CA2422649A1

CA2422649A1 - Hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase fused with a signal peptide, dna sequence and use for obtaining plants containing herbicide-tolerant plants

Info

Publication number: CA2422649A1
Application number: CA002422649A
Authority: CA
Inventors: Jean-Marc Ferullo; Eric Paget
Original assignee: Individual
Current assignee: Bayer CropScience SA
Priority date: 2000-09-08
Filing date: 2000-09-08
Publication date: 2002-03-14
Also published as: AU2000274256A1; EP1315801A1; WO2002020741A1

Abstract

The invention concerns a nucleic acid sequence coding for a hydroxy-phenyl pyruvate-dioxygenase (HPPD) fused with a signal peptide, a chimeric gene containing said sequence as encoding sequence and its use for obtaining plants resistant to certain herbicides. The inventive fusion protein consists of a HPPD fused at its C-terminal or N-terminal end with a signal protein sequence enabling the HPPD to be directed into the cell compartments other than the cytoplasm or the plastids.

Description

Hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase fusionnée à un peptide signal, séquence d'ADN et obtention de plantes contenant un tel gène, tolérantes aux herbicides.
La présente invention concerne une séquence d'acide nucléique codant pour une hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase (HPPD) fusionnée à un peptide signal, un gène chimère contenant cette séquence comme séquence codante et son utilisation pour l'obtention de plantes résistantes à certains herbicides.
Les hydroxy-phényl pyruvate dioxygénases sont des enzymes qui catalysent la réaction de transformation du para-hydroxy-phényl-pyruvate (HPP) en homogentisate.
Cette réaction a lieu en présence de fer (Fez+) en présence d'oxygène (Crouch N.P. & al., Tetrahedron, 53, 20, 6993-7010, 1997).
On connait par ailleurs certaines molécules inhibitrices de cette enzyme, qui viennent se fixer à l'enzyme pour inhiber la transformation de l'HPP en homogentisate.
Certaines de ces molécules ont Trouvé un emploi comme herbicides, dans la mesure où
l'inhibition de la réaction dans les plantes conduit à un blanchiment des feuilles des plantes traitées, et à la mort des dites plantes (Pallett I~. E. et al. 1997 Pestic.
Sci. 50 83-84). De tels herbicides ayant pour cible l'HPPD décrits dans l'état de la technique sont notamment les isoxazoles (EP 418 175, EP 470 856, EP 487 352, EP 527 036, EP 560 482, EP

659, US 5 424 276) en particulier l'isoxaflutole, herbicide sélectif du maïs, les dicétonitriles (EP 496 630, EP 496 631), en particulier la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4-CF3 phényl) propane-1,3-dione et la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4- Hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase fused to a signal peptide, sequence DNA and obtaining plants containing such a gene, tolerant to herbicides.
The present invention relates to a nucleic acid sequence encoding a hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase (HPPD) fused to a signal peptide, a uncomfortable chimera containing this sequence as coding sequence and its use for obtaining plants resistant to certain herbicides.
Hydroxyphenyl pyruvate dioxygenases are enzymes that catalyze the transformation reaction of para-hydroxy-phenyl-pyruvate (HPP) into Homogentisate.
This reaction takes place in the presence of iron (Fez +) in the presence of oxygen (Crouch NP & al., Tetrahedron, 53, 20, 6993-7010, 1997).
We also know some inhibitory molecules of this enzyme, which bind to the enzyme to inhibit the transformation of PPH into Homogentisate.
Some of these molecules have found use as herbicides, in the extent where inhibition of the reaction in plants leads to bleaching of plant leaves treated, and upon the death of said plants (Pallett I ~. E. et al. 1997 Pestic.
Sci. 50 83-84). Of such herbicides targeting HPPD described in the prior art are notably isoxazoles (EP 418 175, EP 470 856, EP 487 352, EP 527 036, EP 560 482, EP

659, US 5,424,276) in particular isoxaflutole, a selective corn herbicide, the diketonitriles (EP 496,630, EP 496,631), in particular 2-cyano-3-cyclopropyl-1- (2-S02 CH3-4-CF3 phenyl) propane-1,3-dione and 2-cyano-3-cyclopropyl-1- (2-S02 CH3-4-

2,3 C12 phényl) propane-l, 3-dione, les tricétones (EP 625 505, EP 625 508, US
5,506,195), en particulier la sulcotrione ou la mésôtrione, ou encore les pyrazolinates.
Des essais pour confirmer que l'HPPD est bien la cible des dicétonitriles (DI~N) et pour mettre en évidence que l'HPPD est, au moins à certaines doses, la cible unique des dicétonitriles ont été effectués en laboratoire en faisant germer des graines d'Arabidopsis sur trois types de milieux en conditions stériles in-vitro 1 milieu Murashig et Skoog( Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised medium for a rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15, 473-479), expérience contr~le de la germination 2 milieu MS plus DKN à la dose de lppm 2.3 C12 phenyl) propane-1,3-dione, triketones (EP 625 505, EP 625 508, US
5,506,195), in particularly sulcotrione or mesôtrione, or pyrazolinates.
Tests to confirm that HPPD is the target of diketonitriles (DI ~ N) and to demonstrate that HPPD is the target, at least at certain doses unique of diketonitriles were made in the laboratory by germinating seeds Arabidopsis on three types of media under sterile in-vitro conditions 1 medium Murashig and Skoog (Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised medium for a rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15 473-479) germination control experience 2 medium MS plus DKN at the dose of lppm

3 milieu MS plus DKN à la même dose + Homogentisate à la concentration de 5 mM.
Il est très net que sur le milieu 1 la germination se fait normalement, chaque plantule développant deux cotylédons bien verts. Le développement se fait ensuite normalement. Sur le milieu 2, la germination a lieu mais la plantule qui émerge est blanche, les deux cotylédons ne présentant aucune pigmentation. Les plantules meurent ensuite en quelques jours. Sur le milieu 3, la germination se fait normalement, les cotylédons sont bien verts. Les plantules se développent mais très rapidement, la quantité
d'homogentisate dans le milieu diminuant, les premiers symptômes de blanchiment apparaissent et la croissance des plantes s'arrêtent, elles finissent par mourir comme dans l'essai effectué sur le milieu n°2.
Ceci permet de confirmer que l'HPPD est bien la cible des DKN in planta et qu'elle semble être la cible unique. Ceci montre aussi que l'homogentisate est transporté du milieu de culture jusqu'au site cellulaire où il est nécessaire pour le bon fonctionnement de la cellule et la survie de la plante.
Pour rendre les plantes tolérantes aux herbicides, on dispose de trois stratégies principales, (1) la détoxification de l'herbicide par une enzyme venant transformer l'herbicide, ou son métabolite actif, en produits de dégradation non toxique, comme par exemple les enzymes de tolérance au bromoxynil ou au basta (EP 242 236, EP 337 899) ;
(2) la mutation de l'enzyme cible en une enzyme fonctiomlelle moins sensible à
l'herbicide, ou son métabolite actif, comme par exemple les enzymes de tolérance au glyphosate (EP 293 356, Padgette S. R. & al., J. Biol. Chem., 266, 33, 1991) ;
ou (3) la surexpression de l'enzyme sensible, de manière à produire dans la plante des quantités suffisantes d'enzyme cible au regard des constantes cinétiques de cette enzyme vis à vis de l'herbicide de manière à avoir suffisamment d'enzyme fonctionnelle, malgré la présence de son inhibiteur.
C'est cette troisième stratégie qui a été décrite pour obtenir avec succès des plantes tolérantes aux inhibiteurs d'HPPD (W0 96/38567), étant entendu que pour la première fois une stratégie de simple surexpression de l'enzyme cible sensible (non mutée) était employée avec succès pour conférer aux plantes une tolérance à un niveau agronomique à
un herbicide.
Alors que les HPPD de plantes sont des enzymes à localisation cytoplasmiques (Garcia, L, et al. 1997. Biochem. J. 325 : 761-769..), il a également été
montré que la meilleure tolérance était obtenue lorsque l'HPPD exogène était accumulée dans les plastes, plus particulièrement les chloroplastes.
Ces résultats montrent d'une part que l'homogentisate peut être transporté du milieu extérieur vers le site intra cellulaire où il est nécessaire pour complémenter,une inhibition de l'HPPD endogène, et d'autre part que l'accumulation d'une HPPD exogène dans la cellule au niveau des plastes ou du cytoplasme permet le même type de complémentation permettant l'obtention de plantes génétiquement modifiées tolérantes aux herbicides inhibiteurs d'HPPD.
On a maintenant constaté que l'adressage d'une HPPD exogène dans d'autres compartiments cellulaires que le cytoplasme ou les plastes, permettait d' améliorer la tolérance aux herbicides inhibiteurs d'HPPD par rapport à un simple adressage cytoplasmique.
La présente invention concerne donc une protéine de fusion constituée par une HPPD fusionnée à son extrémité C-terminale ou N-terminale à une séquence protéique signal permettant l'adressage de l'HPPD dans les compartiments cellulaires autres que le cytoplasme ou les plastes (en particulier chloroplastes).
Par HPPD, on entend selon l' invention toute enzyme HPPD native, mutée ou chimère, présentant l'activité HPPD. De nombreuses HPPD sont décrites dans la littérature, notamment les HPPD de bactéries comme Pseudomonas (Rüetschi & al., Eur. J.
Biochem., 205, 459-466, 1992, WO 96/38567), de plantes comme d'Arabidopsis (WO 96/38567, Genebank AF047834) ou de carotte (W0 96/38567, Genebanlc 87257), de Coccieoides (Genebauc COITRP), ou de mammifères comme la souris ou le cochon.
Par HPPD mutée, on entend selon l'invention les HPPD mutées pour obtenir des propriétés de tolérance aux herbicides inhibiteurs d'HPPD améliorées par rapport à l'HPPD
native correspondante. De manière avantageuse, l'HPPD mutée est une HPPD mutée dans sa partie C-terminale telle que décrite dans la demande de brevet WO 99/24585.
Par HPPD chimère, on entend une HPPD comprenant des éléments provenants de différentes HPPD, notamment les HPPD chimères-décrites dans la demande de brevet WO
99/24586.
De manière avantageuse, l'HPPD est une HPPD de Pseudomohas fluo~escens (W0 96/38567). 3 MS medium plus DKN at the same dose + Homogentisate at the concentration of 5 mM.
It is very clear that on medium 1 germination takes place normally, each seedling developing two very green cotyledons. Development is done then normally. On medium 2, germination takes place but the seedling which emerges is white, the two cotyledons showing no pigmentation. Seedlings die then in a few days. On medium 3, germination takes place normally cotyledons are very green. The seedlings grow but very quickly, the amount of homogentisate in the diminishing medium, the first symptoms of whitening appear and the plants stop growing, they end up die as in the test carried out on medium No. 2.
This confirms that HPPD is indeed the target of DKN in planta and what seems to be the sole target. This also shows that the homogentisate is transported from the middle culture to the cell site where it is necessary for proper operation of the cell and plant survival.
To make plants tolerant to herbicides, there are three strategies main, (1) detoxification of the herbicide by an enzyme from transform the herbicide, or its active metabolite, into non-toxic degradation products, like example tolerance enzymes to bromoxynil or basta (EP 242 236, EP 337 899);
(2) the mutation of the target enzyme into a functional enzyme less sensitive to the herbicide, or its active metabolite, such as, for example, the enzymes of tolerance to glyphosate (EP 293 356, Padgette SR & al., J. Biol. Chem., 266, 33, 1991);
or (3) the overexpression of the sensitive enzyme, so as to produce in the plant quantities sufficient target enzyme with regard to the kinetic constants of this enzyme with respect to the herbicide so as to have enough functional enzyme, despite the presence of its inhibitor.
It is this third strategy which has been described to successfully obtain plants tolerant to HPPD inhibitors (W0 96/38567), it being understood that for the first time a strategy of simple overexpression of the sensitive target enzyme (not mutated) was successfully used to give plants a level tolerance agronomic to a herbicide.
While plant HPPDs are cytoplasmic localizing enzymes (Garcia, L, et al. 1997. Biochem. J. 325: 761-769 ..), it has also been shown that the better tolerance was obtained when exogenous HPPD was accumulated in plastas, more particularly the chloroplasts.
These results show on the one hand that homogentisate can be transported from middle outside towards the intra cellular site where it is necessary for complement, inhibition endogenous HPPD, and secondly that the accumulation of exogenous HPPD in the cell at the level of the plastids or the cytoplasm allows the same type of complementation allowing genetically modified plants tolerant to herbicides HPPD inhibitors.
We have now found that addressing an exogenous HPPD in other cell compartments that the cytoplasm or plastids allowed improve the tolerance to HPPD inhibitor herbicides compared to simple addressing cytoplasmic.
The present invention therefore relates to a fusion protein constituted by a HPPD fused at its C-terminal or N-terminal end to a sequence protein signal allowing the addressing of the HPPD in the cellular compartments other than the cytoplasm or plastids (especially chloroplasts).
By HPPD is meant according to the invention any native HPPD enzyme, mutated or chimera, exhibiting HPPD activity. Many HPPDs are described in the literature, in particular the HPPDs of bacteria such as Pseudomonas (Rüetschi & al., Eur. J.
Biochem.
205, 459-466, 1992, WO 96/38567), plants such as Arabidopsis (WO 96/38567, Genebank AF047834) or carrot (W0 96/38567, Genebanlc 87257), from Coccieoides (Genebauc COITRP), or mammals such as mice or pigs.
By mutated HPPD is meant according to the invention mutated HPPDs in order to obtain tolerance properties to herbicides inhibitors of HPPD improved by compared to HPPD
native native. Advantageously, the mutated HPPD is a mutated HPPD
in its C-terminal part as described in patent application WO 99/24585.
By chimeric HPPD is meant a HPPD comprising elements originating from different HPPDs, in particular the chimeric HPPDs described in the application for WO patent 99/24586.
Advantageously, the HPPD is a HPPD of Pseudomohas fluo ~ escens (W0 96/38567).

