HRP20010301A2 - New therapeutic indication for azithromycin in the treatment of non-infective inflammatory diseases - Google Patents

Description

Izum se odnosi na korištenje 9-deokso-9-dihidro-9a-metil-9a-aza-9a-homoeritromicina A (generički naziv: azitromicin) za liječenje neinfektivnih upalnih bolesti s dominacijom neutrofila, farmaceutske pripravke koji sadrže azitromicin za enteralnu ili parenteralnu primjenu i metode za proizvodnju tih farmaceutskih pripravaka.

Većina upalnih bolesti je karakterizirana nenormalnim nakupljanjem upalnih stanica koje uključuju monocite/makrofage, granulocite, plazma stanice, limfocite i krvne pločice (trombocite). Zajedno s tkivnim endotelnim stanicama i fibroblastima, te upalne stanice otpuštaju kompleksni niz lipida, faktora rasta, citokina i destruktivnih enzima koji izazivaju lokalno oštećenje tkiva.

Jedan oblik upalnog odgovora je neutrofilna upala koje je karakterizirana infiltracijom upaljenog tkiva neutrofilnim polimorfonuklearnim leukocitima (PMN), koji su najvažnija komponenta obrane domaćina. Infekcija tkiva ekstracelularnim bakterijama predstavlja prototip ovog upalnog odgovora. S druge strane, različite neinfektivne bolesti su karakterizirane ekstravaskularnom regrutacijom neutrofila. Ova skupina upalnih bolesti uključuje kroničnu opstruktivnu bolest pluća, sindrom respiratornog distresa odraslih, neke oblike imunim kompleksima uzrokovanog alveolitisa, cističnu fibrozu, bronhitis, bronhiektazije, emfizem, glomerulonefritis, aktivne faze reumatoidnog artritisa, artritis kod uloga (gihta), ulcerativni kolitis, određene dermatoze kao što je psorijaza i vaskulitis. Smatra se da kod tih stanja neutrofili igraju ključnu ulogu u razvoju ozljede tkiva koja, kad je perzistentna, može dovesti do ireverzibilnog uništenja normalne arhitekture tkiva s posljedičnom disfunkcijom organa. Zbog toga je oštećenje tkiva uglavnom uzrokovano aktivacijom neutrofila nakon koje slijedi otpuštanje proteaza i povećana proizvodnja kisikovih radikala.

Kronična opstruktivna bolest pluća (COPD) u osnovi je stanje koje se opisuje kao progresivni razvoj ograničenja protoka zraka koji nije u potpunosti reverzibilan (ATC, 1995.). Većina pacijenata s COPD-om ima tri patološka stanja: bronhitis, emfizem i nakupljanje sluzi. Ova bolest je karakterizirana polaganim progresivnim i ireverzibilnim smanjenjem forsiranog ekspiratornog volumena u prvoj sekundi izdisaja (FEV1), s relativnim očuvanjem forsiranog vitalnog kapaciteta (FVC) (Barnes, N. Engl. J. Med. (2000), 343(4): 269-280). Kod astme i kod COPD-a postoji značajno, ali različito, preoblikovanje dišnih puteva. Veći dio opstrukcije protoka zraka je posljedica dvije glavne komponente, alveolarne destrukcije (emfizem) i opstrukcije malih dišnih puteva (kronični opstruktivni bronhitis). Kod COPD-a, ono je pretežno karakterizirano jakom hiperplazijom mukoznih stanica.

Pušenje cigareta, zagađenje zraka i drugi faktori okoliša glavni su uzroci bolesti. Uzročni mehanizam je trenutno nedefiniran ali oksidacijsko-antioksidacijski poremećaji su snažno implicirani u razvoju bolesti. COPD je kronični upalni proces koji se značajno razlikuje od onoga koji se vidi kod astme, s različitim upalnim stanicama, medijatorima, upalnim posljedicama i odgovorima na liječenje (Keatings et al., Am. J. Respir. Crit Care Med. (1996), 153: 530-534). Primarno, karakteristika ove bolesti je neutrofilna infiltracija pacijentovih pluća.

Čini se da povećane razine proinflamatornih citokina kao što je TNF-α, a posebno kemokina kao što su IL-8 i GRO-α igraju vrlo značajnu ulogu u patogenezi ove bolesti. Sinteza tromboksana u krvnim pločicama (trombocitima) je također pojačana kod pacijenata s COPD-om (Keatings et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. (1996), 153: 530-534; Stockley and Hill, Thorax (2000), 55(7): 629-630). Većina oštećenja tkiva je uzrokovana aktivacijom neutrofila nakon koje slijedi otpuštanje (metalo)proteinaza, i povećana proizvodnja kisikovih radikala (Repine et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. (1997), 156: 341-357; Barnes, Chest (2000), 117(2Suppl): 10S-14S).

Većina terapeutskih napora je usmjerena na kontrolu simptoma (Barnes, Trends Pharm. Sci. (1998), 19(10): 415-423; Barnes, Am. J. Respir. Crit. Care Med. (1999) 160: S72-S79; Hansel et al., Expert Opin. Investig. Drugs (2000) 9(1): 3-23). Simptomi se obično izjednačavaju s ograničenjem protoka zraka a bronhodilatatori su terapija izbora. Prevencija i liječenje komplikacija, prevencija pogoršanja i poboljšana kvaliteta i duljina života također su primarni ciljevi navedeni u tri ključna međunarodna vodiča za liječenje COPD-a (Culpitt and Rogers, Exp. Ipin. Pharmacother. (2000) 1(5): 1007-1020; Hay, Curr. Opin. Chem. Biol. (2000), 4: 412-419). U osnovi, većina sadašnjih terapeutskih istraživanja usmjerena je na medijatore uključene u regrutaciju i aktivaciju neutrofila, ili ublažavanje posljedica njihove neželjene aktivacije (Stockley et al., Chest (2000), 117(2 Suppl): 58S-62S).

Postoji veći broj izvješća o imunomodulirajućem djelovanju makrolidnih antibiotika in vitro (Labro, J. Antimicrob. Chemother. (1998), 41 (Suppl B): 37-46; Labro, Clin. Microb. Rev. (2000), 13(4): 615-650; Wales and Woodhead, Thorax (1999), 54 (Suppl 2): S58-S62). Makrolidni antibiotici su makrociklički spojevi koji sadrže na primjer laktonski prsten od 12, 14, 16 ili 17 članova i 1 do 3 šećerne jedinice, koje su povezane međusobno ili na aglikon glikozidnim vezama. Poznati makrolidni antibiotici su na primjer karbomicin, eritromicin, leukomicin i spiramicin.

Najvažniji nalazi u pogledu interakcije makrolida s fagocitnim inflamatornim stanicama in vitro odnose se na inhibiciju proizvodnje oksidansa od strane stimuliranih stanica (Labro et al., J. Antimicrob. Cemother. (1989), 24 (4): 561-572; Wmeki, Chest (1993), 104: 1191-1193; VVenisch et al., Antimicrob. Agents Chemother. (1996), 40(9): 2039-2042) i moduliranje otpuštanja proinflamatornih i anti-inflamatornih citokina iz tih stanica (Labro et al., J. Antimicrob. Chemother. (1989), 24 (4): 561-572; Khan et al., Internat. J. Antimicrob. Agents (1999), 11: 121-132; Morikawa et al., Antimicrob. Agents and Chemother. (1996), 40(6): 1366-1370; Sugiyama et al., Eur. Respir. J. (1999), 14: 113-1116). Pored toga, nekoliko makrolida izravno potiče egzocitozu (degranulaciju) humanih neutrofila in vitro (Abdelghaffae et al, Antimicrob. Agents Chemother. (1994), 38(7): 1548-1554; Vazifeh et al, Antimicrob. Agents Chemother. (1998), 42 (8): 1944-1951). U eksperimentalnom inflamatornom modelu karageninom uzrokovanog pleuritisa kod štakora, utvrđeno je da su neki makrolidni antibiotici kao roksitromicin, klaritromicin i eritromicin, ali ne i azitromicin, pokazali anti-inflamatorno djelovanje koje je vjerojatno ovisilo o njihovoj sposobnosti sprečavanja proizvodnje pro-inflamatornih medijatora i citokina. U ovom modelu akutne upale, proizvodnja NO, razine TNF-α ili PGE2 bili su značajno smanjeni pre-tretmanom antibioticima Lanario et al, J. Pharmacol Exp. Ther. (2000), 292: 156-163).

Primjena eritromicina je također dovela do anti-inflamatornog djelovanja kod peritonitisa izazvanog zimozanom kod štakora (Agen et al, Agents Actions (1993), 38(1-2): 85-90). Izviješteno je da je roksitromicin djelotvoran u smanjivanju akutne inflamatorne reakcije putem mehanizma različitog od konvencionalnih anti-inflamatornih sredstava kao što je indometacin. U drugom istraživanju, dokazano je da je roksitromicin djelotvoran u standardnom životinjskom modelu koji se koristi za procjenu djelovanja anti-inflamatornih lijekova na edem šape izazvan karageninom, dok su klaritromicin i azitromicin pokazali skromnu aktivnost (Scaglione and Rossini, J. Antimicrob. Chemother. (1998), 41, Suppl B: 47-50).

Neki makrolidni antibiotici, kao što su eritromicin, klaritromicin i roksitromicin već su bili korišteni kao anti-inflamatorni lijekovi, posebno za liječenje difuznog panbronhiolitisa. Na raspolaganju su izvješća o korištenju makrolida za bolesti kao što je reumatoidni artritis i cistična fibroza (Arayssi et al, Programme and Abstracts of the 4th International conference on macrolides, azalides, streptogramins and ketolides, 21-23 January 1998, Barcelona, Spain, Abstract 6; Singh, J. Assoc. Phys. India (1989), 37: 547; Jaffe et al., Lancet (1998), 351: 420). S obzirom na relevantne farmakološke učinke makrolida, izviješteno je da eritromicin inhibira hipersekreciju što je posljedica inhibicije sekrecije sluzi i vode iz epitelnih stanica. On također inhibira akumulaciju neutrofila u upalnom području zbog inhibicije njihovog vezivanja na kapilarne žile, sekrecije IL-8 iz epitelnih stanica i sekrecije IL-8 i LTB4 iz samog neutrofila. Njegovo povoljno djelovanje kod difuznog panbronhiolitisa također uključuje smanjenje proizvodnje superoksida, i smanjenje razine proteolitičkih enzima u plućima.

