FR2848568A1 - New chimeric gene including a sequence for hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase, useful for preparing transgenic plants resistant to herbicides that target this enzyme, by plastid transformation - Google Patents

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Abstract

Chimeric gene (CG) comprising at least one elementary chimeric gene (eCG) that consists of, functionally linked in the direction of transcription, a promoter (P), functional in plants; a sequence encoding hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase (HPPD) and a terminator, functional in plants, is new. Independent claims are also included for: (1) a vector for transforming plant plastids comprising at least two sequences that are homologous to a region of the plant plastome and flank at least one CG; (2) methods for preparing transplastomic plants; (3) a transplastomic plant cell (A), tolerant of herbicides that target HPPD, that contain at least one TG; (4) transplastomic plants (B), tolerant of herbicides that target HPPD, regenerated from the cells of (3) or containing CG; and (5) seeds from the plants of (4).

Description

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Gène chimère permettant l'expression d'une Hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase dans les plastes et plantes transplastomiques contenant un tel gène tolérantes aux herbicides. Chimeric gene allowing expression of a Hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase in plastids and transplastomic plants containing such gene herbicide tolerant.

La présente invention a pour objet des plantes transplastomiques présentant une tolérance améliorée aux herbicides inhibiteurs de l'hydroxyphényl pyruvate dioxygenase, une méthode d'obtention de telles plantes ainsi que les vecteurs utilisés. The present invention relates to transplastomic plants with improved tolerance to herbicides that inhibit hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase, a method of obtaining such plants as well as the vectors used. L'invention a également pour objet un procédé de traitement des plantes transplastomiques dans lequel on applique un inhibiteur de l'HPPD pour éliminer les mauvaises herbes. The invention also relates to a transplastomic plant treatment method which comprises applying an HPPD inhibitor to eliminate weeds.

Les hydroxy-phényl pyruvate dioxygénases (HPPD) sont des enzymes qui catalysent la réaction de transformation du para-hydroxy-phényl-pyruvate (HPP) en homogentisate. Hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase (HPPD) are enzymes which catalyze the reaction of conversion of para-hydroxy-phenyl pyruvate (HPP) to homogentisate.

Cette réaction a lieu en présence de fer (Fe2+) en présence d'oxygène (Crouch NP & al., Tetrahedron, 53,20, 6993-7010,1997). This reaction occurs in the presence of iron (Fe 2+) in the presence of oxygen (Crouch NP et al., Tetrahedron, 53,20, 6993 to 7010.1997).

Par HPPD, on entend selon l'invention toute enzyme HPPD native, mutée ou chimère, présentant l'activité HPPD. By HPPD is meant according to the invention any native HPPD enzyme, mutated or chimeric, having HPPD activity. De nombreuses HPPD sont décrites dans la littérature, notamment les HPPD de bactéries comme Pseudomonas (Rüetschi & al., Eur. J. Biochem., 205,459-466, 1992, WO 96/38567), de plantes comme d'Arabidopsis (WO 96/38567, Genebank AF047834) ou de carotte (WO 96/38567, Genebank 87257), de Coccicoides (Genebank COITRP) ou de mammifères comme l'homme, la souris ou le cochon. Many HPPD are described in the literature, including bacteria such as Pseudomonas HPPD (Rüetschi et al., Eur. J. Biochem., 205.459 to 466, 1992, WO 96/38567), of plants like Arabidopsis (WO 96 / 38567, Genebank AF047834) or of carrot (WO 96/38567, Genebank 87257), of Coccicoides (Genebank COITRP) or of mammals such as humans, mice or pigs.

Par HPPD mutée, on entend selon l'invention les HPPD mutées pour obtenir des propriétés de tolérance aux herbicides inhibiteurs d'HPPD améliorées par rapport à l'HPPD native correspondante. By mutated HPPD is meant according to the invention the HPPD mutated to obtain tolerance properties HPPD inhibitor herbicides improved compared with the corresponding native HPPD. De manière avantageuse, l'HPPD mutée est une HPPD mutée dans sa partie C-terminale telle que décrite dans la demande de brevet WO 99/24585. Advantageously, the mutated HPPD is an HPPD mutated in its C-terminal portion, as described in patent application WO 99/24585. De manière avantageuse, l'HPPD mutée comprend la mutation W336 telle que décrite dans la demande de brevet WO 99/24585. Advantageously, the mutated HPPD comprises the mutation W336 as described in patent application WO 99/24585.

Par HPPD chimère, on entend une HPPD comprenant des éléments provenant de différentes HPPD, notamment les HPPD chimères décrites dans la demande de brevet WO 99/24586. By chimeric HPPD is meant an HPPD comprising elements from various HPPDs, in particular the chimeric HPPDs described in patent application WO 99/24586.

De manière avantageuse, l'HPPD est une HPPD de Pseudomonas fluorescens (WO Advantageously, the HPPD is an HPPD of Pseudomonas fluorescens (WO
96/38567). 96/38567).

On connaît par ailleurs certaines molécules inhibitrices de cette enzyme, qui viennent se fixer à l'enzyme pour inhiber la transformation de l'HPP en homogentisate. It also has some inhibitory molecules of this enzyme, which attach themselves to the enzyme to inhibit transformation of the HPP into homogentisate. Certaines de some of

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ces molécules ont trouvé un emploi comme herbicides, dans la mesure où l'inhibition de la réaction dans les plantes conduit à un blanchiment des feuilles des plantes traitées, et à la mort desdites plantes (Pallett KE et al. 1997 Pestic. Sci. 50 83-84). these molecules have found a use as herbicides, in so far as inhibition of the reaction in plants results in bleaching of the leaves of the treated plants, and the death of said plants (Pallett KE et al. 1997 Pestic. Sci. 50 83-84). De tels herbicides ayant pour cible l'HPPD décrits dans l'état de la technique sont notamment les isoxazoles (EP 418 175, EP 470 856, EP 487 352, EP 527 036, EP 560 482, EP 682 659, US 5 424 276) en particulier l'isoxaflutole (IFT), herbicide sélectif du maïs, les dicétonitriles ou DKN (EP 496 630, EP 496 631), en particulier la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4-CF3 phényl) propane-1,3-dione et la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4-2,3 Cl2 phényl) propane-1,3-dione, les tricétones (EP 625 505, EP 625 508, US 5,506,195), en particulier la sulcotrione ou la mésotrione ou encore les pyrazolinates. Such herbicides having HPPD as target described in prior art are especially isoxazoles (EP 418 175, EP 470 856, EP 487 352, EP 527 036, EP 560 482, EP 682 659, US 5,424,276 ), in particular isoxaflutole (IFT), a selective maize herbicide, diketonitriles or DKN (EP 496 630, EP 496 631), in particular 2-cyano-3-cyclopropyl-1- (2-S02 CH3-4- CF3 phenyl) propane-1,3-dione and 2-cyano-3-cyclopropyl-1- (2-S02 CH3-4-2,3 Cl2 phenyl) propane-1,3-dione, triketones (EP 625 505 EP 625 508, US 5,506,195), in particular sulcotrione or mesotrione or the pyrazolinates.

Pour rendre les plantes tolérantes aux herbicides, on dispose de trois stratégies principales, (1) la détoxification de l'herbicide par une enzyme venant transformer l'herbicide, ou son métabolite actif, en produits de dégradation non toxiques, comme par exemple les enzymes de tolérance au bromoxynil ou au basta (EP 242 236, EP 337 899) ; For making plants tolerant to herbicides, there are three major strategies: (1) detoxifying the herbicide transformed by an enzyme from the herbicide, or its active metabolite, into non-toxic degradation products, such as enzymes tolerance to bromoxynil or to basta (EP 242 236, EP 337 899); (2)la mutation de l'enzyme cible en une enzyme fonctionnelle moins sensible à l'herbicide ou son métabolite actif, comme par exemple les enzymes de tolérance au glyphosate (EP 293 356, Padgette SR & al., J Biol. Chem., 266, 33, 1991, FR2 736 926); (2) mutation of the target enzyme into a functional enzyme less sensitive to the herbicide or the active metabolite, such as tolerance to glyphosate enzymes (EP 293 356, Padgette SR et al., J Biol. Chem. , 266, 33, 1991 736 926 FR2); ou (3) la surexpression de l'enzyme sensible, de manière à produire dans la plante des quantités suffisantes d'enzyme cible au regard des constantes cinétiques de cette enzyme vis à vis de l'herbicide de manière à avoir suffisamment d'enzyme fonctionnelle, malgré la présence de son inhibiteur. or (3) overexpression of the sensitive enzyme, so as to produce in the plant sufficient amounts of target enzyme in terms of kinetic constants of this enzyme with respect to the herbicide so as to have sufficient functional enzyme despite the presence of the inhibitor.

C'est cette troisième stratégie qui a été décrite pour obtenir avec succès des plantes tolérantes aux inhibiteurs d'HPPD (WO 96/38567), étant entendu que pour la première fois une stratégie de simple surexpression de l'enzyme cible sensible était employée avec succès pour conférer aux plantes une tolérance à un niveau agronomique à un herbicide. This third strategy which has been described for successfully obtaining plants tolerant to HPPD inhibitors (WO 96/38567), it being understood that for the first time a simple strategy of overexpression of the sensitive enzyme target was used with successfully for conferring on plants tolerance to an agronomic level to a herbicide. Un niveau agronomique de tolérance aux inhibiteurs d'HPPD a également été obtenu avec des HPPD chimères (WO 99/24586), et même amélioré avec des HPPD mutées dans leur parties terminales (WO 99/24586). An agronomic level of tolerance to HPPD inhibitors was also obtained with chimeric HPPD (WO 99/24586), and even enhanced with HPPD mutated in their end portions (WO 99/24586).

Alors que les HPPD de plantes sont des enzymes à localisation cytoplasmique (Garcia, I., et al. 1997. Biochem. J. 325: 761-769. ), il a également été montré que la meilleure tolérance était obtenue lorsque l'HPPD exogène était accumulée dans les plastes, plus particulièrement les chloroplastes. While the plants are HPPD enzymes cytoplasmic localization (Garcia, I., et al 1997. J. Biochem 325:... 761-769), it was also shown that the best tolerance was achieved when HPPD exogenous had accumulated in the plastids, particularly chloroplasts. Ainsi, l'adressage de l'HPPD vers les chloroplastes a été réalisée à l'aide d'un construit comprenant un peptide de transit optimisé (OTP, EP 508 909) qui permet d'adresser le construit vers le chloroplaste, lui-même suivi de la région codante Thus, the addressing of the HPPD to the chloroplasts was performed using a construct comprising an optimized transit peptide (OTP, EP 508 909), which allows to send the construct to the chloroplast, itself followed by the coding region

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du gène hppd de Pseudomonas fluorescens à son tour suivie du terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens (WO 96/38567). HPPD gene of Pseudomonas fluorescens in turn followed by the nos terminator from Agrobacterium tumefaciens (WO 96/38567).

