FR3105977A1 - Method of making bioluminescent plants - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à une méthode de fabrication de plantes bioluminescentes par introduction des gènes de la luciférase et ceux de la biosynthèse de luciférine dans les chloroplastes de plantes.The present invention relates to a method for producing bioluminescent plants by introducing genes for luciferase and those for the biosynthesis of luciferin into the chloroplasts of plants.
Description
Le domaine de l’invention est celui de la biologie végétale.The field of the invention is that of plant biology.
La bioluminescence est la production et l’émission de lumière par un organisme vivant via une réaction chimique au cours de laquelle l’énergie chimique est convertie en énergie lumineuse.Bioluminescence is the production and emission of light by a living organism through a chemical reaction in which chemical energy is converted into light energy.
Le substrat de base à l’origine de la luminescence est la luciférine, qui émet de la lumière en s’oxydant par l’action de l’enzyme luciférase. Chez les bactéries, l’expression des gènes liés à la bioluminescence est contrôlée par l’opéron lux. D’autres organismes sont également capables de bioluminescence, tels que certains champignons ou des êtres multicellulaires, notamment un grand nombre d’espèces marines.The basic substrate at the origin of luminescence is luciferin, which emits light by being oxidized by the action of the enzyme luciferase. In bacteria, the expression of genes related to bioluminescence is controlled by the lux operon. Other organisms are also capable of bioluminescence, such as certain fungi or multicellular beings, including a large number of marine species.
Il existe un grand nombre de luciférases naturelles que l’on retrouve chez des espèces provenant de milieux très différents. On en trouve chez différentes familles d’insectes comme la luciole (Photinus pyralis) ou chez une famille de scarabées, les élatérides (click beetle) ou encore de vers (Phrixothrix hirtus). Les luciférases se retrouvent aussi dans différentes espèces marines (Renilla reniformis,Gaussia princeps,Cypridina hilgendorfii…) et dans certaines bactéries (Photobacterium phosphoreumouVibrio harveyi). On retrouve encore ce genre de mécanisme dans certains champignons (ex :Panellus stipticus) ou encore dans du phytoplancton (Haddock et al., Ann Rev Mar Sci. 2010;2:443-93; Wilson and Hastings, Annu Rev Cell Dev Biol. 1998;14:197-230).There are a large number of natural luciferases found in species from very different environments. It is found in different families of insects such as the firefly ( Photinus pyralis ) or in a family of beetles, the elaterids (click beetle) or even worms ( Phrixothrix hirtus ). Luciferases are also found in various marine species ( Renilla reniformis , Gaussia princeps , Cypridina hilgendorfii , etc.) and in certain bacteria ( Photobacterium phosphoreum or Vibrio harveyi ). This type of mechanism is still found in certain fungi (eg Panellus stipticus ) or in phytoplankton (Haddock et al., Ann Rev Mar Sci. 2010; 2:443-93; Wilson and Hastings, Annu Rev Cell Dev Biol. 1998;14:197-230).
La structure chimique de la luciférine varie d’une espèce à l’autre et peut être appelée coelentérazine. L’identification de la voie métabolique de synthèse de la coelentérazine ou de la luciférine est importante pour permettre de mettre en place des systèmes bioluminescents auxquels il n’est pas nécessaire d’apporter la luciférine pour obtenir l’effet bioluminescent.The chemical structure of luciferin varies from species to species and may be referred to as coelenterazine. The identification of the metabolic pathway of synthesis of coelenterazine or luciferin is important to allow the establishment of bioluminescent systems to which it is not necessary to provide luciferin to obtain the bioluminescent effect.
Kotlobay et al (Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 Dec 11;115(50):12728-12732) ont décrit des mécanismes de formation et recyclage de la luciférine chez les champignons et ont identifié trois enzymes, en plus de la luciférase (Luz). L’hispidine synthase (HispS) transforme l’acide caféique en hispidine, elle-même substrat de l’enzyme hispidine-3-hydroxylase (H3H) qui transforme l’hispidine en luciférine (3-hydroxyhispidine). Enfin, la caffeylpyruvate hydrolase (CPH) transforme l’oxyluciférine (acide caféil-pyruvique), obtenue après oxydation de la luciférine par la luciférase, en acide caféique.Kotlobay et al (Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 Dec 11;115(50):12728-12732) described mechanisms of formation and recycling of luciferin in fungi and identified three enzymes, in addition to luciferase ( Luz). Hispidine synthase (HispS) transforms caffeic acid into hispidine, itself a substrate for the enzyme hispidine-3-hydroxylase (H3H) which converts hispidine into luciferin (3-hydroxyhispidine). Finally, caffeylpyruvate hydrolase (CPH) transforms oxyluciferin (caffeil-pyruvic acid), obtained after oxidation of luciferin by luciferase, into caffeic acid.
Les plantes bioluminescentes peuvent être utilisées dans le domaine de la décoration et de l’événementiel. Préférentiellement, de telles plantes doivent être capables de produire de la lumière de façon autonome, ou après fourniture d’un substrat peu onéreux. La quantité de lumière qui doit être produite devrait être suffisante afin que l’effet observé soit esthétique. Il est aussi préféré que ces plantes soient stériles afin d’éviter toute contamination dans l’environnement.Bioluminescent plants can be used in the field of decoration and events. Preferably, such plants must be able to produce light independently, or after providing an inexpensive substrate. The amount of light that must be produced should be sufficient for the observed effect to be aesthetic. It is also preferred that these plants be sterile in order to avoid any contamination in the environment.
Afin de résoudre les questions ci-dessus, la Demanderesse a développé une plante dont au moins un chloroplaste d’une cellule contient les gènes codant pour les protéines hispidine-3-hydroxylase (H3H, GenBank: BBH43497.1) et luciférase (Luz, GenBank: BBH43509.1) sous le contrôle de promoteurs actifs dans le chloroplaste. Ainsi, le chloroplaste contient une cassette d’expression des protéines H3H et Luz dans les chloroplastes.In order to solve the above questions, the Applicant has developed a plant in which at least one chloroplast of a cell contains the genes coding for the proteins hispidine-3-hydroxylase (H3H, GenBank: BBH43497.1) and luciferase (Luz, GenBank: BBH43509.1) under the control of promoters active in the chloroplast. Thus, the chloroplast contains an expression cassette for H3H and Luz proteins in chloroplasts.
Dans un mode de réalisation particulier, plusieurs chloroplastes de la cellule contiennent la cassette d’expression. Dans un autre mode de réalisation, plusieurs cellules de la plante contiennent au moins un chloroplaste contenant la cassette d’expression. Dans un mode de réalisation particulier, toutes les cellules de la plante contiennent au moins un chloroplaste contenant la cassette d’expression. Dans ce mode de réalisation, au moins 50% des chloroplastes de la plante contiennent la cassette d’expression, c’est-à-dire que, si l’on prend une partie de la plante et que l’on investigue la présence de la cassette d’expression dans les chloroplastes de cette partie de plante, au moins 50% contiennent cette cassette. Ceci peut être vérifié aisément par toute méthode connue dans l’art telle que la PCR quantitative, méthode préférée.In a particular embodiment, several chloroplasts of the cell contain the expression cassette. In another embodiment, several cells of the plant contain at least one chloroplast containing the expression cassette. In a particular embodiment, all the cells of the plant contain at least one chloroplast containing the expression cassette. In this embodiment, at least 50% of the chloroplasts of the plant contain the expression cassette, i.e., if one takes a part of the plant and investigates the presence of the expression cassette in the chloroplasts of this plant part, at least 50% contain this cassette. This can easily be verified by any method known in the art such as quantitative PCR, the preferred method.