Dokazano je da azitromicin značajno poboljšava funkciju pluća, ali mehanizam koji stoji iza toga je nejasan (Jaffe et al., Lancet (1998), 351: 42), dok je za roksitromicin izviješteno da suprimira rast fibroblasta nazalnih polipa (Nonaka et al., Am. J. Rhinol. (1999), 13:267-272, Yamada et al, Am. J. Rhinol. (2000), 14: 143-148).

Dok postoje čvrsti dokazi u publiciranoj literaturi da makrolidi s prstenom od 14 članova kao što su eritromicin, klaritromicin i roksitromicin inhibiraju in vitro proizvodnju IL-8 i kemotaksu neutrofila, čak i in vitro su ograničeni dokazi da makrolidi sa prstenom od 15 članova kao što je azitromicin imaju slično anti-inflamatorno djelovanje (Criqui et al., Eur. Respir. J. (2000), 15:856-862).

U US 4,886,792 opisano je inhibitorno djelovanje makrolaktona s 15 članim prstenom na degranulaciju neutrofila, ali oni su bili bez šećernih supstituenata azitromicina. Izviješteno je da azitromicin inducira apoptozu u humanim neutrofilima in vitro, ali je bio bez djelovanja na oksidativni metabolizam ili proizvodnju IL-8 (Koch et al., J. Antimicrob. Chemother. (2000), 46: 19-26). Samo jedno istraživanje je pokazalo da azitromicin inhibira kemotaksu neutrofila i aktivno stvaranje kisikovih radikala in vitro (Sugihara, Kansenshogaku Zasshi J. Jpn. Assoc. Infec. Dis. (1997), 71: 329-336). Također, dokazano je da azitromicin ne mijenja razine TNF-α, IL-1β ili IL-6 alveolarnih makrofaga ili krvi (Aubert et al., Pul. Pharmacol. Ther. (1998), 11:263-269).

Mogućnost da azitromicin, zbog svog prstena od 15 članova, ne posjeduje potrebnu strukturu koja daje anti-inflamatornu aktivnost makrolidima s 14 članim prstenom bila je pretpostavljena i postala je vjerojatnija nakon što je uočeno da makrolidi sa 16 članova kao što je josamicin ne smanjuju proizvodnju IL-8 (Takizawa et al., Am. J. Resp. Crit. Care Med. (1997), 156:266-271; Criqui et al., Eur. Respir. J. (2000), 15:856-862).

U usporedbi s makrolidnim antibioticima koji imaju prsten od 14 članova, makrolidni spojevi s prstenom od 15 članova posjeduju nekoliko prednosti. Na primjer, eritromicin, čija je struktura karakterizirana aglikonskim prstenom od 14 članova u kiselom se mediju lako pretvara u anhidroeritromicin, koji je neaktivni C-6/C-12 metabolit spiroketalne strukture (Kurath et al., Experienta (1971), 27: 362). Za razliku od svog roditeljskog antibiotika eritromicina, azitromicin pokazuje poboljšanu stabilnost u kiselom mediju. Nadalje, azitromicin pokazuje značajno višu koncentraciju u tkivima. Zbog svog poboljšanog in vitro djelovanja protiv gram-negativnih mikroorganizama, čak je ispitana mogućnost doziranja jedanput dnevno (Ratshema et al., Antimicrob. Agents Chemother. (1987), 31: 1939).

Zbog toga, tehnički problem koji stoji iza ovog izuma je osigurati poboljšane načine, posebno poboljšane procese i primjene korisne za terapiju neinfektivnih upalnih bolesti s dominacijom neutrofila, kod kojih aktivni sastojak pokazuje korisna anti-inflamatorna djelovanja makrolidnih spojeva koji imaju laktonski prsten od 14 članova kao i poboljšanu stabilnost i visoku koncentraciju u tkivu makrolidnih spojeva koji imaju prsten od 15 članova.

Ovaj izum rješava gore navedeni problem korištenjem aktivnog sastojka izabranog iz skupine koja se sastoji od azitromicina, njegovog farmaceutski prihvatljivog derivata, njegovog farmaceutski prihvatljivog hidrata, njegovog farmaceutski prihvatljivog kompleksa ili kelata i njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju farmaceutskih pripravaka za liječenje neinfektivnih upalnih bolesti s dominacijom neutrofila kod ljudi i životinja.

Za razliku od ograničenog djelovanja azitromicina na funkciju neutrofila in vitro opisanog u struci, prema ovom izumu, iznenađujuće je pronađeno da azitromicin primijenjen na ljudima in vivo ima širok raspon anti-inflamatornog djelovanja i izuzetno je koristan u liječenju inflamatornih bolesti karakteriziranih infiltracijom neutrofilima i oštećenjem tkiva povezanim s neutrofilima.

U ispitivanju provedenom na zdravim dobrovoljcima, praćen je utjecaj azitromicina na odabrane parametre relevantne za upalu. Pronađeno je da primjena azitromicina potiče degranulaciju humanih neutrofila što je vidljivo iz velike promjene koncentracije enzima primarnih azurofilnih granula, kao što su mijeloperoksidaza (MPO), N-acetil-β-D-glukozaminidaza (NAGA) i β-glukoronidaza.

Biološka relevantnost aktivnosti MPO u granulocitima je jaka antimikrobna aktivnost ovisna o kisiku povezana s mobilizacijom svih granula u upalnim granulocitima u upalnom procesu, posebno nakon fagocitnog stimulusa od strane imunih kompleksa. Nakon primjene azitromicina, MPO aktivnost u neutrofilima u razmazu krvi jako je opala i vratila se na polazne vrijednosti tek nakon 28 dana. Dakle, pronađeno je da je degranulacija koja se očitovala s manjom gustoćom MPO u neutrofilima, što je određeno citokemijski, bila povezana s nižim koncentracijama ELISA-om mjerene MPO u lizatima neutrofila.

N-acetil-β-D-glukozaminidaza (NAGA) i β-glukoronidaza su liosomalni enzimi, a oba su smještena u azurofilnim (primarnim ili peroksidaza-pozitivnim) granulama neutrofila. Budući da tijekom upale dolazi do degranulacije neutrofila, oba enzima su markeri degranulacije i mogu se koristiti za procjenu reaktivnosti neutrofila. Istraživanja s azitromicinom su pokazala da se nakon primjene azitromicina aktivnost NAGA u serumu značajno povećala. Čak 28 dana nakon zadnje doze azitromicina vrijednosti NAGA u serumu su još uvijek bile 70% više od početnih vrijednosti. Povećanje NAGA u serumu bilo je popraćeno smanjenjem aktivnosti enzima u PMN. Aktivnost β-glukoronidaze u serumu nije pokazala nikakve promjene tijekom prvog dana nakon zadnje doze azitromicina, ali se kasnije povećala. 28 dana nakon zadnje doze azitromicina aktivnost β-glukoronidaze je bila 40% viša od početne. Aktivnost β-glukoronidaze u PMN se smanjila u roku od nekoliko sati nakon zadnje doze azitromicina ali se nakon toga povećala. 28 dana nakon zadnje doze azitromicina aktivnost β-glukoronidaze u PMN bila je mnogo viša nego početno.

Nadalje, prema izumu, dokazano je da azitromicin inhibira stvaranje reaktivnih kisikovih radikala u stimuliranim neutrofilima što je dokazano inhibicijom kemiluminiscencije koju stvaraju stimulirani neutrofili. Da je azitromicin inhibitor neutrofilnog oksidacijskog praska nadalje je dokazano korištenjem testa s citokromom c. Ispitivanja su također otkrila da azitromicin ima i dugotrajno djelovanje na koncentraciju stanične glutation peroksidaze (GSHPx) i glutation reduktaze, dva enzima koji kontroliraju biološko djelovanje slobodnih radikala koji su uključeni u patogenezu velikog broja bolesti. Proizvodnja slobodnih radikala i poremećaj u redoks statusu mogu modulirati ekspresiju velikog broja inflamatornih molekula, utječući na određene stanične procese koji dovode do inflamatornih procesa. Tako azitromicin osigurava osnovu za liječenje različitih bolesti kao što je COPD kod kojih proizvodnja neutrofilnih radikala postaje pretjerana.

Istraživanja su također potvrdila da azitromicin inducira apoptozu, tj. programiranu smrt stanice, određenih tipova stanica. Apoptoza je važan mehanizam za upotpunjavanje imunog odgovora. Trodnevna primjena azitromicina imala je odgođeno pro-apoptotičko djelovanje na granulocite, kako je pokazala morfologija razmaza krvi. Broj apoptotičkih stanica je dostigao maksimum 28 dana nakon zadnje doze azitromicina što upućuje na smanjen broj aktivnih, potencijalno oštećujućih neutrofila.

U istraživanju su također otkrivena druga anti-inflamatorna djelovanja azitromicina. Za razliku od prethodnih istraživanja (Koch et al., J. Antimicrob. Chemother. (2000), 46: 19-26) utvrđeno je, prema izumu, da azitromicin ima izraženo inhibitorno djelovanje na otpuštanje IL-8 a također i GRO-α. Interleukin-8 (IL-8) je član CXC pod-obitelji kemokina specifičnih za neutrofile. On je snažan kemotaktički i aktivirajući faktor za neutrofile (Oppenheim, Ann. Rev. Immunol. (1999), 9: 617). Ekspresija IL-8 je odgovor na upalne podražaje. IL-8 odgađa spontanu i TNF-α posredovanu apoptozu humanih neutrofila. Za razliku od djelovanja na IL-8, azitromicin postepeno povisuje serumske koncentracije citokina IL-1, zbog čega je najviša koncentracija IL-1 bila pronađena 24 sata nakon zadnje doze azitromicina. Međutim, serumska koncentracija drugog citokina, IL-6, bila je stalno smanjena.

Za razliku od ranijih izvješća (Seeman et al., J.Cardiovasc. Pharmacol. (2000), 36: 533-537) u kojima liječenje azitromicinom nije značajno utjecalo na koncentracije topivog VCAM (sVCAM) u plazmi, istraživanja provedena prema ovom izumu jasno su pokazala izraženo smanjenje nivoa sVCAM u plazmi već 24 h nakon liječenja azitromicinom.