Différentes cassettes d'expression susceptible d'améliorer le niveau de tolérance des plantes transformées ont été décrites avec différents éléments de régulations, et notament des promoteurs dits lumière dépendants (WO 99/25842) ou pour les plantes monocotylédones avec une séquence de régulation promotrice comprenant la combinaisoin du promoteur H3C4 d'histone de maïs et du premier intron de l'actine de riz (WO 99/34005). Different expression cassettes capable of improving the tolerance of the transformed plants have been described with various elements of regulation and notament of said light-dependent promoters (WO 99/25842) or monocotyledonous plants with a promoter regulatory sequence comprising combinaisoin of the H3C4 maize histone promoter and of the first intron of rice actin (WO 99/34005).

Ces résultats montrent d'une part que l'homogentisate peut être transporté du milieu extérieur vers le site intra cellulaire où il est nécessaire pour complémenter une inhibition de l'HPPD endogène, et d'autre part que l'accumulation d'une HPPD exogène dans la cellule au niveau des plastes ou du cytoplasme permettant l'obtention de plantes génétiquement modifiées tolérantes aux herbicides inhibiteurs d'HPPD. These results show firstly that homogentisate can be transported from the external environment to the cell site intra where it is necessary to complement inhibition of endogenous HPPD, and secondly that the accumulation of an exogenous HPPD in the cell at the level of plastids and cytoplasm possible to obtain genetically modified plants tolerant to HPPD inhibitor herbicides. Cependant, une meilleure tolérance au DKN a été observée chez les plantes exprimant l'HPPD dans les plastes However, better tolerance to DKN was observed in plants expressing HPPD in plastids
Un autre moyen d'obtention de plantes exprimant l'HPPD dans les plastes est la transformation directe des plastes. Another means of obtaining plants expressing HPPD in the plastids is the direct transformation of plastids. En effet, la transformation des plastes présente de nombreux avantages parmi lesquels on peut citer : - La transformation des plastes, par laquelle les gènes sont insérés par une double recombinaison homologue dans une ou toutes les copies multiples du génome plastidial circulaire (ou plastome) présent dans chaque cellule présente de cibler précisément la région du plastome où l'on souhaite intégrer le gène d'intérêt, grâce à des séquences plastidiales positionnées de part et d'autre du transgène sur le vecteur de transformation. Indeed, the transformation of this plastid many advantages among which are: - The plastid transformation by which genes are inserted by double homologous recombination in one or all of the multiple copies of the circular plastid genome (or plastome) present in each cell has to precisely target the region of the plastome where it is desired to integrate the gene of interest, by means of plastid sequences positioned on either side of the transgene in the transformation vector. Ce ciblage précis évite l'effet dit de position observé fréquemment en transgenèse nucléaire. This precise targeting avoids the effect of said position frequently observed in nuclear transgenesis.

- L'obtention d'un très grand nombre de copies du transgène par cellule. - Obtaining a large number of copies of the transgene per cell. En effet, selon le stade de développement, une cellule de feuille peut contenir jusqu'à 10 Indeed, according to the developmental stage, a leaf cell can contain up to 10
000 copies d'un petit génome circulaire de 120 à 160 kilobases, chaque molécule portant une large séquence répétée. 000 copies of a small circular genome of 120 to 160 kilobases, each molecule carrying a large repeat sequence. Les cellules de plantes peuvent donc être manipulées de manière à contenir 20 000 copies d'un gène d'intérêt. therefore plant cells can be manipulated to contain 20,000 copies of a gene of interest.

Ceci conduit à des niveaux d'expression élevés, les produits des transgènes pouvant présenter plus de 40% des protéines solubles totales (De Cosa et al., 2001). This leads to high levels of expression of the transgene products that may be more than 40% of total soluble proteins (De Cosa et al., 2001).

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La transformation plastidiale présente l'autre avantage de permettre le contrôle de la dispersion des transgènes dans l'environnement, les traits codés au niveau des plastes ne sont pas transmissibles via le pollen, donc les risques potentiels de transmission du transgène aux espèces sauvages est évité. The plastid transformation has the other advantage of allowing control of the dispersion of transgenes in the environment, traits encoded in the plastids are transmitted via pollen, so the potential risks of transmission of the transgene to the wild species is avoided .

La technologie de transformation des plastes est clairement décrite dans les documents suivants: les brevets américains US Pat. The plastid transformation technology is clearly described in the following documents: US Patents US Pat. No 5,451,513; No. 5,451,513; 5,545,817 , 5,545,818 et 5,576,198, les demandes de brevet internationales WO 95/16783 et WO 97/32977 ainsi que dans l'article McBride et al., 1994. La transformation des plastes par biolistique a été réalisée initialement dans l'algue unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii (Boynton et al., 1988) et cette approche a été étendue au tabac (Svab et al., 1990). 5,545,817, 5,545,818 and 5,576,198, international patent applications WO 95/16783 and WO 97/32977 and in the article McBride et al., 1994. The plastid transformation by biolistic was initially carried out in the unicellular alga Chlamydomonas reinhardtii (Boynton et al., 1988) and this approach has been extended to tobacco (Svab et al., 1990).

La technique classique de transformation de plastes implique le bombardement de feuilles à l'aide de micro-projectiles sur lesquels est fixé l'ADN (Svab et al., 1993, US Patent Ser. No. 6,376,744). The conventional technique of plastid transformation involves the bombardment of leaves with microprojectiles on which is attached DNA (Svab et al., 1993, US Patent Ser. No. 6,376,744).

A l'heure actuelle, la transformation stable des plastes des végétaux supérieurs est pratiquée de manière courante seulement chez le tabac, N. tabacum (Svab et Maliga, 1990 ; Svab et al., 1993). At present, the stable transformation of the plastids of higher plants is practiced routinely only in tobacco, N. tabacum (Svab and Maliga, 1990; Svab et al., 1993). Quelques progrès récents ont néanmoins été réalisés avec la transformation des plastes de riz (Khan et Maligna, 1999), Arabidopsis thaliana (Sikdar et al., 1998), la pomme de terre (Sidorov et al., 1999), le colza (Chaudhun et al., 1999) et la tomate (Ruf et al., 2001). Some recent progress has been made with the transformation of rice plastids (Khan and Maligna, 1999), Arabidopsis thaliana (Sikdar et al., 1998), potato (Sidorov et al., 1999), rapeseed (Chaudhun et al., 1999) and tomato (Ruf et al., 2001). Des plantes transplastomiques fertiles ont été obtenues dans le cas du tabac, de la tomate et de la pomme de terre. Fertile transplastomic plants have been obtained in the case of tobacco, tomato and potato.

L'utilisation de la transformation directe des plastes a été utilisée pour obtenir un bon niveau de tolérance à des herbicides ou de résistance aux insectes ou encore pour la production de protéines en grande quantité. The use of direct plastid transformation has been used to obtain a good level of tolerance to herbicides or resistance to insects or for the production of protein in large quantities. Ainsi, la surexpression à partir du plastome de tabac de gènes de tolérance à des herbicides tels que le glyphosate (Daniell, 1998 ; W099/10513; Ye et al , 2000 ; WO 01/04331, WO 01/04327), ou la phosphinothricine (Basta) (Lutz et al., 2001), confère une excellente tolérance à ces herbicides. Thus, overexpression from the tobacco plastome genes for tolerance to herbicides such as glyphosate (Daniell, 1998; W099 / 10513; Ye et al, 2000; WO 01/04331, WO 01/04327) or phosphinothricin (Basta) (Lutz et al., 2001), provides excellent tolerance to these herbicides. D'autres applications ont conduit à l'obtention de plantes transplastomiques tolérantes aux insectes ou surproduisant des protéines thérapeutiques (McBride et al., 1995 ; US Patent 5,451,513; Staub et al. (2000) ; W099/10513). Other applications have led to obtaining transplastomic plants tolerant to insects or overproduce therapeutic proteins (McBride et al., 1995; US Patent 5,451,513; Staub et al (2000). W099 / 10513).

Cependant, aucun des travaux décrits dans l'art antérieur n'a permis de montrer que l'expression d'un gène de tolérance à un herbicide au niveau du plastome permettait d'obtenir une tolérance accrue par rapport à une expression nucléaire de ce même gène. However, none of the work described in the prior art has shown that the expression of a gene for tolerance to a herbicide in plastome possible to obtain an increased tolerance for nuclear expression of the same gene. Le The

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document WO 01/04327, décrit une technique de transformation des plastes ainsi que des plantes transplatomiques exprimant le gène de tolérance au glyphosate (EPSPS). WO 01/04327 discloses a plastid transformation technique and the transplatomiques plants expressing the gene for tolerance to glyphosate (EPSPS). Les résultats présentés dans ce document attestent d'une tolérance herbicide similaire pour les plantes transformées au niveau nucléaire et plastidial. The results presented here demonstrate a similar herbicide tolerance to plants transformed plastid and nuclear level.

Les références bibliographiques citées précédement sont intégrées par référence à la présente demande de brevet, en particulier les références bibliographiques définissant les séquences d'acide nucléique codant pour des HPPD natives, chimères ou mutées, éventuellement combinées avec un peptide signal ou peptide de transit. The references cited previously are incorporated by reference in the present patent application, especially the references defining the nucleic acid sequences encoding native HPPD, chimeric or mutated, optionally combined with a signal peptide or transit peptide.

Description des figures Figure 1 : Carte du plasmide pCLT111 Figure 2 : du plasmide pCLT129 Figure 3 : Carte du plasmide pCH43 Description détaillée de l'invention Description of Figures Figure 1: Map of the plasmid pCLT111 Figure 2: plasmid pCLT129 Figure 3: Map of the plasmid pCH43 Detailed Description of the invention
La présente invention a pour objet un gène chimère comprenant au moins un gène chimère élémentaire lequel comprend, liés entre eux de manière fonctionnelle dans le sens de la transcription une séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans les plastes, une séquence codante hétérologue codant pour une hydroxyphenyl-pyruvate dioxygenase (HPPD) et un terminateur fonctionnel dans les plastes de cellules végétales. The present invention relates to a chimeric gene comprising at least one chimeric gene elemental which comprises, interconnected functionally in the direction of transcription, a functional promoter regulatory sequence in the plastids, a heterologous coding sequence encoding a hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase (HPPD) and a terminator functional in the plastids of plant cells.

