJDB207/PHO5-I-FK2UPAB-W. Taj plazmid ima nedodirnuto glikozilacijsko mjesto u "kringle" K2, ali mutantno mjesto W(Asn302 → Gln) u u-PA B-lancu.

Plazmide pJDB207/PHO5-I-FUPAB-W i pJDB207/PHO5-I-FGK2UPAB-W konstruiramo na jednak način, polazeći od odgovarajućih nemutiranih plazmida (vidi primjer 29).

4,8 kb SalI-HpaI vektorski dio pJDB207/PHO5-I-FK2UPAB-H nadomjestimo sa 6.2 kb Sall-HpaI vektorskim fragmentom pJDB207F1Lac (vidi primjer 28). 6.2 kb fragment ima 1.4 kb FlLac insert pEMBL19 kloniran na 4.8 kb fragment pJDB2O7. Nakon vezanja, transforamcije i analize novog konstrukta navodimo jedan pravilan plazmid s uključkom FlLac kac pJDB207FlLac/PHO5-I-FK2UPAB-W.

Plazmid pJDB207FlLac/PHO5-I-FGK2UPAB-W dobijemo na jednak način.

Na jednak način 4.8 kb SalI-HpaI vektorski dio pJDB207/PHO5-I-MOU-K2TPAB (vidi primjer 15C) nadomjestimo sa 6.2 kb SaII-HpaI vektorskim fragmentom pJDB207FlLac. Nastali plazmid označavamo kao pJDB207FlLac/PHO5-I-UK2TPAB. Plazmide pJDB207FlLac/PHO5-I-UK2UPAB, pJDB207FlLac/PHO5-ITPAAUPAB i pJDB207FlLac/PHO5-I-UPAATPAB, dobijemo. na jednak način iz plazmida bez vektorskog fragmenta FlLac.

Primjer 32

Mutacija glikozilacijskog mjesta /Asn184Gly-Ser u “kringle” K2FK2UPAB-W.

a) Priprava jednovlaknate šablone:

Plazmid pJDB207FlLac/PHO5-I-FK2UPAB-W upotrebljavamo za transformaciju kompetentnih E.coli RZ1032 Ca2+ stanica /T.A. Kunkel, supra/. Jednu koloniju rezistentnu na ampicilin uzgajamo u LB mediju kojemu je dodano 100 µg/ml ampicilina, 20 µg/ml timidina i 20 µg/ml dezoksiadenozina. Kod stanične gustoće od 1.108/ml skupima stanice, isperemo u LB mediju i ponovno ih suspendiramo u LB mediju koji sadrži 100 µg/ml ampicilina i 0,25 µg/ml uridina. Kod OD600 dodamo 0.3 pomoćnog faga R408 (Pharmacia-PL Biochemicals, Inc.)u m.o.i. 20. Kulturu snažno tresemo 5 sati pri 37°C. Jeunovlaknatu DNA koja sadrži uracil izoliramo iz medija tako kako su opisali T.A. Kunkel (vidi gore). Polazeći od pEMBL19(+) (vidi primjer 28) kloniramo F1 područje u puDB207 u orijentaciji suprotnoj kazaljci na satu. Izolirana jednovlaknata DNA je smisleno Vlakno FK2UPAB uključka u ekspresijskom plazmidu.

b) Mutaciia glikozilacijskog mjesta kod Asn184 "kringle" K2 t-PA

Mutacija se nanosi na treći položaj podudarnog aminokiselinskog prepoznavanja sekvence za glikozilaciju. Ser-186 nadomješten je s Ala.

SSDNA: 184 186

(lanac pravog Asn Gly (F)

usmjerenja) 5'-,..GGG AAT GGG TCA GCC TAC CGT...-3'

mutagenski 3'- CC TTA CCC CGT CGG ATG - -5'

primjer Y:

lanac mutiranog 5'-…GGG AAT GGG GCA GCC TAC CGT...-3'

usmjerenja: Asn Gly (F)

primjer sekvence: 5'-CCACGGGAGGCAGGAGG-3

• •

791 775

Mutacijski protokol je kao onaj opisan u primjeru 30. Umjesto M13 univerzalnog sekvencnog primjera koristimo PHO5, oligonukletidni i primjer formule 5’-ATGCGAGGTTAGTATGGC-3’ koji i. hibridizira do nukleotida -60 do -77 iz ATG u PHO5 u promotoru. Nakon reakcije produljenja i povezivanja pretvorimo kompetentne E.coli BMH71 Ca2+ stanice. /Kunkel, supra/. Kolonije rezistentne na ampicilin pokupimo i uzgajamo u LB mediju koji sadrži 100 mg/1 ampicilina.

Pripremimo plazmid DNA i analiziramo na prisutnost mutacije DNA sekvenciranjem. Mutacija TCA kodona do GCA uzrokuje promjenu Ser → Ala u položaju amino kiseline 186 t-PA. Mutacija u trećem položaju podudarne sekvence ukloni glikozilacijsko mjesto. Jedan klon s mutiranom DNA navodimo kao pJDB207FlLac/PHO5-I-FK2UPAB-WY.

Y označava mutaciju glikozilacijskog mjesta kod Asn184 u K2 t-PA, a W mutaciju kod Asn302 u U-PA B-lanca. Nastali neglikolizirani FK2UPAB hibridni protein ima dvije amino kiselinske promjene: Ser186 → Ala u t PA "kringle" K2 i Asn302 → Gln u u-PA B-lanca.

Analogna mutacija plazmida pJDB207FlLac/PHO5-I-FGK2UPAB-W (vidi primjer 31) vodi do plazmida pJDB207F1Lac/PHO5-I-FK2UPAB-WY, koji kodira za negliko-zilirani FGK2UPAB hibridni protein.

Primjer 33

Konstrukcija plazmida pJDB207FlLac/PHO5-I-K2UPAB-WY

Nukleotidna sekvenca koja kodira za hibridni K2-UPAB protein, kako je definirana s aminokiselinskim slijedom tPA (Ser1-Gln3) (G1y176-Arg275) -uPA (Ilel59-Leu411) nalazi se u plazrnidu pCGC5/K2UPAB. Za izražavanje u kvascu koristimo inducirani PHO5 promotor i povežemo invertazni signalni slijed u okvir sa K2UPAB kodnim područjem. Plazmid pCGC5/K2UPAB razrežemo s Bg1II i AccI. Izoliramo 487 bp Bg1II-AccI fragment. Sadrži kodnu sekvencu iz BglII mjesta t-PA (nukleotidni položaj 178) na AccI mjesto u u-PA (nukleotidni položaj 779). Fragment razrežemo s HphI, što daje 4 fragmenta.

Dva oligcdezoksiribonukleotida formule

Asn (F)

(I) 5'-CTGCATCTTACCAAGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGGCAGCCTACCGTGGCACG -3’

(II) 3'- AGAATGGTTCCTTTGTCACTGACGATGAAACCCTTACCCCGTCGGATGGCACCGTG -5’

sintetiziramo primjenom fosforamiditne metode na sintetizatoru Applied Biosystem Model 380B. Oligonukleotidi I i II tvore dvovlaknati DNA linker. 5-nukleotidi na otvorenom 5 kraju dio su kvasne invertazne signalne sekvence, nakon čega slijedi t-PA kodna sekvenca (Serl-Gln3)-(G1y176-Thr191) do prvog HphI rezanog mjesta u nukleotidnom položaju 752 (vidi sliku 1). Glikozilacijsko mjesto u položaju 729-737 (AsnGlySer) je mutirano u sintetičkoj sekvenci od TCA (Ser) do GCA (Ala), čime je uklonjena glikozilacijska sekvenca prepoznavanja. Mutacija glikozilacijskog mjesta u aminokiselinskirn položajima 184186 t-PA (npr. drugo glikozilacijsko mjesto u izvornom t-PA) označena je kao Y.