4 De manière avantageuse, l'HPPD mutée comprend la mutation W336 telle que décrite dans la demande de brevet WO 99/24585.
Il est connu dans la littérature que l'ajout d'une séquence codante correspondant à
un peptide supplémentaire en N-ou C-terminal de la protéine va permettre le transport de celle ci vers un autre compartiment cellulaire que le cytoplasme où l'ARNm est traduit. Ce peptide dit peptide signal ou peptide de transit selon les cas, selon sa séquence va permettre le routage vers cet autre compartiment qui peut être par exemple le plaste (membrane ou stroma), le lumen du thylakoide ou la membrane du thylalcoide, vers le réticulum endoplasmique, vers la vacuole, la paroi cellulaire, les mitochondries, l'appareil de golgi, le noyau, la membrane nucléaire, sans que cela soit exhaustif Par séquence protéique signal, on entend selon l'invention tout peptide signal ou de transit permettant l'adressage de l'HPPD dans les compartiments cellulaires autres que le cytoplasme ou les plastes (en particulier chloroplastes).
Le rôle de telles séquences protéiques sont notamment décrites dans le numéro de le revue Plant molecular Biology (1998) consacré en grande partie aux transports des protéines dans les différents compartiments de la cellule végétale (Sorting of proteins to vacuoles in plant cells pp 127-144 ; the nuclear pore complex pp145-162 ;
protein translocation into and across the chloroplastic enveloppe membranes pp 91-207 ; multiple pathways for the targeting of thylakoid proteins in chloroplasts pp 209-221 ;
mitochondrial protein import in plants pp 311-338).
De manière avantageuse, la séquence protéique signal permet l'adressage de l'HPPD vers le compartiment vacuolaire (vacuole). De tels peptides sont largements décrits dans la littérature (Neuhaus J.M. and Rogers J.C Sorting of proteins to vacuoles in plant cellsPlant molecular Biology 38 : 127-144, 1998).
De préférence, le peptide vacuolaire de la protéine MsaCiB décrite dans J.M.
Ferullo et al (Plant Molecular Biology 33 : 625-633, 1997) (SEQ ID NO 1 ou 2) que l'on sait maintenant être localisée dans la vacuole, fusionné à la partie C-terminale de l'HPPD.
De manière préférentielle, la protéine de fusion est décrite par l'identificateur de séquence n° 3 ou 4 (SEQ ID NO 3 ou 4) avec sa séquence codante.
La présente invention concerne également une séquence d'acide nucléique codant pour la protéine de fusion selon l'invention.

La présente invention concerne également les séquences capables de s'hybrider de manière sélective avec la séquence d'acide nucléique ci-dessus, les séquences homologues à la séquence ci-dessus, les fragments des dites séquences et les séquences qui diffèrent des séquences ci-dessus mais qui du fait de la dégénérescence du code génétique, codent 4 Advantageously, the mutated HPPD comprises the mutation W336 such that described in patent application WO 99/24585.
It is known in the literature that the addition of a coding sequence corresponding to an additional N- or C-terminal peptide of the protein will allow the transport of this one towards another cellular compartment than the cytoplasm where the mRNA is translated. This peptide called signal peptide or transit peptide depending on the case, depending on its sequence will allow routing to this other compartment which can be for example the plastid (membrane or stroma), the thylakoid lumen or the thylalcoid membrane, towards the reticulum endoplasmic, towards the vacuole, the cell wall, the mitochondria, the golgi apparatus, the nucleus, the nuclear membrane, without being exhaustive By signal protein sequence is meant according to the invention any signal peptide or from transit allowing the addressing of HPPD in cell compartments other than the cytoplasm or plastids (especially chloroplasts).
The role of such protein sequences are described in particular in the number of the journal Plant molecular Biology (1998) devoted largely to transport of proteins in the different compartments of the plant cell (Sorting of proteins to vacuoles in plant cells pp 127-144; the nuclear pore complex pp145-162;
protein translocation into and across the chloroplastic envelope membranes pp 91-207 ; multiple pathways for the targeting of thylakoid proteins in chloroplasts pp 209-221;
mitochondrial protein import in plants pp 311-338).
Advantageously, the signal protein sequence allows the addressing of HPPD to the vacuolar compartment (vacuole). Such peptides are widely described in the literature (Neuhaus JM and Rogers JC Sorting of proteins to vacuoles in plant cellsPlant molecular Biology 38: 127-144, 1998).
Preferably, the vacuolar peptide of the protein MsaCiB described in JM
Ferullo et al (Plant Molecular Biology 33: 625-633, 1997) (SEQ ID NO 1 or 2) that one now knows to be located in the vacuole, merged with part C-terminal of the HPPD.
Preferably, the fusion protein is described by the identifier of sequence No. 3 or 4 (SEQ ID NO 3 or 4) with its coding sequence.
The present invention also relates to a nucleic acid sequence encoding for the fusion protein according to the invention.

The present invention also relates to the sequences capable of hybridizing of selectively with the above nucleic acid sequence, the sequences counterparts to the above sequence, the fragments of said sequences and the sequences that differ sequences above but which due to the degeneracy of the code genetic code

5 pour la même protéine de fusion.
Selon la présente invention, on entend par « séquence d'acide nucléique » une séquence nucléotidique ou polynucléotide, pouvant être de type ADN ou ARN, de préférence de type ADN, notamment double brin.
Par « séquence capable de s'hybridiser de manière sélective », on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec les séquences ci-dessus à un niveau suppérieur au bruit de fond de manière significative. Le bruit de fond peut être lié à
l'hybridiqtion d'autres séquences d'ADN présentes, notamment d'autres ADNc présentes dans une banque d'ADNc. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybiidiser de manière sélective et les séquences définies par les séquence ID
ci-dessus selon l'invention est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Le niveau d'interaction peut être mesuré par exemple , par marquage de la sonde avec des éléments radioactifs, comme le 32P. L'hybridation sélective est généralement obtenue en employant des conditions de milieu très sévères (par exemple NaCI 0,03 M et citrate de sodium 0,03 M à environ 50°C-60°C). L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon les méthodes usuelles de l'état de la technique (notamment Sambroolc & al., 1989, Molecular Cloning : A Labratory Manual).
Par « homologue », on entend selon l'invention un fragment d'acide nucléique présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence nucléotidique codant pour la protéine de fusion selon l'invention. Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation, ou encore en choisissant les oligonucléotides synthétiques employés dans la préparation de ladite séquence par hybridation. Au regard des multiples combinaisons d'acides nucléiques pouvant conduire à
l'expression d'un même acide aminé, les différences entre la séquence de référence selon l'invention et l'homologue correspondant peuvent être importantes. De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de référence, de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Ces 5 for the same fusion protein.
According to the present invention, the term “nucleic acid sequence” means a nucleotide or polynucleotide sequence, which may be of DNA or RNA type, of DNA type, especially double stranded.
By "sequence capable of hybridizing selectively" is meant according to the invention the sequences which hybridize with the above sequences to a level significantly higher than background noise. Background noise can be linked to the hybridization of other DNA sequences present, in particular other cDNAs present in a cDNA library. The signal level generated by the interaction between the sequence able to selectively hybridize and the sequences defined by the ID sequence above according to the invention is generally 10 times, preferably 100 times more intense than that of the interaction of other DNA sequences generating noise background. Level interaction can be measured for example, by labeling the probe with items radioactive, like 32P. Selective hybridization is generally achieved by employing very severe environmental conditions (for example 0.03 M NaCI and citrate sodium 0.03 M at about 50 ° C-60 ° C). Hybridization can of course be performed according to usual methods of the prior art (in particular Sambroolc & al., 1989, Molecular Cloning: A Labratory Manual).
By "homologous" is meant according to the invention a nucleic acid fragment showing one or more sequence changes from the sequence nucleotide encoding the fusion protein according to the invention. These modifications can be obtained using standard mutation techniques, or choosing the synthetic oligonucleotides used in the preparation of said sequence by hybridization. With regard to the multiple combinations of nucleic acids which can drive to the expression of the same amino acid, the differences between the sequence of reference according the invention and the corresponding counterpart may be important. So advantageous, the degree of homology will be at least 70% compared to the sequence of reference, preferably at least 80%, more preferably at least 90%. These

6 modifications sont généralement et de préférence neutres, c'est à dire qu'elles n'affectent pas la séquence primaire de la protéine de fusion. Cette définition s'applique également à la séquence protéique de la protéine de fusion, les mutations étant dans ce cas au niveau des acides aminés et les degrés d'homologie étant définis par rapport à la séquence primaire de la protéine de fusion.
Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple les programmes PILEUP ou BLAST (notamment Altschul & al., 1993, J.
Mol.
Evol. 36 :290-300 ; Altschul & al., 1990, J. Mol. Biol. 215 :403-10).
Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre polypeptides ou protéines sont également connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple le « package » UWGCG et le programme BESTFITT pour calculer les homologies (Deverexu & al., 1984, Nucleic Acid Res. 12, 387-395).
Par « fragments », on entend selon l'invention des fragments des séquences d'ADN
selon l'invention, c'est à dire les séquences ci-dessus pour lesquelles des parties ont été
délétées mais qui conservent la fonction des dites séquences, c'est à dire la fonbction d' adressage pour le petide signal et l' activité HPPD pour la protéine HPPD.
L'invention a encore pour objet l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique codant pour la protéine de fusion selon l'invention dans un procédé pour la transformation des plantes, comme gène marqueur ou comme séquence codante permettant de conférer à
la plante une tolérance aux herbicides inhibiteurs d'HPPD. Cette séquence peut bien entendu également être utilisée en association avec d'autre(s) gènes) marqueurs) etlou séquences) codantes) pour une ou plusieurs propriétés agronomiques.
La présente invention concerne également un gène chimère (ou cassette d'expression) comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte, en particulier les cellules végétales ou les plantes, la séquence codante comprenant au moins une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion telle que définie précédemment.
Par organisme hôte, on entend tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, dans lequel le gène chimère selon l'invention peut être introduit, pour la production d'HPPD mutée. Il s'agit en particulier de bactéries, par exemple E.
coli, de levures, en particulier des genres Saccharomyces ou Kluyve~omyces, Pichia, de 6 modifications are generally and preferably neutral, i.e.
they don't affect not the primary sequence of the fusion protein. This definition applies also at the protein sequence of the fusion protein, the mutations being in this case at the level of amino acids and the degrees of homology being defined with respect to the primary sequence of fusion protein.
Methods for measuring and identifying homologies between sequences nucleic acids are well known to those skilled in the art. We can use through example the PILEUP or BLAST programs (in particular Altschul & al., 1993, J.
Mol.
Evol. 36: 290-300; Altschul & al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10).
Methods for measuring and identifying homologies between polypeptides or proteins are also known to those skilled in the art. You can use by example the UWGCG “package” and the BESTFITT program for calculating homologies (Deverexu & al., 1984, Nucleic Acid Res. 12, 387-395).
By "fragments" is meant according to the invention fragments of the sequences DNA
according to the invention, that is to say the above sequences for which parties have been deleted but which retain the function of said sequences, that is to say the fonbction for the small signal and the HPPD activity for the HPPD protein.
Another subject of the invention is the use of a nucleic acid sequence coding for the fusion protein according to the invention in a process for the transformation plants, as a marker gene or as a coding sequence making it possible to confer on the plant tolerance to herbicides inhibitors of HPPD. This sequence can well also understood to be used in combination with other genes) markers) etlou sequences) coding) for one or more agronomic properties.
The present invention also relates to a chimeric gene (or cassette expression) comprising a coding sequence as well as elements of regulation in heterologous 5 'and 3' position that can function in a host organism, in especially the plant cells or plants, the coding sequence comprising at least one sequence of nucleic acid encoding a fusion protein as defined previously.
By host organism is meant any mono or multicellular organism, lower or higher, in which the chimeric gene according to the invention can be introduced, for the production of mutated HPPD. These are in particular bacteria, for example E.
coli, from yeasts, in particular of the genera Saccharomyces or Kluyve ~ omyces, Pichia,