De manière préférée, l'HPPD est choisie parmi les HPPD natives, mutées ou chimères. Preferably, the HPPD is selected from HPPD native, mutated or chimeric.

De manière encore plus préférée, la séquence codant pour l'HPPD est issue de Pseudomonas fluorescens. Even more preferably, the sequence encoding HPPD is derived from Pseudomonas fluorescens.

Selon un aspect de l'invention la séquence codant pour l'HPPD est issue de Synechocystis. According to one aspect of the invention the sequence encoding HPPD is derived from Synechocystis.

Dans un autre aspect de l'invention, la séquence codant pour l'HPPD peut être d'origine végétale et notamment, elle peut être issue d'Arabidopsis, d'une Ombellifère et plus particulièrement de Daucus carotta. In another aspect of the invention, the sequence encoding the HPPD may be of plant origin and in particular, it may be derived from Arabidopsis, an Umbelliferae Daucus and more particularly carotta. Selon un aspect encore différent, la séquence codant pour l'HPPD peut être issue de Zea maïs. According to a still further aspect, the sequence encoding the HPPD may be derived from Zea maize.

L'invention concerne également gène chimère comprenant au moins un gène chimère élémentaire comprenant la séquence codant pour une HPPD ainsi qu'au moins un autre gène chimère élémentaire comprenant, liés entre de manière opérationnelle dans le sens de la transcription une séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans les plastes, une The invention also relates to chimeric gene comprising at least one elemental chimeric gene comprising the sequence encoding an HPPD and at least one other elemental chimeric gene comprising operably linked in the direction of transcription, a functional promoter regulatory sequence in plastids, a

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séquence codant pour un marqueur de sélection, un terminateur fonctionnel dans les plastes de cellules végétales. sequence encoding a selection marker, a terminator functional in the plastids of plant cells.

L'expression "liés entre eux de manière opérationnelle" signifie que lesdits éléments du gène chimère élémentaire sont liés entre eux de manière à ce que leur fonctionnement soit coordonné et permettent l'expression de la séquence codante. The term "interconnected operatively" means that said elements of the elemental chimeric gene are linked together so that their operation is coordinated and allows the expression of the coding sequence. A titre d'exemple, un promoteur est lié de manière opérationnelle à une séquence codante lorsqu'il est capable d'assurer l'expression de ladite séquence codante. For example, a promoter is operably linked to a coding sequence when it is capable of ensuring expression of said coding sequence. La construction du gène chimère selon l'invention et l'assemblage de ses différents éléments est réalisable par l'emploi de techniques bien connues de l'homme du métier, notamment celles décrites dans Sambrook et al. Construction of the chimeric gene of the invention and the assembly of its various elements can be carried by the use of techniques well known to those skilled in the art, including those described in Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Le choix des éléments régulateurs constituant le gène chimère est essentiellement fonction de la plante et du type de plaste dans lesquelles ils doivent fonctionner, et l'homme du métier est capable de sélectionner des éléments régulateurs fonctionnels dans une plante donnée. The choice of the regulatory elements constituting the chimeric gene depends essentially on the plant and the type of plastid in which they must function, and those skilled in the art are capable of selecting regulatory elements functional in a given plant.

Parmi les promoteurs fonctionnels dans les plastes de cellules végétales, on peut noter à titre d'exemple le promoteur du gène psbA, codant pour la protéine D1 du PSII (Staub et al., 1993, EMBO Journal 12 (2): 601-606), ou le promoteur constitutif de l'opéron des ARN ribosomaux, Prrn (Staub et al., 1992, Plant Cell 4 : 39-45). Among the promoters that are functional in the plastids of plant cells, it may be noted by way of example the promoter of the psbA gene, encoding the D1 protein of PSII (Staub et al, 1993, EMBO Journal 12 (2):. 601-606 ) or the constitutive promoter of the ribosomal RNA operon, Prrn (Staub et al, 1992, Plant Cell. 4: 39-45). D'une manière générale, tout promoteur issu d'un gène de plastome de plantes ou d'un gène de bactérie conviendra, et l'homme du métier saura faire le choix adéquat parmi les différents promoteurs disponibles de manière à obtenir un mode d'expression désiré (constitutif ou inductible). In general, any promoter derived from a plant plastome gene or a bacterial gene appropriate, and the skilled person will make the right choice from the various promoters available so as to obtain a mode desired expression (constitutive or inducible). Un promoteur préféré selon l'invention est constitué du promoteur Prrn de Tabac associé à une portion 5' de la région 5' non-traduite du gène rbcL de tabac (Svab et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. A preferred promoter according to the invention consists of the Tobacco Prrn promoter combined with a 5 'portion of the 5' untranslated tobacco rbcL gene (Svab et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci.

90 : 913-917). 90: 913-917).

De façon encore plus préférentielle, le promoteur correspond au promoteur lumière dépendant le promoteur du gène psbA, codant pour la protéine D1 du PSII (Staub et al., 1993, EMBO Journal 12 (2): 601-606). Even more preferably, the promoter is the light dependent promoter promoter psbA gene, encoding the D1 protein of PSII (Staub et al, 1993, EMBO Journal 12 (2). 601-606).

Le marqueur de sélection permet de sélectionner les plastes et les cellules effectivement transformées, c'est-à-dire celles ayant incorporé le(s) gène(s) chimérique (s) dans leur plastome. The selectable marker used to select the plastids and the cells actually transformed, that is to say those having incorporated the (s) gene (s) chimeric (s) into their plastome. Il permet également d'obtenir des plantes transplastomiques fertiles à l'état d'homoplasmie. It also provides fertile transplastomic plants in the state of homoplasmie. Parmi les gènes utilisables codant pour des marqueurs de sélection, on peut citer des gènes de résistance aux antibiotiques spectinomycine-streptomycine et kanamycine tel que, par exemple, les gènes chimériques aadA codant une aminoglycoside Among the usable genes encoding selectable markers include the spectinomycin-streptomycin antibiotic resistance genes such as kanamycin, for example, chimeric aadA gene encoding an aminoglycoside

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3"-adenyltransférase (Svab et al., 1993) et neo codant une néomycine phosphotransférase (Carrer et al., 1993) respectivement, mais également un gène de tolérance au bétaïne aldéhyde tel que le gène codant la bétaïne aldéhyde déshydrogénase (Daniell et al., 2001), mais aussi des gènes de tolérance aux herbicides tel que le gène bar (White et al., 1990, Nucleic Acid Res. 18 (4):1062) pourla tolérance au bialaphos, le gène EPSPS (US 5,188,642) pour la tolérance au glyphosate. On peut également utiliser des gènes rapporteurs codant pour des enzymes facilement identifiables comme l'enzyme GUS (ssglucuronidase) (Staub et al., 1993) ou la GFP (green fluorescent protein) (Sidorov et al., 199), des gènes codant pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567, WO 97/04103 et WO 01/64023. 3 "-adenyltransférase (Svab et al., 1993) and neo encoding a neomycin phosphotransferase (Carrer et al., 1993) respectively, but also a tolerance to betaine aldehyde gene such as the gene encoding betaine aldehyde dehydrogenase (Daniell et al ., 2001), but also genes for tolerance to herbicides such as the bar gene (White et al, 1990, Nucleic Acid Res 18 (4..): 1062) forthe tolerance to bialaphos, the EPSPS gene (US 5,188,642) to glyphosate tolerance. It may also be used reporter genes encoding readily identifiable enzymes such as the GUS enzyme (ssglucuronidase) (Staub et al., 1993) or GFP (green fluorescent protein) (Sidorov et al., 199) , genes encoding pigments or enzymes regulating the production of pigments in the transformed cells. such genes are in particular described in patent applications WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567, WO 97/04103 and WO 01/64023.

De manière préférentielle, le gène codant pour un marqueur de sélection est le gène aadA codant pour une amino glycoside 3"-adényltransférase conférant la résistance à la streptomycine et à la spectinomycine (Svab et al., 1993). Preferably, the gene encoding a selectable marker is the aadA gene encoding an amino glycoside 3 "-adényltransférase conferring resistance to streptomycin and to spectinomycin (Svab et al., 1993).

Parmi les terminateurs fonctionnels dans les plastes de cellules végétales, on peut noter à titre d'exemple le terminateur du gène psbA, du gène rbcL codant pour la large sousunité de la Rubisco, du gène rps16 codant une protéine ribosomale de tabac (Shinozaki et al., 1986; Staub et al., 1993). Among the terminators functional in the plastids of plant cells, it may be noted by way of example the terminator of the psbA gene, of the rbcL gene encoding the Rubisco large subunit of of the rps16 gene encoding a ribosomal protein of tobacco (Shinozaki et al ., 1986; Staub et al, 1993)..

L'invention concerne également un vecteur de transformation adapté à la transformation des plastes de plante caractérisé en ce qu'il comprend deux régions de recombinaison homologue du plastome de la plante, encadrant au moins un gène chimère selon l'invention. The invention also relates to a transformation vector suitable for the transformation of plant plastids, characterized in that it comprises two regions homologous recombination of the plastome of the plant, bordering at least one chimeric gene according to the invention.

Ces régions, situées en amont (RRHG) et en aval (RRHD) du(des) gène(s) chimère(s) élémentaires, permettent la double recombinaison homologue avec une région intergénique du plastome qui comprend les régions contigües RRHG et RRHD. These regions, located upstream (RRHG) and downstream (RRHD) of (the) gene (s) chimera (s) Elementary, allow double homologous recombination with an intergenic region of the plastome which comprises the contiguous regions RRHG and RRHD.

De façon préférentielle, les deux régions de recombinaison homologues selon l'invention correspondent à des séquences contigües permettant l'intégration du gène chimère dans une région intergénique du plastome. Preferably, the two homologous recombination regions according to the invention correspond to contiguous sequences that allow the integration of the chimeric gene into an intergenic region of the plastome. Dans un mode de réalisation particulier, cette région correspond à la région de l'opéron des ARN ribosomiques du plastome. In a particular embodiment, this region corresponds to the region of the operon of ribosomal RNA of the plastome. Dans un autre mode de réalisation particulier, cette région intergénique comprend l'extrémité 3' du gène rbcL codant pour la large sous-unité de la Rubisco, et que l'autre séquence homologue In another particular embodiment, this intergenic region comprises the 3 'end of the rbcL gene encoding the large subunit of Rubisco, and the other homologous sequence

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comprend à l'extrémité du gène 5' accD, codant pour une sous unité de l'acétyl-CoAcarboxylase. comprises at the end of gene 5 'accD, encoding a subunit of acetyl-CoAcarboxylase. Et plus particulièrement, cette région intergénique comprend l'extrémité 3' du gène rbcL codant pour la large sous-unité de la Rubisco correspondant aux nucléotides 57755 à 59297 du plastome de N. tabacum, cv. And more particularly, this intergenic region comprises the 3 'end of the rbcL gene encoding the large subunit of Rubisco corresponding to nucleotides 57755 to 59297 of the plastome of N. tabacum, cv. Petit Havana et que l'autre séquence homologue comprend l'extrémité 5' du gène accD correspondant aux nucléotides 59298 à 60526 du plastome de N. tabacum, cv. Petit Havana, and the other homologous sequence comprises the 5 'end of the accD gene corresponding to nucleotides 59298 to 60526 of the plastome of N. tabacum, cv. Petit Havana. Little Havana.