Oligonukleotide I i II fosforiliramo na njihovim krajevima 5’, grijemo 10 minuta pri 85°C i renaturiramo tijekom hlađenja na sobnu temperaturu. 10,5 µg (270 pmolova) kinalizirane, dvovlaknate linkerske DNA povežemo u trideseterostrukom molnom suvišku na HphI rezane fragmente (vidi gore), kako je opisano u primjeru 8B. Suvišne linkerske molekule uklonimo taloženjem s izopropanolom. DNA nadalje probavimo sa ScaI. Izoliramo fragment 252 kb na preparativnom 1,5% agaroznom gelu, elektroeluiramo i taložimo u etanolu.

Plazmid P31RIT-12 (vidi primjer 6B) probavimo sa SalI i Xhol. Izolirani fragment probavimo nadalje s HgaI (vidi primjer 6C) i BamHI. Izoliramo nastali fragment 591 bp BamHI-HgaI. On sadrži PHO5 promotor i invertaznu signalnu sekvencu.

Plazmid pJDB207/PHO5-I-K2UPAB-W probavimo s BamHI. 5 linearne DNA djelomično probavimo s 10 jedinica ScaI tijekom 10 minuta. Reakciju zaustavljamo dodatkom 10 mM EDTA. 7.7 kb BamHI-ScaI vektorski fragment izoliramo, elektroeluirarno i istaložimo u etanolu. On sadrži 3’ dio kodne sekvence ScaI mjesta u t-PA (položaj 953) do kraja u-PA B-lanca (PvuII mjesto u položaju 144- s dodanim XhoI linkerom), PHO5 krajnje i pJDB207 vektorske sekvence. Povežemo 0,2 pmola svakog od 591 bp BamHI-HgaI fragmenta i 252 bp ljepljivih krajeva (linker)-Scal fragmenta i 0,1 pmola 7.7 kb vektorskog fragmenta. Nakon transformacije E.coli HB101 Ca2+ stanica uzgojima 12 kolonija rezistentnih na ampicilin. Plazmid DNA izoliramo i analiziramo probavama s EcoRI i HindIII. Prisutnost mutacija provjerimo DNA sekvenciranjem. Odabiremo jedan pravilan klon i njega navodimo kao pJDB207/PHO5-I-K2UPAB-WY. Glikozilirana mjesta i "kringle" K2 t-FA i u u-PA B-lanca su mutirana (Y odnosno W).

Nastali neglikozilirani K2UPAB hibridni protein ima dvije aminokiselinske promjene: Ser186 → Ala u t-PA K2 domeni i Asn302 → Gln u u-PA B-lancu.

Primjer 34

Mutacija glikozilacijskih mjesta /Asn184GlySer/ i /Asn44BArgThr/ u hibridu K2UPAB

Jednovlaknatu šablonu /T.A. Kunkel, supra/ koja sadrži uracil; plazmida pJDB207/FlLac/PHO5-I-UK2TPAB (vidi primjer 31) pripremimo tako kako je opisano u primjeru 30. Shema mutacije za glikozilacijsko mjesto kod Asn184 je kao ona opisana u primjeru 32. Mutacija glikozilacijskog mjesta kod Asn448 uzrokuje aminokiselinsku promjenu Thr450 → Ala.

jednovlaknata DNA 448 450

(vlakna pravilnog Asn Arg (F)

usmjerenja) 5'-...CTT AAC AGA ACA GTC ACC GAC A...-3'

mutagenski 3’-...GAA TTG TCT CGT CAG TGG CTG T…..-5'

primjer Z:

vlakno mutiranog 5'- CTT AAC AGA GCA GTC ACC GAC A -3'

usmjerenja: Asn Arg (F)

sekvencni primjer: 5’-TGGCAGGCGTCGTGCAA-3'

• •

1603 1587

Mutacijski protokol opisan je u primjeru 30. Oba fosforilirana mutagenska primjera Y i Z su renaturirani u jednovlaknatu šablonu pJDB207FlLac/PHO5-I-UK2TPAB, koja sadrži uracil. U danom slučaju koristimo .još PHO5 oligonukletidni primjer (vidi primjer 32).

Nakon reakcije produljenja i povezivanja trasformiraju se kompetentne E.coli BMH71 Ca2+ stanice. Pripremimo plazmid transformanata rezistentnih na ampicilin i prisutnost obaju mutacija analiziramo sekvenciranjem DNA s označenim sekventnim uspoređivanjima.

Plazmid DNA jednog klona s obje mutacije navodimo kao pJDB207FlLac/PHO5-I-UK2TPAB-YZ. Y označava mutaciju glikozi-lacijskog mjesta kod Asn184, Z mutaciju kod Asn448. Neglikolizirani hibridni protein UK2TPAB ima dvije aminokiselinske promjene: Ser186 → Ala u K2 "kringle" t-PA i Thr450 → Ala u t-PA B-lancu.

Mutacijski protokol bio također upotrijebljen šablone

pJDB207FlLac/PHO5-I-UK2TPAB,

pJDB207FlLac/PHO5-I-TPAAUPAB i

pJDB207FlLac/PHO5-I-UPAATPAB- (vidi primjer 31)

s mutagenetskim primjerom W za mutaciju glikozilacijskog mjesta u-PA B-lanca i/ili mutagenskog primjera Y i Z i druge, objavljene u europskoj patentnoj prijavi br. 225286, za mutaciju glikozilacijskih mjesta u t-PA.

Primjer 35

Transformacija Saccharomyces cereviesiae GRF18 i priprava kvasnih staničnih ekstrakata

Plazmide

pJDB207/PHO5-I-FK2UPAB,

pJDB207F1Lac/PHO5-I-FK2UPAB-W,

pJDB207F1Lac/PHO5-I-FR2UPAB-WY,

pJDB207F1Lac/PHO5-I-UK2TPAB,

pJDB207F1Lac/PHO5-I-UK2TPAB-YZ,

pJDB207/PHO5-I-K2UPAB-WY,

pJDB207/PHO5-I-FUPAB,

pJDB207/PHO5-I-FUPAB-W,

pJDB207/PHO5-I-FGK2UPAB,

pJDB207/PHO5-I-FGK2UPAB-W,

pJDB207F1Lac/PHO5-I-FGK2UPAB-W'.i

pJDB207F1Lac/PHO5-I-FGK2UPAB-WY

transformiramo u Saccharomyces cereviesiae soj GRF18 (DSM 3665). Transformacija, stanični rast i priprava staničnih ekstrakata opisani su u primjeru 16.

Nastale hibridne plazminogenske aktivatore možemo očistiti analogno načinu opisanom u primjerima 22 do 24.