Il est intéressant de transformer les chloroplastes (ou plastes) des plantes pour plusieurs raisons:
- ceux-ci sont présents en grande quantité dans chaque cellule, ce qui permet de multiplier la quantité de points de réactions enzymatiques produisant la bioluminescence
- les chloroplastes sont présents dans le cytoplasme de la cellule et ne sont pas transmissibles par le pollen, ce qui évite la contamination à d'autres plantes de même espèce
- il y a plusieurs copies du génome dans chaque chloroplaste, ce qui permet également de multiplier la quantité de points de réactions enzymatiques produisant la bioluminescence.It is interesting to transform the chloroplasts (or plastids) of plants for several reasons:
- these are present in large quantities in each cell, which makes it possible to multiply the quantity of points of enzymatic reactions producing bioluminescence
- the chloroplasts are present in the cytoplasm of the cell and are not transmitted by pollen, which avoids contamination with other plants of the same species
- there are several copies of the genome in each chloroplast, which also makes it possible to multiply the quantity of points of enzymatic reactions producing bioluminescence.
Transformation des chloroplastesTransformation of chloroplasts
Les méthodes de transformation des plastes sont connues dans l’art.Methods of plastid transformation are known in the art.
Ainsi, on peut transformer les chloroplastes par biolistique. On bombarde les tissus (cellules) méristématiques. Avec des microbilles d’or enrobées d’ADN. Après divisions, le nombre de plastes transformés augmentera plus rapidement que les plastes non transformés (notamment lorsque l’on utilise un milieu de sélection), est les plastes non transformés vont se « perdre » par dilution.Thus, chloroplasts can be transformed by biolistics. The meristematic tissues (cells) are bombarded. With DNA-coated gold microbeads. After divisions, the number of transformed plastids will increase more rapidly than untransformed plastids (especially when using a selection medium), and untransformed plastids will be "lost" by dilution.
Alternativement, on peut utiliser la méthode des PEGs (polyéthylène glycols). La déstabilisation des membranes plasmiques en présence de PEG permet l’entrée des transgènes dans les chloroplastes.Alternatively, the PEG (polyethylene glycol) method can be used. The destabilization of plasma membranes in the presence of PEG allows the entry of transgenes into chloroplasts.
TransgènesTransgenes
L’invention se rapporte ainsi à une plante dont au moins un chloroplaste d’une cellule contient les gènes codant pour les protéines hispidin synthase (H3H) et luciférase (Luz) sous le contrôle de promoteurs actifs dans le chloroplaste.The invention thus relates to a plant of which at least one chloroplast of a cell contains the genes coding for the proteins hispidin synthase (H3H) and luciferase (Luz) under the control of active promoters in the chloroplast.
L’invention se rapporte également à une cellule de plante dont au moins un chloroplaste d’une cellule contient les gènes codant pour les protéines hispidin synthase (H3H) et luciférase (Luz) sous le contrôle de promoteurs actifs dans le chloroplaste. Il est possible de régénérer une plante complète à partir de cette cellule.The invention also relates to a plant cell of which at least one chloroplast of a cell contains the genes encoding the proteins hispidin synthase (H3H) and luciferase (Luz) under the control of promoters active in the chloroplast. It is possible to regenerate a complete plant from this cell.
La cellule ainsi décrite peut produire de la lumière par ajout d’hispidine dans le milieu de culture. Lorsque cette cellule est présente dans une plante, l’hispidine présente dans le milieu de culture atteint la cellule via la sève.The cell thus described can produce light by adding hispidine to the culture medium. When this cell is present in a plant, the hispidine present in the culture medium reaches the cell via the sap.
Dans le chloroplaste, l’hispidine est alors transformée en luciférine par l’enzyme H3H, puis la luciférine est oxydée en oxyluciférine par la luciférase Luz, en produisant de la lumière. Ce mode de réalisation permet d’obtenir la luminescence uniquement lorsque le substrat (hispidine) est apporté à la plante.In the chloroplast, hispidine is then transformed into luciferin by the enzyme H3H, then the luciferin is oxidized into oxyluciferin by luciferase Luz, producing light. This embodiment makes it possible to obtain luminescence only when the substrate (hispidine) is brought to the plant.
Dans un autre mode de réalisation, les chloroplastes des cellules de plantes contiennent, outre les gènes codant pour les enzymes H3H et Luz, un gène codant pour l’enzyme hispidine synthase HispS, sous le contrôle d’un promoteur actif dans les chloroplastes. Dans ce mode de réalisation, la luminescence sera initiée grâce à l’acide caféique naturellement présent dans la cellule végétale (cytoplasme) et dans le chloroplaste. Celui-ci est alors transformé en hispidine, qui donne ensuite la luciférine. Alternativement, on peut initier la luminescence en ajoutant de l’acide caféique dans le milieu de culture.In another embodiment, the chloroplasts of plant cells contain, in addition to the genes encoding the enzymes H3H and Luz, a gene encoding the enzyme hispidine synthase HispS, under the control of a promoter active in the chloroplasts. In this embodiment, the luminescence will be initiated thanks to the caffeic acid naturally present in the plant cell (cytoplasm) and in the chloroplast. This is then transformed into hispidine, which then gives luciferin. Alternatively, luminescence can be initiated by adding caffeic acid to the culture medium.
Dans ce mode de réalisation, la cellule peut ainsi produire la luminescence de façon autonome, c’est-à-dire qu’elle contienne l’ensemble des gènes permettant la synthèse de luciférine, ainsi que son recyclage.In this embodiment, the cell can thus produce luminescence autonomously, i.e. it contains all the genes allowing the synthesis of luciferin, as well as its recycling.
Dans un autre mode de réalisation, on préfère toutefois qu’elle contienne l’ensemble des gènes permettant la synthèse de luciférine, ainsi que les gènes permettant le recyclage de l’acide caféil-pyruvique, produit de réaction de la luciférase sur la luciférine, afin d’éviter son accumulation et un risque de déficit en acide caféique.In another embodiment, however, it is preferred that it contain all the genes allowing the synthesis of luciferin, as well as the genes allowing the recycling of caffeil-pyruvic acid, the reaction product of luciferase on luciferin, in order to avoid its accumulation and a risk of caffeic acid deficiency.
Dans ce mode de réalisation, le chloroplaste contient les gènes codant pour les protéines caféyl-pyruvate hydrolase (CPH, GenBank: BBH43519.1), hispidine synthase (HispS, GenBank: BBH43485.1), sous le contrôle de promoteurs actifs dans les chloroplastes.In this embodiment, the chloroplast contains the genes encoding the proteins caffeyl-pyruvate hydrolase (CPH, GenBank: BBH43519.1), hispidine synthase (HispS, GenBank: BBH43485.1), under the control of promoters active in the chloroplasts .
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la luciférase est SEQ ID NO: 20 (avec ou sans l’étiquette poly_histidine, His-tag).In a particular embodiment, the luciferase sequence is SEQ ID NO: 20 (with or without the poly_histidine tag, His-tag).
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de l’enzyme H3H est SEQ ID NO: 21 (avec ou sans l’étiquette poly_histidine, His-tag).In a particular embodiment, the sequence of the H3H enzyme is SEQ ID NO: 21 (with or without the poly_histidine tag, His-tag).
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de l’enzyme CPH est SEQ ID NO: 22 (avec ou sans l’étiquette poly_histidine, His-tag).In a particular embodiment, the sequence of the CPH enzyme is SEQ ID NO: 22 (with or without the poly_histidine tag, His-tag).
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de l’enzyme HispS est SEQ ID NO: 23 (avec ou sans l’étiquette poly_histidine, His-tag).In a particular embodiment, the sequence of the HispS enzyme is SEQ ID NO: 23 (with or without the poly_histidine tag, His-tag).
Dans un mode de réalisation, le chloroplaste contient également un gène codant pour une phosphopantetheinyl transferase (NpgA, NCBI Reference Sequence: XP_663744.1), également sous le contrôle d’un promoteur actif dans les plastes. Le gène codant pour NpgA peut être ajouté dans chaque mode de réalisation tel que décrit ci-dessus.In one embodiment, the chloroplast also contains a gene encoding a phosphopantetheinyl transferase (NpgA, NCBI Reference Sequence: XP_663744.1), also under the control of a promoter active in plastids. The gene encoding NpgA may be added in each embodiment as described above.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence de la NpgA est SEQ ID NO: 24 (avec ou sans l’étiquette poly_histidine, His-tag).In a particular embodiment, the sequence of the NpgA is SEQ ID NO: 24 (with or without the poly_histidine tag, His-tag).