La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention des plantes transplastomiques tolérantes aux inhibiteurs de l'HPPD, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : transformation des cellules avec un vecteur selon l'invention, sélection des cellules comprenant des plastes transformés, régénérations des plantes à partir des cellules transformées. The present invention also has for object a process for obtaining transplastomic plants tolerant to HPPD inhibitors, said method comprising the steps of: transforming cells with a vector according to the invention, selection for cells comprising transformed plastids, regenerations plants from the transformed cells.

Par "transplastornique", on entend selon l'invention des plantes ayant intégré de manière stable dans leur plastome un gène chimère fonctionnel dans les plastes, en particulier dans les chioroplastes. By "transplastornique" is meant according to the invention plants having stably integrated into their plastome a chimeric gene functional in plastids, in particular in chioroplastes. Le plastome est constitué par le génome des organites cellulaires autres que la noyau, en particulier le génome des chloroplastes. The plastome consists of the genome of the cellular organelles other than the nucleus, in particular the chloroplasts genome.

La transformation des cellules peut s'effectuer par toute méthode de transformation de cellules végétales. Cell transformation can be performed by any method for transforming plant cells. Parmi les méthodes de transformation utilisables pour obtenir cellules transformées selon l'invention, une de celles-ci consiste à mettre les cellules ou tissus des plantes à transformer en présence de polyéthylène glycol (PEG) et du vecteur de transformation (Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168(1), 111-115 ; Mercenier and Chassy, 1988, Biochimie 70 (4), 503-517).L'électroporation est une autre méthode qui consiste à soumettre les cellules ou tissus à transformer et les vecteurs à un champ électrique (Andreason and Evans, 1988, Biotechniques 6 (7), Shigekawa and Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3(1), 56-62). Among the processing methods used to obtain transformed cells of the invention, one of them is to put the cells and tissues of plants to convert in the presence of polyethylene glycol (PEG) and the transformation vector (Chang and Cohen, 1979 .., Mol Gen. Genet 168 (1), 111-115; and Mercenier Chassy, ​​1988 Biochemistry 70 (4), 503-517) .L'électroporation is another method of subjecting the cells or tissues to be transformed and the vectors to an electric field (Andreason and Evans, 1988, Biotechniques 6 (7), Shigekawa and Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3 (1), 56-62). Une autre méthode consiste à injecter directement les vecteurs dans les cellules ou les tissus par micro-injection (Gordon and Ruddle, 1985, Gene 33 (2), 121-136). Another method consists in directly injecting the vectors into cells or tissues by microinjection (Gordon and Ruddle, 1985, Gene 33 (2), 121-136). La transformation de cellules ou tissus végétaux peut également se faire à l'aide de bactéries du genre Agrobacterium, de préférence par infection des cellules ou tissus desdites plantes par A. tumefaciens (Knopf, 1979, Subcell. Biochem. The transformation of plant cells or tissues can also be done using bacteria of the Agrobacterium genus, preferably by infection of cells or tissues of said plants with A. tumefaciens (Knopf, 1979 Subcell. Biochem.

6,143-173; 6.143 to 173; Shaw et al., 1983, Gene 23(3):315-330) ou A. rhizogenes (Bevan et Chilton, 1982, Annu. Rev. Genet. 16 :357-384; Tepfer and Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sci 4(1), 24-28) génétiquement modifiés permettant ainsi l'adressage du T-DNA spécifiquement vers les plastes. Shaw et al, 1983, Gene 23 (3): 315-330) or A. rhizogenes (Bevan and Chilton, 1982 Annu Rev Genet 16: 357-384; Tepfer and Brain Delbart, 1987 Microbiol.... Sci 4 (1), 24-28) genetically modified allowing the addressing of the T-DNA specifically to the plastids. De manière préférentielle, la transformation de cellules ou tissus végétaux par Preferably, the transformation of plant cells or tissues by

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Agrobacterium tumefaciens est réalisée selon le protocole décrit par Ishida et al. Agrobacterium tumefaciens is carried out according to the protocol described by Ishida et al. (1996, Nat. (1996, Nat.

Biotechnol. Biotechnol. 14 (6), 745-750). 14 (6), 745-750).

Selon un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, la méthode dite de bombardement de particules ou biolistique sera utilisée. According to a preferred embodiment of the method according to the invention, said method of particle bombardment or biolistics be used. Elle consiste à bombarder les tissus avec des particules sur lesquelles sont adsorbés les vecteurs selon l'invention (Bruce et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (24), 9692-9696;Klein et al., 1992, Biotechnology 10 (3), 286-291 ; US Patent No. 4,945,050). It consists in bombarding the tissues with particles onto which are adsorbed the vectors of the invention (Bruce et al, 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86 (24), 9692-9696;...... Klein et al, 1992 Biotechnology 10 (3), 286-291; US ​​Patent No. 4,945,050).

La sélection des cellules transformées peut être réalisée à l'aide d'un inhibiteur de l'HPPD et/ou d'un autre marqueur de sélection. Selection of transformed cells can be achieved by means of a HPPD inhibitor and / or another selectable marker. L'application desdits produits pouvant être faite de manière conjointe ou séquentielle. The application of these products can be done jointly or sequentially. De façon préférée, la sélection est pratiquée en présente d'un inhibiteur de l'HPPD et de streptomycine et/ou de spectinomycine. Preferably, the selection is practiced in present of a HPPD inhibitor and streptomycin and / or spectinomycin.

Le procédé d'obtention de plantes transplastomiques tolérantes aux inhibiteurs de l'HPPD selon l'invention peut comporter une étape de sélection supplémentaire intervenant sur les plantes régénérées. The method of obtaining transplastomic plants tolerant to HPPD inhibitors of the invention may comprise an additional step of selecting intervening on the regenerated plants.

L'invention a également pour objet une cellule végétale transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD, caractérisée en ce qu'elle comprend un gène chimère comprenant au moins une séquence codant pour une HPPD et éventuellement une séquence codante hétérologue codant pour un marqueur de sélection. The invention also relates to a transplastomic plant cell tolerant to herbicides having HPPD as target, characterized in that it comprises a chimeric gene comprising at least a sequence encoding an HPPD and optionally a heterologous coding sequence encoding a marker Selection.

L'invention concerne une plante transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD, caractérisée en ce qu'elle est régénérée à partir des cellules transformées telles que définies ci-dessus. The invention relates to a transplastomic plant tolerant to herbicides having HPPD as target, characterized in that it is regenerated from the transformed cells as defined above.

L'invention concerne également une plante transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD comprenant un gène chimère comprenant au moins une séquence codant pour une HPPD. The invention also relates to a transplastomic plant tolerant to herbicides having HPPD as target comprising a chimeric gene comprising at least a sequence encoding an HPPD.

Une plante transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD selon l'invention comprend un gène chimère comprenant une séquence codant pour une HPPD ainsi qu'une séquence codant pour un marqueur de sélection, est un autre objet de la présente invention. A transplastomic plant tolerant to herbicides having HPPD as the target according to the invention comprises a chimeric gene comprising a sequence encoding an HPPD well as a sequence encoding a selection marker, is another object of the present invention.

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Les plantes transpiastomiques hétéroplasmiques tolérantes aux herbicides ayant pour cible l'HPPD selon l'invention constituent un aspect de l'invention. Plants transpiastomiques heteroplasmic tolerant to herbicides having HPPD as the target according to the invention form an aspect of the invention. Par "hétéroplasmique", il faut comprendre un état selon lequel les cellules contiennent une population mixte de différents génomes plastidiaux à l'intérieur d'un plaste ou une population de plastes contenus dans des cellules ou tissus de plantes. By "heteroplasmic" is meant a state in which the cells contain a mixed population of different plastid genomes within a plastid or a population of plastids contained in plant cells or tissues.

Les plantes transplastomiques homoplasmiques tolérantes aux herbicides ayant pour cible l'HPPD selon l'invention constituent un autre aspect de l'invention. Homoplasmic transplastomic plants tolerant to herbicides having HPPD as the target according to the invention constitute a further aspect of the invention. L'état d'homoplasmie correspond à un état selon lequel toutes les cellules contiennent une population de plastome identique. The homoplasmy state corresponds to a state in which all cells contain a population of identical plastome. Selon l'invention, des plantes transplastomiques sont à l'état d'homoplasmie lorsque toutes leurs cellules ne contiennent que des copies de plastome transformés, et plus aucun plastomes non-transformés. According to the invention, transplastomic plants are in the state of homoplasmy when all their cells contain only copies of transformed plastome and no more unprocessed plastomes. Cet état est généralement obtenu par sélection des copies de plastome ayant intégré la gène chimère, notamment grâce à l'association de ladite gène chimère avec un gène codant pour un marqueur de sélection. This state is usually obtained by selecting plastome copies of having integrated the chimeric gene, in particular thanks to the combination of said chimeric gene with a gene encoding a selection marker. Les plastomes n'ayant pas intégré le marqueur de sélection sont alors éliminés lorsque les tissus transformés sont mis en contact avec l'agent de sélection correspondant. Plastomes have not integrated the selectable marker are then removed when the transformed tissues are contacted with the corresponding selection agent.

Les plantes transplastomiques tolérantes aux herbicides ayant pour cible l'HPPD selon l'invention peuvent être du type monocotylédones telles que par exemple les céréales dont le blé, la canne à sucre, le riz et le mais ou dicotylédones comme le tabac, le soja, le colza, le coton, la betterave, le trèfle, etc. Transplastomic plants tolerant to herbicides having HPPD as the target according to the invention may be of the type such as monocots, for example cereals including wheat, sugar cane, rice and maize or dicotyledons such as tobacco, soybean, rapeseed, cotton, beets, clover, etc.