Primjer 36

Pripravaa liofiliziranih, hibridnih plazminogenskih aktivatora

Otopinu dobivenu po bilo kojem od primjera 22 do 24 čistimo dalje i liofiliziramo kako slijedi:

Otopinu razrijedimo s 10 volumena 0,1 M amonijevog acetata s pH 5,0 (cjelokupni volumen 80 ml) i nanesemo na kolonu koja sadrži 5 ml CM-Sepharoze Fast Flow (Pharmacia) s protokom 25 ml/sat pri sobnoj temperaturi. Kolonu smo prethodno uravnotežili s 0,1 M amonijevim acetatom. Perkolat, koji ne sadrži proizvod, odbacimo. Kolonu isperemo s 15 ml 0, 1 M amonijevog acetata s pH S, 0 i s 10 ml 0,1 M amonijevog acetata s pH 7,0. Zatim provedemo eluiranje apsorbiranog hibridnog PA s 1 M amonijevim acetatorn s pH 8,6 pri sobnoj temperaturi (protok 5 ml/sat). Da spriječimo tvorbu plina na koloni izvršimo eluiranje pod povišenim tlakom 1 do 1,5 bara. Sadržaj hibridnog PA u eluatu mjerimo s UV monitorom (280 nm). Skupimo frakcije koje sadrže pribl. 90% eluiranog hibridnog PA i podvrgnemo liofilizaciji. Čistoća čvrstog hibridnog PA liofilizata je pribl. ili iznad 95%, kako ocjenjujemo s HPLC. Proizvod ne sadrži deterdžente.

Primjer 37

Prvi farmaceutski sastav za parenteralno davanje

Otopinu koja sadrži čisti uPA(1-44)-tPA(176-527), dobiven kao što je gore opisano, dijaliziramo prema 0,3 molarnom natrijevom kloridu, koji sadrži 0,01% Tween 80®, i pohranimo pri -80°C. Prije davanja namjestimo koncentraciju na 75 µg/ml cjelokupnog PA i 0,3 M NaCl. Otopinu steriliziramo filtracijom kroz membranski filtar 0,22 µl.

Umjesto gore spomenutog PA možemo upotrijebiti također jednaku količinu drugih PA, opisanih u prethodnim primjerima, kao npr.:

uPA(1-158)-tPA(276-527),

uPA(1-131)-tPA(263-527), tPA(1-275)-uPA(159-411),

tPA(1-262)-uPA(132-411), uPA(1-44)-tPA(176-261)-uPA(134-411),

tPA(1-49)-tPA(262-275)-uPA(159-411), tPA(1-49)-uPA(134-411),

tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411),

tPA(1-49)-tPA(176-262)-uPA(132-411),

tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411);

tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411) ili

tPA(1-86)-tPA(176-262)-uPA(132-411);

ili mutantni hibridni PA, kao npr.

tPA(1-49)-tPA(262-275)-uPA(159-301, Gln, 303-411),

tPA(1-49)-tPA(176-185, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gln, 303-411),

uPA(1-44)-tPA(176-185, Ala, 187-449, Ala, 451-527),

tPA(1-3)-tPA(176-185, Als, 187-275)-uPA(159-301, Gln, 3D3-411) ili

tPA(1-86)-tPA(176-185, Ala,.l87-275)-uPA(159-301, Gln, 303-411).

Primjer 38

Drugi farmaceutski sastav za parenteralno davanje (disperzija za injekcije)

169,3 mg sojinog lecitina (sojin fosfatit NC 95, proizvođač: Nattermann, Koeln, SRN, čistoće 90 do 96%; sastav masnih kiselina: linolna kiselina 61 do 71%, linolenska kiselina 4 do 7%, uljna kiselina 6 do 13%, palmitinska kiselina 10 do 15%, stearinska kiselina 1,5 do 3,5%) i 92,7 mg čistog natrijevog glikoholata otopimo u 752,5 ml sterilizirane vode. Otopini namjestimo pH na 7,4 s 1N NaOH. Dodamo 10 mg liofiliziranog uPA(1-44)-tPA(176-527). Smjesu miješamo dok dobijemo bistru otopinu. Otopinu steriliziramo filtracijom kroz membranski filter 0,22 µm i napunimo ampule.

Umjesto gore spomenutog PA možemo upotrijebiti također i jednaku količinu nekog drugog PA opisanog u prethodnim primjerima, kao npr.:

uPA(1-158)-tPA(276-527),

uPA(1-131)-tPA(263-527), tPA(1-275)-uPA(159-411),

tPA(1-262)-uPA(132-411), uPA(1-44)-tPA(176-261)-uPA(134-411),

tPA(1-49)-tPA(262-275)-uPA(159-411), tPA(1-49)-uPA(134-411),

tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411),

tPA(1-49)-tPA(176-262)-uPA(132-411),

tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411);

tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411) ili

tPA(1-86)-tPA(176-262)-uPA(132-411),

ili mutantni hibridni PA, kao npr.

tPA(1-49)-tPA(262-275)-uPA(159-301, Gln, 303-411),

tPA(1-49)-tPA(176-185, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gln, 303-411),

uPA(1-44)-tPA(176-185, Ala, 187-449, Ala, 451-527),

tPA(1-3)-tPA(176-185,'Ala, l87-275)-uPA(159-301, Gln, 303-411),

tPA(1-86)-tPA(176-185, Ala, 187-275)-uPA(159-301, Gln, 303-411).

Primjer 39

Treći farmaceutski sastav za parenteralno davanje (uključiv bolusne infekcije)

100 mg hibridnog plazminogenskog aktivatora ili mutantnog hibridnog plazminogenskog aktivatora, npr. takovog kao što su oni spomenuti u primjerima 37 do 38, otopimo u 1000 ml 50 mM glutaminske kiseline/natrijev glutamat, koji sadrži 0, 7% NaCl, s pH 4, 5. S otopinom punimo ampule, a možemo ju upotrijebiti i za intravenoznu (bolusnu) infuziju.

Deponiranje mikroorganizama

Slijedeće vrste deponirali smo godine 1987 pri Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen (DSM), Grisebachs-strasse 8, D-3000 Göttingen, SRN (s danim pristupnim brojevima):

E.coli HB101/pW349F Pristupni broj:

E.coli.HB101/pCS16

E.coli HB101/pcUK176

E.coli HB101/pCGA26

E.coli HB101/pSV2911neo.

Slijedeće hibridne stanične linije deponirali smo 1987. g. u "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes", Institut Pasteur, Pariz, (CNCM), Francuska, pod danim pristupnim brojevima.