7 champignons, en particulier Aspergillus, d'un baculovirus, ou de préférence des cellules végétales et des plantes.
Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences.
On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié
capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé, le colza, le soja, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton, etc.
Les éléments de régulation nécessaires à l'expression de la séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion selon l'invention sont bien connus de (homme du métier en fonction de l' organisme hôte. Ils comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de transcription, des séquences terminatrices, y compris des codons start et stop. Les moyens et méthodes pour identifier et sélectionner les éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier et largement dëcrits dans la littérature.
L'invention concerne plus particulièrement la transformation des plantes.
Promoteurs Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur s'exprimant notamment dans les feuilles des plantes, comme par exemple des promoteurs dits constitutifs d'origine bactérienne, virale ou végétale ou encore des promoteurs dits lumière dépendants comme celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose- biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO) de plante ou tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. Parmi les promoteurs d'origine végétale on citera les promoteurs d'histone tels que décrits dans la demande EP 0 507 698, ou le promoteur d'actine de riz (US 5,641,876). Parmi les promoteurs d'un gène de virus de plante, on citera celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S), ou le promoteur du circovirus (AU 689 311).
De manière préférentielle, le promoteur est choisi parmi les promoteurs lumière dépendants (W0 99/25842), le promoteur d'actine de riz, les promoteurs d'histone et les 7 fungi, especially Aspergillus, of a baculovirus, or preferably cells plants and plants.
By "plant cell" is meant according to the invention any cell originating from a plant and can constitute undifferentiated tissues such as calluses, tissues differentiated such as embryos, parts of plants, plants or seeds.
The term "plant" according to the invention means any multicellular organism differentiated capable of photosynthesis, in particular monocots or dicots, more particularly crop plants intended or not intended for food animal or human, like corn, wheat, rapeseed, soy, rice, sugarcane, beet, tobacco, cotton, etc.
The regulatory elements necessary for the expression of the acid sequence nucleic acid coding for a fusion protein according to the invention are indeed known to (skilled in the art depending on the host organism. They include in particular of the promoter sequences, transcription activators, sequences terminators, including including start and stop codons. Means and methods to identify and select the regulatory elements are well known to those skilled in the art and widely described in the literature.
The invention relates more particularly to the transformation of plants.
Promoters As a promoter regulatory sequence in plants, all promoter sequence of a gene expressing itself naturally in plants in particular one promoter expressed in particular in the leaves of plants, such as example of promoters known as constitutive of bacterial, viral or vegetable origin or more so-called light-dependent promoters such as that of a gene for the small unit of ribulose- biscarboxylase / oxygenase (RuBisCO) from plants or any promoter suitable known that can be used. Among the promoters of plant origin, mention will be made the histone promoters as described in application EP 0 507 698, or the sponsor rice actin (US 5,641,876). Among the promoters of a virus gene plant, we will quote that of the cauliflower mosaic (CAMV 19S or 35S), or the promoter of circovirus (AU 689 311).
Preferably, the promoter is chosen from promoters light dependent (WO 99/25842), the rice actin promoter, the promoters of histone and the

8 promoteurs consitués par la fusion d'un promoteur d'histone et du premier intron de l'actine de riz (W0 99/34005).
Eléments de transcription Selon (invention, on peut également utiliser, en association avec le promoteur COMTII selon l'invention, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"), comme par exemple l'activateur de translation du virus de la mosaïque du tabac (VMT) décrit dans la demande WO 87/07644, ou du virus etch du tabac (TEV) décrit par Carrington & Freed.
Terminateur Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, d'origine virale, comme par exemple le terminateur du CaMV 355, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.
La présente invention concerne également un vecteur de clonage et/ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte contenant au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus. Ce vecteur comprend outre le gène chimère ci-dessus, au moins une origine de réplication. Ce vecteur peut être constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus, transformés par l'introduction du gène chimère selon l'invention. De tels vecteurs de transformation en fonction de l'organisme hôte à
transformer sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
Pour la transformation des cellules végétales ou des plantes, il s'agira notamment d'un virus qui peut être employé pour la transformation des plantes développées et contenant en outre ses propres éléments de réplication et d'expression. De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'invention est un plasmide.
Selon au autre mode de réalisation de l'invention, le vecteur comprend outre le gène chimère selon l'invention au moins un deuxième gène chimère fonctionnelle dans le même orgânisme hôte, comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une HPPD
pour un adressage dans un compartiment cellulaire autre que le compartiment cellulaire dans lequel l'HPPD du premier gène chimère est adressée. 8 promoters formed by the fusion of a histone promoter and the first intron of rice actin (W0 99/34005).
Transcription elements According to (invention, it is also possible to use, in association with the promoter COMTII according to the invention, other regulatory sequences, which are located between the promoter and coding sequence, such as transcription activators ( "Enhancer"), like for example the translational activator of the tobacco mosaic virus (VMT) described in application WO 87/07644, or of the etch tobacco virus (TEV) described by Carrington & Freed.
terminator As terminating or polyadenylation regulatory sequence, use any corresponding sequence of bacterial origin, such as for example the terminator nos of Agrobacterium tumefaciens, of viral origin, such as for example terminator of CaMV 355, or of vegetable origin, such as for example a terminator of histone such as described in application EP 0 633 317.
The present invention also relates to a cloning vector and / or expression for the transformation of a host organism containing at least one chimeric gene such as defined above. This vector comprises, in addition to the above chimeric gene, minus one origin of replication. This vector can consist of a plasmid, a cosmid, a bacteriophage or virus, transformed by the introduction of the chimeric gene according to the invention. Such vectors of transformation depending on the organism host to transform are well known to those skilled in the art and widely described in the literature.
For the transformation of plant cells or plants, it will be including a virus which can be used for the transformation of developed plants and containing in in addition to its own elements of replication and expression. So preferential, the vector for transforming plant cells or plants according to the invention is a plasmid.
According to another embodiment of the invention, the vector further comprises the gene chimera according to the invention at least one second functional chimeric gene in the same host organism, comprising a nucleic acid sequence encoding an HPPD
for addressing in a cell compartment other than the compartment cell in which the HPPD of the first chimeric gene is addressed.

9 Par exemple, si le premier gène chimère selon l'invention permet un adressage de l'HPPD dans la vacuole, le deuxième gène chimère peut être un autre gène chimère selon l'invention permettant l'adressage de l'HPPD dans le lumen du thylakoide ou la membrane du thylakoide, dans le réticulum endoplasmique" la paroi cellulaire ou les mitochondries, ou un gène chimère tel que décrit dans l'état de la technique permetant l'adressage de l'HPPD soit dans le cytoplasme, soit dans les chloroplastes.
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, le deuxième gène chimère permet l'adressage de l'HPPD dans les chloroplastes. Il comprend outre les éléments de régulations définis ci-dessus, permettant l'expression de la séquence codante dans un organisme hôte, une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion peptide de transit/HPPD.
Le peptide de transit permet d'adresser l'HPPD chimère dans les plastes, plus particulièrement les chloroplastes, la protéine de fusion étant clivée entre le peptide de transit et l'HPPD chimère au passage de la membrane des plastes. Le peptide de transit peut être simple, comme un peptide de transit d'EPSPS (décrit dans le brevet US
5,188,642) ou un peptide de transit de celui de la petite sous-tu~ité de ribulose-biscarboxylase/oxygénase (ssu RuBisCO) d'une plante, éventuellement comprenant quelques acides aminés de la partie N-terminale de la ssu RuBisCO mature (EP
189 707) ou encore un peptide de transit multiple comprenant un premier peptide de transit de plante fusionné à une partie de la séquence N-terminale d'une protéine mature à
localisation plastidiale, fusionnée à un deuxième peptide de transit de plante tel que décrit dans le brevet EP 508 909, et plus particulièrement le peptide de transit optimisé
comprenant un peptide de transit de la ssu RuBisCO de tournesol fusionné à 22 acides aminés de l'extrémité N-terminale de la ssu RuBisCO de maïs fusionnée au peptide de transit de la ssu RuBisCO de maïs tel que décrit avec sa séquence codante dans le brevet EP
508 909.
De tels gènes chimères sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO
96/38567, WO 99/25842, WO 99/24585, WO 99/24586, WO 99/34005.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le vecteur comprend outre le gène chimère selon l'invention, et le cas échéant un deuxième gène chimère codant pour taie HPPD, un autre gène chimère codant pour un autre gène d'intérêt. Il peut s'agir d'un gène codant pour un marqueur de sélection comme d'un gène conférant à la plante transformée de nouvelles propriétés agronomiques, ou d'un gène d'amélioration de la qualité agronomique de la plante transformée.
Marqueurs de Sélection Parmi les gènes codant pour des marqueurs de sélection, on peut citer les gènes de résistance aux antibiotiques, les gènes de tolérance aux herbicides (bialaphos, glyphosate 5 ou isoxazoles), des gènes codant pour des enzymes rapporteurs facilement identifiables comme l'enzyme GUS, des gènes codant pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes marqueurs de sélection sont notamment décrits dans les demandes de brevet EP 242 236, EP
242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 ou WO 97/04103. 9 For example, if the first chimeric gene according to the invention allows addressing of HPPD in the vacuole, the second chimeric gene may be another gene chimera according to the invention for addressing HPPD in the lumen of the thylakoid or membrane thylakoid, in the endoplasmic reticulum "the cell wall or mitochondria, or a chimeric gene as described in the state of the art allowing the addressing of HPPD either in the cytoplasm or in the chloroplasts.
According to a preferred embodiment of the invention, the second gene chimera allows the addressing of HPPD in chloroplasts. It also includes elements of regulations defined above, allowing the expression of the coding sequence in one host organism, a nucleic acid sequence encoding a protein of peptide fusion transit / HPPD.
The transit peptide makes it possible to address the chimeric HPPD in the plasts, more particularly chloroplasts, the fusion protein being cleaved between the peptide of transit and chimeric HPPD at the passage of the plastid membrane. The peptide of transit can be simple, like an EPSPS transit peptide (described in the patent US
5,188,642) or a transit peptide from that of the small sub-tu ~ ity of ribulose biscarboxylase / oxygenase (ssu RuBisCO) of a plant, possibly comprising some amino acids from the N-terminal part of mature RuBisCO ssu (EP
189 707) or a multiple transit peptide comprising a first peptide of plant transit fused to part of the N-terminal sequence of a mature protein to location plastid, fused to a second plant transit peptide such as described in the Patent EP 508,909, and more particularly the optimized transit peptide including a transit peptide of RuBisCO ssu from sunflower fused to 22 amino acids of the N-terminal end of the RuBisCO corn ssu fused to the peptide of transit of ssu RuBisCO of corn as described with its coding sequence in the EP patent 508 909.
Such chimeric genes are described in particular in WO patent applications 96/38567, WO 99/25842, WO 99/24585, WO 99/24586, WO 99/34005.
According to another embodiment of the invention, the vector further comprises the chimeric gene according to the invention, and if necessary a second chimeric gene coding for pillowcase HPPD, another chimeric gene coding for another gene of interest. he can be a gene encoding a selection marker as a gene conferring on the plant transformed with new agronomic properties, or an improvement gene of the agronomic quality of the transformed plant.
Selection Markers Among the genes coding for selection markers, mention may be made of genes of antibiotic resistance, herbicide tolerance genes (bialaphos, glyphosate 5 or isoxazoles), genes encoding reporter enzymes easily identifiable such as the enzyme GUS, genes coding for pigments or enzymes regulating the production of pigments in transformed cells. Such marker genes of selection are described in particular in patent applications EP 242 236, EP
242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 or WO 97/04103.