L'invention comprend également des parties des plantes transplastomiques, et la descendance de ces plantes. The invention also includes parts of transplastomic plants and the progeny of these plants. On entend par "parties", tout organe de ces plantes, qu'il soit aérien ou souterrain. The term "parts", organ of these plants, whether overhead or underground. Les organes aériens sont les tiges, les feuilles, et les fleurs comprenant les organes reproducteurs mâles et femelles. The aerial organs are the stems, leaves, and flowers comprising the male reproductive organs and female. Les organes souterrains sont principalement les racines, mais ils peuvent également être des tubercules. The underground parts are mainly the roots, but they can also be tubers. Par "descendance", on entend principalement les graines contenant les embryons issus de la reproduction de ces plantes entre-elles. By "seed" is meant mainly the seeds containing the embryos derived from the reproduction of these plants each other. Par extension, le terme "descendance" s'applique à toutes les graines formées à chaque nouvelle génération issue de croisements dont au moins un des parents est une plante transformée selon l'invention. By extension, the term "offspring" applies to all the seeds formed at each new generation derived from crosses at least one parent is a transformed plant of the invention. Une descendance peut également être obtenue par multiplication végétative desdites plantes transformées. Offspring can also be obtained by vegetative propagation said transformed plants. Les graines selon l'invention peuvent être enrobées d'une composition agrochimique comprenant au moins un produit actif possédant une activité sélectionnée parmi les activités fongicide, herbicide, insecticide, nématicide, bactéricide ou virucide. The seeds according to the invention may be coated with an agrochemical composition comprising at least one active product with an activity selected from the fungicidal activity, herbicidal, insecticidal, nematicidal, bactericidal or virucidal.

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L'invention a aussi pour objet un procédé de désherbage sélectif de plantes, notamment de cultures, à l'aide d'un inhibiteur de l'HPPD notamment un herbicide définit auparavant, caractérisé en ce qu'on applique cet herbicide sur des plantes transplastomiques selon l'invention, tant en présemis, en prélevée qu'en postlevée de la culture. The invention also has for object a method of selective weeding of plants, in particular of crops, using an HPPD inhibitor, in particular a herbicide defined previously, characterized in that this herbicide is applied on transplastomic plants according to the invention, both pre-plant, preemergence in post-emergence of the crop.

La présente invention concerne également un procédé de contrôle des mauvaises herbes dans une surface d'un champ comprenant des graines ou des plantes transformées avec le gène chimère selon l'invention, lequel procédé consiste à appliquer dans la dite surface du champ une dose toxique pour les dites mauvaises herbes d'un herbicide inhibiteur d'HPPD, sans toutefois affecter de manière substantielle les graines ou plantes transplastomiques selon l'invention. The present invention also relates to a weed control method in an area of ​​a field comprising seeds or plants transformed with the chimeric gene of the invention, which method comprises applying to the said area of ​​the field a toxic dose the said weeds an HPPD-inhibiting herbicide, without substantially affecting the seeds or plants transplastomic the invention.

La présente invention concerne également un procédé de culture des plantes transformées selon l'invention avec un gène chimère selon l'invention lequel procédé consiste à semer les graines des dites plantes transformées dans une surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface du dit champ une dose toxique pour les mauvaises herbes d'un herbicide ayant pour cible l'HPPD défini cidessus en cas de présence de mauvaises herbes, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées. The present invention also relates to a method for culturing the transformed plants according to the invention with a chimeric gene according to the invention which method comprises sowing the seeds of the said transformed plants in an area of ​​a field suitable for growing said plants, applying to said area of ​​said field a dose toxic to weeds of a herbicide having HPPD defined above the target in case of presence of weeds without substantially affecting the said seeds or the said transformed plants, then in harvesting the cultivated plants when they reach the desired maturity and optionally in separating the seeds from the harvested plants.

Par sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées , on entend selon l'invention que les plantes comprenant la cassette d'expression selon l'invention, soumises à une application d'une dose d'herbicide toxique pour les mauvaises herbes, présentent une phytotoxicité légère ou nulle. By without substantially affecting the said seeds or the said transformed plants is meant according to the invention that plants comprising the expression cassette according to the invention, subjected to application of a herbicide toxic dose for bad herbs, with mild or no phytotoxicity. Par dose toxique pour les mauvaises herbes, on entend selon l'invention une dose d'application de l'herbicide pour laquelle les mauvaises herbes sont tuées. For toxic dose weeds means of the invention an application rate of the herbicide for which the weeds are killed. Par phytotoxicité légère on etend selon l'invention un pourcentage de feuilles blanchies inférieur à 25%, préférentiellement inférieur à 10%, plus préférentiellement inférieur à 5%. By slight phytotoxicity we extend according to the invention the percentage of leaves bleached less than 25%, preferably less than 10%, more preferably less than 5%. Il est entendu également selon la présente invention que l'application de la même dose toxique sur une plante autrement comparable non transformée, c'est à dire ne comprenant pas la cassette d'expression selon l'invention, conduirait à observer sur ladite plante des symtomes de phytotoxicité suppérieurs à ceux observés pour la plante transformée comprenant la cassette d'expression selon l'invention. It is also understood according to the present invention that the application of the toxic dose of an otherwise comparable untransformed plant, i.e. not comprising the expression cassette according to the invention lead to observe on the said plant symtomes phytotoxicity divertor to those observed for the transformed plant comprising the expression cassette of the invention.

Dans les deux procédés ci-dessus, l'application de l'herbicide ayant pour cible l'HPPD peut être faite selon l'invention, tant en présemis, en prélevée qu'en postlevée de la culture. In both the above methods, the application of the herbicide having HPPD as the target can be made according to the invention, both pre-plant, preemergence in post-emergence of the crop.

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Par herbicide au sens de la présente invention on entend une matière active herbicide seule ou associée à un additif qui modifie son efficacité comme par exemple un agent augmentant l'activité (synergiste) ou limitant l'activité (en anglais safener). By herbicide as defined in the present invention means a single herbicide active ingredient or in combination with an additive which modifies its effectiveness such as a agent increasing the activity (synergist) or limiting the activity (safener). Les herbicides inhibiteurs d'HPPD sont en particulier définis auparavant. The HPPD inhibitors herbicides are particularly defined before. Bien entendu, pour leur application pratique, les herbicides ci-dessus sont associée de manière en soi connue aux adjuvants de formulations utilisés habituellement en agrochimie. Of course, for practical application, the above herbicides are associated per se known adjuvants formulations commonly used in agrochemicals.

Les herbicides inhibiteurs d'HPPD sont choisis parmi les isoxazoles en particulier l'isoxaflutole, les dicétonitriles en particulier la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4-CF3 phényl) propane-1,3-dione et la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CHg-4-2,3 CI2 phényl) propane-1,3-dione, les tricétones, en particulier la sulcotrione ou la mésotrione, ou les pyrazolinates. The HPPD-inhibiting herbicides are selected from isoxazoles, in particular isoxaflutole, diketonitriles, in particular 2-cyano-3-cyclopropyl-1- (2-S02 CH3-4-CF3 phenyl) propane-1,3-dione and 2-cyano-3-cyclopropyl-1- (2-S02 CI2 4 to 2.3 CHG-phenyl) propane-1,3-dione, triketones, in particular sulcotrione or mesotrione, or pyrazolinates.

Les techniques de biologie moléculaire sont décrites dans Ausubel (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc. (1994) : Maniatis T., Fritsch EF and Sambrook J. Molecular Cloning . Molecular biology techniques are described in Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc. (1994) (Ed.): T. Maniatis, EF Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning. A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989). A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989). Les réactions de PCR sont réalisées dans un appareil Perkin Elmer GeneAmp PCR system 9600. Les réactions d'amplification pour chaque échantillon sont effectuées au cours de 30 cycles comportant différentes étapes : une étape de dénaturation à 94 C pendant une minute, une étape d'appariement de 45 secondes à une température de 50à 60 C, en fonction des amorces utilisées et une étape d'élongation à 72 C de 1 à 2 minutes selon la taille des produits PCR à amplifier. PCR reactions were performed in a Perkin Elmer GeneAmp PCR system 9600. The amplification reactions for each sample are carried out in 30 cycles comprising various steps: a denaturation step at 94 C for one minute, a step of pairing 45 seconds at a temperature of 50A C 60, depending on the primers used, and an elongation step at 72 C for 1 to 2 minutes depending on the size of the PCR products to be amplified. Ces cycles ont précédés d'une période de dénaturation à 94 C durant 5 minutes et suivis d'une période d'élongation finale de 5 minutes à 72 C. Une température de 4 C est appliquée après 30 cycles. These cycles were preceded by a denaturation period at 94 C for 5 minutes and followed by a final elongation period of 5 minutes at 72 C. A temperature of 4 C is applied after 30 cycles. Les produits PCR sont séparés sur gel d'agarose. The PCR products are separated on agarose gel.

La position des différents fragments d'ADN issus du plastome de Nicotiana tabacum est indiquée conformément à la numérotation proposée par Shinozki et al., 1986 et repris dans Genebank sous le numéro d'accession Z00044). The position of the various DNA fragments derived from the Nicotiana tabacum plastome is indicated in accordance with the numbering proposed by Shinozki et al., 1986 and repeated in Genebank under the accession number Z00044).

L'invention sera plus particulièrement illustrée par les exemples qui suivent, étant entendu que ces exemples ne sont pas limitatifs. The invention will be more specifically illustrated by the following examples, it being understood that these examples are not exhaustive.

Exemple 1: Construction des vecteurs pCLT111 et pCLT129, utiles à la production de plantes transplastomiques surexprimant l'hppd Example 1 Construction of vectors and pCLT111 pCLT129 useful in the production of transplastomic plants overexpressing the HPPD

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Les deux plasmides pCLT111 et pCLT129 contiennent deux gènes chimères élémentaires adjacents, nommées "AADA" et "HPPD", encadrées par deux fragments d'ADN, "RRHD" (Région de Recombinaison Homologue Droite) et "RRHG" (Région de Recombinaison Homologue Gauche), facilitant l'intégration du gène chimère dans le génome plastidial. Both plasmids and pCLT111 pCLT129 contain two adjacent elementary chimeric genes, called "AADA" and "HPPD" flanked by two DNA fragments, "RRHD" (Region Homologous Recombination Right) and "RRHG" (Left Homologous Recombination Region ), facilitating the integration of the chimeric gene in the plastid genome. Pour les deux plasmides, le fragment RRHG (nucléotides 57755 à 59297 du plastome de N. tabacum, cv. Petit Havana) correspond à l'extrémité 3' du gène rbcL codant pour la large sous-unité de la Rubisco, et le fragment RRHD (nucléotides 59298 à 60526 du plastome de N. tabacum, cv. Petit Havana) correspond à l'extrémité 5' du gène accD, codant pour une sous-unité de l'acétyl-CoA-carboxylase. In both plasmids, the RRHG fragment (nucleotides 57755 to 59297 of the plastome of N. tabacum, cv. Petit Havana) corresponds to the 3 'end of the rbcL gene encoding the large subunit of Rubisco, and the fragment RRHD (59298 nucleotide 60526 of the plastome of N. tabacum, cv. Petit Havana) corresponds to the 5 'end of the accD gene, encoding a subunit of acetyl-CoA carboxylase.