Hibridomi: Pristupni broj:

405B.33.3

406A.23.7

407A.15.27

Claims (27)

1. Jednolančani hibridni plazminogenski aktivator, naznačen time, da se sastoji od a) humane t-PA "kringle" 2 domene, humane katalitičke u-PA domene i spojne sekvencije koja povezuje humanu t-PA "kringle" 2 domenu s humanom u-PA katalitičkom domenom, pri čemu je spojna sekvencija odabrana iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije koja povezuj e A-lanac s B-lancem u humanom t-PA spojne sekvencije koja povezuj e A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije sastavljene od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, k tome N-terminalni, cisteinski ostatak sposoban za tvorbu sumpor-sumpor mosta na humanu u-PA katalitičku domenu; i opcijski dodatno jedne ili više sekvencija odabranih iz skupine koja se sastoji od (i) spojne sekvencije koja N-terminalno pokriva "kringle" 2 domenu u humanom t-PA ili njezin fragment, a koja je spojna sekvencija ili njezin fragment smještena u hibridnom plazminogenskom aktivatoru N-terminalno prema humanoj t-PA "kringle" 2 domeni; te (ii) T-regiju humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, a koja je T-regija ili njezin fragment smještena na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora; b) humane t-PA "finger" domene, humane t-PA "kringle" 2 domene, humane u-PA katalitičke domene i spojne sekvencije koja povezuj e humanu t-PA "kringle" 2 domenu i humanu u-PA katalitičku domenu, a koja spojna sekvencija je odabrana iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije što povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije sastavljene od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, k tome N-terminalni, cisteinski ostatak što može tvoriti mostove sumpor-sumpor na humanu u-PA katalitičku domenu; te opcijski dodatno jedne ili više sekvencija odabranih iz skupine koja se sastoji od (i) spojne sekvencije koja C-terminalno pokriva "finger" domenu u humanom t-PA, spojne sekvencije koja N-terminalno pokriva "kringle" 2 domenu u humanom t-PA, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju koja je sastavljena od obje rečene spojne sekvencije ili njihovih fragmenata, a koja spojna sekvencija ili sjedinjena spojna sekvencija je smještena između t-PA "finger" domene i t-PA "kringle" 2 domene u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; i (ii) T-regije humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, a koja T-regija ili njezin fragment je smješten na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora; (c) humane t-PA "finger" domene, humane t-PA domene faktora rasta, humane t-PA "kringle" 2 domene, humane u-PA katalitičke domene, i spojne sekvencije koja povezuje humanu t-PA "kringle" 2 domenu s humanom u-PA katalitičkom domenom, a koja spojna sekvencija se odabire iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije koja je sastavljena od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, k tome N-terminalni, cisteinski ostatak koji može tvoriti most sumpor-sumpor na humanu u-PA katalitićku domenu; i opcijski dodatno jednu ili više sekvencija odabranih iz skupine koja sadrži (i) spojnu sekvenciju koja C-terminalno pokriva "finger" domenu u humanom t-PA ili njezin fragment, spojnu sekvenciju koja N-terminalno pokriva t-PA domenu faktora rasta u humanom t-PA ili njezin fragment, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju sastavljenu od rečene obje spojne sekvencije ili njihovih fragmenata, pri čemu su rečene spojne sekvencije ili sjedinjene spojne sekvencije smještene između "finger" domene i domene faktora rasta u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; (ii) spojnu sekvenciju koja C-terminalno pokriva domenu faktora rasta u humanom t-PA ili njezin fragment, spojnu sekvenciju koja N-terminalno pokriva "kringle" 2 domenu u humanom t-PA ili njezin fragment, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju koja se sastoji od obje spomenute spojne sekvencije ili od njihovih fragmenata, pri čemu su rečene spojne sekvencije ili sjedinjene spojne sekvencije smještene između faktora rasta i "kringle" 2 domene u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; te (iii) T-regiju humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, a koja T-regija ili njezin fragment je smještena na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora.

2. Jednolančani hibridni plazminogenski aktivator prema zahtjevu 1, naznačen time, da je odabran iz skupine koja se sastoji od tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA-(159-411), tPA(1-49)-tPA(176-275)uPA(159-411) i tPA(1-86) -tPA(176-275) -uPA(159-411).

3. Jednolančani hibridni plazminogenski aktivator prema zahtjevu l, naznačen time, da je to tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411).

4. Sekvencija DNA, naznačena time, da je šifrirana za jednolančani hibridni plazminogenski aktivator, koji se sastoji od a) humane t-PA "kringle" 2 domene, humane katalitičke u-PA domene i spojne sekvencije koja povezuje humanu t-PA, "kringle" 2 domenu s humanom u-PA katalitičkom domenom pri čemu je spojna sekvencija odabrana iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije sastavljene od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, k tome N-terminalni, cisteinski ostatak sposoban za tvorbu sumpor-sumpor mosta na humanu u-PA katalitičku domenu; i opcijski dodatno jedne ili više sekvencija odabranih iz skupine koja se sastoji od (i) spojne sekvencije koja N-terminalno pokriva "kringle" 2 domenu u humanom t-PA ili njezin fragment, a koja je spojna sekvencija ili njezin fragment smještena u hibridnom plazminogenskom aktivatoru N-terminalno prema humanoj t-PA "kringle" 2 domeni; te (ii) T-regiju humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, koja je T-regija ili njezin fragment smještena na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora; b) humane t-PA "finger" domene, humane t-PA "kringle" 2 domene, humane u-PA katalitičke domene i spojne sekvencije koja povezuje humanu t-PA "kringle" 2 domenu i humanu uPA katalitičku domenu, a koja spojna sekvencija je odabrana iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije što povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencijom sastavljene od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, i k tome N-terminalni, cisteinski ostatak što može tvoriti moste sumpor-sumpor na humanu uPA katalitičku domenu; te opcijski dodatno jednu ili više sekvencija odabranih iz skupine koja se sastoji od (i) spojne sekvencije koja C-terminalno pokriva "finger" domenu u humanom t-PA, spojne sekvencije koja N-terminalno pokriva "kringle" 2 domenu u humanom t-PA, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju koja je sastavljena od obje rečene spojne sekvencije ili njihovih fragmenata, a koja je spojna sekvencija ili sjedinjena spojna sekvencija smještena između t-PA "finger" domene i t-PA "kringle" 2 domene u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; i (ii) T-regije humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, a koja T-regija ili njezin fragment je smješten na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora; (c) humane t-PA "finger" domene, humane t-PA domene faktora rasta, humane t-PA "kringle" 2 domene, humane u-PA katalitičke domene, i spojne sekvencije koja povezuje humanu t-PA "kringle" 2 domenu s humanom u-PA katalitičkom domenom, a koja spojna sekvencija se odabire iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije koja povezuj e A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije koja je sastavljena od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, k tome N-terminalni, cisteinski ostatak koji može tvoriti most sumpor-sumpor na humanu u-PA katalitičku domenu; i opcijski dodatno jednu ili više sekvencija odabranih iz skupine koja sadrži (i) spojnu sekvenciju koja C-terminalno pokriva "finger" domenu u humanom t-PA ili njezin fragment, spojnu sekvenciju koja N-terminalno pokriva t-PA domenu faktora rasta u humanom t-PA ili njezin fragment, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju sastavljenu od rečene obje spojne sekvencije ili njihovih fragmenata, pri čemu su rečene spojne sekvencije ili sjedinjene spojne sekvencije smještene između "finger" domene i domene faktora rasta u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; (ii) spojnu sekvenciju koja C-terminalno pokriva domenu faktora rasta u humanom t-PA ili njezin fragment, spojnu sekvenciju koja N-terminalno pokriva "kringle" 2 domenu u humanom t-PA ili njezin fragment, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju koja se sastoji od obje spomenute spojne sekvencije ili od njihovih fragmenata, pri čemu su rečene spojne sekvencije ili sjedinjene spojne sekvencije smještene između faktora rasta i "kringle" 2 domene u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; te (iii) T-regiju humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, a koja je T-regija ili njezin fragment smještena na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora.