Rezultati dobiveni prema izumu pokazuju da trodnevno liječenje zdravih ljudskih ispitanika, standardnim antibakterijskim režimom doziranja azitromicina, ima akutno djelovanje na neutrofilne granularne enzime, oksidacijski prasak, oksidacijske zaštitne mehanizme i neutrofilne kemokine i cirkulirajuće IL-1, IL-6, IL-8, kao i odgođeno djelovanje na apoptozu neutrofila i topive adhezijske molekule.

Prema ovom izumu, dakle, azitromicin se može koristiti kao vrijedno profilaktičko i/ili terapijsko sredstvo u neinfektivnim upalnim bolestima s dominacijom neutrofila.

Sljedeće definicije su iznesene radi ilustracije i definiranja značenja i opsega različitih termina korištenih za opisivanje ovog izuma.

Termin «neinfektivna upalna bolest s dominacijom neutrofila» odnosi se na upalne bolesti, poremećaje ili stanja koja proizlaze iz oštećenja tkiva, kemijske iradijacije ili imunih procesa, ali ne od invazije mikroorganizama kao što su virusi, bakterije, gljivice, protozoe ili slično, i koje su karakterizirane infiltracijom upaljenog tkiva neutrofilima koji su prve upalne stanice koje ulaze u tkivo i pojačavaju upalni odgovor. Kod nekih neinfektivnih upalnih bolesti neutrofili ostaju dominantni tip stanica unutar upaljenog područja, čak i kad je odgovor produžen zbog stalne prisutnosti poticaja za infiltraciju i aktivaciju neutrofila. Dakle, primjeri su kronična opstruktivna bolest pluća (COPD), sindrom respiratornog distresa odraslih (ARDS) i neutrofilne dermatoze. Druge neinfektivne upalne bolesti s dominacijom neutrofila uključuju bolesti iza kojih stoji stimulus za kroničnost patologije, koji nije ovisan o neutrofilima. Na primjer, autoimune bolesti su uglavnom posljedica razvoja imunih odgovora na normalne strukturalne komponente tijela i uključuju aktivaciju T limfocita, uz moguću proizvodnju autoantitijela od B limfocita. Kod reumatoidnog artritisa (RA), na primjer, imune reakcije su usmjerene protiv strukturnih komponenti zglobova. Međutim, kod RA i drugih autoimunih bolesti dolazi do akutnih izbijanja bolesti, koja su karakterizirana intenzivnom infiltracijom i aktivacijom neutrofila. Te aktivne faze kronične autoimune upale su praćene dominacijom neutrofila, što na primjer rezultira izraženim nakupljanjem neutrofila u sinovijalnim tekućinama pacijenata s RA. Kod nekih autoimunih bolesti, izraženo je stvaranje autoantitijela, što dovodi do deponiranja imunih kompleksa antigena i autoantitijela u tijelu i aktivacije komplementarnog sustava. Neutrofili ulaze u tkivo pri pokušaju da progutaju imune komplekse a infiltracija i aktivacija neutrofila je egzacerbirana aktiviranim komplementom. Primjer ovog tipa bolesti je bubrežna bolest, posebno glomerulonefritis koji ima za posljedicu izraženo oštećenje bubrega.

Zbog toga, termin «neinfektivna inflamatorna bolest s dominacijom neutrofila» uključuje, ali se ne ograničava na, kroničnu opstruktivnu bolest pluća (COPD), simptom respiratornog distresa odraslih (ARDS), bronhitis, bronhiektazu, emfizem, cističnu fibrozu, upalnu bolest crijeva, artritis kod uloga (gihta), autoimune bolesti karakterizirane akutnim fazama s dominacijom neutrofila, kao što je reumatoidni artritis, autoimune bolesti, kod kojih je infiltracija neutrofilima egzacerbirana aktiviranjem komplementa, kao što je glomerulonefritis, i kožne bolesti, posebno sve vrste neutrofilnih dermatoza uključujući psorijatiformne dermatoze, kao što su psorijaza i Reiterov sindrom, autoimune bulozne dermatoze, neutrofilne dermatoze s osnovom u krvnim žilama kao što su leukocitoklasitični vaskulitis, Sweetov sindrom, pustularni vaskulitis, erythema nodosum i familijalna mediteranska groznica, i pyoderma gangrenosum.

Termin «neinfektivna inflamatorna bolest s dominacijom neutrofila» uključuje također sve popratne bolesti, poremećaje ili stanja koji su posljedica neinfektivne inflamatorne bolesti s dominacijom neutrofila i koji mogu djelovati na druga tkiva ili organe u tijelu osim onih na koje djeluje sama upalna bolest. Primjer za to su ekstraintestinalne bolesti kao što je uveitis i kronični hepatitis koji mogu biti posljedica upalne bolesti crijeva.

Termin «aktivni sastojak» ili «aktivno sredstvo» odnosi se na sve supstance koje djeluju na ili prepoznaju biološke stanice ili njihove dijelove, posebno stanične organele stanice ili stanične komponente. Takvi aktivni sastojci ili sredstva su kemijske prirode. Napose, takvi aktivni sastojci ili sredstva su dijagnostici ili terapeutici. U kontekstu ovog izuma termin «aktivni sastojci» ili «aktivna sredstva» posebno se odnosi na terapeutike, npr. supstance, koje se mogu primjenjivati kao preventivna mjera ili tijekom toka bolesti, poremećaja ili stanja na organizme kojima je potrebno takvo liječenje kako bi se spriječila ili smanjila ili uklonila bolest, poremećaj ili stanje, posebno neinfektivna inflamatorna bolest s dominacijom neutrofila.

U kontekstu ovog izuma, termin «liječenje» se odnosi na profilaktičko i/ili terapeutsko djelovanje lijeka ili medikamenta koji su definirani kao farmaceutski pripravak koji uključuje farmaceutski ili dijagnostički djelotvorni spoj u kombinaciji s barem jednim aditivom, kao što je nosač.

«Azitromicin» se odnosi na makrolidni spoj N-metil-11-aza-10-deokso-10-dihidroeritromicin A (9-deokso-9-dihidro-9a-metil-9a-aza-9a-homoeritromicin A) s azalaktonskim prstenom od 15 članova koji se može dobiti Beckmannovom pregradnjom eritromicin A-oksima nakon koje slijedi Eschweiler-Clarkeova reduktivna N-metilacija kako je u osnovi opisano u US 4,517,359, US 4,328,334 i BE 892,357, čime je sadržaj otkrića ovih dokumenata s obzirom na metode proizvodnje azitromicina u potpunosti inkorporiran u sadržaj otkrića ove prijave.

Termin «farmaceutski prihvatljiv derivat» odnosi se na netoksične funkcionalne ekvivalente ili derivate azitromicina, koji se mogu dobiti zamjenom atoma ili molekularnih skupina ili veza molekule azitromicina, čime se ne mijenja osnovna struktura azitromicina, i koji se razlikuju od strukture azitromicina na barem jednoj poziciji. Termin «farmaceutski prihvatljiv derivat» uključuje na primjer O-metil derivate azitromicina koji se mogu dobiti u osnovi kako je opisano u US 5,250,518, čime je sadržaj otkrića ovog dokumenta s obzirom na metode proizvodnje O-metil derivata u potpunosti inkorporiran u sadržaj otkrića ove prijave.

Termin «farmaceutski prihvatljiv derivat» također uključuje estere azitromicina koji zadržavaju, nakon hidrolize esterske veze, biološku djelotvornost i osobine azitromicina i nisu biološki ili na drugi način nepoželjni. Tehnike za pripremu farmaceutski prihvatljivih estera su na primjer iznesene u March Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York (1985) p. 1152. Farmaceutski prihvatljivi esteri korisni kao prolijekovi su izneseni u Bundgaard, H., ed., (1985) Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam.

Termin «farmaceutski prihvatljiv hidrat» odnosi se na netoksične krute ili tekuće spojeve azitromicina koji zadržavaju biološku aktivnost azitromicina i stvaraju se procesom hidracije čime se jedna ili više molekula vode spaja s molekulom azitromicina zbog dipolnih sila. Termin uključuje na primjer mono- i dihidrate azitromicina.

Termin «farmaceutski prihvatljive soli» odnosi se na netoksične alkalijske metale, zemljano-alkalijske metale, i uobičajeno korištene amonijeve soli uključujući amonij, barij, kalcij, litij, magnezij, kalij, protaminske cinkove soli i natrij, koji se pripremaju metodama poznatim u struci. Termin također uključuje netoksične, tj. farmaceutski prihvatljive adicijske soli s kiselinama, koje se općenito pripremaju reakcijom azitromicina s pogodnom organskom ili anorganskom kiselinom, kao što je acetat, benzoat, bisulfat, borat, citrat, fumarat, hidrobromid, hidroklorid, laktat, laurat, maleat, napsilat, oleat, oksalat, fosfat, sukcinat, sulfat, tartarat, tosilat, valerat itd.

Termin «farmaceutski prihvatljive adicijske soli s kiselinama » odnosi se na soli koje zadržavaju biološku djelotvornost i osobine slobodnih baza i koje nisu biološki ili na drugi način nepoželjne, stvorene s anorganskim kiselinama kao što je bromovodična kiselina, solna kiselina, dušična kiselina, fosforna kiselina, sumporna kiselina, i organske kiseline kao što je octena kiselina, benzojeva kiselina, cimetna kiselina, limunska kiselina, etansulfonska kiselina, fumarna kiselina, glikolna kiselina, maleinska kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, bademova kiselina, mentansulfonska kiselina, oksalna propionska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, pirogrožđana kiselina, salicilna kiselina, jantarna kiselina, vinska kiselina itd.

Soli iz izuma se mogu dobiti otapanjem azitromicina u vodenom ili vodeno/alkoholnom otapalu ili u drugim pogodnim otapalima s odgovarajućom bazom i zatim izolacijom dobivene soli iz izuma evaporacijom otopine, zamrzavanjem i liofilizacijom ili dodavanjem drugog otapala, npr. dietiletera, u vodenu i/ili alkoholnu otopinu soli azitromicina uključujući separaciju netopive sirove soli. Za pripremu lužnatih soli azitromicina, bolje je koristiti karbonate alkalnih metalna ili hidrogenkarbonate. Pripremljene soli su lako topive u vodi.