Dans un mode de réalisation particulier, la plante est telle que l’ensemble de ses cellules contient au moins un chloroplaste (et de préférence au moins 50% de ses chloroplastes) transformé par les gènes codant pour les protéines H3H, Luz, CPH, HispS et NpgA.In a particular embodiment, the plant is such that all of its cells contain at least one chloroplast (and preferably at least 50% of its chloroplasts) transformed by the genes coding for the proteins H3H, Luz, CPH, HispS and NpgA.
L’invention se rapporte également à une cellule de plante dont au moins 50% des chloroplastes sont transformés par les gènes codant pour les protéines H3H, Luz, CPH, HispS et NpgA.The invention also relates to a plant cell in which at least 50% of the chloroplasts are transformed by the genes encoding the proteins H3H, Luz, CPH, HispS and NpgA.
VecteursVectors
L’invention se rapporte également à un vecteur contenant
(a) une origine de réplication dans une bactérie ou une levure, préférentiellement une origine de réplication dansEscherichia coli,
(b) une séquence d’acide nucléique codant pour la protéine Luz (en particulier SEQ ID NO: 1) sous le contrôle d’un promoteur fonctionnel dans les chloroplastes,
(c) une séquence d’acide nucléique codant pour la protéine H3H (en particulier SEQ ID NO: 2) sous le contrôle d’un promoteur fonctionnel dans les chloroplastes,
(d) deux séquences nucléiques présentes dans un chloroplaste, de préférence trnI (SEQ ID NO: 6) et trnA (SEQ ID NO: 7), flanquant lesdites séquences d’acide nucléique (b) et (c),
ces séquences (b) et (c) étant donc localisées entre ces deux séquences (d).The invention also relates to a vector containing
(a) an origin of replication in a bacterium or yeast, preferably an origin of replication in Escherichia coli ,
(b) a nucleic acid sequence encoding the Luz protein (in particular SEQ ID NO: 1) under the control of a functional promoter in chloroplasts,
(c) a nucleic acid sequence encoding the H3H protein (in particular SEQ ID NO: 2) under the control of a functional promoter in chloroplasts,
(d) two nucleic acid sequences present in a chloroplast, preferably trnI (SEQ ID NO: 6) and trnA (SEQ ID NO: 7), flanking said nucleic acid sequences (b) and (c),
these sequences (b) and (c) therefore being located between these two sequences (d).
Dans un mode de réalisation particulier, le vecteur contient également
(e) une séquence d’acide nucléique codant pour une protéine Cph (en particulier SEQ ID NO: 3), localisée entre les séquences (d) avec les séquences (b) et (c).In a particular embodiment, the vector also contains
(e) a nucleic acid sequence coding for a Cph protein (in particular SEQ ID NO: 3), located between sequences (d) with sequences (b) and (c).
Dans un mode de réalisation particulier, le vecteur contient également
(f) une séquence d’acide nucléique codant pour une protéine HispS (en particulier SEQ ID NO: 4), localisée entre les séquences (d) avec les séquences (b) et (c).In a particular embodiment, the vector also contains
(f) a nucleic acid sequence coding for a HispS protein (in particular SEQ ID NO: 4), located between sequences (d) with sequences (b) and (c).
Dans un mode de réalisation particulier, le vecteur contient également
(g) une séquence d’acide nucléique codant pour une protéine NpgA (en particulier SEQ ID NO: 5), localisée entre les séquences (d) avec les séquences (b) et (c).In a particular embodiment, the vector also contains
(g) a nucleic acid sequence coding for an NpgA protein (in particular SEQ ID NO: 5), located between sequences (d) with sequences (b) and (c).
Dans un mode de réalisation préféré, le vecteur contient l’origine de réplication (a), ainsi que les séquences (b), (c), (e), (f) et (g) flanquées par les séquences (d).In a preferred embodiment, the vector contains the origin of replication (a), together with the sequences (b), (c), (e), (f) and (g) flanked by the sequences (d).
Cellules hôtesHost cells
L’invention se rapporte également à une cellule hôte contenant un vecteur tel que décrit ci-dessus. Cette cellule est préférentiellement une cellule bactérienne, de façon préféréeEscherichia colitransformée par le vecteur.The invention also relates to a host cell containing a vector as described above. This cell is preferably a bacterial cell, preferably Escherichia coli transformed by the vector.
Optimisation des séquences codantesOptimization of coding sequences
Il est préférable que la séquence nucléique des gènes ait été optimisée pour expression dans les chloroplastes (adaptation des usages de codon des chloroplastes).It is preferable that the nucleic acid sequence of the genes has been optimized for expression in the chloroplasts (adaptation of the codon usages of the chloroplasts).
On peut se baser sur les informations données dans Nakamura et al (Plant J. 2007 Jan;49(1):128-34. 2006), Liu et al (J Genet. 2005 Apr;84(1):55-62) ou Zhang et al (Journal of Integrative Plant Biology 2007, 49 (2): 246−254). En particulier on utilise les bases de données du Kazusa DNA Research Institute qui peuvent être trouvées sur leur site internet https://www.kazusa.or.jp/codon.We can rely on the information given in Nakamura et al (Plant J. 2007 Jan;49(1):128-34. 2006), Liu et al (J Genet. 2005 Apr;84(1):55-62) or Zhang et al (Journal of Integrative Plant Biology 2007, 49 (2): 246−254). In particular we use the databases of the Kazusa DNA Research Institute which can be found on their website https://www.kazusa.or.jp/codon.
Les séquences SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 5 sont ainsi des séquences optimisées pour une expression dans les chloroplastes. On peut utiliser ces séquences, ou des séquences présentant au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité, de préférence au moins 98% d’identité, de façon plus préférée au moins 99% d’identité avec ces séquences et qui codent pour les protéines SEQ ID NO: 20 à SEQ ID NO: 24 respectivement.The sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 5 are thus sequences optimized for expression in chloroplasts. These sequences, or sequences having at least 90% identity, preferably at least 95% identity, preferably at least 98% identity, more preferably at least 99% identity with these sequences and which code for the proteins SEQ ID NO: 20 to SEQ ID NO: 24 respectively.
De préférence, les gènes optimisés le sont pour obtenir un taux de GC compris entre 35% et 40%. On choisit aussi les codons préférentiellement exprimés dans les chloroplastes notamment en tenant compte des données de Liu et al.Preferably, the genes are optimized to obtain a GC rate of between 35% and 40%. The codons preferentially expressed in the chloroplasts are also chosen, in particular taking into account the data of Liu et al.
OrganismeBody
Le système utilisé est un système issu de champignons (fungus). En particulier, on préfère utiliser le système d’enzymes issu d’un champignon choisi parmiNeonothopanus nambi,Neonothopanus gardneri, ouOmphalotus olearius.The system used is a system derived from fungi (fungus). In particular, it is preferred to use the enzyme system derived from a fungus chosen from Neonothopanus nambi , Neonothopanus gardneri , or Omphalotus olearius .
De préférence, on préfère lorsque l’ensemble des enzymes utilisées (HispS, H3H, Luz, et CPH) provient du même organisme, de préférenceNeonothopanus nambi. L’utilisation de séquences provenant deNeonothopanus gardneri, qui sont très similaires à celles deNeonothopanus nambi, est également envisagée. On peut aussi utiliser à la fois certaines séquences provenant deNeonothopanus nambiet d’autres provenant deNeonothopanus gardneri.Preferably, it is preferred when all of the enzymes used (HispS, H3H, Luz, and CPH) come from the same organism, preferably Neonothopanus nambi . The use of sequences from Neonothopanus gardneri , which are very similar to those of Neonothopanus nambi , is also considered. It is also possible to use both certain sequences originating from Neonothopanus nambi and others originating from Neonothopanus gardneri .