5. Sekvencija DNA prema zahtjevu 4, naznačena time, da je šifrirana za jednolanačani hibridni plazminogenski aktivator odabran iz skupine koja se sastoji od tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA(159-411), tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411) i tPA(1-86)tPA(176-275)-uPA(159-411).

6. Sekvencija DNA prema zahtjevu 4, naznačena time, da je šifrirana za jednolanačani hibridni plazminogenski aktivator, te da je to tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA-(159-411).

7. Hibridni vektor, naznačen time, da je za primjenu u eukariotskom domaćinu koji sadrži sekvenciju DNA šifriranu za jednolančani hibridni plazminogenski aktivator, koji se sastoji od a) humane t-PA "kringle" 2 domene, humane katalitičke u-PA domene i spojne sekvencije koja povezuje humanu t-PA "kringle" 2 domenu s humanom u-PA katalitičkom domenom, pri čemu je spojna sekvencija odabrana iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije sastavljene od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, k tome N-terminalni, cisteinski ostatak sposoban za tvorbu sumpor-sumpor mosta na humanu u-PA katalitićku domenu; i opcijski dodatno jedne ili više sekvencija odabranih iz skupine koja se sastoji od (i) spojne sekvencije koje N-terminalno pokrivaju "kringle" 2 domenu u humanom t-PA ili njezin fragment, a koja je spojna sekvencija ili njezin fragment smještena u hibridnom plazminogenskom aktivatoru N-terminalno prema humanoj t-PA "kringle" 2 domeni; te (ii) T-regiju humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, koja je T-regija ili njezin fragment smještena na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora; b) humane t-PA "finger" domene, humane t-PA "kringle" 2 domene, humane u-PA katalitičke domene i spojne sekvencije koja povezuje humanu t-PA "kringle" 2 domenu i humanu u-PA katalitičku domenu, a koja spojna sekvencija je odabrana iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije što povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencijom sastavljene od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, i k tome N-terminalni, cisteinski ostatak što može tvoriti mostove sumpor-sumpor na humanu u-PA katalitičku domenu; te opcijski dodatno jednu ili više sekvencija odabranih iz skupine koja se sastoji od (i) spojne sekvencije koja C-terminalno pokriva "finger" domenu u humanom t-PA, spojne sekvencije koja N-terminalno pokriva "kringle" 2 domenu u humanom t-PA, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju koja je sastavljena od obje rečene spojne sekvencije ili njihovih fragmenata, a koja je spojna sekvencija ili sjedinjena spojna sekvencija smještena između t-PA "finger" domene i t-PA "kringle" 2 domene u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; i (ii) T-regije humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, a koja je T-regija ili njezin fragment smještena na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora; (c) humane t-PA "finger" domene, humane t-PA domene faktora rasta, humane t-PA "kringle" 2 domene, humane u-PA katalitičke domene, i spojne sekvencije koja povezuj e humanu t-PA "kringle" 2 domenu s humanom u-PA katalitičkom domenom, a koja spojna sekvencija se odabire iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije koja je sastavljena od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, i k tome N-terminalni, cisteinski ostatak koji može tvoriti most sumpor-sumpor na humanu u-PA katalitičku domenu; i opcijski dodatno jednu ili više sekvencija odabranih iz skupine koja sadrži (i) spojnu sekvenciju koja C-terminalno pokriva "finger" domenu u humanom t-PA ili njezin fragment, spojnu sekvenciju koja N-terminalno pokriva t-PA domenu faktora rasta u humanom t-PA ili njezin fragment, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju sastavljenu od rečene obje spojne sekvencije ili njihovih fragmenata, pri čemu su rečene spojne sekvencije ili sjednjene spojne sekvencije smještene između "finger" domene i domene faktora rasta u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; (ii) spojnu sekvenciju koja C-terminalno pokriva domenu faktora rasta u humanom t-PA ili njezin fragment, spojnu sekvenciju koja N-terminalno pokriva "kringle" 2 domenu u humanom t-PA ili njezin fragment, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju koja se sastoji od obje spomenute spojne sekvencije ili od njihovih fragmenata, pri čemu su rečene spojne sekvencije ili sjedinjene spojne sekvencije smještene između faktora rasta i "kringle" 2 domene u hibridnom plazminogenskom akiivatoru; te (iii) T-regiju humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, a koja je T-regija ili njezin fragment smještena na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora.

8. Hibridni vektor prema zahtjevu 7, naznačen time, da je za primjenu u eukariotskom domaćinu koji sadrži DNA sekvenciju šifriranu za jednolančani hibridni plazminogenski aktivator odabran iz skupine koja sadrži tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA-(159-411), tPA(149)-tPA(176-275)-uPA(159-411) i tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411).

9. Hibridni vektor prema zahtjevu 7, naznačen time, da je za primjenu u eukariotskom domaćinu koji sadrži DNA sekvenciju šifriranu za jednolančani hibridni plazminogenski aktivator, a koji je tPA(1-3)-tPA(176-275) –Upa-(159-411).

10. Eukariotska domaćinska stanica, naznačena time, da je transformirana s hibridnim vektorom koji sadrži DNA sekvenciju šifriranu za jednolanačani hibridni plazminogenski aktivator koji se sastoji od a) humane t-PA "kringle" 2 domene, humane katalitičke u-PA domene i spoj ne sekvencije koja povezuje humanu t-PA "kringle" 2 domenu s humanom u-PA katalitičkom domenom, pri čemu je spojna sekvencija odabrana iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije sastavljene od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, k tome N-terminalni, cisteinski ostatak sposoban za tvorbu sumpor-sumpor mosta na humanu u-PA katalitičku domenu; i opcijski dodatno jedne ili više sekvencija odabranih iz skupine koja se sastoji od (i) spojne sekvencije koje N-terminalno pokrivaju "kringle" 2 domenu u humanom t-PA ili njezin fragment, a koja je spojna sekvencija ili njezin fragment smještena u hibridnom plazminogenskom aktivatoru N-terminalno prema humanoj t-PA "kringle" 2 domeni; te (ii) T-regiju humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragent, koja je T-regija ili njezin fragment smještena na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora; b) humane t-PA "finger" domene, humane t-PA "kringle" 2 domene, humane u-PA katalitičke domene i spojne sekvencije koja povezuj e humanu t-PA "kringle" 2 domenu i humanu uPA katalitičku domenu, a koja spojna sekvencija je odabrana iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije što povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije sastavljene od subsekvencij a rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, i k tome N-terminalni, cisteinski ostatak što može tvoriti mostove sumpor-sumpor na humanu u-PA katalitičku domenu; te opcijski dodatno jednu ili više sekvencija odabranih iz skupine koja se sastoji od (i) spojne sekvencije koja C-terminalno pokriva "finger" domenu u humanom t-PA, spojne sekvencije koja N-terminalno pokriva "kringle" 2 domenu u humanom t-PA, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju koja je sastavljena od obje rečene spojne sekvencije ili njihovih fragmenata, a koja spojna sekvencija ili sjedinjena spojna sekvencija je smještena između t-PA "finger" domene i t-PA "kringle" 2 domene u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; i (ii) T-regije humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, a koja je T-regija ili njezin fragment smještena na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora; (c) humane t-PA "finger" domene, humane t-PA domene faktora rasta, humane t-PA "kringle" 2 domene, humane u-PA katalitičke domene, i spojne sekvencije koja povezuje humanu t-PA "kringle" 2 domenu s humanom u-PA katalitičkom domenom, a koja spojna sekvencija se odabire iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije koja je sastavljena od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, i k tome N-terminalni, cisteinski ostatak koji može tvoriti most sumpor-sumpor na humanu u-PA katalitičku domenu; i opcijski dodatno jednu ili više sekvencija odabranih iz skupine koja sadrži (i) spojnu sekvenciju koja C-terminalno pokriva "finger" domenu u humanom t-PA ili njezin fragment, spojnu sekvenciju koja N-terminalno pokriva t-PA domenu faktora rasta u humanom t-PA ili njezin fragment, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju sastavljenu od rečene obje spojne sekvencije ili njihovih fragmenata, pri čemu su rečene spojne sekvencije ili sjednjene spojne sekvencije smještene između "finger" domene i domene faktora rasta u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; (ii) spojnu sekvenciju koja C-terminalno pokriva domenu faktora rasta u humanom t-PA ili njezin fragment, spojnu sekvenciju koja N-terminalno pokriva "kringle" 2 domenu u humanom t-PA ili njezin fragment, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju koja se sastoji od obje spomenute spojne sekvencije ili od njihovih fragmenata, pri čemu su rečene spojne sekvencije ili sjedinjene spojne sekvencije smještene između faktora rasta i "kringle" 2 domene u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; te (iii) T-regiju humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, a koja je T-regija ili njezin fragment smještena na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora.