10 Gènes d'intérêt Parmi les gènes conférant de nouvelles propriétés agronomiques aux plantes transformées, on peut citer les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, ceux conférant une résistance à certains insectes, ceux conférant une tolérance à
certaines maladies, etc. De tels gènes sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO
91/02071 et WO 95/06128.
Tolërance herbicide Parmi les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, on peut citer le gène Bai conférant une tolérance au bialaphos, le gène codant pour une EPSPS
appropriée conférant une résistance aux herbicides ayant l'EPSPS comme cible comme le glyphosate et ses sels (US 4,535,060, US 4,769,061, US 5,094,945, US 4,940,835, US
5,188,642, US
4,971,908, US 5,145,783, US 5,310,667, US 5,312,910, US 5,627,061, US
5,633,435, FR 2 736 926), le gène codant pour la glyphosate oxydoréductase (US 5,463,175).
Parmi les gènes codant pour une EPSPS appropriée conférant une résistance aux herbicides ayant l'EPSPS comme cible, on citera plus particulièrement le gëne codant pour une EPSPS végétale, en particulier de maïs, présentant deux mutations 102 et 106, décrit dans la demande de brevet FR 2 736 926, dénommé ci-dessous EPSPS double mutant, ou encore le gène codant pour une EPSPS isolée d'Ag~obacteriun2 décrit par les séquences ID
2 et ID 3 du brevet US 5,633,435, dénommé ci-dessous CP4.
Dans les cas des gènes codant pour EPSPS, et plus particulièrement pour les gènes ci-dessus, la séquence codant pour ces enzymes est avantageusement précédée par une séquence codant pour un peptide de transit, en particulier pour le peptide de transit tel que défini ci-dessus. 10 Genes of interest Among the genes conferring new agronomic properties on plants transformed, we can cite genes conferring tolerance to certain herbicides, those conferring resistance to certain insects, those conferring tolerance to some diseases, etc. Such genes are described in particular in the applications for WO patent 91/02071 and WO 95/06128.
Herbicide tolerance Among the genes conferring tolerance to certain herbicides, mention may be made the gene Bai conferring tolerance on bialaphos, the gene coding for EPSPS
appropriate conferring resistance to herbicides with EPSPS as a target such as glyphosate and its salts (US 4,535,060, US 4,769,061, US 5,094,945, US 4,940,835, US
5,188,642, US
4,971,908, US 5,145,783, US 5,310,667, US 5,312,910, US 5,627,061, US
5,633,435, FR 2 736 926), the gene coding for glyphosate oxidoreductase (US 5,463,175).
Among the genes coding for an appropriate EPSPS conferring resistance to herbicides with EPSPS as target, we will more particularly mention the gene coding for a plant EPSPS, in particular of corn, exhibiting two mutations 102 and 106, described in patent application FR 2 736 926, hereinafter referred to as double EPSPS
mutant, or still the gene coding for an EPSPS isolated from Ag ~ obacteriun2 described by ID sequences 2 and ID 3 of US Patent 5,633,435, hereinafter referred to as CP4.
In the case of the genes coding for EPSPS, and more particularly for the Genoa above, the sequence coding for these enzymes is advantageously preceded by one sequence coding for a transit peptide, in particular for the peptide of transit such as defined above.

11 Résistance aux Insectes Parmi les protéines d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux insectes, on citera plus particulièrement les protéines Bt largement décrites dans la littérature et bien connues de l'homme du métier. On citera aussi les protéines extraites de bactéries comme Photorabdus (W0 97117432 & WO 98/08932).
Résistance aux Maladies Parmi les protéines ou peptides d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux maladies on citera notamment les chitinases, les glucanases, l' oxalate oxydase, toutes ces protéines et leurs séquences codantes étant largement décrites dans la littérature, ou encore les peptides antibactériens etlou antifongiques, en particulier les peptides de moins de 100 acides aminés riches en cystéines comme les thionines ou défensines de plantes, et plus particulièrement les peptides lytiques de toutes origines comprenant un ou plusieurs ponts Bisulfures entre les cystéines et des régions comprenant des acides aminés basiques, notamment les peptides lytiques suivants :
l'androctonine (W0 97/30082 et WO 99/09189), la drosomicine (W0 99/02717) ou la thanatine (W0 99/24594).
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la protéine ou peptide d'intérêt est choisi parmi les peptides éliciteurs fongiques, en particulier les élicitines (Kamoun & al., 1993 ; Panabières & al., 1995).
Modification de la qualité
On peut également citer les gènes modifiant la constitution des plantes modifiées, en particulier la teneur et la qualité de certains acides gras essentiels (EP 666 918) ou encore la teneur et la qualité des protéines, en particuliers dans les feuilles et/ou les graines desdites plantes. On citera en particulier les gènes codant pour des protéines enrichies en acides aminés soufrés (Korit, A.A. & al., Eur. J. Biochem. (1991) 195, 329-334 ; WO
98/20133 ; WO 97/41239 ; WO 95/31554 ; WO 94/20828 ; WO 92/14822). Ces protéines enrichies en acides aminés soufrés auront également pour fonction de piéger et stocker la cystéine efi/ou la méthionine excédentaire; permettant d' éviter les problèmes éventuels de toxicité liés à une surproduction de ces acides aminés soufrés en les piégeant. On peut citer également des gènes codant pour des peptides riches en acides aminés soufrés et plus particulièrement en cystéines, les dits peptides ayant également une activité
antibactérienne et/ou antifongique. On citera plus particulièrement les défensines de plantes, de même que 11 Insect resistance Among the proteins of interest conferring new resistance properties to the insects, more particularly the Bt proteins widely described in the literature and well known to those skilled in the art. We will also mention the proteins extracted from bacteria such as Photorabdus (W0 97117432 & WO 98/08932).
Resistance to Diseases Among the proteins or peptides of interest conferring new properties of resistance to diseases include chitinases, glucanases, oxalate oxidase, all of these proteins and their coding sequences being largely described in the literature, or antibacterial and / or antifungal peptides, in especially the peptides of less than 100 amino acids rich in cysteines such as thionines or plant defensins, and more particularly the lytic peptides of all origins comprising one or more bisulphide bridges between cysteines and regions comprising basic amino acids, in particular the following lytic peptides:
androctonine (W0 97/30082 and WO 99/09189), drosomicin (W0 99/02717) or thanatine (W0 99/24594).
According to a particular embodiment of the invention, the protein or peptide of interest is chosen from fungal eliciting peptides, in particular elicitins (Kamoun & al., 1993; Panabières & al., 1995).
Change in quality We can also cite the genes modifying the constitution of plants modified, in in particular the content and quality of certain essential fatty acids (EP 666 918) or the content and quality of the proteins, in particular in the leaves and / or seeds of said plants. Mention will in particular be made of the genes coding for proteins enriched in sulfur amino acids (Korit, AA & al., Eur. J. Biochem. (1991) 195, 329-334 ; WO
98/20133; WO 97/41239; WO 95/31554; WO 94/20828; WO 92/14822). These protein enriched in sulfur amino acids will also have the function of trapping and store the cysteine efi / or excess methionine; avoiding problems possible from toxicity linked to an overproduction of these sulfur amino acids by trapping. We can cite also genes coding for peptides rich in sulfur amino acids and more particularly in cysteines, said peptides also having activity antibacterial and / or antifungal. Mention will be made more particularly of plant defensins, in the same way

12 les peptides lytiques de toute origine, et plus particulièrement les peptides lytiques suivants: l'androctonine, la drosomicine ou la thanatine.
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des organismes hôtes, en particulier des cellules végétales par intégration d'au moins une séquence d'acide nucléique ou un gène chimère tels que définis ci-dessus, transformation qui peut être obtenue par tout moyen connu approprié, amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les références citées dans la présente demande, plus particulièrement par le vecteur selon l'invention.
Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules, des protoplastes ou des tissus avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Ag~obacterium tumefaciens ou Ri d Ag~obacte~ium ~hizogenes. D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation,'~ou encore la précipitation directe au moyen de PEG.
L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de l'organisme hôte, en particulier de la cellule végétale ou de la plante.
La présente invention a encore pour objet les organismes hôtes, en particulier cellules végétales ou plantes, transformés et contenant un gène chimère comprenant une séquence codante pour une protéine de fusion définie ci-dessus. De préférence, le gène chimère est intégré de manière stable dans le génome de l'organisme hôte.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'organisme hôte, et plus particulièrement la cellule végétale, comprend outre le gène chimère selon l'invention au moins un deuxième gène chimère fonctionnel dans le même organisme hôte, comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une HPPD pour un adressage dans un compartiment cellulaire autre .que le compartiment cellulaire dans lequel l'HPPD du premier gène chimère est adressée tel que défini ci-dessus.
Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, l'organisme hôte, et plus particulièrement la cellule végétale, comprend outre le gène chimère selon l'invention, et le cas échéant un deuxième gène chimère codant pour une HPPD, un autre gène chimère codant pour un autre gène d'intérêt tel qu edéfini ci-dessus.
Les différents gènes chimères peuvent être intégrés dans le génome de l'organisme hôte par transformation au moyen d'un vecteur selon l'invention comprenant les différents 12 lytic peptides of any origin, and more particularly peptides lytic following: androctonine, drosomicine or thanatine.
The invention also relates to a process for the transformation of organisms hosts in particular plant cells by integration of at least one sequence acid nucleic acid or a chimeric gene as defined above, a transformation which may be obtained by any suitable known means, fully described in the literature specialized and including the references cited in this application, more particularly by the vector according to the invention.
A series of methods involves bombarding cells, protoplasts or of the tissues with particles to which the DNA sequences are attached. A
other series of methods consists in using as a means of transfer into the plant a chimeric gene inserted into a Ti plasmid of Ag ~ obacterium tumefaciens or Ri d Ag ~ obacte ~ ium ~ Hizogenes. Other methods can be used such as micro-injection or electroporation, '~ or direct precipitation using PEG.
The skilled person will choose the appropriate method depending on the nature of the organism host, in particular of the plant cell or plant.
The present invention also relates to host organisms, in particular plant cells or plants, transformed and containing a chimeric gene including a coding sequence for a fusion protein defined above. Preferably, the gene chimera is stably integrated into the genome of the host organism.
According to a particular embodiment of the invention, the host organism, and more particularly the plant cell, in addition to the chimeric gene according to the invention to at least one second functional chimeric gene in the same host organism, comprising a nucleic acid sequence encoding an HPPD for addressing in a cell compartment other than the cell compartment in which the HPPD of first chimeric gene is addressed as defined above.
According to another particular embodiment of the invention, the organism host, and more particularly the plant cell, comprises, in addition to the chimeric gene according to the invention, and if necessary a second chimeric gene coding for an HPPD, another gene chimera coding for another gene of interest as defined above.
The different chimeric genes can be integrated into the genome of the body host by transformation using a vector according to the invention comprising the different

13 gènes chimères tels que définis ci-dessus.
Les différents gènes chimères peuvent également être intégrés de manière stable dans le génome de l'organisme hôte par co-transformation au moyen de plusieurs vecteurs, chacun comprenant au moins un gène chimère devant être intégré dans le génome de l'organisme hôte.
La présente invention a encore pour objet les plantes transformées, dans le génome desquelles au moins un gène chimère selon l'invention est intégré de manière stable. Les plantes selon l'invention contiennent des cellules transformées telles que définies ci-dessus, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées ci-dessus. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépend de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les références ci-dessus. Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants: US 4,459,355, US 4,536,475, US
5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US
5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US
5,565,346, US
5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US
5,510,318, US
5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP
674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128.
La présente invention concerne également les plantes transformées issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées ci-dessus, ainsi que les graines de plantes transformées.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les plantes transformées comprennent outre le gène chimère selon l'invention au moins un deuxième gène chimère fonctionnel dans le même organisme hôte, comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une HPPD pour un adressage dans un compartiment cellulaire autre que le compartiment cellulaire dans lequel l'HPPD du premier gène chimère est adressée tel que défini ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les plantes transformées comprennent outre le gène chimère selon l'invention, et le cas échéant un deuxième gène chimère codant pour une HPPD, un autre gène chimère codant pour un autre gène d'intérêt tel que défini ci-dessus.
Les différents gènes chimères dans les plantes transformées selon l'invention 13 chimeric genes as defined above.
The different chimeric genes can also be integrated in a way stable in the genome of the host organism by co-transformation using several vectors each comprising at least one chimeric gene to be integrated into the genome of the host organism.
The present invention also relates to transformed plants, in the genome of which at least one chimeric gene according to the invention is integrated so stable. The plants according to the invention contain transformed cells such as defined above above, especially plants regenerated from cells transformed above. The regeneration is obtained by any suitable process which depends on the nature of species, as for example described in the references above. For the processes of transformation of plant cells and plant regeneration, we will cite in particular the following patents and patent applications: US 4,459,355, US 4,536,475, US
5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604,662, EP 672,752, US 4,945,050, US
5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US
5,565,346, US
5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US
5,510,318, US
5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP
674,725, WO 91/02071 and WO 95/06128.
The present invention also relates to the transformed plants derived from the cultivation and / or crossing of the above regenerated plants, as well as seeds transformed plants.
According to a particular embodiment of the invention, the plants transformed comprise, in addition to the chimeric gene according to the invention, at least one second gene chimera functional in the same host organism, comprising an acid sequence nucleic coding for a HPPD for addressing in a different cell compartment that the cell compartment in which the HPPD of the first chimeric gene is addressed as defined above.
According to another embodiment of the invention, the transformed plants comprise, in addition to the chimeric gene according to the invention, and where appropriate a second gene chimeric coding for HPPD, another gene chimeric coding for another gene interest as defined above.
The various chimeric genes in plants transformed according to the invention

14 peuvent provenir soit de la même plante transformée parente, et dans ce cas la plante est issue d'un seul procédé de transformation/régénération avec les différents gènes chimères contenus dans un même vecteur ou par co-transformation au moyen de plusieurs vecteurs.
Elle peut également être obtenue par le croisement de plantes parentes contenant chacune au moins un gène chimère , l'une des plantes parentes comprenant au moins un gène chimère selon l'invention.
Les plantes transformées pouvant être obtenues selon l'inventïon peuvent être du type monocotylédones telles que par exemple les céréales, la canne à sucre, le riz et le maïs ou dicotyledones comme par exemple le tabac, la soja, le colza, le coton, la betterave, le trèfle, etc.
L'invention a aussi pour objet un procédé de désherbage sélectif de plantes, notamment de cultures, à l'aide d'un inhibiteur de fHPPD notamment un herbicide définit auparavant, caractérisé en ce qu'on applique cet herbicide sur des plantes transformées selon l'invention, tant en présemis, en prélevée qu'en postlevée de la culture.
La présente invention concerne également un procédé de contrôle des mauvaises herbes dans une surface d'un champ comprenant des graines ou des plantes transformées avec le gène chimère selon l'invention, lequel procédé consiste à appliquer dans la dite surface du champ une dose toxique pour les dites mauvaises herbes d'un herbicide inhibiteur d'HPPD, sans toutefois affecter de manière substantielle les graines ou plantes transformée avec le dit gène chimère selon l'invention.
La présente invention concerne également un procédé de culture des plantes transformées selon l'invention avec un gène chimère selon l'invention lequel procédé
consiste à semer les graines des dites plantes transformées dans une surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface du dit champ une dose toxique pour les mauvaises herbes d'un herbicide ayant pour cible l'HPPD
défini ci-dessus en cas de présence de mauvaises herbes, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées.
Dans les deux procédés ci-dessus, l'application de l'herbicide ayant pour cible l'HPPD peut être faite selon l'invention, tant en présemis, en prélevée qu'en postlevée de la culture.