Termin « farmaceutski prihvatljiv kompleks ili kelat» odnosi se na netoksične komplekse i kelate azitromicina s bivalentnim i/ili trovalentnim metalima koji se općenito mogu dobiti kako je opisano u US 5,498,699, čime je sadržaj otkrića ovog dokumenta s obzirom na metode proizvodnje kompleksa i kelata azitromicina u potpunosti inkorporiran u sadržaj otkrića ove prijave. Kao metali koji stvaraju komplekse i kelate, mogu se koristiti metali II i III skupine koji mogu stvarati fiziološki tolerirane spojeve, posebno Mg2+, AI3+, Fe3+, Rh3+, La3+ i Bi3+. Odnos azitromicina prema metalu je preferiran u rasponu od 1 : 1 do 1 : 4. Kako bi se dobili kompleksi i kelati azitromicina, antibiotik reagira u obliku slobodne baze ili soli, posebno kao hidroklorid, sa soli bivalentnog i/ili trovalentnog metala u omjeru 2 : 1 na sobnoj temperaturi u vodenoj otopini ili u smjesi vode/alkohola kod pH 8,0 do 11,0 s metalnim hidroksidom i/ili karbonatom, subsalicilatom ili njegovim gelom. Preferirani primjeri uključuju kelate azitromicina s antacidima izabranim iz skupine soli Al, Mg i Bi, kelate azitromicina sa surfaktantom i kelate azitromicina s bizmut-subsalicilatom koji su u obliku gela.

Termin «farmaceutski ili terapeutski prihvatljivi nosač» odnosi se na noseći medij koji ne ometa djelotvornost biološke aktivnosti aktivnih sastojaka i koji nije toksičan za domaćina ili pacijenta.

Aktivni sastojak izabran iz skupine koja se sastoji od azitromicina, njegovog farmaceutski prihvatljivog derivata, njegovog farmaceutski prihvatljivog hidrata, njegovog farmaceutski prihvatljivog kompleksa ili kelata i farmaceutski prihvatljive soli također se može primjenjivati na životinjama, uključujući sisavce kao što su glodavci i primati, uključujući ljude, za sprečavanje ili smanjenje ili uklanjanje neinfektivne upalne bolesti s dominacijom neutrofila. Na taj način, ovaj izum obuhvaća metode terapeutskog liječenja takvih poremećaja ili bolesti koje uključuju primjenu aktivnog sastojka iz izuma u količinama dovoljnim da se postigne željeno djelovanje azitromicina in vivo. Na primjer, aktivno sredstvo ili sastojak ovog izuma može se primjenjivati u terapeutski ili farmaceutski djelotvornoj količini za liječenje različitih neinfektivnih upalnih bolesti, uključujući, ali ne ograničavajući se na, COPD, ARDS i neutrofilne dermatoze.

«Terapeutski ili farmaceutski djelotvorna količina» primijenjena na azitromicin ili spojeve i pripravke ovog izuma koje sadrže azitromicin odnosi se na količinu spoja ili pripravka dovoljnu da izazove željeni biološki rezultat. Taj rezultat može biti ublažavanje znakova, simptoma, ili uzroka bolesti, ili bilo koja druga željena promjena biološkog sustava. U ovom izumu, rezultat će na primjer u posebno preferiranom obliku uključivati prevenciju, uklanjanje i/ili smanjenje simptoma ili uzroka neinfektivnog upalnog stanja s dominacijom neutrofila akutnim djelovanjem na granularne enzime neutrofila, oksidacijski prasak, oksidativne zaštitne mehanizme i neutrofilne kemokine i cirkulirajuće IL-1, IL-6, IL-8, kao i odgođenim djelovanjem na apoptozu neutrofila i topive adhezijske molekule. U preferiranom obliku aktivni sastojci ovog izuma bit će primjenjivani profilaktički prije izbijanja neinfektivne upalne bolesti s dominacijom neutrofila.

U skladu s tim, ovaj izum također osigurava farmaceutske pripravke, uključujući, kao aktivni sastojak azitromicin, njegov farmaceutski prihvatljiv derivat, njegov farmaceutski prihvatljiv hidrat, njegov farmaceutski prihvatljiv kompleks ili kelat i farmaceutski prihvatljivu sol u svezi s farmaceutskim nosačem ili otapalom. Pripravci ovog izuma mogu se primjenjivati sistemski ili lokalno, posebno intravaskularnom, oralnom, pulmonarnom, parenteralnom, npr. intramuskularnom, intraperitonealnom, intravenoznom (IV) ili supkutanom injekcijom ili inhalacijom, npr. preko formulacije finog praha, transdermalnog, nazalnog, vaginalnog, rektalnog ili sublingvalnog načina primjene i mogu se formulirati u dozirnim oblicima pogodnim za svaki način primjene. Aktivno sredstvo ili sastojak po mogućnosti se daje u farmaceutski djelotvornoj količini.

Čvrsti dozirni oblici za oralnu primjenu uključuju kapsule, lingvalete, tablete, pilule, praške, liposome, flastere, film tablete s odgođenim djelovanjem i granule. U takvom čvrstim oralnim oblicima, aktivni spoj se miješa s barem jednim inertnim farmaceutski prihvatljivim nosačem, kao što je laktoza, saharoza, ili škrob. Takvi dozirni oblici mogu također uključivati dodatne supstance pored inertnih otapala, npr. klizna sredstva kao što je magnezij stearat. U slučaju kapsula, tableta i pilula, dozirni oblici mogu također uključivati sredstva za povećanje volumena i/ili pufere, kao i arome. Tablete i pilule pored toga mogu biti pripremljene s enteričkim ovojnicama.

Tekući dozirni oblici za oralnu primjenu uključuju farmaceutski prihvatljive emulzije, otopine, suspenzije, sirupe, s eliksirima koji sadrže inertne diluente uobičajeno korištene u struci, kao što je voda. Pored takvih inertnih diluenata, pripravci mogu također uključivati pomoćna sredstva, kao što su soli za variranje osmotskog tlaka, sredstva za podešavanje pH, sredstva za prodiranje u kožu, ovlaživače, emulgatore i sredstva za suspendiranje, i zaslađivače, arome i mirise.

Farmaceutski pripravci prema ovom izumu za parenteralnu primjenu uključuju sterilne vodene i ne-vodene otopine, suspenzije ili emulzije. Primjeri ne-vodenih otapala ili nosača su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja, kao što su maslinovo ulje i ulje kukuruza, želatina, i injektibilni organski esteri kao što je etil oleat. Takvi dozirni oblici mogu također sadržavati pomoćna sredstva kao što su konzervansi, ovlaživači, emulgatori i disperzivna sredstva. Mogu se sterilizirati, na primjer, filtracijom kroz filter koji zadržava bakterije, uključivanjem sredstava za sterilizaciju u pripravke, ozračivanjem pripravaka ili zagrijavanjem pripravaka. Oni se također mogu proizvoditi korištenjem sterilne vode, ili nekog drugog sterilnog injektibilnog medija, neposredno prije upotrebe.

Formulacije za injektiranje uključivat će fiziološki prihvatljiv medij, kao što je voda, fiziološka otopina, PBS, etanol rarijeđen s vodom, etilen glikoli razrijeđen s vodom i slično. Konzervansi topiva u vodi koja se mogu koristiti uključuju natrijev bisulfit, natrijev tiosulfat, askorbat, benzalkonijev klorid, klorobutanol, timerosal, fenilživin borat, parabene, benzil alkohol i feniletanol. Ta sredstva mogu biti prisutna pojedinačno u količinama od oko 0,001 do oko 5% težinski, a preferirano oko 0,01 do oko 2%. Pogodni puferi topivi u vodi koji se mogu koristiti su karbonati alkalijskih ili zemljano-alkalijskih metala, fosfati, bikarbonati, citrati, borati, acetati, sukcinati i slično, kao što je natrijev fosfat, citrat, borat, acetat, bikarbonat i karbonat. Aditivi kao što je karbometilceluloza mogu se koristiti kao nosač u količinama od oko 0,01 do oko 5% težinski. Formulacija može varirati ovisno o svrsi formulacije, specifičnom načinu liječenja bolesti, namjeravanom liječenju itd.

Pripravci za rektalnu ili vaginalnu primjenu su po mogućnosti supozitoriji koji mogu sadržavati, pored aktivne supstance, ekscipijensi kao što su kakao maslac ili vosak za supozitorije. Pripravci za nazalnu ili sublingvalnu primjenu se također pripremaju sa standardnim ekscipijensima dobro poznatim u struci.

Pripravci koji sadrže aktivno sredstvo ili sastojak ovog izuma mogu se primjenjivati za profilaktičko i/ili terapeutsko liječenje. Kod terapeutske primjene, pripravci se daju pacijentu koji već pati od bolesti, kako je opisano gore, u količini dovoljnoj za liječenje ili barem djelomično zaustavljanje simptoma bolesti i njezinih komplikacija, tj. terapeutski djelotvornoj količini.

Kod profilaktičkih primjena, pripravci koji sadrže aktivno sredstvo ili sastojak ovog izuma se daju pacijentu osjetljivom na ili na drugi način u opasnosti od određene bolesti. Takva količina se definira kao «profilaktički djelotvorna doza». Kod ove upotrebe, precizne količine opet ovise o pacijentovom stanju zdravlja i težini.

Farmaceutski pripravci iz ovog izuma mogu se primjenjivati u depot obliku, kao što su pripravci s polaganim otpuštanjem. Takvi pripravci s polaganim otpuštanjem mogu uključivati čestice aktivnog sredstva ili sastojka u matriksu, napravljenom npr. od kolagena.

Količine aktivnog sredstva ili sastojka potrebne za djelotvornu terapiju ovisit će o mnogo različitih faktora, uključujući način primjene, ciljno mjesto, fiziološko stanje pacijenta, i druge korištene medikamente.

Aktivno sredstvo ili sastojak iz ovog izuma izabran iz skupine koja se sastoji od azitromicina, njegovog farmaceutski prihvatljivog derivata, njegovog farmaceutski prihvatljivog hidrata, njegovog farmaceutski prihvatljivog kompleksa ili kelata i njegove farmaceutski prihvatljive soli djelotvoran je u liječenju neinfektivnih upalnih bolesti s dominacijom neutrofila kad se primjenjuje u rasponu od oko 10 mg do oko 2000 mg dnevno, preferirano od oko 30 do 1500 mg. Specifična primijenjena doze koja se koristi ovisi o posebnom stanju koje se liječi, načinu unošenja, kao i o procjeni kliničara ovisnoj o faktorima kao što su ozbiljnost stanja, te dob i opće stanje pacijenta.