11. Eukariotska domaćinska stanica prema zahtjevu 10, naznačena time, da je transformirana pomoću hibridnog vektora koji sadrži sekvenciju DNA šifriranu za jednolančani hibridni plazminogenski aktivator odabran iz skupine koja se sastoji od tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA-(159-411), tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411) i tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411).

12. Eukariotska domaćinska stanica prema zahtjevu 10, naznačena time, da je transformirana pomoću hibridnog vektora koji sadrži sekvenciju DNA šifriranu za jednolančani hibridni plazminogenski aktivator, a koji je tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA-(159-411).

13. Metoda, naznačena time, da je za pripravu jednolančanog hibridnog plazminogenskog aktivatora, koji se sastoji od a) humane t-PA "kringle" 2 domene, humane katalitičke u-PA domene i spojne sekvencije koja povezuje humanu t-PA "kringle" 2 domenu s humanom u-PA katalitičkom domenom, pri čemu je spojna sekvencija odabrana iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije sastavljene od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, k tome N-terminalni, cisteinski ostatak sposoban za tvorbu sumpor-sumpor mosta na humanu u-PA katalitičku domenu; i opcijski dodatno jedne ili više sekvencija odabranih iz skupine koja se sastoji od (i) spojne sekvencije koja N-terminalno pokriva "kringle" 2 domenu u humanom t-PA ili njezin fragment, a koja je spojna sekvencija ili njezin fragment smještena u hibridnom plazminogenskom aktivatoru N-terminalno prema humanoj t-PA "kringle" 2 domeni; te (ii) T-regiju humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragent, koja je T-regija ili njezin fragment smještena na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora; b) humane t-PA "finger" domene, humane t-PA "kringle" 2 domene, humane u-PA katalitičke domene i spojne sekvencije koja povezuj e humanu t-PA "kringle" 2 domenu i humanu u-PA katalitičku domenu, a koja spojna sekvencija je odabrana iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije što povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije sastavljene od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, i k tome N-terminalni, cisteinski ostatak što može tvoriti mostove sumpor-sumpor na humanu u-PA katalitičku domenu; te opcijski dodatno jednu ili više sekvencija odabranih iz skupine koja se sastoji od (i) spojne sekvencije koja C-terminalno pokriva "finger " domenu u humanom t-PA, spojne sekvencije koja N-terminalno pokriva "kringle" 2 domenu u humanom t-PA, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju koja je sastavljena od obje rečene spojne sekvencije ili njihovih fragmenata, a koja spoj na sekvencija ili sjedinjena spoj na sekvencija je smještena između t-PA "finger" domene i t-PA "kringle" 2 domene u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; i (ii) T-regije humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, a koja je T-regija ili njezin fragment smještena na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora; (c) humane t-PA "finger" domene, humane t-PA domene faktora rasta, humane t-PA "kringle" 2 domene, humane u-PA katalitičke domene, i spojne sekvencije koja povezuje humanu t-PA "kringle" 2 domenu s humanom u-PA katalitičkom domenom, a koja spojna sekvencija se odabire iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije koja je sastavljena od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, i k tome N-terminalni, cisteinski ostatak koji može tvoriti most sumpor-sumpor na humanu u-PA katalitičku domenu; i opcijski dodatno jednu ili više sekvencija odabranih iz skupine koja sadrži (i) spojnu sekvenciju koja C-terminalno pokriva "finger" domenu u humanom t-PA ili njezin fragment, spojnu sekvenciju koja N-terminalno pokriva t-PA domenu faktora rasta u humanom t-PA ili njezin fragment, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju sastavljenu od rečene obje spojne sekvencije ili njihovih fragmenata, pri čemu su rečene spojne sekvencije ili sjedinjene spojne sekvencije smještene između "finger" domene i domene faktora rasta u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; (ii) spojnu sekvenciju koja C-terminalno pokriva domenu faktora rasta u humanom t-PA ili njezin fragment, spojnu sekvenciju koja N-terminalno pokriva "kringle" 2 domenu u humanom t-PA ili njezin fragment, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju koja se sastoji od obje spomenute spojne sekvencije ili od njihovih fragmenata, pri čemu su rečene spojne sekvencije ili sjedinjene spojne sekvencije smještene između faktora rasta i "kringle" 2 domene u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; te (iii) T-regiju humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, a koja je T-regija ili njezin fragment smještena na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora; pri čemu rečena metoda uključuje kulturu transformiranog eukariotskog domaćina koji sadrži DNA šifriran za rečeni hibridni plazminogenski aktivator pod prikladnim hranidbenim uvjetima, te izolaciju rečenog hibridnog plazminogenskog aktivatora.

14. Metoda prema zahtjevu 13, naznačena time, da je za pripravu jednolanačanog hibridnog plazminogenskog aktivatora, odabranog iz skupine koja sadrži tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA-(159-411), tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411) i tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411).

15. Metoda prema zahtjevu 13, naznačena time, da je za pripravu jednolančanog hibridnog plazminogenskog aktivatora, a koji je tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA-(159-411).