Le gène chimère élémentaire AADA ("AADA-111", SEQ ID No 1) du plasmide pCLT111 (issu d'un plasmide pBS11SK, Stratagène) est un gène chimérique composé, de 5' en 3', du promoteur de l'opéron des ARN ribosomiques ("Prrn", nucléotides 102 561 à 102 677 du plastome de N. tabacum), d'une portion de la région 5' transcrite et non traduite du gène rbcL ("5'rbcL", nucléotides 57 569 à 57 584 du plastome de N. tabacum), de la séquence codante du gène aadA dont le produit confère la résistance à la spectinomycine (Svab and Maliga, 1993), et du terminateur du gène psbA ("3'psbA", nucléotides 146 à 533 du plastome de N. tahacum, cv Petit Havana). Elemental chimeric gene AADA ( "AADA-111", SEQ ID NO 1) pCLT111 plasmid (from a plasmid pBS11SK, Stratagene) is a chimeric gene composed, from 5 'to 3', the promoter of the operon of ribosomal RNA ( "Prrn", nucleotides 102 561 to 102 677 of the N. tabacum plastome), of a portion of the 5 'transcribed and untranslated region of the rbcL gene ( "5'rbcL" nucleotides 57 569 to 57 584 plastome of N. tabacum) of the coding sequence of the aadA gene whose product confers resistance to spectinomycin (Svab and Maliga, 1993) and the terminator of the psbA gene ( "3'psbA", nucleotides 146-533 of the plastome of N. tahacum cv Petit Havana). Le gène chimère élémentaire "HPPD" du plasmide pCLT111 ("HPPD-111", SEQ ID No 5) est un gène chimérique composé, de 5' en 3', du promoteur du gène psbA ("PpsbA ", nucléotides 1596 à 1819 du plastome de N. tabacum, cv PBD6), de la séquence codante du gène hppd de Pseudomonas fluorescens (SEQ ID NO 1 de la demande de brevet WO 98/02562), et du terminateur du gène rbcL ("3'rbcL", nucléotides 59 036 à 59 246 du plastome de N. tabacum, cv PBD6). Elemental chimeric gene "HPPD" plasmid pCLT111 ( "HPPD-111", SEQ ID No. 5) is a chimeric gene composed, from 5 'to 3', the promoter of the psbA gene ( "PpsbA", 1596-1819 the nucleotides plastome N. tabacum, cv PBD6), the coding sequence of the HPPD gene of Pseudomonas fluorescens (SEQ ID NO 1 of the patent application WO 98/02562), and the terminator of the rbcL gene ( "3'rbcL" nucleotides 59 036 to 59 246 of the plastome of N. tabacum, cv PBD6). Les deux gènes chimères élémentaires sont dans la même orientation et le gène chimère élémentaire "HPPD" est en 5' du gène chimère élémentaire "AADA", de telle sorte que le gène hppd se trouve flanqué de deux séquences identiques 3'rbcL en répétition directe (présentes sur RRHG et dans la cassette HPPD-111) (Figure 1). The two elementary chimeric genes are in the same orientation and elemental chimeric gene "HPPD" is 5 'to the gene elemental chimeric "AADA", so that the HPPD gene is flanked by two identical sequences in direct repeat 3'rbcL (RRHG present on and in the cassette HPPD-111) (Figure 1).

Le gène chimère élémentaire "AADA" (AADA-129, SEQ ID No. 3) du plasmide pCLT129 (issu d'un plasmide pBS11SK, Stratagène) est composée, de 5' en 3', du promoteur Prrn, d'une portion de la région 5' transcrite et non traduite du gène rbcL ("5'rbcL", nucléotides 57 569 à 57 584 du plastome de N. tabacum), de la séquence codante du gène aadA et du terminateur 3'rbcL. Elemental chimeric gene "AADA" (AADA-129, SEQ ID No. 3) of pCLT129 plasmid (from a plasmid pBS11SK, Stratagene) is composed, from 5 'to 3' of the Prrn promoter, a portion of the 5 'transcribed and untranslated region of the rbcL gene ( "5'rbcL" nucleotides 57 569 to 57 584 of the N. tabacum plastome), of the coding sequence of the aadA gene and the terminator 3'rbcL. Le gène chimère élémentaire HPPD du plasmide pCLT129 (HPPD-129, SEQ ID No 7) est composée de 5' en 3', du promoteur Prrn, d'une portion de la région 5' transcrite et non traduite du gène rbcL ("5'rbcL", nucléotides 57 569 à 57 584 du plastome de N. tabacum), de la séquence codante du gène hppd de P. fluorescens (identique à cette du gène chimère élémentaire HPPD-111) et du terminateur 3'psbA. The elemental chimeric gene HPPD plasmid pCLT129 (HPPD-129, SEQ ID No. 7) is composed of 5 'to 3' of the Prrn promoter, a portion of the 5 'transcribed and untranslated region of the rbcL gene ( "5 'rbcL ", nucleotides 57 569 to 57 584 of the N. tabacum plastome), of the coding sequence of the gene of P. fluorescens HPPD (identical to that of the elemental chimeric gene HPPD-111) and 3'psbA terminator. Les deux cassettes sont dans la même orientation et la cassette AADA-129 est en 5' de la The two cassettes are in the same orientation and the AADA-129 cassette is 5 'of the

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cassette HPPD-129 de telle sorte que le gène aadA se trouve flanqué de deux séquences quasi-identiques, 3'rbcL-Prrn, les deux séquences différant uniquement au niveau de la jonction entre 3'rbcL et Prrn (Figure 2). cassette HPPD-129 such that the aadA gene is flanked by two nearly identical sequences, 3'rbcL-Prrn, the two sequences differing only at the junction between 3'rbcL and Prrn (Figure 2).

Exemple 2: Transformation par biolistiaue des génomes plastidiaux de tabac. Example 2: Transformation of tobacco plastid biolistiaue genomes.

Des plants de Nicotiana tabacum cv 'PBD6' sont cultivés en conditions stériles sur un milieu MS (Murashige T. and Skoog F., 1962) (Sigma M-5519 à 4,4 g/l) et saccharose (30 g/l). Plants of Nicotiana tabacum cv 'PBD6' are grown under sterile conditions on an MS medium (Murashige T. and Skoog F., 1962) (Sigma M-5519 to 4.4 g / l) and sucrose (30 g / l) . Des feuilles de 3 à 5 cm sont bombardées sur leur face inférieure en utilisant un canon construit au laboratoire d'après celui décrit par Finer et al. Leaves of 3 to 5 cm are bombarded on their lower surface using a gun constructed in the laboratory according to that described by Finer et al. (1992), le "PIG" (Particule Inflow Gun). (1992), the "PIG" (Particle Inflow Gun). Les micro-projectiles de tungstène (particules M17 de 1 m) sont complexés à l'ADN (pCLT111 ou pCL129, 5 g/ tir) en présence de CaCl2 (0,8 à 1 M) et de spermidine (14 à 16 mM). Tungsten microprojectiles (M17 particles of 1 m) are complexed with the DNA (or pCLT111 pCL129, 5 g / shot) in the presence of CaCl2 (0.8 to 1 M) and spermidine (14 to 16 mM) . Les feuilles bombardées sont ensuite placées de manière à disposer la face inférieure sur un milieu MS supplémenté avec 0,05 mg/l d'acide a-naphtalène acétique (ANA; Sigma), 2 mg/l de 6-benzylam:nopurine (BAP; Sigma), 30 g/l de saccharose et 7g/l de phytagar (milieu MS 0,05-2). The bombarded leaves are then placed so as to have the lower face on an MS medium supplemented with 0.05 mg / l naphthalene acetic acid, (NAA; Sigma), 2 mg / l of 6-benzylam: nopurine (BAP ; Sigma), 30 g / l of sucrose and 7 g / l of phytagar (MS 0.05-2 medium). Deux à trois jours après le bombardement les feuilles bombardées sont découpées en carré de 5 mm de côtés et placées, toujours face inférieure sur un milieu MS 0,05-2 contenant 500 mg/l de spectinomycine dihydrochloride (et/ou différentes concentrations de DKN). Two to three days after bombardment the bombarded leaves are cut into 5-mm square of sides and placed, always lower face on an MS 0.05-2 medium containing 500 mg / l spectinomycin dihydrochloride (and / or different concentrations of DKN ). Les cals et les pousses résistants à la spectinomycine (et/ou au DKN) sont régénérées sur le même milieu et sont enracinés sur un milieu contenant MS à demi force, 15 g/l de saccharose et 500 mg/l de spectinomycine (et/ou différentes concentrations de DKN) pour obtenir les plantes TO ( correspondant à un premier cycle de régénération appelé R1). Calli and shoots resistant to spectinomycin (and / or DKN) are regenerated on the same medium and are rooted on a medium containing MS half strength, 15 g / l of sucrose and 500 mg / l spectinomycin (and / or various concentrations of DKN) to obtain the tO plants (corresponding to a first regeneration cycle called R1). De manière à approcher un état d'homoplasmie, un deuxième cycle de régénération est réalisé sur un milieu MS 0,05-2 contenant de la spectinomycine (500 mg/I) et du DKN (1 ppm). So as to approach a state of homoplasmy, a second regeneration cycle is carried out on an MS 0.05-2 medium containing spectinomycin (500 mg / I) and DKN (1 ppm). Les pousses régénérées (appelées événements R2) sont enracinées et les plantes (TO) transférées en serre. The regenerated shoots (called R2 events) are rooted and plants (TO) transferred to the greenhouse. Les premières générations de graines sont des générations T1. The first seeds of generations are T1 generations.

Deux séries indépendantes de bombardements de feuilles de tabac avec pCLT111, CLT111- 1 et CLT111-2 ont été effectuées en utilisant respectivement comme agents de sélection soit uniquement la spectinomycine (500 mg/l), soit un mélange de spectinomycine (300 mg/I) de DKN (0,5 ppm). Two independent sets of bombardment of tobacco leaves with pCLT111, CLT111- 1 and CLT111-2 were performed using respectively as selection agents is only spectinomycin (500 mg / l) or a mixture of spectinomycin (300 mg / I ) of DKN (0.5 ppm).