Par herbicide au sens de la présente invention on entend une matière active herbicide seule ou associée à un additif qui modifie son efficacité comme par exemple un agent augmentant l'activité (synergiste) ou limitant l'activité (en anglais safener). Les herbicides inhibiteurs d'HPPD sont en particulier définis auparavant. Bien entendu, pour 5 leur application pratique, les herbicides ci-dessus sont associée de manière en soi connue aux adjuvants de formulations utilisés habituellement en agrochimie Lorsque la plante transformée selon l'invention comprend un autre gène de tolérance à un autre herbicide (comme par exemple un gène codant pour une EPSPS mutée ou non conférant à la plante une tolérance au glyphosate), ou lorsque la plante transformée 10 est naturellement insensible à un autre herbicides, le procédé selon l'invention peut comprendre l'application simultanée ou décalée dans le temps d'un inhibiteur d'HPPD en association avec ledit herbicide, par exemple le glyphosate.
L'invention a encore pour objet l'utilisation du gène chimère codant pour une protéine de fusion selon l'invention comme gène marqueur au cours du cycle 14 can either come from the same parent transformed plant, and in this case the plant is from a single transformation / regeneration process with the different chimeric genes contained in the same vector or by co-transformation by means of several vectors.
It can also be obtained by crossing parent plants each containing at least one chimeric gene, one of the parent plants comprising at least one uncomfortable chimera according to the invention.
The transformed plants obtainable according to the invention can be of monocotyledonous type such as for example cereals, sugar cane, rice and corn or dicotyledons such as tobacco, soybeans, rapeseed, cotton, beet, the clover, etc.
The subject of the invention is also a process for selective weeding of plants, including cultures, using an fHPPD inhibitor including a herbicide defines previously, characterized in that this herbicide is applied to plants transformed according to the invention, both in pre-plant, pre-emergence and post-emergence of the culture.
The present invention also relates to a method for controlling bad grasses in a surface of a field including seeds or plants transformed with the chimeric gene according to the invention, which method consists in applying in the said field surface a toxic dose to the so-called weeds of a herbicide inhibitor of HPPD, without, however, substantially affecting the seeds or plants transformed with the said chimeric gene according to the invention.
The present invention also relates to a method for cultivating plants.
transformed according to the invention with a chimeric gene according to the invention which process consists in sowing the seeds of these transformed plants in a surface of a field suitable for growing said plants, to be applied to said surface of said field one weed toxic dose of a herbicide targeting HPPD
defined above above if weeds are present, without affecting substantial them say seeds or said transformed plants and then harvest the plants cultivated when they reach the desired maturity and eventually separate the seeds of harvested plants.
In the above two processes, the application of the herbicide having as its target HPPD can be made according to the invention, both in pre-planting, pre-emergence and post-emergence from Culture.

By herbicide within the meaning of the present invention means an active material herbicide alone or combined with an additive which modifies its effectiveness as for example one agent increasing activity (synergist) or limiting activity (in English safener). The HPPD inhibitor herbicides are in particular defined previously. Well heard, for 5 their practical application, the above herbicides are associated in a way per se known adjuvants of formulations usually used in agrochemistry When the plant transformed according to the invention comprises another gene for tolerance to another herbicide (such as a gene encoding a Mutated EPSPS
or not giving the plant tolerance to glyphosate), or when the transformed plant 10 is naturally insensitive to another herbicide, the process according to the invention can understand the simultaneous or delayed application of an inhibitor of HPPD in association with said herbicide, for example glyphosate.
Another subject of the invention is the use of the chimeric gene coding for a fusion protein according to the invention as a marker gene during the cycle

15 "transformation-régénération" d'une espèce végétale et sélection sur l'herbicide ci-dessus.
Lorsque le gène chimère selon l'invention est combiné dans un même vecteur â
un autre gène chimère codant pour une protéine d'intérêt conférant de nouvelles propriétés agronomiques autre qu'un gène de tolérance herbicide (résistance aux insectes, résistance aux maladies, modification de la qualité), l'application de l'herbicide inhibiteur d'HPPD
sur les plantes transformées et leurs descendances, permet de sélectionner dans les champs les plantes issues d'un croisement entre une plante parente comprenant les deux gènes chimères et une plante non transformée qui auront conservé les gènes chimères.
Les différents aspects de l'invention seront mieux compris à l'aide des exemples expérimentaux ci-dessous.
Toutes les méthodes ou opérations décrites ci-dessous dans ces exemples sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de fart pour parvenir au même résultat. La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans "Carrent Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F.M. et al , publiés par Greene Publishing Associates et Wiley -Interscience (1989) ou dans Molecular cloning, T.Maniatis, E.F.Fritsch, J.Sambrook,l982. 15 "transformation-regeneration" of a plant species and selection on the above herbicide.
When the chimeric gene according to the invention is combined in the same vector â
a another chimeric gene coding for a protein of interest conferring new properties agronomic other than a herbicide tolerance gene (insect resistance, resistance disease, change in quality), application of the herbicide HPPD inhibitor on transformed plants and their descendants, allows you to select in the fields plants from a cross between a parent plant including two genes chimeras and an unprocessed plant that will have retained the chimeric genes.
The various aspects of the invention will be better understood using the examples below.
All the methods or operations described below in these examples are given as examples and correspond to a choice made from among different methods available to achieve the same result. This choice has no affect the quality of the result and therefore any suitable method can be used by humans of wax to achieve the same result. Most engineering methods fragments of DNA are described in "Carrent Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 and Ausubel FM et al, published by Greene Publishing Associates and Wiley -Interscience (1989) or in Molecular cloning, T. Maniatis, EFFritsch, J. Sambrook, l982.

16 Exemple 1 : Constructions des différents gènes pour l'expression dans le tabac A) Clone O : un dérivé de pRP O décrit dans le brevet WO 96/38567 contenant une cassette d'expression de l'HPPD, promoteur double histone - TEV - gène HPPD -terminateur nos. Pour obtenir le clone O, pRP O a été digéré par Sac I et Pvu II, le gène chimère a été purifié puis ligué dans pPZP 212 préalablement digéré par Sac I
et Sma I
décrit dans P. Hajdukiewicz et al Plant Molecular Biology 25 :989-994, 1994.
B) Clone : un dérivé de pRP Q décrit dans le brevet WO 96/38567 contenant une cassette d'expression de l'HPPD, promoteur double histone - TEV - OTP - gène HPPD -terminateur nos. Pour obtenir le clone Q, pRP Q a été digéré par Sac I et Pvu II, le gène chimère a été purifié puis ligué dans pPZP 212 préalablement digéré par Sac I
et Sma I, pPZP 212.
C) Clone vacuole : le peptide vacuole utilisé dans le cadre de ce travail est celui décrit dans l'article suivant : J.M. Ferullo et al Plant Molecular Biology 33 : 625-633, 1997 Peptide de transit vacuole : Ce peptide a été réalisé à l'aide de deux PCR
successives.
La première est réalisée dans le but de synthétiser le peptide de transit vacuole. Les oligonucléotides choisis ont les séquence suivantes VAC 1: 5' AAGATCAAGG ACAAAATTCA TGGTGAAGGT GCAGATGGTG AAAAGAAAAA
GAAGAAGGAG AAGAAGAAAC ATG 3' VAC 2: 5' ATCACTGTCA CTGCTGCTGC TATCATGGCC ATGTTCATGA CCCTCTCCAT
GTTTCTTCTT CTCCTTCTTC 3°
Ces oligonucléotides s'hybrident l'un à l'autre dans la région figurée en gras et permettent ainsi de reconstituer le peptide transit vacuole qui comporte 123 paires de bases.
La réaction a été réalisée dans un appareil PCR HYBAID avec la Taq polymerase PERI~IN ELMER dans son tampon dans les conditions standards, c'est à dire pour 501 de réaction on mélange les dNTP à 200~,M, la Taq polymérase à 2,5 unités et 0,5,1 de chaque oligonucléotide à 10~M. Un seul cycle PCR a été réalisé, il se compose de 5 min à
95°C puis 1 min à 64°C puis 10 min à 72°C.
La seconde PCR a servi à ajouter les sites de restriction Xcm I et Sal I
nécessaire au clonage dans pRP O. Les oligonucléotides utilisés ont pour séquences 16 EXAMPLE 1 Constructions of the Different Genes for Expression in Tobacco A) Clone O: a derivative of pRP O described in patent WO 96/38567 containing an expression cassette for HPPD, a double histone promoter - TEV - gene HPPD -terminator nos. To obtain the clone O, pRP O was digested with Sac I and Pvu II, the gene chimera was purified and then ligated into pPZP 212 previously digested with Sac I
and Sma I
described in P. Hajdukiewicz et al Plant Molecular Biology 25: 989-994, 1994.
B) Clone: a derivative of pRP Q described in patent WO 96/38567 containing a HPPD expression cassette, double histone promoter - TEV - OTP - gene HPPD -terminator nos. To obtain the clone Q, pRP Q was digested with Sac I and Pvu II, the gene chimera was purified and then ligated into pPZP 212 previously digested with Sac I
and Sma I, pPZP 212.
C) Vacuole clone: the vacuole peptide used in this work is the one described in the following article: JM Ferullo et al Plant Molecular Biology 33 : 625-633, 1997 Transit peptide vacuole: This peptide was produced using two PCR
successive.
The first is carried out with the aim of synthesizing the transit peptide vacuole. The selected oligonucleotides have the following sequence VAC 1: 5 'AAGATCAAGG ACAAAATTCA TGGTGAAGGT GCAGATGGTG AAAAGAAAAA
GAAGAAGGAG AAGAAGAAAC ATG 3 ' VAC 2: 5 'ATCACTGTCA CTGCTGCTGC TATCATGGCC ATGTTCATGA CCCTCTCCAT
GTTTCTTCTT CTCCTTCTTC 3 °
These oligonucleotides hybridize to each other in the region shown in bold and thus make it possible to reconstitute the vacuole transit peptide which comprises 123 base pairs.
The reaction was carried out in a HYBAID PCR apparatus with Taq polymerase PERI ~ IN ELMER in its buffer under standard conditions, ie for 501 from reaction the dNTPs are mixed at 200 ~, M, the Taq polymerase at 2.5 units and 0.5.1 of each 10 ~ M oligonucleotide. A single PCR cycle was carried out, it consists of 5 min to 95 ° C then 1 min at 64 ° C then 10 min at 72 ° C.
The second PCR was used to add the restriction sites Xcm I and Sal I
necessary to cloning into pRP O. The oligonucleotides used have the following sequences