Aktivna sredstva ili sastojci ovog izuma mogu se primjenjivati sami ili zajedno s drugim medikamentima trenutno korištenim za liječenje neinfektivnih upalnih bolesti s dominacijom neutrofila kao što su nesteroidna anti-inflamatorna sredstva, kao što su metil ksantinska anti-inflamatorna sredstva, steroidna anti-inflamatorna sredstva, imunomodulatori, imunosupresivna sredstva, bronhodilatatori, antireumatska sredstva, korikosteroidi, (β2-agonisti, kolinergički antagonisti, i slično, čime se doza ovih drugih eventualno može smanjiti za 50% ili 25% zbog anti-inflamatornog djelovanja aktivnih sastojaka ovog izuma.

Pripravak, preferirano pripravak topiv u vodi, ovog izuma, može nadalje sadržavati protein topiv u vodi injektibilan u tjelesne tekućine bez pokazivanja bilo kakve značajne farmakološke aktivnosti u koncentraciji korištenoj u jediničnom dozirnom obliku ovog izuma (u daljnjem tekstu, «protein topiv u vodi»). Kao takav protein topiv u vodi, preferira se serumski albumin, globulin, kolagen i/ili želatina. Taj protein se može dodati u količini koja se općenito upotrebljava u injektibilnim farmaceutskim pripravcima. Tako, na primjer, težinski omjer između proteina topivog u vodi i aktivnog sredstva ili sastojka ovog izuma je oko 0,0001:1 do 100:1, preferirano oko 0,001:1 do oko 10:1 ili još preferiranije oko 0,01 do oko 1:1.

Nadalje, izum se također odnosi na sama gore navedena aktivna sredstva ili sastojke ili pripravke koji ih sadržavaju, posebno, u sušenom i/ili čistom obliku ili u vodenoj ili vodenoj/alkoholnoj otopini. pH otopine pripremljene iz pripravka topivog u vodi ili aktivnog sredstva ovog izuma mora biti takav da navedeni pH nema nikakvo negativno djelovanje na aktivnost farmakološki aktivnog peptida, ali je unutar prihvatljivog raspona za injekcije općenito i nadalje, takav da rečeni pH neće dovesti do velike promjene viskoznosti otopine niti dozvoliti stvaranje precipitata ili slično. Otopina tako treba preferirano imati pH od oko 4 do 7, preferirano 5 do 6, posebno 5,3 do 5,5.

Kad se pripravak izuma topiv u vodi pretvori u vodenu otopinu za primjenu, koncentracija farmakološki aktivnog sredstva ili sastojka ili njegove soli u rečenoj otopini treba preferirano biti oko 0,0000001 do 10% (w/v), još bolje 0,000001 do 5% (w/v) ili još bolje oko 0,00001 do 1% (w/v).

Pripravak ovog izuma po mogućnosti treba imati jedinični dozirni oblik koji sadržava farmakološki aktivno sredstvo ili sastojak izuma i, ako je potrebno, zajedno s daljnjim aditivima kao što je gore navedeni protein topiv u vodi. Tako se, na primjer, dvije ili tri gore navedene komponente pripravljaju u ampuli ili bočici otapanjem ili suspendiranjem u sterilnoj vodi ili sterilnoj fiziološkoj otopini. U tom slučaju, metoda pripreme može uključivati miješanje otopine farmakološki aktivnog sredstva ili sastojka i nadalje, ako je potrebno, otopine aditiva ili dodavanje aditiva u obliku praška u otopinu farmakološki aktivnog sredstva ili sastojka ili bilo koju drugu kombinaciju odgovarajućih postupaka. Dozirni oblik se također može pripremati dodavanjem sterilne vode ili sterilne fiziološke otopine u liofilizat ili prašak osušen vakuumom u kojem se zajedno nalaze farmakološki aktivno sredstvo, i ako je potrebno, aditiv. Ovaj jedinični dozirni oblik može sadržavati jedan ili više uobičajenih aditiva kao što su sredstva za korekciju pH (npr. glicin, solna kiselina, natrijev hidroksid), lokalne anestetike (npr. ksilokain hidroklorid, klorobutanol), izotonizirajuća sredstva (npr. natrijev klorid, manitol, sorbitol), emulgatore, inhibitore adsorpcije (npr. Tween® 60 ili 80), talk, škrob, laktozu i tragakant, magnezij stearat, glicerol, propilen glikol, konzervanse, benzil alkohol, metilhidroksi benzoat i/ili hidrogenizirano ulje kikirikija. Ovaj jedinični dozirni oblik može nadalje sadržavati farmaceutski prihvatljiv ekscipijens kao što su polietilen glikol 400 ili dekstran.

Pripravak ovog izuma sačinjen je miješanjem tih sastojaka prema uobičajenoj metodi. Cilj miješanja sastojaka ovog izuma treba biti takav da se održi aktivnost farmakološki aktivnog sredstva i svede na minimum stvaranje mjehurića tijekom postupka. Sastojci se stave u posudu (na primjer bocu ili bubanj) bilo istovremeno ili nekim redoslijedom. Atmosfera u posudi može biti, na primjer, sterilni čisti zrak ili sterilni čisti plin dušik. Dobivena otopina se može prenijeti u malei bočice ili ampule i može se dalje podvrgnuti liofilizaciji.

Tekući oblik ili oblik liofiliziranog praška pripravka ovog izuma može se otopiti ili dispergirati u otopini biorazgradivog polimera kao što je kopolimer poli(mliječne-glikolne) kiseline, poli(hidromaslačne) kiseline, kopolimer poli(hidroksimaslačne-glikolne) kiseline, ili njihova mješavina, i zatim može biti formuliran, na primjer, u filmove, mikrokapsule (mikrosfere) ili nanokapsule (nanosfere), posebno u obliku mekih ili čvrstih kapsula.

Pored toga, pripravak ovog izuma inkapsuliran u liposome uključujući fosfolipide, kolesterole ili njihove derivate, može se nadalje dispergirati u fiziološkoj otopini ili hijaluronskoj kiselini otopljenoj u fiziološkoj otopini.

Meka kapsula može biti punjena tekućim oblikom pripravka ovog izuma. Čvrsta kapsula može biti punjena liofiliziranim praškom pripravka ovog izuma ili se liofilizirani prašak ovog pripravka može komprimirati u tablete za rektalnu primjenu odnosno oralnu primjenu.

Naravno, pripravak ovog izuma se može isporučivati u napunjenim špricama za samostalnu upotrebu.

lako su gore specifično opisani samo preferirani oblici izuma, prihvaća se da su izmjene i varijacije izuma moguće bez odstupanja od duha i namjeravana opsega izuma. Daljnji preferirani oblici ovog izuma navedeni su u zahtjevima.

Primjer

Provedeno je istraživanje na zdravim dobrovoljcima i praćeno je djelovanje azitromicina primijenjenog u dozi od 3 x 500 mg na odabrane parametre relevantne za upalu.

Primjena lijeka, uzimanje uzoraka krvi i plazme

Svaki ispitanik je primio dvije standardne 250 mg kapsule azitromicina (Sumamed®, PLIVA Zagreb) u tri uzastopna dana. Neposredno prije liječenja i 2 h i 30 min, 24 h i 28 dana nakon treće i zadnje doze azitromicina, skupljena je krv iz kubitalne vene u epruvete koje sadrže EDTA. Alikvoti su uzeti za brojanje stanica, pripremu razmaza, izolaciju polimorfonuklearnih stanica i seruma.

Analiza primarnih azurofilnih granularnih enzima

Leukocitne granule su organele ograđene membranom koje sadrže veći broj antimikrobnih proteina. Osim što sadržavaju razgradne enzime koji se mogu ekstracelularno izlučivati iz neutrofila ili drugačije ispuštati u fagocitne mjehuriće, membrane mnogih vrsta ovih granula i mjehurića sadržavaju važne molekule kao određene receptore (npr. fMLP receptor) i citokrom b NADPH oksidaze.

a) Analiza mijeloperoksidaze

Enzim mijeloperoksidaza (MPO) je protein od 135.000 daltona koji sadrži dva teška i dva laka lanca od 55.000 i 15.000 daltona. MPO je smješten u primarnim ili azurofilnim granulama granulocitnih stanica. Funkcija MPO je da osigura reaktivne metabolite kisika koji su bitni za mikrobicidno djelovanje neutrofila. Stvaranje metabolita kisika ovisno je o komponentama MPO-negativnih granula (u kojima se nalazi flavocitokrom b558, bitna komponenta NADPH oksidaze) i na komponente azurofilnih MPO pozitivnih granula. MPO pretvara relativno neškodljiv proizvod NADPH oksidaze, H2O2, u hipoklornu kiselinu. Biološka važnost MPO aktivnosti u granulocitima je snažna antimikrobna aktivnost ovisna o kisiku povezana s mobilizacijom svih granula u inflamatornim granulocitima u upalnom procesu, posebno nakon fagocitnog stimulusa od strane imunih kompleksa.

Aktivnost MPO je određena iz intenziteta obojenja neutrofila u razmazima krvi i u lizatima stanica ELISA-om. Nakon fiksacije u etanol-formaldehidu, razmazi su inkubirani u otopini supstrata koja sadrži vodikov peroksid i benzidin (SIGMA). Nakon inkubacije, razmazi su protu-obojeni Giemsa otopinom. Pozitivnost MPO vrijednosti 100 granulocita je procijenjena i ocijenjena od 0 do 4+ na osnovi intenziteta precipitirane boje u citoplazmi. Zbog toga vrijednost ocjene može biti od 0 do 400. Normalne vrijednosti raspona ocjene (290 - 390) uzete su iz ovog istraživanja prije primjene azitromicina. MPO aktivnost je također procijenjena na digitalnoj slici razmaza napravljenoj digitalnom kamerom pod jakim povećanjem (x 1000) svjetlosnog mikroskopa. MPO aktivnosti u neutrofilima u razmazu krvi su se smanjile od 2 h i 30 min do 24 h nakon zadnje doze azitromicina i vratile na osnovnu liniju nakon 28 dana (Tabela 1). Koncentracija MPO enzimskog proteina određena ELISA-om u lizatima neutrofila prikazana je u Tabeli 1. Promjena u neutrofilnom enzimskom proteinu je slijedila isti obrazac promjena prisutan kod aktivnosti intracelularnog enzima, smanjujući se od 2 h i 30 min do 24 h nakon zadnje doze azitromicina i vraćajući se na početne vrijednosti nakon 28 dana. Oba metodološka pristupa određivanju MPO potvrdila su jedan drugi. Degranulacija koja se očitovala nižom gustoćom MPO neutrofila određena citokemijski bila je povezana s nižim ELISA MPO koncentracijama u lizatima neutrofila.

b) Analiza N-acetil-β-D-glukozaminidaze (NAGA) i β-glukoronidaze

Glikozidaze su enzimi koji kataliziraju hidrolizu glukozidnih veza oligosaharida i drugih glikozida. Oni su specifični za glikozidni dio supstratne molekule. N-acetil-β-D-glukozaminidaza (NAGA) i β-glukoronidaza su takvi enzimi. Oni su lizosomalni enzimi, oba su smještena u azurofilnim (primarnim; peroksidaza-pozitivnim) granulama neutrofila. Kako je degranulacija neutrofila prisutna tijekom upale, mnogi autori izabiru te enzime kao markere degranulacije i za procjenu reaktivnosti neutrofila. Katalitička koncentracija oba enzima u serumu i lizatima neutrofila određena je korištenjem fluorimetrijske metode opisane od O'Briena et al. (New Engl. J. Med. (1970) 283: 15-20) za NAGA i Glaser & Sly (J. Lab. Clin. Med. (1973) 82: 969) za β-glukoronidazu.