Exemple 3: Identification des lignées transplastomiaues CLT111 et CLT129. Example 3: Identification of lines and transplastomiaues CLT111 CLT129.

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Le criblage des lignées transplastomiques parmi les événements tolérants à la spectinomycine et à la spectinomycine et DKN a été réalisé par PCR à l'aide d'amorces spécifiques permettant de détecter l'intégration des cassettes d'expression dans le plastome, à l'aide d'une amorce qui s'hybride dans le génome plastidial natif, adjacent au point d'intégration et d'une amorce qui s'hybride sur l'un des transgènes (hppd ou aadA). Screening the transplastomic lines among the tolerant events spectinomycin and spectinomycin and DKN was created by PCR using specific primers to detect the integration of expression cassettes into the plastome, using a primer that hybridizes in the native plastid genome, adjacent to the point of integration and a primer which hybridizes to one of the transgenes (HPPD or aadA). Nous avons choisi les amorces suivantes: ORBCL52 (5'-atgtcaccacaaacagagactaaagc-3') (SEQ ID No 9) et RHPP1 (5'-gagccgatcttcgagatca-3') (SEQ ID No 10)qui s'hybrident respectivement sur le plastome au niveau du gène rbcL (nucléotides 57595 à 57620, à l'extérieur de RRHG) et sur le gène hppd. We chose the following primers: ORBCL52 (5'-atgtcaccacaaacagagactaaagc-3 ') (SEQ ID No. 9) and RHPP1 (5'-gagccgatcttcgagatca-3') (SEQ ID No. 10) that hybridize respectively at the plastome rbcL gene (nucleotide 57595 to 57620, outside RRHG) and the HPPD gene. Un amplicon de 2026 pb sera caractéristique d'un événement transplatomique CLT111, tandis qu'un amplicon de 3106 pb est attendu pour les événements transplastomiques CLT129. A 2026 bp amplicon will feature a transplatomique CLT111 event, while a 3106 bp amplicon is expected in the CLT129 transplastomic events. Nous avons constaté que 15% des cals régénérés sur spectinomycine au cours de la transformation CLT111-1 se sont révélés transplastomiques, tandis qu'au cours de la transformation CLT111-2, 28% des cals se développant sur la double sélection spectinomycine+DKN étaient transplastomiques. We found that 15% of callus regenerated on spectinomycin in the CLT111-1 transformation proved transplastomic, while during the CLT111-2 transformation, 28% of callus developing on the double selection spectinomycin were DKN + transplastomic. Nous en concluons qu'une double sélection antibiotique+herbicide favorise une augmentation de la fréquence de transformation plastidiale et une diminution de faux positifs par comparaison avec une sélection simple sur antibiotique. We conclude that a double antibiotic selection + herbicide promotes an increase in the plastid transformation frequency and reduced false positives compared with a simple selection of antibiotic.

La nature transplastoniique des différents événements de transformation a été confirmée en effectuant une analyse de type Southern Blot sur l'ADN de ces événements et de leur descendance. Nature transplastoniique different transformation events was confirmed by performing Southern blot type analysis on the DNA of these events and their offspring. L'ADN de feuilles de tabacs issus des transformations avec les plasmides pCLT111 et pCLT129 a été extrait et digéré à l'aide des enzymes de restriction Ncol et Hind/II. The DNA of tobacco leaves derived from transformations with plasmids pCLT111 and pCLT129 was extracted and digested with the restriction enzymes NcoI and Hind / II. L'ADN de tabac sauvage (WT) a été extrait et digéré à l'aide des mêmes enzymes. The DNA of wild tobacco (WT) was extracted and digested with the same enzymes.

A l'exception de la lignée 4 issue de la transformation CLT111-1, toutes les lignées analysées présentent les profils attendus : la sonde HPPD révèle la présence d'une bande à 1298 pb dans le cas des lignées CLT111 et à 6074 pb dans le cas des lignées CLT129, aucune bande n'étant présente sur le contrôle non transformé. With the exception of the line 4 after the CLT111-1 processing, all the analyzed lines exhibit the expected profiles: The HPPD probe revealed the presence of a band at 1298 bp in the case of CLT111 lines and 6074 bp in for lines CLT129, no band is present on the untransformed control. La sonde RRHG révèle la bande à 6429 pb correspondant au plastome sauvage sur le contrôle non transformé, et une bande majoritaire à 2085 pb dans les événements CLT111, 1863 pb dans les événements CLT129, caractéristique de l'intégration du transgène entre RRHG et RRHD. The RRHG probe reveals the band to 6429 bp corresponding to the wild plastome on the untransformed control, and a major band at 2085 bp in the CLT111 events 1863 bp in the CLT129 events characteristic of transgene integration between RRHG and RRHD. Toutefois, la présence d'une bande de faible intensité à 6429 pb indique qu'une partie des plastomes n'ont pas intégré le transgène: toutes les lignées sont dans un état dit d'hétéroplasmie. However, the presence of a low intensity band at 6429 bp indicates that part of the plastome have not integrated the transgene All lines are in a state of hétéroplasmie said.

La transmission des transgènes à la descendance de ces événements transplastomiques a été vérifiée en testant la présence du marqueur AADA par semis sur un milieu de germination contenant de la spectinomycine. The transmission of the transgene to offspring of these transplastomic events was verified by testing the presence of the ADAA marker planting on a germination medium containing spectinomycin. La résistance à l'antibiotique s'est The resistance to the antibiotic has

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retrouvée dans 100% des graines semées. found in 100% of sown seeds. L'analyse par southern blot de l'ADN des descendants révèle un profil strictement identique à celui des plantes régénérées. Southern blot analysis of DNA descendants reveals a strictly identical profile to that of the regenerated plants. En particulier, l'état héteroplasmique s'est transmis sans modification sensible du ratio plastome sauvage/plastome transformé, si on se fonde sur l'intensité relative des bandes à 2085 et 6429 pb (événements CLT-111), ou des bandes à 1863 et 6429 pb (événements CLT-129). In particular, the heteroplasmic state was transmitted without substantial modification of the plastome wild ratio / transformed plastome, if one is based on the relative intensity of the bands at 2085 and 6429 bp (CLT-111 events), or tapes to 1863 and 6429 bp (CLT-129 events).

L'uniformité du phénotype de ces plantes, toutes parfaitement insensibles à la spectinomycine, confirme aussi l'absence de variation du niveau d'expression entre les différentes lignées, un phénomène couramment observé en transformation nucléaire attribué à "l'effet de position". The uniformity of the phenotype of these plants, all perfectly insensitive to spectinomycin, also confirms the lack of variation in the expression level between the various lines, a phenomenon commonly observed in nuclear transformation attributed to "position effect".

Exemple 4: Tolérance des lignées transplastomiques à un herbicide inhibiteur de l'hppd Example 4: Tolerance transplastomic lines to a HPPD inhibitor herbicide of the
Cinq cent graines environ des graines T1 issues des événements de transformation CLT111-1 ou CLT111-2 sont semées sur des milieux de germination MS à demi force en présence de DKN à différentes concentrations (1,5, 10,20, 40 ppm). Five percent seeds of T1 seed derived from CLT111-1 and CLT111-2 transformation events were sown on MS germination media at half strength in the presence of DKN at different concentrations (1.5, 10.20, 40 ppm). Des graines de tabac sauvage et la lignée pCH43-4 ont été semées sur ces différents milieux pour permettre une comparaison de tolérance au DKN entre les événements transplastomiques, nucléaires et sauvages. wild tobacco seeds and pCH43-4 line were sown on these different environments to enable comparison of tolerance between DKN transplastomic events, nuclear and wild.

L'événement pCH43-4 provient d'une transformation nucléaire avec un gène chimère comprenant : un promoteur CsVMV (W097/48819) défini dans la présente demande par l'identifiant de séquence SEQ ID No 11, un peptide transit (OTP) (EP 508 909), une séquence codante codant pour une HPPD (SEQ ID No 1 de la demande de brevet WO 96/38567) et le terminateur nos d'Agrobactérium tumefaciens, présents dans le vecteur pCH43D (Figure 3). The pCH43-4 event is from a nuclear transformation with a chimeric gene comprising: a CsVMV promoter (W097 / 48819) defined in the present application by the identifier of sequence SEQ ID No. 11, a transit peptide (OTP) (EP 508 909), a coding sequence encoding an HPPD (SEQ ID NO: 1 of patent application WO 96/38567) and the nos terminator of Agrobacterium tumefaciens, pCH43D present in the vector (Figure 3). L'HPPD produite dans le cytosol est ensuite adressée dans les plastes grâce à au peptide de transit. The HPPD produced in the cytosol is then sent in plastids through the transit peptide. L'événement pCH43-4 présente un excellent niveau de tolérance à l'isoxaflutole (5-cyclopropylisoxazole-4yl é mésyl-4-trifluoprométhylphényl cétone ou IFT) aux doses agronomiques. The pCH43-4 event presents an excellent level of tolerance to isoxaflutole (5-ed cyclopropylisoxazole-4-yl-4-mesyl trifluoprométhylphényl ketone or IFT) to agronomic doses.

Toutes les plantes issues de ces graines se sont développées normalement jusqu'à une dose de 10 ppm 2-cyclopropyl-3-2-mésyl-4-trifluorométhylphenyl-3-oxopropanenitrile (DKN), alors qu'à cette dose, les plantes de la lignée nucléaire pCH43-4 présentent d'importants symptômes de phytotoxicité. All plants from these seeds developed normally up to a dose of 10 ppm 2-cyclopropyl-3-2-mesyl-4-trifluoromethylphenyl-3-oxopropanenitrile (DKN), whereas this dose, plant pCH43-4 the nuclear line have significant symptoms of phytotoxicity. De plus, certaines lignées CLT111 ont montré une tolérance parfaite jusqu'à 40 ppm DKN. In addition, some CLT111 lines showed perfect tolerance up to 40 ppm DKN.

Des tests de tolérance à l'IFT en traitement de pré-émergence ont aussi réalisés en serre. tolerance tests at IFT in treating pre-emergence also conducted in a greenhouse. Environ 500 graines T1 des événements CLT111 ont été semées dans des barquettes de vermiculite puis traités par pulvérisation d'une solution d'IFT à 200 g/ha. 500 CLT111 events of T1 seed was sown in vermiculite trays and sprayed with a solution of IFT to 200 g / ha. Dans ces In these

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conditions, le contrôle pCH43-4 présente de fort symptomes de phytotoxicité , tandis que plusieurs événements transplastomiques n'ont présenté aucun symptôme. conditions, control pCH43-4 present strong symptoms of phytotoxicity, while several transplastomic events showed no symptoms.