Il est rappelé que le gènenpgA(4′-phosphopantetheinyl transferase) provient d’Aspergillus nidulans.It is recalled that the npgA (4′-phosphopantetheinyl transferase) gene comes from Aspergillus nidulans .
Promoteurs et séquences codantesPromoters and coding sequences
OpéronOperon
Dans un premier mode de réalisation, on exprime les différents gènes sous le contrôle d’un unique promoteur, sous la forme d’un opéron, ainsi qu’il est connu dans l’art, pour des gènes impliqués dans une même voie métabolique (cf Saxena et al., 2014 J Biosci. 2014 Mar;39(1):33-41; Kumar et al, 2012 Metab Eng. 2012 Jan;14(1):19-28).In a first embodiment, the different genes are expressed under the control of a single promoter, in the form of an operon, as is known in the art, for genes involved in the same metabolic pathway ( cf Saxena et al., 2014 J Biosci. 2014 Mar;39(1):33-41; Kumar et al, 2012 Metab Eng. 2012 Jan;14(1):19-28).
Dans ce mode de réalisation, on peut utiliser un promoteur choisi parmi les promoteurs PatpI, Prrn, PrbcL ou PpsbA (en particulier ceux décrits par les séquences SEQ ID NO: 8 à SEQ ID NO: 12).In this embodiment, it is possible to use a promoter chosen from the PatpI, Prrn, PrbcL or PpsbA promoters (in particular those described by the sequences SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 12).
Promoteurs individuelsIndividual promoters
Dans un autre mode de réalisation, chaque transgène introduit dans le chloroplaste de la plante est sous le contrôle de son propre promoteur.In another embodiment, each transgene introduced into the plant chloroplast is under the control of its own promoter.
On peut choisir les promoteurs PatpI, Prrn, PrbcL ou PpsbA.The PatpI, Prrn, PrbcL or PpsbA promoters can be chosen.
De préférence, le gène H3h est sous le contrôle du promoteur PpsbA, en particulier la partie spécifiée dans SEQ ID NO: 9.Preferably, the H3h gene is under the control of the PpsbA promoter, in particular the part specified in SEQ ID NO: 9.
De préférence, le gène Luz est sous le contrôle du promoteur PpsbA, en particulier la partie spécifiée dans SEQ ID NO: 9.Preferably, the Luz gene is under the control of the PpsbA promoter, in particular the part specified in SEQ ID NO: 9.
De préférence, le gène Cph est sous le contrôle du promoteur PrbcL, en particulier la partie spécifiée SEQ ID NO: 10.Preferably, the Cph gene is under the control of the PrbcL promoter, in particular the part specified SEQ ID NO: 10.
De préférence, le gène HispS est sous le contrôle du promoteur Prrn, en particulier la partie spécifiée dans SEQ ID NO: 11.Preferably, the HispS gene is under the control of the Prrn promoter, in particular the part specified in SEQ ID NO: 11.
De préférence le gène npgA est sous le contrôle du promoteur PatpI, en particulier la partie spécifiée dans SEQ ID NO: 12.Preferably the npgA gene is under the control of the PatpI promoter, in particular the part specified in SEQ ID NO: 12.
Dans un mode de réalisation particulier, on optimise les séquences, et en particulier les promoteurs en choisissant des séquences 5’UTR particulières, afin d’optimiser l’expression des gènes dans les chloroplastes (De Costa et al. Genes Genet Syst. 2001 Dec;76(6):363-71); Drechsel et Bock Nucleic Acids Res. 2011 Mar;39(4):1427-38); Shinozaki et Sugiura Gene. 1982 Nov 20(1) 91-102 et Nucleic Acids Res. 1982 Aug 25;10(16):4923-34; Kuroda and Maliga, Plant Physiol. 2001 Jan;125(1):430-6).In a particular embodiment, the sequences, and in particular the promoters, are optimized by choosing particular 5′UTR sequences, in order to optimize the expression of the genes in the chloroplasts (De Costa et al. Genes Genet Syst. 2001 Dec ;76(6):363-71); Drechsel and Bock Nucleic Acids Res. 2011 Mar;39(4):1427-38); Shinozaki and Sugiura Gene. 1982 Nov 20(1) 91-102 and Nucleic Acids Res. 1982 Aug 25;10(16):4923-34; Kuroda and Maliga, Plant Physiol. 2001 Jan;125(1):430-6).
Les séquences SEQ ID NO: 9 à SEQ ID NO: 12 représentent de tels promoteurs optimisés avec des 5’UTR ajoutés pour améliorer l’expression.The sequences SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO: 12 represent such promoters optimized with 5'UTRs added to improve expression.
Ainsi, de préférence, le gène H3h est sous le contrôle du promoteur optimisé décrit par SEQ ID NO: 9.Thus, preferably, the H3h gene is under the control of the optimized promoter described by SEQ ID NO: 9.
De préférence, le gène Luz est sous le contrôle du promoteur PpsbA optimisé décrit par SEQ ID NO: 9.Preferably, the Luz gene is under the control of the optimized PpsbA promoter described by SEQ ID NO: 9.
De préférence, le gène Cph est sous le contrôle du promoteur PrbcL optimisé décrit par SEQ ID NO: 10.Preferably, the Cph gene is under the control of the optimized PrbcL promoter described by SEQ ID NO: 10.
De préférence, le gène HispS est sous le contrôle du promoteur Prrn optimisé décrit par SEQ ID NO: 11.Preferably, the HispS gene is under the control of the optimized Prrn promoter described by SEQ ID NO: 11.
De préférence le gène npgA est sous le contrôle du promoteur PatpI optimisé décrit par SEQ ID NO: 12.Preferably the npgA gene is under the control of the optimized PatpI promoter described by SEQ ID NO: 12.
On utilise également des terminateurs positionnés en 3’ des séquences nucléiques codantes. On peut utiliser les terminateurs représentés par les séquences SEQ ID NO: 13 à SEQ ID NO: 18.Terminators positioned 3′ of the coding nucleic sequences are also used. The terminators represented by the sequences SEQ ID NO: 13 to SEQ ID NO: 18 can be used.
Dans un mode de réalisation préféré, on utilise un construit (5’-3’) SEQ ID NO: 9- SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO:14 pour exprimer Luz.In a preferred embodiment, a construct (5'-3') SEQ ID NO: 9- SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO: 14 is used to express Luz.
Dans un mode de réalisation préféré, on utilise un construit (5’-3’) SEQ ID NO: 9- SEQ ID NO: 2- SEQ ID NO:15 pour exprimer H3H.In a preferred embodiment, a construct (5'-3') SEQ ID NO: 9- SEQ ID NO: 2- SEQ ID NO: 15 is used to express H3H.
Dans un mode de réalisation préféré, on utilise un construit (5’-3’) SEQ ID NO: 10- SEQ ID NO: 3- SEQ ID NO:16 pour exprimer Cph.In a preferred embodiment, a construct (5'-3') SEQ ID NO: 10- SEQ ID NO: 3- SEQ ID NO: 16 is used to express Cph.
Dans un mode de réalisation préféré, on utilise un construit (5’-3’) SEQ ID NO: 11- SEQ ID NO: 4- SEQ ID NO:14 pour exprimer HispS.In a preferred embodiment, a construct (5'-3') SEQ ID NO: 11- SEQ ID NO: 4- SEQ ID NO: 14 is used to express HispS.
Dans un mode de réalisation préféré, on utilise un construit (5’-3’) SEQ ID NO: 12- SEQ ID NO: 5- SEQ ID NO:18 pour exprimer NpgA.In a preferred embodiment, a construct (5'-3') SEQ ID NO: 12- SEQ ID NO: 5- SEQ ID NO: 18 is used to express NpgA.
Dans un mode de réalisation préféré, on utilise un construit (5’-3’) SEQ ID NO: 8- SEQ ID NO: 19- SEQ ID NO:17 pour exprimer le gène de sélection aadA.In a preferred embodiment, a construct (5′-3′) SEQ ID NO: 8- SEQ ID NO: 19- SEQ ID NO: 17 is used to express the aadA selection gene.