Rezultati su pokazali (Tabela 1) da se aktivnost NAGA u serumu povećava oko 30% 2 h i 30 min nakon zadnje doze. 24 h nakon zadnje doze ona je otprilike 50% viša od početnih vrijednosti. 28 dana nakon toga, vrijednosti NAGA u serumu su bile još uvijek 70% više od početnih vrijednosti. Povećanje NAGA u serumu je bilo popraćeno smanjenjem aktivnosti enzima u PMN. 2 h i 30 min nakon zadnje doze određeno je smanjenje od oko 70% u NAGA u granulocitima. 24 h nakon toga, aktivnost NAGA u PMN povećala se za oko 30% ali je još uvijek bila oko 40% niža u usporedbi s početnim vrijednostima. Nakon 28 dana aktivnost NAGA se povećala 40% u odnosu na početne vrijednosti (Tabela 1).

Aktivnost β-glukoronidaze u serumu nije pokazala nikakve promjene tijekom prva 24 h nakon zadnje doze. 28 dana kasnije vrijednosti u serumu bile su oko 40% više od početnih. Aktivnost β-glukoronidaze u PMN smanjila se za oko 20% nakon 2 h i 30 min i za oko 50% 24 h kasnije u usporedbi s početnim vrijednostima. Međutim, 28 dana nakon toga, aktivnost β-glukoronidaze u PMN bila je mnogo viša (oko 300%) u usporedbi s početnim vrijednostima (Tabela 1).

Kad se analizira aktivnost glukozidaza, očito je da je azitromicin kod zdravih dobrovoljaca doveo do otpuštanja 40 - 50% enzima iz azurofilnih granula u roku od 24 h nakon zadnje doze. Smanjenje aktivnosti NAGA u PMN-ima je popraćeno povećanjem u serumu. Aktivnost ta dva enzima u serumu je pokazala lagano povećanje iznad osnovne linije (prije primjene azitromicina) 2 h i 30 min i 24 h nakon zadnje doze lijeka, dalje se povećavajući 28 dana kasnije (Tabela 1).

Suprotno tome, aktivnost ta dva enzima u lizatima neutrofila smanjivala se u satima nakon zadnje doze azitromicina, pad aktivnosti NAGA bio je najveći nakon 2 h i 30 min i vratio se na početnu razinu nakon 28 dana. Stanična aktivnost β-glukoronidaze još je padala nakon 24 h nakon zadnje doze azitromicina i povećala se prilično iznad početne razine nakon 28 dana (Tabela 1).

Kao sažetak, enzimi otpušteni iz primarnih azurofilnih granula neutrofila imali su tendenciju prisutnosti u serumu s lagano višim aktivnostima 2 h i 30 min - 24 h nakon primjene azitromicina, dok su tijekom istog vremenskog perioda, njihove aktivnosti bile niže u neutrofilima periferne krvi, što upućuje na to da su otpušteni degranulacijom. NAGA se otpušta brzo nakon primjene azitromicina, dok su MPO i β-glukoronidaza pokazali odgođeno otpuštanje. Oporavak aktivnosti ovih enzima također je variralo.

Istraživanja neutrofilnog oksidaciiskog praska

Svi aerobni organizmi koriste kisik za proizvodnju energije. Međutim, postoje mnoge indikacije da su prednosti korištenja kisika također povezane s opasnošću da oksidativni proces može također izazvati oštećenje. Tijekom fagocitoze kad su neutrofili stimulirani, oni su podvrgnuti oksidacijskom prasku, uz stvaranje i otpuštanje reaktivnih kisikovih radikala. Ti reaktivni kisikovi radikali služe kao glavni mehanizmi kojima fagociti posreduju svoje antimikrobno djelovanje. Reakcije su karakterizirane brzim uzimanjem (potrošnjom) kisika nakon kojeg slijedi redukcija kisika u superoksid (O2-). Ovo katalizira NADPH oksidaze koristeći NADPH ili NADH kao davaoca elektrona. Kad se ti obrambeni mehanizmi neodgovarajuće usmjere, dolazi do oštećenja tkiva.

a) Određivanje nastanka kemiluminiscencije

Stvaranje reaktivnih kisikovih radikala od strane aktiviranih stanica često se određuje mjerenjem kemiluminiscencije (CL). Stvoreni kisikovi radikali reagiraju s kemikalijom koja proizvodi fotone (npr. Luminol) i rezultirajuća emisija svjetla mjeri se fotoćelijom. Kemiluminiscencija se može otkriti kao rezultat stimulacije (npr. fMLP) leukocita i ona je mjera njihove oksidativne citotoksične aktivnosti (Allen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1972), 47: 679). Rezultati ovog istraživanja prikazani u Tabeli 1 pokazuju da azitromicin inhibira nastanak kemiluminiscencije stimuliranih neutrofila izoliranih iz krvi ljudi liječenih azitromicinom.

b) Sustav određivanja citokromom c

Neutrofili su bili inkubirani s citokromom c i stimulirani s fMLP (Cohen and Chovaniec, (1978), J. Clin. Invest. 61: 1081-1087). Snimljene su apsorbance kod 550 nm i 540 nm i rezultati su izraženi kao delta A. Neutrofilni oksidacijski prasak kao odgovor na bakterijski peptid fMLP bio je inhibiran trodnevnim doziranjem azitromicina (Tabela 1). Korištenjem i citokroma c i luminola kao sustava određivanja, inhibicija je bila otkrivena već 2 h i 30 min nakon zadnje doze azitromicina, bila je veća nakon 24 h i nije se vratila na normalu 28 dana kasnije.

Posljedično, azitromicin treba smatrati inhibitorom oksidacijskog praska. Tako, azitromicin osigurava osnovu za razne bolesti u kojima proizvodnja radikala u neutrofilima (oksidacijski prasak) postaje pretjerana, kao što je COPD.

Analiza glutation peroksidaze i glutation reduktaze

Slobodni radikali kisika i lipidne peroksidaze uključeni su u patogenezu velikog broja bolesti. Biološko djelovanje slobodnih radikala kontrolira se in vivo velikim rasponom antioksidanata kao što su α-tokoferol (vitamin E), askorbinska kiselina (vitamin C), β-karoten, reducirani glutation (GSH) i antioksidantni enzimi (superoksid dizmutaza, SOD, glutation peroksidaza GSHPx, katalaza, CAT) (Benabdeslam et al, Clin. Chem. Lab. Med. (1999) 37: 511-516; Mates et al., Blood Cells Mol. (1999), 25: 103-109). Nedavno su antioksidativne funkcije definitivno povezane s anti-inflamatornim i/ili imunosupresivnim osobinama (Mates et al, Blood Cells Mol. (1999) 25: 103-109). Proizvodnja slobodnih radikala i poremećaj redoks statusa može modulirati ekspresiju različitih inflamatornih molekula (Sundaresan et al., Science (1995), 270: 296-299; Kaouass et al., Endocrine (1997), 6: 187-194), koje utječu na određene stanične procese dovodeći do upalnih procesa, koji pojačavaju upalu i dovode do oštećenja tkiva (Tsai et al., FEBS Lett. (1997), 436: 411-414).

Stanična glutation peroksidaza (GSHPx) tetramerni je protein u kojem svaka od četiri identične pod-jedinice sadržava jedan atom selena (Se) u obliku selenocisteina na aktivnom mjestu (Misso et al., J. Leukoc. Biol. (1998), 63: 124-130). GSHPx igra ulogu u detoksifikaciji H2O2 i pretvara lipidne hidroperokside u netoksične alkohole (Akkus et al., Clin. Chim. Acta (1996), 244: 221-227); Urban et al., Biomed & Pharmacother. (1997), 51: 388-390). U ovom istraživanju na zdravim dobrovoljcima kojima je davan azitromicin, alteracije aktivnosti intracelularne GSHPx polimorfonukleara određene su korištenjem komercijalnog kompleta RANSEL (Randox Laboratories). GSHPx katalizira oksidaciju glutationa kumen hidroperoksidom. U prisutnosti glutation reduktaze i NADPH, oksidirani glutation se odmah pretvara u reducirani oblik uz istovremenu oksidaciju NADPH u NADP+. Izmjereno je smanjenje apsorbance kod 340 nm.

Glutation reduktaza je svugdje prisutan enzim koji katalizira redukciju oksidiranog glutationa (GSSG) u glutation (GSH). Glutation reduktaza je bitna za glutation redoks ciklus koji održava odgovarajuće nivoe reduciranog staničnog GSH. GSH služi kao antioksidant, reagirajući sa slobodnim radikalima i organskim peroksidima, u prijenosu amino kiselina, i kao supstrat za GSHPx i glutation S-transferaze u detoksifikaciji organskih peroksida i metabolizmu ksenobiotika. Glutation reduktaza je određena korištenjem BIOXYTECH® GR-340™ kolorimetrijskog testa za glutation reduktazu (OXIS International, Inc.). Ukratko, oksidacija NADPH u NADP+ je katalizirana ograničavajućom koncentracijom glutation reduktaze.