16. Metoda, naznačena time, da je za pripravu sekvencije DNA, šifrirane za jednolančani hibridni plazminogenski aktivator koji se sastoji od a) humane t-PA "kringle" 2 domene, humane katalitičke u-PA domene i spojne sekvencije koja povezuje humanu t-PA, "kringle" 2 domenu s humanom u-PA katalitičkom domenom pri čemu je spojna sekvencija odabrana iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije sastavljene od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sektvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazrninom, k tome N-terminalni, cisteinski ostatak sposoban za tvorbu sumpor-sumpor mosta na humanu u-PA katalitičku domenu; i opcijski dodatno jedne ili više sekvencija odabranih iz skupine koja se sastoji od (i) spojne sekvencije koja N-terminalno pokriva "kringle" 2 domenu u humanom t-PA ili njezin fragment, a koja je spojna sekvencija ili njezin fragment smještena u hibridnom plazminogenskom aktivatoru N-terminalno prema humanoj t-PA "kringle" 2 domeni; te (ii) T-regiju humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, koja je T-regija ili njezin fragment smještena na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora; b) humane t-PA "finger" domene, humane t-PA "kringle" 2 domene, humane u-PA katalitičke domene i spojne sekvencije koja povezuje humanu t-PA "kringle" 2 domenu i humanu u-PA katalitičku domenu, a koja spoj na sekvencija je odabrana iz skupine koja se sastoji od spojne sekvericije što povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije sastavljene od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, i k tome N-terminalni, cisteinski ostatak što može tvoriti mostove sumpor-sumpor na humanu u-PA katalitičku domenu; te opcijski dodatno jednu ili više sekvencija odabranih iz skupine koja se sastoji od (i) spojne sekvencije koja C-terminalno pokriva "finger" domenu u humanom t-PA, spojne sekvencije koja Nterminalno pokriva "kringle" 2 domenu u humanom tPA, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju koja je sastavljena od obje rečene spojne sekvencije ili njihovih fragmenata, a koja je spojna sekvencija ili sjedinjena spojna sekvencija smještena između t-PA "finger" domene i t-PA "kringle" 2 domene u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; i (ii) T-regije humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, a koja je T-regija ili njezin fragment smješten na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora; (c) humane t-PA "finger" domene, humane t-PA domene faktora rasta, humane t-PA "kringle" 2 domene, humane u-PA katalitičke domene, i spojne sekvencije koja povezuje humanu t-PA "kringle" 2 domenu s humanom u-PA katalitičkom domenom, a koja spojna sekvencija se odabire iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije koja je sastavljena od subsekvencij a rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, i k tome N-terminalni, cisteinski ostatak koji može tvoriti most sumpor-sumpor na humanu u-PA katalitičku domenu; i opcijski dodatno jednu ili više sekvencija odabranih iz skupine koja sadrži (i) spojnu sekvenciju koja C-terminalno pokriva “finger” domenu uD humanom t-PA ili njezin fragment, spojnu sekvenciju koja N-terminalno pokriva t-PA domenu faktora rasta u humanom t-PA ili njezin fragment, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju sastavljenu od rečene obje spojne sekvencije ili njihovih fragmenata, pri čemu su rečene spojne sekvencije ili sjedinjene spojne sekvencije smještene između "finger" domene i domene faktara rasta u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; (ii) spojnu sekvenciju koja C-terminalno pokriva domenu faktora rasta u humanom t-PA ili njezin fragment, spojnu sekvenciju koja N-terminalno pokriva "kringle" 2 domenu u humanom t-PA ili njezin fragment, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju koja se sastoji od obje spomenute spojne sekvencije ili od njihovih fragmenata, pri čemu su rečene spoj ne sekvencije ili sjedinjene spojne sekvencije smještene između faktora rasta i "kringle" 2 domene u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; te (iii) T-regiju humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, a koja je T-regija ili njezin fragment smještena na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora; pri čemu rečena metoda uključuje kemijsku sintezu DNA ili pripravu fragmenata šifriranih za polinukleotidne sekvencije za u-PA i t-PA cDNA, te njihovo ponovno povezivanje prema prethodno određenom redoslijedu, opcijski uključujući jedan ili više koraka.

17. Metoda prema zahtjevu 16, naznačena time, da je za pripravu sekvencije DNA šifrirane za jednolančani hibridni plazminogenski aktivator odabran iz skupine koja se sastoji od tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA-(159-411), tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411) i tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411).

18. Metoda prema zahtjevu 16, naznačena time, da je za pripravu sekvencije DNA šifrirane za jednolančani hibridni plazminogenski aktivator, a koji je tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA-(159411).

19. Metoda, naznačena time, da je za pripravu hibridnog vektora za primjenu u eukariotskom domaćinu koji sadrži sekvenciju DNA šifriranu za jednolančani hibridni plazminogenski aktivator, koji se sastoji od a) humane t-PA "kringle" 2 domene, humane katalitičke u-PA domene i spojne sekvencije koja povezuje humanu t-PA "kringle" 2 domenu s humanom u-PA katalitičkom domenom, pri čemu je spojna sekvencija odabrana iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije sastavljene od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, k tome N-terminalni, cisteinski ostatak sposoban za tvorbu sumpor-sumpor mosta na humanu u-PA katalitičku domenu; i opcijski dodatno jedne ili više sekvencija odabranih iz skupine koja se sastoji od (i) spojne sekvencije koja N-terminalno pokriva "kringle" 2 domenu u humanom t-PA ili njezin fragment, a koja je spojna sekvencija ili njezin fragment smještena u hibridnom plazminogenskom aktivatoru N-terminalno prema humanoj t-PA "kringle" 2 domeni; te (ii) T-regiju humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, koja je T-regija ili njezin fragment smještena na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora; b) humane t-PA "finger" domene, humane t-PA "kringle" 2 domene, humane u-PA katalitičke domene i spojne sekvencije koja povezuj e humanu t-PA "kringle" 2 domenu i humanu u-PA katalitičku domenu, a koja spojna sekvencija je odabrana iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije što povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije sastavljene od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, i k tome N-terminalni, cisteinski ostatak što može tvoriti mostove sumpor-sumpor na humanu u-PA katalitičku domenu; te opcijski dodatno jednu ili više sekvencija odabranih iz skupine koja se sastoji od (i) spojne sekvencije koja C-terminalno pokriva "finger" domenu u humanom t-PA, spojne sekvencije koja N-terminalno pokriva "kringle" 2 domenu u humanom t-PA, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju koja je sastavljena od obje rečene spojne sekvencije ili njihovih fragmenata, a koja spojna sekvencija ili sjedinjena spojna sekvencija je smještena između t-PA "finger" domene i t-PA "kringle" 2 domene u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; i (ii) T-regije humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, a koja je T-regija ili njezin fragment smještena na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora; (c) humane t-PA "finger" domene, humane t-PA domene faktora rasta, humane t-PA "kringle" 2 domene, humane u-PA katalitičke domene, i spojne sekvencije koja povezuje humanu t-PA "kringle" 2 domenu s humanom u-PA katalitičkom domenom, a koja spojna sekvencija se odabire iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spoj ne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije koja je sastavljena od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, i k tome N-terminalni, cisteinski ostatak koji može tvoriti most sumpor-sumpor na humanu u-PA katalitičku domenu; i opcijski dodatno jednu ili više sekvencija odabranih iz skupine koja sadrži (i) spojnu sekvenciju koja C-terminalno pokriva "finger" domenu u humanom t-PA ili njezin fragment, spojnu sekvenciju koja N-terminalno pokriva t-PA domenu faktora rasta u humanom t-PA ili njezin fragment, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju sastavljenu od rečene obje spojne sekvencije ili njihovih fragmenata, pri čemu su rečene spojne sekvencije ili sjedinjene spojne sekvencije smještene između "finger" domene i domene faktora rasta u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; (ii) spojnu sekvenciju koja C-terminalno pokriva domenu faktora rasta u humanom t-PA ili njezin fragment, spojnu sekvenciju koja N-terminalno pokriva, "kringle" 2 domenu u humanom t-PA ili njezin fragment ili sjedinjenu spojnu sekvenciju koja se sastoji od obje spomenute spojne sekvencije ili od njihovih fragmenata, pri čemu su rečene spojne sekvencije ili sjedinjene spojne sekvencije smještene između faktora rasta i "kringle" 2 domene u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; te (iii) T-regiju humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, a koja je T-regija ili njezin fragment smještena na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora; pri čemu rečena metoda uključuje povezivanje DNA segmenata koji sadrže eukariotski promotor, šifrirajuće područje za hibridni plazminogenski aktivator, sekvenciju eukariotskog gena koja prekriva položaj 3' i vektor DNA.