Intégration de la cassette d’expression au sein des chloroplastesIntegration of the expression cassette within chloroplasts
Ainsi que vu plus haut, dans un mode de réalisation particulier, l’ensemble des gènes présents dans les chloroplastes forme une cassette d’expression, c’est-à-dire que ces gènes sont présents les uns à la suite des autres sur un fragment d’ADN. Ainsi, on transforme les chloroplastes avec cette cassette d’expression, afin d’obtenir l’expression des gènes codées dans cette cassette d’expression.As seen above, in a particular embodiment, all the genes present in the chloroplasts form an expression cassette, that is to say these genes are present one after the other on a DNA fragment. Thus, the chloroplasts are transformed with this expression cassette, in order to obtain the expression of the genes encoded in this expression cassette.
Il est préféré lorsque les gènes sont intégrés dans le génome des chloroplastes. En particulier, on utilise la recombinaison homologue pour introduire les gènes à une localisation sélectionnée dans le génome du chloroplaste.It is preferred when the genes are integrated into the chloroplast genome. In particular, homologous recombination is used to introduce genes at a selected location in the chloroplast genome.
De nombreux sites d’insertions sont possibles, dans le génome du chloroplaste. On choisit préférentiellement d’intégrer la cassette d’expression dans une région non codante du génome du chloroplaste. On peut ainsi utiliser des séquences inter-géniques comprises entre deux séquences codant pour les ARN de transfert du chloroplaste.Many insertion sites are possible in the chloroplast genome. It is preferentially chosen to integrate the expression cassette into a non-coding region of the chloroplast genome. It is thus possible to use intergenic sequences comprised between two sequences coding for the transfer RNAs of the chloroplast.
En particulier, on choisit les sites trnI (SEQ ID NO: 6) et trnA (SEQ ID NO: 7), codant pour les ARN de transfert de l’isoleucine et l’alanine. On peut ainsi utiliser les séquences SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7, ou des séquences contenant ces séquences. On peut aussi utiliser des séquences incluses dans SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7. Toutefois, dans ce cas, on préfère utiliser des séquences présentant au moins 1000 bases, de préférence au moins 1300 bases, de préférences au moins 1500 bases, de préférence au moins 1700 bases de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7. De fait, afin d’augmenter les chances de recombinaison homologue, il est préférable d’utiliser des séquences les plus longues possibles.In particular, the trnI (SEQ ID NO: 6) and trnA (SEQ ID NO: 7) sites are chosen, coding for the transfer RNAs of isoleucine and alanine. It is thus possible to use the sequences SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7, or sequences containing these sequences. It is also possible to use sequences included in SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7. However, in this case, it is preferred to use sequences having at least 1000 bases, preferably at least 1300 bases, preferably at least 1500 bases , preferably at least 1700 bases of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7. In fact, in order to increase the chances of homologous recombination, it is preferable to use the longest possible sequences.
Les séquences SEQ ID NO: 6 et SEQ ID NO: 7 sont issues du tabac (Nicotiana benthamiana). Elles sont donc particulièrement adaptées pour une intégration par recombinaison homologue dans les chloroplastes du tabac. Elles peuvent toutefois être utilisées pour d’autres plantes, en raison de la grande homologie existant entre ces séquences et les séquences trnI et trnA de chloroplastes d’autres plantes. Ainsi, on peut utiliser des séquences présentant au moins 99% d’identité, de façon plus préférée au moins 99.45% d’identité, de façon plus préférée au moins 99.5% d’identité, de façon plus préférée au moins 99.7% d’identité avec SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7.The sequences SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 are from tobacco (Nicotiana benthamiana). They are therefore particularly suitable for integration by homologous recombination into tobacco chloroplasts. They can however be used for other plants, because of the great homology existing between these sequences and the trnI and trnA sequences of chloroplasts of other plants. Thus, one can use sequences having at least 99% identity, more preferably at least 99.45% identity, more preferably at least 99.5% identity, more preferably at least 99.7% identity with SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7.
Comparaison de séquences / détermination du pourcentage d’identitéSequence comparison / determination of percent identity
Afin d’évaluer l’identité entre deux séquences nucléiques, on utilise le logiciel Blastn (nucleotide blast) développé à partir de Altschul et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Altschul et al, (2005) FEBS J. 272:5101-5109, disponible sur le site du NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) en utilisant les paramètres suivants, indiqués en anglais:
Nombre max de séquences cibles (Max target sequences): 100
Sélectionnez le nombre maximum de séquences alignées à afficher (Select the maximum number of aligned sequences to display)
Courtes requêtes : Ajustement automatique des paramètres pour les courtes séquences d'entrée (Short queries: Automatically adjust parameters for short input sequences)
Seuil attendu (Expect threshold): 10
Taille de mot (Word size): 28
Correspondance max dans une plage de recherche (Max matches in a query range): 0
Paramètres de notation (Scoring Parameters)
Scores de correspondance/écart (Match/Mismatch Scores): 1,-2
Coût des écarts : Linéaire (Gap Costs: Linear)
Filtres et masquage (Filters and Masking)
Filtre : Régions de faible complexité filtre : allumé (Filter : Low complexity regions filter : on)
Masque : Masque pour table de consultation uniquement: allumé (Mask : Mask for lookup table only : on)In order to evaluate the identity between two nucleic acid sequences, the Blastn software ( nucleotide blast ) developed from Altschul et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Altschul et al, (2005) FEBS J. 272:5101-5109, available on the NCBI website (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) using the following parameters, indicated in English :
Max target sequences: 100
Select the maximum number of aligned sequences to display
Short queries: Automatically adjust parameters for short input sequences
Expected threshold: 10
Word size: 28
Max matches in a query range: 0
Scoring Parameters
Match/Mismatch Scores: 1,-2
Gap Costs: Linear
Filters and Masking
Filter: Low complexity regions filter: on
Mask: Mask for lookup table only: on
Afin d’évaluer l’identité entre deux séquences protéiques, on utilise le logiciel Blastp (protein blast) développé à partir de Altschul et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Altschul et al, (2005) FEBS J. 272:5101-5109, disponible sur le site du NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) en utilisant les paramètres suivants, indiqués en anglais:
Seuil attendu (Expected threshold) : 10
Taille de mot (Word size) : 3
Correspondance max dans une plage de recherche (Max matches in a query range): 0
Matrice (Matrix): BLOSUM62
Coût des écarts (Gap Costs): Existence 11, Extension 1.
Ajustements de la composition : Ajustement conditionnel de la matrice des scores de composition (Compositional adjustments: Conditional compositional score matrix adjustment)
Pas de filtre pour les régions à faible complexité (No filter for low complexity regions)In order to evaluate the identity between two protein sequences, the Blastp software ( protein blast ) developed from Altschul et al, (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Altschul et al, (2005) FEBS J. 272:5101-5109, available on the NCBI website (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) using the following parameters, indicated in English :
Expected threshold: 10
Word size: 3
Max matches in a query range: 0
Matrix (Matrix): BLOSUM62
Gap Costs: Existence 11, Extension 1.
Compositional adjustments: Conditional compositional score matrix adjustment
No filter for low complexity regions
PlantePlant
La plante selon l’invention est préférentiellement une plante ornementale. Elle est préférentiellement choisie dans le groupe constitué deHedera helix,Petunia axillaris subsp. axillaris,Nicotiana benthamiana,Ficus benjamina,ficus elastica,Ficus microcarpa,Chlorophytum comosum,Monstera deliciosa,Sansevieria socotrana,Pelargonium x hortorum,Spathiphyllum wallisii,Dracaena draco,Dracaena angustifolia,Yucca aloifolia,Beaucarnea recurvata,Syngonium podophyllum,Fittonia verschaffeltii,Aloe vera,Aloe Aloe jucunda,Aloe juvenna,Dieffenbachia. Livistona speciosa,Orchidaceae. En particulier, la plante estNicotiana benthamiana. Dans un autre mode de réalisation, la plante est le pétunia (Petunia axillaris subsp. Axillaris). Dans un autre mode de réalisation, la plante est le lierre (Hedera helix).The plant according to the invention is preferably an ornamental plant. It is preferably chosen from the group consisting of Hedera helix , Petunia axillaris subsp. axillaris , Nicotiana benthamiana , Ficus benjamina , ficus elastica , Ficus microcarpa , Chlorophytum comosum , Monstera deliciosa , Sansevieria socotrana , Pelargonium x hortorum , Spathiphyllum wallisii , Dracaena draco , Dracaena angustifolia , Yucca aloifolia , Beaucarnea recurvatii , Fitlophylt podii um , Aloe Aloe jucunda , Aloe juvenna , Dieffenbachia. Livistona speciosa , Orchidaceae . In particular, the plant is Nicotiana benthamiana . In another embodiment, the plant is the petunia ( Petunia axillaris subsp. Axillaris ). In another embodiment, the plant is ivy ( Hedera helix ).