17 VAC 3:5' ACGTCCAGGT GCGTCGTGGT GTATTGACCG CCGATAAGAT CAAGGACAAA ATTC 3' VAC 4:5' ACGTGTCGAC TTAATCACTG TCACTGCTGC TG 3' Ces oligonucléotides permettent d'obtenir un fragment amplifié de 169 paires de bases. La réaction a été réalisée dans un appaxeil PCR HYBAID avec la Taq polymerase PERKIN ELMER dans son tampon dans les conditions standards, c'est à dire pour SOwI de réaction on mélange les dNTP à 200~M, la Taq polymérase à 2,S unités, O,S ~l de chaque oligonucléotides à 10~M et 1 ~,l de la première PCR . Le programme d'amplification utilisé
est, 4 min à 95°C puis 3S cycles <30 sec 95°C, 30 sec 66°C, 1 min 72°C> suivi de 10 min à 72°C.
n pRP O - vacuole : un dérivé de pRP O contenant une cassette d'expression de l'HPPD, promoteur double histone - TEV - gène HPPD - peptide de transit vacuole -terminateur nos. Pour le construire le plasmide pRP O a été digére par Xcm I
et Sal I puis Iigué sur le peptide transit vacuole préalablement purifié et digéré pax Xcm I
et Sal I.
n - clone vacuole : un dérive de pRP O - vacuole contenant une cassette 1S d'expression de l'HPPD, promoteur double histone - TEV - gène HPPD -peptide de transit vacuole - terminâteur nos. Pour obtenir le clone. vacuole , pRP O - vacuole a été digéré par Sac I et Pvu II, le gène chimère a été purifié puis ligué dans pPZP 212 préalablement digéré par Sac I et Sma I.
Exemple 2: Expression d'HPPD de Pseudomonas fluorescens dans le tabac A) Transformation du Tabac "Petit havana" four obtention de plantes ' sélection kanamycine.
Les gènes chiméres décrits précédemment ont été transférés dans du tabac "Petit havana" selon les procédures de transformation et de régénération déjà
décrites dans la 2S demande européenne EP n° 0 50~ 909.
1 ) Transformation:
Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène d'Agrobacterium tmnefaciens EHA lOS.
2) Régénération:
La régénération du tabac "Petit havana" à partir d'expiants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashig et Skoog (MS) comprenant 30g/1 de saccharose ainsi que 350mg/I de cëfotaxime et 200 mg/m1 de kanamycine. Les expiants foliaires sont prélevés 17 VAC 3: 5 'ACGTCCAGGT GCGTCGTGGT GTATTGACCG CCGATAAGAT CAAGGACAAA ATTC 3' VAC 4: 5 'ACGTGTCGAC TTAATCACTG TCACTGCTGC TG 3' These oligonucleotides make it possible to obtain an amplified fragment of 169 pairs of bases. The reaction was carried out in a HYBAID PCR device with Taq polymerase PERKIN ELMER in its buffer under standard conditions, i.e. for SOwI of reaction the dNTPs are mixed at 200 ~ M, the Taq polymerase at 2, S units, O, S ~ l of each oligonucleotides at 10 ~ M and 1 ~, l of the first PCR. The program amplification used east, 4 min at 95 ° C then 3S cycles <30 sec 95 ° C, 30 sec 66 ° C, 1 min 72 ° C> followed by 10 min at 72 ° C.
n pRP O - vacuole: a derivative of pRP O containing an expression cassette for HPPD, double histone promoter - TEV - HPPD gene - transit peptide vacuole -terminator nos. To construct it, the plasmid pRP O was digested with Xcm I
and Sal I then Iguided on the vacuole transit peptide previously purified and digested pax Xcm I
and Sal I.
n - vacuole clone: a derivative of pRP O - vacuole containing a cassette 1S of expression of HPPD, double histone promoter - TEV - HPPD gene -transit peptide vacuole - terminator nos. To get the clone. vacuole, pRP O - vacuole a been digested by Sac I and Pvu II, the chimeric gene was purified and then ligated into pPZP 212 beforehand digested by Sac I and Sma I.
EXAMPLE 2 Expression of HPPD of Pseudomonas fluorescens in Tobacco A) Processing of Tobacco "Petit havana" for obtaining plants' selection kanamycin.
The chimeric genes described above were transferred to tobacco "Small havana "according to the transformation and regeneration procedures already described in the 2S European application EP n ° 0 50 ~ 909.
1) Transformation:
The vector is introduced into the non-oncogenic strain of Agrobacterium tmnefaciens EHA lOS.
2) Regeneration:
The regeneration of "Petit Havana" tobacco from leaf explants is performed on a Murashig and Skoog (MS) base medium comprising 30 g / 1 of sucrose as well than 350 mg / I of cefotaxime and 200 mg / m1 of kanamycin. The leaf explants are collected

18 sur des plants en serre et transformés selon la technique des disques foliaires (Science 1985, Vol 227, p1229-1231) en trois étapes successives - la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30g/1 de saccharose contenant O.OSmg/1 d'acide naphtylacétique (ANA) et 2mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours et 200 mg/ml de lcanamycine.
- Les pousses vertes formées au cours de cette étape sont ensuite développées par culture sur un milieu MS additionné de 30g/1 de saccharose et 200 mg/ml de kanamycine, mais ne contenant pas d'hormone, pendant 10 jours.
- Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucres 200 mg/ml de kanamycine et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours, les pousses enracinées sont passées en terre.
La tolérance des plantes transformées est étudiée par semis sur un sol traité
à
l' isoxaflutole.
B) Transformation du Tabac "Petit havana" pour évaluation des construits en terme de tolérance au cours de la phase de transformation / ré~éneration : sélection kanam, cil dicétonitrile.
1) La transformation est effectuée comme précédemment.
2) La régénération du tabac "Petit havana" à partir d'expiants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30g/1 de saccharose ainsi que 350mg/1 de céfotaxime et 200 mg/1 de kanamycine et des doses variables de la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-méthylsulfonyl-4-trifluorométhylphényl) propan-1,3-dione, 2,5 ppm, 3,125 ppm, 3,75 ppm. Les expiants foliaires sont prélevés sur des plants en serre et transformés selon la technique des disques foliaires (Science 1985, Vol 227, p1229-1231) en deux étapes successives - la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS additionné de 30g/1 de saccharose contenant O.OSmg/1 d'acide naphtylacétique (ANA) et 2mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 19 jours et kanamycine + les doses variables d'herbicide.
- La deuxième correspond à un repiquage des disques foliaires (sur lesquels des cals et des pousses se sont formés) sur un milieu MS additionné de 30g/1 de saccharose 18 on plants in the greenhouse and transformed using the disc technique leaf (Science 1985, Vol 227, p1229-1231) in three successive stages - the first includes the induction of shoots on an MS medium supplemented with 30g / 1 sucrose containing O.OSmg / 1 naphthylacetic acid (ANA) and 2mg / 1 of benzylaminopurine (BAP) for 15 days and 200 mg / ml lcanamycin.
- The green shoots formed during this stage are then developed through culture on MS medium supplemented with 30g / l of sucrose and 200 mg / ml of kanamycin but containing no hormone, for 10 days.
- Then we take developed shoots and we cultivate them on a medium of rooting MS with half content of salts, vitamins and sugars 200 mg / ml of kanamycin and containing no hormone. After about 15 days, the shoots rooted are passed into the earth.
The tolerance of transformed plants is studied by sowing on treated soil at isoxaflutole.
B) Transformation of Tobacco "Petit Havana" for evaluation of buildings in term of tolerance during the transformation / regeneration phase: selection kanam, eyelash diketonitrile.
1) The transformation is carried out as above.
2) The regeneration of "Petit Havana" tobacco from leaf explants is conducted on a Murashige and Skoog (MS) base medium comprising 30 g / 1 of sucrose as well as 350mg / 1 of cefotaxime and 200 mg / 1 of kanamycin and variable doses of 2-cyano-3-cyclopropyl-1- (2-methylsulfonyl-4-trifluoromethylphenyl) propan-1,3-dione, 2.5 ppm 3.125 ppm, 3.75 ppm. The leaf explants are taken from plants in squeeze and transformed using the leaf disc technique (Science 1985, Vol 227, p1229-1231) in two successive stages - the first includes the induction of shoots on an MS medium supplemented with 30g / 1 sucrose containing O.OSmg / 1 naphthylacetic acid (ANA) and 2mg / 1 of benzylaminopurine (BAP) for 19 days and kanamycin + variable doses herbicide.
- The second corresponds to transplanting the leaf discs (on which calluses and shoots have formed) on MS medium supplemented with 30g / l of sucrose

19 contenant O.Olmgll d'acide naphtylacétique (ANA) et 2mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 3 jours et kanamycine + les doses variables d'herbicide ; la mesure de la tolérance est effectuée à ce moment là.
3) Mesure de la tolérance à (herbicide des plantules in- vitro .
Les expériences sont réalisées par action de l'isoxaflutole (ou plus précisement du dicétonitrile correspondant à l'isoxaflutole) sur les pousses.
Si au cours de la transformation, des pousses apparaissent ceci signifie qu'elles ont intégrées le gène de tolérance à la kanamycine ; si elles ont intégrées le gène de tolérance à
la kanamycine cela signifie aussi qu'elles ont intégré le gène permettant l'expression de l'HPPD dde Pseudomonas fluorescens et sa localisation finale dans le cytoplasme, ou le chloroplaste ou encore dans la vacuole. En effet ces deux gènes ou construits sont liés sur le T-DNA. Si les pousses sont blanches cela signifie qu'elles sont issues d'une cellule qui a intégré le gène de tolérance à la kanamycine (sinon la pousse n'apparaitrait pas) et le gène de tolérance HPPD mais que celui n'est pas suffisant pour induire une tolérance à
l'herbicide. Le pourcentage de plantules vertes par rapport au nombre de plantules (blanches et vertes) est donc une mesure de la tolérance induite par le gène.
Cette expérience a été réalisée en utilisant différentes concentrations d'inhibiteur d'HPPD, le RPA 202248 (qui est le dicétonitrile de l'isoxaflutole), 2,5 ppm, 3,125 ppm et 3,75 ppm. Le comptage a été effectué en comptant toutes les pousses blanches ou vertes puis toutes les pousses vertes, résultat dans le tableau ci-dessous.
Tableau récapitulatif de la toléraaice induite par les différentes localisation HPPD
Localisation de l'HPPD % de pousses vertes à
2,Sppm 3,125ppm cytoplasme 3,1 3,7 chloroplates 17, 2 8,6 vacuole 10,1 9 Ces résultats confirment que l'adressage de l'HPPD dans la vacuole permet d'obtenir un pourcentage de pousses vertes voisin de celui observé pour un adressage dans les chloroplastes (en particulier à 3,125 ppm), et en tous cas supérieur au pourcentage obtenu avec un adressage cytoplasmique, bien que l'HPPD native soit localisée dans le cytoplsame.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) LISTE DE SEQUENCES
<110> RHONE-POULENC AGRO
<120> Hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase fusionnée à un peptide signal, séquence d'ADN et obtention de plantes contenant un tel gène, tolérantes aux herbicides.
<140>
<141>
<160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 120 <212> ADN
<213> synthetic construct <220>
<221> CDS
<222> (1)..(120) <400> 1 aag atc aag gac aaa att cat ggt gaa ggt gca gat ggt gaa aag aaa 48 Lys Ile Lys Asp Lys Ile His Gly Glu Gly Ala Asp Gly Glu Lys Lys aag aag aag gag aag aag aaa cat gga gag ggt cat gaa cat ggc cat 96 Lys Lys Lys Glu Lys Lys Lys His Gly Glu Gly His Glu His Gly His 19 containing O. Olmgll naphthylacetic acid (ANA) and 2 mg / 1 of benzylaminopurine (BAP) for 3 days and kanamycin + variable doses of herbicide; the measure of tolerance is done at this time.
3) Measurement of tolerance to (herbicide of seedlings in vitro.
The experiments are carried out by the action of isoxaflutole (or more precisely from diketonitrile corresponding to isoxaflutole) on the shoots.
If sprouts appear during processing this means What are integrated the kanamycin tolerance gene; if they have integrated the tolerance gene kanamycin it also means that they have integrated the gene allowing the expression of the HPPD of Pseudomonas fluorescens and its final localization in the cytoplasm, or the chloroplast or in the vacuole. Indeed these two genes or constructed are linked on T-DNA. If the shoots are white it means that they came from of a cell that has integrated the kanamycin tolerance gene (otherwise the growth would not appear not) and the gene of tolerance HPPD but that that is not sufficient to induce a tolerance to the herbicide. The percentage of green seedlings in relation to the number of seedlings (white and green) is therefore a measure of the tolerance induced by the gene.
This experiment was carried out using different concentrations inhibitor HPPD, RPA 202248 (which is the diketonitrile of isoxaflutole), 2.5 ppm, 3.125 ppm and 3.75 ppm. Counting was done by counting all white shoots or green then all the green shoots, result in the table below.
Summary table of tolerance induced by the different HPPD localization Location of HPPD% of green shoots to 2, Sppm 3.125ppm cytoplasm 3.1 3.7 chloroplates 17, 2 8.6 vacuole 10.1 9 These results confirm that the addressing of HPPD in the vacuole allows to obtain a percentage of green shoots close to that observed for a addressing in chloroplasts (in particular at 3.125 ppm), and in any case higher than percentage obtained with cytoplasmic addressing, although native HPPD is localized in the cytoplsame.
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) LIST OF SEQUENCES
<110> RHONE-POULENC AGRO
<120> Hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase fused to a signal peptide, DNA sequence and plant breeding containing such a gene, herbicide tolerant.
<140>
<141>
<160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 120 <212> DNA
<213> synthetic construct <220>
<221> CDS
<222> (1) .. (120) <400> 1 aag atc aag gac aaa att cat ggt gaa ggt gca gat ggt gaa aag aaa 48 Lys Ile Lys Asp Lys Ile His Gly Glu Gly Ala Asp Gly Glu Lys Lys aag aag aag gag aag aag aaa cat gga gag ggt cat gaa cat ggc cat 96 Lys Lys Lys Glu Lys Lys Lys His Gly Glu Gly His Glu His Gly His