GSHPx aktivnost u lizatima neutrofila (izražena po broju stanica) bila je nepromijenjena 2 h i 30 min nakon zadnje doze azitromicina, ali se značajno smanjila 24 h nakon te zadnje doze (Tabela 1). Aktivnost se vratila na polazne vrijednosti 28 dana nakon toga. Aktivnost glutation reduktaze u lizatima stanica (izražena po broju stanica) pokazala je sličnu tendenciju, značajno se smanjujući 2 h i 30 min i 24 h nakon zadnje doze azitromicina, vraćajući se na normalne vrijednosti i zatim dostižući nivoe više od normalnih 28 dana nakon liječenja (Tabela 1).

Analiza apoptoze

Trodnevna primjena azitromicina imala je odgođeno pro-apoptotičko djelovanje na granulocite, kako je pokazano morfologijom razmaza krvi. Rezultati su prikazani u Tabeli 1. Broj izbrojenih apoptotičkih stanica stalno se povećavao nakon trodnevnog doziranja azitromicinom, postižući statistički značaj 28 dana nakon zadnje doze. Povećani broj apoptotičkih stanica upućuje na smanjeni broj aktivnih, potencijalno oštećujućih neutrofila.

Analiza citokina i kemokina

Druga akutna, ali potencijalno anti-inflamatorna djelovanja azitromicina također su otkrivena u ovom istraživanju.

Interleukin-8, član CXC podskupine kemokina specifičnih za neutrofile snažan je kemotaktički i aktivirajući faktor za neutrofile (Oppenheim, J. Ann. Rev. Immunol. (1999), 9: 617). On se veže na barem dva G protein vezana receptora (IL-8R1 i IL-8R2). Ti receptori su funkcionalno različiti. Odgovori, kao što su promjene u citosolnoj koncentraciji Ca2+ iona i otpuštanje enzima granula, posredovane su od oba receptora, dok oksidacijski prasak i aktivacija fosfolipaze D ovise isključivo o stimulaciji putem IL-8R1 (Johnes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996), 93: 6682-6686). IL-8 je ključni medijator u regrutaciji cirkulirajućih neutrofila. Ovaj kemokin je izražen kao odgovor na upalne podražaje, i izlučuje se od različitih tipova stanica, uključujući limfocite, epitelne stanice, keratinocite, fibroblaste, endotelne stanice, stanice glatkih mišića i neutrofile. U ovom posljednjem slučaju, IL-8 je jedan od najobilnije izlučivanih (i najopsežnije proučavanih) citokina koje proizvode neutrofili. Zanimljivo je da neutrofili predstavljaju primarni stanični cilj za IL-8, na koji odgovaraju kemotaksijom, otpuštanjem sadržaja granula, oksidacijskim praskom, povećanjem ekspresije i aktivnosti receptora na površini stanice (up-regulation), povećanim prijanjanjem na nestimulirane endotelne stanice, i transmigracijom kroz endotel. Sredstva koja mogu stimulirati proizvodnju IL-8 u humanim neutrofilima su: TNF-α, IL-1β, GM-CSF, leukotrien B4, PAF, fMLP, laktoferin, LPS i mnoga druga (Cassatella, M.A., Adv. Immunol. (1999), 73: 369-509). IL-8 usporava spontanu i TNF-α posredovanu apoptozu humanih neutrofila (Ketritz et al., Kidney Int. (1998), 53: 84-91). IL-8 je predominantni C-X-C kemokin i dominantni kemoatraktant neutrofila koji se akumulira u supernatantu LPS- stimuliranih humanih alveolarnih makrofaga (Goodman et al., Am. J. Physiol. (1998), 275: L87-L95).

Izviješteno je da eritromicin ima inhibitorno djelovanje na ekspresiju IL-8 u humanim epitelnim stanicama i taj način djelovanja je vjerojatno relevantan za njegovu kliničku djelotvornost (Takizawa et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. (1997), 156:266-271).

Roksitromicin također ima sposobnost smanjivanja proizvodnje IL-8 u fibroblastima nazalnih polipa (Nonaka et al., Acta Otolaryngol. (1998) Suppl. 539: 71-75). U sinoviocitima kod reumatoidnog artritisa, proizvodnja IL-1α, IL-6, IL-8, GM-CSF može se inhibirati klaritromicinom (Matsuoka et al., Clin. Exp. Immunol. (1996), 104(3): 501-8). Ex vivo određivanje proizvodnje IL-8 u cijeloj krvi također je potvrdilo potencijal eritromicina za inhibiciju proizvodnje IL-8 (Schultz et al., J. Antimicrob. Chemother. (2000), 46: 235-240). Nedavno je izviješteno o sličnom nalazu za humane bronhijalne epitelne stanice (Desaki M. et al, Biochim. Biophys Res. Commun. (2000)267: 124-128). Međutim, u nedavnom istraživanju izviješteno je o nepostojanju modulatornog djelovanja azitromicina na proizvodnju IL-8 PMN-a in vitro (Koch et ai, J. Antimicrob. Chemother. (2000), 46: 19-26).

Koncentracije citokina i kemokina su određivane korištenjem kompleta ELISA. Nakon trodnevne primjene azitromicina uočeno je nekoliko različitih obrazaca odgovora serumskim koncentracijama citokina i kemokina. Brzo i izraženo smanjenje koncentracija u plazmi kemokina koji stimulira neutrofile, IL-8 i GRO-α primijećeno je 2 h i 30 min i 24 h nakon zadnje doze azitromicina (Tabela 1). Koncentracija IL-8 se bazično vratila na polazne vrijednosti nakon 28 dana, dok je koncentracija GRO-α bila smanjena u to vrijeme.

Ovi podaci jasno pokazuju akutno inhibitorno djelovanje azitromicina na otpuštanje IL-8 ex vivo, a ta karakteristika se također širi na inhibiciju otpuštanja kemokina GRO-α. Međutim, treba napomenuti da je mjerena koncentracija kemokina u serumu. Zbog toga ne možemo izvoditi nikakve zaključke u pogledu staničnog(ih) izvora kemokina.

Niska bazična koncentracija IL-1 u serumu postepeno se povećala nakon zadnje doze azitromicina, postižući statistički značajan porast nakon 24 h (Tabela 1). Koncentracija se vratila na polazne vrijednosti 28 dana nakon primjene azitromicina. Nasuprot tome, koncentracija l L-6 u serumu je pokazala stalno smanjenje, postigavši statistički značaj 28 dana nakon zadnje doze azitromicina (Tabela 1).

Analiza adheziiskih molekula

Suprotno od prethodno iznesenih podataka (Semaan et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. (2000), 36: 533-537) kod kojih liječenje azitromicinom nije značajno utjecalo na razine topivog VCAM u plazmi, u ovom je istraživanju smanjenje sVCAM u serumu primijećeno 24 h nakon zadnje doze azitromicina, ostajući značajno smanjeno nakon 28 dana, što upućuje na to da azitromicin ima potencijal inhibiranja kako stvaranja neutrofilnih kemotaktičkih peptida tako i ekspresije i otpuštanja adhezivnih molekula za aktivirane leukocite (Tabela 1). Za kvantitativno određivanje serumske koncentracije humanog sVCAM korišten je ELISA komplet (R&D Systems, UK).

Proteini u uzorcima PMN su određivani prema Bradfordovoj metodi (Anal. Biochem. (1976) 72: 248-254) korištenjem goveđeg serumskog albumina kao standarda.

Claims (58)

1. Uporaba aktivnog sastojka izabranog iz skupine koja se sastoji od azitromicina, njegovog farmaceutski prihvatljivog derivata, njegovog farmaceutski prihvatljivog hidrata, njegovog farmaceutski prihvatljivog kompleksa ili kelata i njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju farmaceutskih pripravaka za liječenje neinfektivnih upalnih bolesti s dominacijom neutrofila kod ljudi i životinja.

2. Uporaba prema zahtjevu 1, naznačena time da je neinfektivna upalna bolest s dominacijom neutrofila plućna bolest uključujući kroničnu opstruktivnu plućnu bolest (COPD), sindrom respiratornog distresa odraslih (ARDS), bronhitis, bronhiektazu, cističnu fibrozu i emfizem.

3. Uporaba prema zahtjevu 1, naznačena time da je neinfektivna upalna bolest s dominacijom neutrofila kožna bolest, posebno neutrofilna dermatoza uključujući psorijatiformne dermatoze kao što su psorijaza i Reiterov sindrom, autoimune bulozne dermatoze, neutrofilne dermatoze s osnovom u krvnim žilama kao što su leukocitoklastični vaskulitis, Sweetov sindrom, pustularni vaskulitis, erythema nodosum i familijarna mediteranska groznica, i pioderma gangrenosum.

4. Uporaba prema zahtjevu 1, naznačena time da je neinfektivna upalna bolest s dominacijom neutrofila autoimuna bolest, kod koje je infiltracija neutrofilima egzacerbirana aktivacijom komplementa, posebno bubrežne bolesti uključujući glomerulonefritis.

5. Uporaba prema zahtjevu 1, naznačena time da je neinfektivna upalna bolest s dominacijom neutrofila crijevna bolest uključujući upalnu bolest crijeva.

6. Uporaba prema zahtjevu 1, naznačena time da je neinfektivna upalna bolest s dominacijom neutrofila autoimuna bolest karakterizirana akutnim fazama s dominacijom neutrofila, kao što je reumatoidni artritis.

7. Uporaba prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 6, naznačena time da je aktivni sastojak O-metil-derivat azitromicina.

8. Uporaba prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 6, naznačena time da je aktivni sastojak ester azitromicina.

9. Uporaba prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 6, naznačena time da je aktivni sastojak monohidrat azitromicina.

10. Uporaba prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 6, naznačena time da je aktivni sastojak dihidrat azitromicina.

11. Uporaba prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 6, naznačena time da je aktivni sastojak kompleks ili kelat azitromicina s metalnim ionima.

12. Uporaba prema zahtjevu 11, naznačena time da je omjer azitromicina i metala 1 : 1 do 1 : 4.

13. Uporaba prema zahtjevu 11 ili 12, naznačena time da su metalni ioni bivalentni ioni metala.

14. Uporaba prema zahtjevu 11 ili 12, naznačena time da su metalni ioni trovalentni ioni metala.

15. Uporaba prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 6, naznačena time da je aktivni sastojak alkalijski metal, zemno-alkalijski metal ili amonijeva sol azitromicina.

16. Uporaba prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 6, naznačena time da je aktivni sastojak adiciona sol azitromicina s kiselinama.