Méthode de productionProduction method
L’invention se rapporte également à une méthode de production d’une plante telle que décrite ci-dessus, comprenant une étape d’insertion des transgènes tels que décrits plus haut dans le génome de chloroplastes de cellules de plantes. La méthode comprend aussi préférentiellement l’étape de régénération d’une plante par culture de cals.The invention also relates to a method for producing a plant as described above, comprising a step of inserting the transgenes as described above into the genome of plant cell chloroplasts. The method also preferably comprises the step of regenerating a plant by culturing calluses.
Dans un premier mode de réalisation, la méthode comprend l’insertion des transgènes codant pour les enzymes H3H et Luz dans le génome de chloroplastes de cellules de plantes.In a first embodiment, the method comprises the insertion of the transgenes encoding the H3H and Luz enzymes into the genome of plant cell chloroplasts.
Dans un autre mode de réalisation, la méthode comprend l’insertion des transgènes codant pour les enzymes Cph, H3H et Luz dans le génome de chloroplastes de cellules de plantes.In another embodiment, the method includes inserting the transgenes encoding the enzymes Cph, H3H and Luz into the chloroplast genome of plant cells.
Dans un autre mode de réalisation, la méthode comprend l’insertion des transgènes codant pour les enzymes Cph, HispS, H3H et Luz dans le génome de chloroplastes de cellules de plantes.In another embodiment, the method involves inserting the transgenes encoding the enzymes Cph, HispS, H3H and Luz into the chloroplast genome of plant cells.
Dans un autre mode de réalisation, la méthode comprend l’insertion des transgènes codant pour les enzymes Cph, HispS, H3H et Luz dans le génome de chloroplastes de cellules de plantes, ainsi qu’un transgène codant pour NpgA.In another embodiment, the method includes inserting the transgenes encoding the enzymes Cph, HispS, H3H, and Luz into the genome of plant cell chloroplasts, as well as a transgene encoding NpgA.
Dans un mode de réalisation, l’intégration des transgènes est effectuée par bombardement de feuilles de plantes avec un plasmide à l’aide d’un canon à particules. Pour ce faire, on prépare la cassette d’expression (fragment d’ADN portant les transgènes que l’on souhaite intégrer dans le génome du chloroplaste), et on recouvre des microbilles de métal (préférentiellement en or, mais pouvant également être en tungstène) qui sont ensuite projetées sur les cellules végétales.In one embodiment, integration of transgenes is accomplished by bombarding plant leaves with a plasmid using a particle gun. To do this, we prepare the expression cassette (fragment of DNA carrying the transgenes that we want to integrate into the genome of the chloroplast), and we cover metal microbeads (preferably gold, but can also be tungsten ) which are then projected onto the plant cells.
Dans un autre mode de réalisation, les cellules végétales sont mise en contact avec du polyéthylène glycol (PEG), qui déstabilise les membranes plasmiques et permet l’entrée des fragments d’ADN portant les transgènes à intégrer dans le génome du plaste.In another embodiment, plant cells are brought into contact with polyethylene glycol (PEG), which destabilizes the plasma membranes and allows the entry of DNA fragments carrying the transgenes to be integrated into the plastid genome.
Dans l’un et l’autre cas, on cultive les cellules transformées dans les conditions permettant d’obtenir des cals, que l’on cultive, puis à partir desquels on régénère une plante par des méthodes connues dans l’art.In either case, the transformed cells are cultured under conditions to obtain calli, which are cultured, and then from which a plant is regenerated by methods known in the art.
Dans un mode de réalisation préféré, la culture des cals est effectuée sur un milieu sélectif. Un milieu sélectif est un milieu contenant un élément sélectif (souvent un antibiotique ou un herbicide) sur lequel ne peuvent pousser que les cellules contenant un gène de résistance à l’élément sélectif, alors que les cellules ne contenant pas ce gène ne peuvent pousser ou poussent de façon ralentie.In a preferred embodiment, the culture of the calluses is carried out on a selective medium. A selective medium is a medium containing a selective element (often an antibiotic or a herbicide) on which only cells containing a resistance gene for the selective element can grow, whereas cells not containing this gene cannot grow or grow slowly.
Parmi les éléments sélectifs, on peut citer les antibiotiques : neomycine/kanamycine et nptII (aminoglycoside 3'-phosphotransférase), betain et badh (betain aldehyde deshydrogenase), hygromycine B et hph (hygromycine B phosphotransférase), spectinomycine / streptomycine et aadA (aminoglycoside 3'-adenyltransferase), chloramphenicol et cat (chloramphénicol acétyltransférase), amikacin et aphA6 (3'-aminoglycoside phosphotransferase), blasticidine S et bsr (blasticidine S deaminase), sulfonamides et sull (dihydropteorate synthase DHPS), gentamycine et aacC1 (gentamycine acetyltransferase) ou les herbicides bialophos / phosphinotricine / glufosinate et pat (phosphinotricine acteyltransferase), glyphosate et gox (glyphosate oxydoreductase) ou epsp (5 eonylpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase), bromoxynil et bxn (bromosynile nitrilase), sulfonylureas / imidazolines / triazolopyrimidines / pyrimidylbenzoates et als (acetolactate synthase).Selective elements include antibiotics: neomycin/kanamycin and nptII (aminoglycoside 3'-phosphotransferase), betain and badh (betain aldehyde dehydrogenase), hygromycin B and hph (hygromycin B phosphotransferase), spectinomycin/streptomycin and aadA (aminoglycoside 3'-adenyltransferase), chloramphenicol and cat (chloramphenicol acetyltransferase), amikacin and aphA6 (3'-aminoglycoside phosphotransferase), blasticidin S and bsr (blasticidin S deaminase), sulfonamides and sull (dihydropteorate synthase DHPS), gentamycin and aacC1 (gentamycin acetyltransferase ) or the herbicides bialophos / phosphinotricin / glufosinate and pat (phosphinotricine actyltransferase), glyphosate and gox (glyphosate oxidoreductase) or epsp (5 eonylpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase), bromoxynil and bxn (bromosynil nitrilase), sulfonylureas / imidazolines / triazolopyrimidines / pyrimidylbenzoates et als (acetolactate synthase).
On utilise en particulier le gène aadA (aminoglycoside 3'-adenyltransferase) qui confère la résistance à la spectinomycine, dont une séquence codante est représentée par SEQ ID NO: 19.In particular, the aadA gene (aminoglycoside 3'-adenyltransferase) is used, which confers resistance to spectinomycin, a coding sequence of which is represented by SEQ ID NO: 19.
Le gène de résistance est introduit dans la cassette d’expression contenant les transgènes d’intérêt, sous le contrôle d’un promoteur actif dans les chloroplastes. On peut également mettre en œuvre un système dans lequel le gène de résistance peut être excisé après transformation, notamment en suivant l’enseignement de Scutt et al (Biochimie 84 (2002) 1119-1126) ou Lantham et al (Nature Biotechnology, 2000, (18), 1172-76).The resistance gene is introduced into the expression cassette containing the transgenes of interest, under the control of a promoter active in the chloroplasts. It is also possible to implement a system in which the resistance gene can be excised after transformation, in particular by following the teaching of Scutt et al (Biochimie 84 (2002) 1119-1126) or Lantham et al (Nature Biotechnology, 2000, (18), 1172-76).