20 25 30 gat agc agc agc agt gac agt gat 120 Asp Ser Ser Ser Ser Asp Ser Asp <210> 2 <211> 40 <212>
<213> synthetic construct <400> 2 Lys Ile Lys Asp Lys Ile His Gly Glu Gly Ala Asp Gly Glu Lys Lys Lys Lys Lys Glu Lys Lys Lys His Gly Glu Gly His Glu His Gly His Asp Ser Ser Ser Ser Asp Ser Asp <210> 3 <211> 1194 <212> ADN
<213> synthetic construct <220>
<221> CDS
<222> (1)..(1194) FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) <400> 3 atg gca gat cta tac gaa aac cca atg ggc ctg atg ggc ttt gaa ttc 48 Met Ala Asp Leu Tyr G1u Asn Pro Met Gly Leu Met Gly Phe Glu Phe 1 5 ~ 10 15 atc gaa ttc gcg tcg ccg acg ccg ggt acc ctg gag ccg atc ttc gag 96 Ile Glu Phe Ala Ser Pro Thr Pro Gly Thr Leu Glu Pro Ile Phe Glu atc atg ggc ttc acc aaa gtc gcg acc cac cgt tcc aag aac gtg cac l44 Ile Met Gly Phe Thr Lys Val Ala Thr His Arg Ser Lys Asn Val His ctg tac cgc cag ggc gag atc aac ctg atc ctc aac aac gag ccc aac 192 Leu Tyr Arg Gln Gly Glu Ile Asn Leu Ile Leu Asn Asn Glu Pro Asn agc atc gcc tcc tac ttt gcg gcc gaa cac ggc ccg tcg gtg tgc ggc 240 Ser Ile Ala Ser Tyr Phe Ala Ala Glu His Gly Pro Ser Val Cys Gly atg gcg ttc cgc gtg aag gac tcg caa aag gcc tac aac cgc gcc ctg 288 Met Ala Phe Arg Val Lys Asp Ser Gln Lys Ala Tyr Asn Arg Ala Leu gaa ctc ggc gcc cag ccg atc cat att gac acc ggg ccg atg gaa ttg 336 Glu Leu Gly Ala Gln Pro Ile His Ile Asp Thr Gly Pro Met Glu Leu 100 105 l10 aac ctg ccg gcg atc aag ggc atc ggc ggc gcg ccg ttg tac ctg atc 384 Asn Leu Pro Ala Ile Lys Gly Ile Gly Gly Ala Pro Leu Tyr Leu Ile gac cgt ttc ggc gaa ggc agc tcg atc tac gac atc gac ttc gtg tac 432 Asp Arg Phe Gly Glu Gly Ser Ser Ile Tyr Asp Ile Asp Phe Val Tyr ctc gaa ggt gtg gag cgc aat ccg gtc ggt gca ggt ctc aaa gtc atc 480 Leu Glu Gly Val Glu Arg Asn Pro Val Gly Ala Gly Leu Lys Val Ile 145 150 l55 160 gac cac ctg acc cac aac gtc tat cgc ggc cgc atg gtc tac tgg gcc 528 Asp His Leu Thr His Asn Val Tyr Arg Gly Arg Met Val Tyr Trp Ala aac ttc tac gag aaa ttg ttc aac ttc cgt gaa gcg cgt tac ttc gat 576 Asn Phe Tyr Glu Lys Leu Phe Asn Phe Arg Glu Ala Arg Tyr Phe Asp atc aag ggc gag tac acc ggc ctg act tcc aag gcc atg agt gcg ccg 624 Ile Lys Gly Glu Tyr Thr Gly Leu Thr Ser Lys Ala Met Ser Ala Pro gac ggc atg atc cgc atc ccg ctg aac gaa gag tcg tcc aag ggc gcg 672 Asp Gly Met Ile Arg Ile Pro Leu Asn Glu Glu Ser Ser Lys Gly Ala ggg cag atc gaa gag ttc ctg atg cag ttc aac ggc gaa ggc atc cag 720 Gly Gln Ile Glu Glu Phe Leu Met Gln Phe Asn Gly Glu Gly Ile Gln FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) cac gtg ttcctcacc gacgacctg gtcaagacc gacgcg ttg 768 gcg tgg His Val PheLeuThr AspAspLeu ValLysThr AspAla Leu Ala Trp aag aaa ggcatgcgc ttcatgacc gcgccgcca acttat tac 8l6 atc gac Lys Lys GlyMetArg PheMetThr AlaProPro ThrTyr Tyr Ile Asp gaaatg ctcgaaggc cgcctg cctgaccac ggcgagccg gtggatcaa 864 GluMet LeuGluGly ArgLeu ProAspHis GlyGluPro ValAspGln ctgcag gcacgcggt atcctg ctggacgga tcttccgtg gaaggcgac 912 LeuGln AlaArgGly IleLeu LeuAspGly SerSerVal GluGlyAsp aaacgc ctgctgctg cagatc ttctcggaa accctgatg ggcccggtg 960 LysArg LeuLeuLeu GlnIle PheSerGlu ThrLeuMet GlyProVal ttcttc gaattcatc cagcgc aagggcgac gatgggttt ggcgagggc 1008 PhePhe GluPheIle GlnArg LysGlyAsp AspGlyPhe GlyGluGly aacttc aaggcgctg ttcgag tccatcgaa cgtgaccag gtgcgtcgt 1056 AsnPhe LysAlaLeu PheGlu SerIleGlu ArgAspGln ValArgArg ggtgta ttgaccgcc gataag atcaaggac aaaattcat ggtgaaggt 1104 GlyVal LeuThrAla AspLys IleLysAsp LysIleHis GlyGluGly gcagat ggtgaaaag aaaaag aagaaggag aagaagaaa catggagag 1152 AlaAsp GlyGluLys LysLys LysLysGlu LysLysLys HisGlyGlu ggtcat gaacatggc catgat agcagcagc agtgacagt gat 2194 GlyHis GluHisGly HisAsp SerSerSer SerAspSer Asp <210> 4 <211> 398 <212>
<213> synthetic construct <400> 4 Met Ala Asp Leu Tyr Glu Asn Pro Met Gly Leu Met Gly Phe Glu Phe Ile Glu Phe Ala Ser Pro Thr Pro Gly Thr Leu Glu Pro Ile Phe Glu Ile Met Gly Phe Thr Lys Val Ala Thr His Arg Ser Lys Asn Val His Leu Tyr Arg Gln Gly Glu Ile Asn Leu Ile Leu Asn Asn Glu Pro Asn Ser Ile Ala Ser Tyr Phe Ala Ala Glu His Gly Pro Ser Val Cys Gly FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) Met Ala Phe Arg Val Lys Asp Ser Gln Lys Ala Tyr Asn Arg Ala Leu Glu Leu Gly Ala Gln Pro Tle His Ile Asp Thr Gly Pro Met Glu Leu Asn Leu Pro Ala Ile Lys Gly Ile Gly Gly Ala Pro Leu Tyr Leu Ile Asp Arg Phe Gly Glu Gly Ser Ser Ile Tyr Asp Ile Asp Phe Val Tyr Leu Glu Gly Val Glu Arg Asn Pro Val Gly Ala Gly Leu Lys Val Ile Asp His Leu Thr His Asn Val Tyr Arg Gly Arg Met Val Tyr Trp Ala Asn Phe Tyr Glu Lys Leu Phe Asn Phe Arg Glu Ala Arg Tyr Phe Asp Ile Lys Gly Glu Tyr Thr Gly Leu Thr Ser Lys Ala Met Ser Ala Pro Asp Gly Met Ile Arg Ile Pro Leu Asn Glu Glu Ser Ser Lys Gly Ala Gly Gln Ile Glu G1u Phe Leu Met Gln Phe Asn Gly Glu Gly Ile Gln His Val Ala Phe Leu Thr Asp Asp Leu Val Lys Thr Trp Asp Ala Leu Lys Lys Ile Gly Met Arg Phe Met Thr Ala Pro Pro Asp Thr Tyr Tyr Glu Met Leu Glu Gly Arg Leu Pro Asp His Gly Glu Pro Val Asp Gln Leu Gln Ala Arg Gly Ile Leu Leu Asp Gly Ser Ser Val Glu Gly Asp Lys Arg Leu Leu Leu Gln Ile Phe Ser Glu Thr Leu Met Gly Pro Val Phe Phe Glu Phe Ile Gln Arg Lys Gly Asp Asp Gly Phe Gly Glu Gly Asn Phe Lys Ala Leu Phe Glu Ser Ile Glu Arg Asp Gln Val Arg Arg Gly Val Leu Thr Ala Asp Lys Ile Lys Asp Lys Ile His Gly Glu Gly Ala Asp Gly Glu Lys Lys Lys Lys Lys Glu Lys Lys Lys His Gly Glu Gly His Glu His Gly His Asp Ser Ser Ser Ser Asp Ser Asp <210> 5 FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) <211> 73 <212> ADN
<213> synthetic construct <400> 5 aagatcaagg acaaaattca tggtgaaggt gcagatggtg aaaagaaaaa gaagaaggag 60 aagaagaaac atg 73 <210> 6 <211> 70 <212> ADN
<213> synthetic construct <400> 6 atcactgtca ctgctgctgc tatcatggcc atgttcatga ccctctccat gtttcttctt 60 ~CtCCttcttC 7O
<210> 7 <211> 54 <212> ADN
<213> synthetic construct <400> 7 acgtccaggt gcgtcgtggt gtattgaccg ccgataagat caaggacaaa attc 54 <210> 8 <211> 32 <212> ADN
<213> synthetic construct <400> 8 acgtgtcgac ttaatcactg tcactgctgc tg 32 FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) 20 25 30 gat agc agc agc agt gac agt gat 120 Asp Ser Ser Ser Ser Asp Ser Asp <210> 2 <211> 40 <212>
<213> synthetic construct <400> 2 Lys Ile Lys Asp Lys Ile His Gly Glu Gly Ala Asp Gly Glu Lys Lys Lys Lys Lys Glu Lys Lys Lys His Gly Glu Gly His Glu His Gly His Asp Ser Ser Ser Ser Asp Ser Asp <210> 3 <211> 1194 <212> DNA
<213> synthetic construct <220>
<221> CDS
<222> (1) .. (1194) SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) <400> 3 atg gca gat cta tac gaa aac cca atg ggc ctg atg ggc ttt gaa ttc 48 Met Ala Asp Leu Tyr G1u Asn Pro Met Gly Leu Met Gly Phe Glu Phe 1 5 ~ 10 15 atc gaa ttc gcg tcg ccg acg ccg ggt acc ctg gag ccg atc ttc gag 96 Ile Glu Phe Ala Ser Pro Thr Pro Gly Thr Leu Glu Pro Ile Phe Glu atc atg ggc ttc acc aaa gtc gcg acc cac cgt tcc aag aac gtg cac l44 Ile Met Gly Phe Thr Lys Val Ala Thr His Arg Ser Lys Asn Val His ctg tac cgc cag ggc gag atc aac ctg atc ctc aac aac gag ccc aac 192 Leu Tyr Arg Gln Gly Glu Ile Asn Leu Ile Leu Asn Asn Glu Pro Asn agc atc gcc tcc tac ttt gcg gcc gaa cac ggc ccg tcg gtg tgc ggc 240 Ser Ile Ala Ser Tyr Phe Ala Ala Glu His Gly Pro Ser Val Cys Gly atg gcg ttc cgc gtg aag gac tcg caa aag gcc tac aac cgc gcc ctg 288 Met Ala Phe Arg Val Lys Asp Ser Gln Lys Ala Tyr Asn Arg Ala Leu gaa ctc ggc gcc cag ccg atc cat att gac acc ggg ccg atg gaa ttg 336 Glu Leu Gly Ala Gln Pro Ile His Ile Asp Thr Gly Pro Met Glu Leu 100 105 l10 aac ctg ccg gcg atc aag ggc atc ggc ggc gcg ccg ttg tac ctg atc 384 Asn Leu Pro Ala Ile Lys Gly Ile Gly Gly Ala Pro Leu Tyr Leu Ile gac cgt ttc ggc gaa ggc agc tcg atc tac gac atc gac ttc gtg tac 432 Asp Arg Phe Gly Glu Gly Ser Ser Tyr Island Asp Ile Asp Phe Val Tyr ctc gaa ggt gtg gag cgc aat ccg gtc ggt gca ggt ctc aaa gtc atc 480 Leu Glu Gly Val Glu Arg Asn Pro Val Gly Ala Gly Leu Lys Val Ile 145 150 l55 160 gac cac ctg acc cac aac gtc tat cgc ggc cgc atg gtc tac tgg gcc 528 Asp His Leu Thr His Asn Val Tyr Arg Gly Arg Met Val Tyr Trp Ala aac ttc tac gag aaa ttg ttc aac ttc cgt gaa gcg cgt tac ttc gat 576 Asn Phe Tyr Glu Lys Leu Phe Asn Phe Arg Glu Ala Arg Tyr Phe Asp atc aag ggc gag tac acc ggc ctg act tcc aag gcc atg agt gcg ccg 624 Ile Lys Gly Glu Tyr Thr Gly Leu Thr Ser Lys Ala Met Ser Ala Pro gac ggc atg atc cgc atc ccg ctg aac gaa gag tcg tcc aag ggc gcg 672 Asp Gly Met Ile Arg Ile Pro Leu Asn Glu Glu Ser Ser Lys Gly Ala ggg cag atc gaa gag ttc ctg atg cag ttc aac ggc gaa ggc atc cag 720 Gly Gln Ile Glu Glu Phe Leu Met Gln Phe Asn Gly Glu Gly Ile Gln SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) cac gtg ttcctcacc gacgacctg gtcaagacc gacgcg ttg 768 gcg tgg His Val PheLeuThr AspAspLeu ValLysThr AspAla Leu Ala Trp aag aaa ggcatgcgc ttcatgacc gcgccgcca acttat tac 8l6 atc gac Lys Lys GlyMetArg PheMetThr AlaProPro ThrTyr Tyr Asp Island gaaatg ctcgaaggc cgcctg cctgaccac ggcgagccg gtggatcaa 864 GluMet LeuGluGly ArgLeu ProAspHis GlyGluPro ValAspGln ctgcag gcacgcggt atcctg ctggacgga tcttccgtg gaaggcgac 912 LeuGln AlaArgGly IleLeu LeuAspGly SerSerVal GluGlyAsp aaacgc ctgctgctg cagatc ttctcggaa accctgatg ggcccggtg 960 LysArg LeuLeuLeu GlnIle PheSerGlu ThrLeuMet GlyProVal ttcttc gaattcatc cagcgc aagggcgac gatgggttt ggcgagggc 1008 PhePhe GluPheIle GlnArg LysGlyAsp AspGlyPhe GlyGluGly aacttc aaggcgctg ttcgag tccatcgaa cgtgaccag gtgcgtcgt 1056 AsnPhe LysAlaLeu PheGlu SerIleGlu ArgAspGln ValArgArg ggtgta ttgaccgcc gataag atcaaggac aaaattcat ggtgaaggt 1104 GlyVal LeuThrAla AspLys IleLysAsp LysIleHis GlyGluGly gcagat ggtgaaaag aaaaag aagaaggag aagaagaaa catggagag 1152 AlaAsp GlyGluLys LysLys LysLysGlu LysLysLys HisGlyGlu ggtcat gaacatggc catgat agcagcagc agtgacagt gat 2194 GlyHis GluHisGly HisAsp SerSerSer SerAspSer Asp <210> 4 <211> 398 <212>
<213> synthetic construct <400> 4 Met Ala Asp Leu Tyr Glu Asn Pro Met Gly Leu Met Gly Phe Glu Phe Ile Glu Phe Ala Ser Pro Thr Pro Gly Thr Leu Glu Pro Ile Phe Glu Ile Met Gly Phe Thr Lys Val Ala Thr His Arg Ser Lys Asn Val His Leu Tyr Arg Gln Gly Glu Ile Asn Leu Ile Leu Asn Asn Glu Pro Asn Ser Ile Ala Ser Tyr Phe Ala Ala Glu His Gly Pro Ser Val Cys Gly SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Met Ala Phe Arg Val Lys Asp Ser Gln Lys Ala Tyr Asn Arg Ala Leu Glu Leu Gly Ala Gln Pro Tle His Ile Asp Thr Gly Pro Met Glu Leu Asn Leu Pro Ala Ile Lys Gly Ile Gly Gly Ala Pro Leu Tyr Leu Ile Asp Arg Phe Gly Glu Gly Ser Ser Tyr Island Asp Ile Asp Phe Val Tyr Leu Glu Gly Val Glu Arg Asn Pro Val Gly Ala Gly Leu Lys Val Ile Asp His Leu Thr His Asn Val Tyr Arg Gly Arg Met Val Tyr Trp Ala Asn Phe Tyr Glu Lys Leu Phe Asn Phe Arg Glu Ala Arg Tyr Phe Asp Ile Lys Gly Glu Tyr Thr Gly Leu Thr Ser Lys Ala Met Ser Ala Pro Asp Gly Met Ile Arg Ile Pro Leu Asn Glu Glu Ser Ser Lys Gly Ala Gly Gln Ile Glu G1u Phe Leu Met Gln Phe Asn Gly Glu Gly Ile Gln His Val Ala Phe Leu Thr Asp Asp Leu Val Lys Thr Trp Asp Ala Leu Lys Lys Ile Gly Met Arg Phe Met Thr Ala Pro Pro Asp Thr Tyr Tyr Glu Met Leu Glu Gly Arg Leu Pro Asp His Gly Glu Pro Val Asp Gln Leu Gln Ala Arg Gly Ile Leu Leu Asp Gly Ser Ser Val Glu Gly Asp Lys Arg Leu Leu Leu Gln Ile Phe Ser Glu Thr Leu Met Gly Pro Val Phe Phe Glu Phe Ile Gln Arg Lys Gly Asp Asp Gly Phe Gly Glu Gly Asn Phe Lys Ala Leu Phe Glu Ser Ile Glu Arg Asp Gln Val Arg Arg Gly Val Leu Thr Ala Asp Lys Ile Lys Asp Lys Ile His Gly Glu Gly Ala Asp Gly Glu Lys Lys Lys Lys Lys Glu Lys Lys Lys Lys His Gly Glu Gly His Glu His Gly His Asp Ser Ser Ser Ser Asp Ser Asp <210> 5 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) <211> 73 <212> DNA
<213> synthetic construct <400> 5 aagatcaagg acaaaattca tggtgaaggt gcagatggtg aaaagaaaaa gaagaaggag 60 aagaagaaac atg 73 <210> 6 <211> 70 <212> DNA
<213> synthetic construct <400> 6 atcactgtca ctgctgctgc tatcatggcc atgttcatga ccctctccat gtttcttctt 60 ~ CtCCttcttC 7O
<210> 7 <211> 54 <212> DNA
<213> synthetic construct <400> 7 acgtccaggt gcgtcgtggt gtattgaccg ccgataagat caaggacaaa attc 54 <210> 8 <211> 32 <212> DNA
<213> synthetic construct <400> 8 acgtgtcgac ttaatcactg tcactgctgc tg 32 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