20. Metoda prema zahtjevu 19, naznačena time, da je za pripravu hibridnog vektora za primjenu u eukariotskom domaćinu koji uključuje sekvenciju DNA šifriranu za jednolančani hibridni plazminogenski aktivator odabran iz skupine koja se sastoji od tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA-(159-411), tPA(1-49)-tPA(176-275)-uPA(159-411) i tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411).

21. Metoda prema zahtjevu 19, naznačena time, da je za pripravu hibridnog vektora za primjenu u eukariotskom domaćinu koji uključuje sekvenciju DNA šifriranu za jednolančani hibridni plazminogenski aktivator, a koji je tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA-(159-411).

22. Metoda, naznačena time, da je za pripravu transformirane eukariotske stanice, transformirane s hibridnim vektorom koji sadrži sekvenciju DNA šifriranu za jednolančani hibridni plazminogen koji se sastoji od a) humane t-PA "kringle" 2 domene, humane katalitičke u-PA domene i spojne sekvencije koja povezuje humanu t-PA "kringle" 2 domenu s humanom u-PA katalitičkom domenom, pri čemu je spojna sekvencija odabrana iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuj e A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije sastavljene od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesori položaj koji se može cijepati plazminom, k tome N-terminalni, cisteinski ostatak sposoban za tvorbu sumpor-sumpor mosta na humanu u-PA katalitičku domenu; i opcijski dodatno jedne ili više sekvencija odabranih iz skupine koja se sastoji od (i) spojne sekvencije koja N-terminalno pokriva "kringle" 2 domenu u hurnanom t-PA ili njezin fragment, a koja je spojna sekvencija ili njezin fragment smještena u hibridnom plazminogenskom aktivatoru N-terminalno prema humanoj t-PA "kringle" 2 domeni; te (ii) T-regiju humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, koja je T-regija ili njezin fragment smještena na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora; b) humane t-PA "finger" domene, humane t-PA "kringle" 2 domene, humane u-PA katalitičke domene i spojne sekvencije koja povezuj e humanu t-PA "kringle" 2 domenu i humanu u-PA katalitičku domenu, a koja spojna sekvencija je odabrana iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije što povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije sastavljene od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, i k tome N-terminalni, cisteinski ostatak što može tvoriti mostove sumpor-sumpor na humanu u-PA katalitičku domenu; te opcijski dodatno jednu ili više sekvencija odabranih iz skupine koja se sastoji od (i) spojne sekvencije koja C-terminalno pokriva "finger" domenu u humanom t-PA, spojne sekvencije koja N-terminalno pokriva "kringle" 2 domenu u humanom t-PA, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju koja je sastavljena od obje rečene spojne sekvencije ili njihovih fragmenata, a koja spoj na sekvencija ili sjedinjena spoj na sekvencija je smještena između t-PA "finger" domene i t-PA "kringle" 2 domene u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; i (ii) T-regije humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, a koja je T-regija ili njezin fragment smješten na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora; (c) humane t-PA "finger" domene, humane t-PA domene faktora rasta, humane t-PA "kringle" 2 domene, humane u-PA katalitičke domene, i spoj ne sekvencije koja povezuj e humanu t-PA "kringle" 2 domenu s humanom u-PA katalitičkom domenom, a koja spojna sekvencija se odabire iz skupine koja se sastoji od spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom t-PA, spojne sekvencije koja povezuje A-lanac s B-lancem u humanom u-PA, te hibridne spojne sekvencije koja je sastavljena od subsekvencija rečenih spojnih sekvencija, pri čemu rečene spojne sekvencije i hibridne spojne sekvencije uključuju procesni položaj koji se može cijepati plazminom, i k tome N-terminalni, cisteinski ostatak koji može tvoriti most sumpor-sumpor na humanu u-PA katalitičku domenu; i opcijski dodatno jednu ili više sekvencija odabranih iz skupine koja sadrži (i) spojnu sekvenciju koja C-terminalno pokriva "finger" domenu u humanom t-PA ili njezin fragment, spojnu sekvenciju koja N-terminalno pokriva t-PA domenu faktora rasta u humanom t-PA ili njezin fragment, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju sastavljenu od rečene obje spojne sekvencije ili njihovih fragmenata, pri čemu su rečene spojne sekvencije ili sjedinjene spojne sekvencije smještene između "finger" domene i domene faktora rasta u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; (ii) spojnu sekvenciju koja C-terminalno pokriva domenu faktora rasta u humanom t-PA ili njezin fragment, spojnu sekvenciju koja N-terminalno pokriva "kringle" 2 domenu u humanom t-PA ili njezin fragment, ili sjedinjenu spojnu sekvenciju koja se sastoji od obje spomenute spojne sekvencije ili od njihovih fragmenata, pri čemu su rečene spojne sekvencije ili sjedinjene spojne sekvencije smještene između faktora rasta i "kringle" 2 domene u hibridnom plazminogenskom aktivatoru; te (iii) T-regiju humanog t-PA ili njezin N-terminalni fragment, a koja je T-regija ili njezin fragment smještena na N-terminusu hibridnog plazminogenskog aktivatora; pri čemu metoda uključuje transformaciju eukariotskih domaćinskih stanica s rečenim hibridnim vektorom.

23. Metoda prema zahtjevu 22, naznačena time, da je za pripravu transformiranih eukariotskih stanica, transformiranih pomoću hibridnog vektora koji sadrži sekvenciju DNA šifriranu za jednolančani hibridni plazminogenski aktivator odabran iz skupine koja se sastoji od tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA-(159-411), tPA(1-49)tPA(176-275)-uPA(159-411) i tPA(1-86)-tPA(176-275)-uPA(159-411).

24. Metoda prema zahtjevu 22, naznačena time, da je za pripravu transformiranih eukariotskih stanica, transformiranih pomoću hibridnog vektora koji sadrži sekvenciju DNA šifriranu za jednolančani hibridni plazminogenski aktivator, a koji je tPA(1-3)-tPA(176-275)-uPA-(159-411).

25. Farmaceutski pripravak, naznačen time, da sadrži jednolančani hibridni plazminogenski aktivator prema zahtjevima 1 do 3, zajedno s farmaceutski prihvatljivim nosivim tvarima.

26. Jednolančani hibridni plazminogenski aktivator prema zahtjevima 1 do 3, naznačen time, da se uporabi u metodi terapijske profilaktičke obradbe u ljudskom tijelu.

27. Primjena jednolančanog hibridnog plazminogenskog aktivatora prema zahtjevima 1 do 3, naznačena time, da je za pripravu farmaceutskih pripravaka.