17. Uporaba prema zahtjevu 16, naznačena time da se adiciona sol s kiselinama stvara s anorganskom kiselinom.

18. Uporaba prema zahtjevu 16 ili 17, naznačena time da je anorganska kiselina bromovodična kiselina, dušična kiselina, fosforna kiselina ili sumporna kiselina.

19. Uporaba prema zahtjevu 16, naznačena time da se adicine sol s kiselinama stvara s organskom kiselinom.

20. Uporaba prema zahtjevu 19, naznačena time da je organska kiselina octena kiselina, benzojeva kiselina, cimetna kiselina, limunska kiselina, etansulfonska kiselina, fumarna kiselina, glikolna kiselina, maleinska kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, bademova kiselina, mentansulfonska kiselina, oksalna kiselina, p-toluensulfonska kiselina, pirogrožđana kiselina, salicilna kiselina, jantarna kiselina ili vinska kiselina.

21. Uporaba prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 20, naznačena time da farmaceutski pripravak sadrži aktivni sastojak u količini dovoljnoj da ukine ili smanji bolest ili zaustavi njeno napredovanje.

22. Uporaba prema zahtjevu 21, naznačena time da se farmaceutski pripravci primjenjuju jedan do tri puta dnevno u dozi od 10 mg do 2000 mg aktivnog sastojka.

23. Uporaba prema zahtjevu 22, naznačena time da se farmaceutski pripravci primjenjuju jedan do tri puta dnevno u dozi od 30 mg do 1500 mg aktivnog sastojka.

24. Uporaba prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 23, naznačena time da se farmaceutski pripravci primjenjuju oralno u krutim ili tekućim dozirnim oblicima.

25. Uporaba prema zahtjevu 24, naznačena time da su kruti farmaceutski pripravci za oralnu primjenu kapsule, lingvalete, tablete, pilule, prašci, liposomi, flasteri, ovojnice s produljenim djelovanjem i granule.

26. Uporaba prema zahtjevu 24 ili 25, naznačena time da kruti farmaceutski pripravci za oralnu primjenu sadrže barem jedan inertni farmaceutski prihvatljivi nosač.

27. Uporaba prema zahtjevu 26, naznačena time da je inertni farmaceutski nosači laktoza, saharoza ili škrob.

28. Uporaba prema bilo kojem od zahtjeva 24 do 27, naznačena time da kruti farmaceutski pripravci za oralnu primjenu uključuju dodatne supstance izabrane iz skupine koja se sastoji od kliznih sredstava kao što je magnezij stearat, sredstava za povećanje volumena i/ili pufera i aroma.

29. Uporaba prema bilo kojem od zahtjeva 24 do 28, naznačena time da se kruti farmaceutski pripravci za oralnu primjenu pripremljeni s enteričkim ovojnicama.

30. Uporaba prema zahtjevu 24, naznačena time da su tekući farmaceutski pripravci za oralnu primjenu farmaceutski prihvatljive emulzije, otopine, suspenzije ili sirupi.

31. Uporaba prema zahtjevu 30, naznačena time da tekući farmaceutski pripravak za oralnu primjenu sadrži barem jedan inertni farmaceutski prihvatljivi nosač.

32. Uporaba prema zahtjevu 31, naznačena time da je inertni farmaceutski prihvatljivi nosač voda ili fiziološka otopina.

33. Uporaba prema bilo kojem od zahtjeva 30 do 32, naznačena time da tekući farmaceutski pripravak za oralnu primjenu sadrži dodatne supstance, izabrane iz skupine koja se sastoji od pomoćnih tvari, soli za variranje osmotskog tlaka, sredstava za podešavanje pH, sredstava za penetraciju u kožu, sredstava za ovlaživanje, emulzifikatora i sredstava za suspendiranje.

34. Uporaba prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 23, naznačena time da se farmaceutski pripravci primjenjuju parenteralno.

35. Uporaba prema zahtjevu 34, naznačena time da su farmaceutski pripravci za parenteralnu primjenu infuzije ili injekcije.

36. Uporaba prema zahtjevu 34 ili 35, naznačena time da su farmaceutski pripravci za parenteralnu primjenu sterilne vodene ili ne-vodene otopine, suspenzije ili emulzije.

37. Uporaba prema bilo kojem od zahtjeva 34 do 36, naznačena time da farmaceutski pripravci za parenteralnu primjenu uključuju ne-vodena otapala ili nosače.

38. Uporaba prema zahtjevu 37, naznačena time da su ne-vodena otapala ili nosači propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja, kao što su maslinovo ulje i ulje kukuruza, želatina, i injektibilni organski esteri kao što je etil oleat.

39. Uporaba prema bilo kojem od zahtjeva 34 do 38, naznačena time da farmaceutski pripravci za parenteralnu primjenu uključuju pomoćna sredstva kao što su sredstva za održavanje, ovlaživači, emulgatori i disperzivna sredstva.

40. Uporaba prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 23, naznačena time da se farmaceutski pripravci primjenjuju rektalno ili vaginalno.

41. Uporaba prema zahtjevu 40, naznačena time da su farmaceutski pripravci za rektalnu ili vaginalnu primjenu supozitorije, klistiri ili pjene.

42. Uporaba prema zahtjevu 40 ili 41, naznačena time da farmaceutski pripravci za rektalnu ili vaginalnu primjenu sadrže ekscipijense kao što su kakao maslac ili vosak za supozitorije.

43. Uporaba prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 42, naznačena time da farmaceutski pripravci za liječenje neinfektivnih upalnih bolesti s dominacijom neutrofila sadrže jedno ili više dodatnih aktivnih sastojaka korisnih za liječenje takvih bolesti izabranih iz skupine koja se sastoji od nesteroidnih anti-inflamatornih sredstva, steroidnih anti-inflamatornih sredstava, bronhodilatatora, antireumatskih sredstava, imunomodulatora, imunosupresivnih sredstava, kortikosteroida, (β2-agonista i kolinergičkih antagonista.

44. Uporaba prema zahtjevu 43, naznačena time da je doza dodatnih aktivnih sastojaka smanjena u usporedbi s farmaceutskim pripravcima koji sadrže isključivo jedan od dodatnih aktivnih sastojaka.

45. Farmaceutski pripravak za liječenje neinfektivnih upalnih bolesti s dominacijom neutrofila kod ljudi i životinja koji uključuje kao aktivni sastojak azitromicin, njegov farmaceutski prihvatljivi derivat, njegov farmaceutski prihvatljiv hidratat, njegov farmaceutski prihvatljiv kompleks ili kelat i njegovu farmaceutski prihvatljivu sol.

46. Farmaceutski pripravak prema zahtjevu 45, naznačen time da je aktivni sastojak O-metil-derivat ili ester azitromicina.

47. Farmaceutskih pripravak prema zahtjevu 45, naznačen time da je aktivni sastojak monohidrat ili dihidrat azitromicina.

48. Farmaceutski pripravak prema zahtjevu 45, naznačen time da je aktivni sastojak kompleks ili kelat azitromicina s bivelentnim ili trovalentnim metalnim ionima.

49. Farmaceutski pripravak prema zahtjevu 48, naznačen time da je omjer između azitromicina i metalnih iona 1 : 1 do 1 : 4.

50. Farmaceutski pripravak prema zahtjevu 45, naznačen time da je aktivni sastojak alkalijski metal, zemljano-alkalijski metal ili amonijeva sol azitromicina.

51. Farmaceutski pripravak prema zahtjevu 45, naznačen time da je aktivni sastojak adiciona sol azitromicina s kiselinama.

52. Farmaceutski pripravak prema zahtjevu 51, naznačen time da se adiciona sol s kiselinom stvara s anorganskom kiselinom, kao što je bromovodična kiselina, dušična kiselina, fosforna kiselina ili sumporna kiselina.

53. Farmaceutski pripravak prema zahtjevu 51, naznačen time da se adiciona sol dobivena dodavanjem kiseline stvara s organskom kiselinom, kao što je octena kiselina, benzojeva kiselina, cimetna kiselina, limunska kiselina, etansulfonska kiselina, fumarna kiselina, glikolna kiselina, maleinska kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, bademova kiselina, mentansulfonska kiselina, oksalna kiselina, p-toluensulfonska kiselina, pirogrožđana kiselina, salicilna kiselina, jantarna kiselina ili vinska kiselina.

54. Farmaceutski pripravak prema bilo kojem od zahtjeva 45 do 53, naznačen time da je aktivni sastojak sadržan u količini dovoljnoj da ukine ili smanji bolest ili zaustavi njeno napredovanje.

55. Farmaceutski pripravak prema bilo kojem od zahtjeva 45 do 54, koji uključuje jedno ili više dodatnih aktivnih sastojaka korisnih za liječenje takvih bolesti izabranih iz skupine koja se sastoji od nesteroidnih anti-inflamatornih sredstva, steroidnih anti-inflamatornih sredstava, bronhodilatatora, antireumatskih sredstava, imunomodulatora, imunosupresivnih sredstava, kortikosteroida, β2-agonista i kolinergičkih antagonista.

56. Farmaceutski pripravak prema zahtjevu 55, naznačen time da je doza dodatnih aktivnih sastojaka smanjena u usporedbi s farmaceutskim pripravcima, koji sadrže isključivo jedan od dodatnih aktivnih sastojaka.

57. Metoda za proizvodnju farmaceutskog pripravka za liječenje neinfektivnih upalnih bolesti s dominacijom neutrofila kod ljudi i životinja uključujući kao aktivni sastojak azitromicin, njegov farmaceutski prihvatljiv derivat, njegov farmaceutski prihvatljiv hidrat, njegov farmaceutski prihvatljiv kompleks ili kelat i njegovu farmaceutski prihvatljivu sol uključujući miješanje aktivnog sastojka s dodacima i prema potrebi s drugim dodatnim aktivnim sastojcima korisnim za liječenje takvih bolesti, otapanjem ili suspendiranjem dobivene smjese u sterilnoj vodenoj ili vodeno/alkoholnoj otopini, podešavanjem pH otopine na vrijednost od oko 4 do 7 korištenjem sredstava za podešavanje pH i punjenjem u bočice ili ampule.

58. Metoda prema zahtjevu 57, naznačena time da su dodatni aktivni sastojci izabrani iz skupine koja se sastoji od nesteroidnih anti-inflamatornih sredstva, steroidnih anti-inflamatornih sredstava, bronhodilatatora, antireumatskih sredstava, imunomodulatora, imunosupresivnih sredstava, kortikosteroida, β2-agonista i kolinergičkih antagonista.