Claims

21

1. Fusion protein consisting of an HPPD fused at its C- end terminal or N-terminal to a signal protein sequence allowing the addressing of HPPD in cellular compartments other than the cytoplasm or plastids.

2. Fusion protein according to claim 1, characterized in that the HPPD
is a native, mutated or chimeric HPPD enzyme exhibiting HPPD activity.

3. Fusion protein according to one of claims 1 or 2, characterized in this that the HPPD is chosen from the HPPDs of bacteria such as Pseudomonas, of plants like Arabidopsis or carrot, Coccicoides, or mammals like the mouse or the pig.

4. Fusion protein according to one of claims 1 to 3, characterized in that that the HPPD is a Pseudomonas fluorescens HPPD.

5. Fusion protein according to one of claims I to 3, characterized in that that the HPPD is a mutated HPPD in its C-terminal part.

6. Fusion protein according to claim 5, characterized in that the HPPD
mutated includes the W336 mutation.

7. Fusion protein according to one of claims I to 4, characterized in this that HPPD is a chimeric HPPD comprising elements from different HPPD.

8. Fusion protein according to one of claims 1 to 7, characterized in that that the signal protein sequence allows the addressing of the HPPD to the lumen of the thylakoid or the thylakoid membrane, to the endoplasmic reticulum, to the vacuole, Wall cell, mitochondria, golgi apparatus, nucleus, membrane nuclear.

9. Fusion protein according to claim 8, characterized in that the signal protein sequence allows the targeting of HPPD to the compartment vacuolar (vacuole).

10. Fusion protein according to claim 9, characterized in that the signal protein sequence is depicted by SEQ ID NO I.

11. Fusion protein according to claim 10, characterized in that 1a signal protein sequence is fused to the C-terminal part of the HPPD.

12. Fusion protein according to one of claims 1 to 11, characterized in this that it is described by sequence identifier No. 4 (SEQ ID NO
4).

13. Nucleic acid sequence encoding the fusion protein according to one of claims 1 to 12.

14. Chimeric gene (or expression cassette) comprising a coding sequence as well as heterologous 5' and 3' regulatory elements that can function in a host organism, in particular plant cells or plants, the sequence coding comprising at least one nucleic acid sequence coding for a protein fusion according to claims 1 to 12.

15. Chimeric gene according to claim 14, characterized in that the organism host is selected from plant cells or plants.

16. Chimeric gene according to one of claims 14 or 15, characterized in that that the nucleic acid sequence is represented by SEQ ID NO 3.

17. Cloning and/or expression vector for transformation of a host organism containing at least one chimeric gene according to claims 14 at 16.

18. Vector according to claim 17, characterized in that it further comprises the chimeric gene according to one of. claims 14 to 16 at least one second gene chimera functional in the same host organism, comprising an acid sequence nucleic encoding an HPPD for addressing in a cell compartment other that the cellular compartment in which the HPPD of the first chimeric gene is addressed.

19. Vector according to one of claims 17 or 18, characterized in that the second chimeric gene allows addressing of HPPD in chloroplasts, including a nucleic acid sequence encoding a peptide fusion protein of transit/HPPD.

20. Vector according to one of claims 17 to 19, characterized in that it further comprises the chimeric gene according to one of claims 14 to 16, and the if necessary a second chimeric gene encoding an HPPD, another chimeric gene encoding a other gene of interest.

21. Transformed host organism characterized by containing a gene chimera according to one of claims 14 to 16.

22. Host organism according to claim 21, characterized in that it comprises besides the chimeric gene according to one of claims 14 to 16 at least one second gene functional chimera in the same host organism, comprising a sequence acid nucleic acid encoding an HPPD for addressing in a compartment cellular other that the cellular compartment in which the HPPD of the first chimeric gene is addressed.

23. Host organism according to claim 22, characterized in that the second chimeric gene allows addressing of HPPD in chloroplasts, including a nucleic acid sequence encoding a peptide fusion protein of transit/HPPD.

24. Host organism according to one of claims 21 to 23, characterized in that that it comprises, in addition to the chimeric gene according to claim 14 to 16, and the case optionally a second chimeric gene encoding an HPPD, another chimeric gene coding for another gene of interest.

25. Host organism according to one of claims 21 to 24, characterized in that that it is a plant cell.

26. Host organism according to claim 25, characterized in that the cells plants are chosen from the cells of plants of the monocotyledonous type such as cereals, sugar cane, rice and corn or dicots such as tobacco, soybeans, rapeseed, cotton, beets, clover.

27. Transformed plants, in the genome of which at least one chimeric gene according to one of claims 14 to 16 is stably integrated.

28. Plant according to claim 27, characterized in that it contains cells transformed according to one of claims 25 or 26.

29. Plant according to one of claims 27 or 28, characterized in that that they is regenerated from cells transformed according to one of claims 25 or 26.

30. Transformed plant according to claim 28, characterized in that it is from the cultivation and/or crossing of regenerated plants according to the claim 29.

31. Plant transformed according to one of claims 27 to 30, characterized in this that it comprises, in addition to the chimeric gene according to one of claims 14 to 16, at least a second functional chimeric gene, comprising an acid sequence nucleic coding for an HPPD for addressing in a cellular compartment other than the cellular compartment in which the HPPD of the first chimeric gene is addressed.

32. Transformed plant according to claim 31, characterized in that the second chimeric gene allows addressing of HPPD in chloroplasts, including a nucleic acid sequence encoding a peptide fusion protein of transit/HPPD.

33. Transformed plant according to one of claims 27 to 32, characterized in this that it comprises, in addition to the chimeric gene according to one of claims 14 to 16, and the these optionally a second chimeric gene encoding an HPPD, another chimeric gene coding for another gene of interest.

34. Plant transformed according to one of claims 27 to 33, characterized in this that it is of the monocotyledonous type such as cereals, sugar cane, rice and maize or dicotyledons such as tobacco, soya, rapeseed, cotton, beet, clover.

35. Seeds of transformed plants according to one of claims 27 to 34.

36. Process for the selective weeding of plants, in particular crops, using of an HPPD inhibitor, characterized in that this herbicide is applied to Plant processed according to one of claims 27 to 34, both in pre-sowing, in collected only in culture post-emergence. .

37. Method of controlling weeds in an area of a field comprising seeds or plants transformed with the chimeric gene according to one of claims 27 to 35, which method comprises applying in said field area a toxic dose for said weeds of an inhibitor herbicide of HPPD, without however, substantially affect the seeds or plants transformed.

38. Process for cultivating transformed plants according to one of the claims 27 to 34, which method consists in sowing the seeds of said plants transformed according to claim 35 in an area of a field suitable for the cultivation of say plants, to apply to the said surface of the said field a toxic dose for the bad herbs of a herbicide that targets HPPD when weeds are present, without to affect substantially said seeds or said transformed plants, then collect the cultivated plants when they reach the desired maturity and possibly separate the seeds of the harvested plants.