L’invention se rapporte également à un système lumineux comprenant une plante émettant de la bioluminescence telle que décrite ci-dessus, c’est-à-dire dont au moins une cellule contient au moins un chloroplaste contenant les gènes cités ci-dessus, et qui émet de la bioluminescence par oxydation de la luciférine par l’enzyme Luz.The invention also relates to a light system comprising a plant emitting bioluminescence as described above, that is to say of which at least one cell contains at least one chloroplast containing the genes mentioned above, and which emits bioluminescence by oxidation of luciferin by the enzyme Luz.
De préférence, le système contient une plante dont au moins 50% des chloroplastes contient le système enzymatique mentionné ci-dessus.Preferably, the system contains a plant of which at least 50% of the chloroplasts contain the enzymatic system mentioned above.
L’invention se rapporte également à un procédé de production de lumière, comprenant l’étape d’ajout d’hispidine dans le milieu de culture d’une plante telle que décrite ci-dessus, et dont au moins un chloroplaste contient au moins les gènes codant pour les enzymes H3H et Luz (de préférence intégrés dans son génome).The invention also relates to a process for producing light, comprising the step of adding hispidine to the culture medium of a plant as described above, and of which at least one chloroplast contains at least the genes encoding H3H and Luz enzymes (preferably integrated into its genome).
L’invention se rapporte également à un procédé de production de lumière (par une plante), comprenant l’étape d’ajout d’acide caféique dans le milieu de culture d’une plante telle que décrite ci-dessus, et dont au moins un chloroplaste contient au moins les gènes codant pour les enzymes HispS, H3H et Luz (de préférence intégrés dans son génome).The invention also relates to a method for producing light (by a plant), comprising the step of adding caffeic acid to the culture medium of a plant as described above, and of which at least a chloroplast contains at least the genes coding for the enzymes HispS, H3H and Luz (preferably integrated into its genome).
L’invention se rapporte également à un procédé de production de lumière (par une plante), comprenant l’étape d’ajout d’acide caféique dans le milieu de culture d’une plante telle que décrite ci-dessus, et dont au moins un chloroplaste contient les gènes codant pour les enzymes HispS, H3H, Luz, Cph (de préférence intégrés dans son génome).The invention also relates to a method for producing light (by a plant), comprising the step of adding caffeic acid to the culture medium of a plant as described above, and of which at least a chloroplast contains the genes coding for the enzymes HispS, H3H, Luz, Cph (preferably integrated into its genome).
Préférentiellement le chloroplaste contient également et le gène codant pour NpgA, dans les procédés ci-dessus.Preferably, the chloroplast also contains and the gene encoding NpgA, in the above methods.
EXEMPLESEXAMPLES
Les exemples ci-dessous et figures décrivent un mode de réalisation particulier de l’invention.The examples below and figures describe a particular embodiment of the invention.
Exemple 1. Préparation du plasmide contenant les gènes H3H et Luz et les séquences permettant l’intégration de ces gènes dans le génome du chloroplaste ainsi que leur expressionExample 1. Preparation of the plasmid containing the H3H and Luz genes and the sequences allowing the integration of these genes into the chloroplast genome as well as their expression
Les séquences des gènes H3H et Luz ont été adaptées avec des codons d’usage des chloroplastes puis synthétisées (SEQ ID NO: 2 et SEQ ID NO: 1). Les promoteurs ont été choisis parmi l’ensemble des promoteurs présents dans le génome du chloroplaste et modifiés dans leur séquence 5’UTR de sorte de maximiser l’expression des gènes sous leurs contrôles. Ces promoteurs modifiés ont alors été synthétisés. Les terminateurs ont été choisis parmi l’ensemble des terminateurs présents dans le génome du chloroplaste et certains ont été optimisés pour être les plus courts possibles tout en gardant leurs fonctions. Ils ont aussi été synthétisés. Les séquences trnI et trnA (SEQ ID NO: 6 et SEQ ID NO: 7) ont été choisies pour permettre l’intégration des gènes H3H et Luz dans le génome du chloroplaste. Elles ont été amplifiées par PCR (Polymerase Chain Reaction) à partir d’ADN chloroplastique deNicotiana benthamiana. Le gène de résistance à la spectinomycine / streptomycine nommé aadA a été amplifié par PCR à partir d’un plasmide le contenant (SEQ ID NO: 19).The sequences of the H3H and Luz genes were adapted with chloroplast usage codons and then synthesized (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 1). The promoters were chosen from all the promoters present in the chloroplast genome and modified in their 5′UTR sequence so as to maximize the expression of the genes under their control. These modified promoters were then synthesized. The terminators were chosen from all the terminators present in the chloroplast genome and some were optimized to be as short as possible while retaining their functions. They have also been synthesized. The trnI and trnA sequences (SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7) were chosen to allow the integration of the H3H and Luz genes into the chloroplast genome. They were amplified by PCR (Polymerase Chain Reaction) from chloroplast DNA of Nicotiana benthamiana . The spectinomycin/streptomycin resistance gene named aadA was amplified by PCR from a plasmid containing it (SEQ ID NO: 19).
Pour élaborer le vecteur plasmidique contenant l’ensemble de ces séquences, le plasmide pUC19 a été utilisé. Les promoteurs, gènes et terminateurs ont été amplifiés par PCR et chaque partie du trio ont été liguées entre elles: promoteur, gène et terminateur avec la méthode In-fusion de chez Takara. 50 ng ou 100ng d’ADN ont été mis à incuber à 50°C pendant 1h avec les enzymes de ligation du kit In-fusion. Les produits de ligation ont alors été amplifiés par PCR.To develop the plasmid vector containing all of these sequences, the plasmid pUC19 was used. The promoters, genes and terminators were amplified by PCR and each part of the trio was ligated together: promoter, gene and terminator with the In-fusion method from Takara. 50 ng or 100 ng of DNA were incubated at 50°C for 1 hour with the ligation enzymes from the In-fusion kit. The ligation products were then amplified by PCR.
Les trois gènes (aadA, H3H, et Luz) ainsi fusionnés avec leurs promoteurs et terminateurs respectifs, et les séquences trnI et trnA ont alors été clonés dans le plasmide pUC19 linéarisé par PCR, en suivant le protocole de NEBuilder.The three genes (aadA, H3H, and Luz) thus fused with their respective promoters and terminators, and the trnI and trnA sequences were then cloned into the pUC19 plasmid linearized by PCR, following the NEBuilder protocol.
Le NEBuilder se base sur la stratégie de clonage par la méthode de «Gibson assembly.» Les primers ont été dessinés de sorte que les fragments présentent un chevauchement de séquence de 25pb entre eux et avec la séquence du site d’insertion du plasmide pUC19.The NEBuilder is based on the strategy of cloning by the method of "Gibson assembly." The primers were designed so that the fragments have a sequence overlap of 25 bp between themselves and with the sequence of the insertion site of the plasmid pUC19.
Gibson Reaction and Bacterial TransformationGibson Reaction and Bacterial Transformation
1. 40 à 75 ng d’ADN de chaque produit de PCR sont utilisés avec du tampon NEBuilder® HiFi DNA assembly 2X et incubés 1h à 50°C. 2. Les bactéries compétentes NEB 10-alpha sont transformées avec les produits de ligation par choc thermique, incubées 1h à 37°C puis étalées sur boite LB agar avec antibiotique et mises à incuber sur la nuit à 37°C. 3. L’ADN plasmidique d’une quinzaine de clones est extrait et analysé par séquençage. 4. Les clones positifs sont alors amplifiés dans un plus grand volume de LB + antibiotique (100ml) et leur ADN plasmidique est extrait et analysé par séquençage.1. 40 to 75 ng of DNA from each PCR product are used with NEBuilder® HiFi DNA assembly 2X buffer and incubated for 1 hour at 50°C. 2. The competent NEB 10-alpha bacteria are transformed with the ligation products by heat shock, incubated for 1 hour at 37°C then plated on an LB agar dish with antibiotic and incubated overnight at 37°C. 3. The plasmid DNA of about fifteen clones is extracted and analyzed by sequencing. 4. The positive clones are then amplified in a larger volume of LB + antibiotic (100ml) and their plasmid DNA is extracted and analyzed by sequencing.
Transformation des plants de Tabac avec les plasmides obtenusTransformation of tobacco plants with the obtained plasmids
Recouvrir les billes d’or avec l’ADN plasmidiqueCover gold beads with plasmid DNA
Matériel nécessaire : 1. Ethanol 100%. 2. Billes d’or stériles (Biorad). 3. CaCl2 2.5M. 4. 0.1 M de spermidine. 5. Milieu de croissance des plantes in vitro: MS avec vitamines supplémenté de sucrose à 3%. 6. Hormones 6-benzyl aminopurine (BAP), indole-3-acetic acid (IAA), indole3-butyric acid (IBA), à la concentration de 1 mg/mL. 7. Spectinomycine à 500 mg/L.Materials needed: 1. Ethanol 100%. 2. Sterile gold beads (Biorad). 3.CaCl2 2.5M. 4. 0.1 M spermidine. 5. In vitro plant growth medium: MS with vitamins supplemented with 3% sucrose. 6. Hormones 6-benzyl aminopurine (BAP), indole-3-acetic acid (IAA), indole-3-butyric acid (IBA), at a concentration of 1 mg/mL. 7. Spectinomycin 500 mg/L.
Les billes d’or sont préparées en suivant le protocole de Biorad fourni avec les billes.The gold beads are prepared following the Biorad protocol supplied with the beads.
L’ADN plasmidique est alors précipité sur les billes d’or (pour 5 échantillons) : 1. Vortexer 50 μL de billes d’or pendant 1 minute. 2. Ajouter 10 μL d’ADN plasmidique (à 1 μg/μL) et vortexer le mélange. 3. Ajouter 50µl de Cacl2 2,5 M et vortexer le mélange. 4. Ajouter 20 μL de spermidine à 0,1 M et vortexer le mélange. Les billes sont ensuite lavées avec de l’éthanol à 100% puis resuspendues dans 40µl d’éthanol 100%The plasmid DNA is then precipitated onto the gold beads (for 5 samples): 1. Vortex 50 μL of gold beads for 1 minute. 2. Add 10 μL of plasmid DNA (at 1 μg/μL) and vortex the mixture. 3. Add 50µl of 2.5 M Cacl2 and vortex the mixture. 4. Add 20 μL of 0.1 M spermidine and vortex the mixture. The beads are then washed with 100% ethanol and then resuspended in 40µl of 100% ethanol
Bombardement des feuilles de Nicotiana benthamiana avec les billes d’orBombardment of Nicotiana benthamiana leaves with gold balls
Préparation de la chambre à bombardement : 1. Laver la chambre et les grilles à l’éthanol 70%. 2. Placer les billes d’or recouvertes avec l’ADN plasmidique sur la grille prévue à cet effet. 3. Placer la feuille intacte sur papier filtre Whatman No. 1 placée lui-même sur milieu sans antibiotiques. Placer l’échantillon et fermer la chambre de bombardement. 4. Allumer la pompe pour atteindre la pression attendue et presser le bouton pour tirer. 5. Arrêter la pompe pour enlever la pression et ouvrir la chambre. 6. Incuber les échantillons bombardés sur boite pendant 2 jours dans le noir. Le troisième jour, couper les explants de 3-5mm de côté et les placer sur milieu de sélection (MS supplémenté de sucrose 3% et d’hormones: 1 mg/L BAP, et 0.1 mg/IAA, avec 500 mg/L de spectinomycine. 3. Les tiges transgéniques apparaissent après 3 à 5 semaines de transformation. Couper les feuilles des tiges transgéniques apparues en petits carrés de 2 mm de côté et les placer dans un nouveau milieu de sélection, pour atteindre l’homoplasmie. Régénérer des plantes selon les méthodes connues.Preparation of the bombardment chamber: 1. Wash the chamber and the grids with 70% ethanol. 2. Place the gold beads covered with the plasmid DNA on the grid provided for this purpose. 3. Place the intact leaf on Whatman No. 1 filter paper placed on medium without antibiotics. Place the sample and close the bombardment chamber. 4. Turn on the pump to reach the expected pressure and press the button to fire. 5. Stop the pump to relieve the pressure and open the chamber. 6. Incubate the plate-bombarded samples for 2 days in the dark. On the third day, cut the explants 3-5mm aside and place them on selection medium (MS supplemented with 3% sucrose and hormones: 1 mg/L BAP, and 0.1 mg/IAA, with 500 mg/L of spectinomycin 3. The transgenic stems appear after 3 to 5 weeks of transformation Cut the leaves of the transgenic stems that have appeared into small squares of 2 mm side and place them in a new selection medium, to achieve homoplasmy Regenerate plants according to known methods.
On peut vérifier que les cellules des plantes produisent de la lumière lorsqu’elles sont cultivées sur un milieu contenant de l’hispidine.Plant cells can be verified to produce light when grown on a medium containing hispidine.
Exemple 2. Préparation du plasmide contenant les gènes H3H, Luz, CPH, HispS, NpgA et les séquences permettant l’intégration de ces gènes dans le génome du chloroplaste ainsi que leur expressionExample 2. Preparation of the plasmid containing the genes H3H, Luz, CPH, HispS, NpgA and the sequences allowing the integration of these genes into the genome of the chloroplast as well as their expression
Les séquences des gènesLuz, H3H, CPH, HispS, NpgAont été adaptées avec des codons d’usage des chloroplastes puis synthétisées (SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 5 respectivement). Les promoteurs choisis sont SEQ ID NO: 9 à SEQ ID NO: 12 respectivement et les terminateurs SEQ ID NO: 14 (Luz et HispS), SEQ ID NO:15 (H3H), SEQ ID NO: 16 (CPH) et SEQ ID NO: 18 (NpgA). Luz, H3H, CPH, HispS, NpgA gene sequences were matched with chloroplast usage codons and then synthesized (SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 5 respectively). The promoters chosen are SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO: 12 respectively and the terminators SEQ ID NO: 14 (Luz and HispS), SEQ ID NO: 15 (H3H), SEQ ID NO: 16 (CPH) and SEQ ID NO: 18 (NpgA).
Les séquences trnI et trnA (SEQ ID NO: 6 et SEQ ID NO: 7) ont été choisies pour permettre l’intégration des gènes H3H et Luz dans le génome du chloroplaste. Elles ont été amplifiées par PCR (Polymerase Chain Reaction) à partir d’ADN chloroplastique deNicotiana benthamiana. Le gène de résistance à la spectinomycine / streptomycine nommé aadA a été amplifié par PCR à partir d’un plasmide le contenant (SEQ ID NO: 19).The trnI and trnA sequences (SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7) were chosen to allow the integration of the H3H and Luz genes into the chloroplast genome. They were amplified by PCR (Polymerase Chain Reaction) from chloroplast DNA of Nicotiana benthamiana . The spectinomycin/streptomycin resistance gene named aadA was amplified by PCR from a plasmid containing it (SEQ ID NO: 19).
Une cassette d’expression a été préparée ainsi que décrit plus haut et intégrée dans un plasmide.An expression cassette was prepared as described above and integrated into a plasmid.
La transformation de chloroplastes a été réalisée par biolistique sur des feuilles de tabac, ainsi que décrit plus haut.The transformation of chloroplasts was carried out by biolistics on tobacco leaves, as described above.
Les échantillons ont été récupérés, cultivés (plusieurs fois pour atteindre l’homoplasmie) sur milieu contenant de la spectinomycine.The samples were recovered, cultured (several times to reach homoplasmy) on medium containing spectinomycin.
On peut ainsi vérifier que les cellules produisent de la lumière sans ajout de composé externe.It is thus possible to verify that the cells produce light without adding an external compound.
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Also Published As
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