Exemple 5 : Comparaison de l'efficacité des promoteurs Prrn et PpbsA Afin de vérifier l'effet de la séquence promotrice placée en amont du gène hppd sur le niveau de tolérance herbicide des plantes transplastomiques, l'expérience suivante a été réalisée. Example 5: Comparison of the effectiveness of Prrn promoters and PpbsA order to verify the effect of the promoter sequence located upstream of the HPPD gene on the level of herbicide tolerance transplastomic plants, the following experiment was performed.

Des morceaux de feuilles issues des événements CLT111 et CLT129 ont été placés sur un milieu de régénérations contenant 1 ppm DKN. Pieces of leaves from CLT111 CLT129 events and were placed on a regeneration medium containing 1 ppm DKN. A cette dose, toutes les pousses régénéres à partir de l'évenement CLT111 sont vertes au contraire des pousses CLT129 qui ne sont pas toutes tolérantes au DKN (mélange de pousses vertes et blanches pour un même événement). At this dose, all regenerated shoots from the event CLT111 are green instead of CLT129 shoots that not all tolerant DKN (mixture of white and green shoots for the same event).

On en conclut que l'utilisation d'un promoteur spécifique des chloroplastes ou spécifique des chloroplastes et inductble par la lumière tel que PpsbA est particulièrement appropriée à l'élaboration de plantes tolérantes aux inhibiteurs de l'HPPD. It is concluded that the use of a specific promoter or chloroplast specific chloroplast and inductble by light such as PpsbA is particularly suitable for the development of plants tolerant to HPPD inhibitors.

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Claims (47)

  1. REVENDICATIONS 1.Gène chimère comprenant au moins un gène chimère élémentaire lequel comprend, liés entre eux de manière fonctionnelle dans le sens de la transcription : - une séquence de régulation promotrice opérationnelle dans les plastes, - une séquence codant pour une hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase (HPPD), - un terminateur fonctionnel dans les plastes de cellules végétales CLAIMS 1.A gene chimeric gene comprising at least one elementary chimera which comprises, interconnected functionally in the direction of transcription: - a functioning promoter regulatory sequence in the plastids, - a sequence encoding a pyruvate hydroxyphenyl dioxygenase (HPPD ), - a terminator functional in the plastids of plant cells
  2. 2. Gène chimère selon la revendication 1 caractérisée en ce que la séquence de régulation promotrice permet une expression constitutive. 2. A gene construct according to claim 1 characterized in that the promoter regulatory sequence which allows constitutive expression.
  3. 3. Gène chimère selon la revendication 1 caractérisée en ce que la séquence de régulation promotrice permet une expression dans les tissus photosynthétiques. 3. A gene construct according to claim 1 characterized in that the promoter regulatory sequence allows expression in photosynthetic tissues.
  4. 4. Gène chimère selon la revendication 3 caractérisé en en ce que la séquence promotrice est représentée par le promoteur PpsbA. 4. A gene construct according to claim 3, characterized in in that the promoter sequence is represented by the PpsbA promoter.
  5. 5. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que la séquence codante pour une HPPD est choisie parmi les HPPD natives, mutées ou chimères. 5. A gene construct according to any one of claims 1 to 4 characterized in that the coding sequence for an HPPD is selected from native HPPD mutated or chimeric.
  6. 6. Gène chimère selon les revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la séquence codante codant pour une HPPD est issue de Pseudomonas sp. 6. A gene construct according to claims 1 to 4, characterized in that the coding sequence encoding an HPPD is derived from Pseudomonas sp.
  7. 7. Gène chimère selon les revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la séquence codante codant pour une HPPD est issue de Pseudomonas fluorescens. 7. A gene construct according to claims 1 to 4, characterized in that the coding sequence encoding an HPPD is from Pseudomonas fluorescens.
  8. 8. Gène chimère selon les revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la séquence codante codant pour une HPPD est issue de Synechocystis. 8. A gene construct according to claims 1 to 4, characterized in that the coding sequence encoding an HPPD is derived from Synechocystis.
  9. 9. Gène chimère selon les revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la séquence codante codant pour une HPPD est d'origine végétale. 9. A gene construct according to claims 1 to 4, characterized in that the coding sequence encoding an HPPD is of plant origin.
  10. 10. Gène chimère selon la revendication 9, caractérisée en ce que la séquence codante codant pour une HPPD est issue d'Arabidopsis. 10. A gene construct according to claim 9, characterized in that the coding sequence encoding an HPPD originates from Arabidopsis.
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  11. 11 Gène chimère selon la revendication 9, caractérisée en ce que la séquence codante codant pour une HPPD est issue d'une Ombellifère. 11 A gene construct according to claim 9, characterized in that the coding sequence encoding an HPPD is derived from a umbellifer.
  12. 12. Gène chimère selon la revendication 11, caractérisée en ce que la séquence codante codant pour une HPPD est issue de Daucus carotta. 12. A gene construct according to claim 11, characterized in that the coding sequence encoding an HPPD is derived from Daucus carotta.
  13. 13. Gène chimère selon la revendication 11, caractérisée en ce que séquence codante codant pour une HPPD est issue de Zea maïs. 13. A gene construct according to claim 11, characterized in that coding sequence encoding an HPPD is derived from Zea maize.
  14. 14. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 13 comprenant en outre un deuxième gène chimère élémentaire comprenant, liés entre eux de manière opérationnelle dans le sens de la transcription : - une séquence de régulation promotrice opérationnelle dans les plastes, - une séquence codant pour un marqueur de sélection, - un terminateur fonctionnel dans les plastes de cellules végétales. 14. A chimeric gene according to one of claims 1 to 13 further comprising a second elemental chimeric gene comprising interconnected operatively in the direction of transcription: - a functioning promoter regulatory sequence in the plastids, - a sequence encoding a selectable marker - a terminator functional in the plastids of plant cells.
  15. 15. Gène chimère selon la revendication 14 caractérisée en ce que la séquence de régulation promotrice du deuxième gène chimère permet une expression constitutive. 15. A gene construct according to claim 14 characterized in that the promoter regulatory sequence of the second chimeric gene allows constitutive expression.
  16. 16. Gène chimère selon la revendication 15 caractérisé en ce que la séquence promotrice est représenté par le promoteur Prrn, 16. A gene construct according to claim 15 characterized in that the promoter sequence is represented by the Prrn promoter,
  17. 17. Gène chimère selon la revendication 14, caractérisée en ce que la séquence codante code pour une amino glycoside 3"-adényltransférase. 17. A gene construct according to claim 14, characterized in that the coding sequence encodes an amino glycoside 3 "-adényltransférase.
  18. 18. Vecteur de transformation adapté à la transformation des plastes de plante caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux séquences homologues d'une région du plastome de la plante à transformer, lesdites séquences homologues encadrant au moins un gène chimère selon les revendications 1 à 13. 18. Transformation vector suitable for the transformation of plant plastids, characterized in that it comprises at least two sequences homologous to a plastome region of the plant to be transformed, said homologous sequences flanking at least one chimeric gene according to claim 1 13.
  19. 19. Vecteur de transformation adapté à la transformation des plastes de plante caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux séquences homologues d'une région du plastome de la plante à transformer, lesdites séquences homologues encadrant au moins gène chimère selon les revendications 14 à 17. 19. Transformation vector suitable for the transformation of plant plastids, characterized in that it comprises at least two sequences homologous to a plastome region of the plant to be transformed, said homologous sequences flanking at least chimeric gene according to claims 14 to 17.
  20. 20. Vecteur selon l'une des revendications 18 ou 19, caractérisé en ce que les deux séquences homologues d'une région du plastome de la plante à transformer 20. Vector according to one of claims 18 or 19, characterized in that the two homologous sequences of a plastome region of the plant to be transformed
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    correspondent à des séquences contigües permettant l'intégration du gène chimère dans une région intergénique de plastome. correspond to contiguous sequences allowing the integration of the chimeric gene into an intergenic region of the plastome.
  21. 21. Vecteur selon la revendication 20, caractérisé en ce que ladite région correspond à la région de l'opéron des ARN ribosomiques du plastome. 21. The vector of claim 20, characterized in that said region corresponds to the region of the operon of ribosomal RNA of the plastome.
  22. 22. Vecteur selon la revendication 20, caractérisé en ce que l'une des deux séquences homologues comprend l'extrémité 3' du gène rbcL codant pour la large sous-unité de la 22. The vector of claim 20, characterized in that one of the two homologous sequences comprises the 3 'end of the rbcL gene encoding the large subunit of the
    Rubisco, et que l'autre séquence homologue comprend l'extrémité du gène 5' accD, codant pour une sous unité de l'acétyl-CoA-carboxylase. Rubisco, and the other homologous sequence comprises the end of the gene 5 'accD, encoding a subunit of acetyl-CoA carboxylase.
  23. 23. Vecteur selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'une des deux séquences homologues comprend l'extrémité 3' du gène rbcL codant pour la large sous-unité de la 23. The vector of claim 22, characterized in that one of the two homologous sequences comprises the 3 'end of the rbcL gene encoding the large subunit of the
    Rubisco correspondant aux nucléotides 57755 à 59297 du plastome de N. tabacum, cv. Rubisco corresponding to nucleotides 57755 to 59297 of the plastome of N. tabacum, cv.
    Havana. Havana.
    Petit Havana et que l'autre séquence homologue comprend l'extrémité 5' du gène accD correspondant aux nucléotides 59298 à 60526 du plastome de N. tabacum, cv. Petit Havana, and the other homologous sequence comprises the 5 'end of the accD gene corresponding to nucleotides 59298 to 60526 of the plastome of N. tabacum, cv. Petit Small
  24. 24. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques comprenant au moins les étapes suivantes : transformation de cellules végétales avec un vecteur adapté à la transformation des plastes, - sélection des cellules comprenant les plastes transformés, - régénération de plantes transplastomiques à partir des cellules transformées, caractérisé en ce que le vecteur adapté à la transformation des plastes est un vecteur selon l'une des revendications 18,20 à 23. 24. A method of obtaining transplastomic plants comprising at least the steps of: transforming plant cells with a vector suitable for the transformation of plastids, - selection of the cells comprising the transformed plastids, - regeneration of transplastomic plants from the transformed cells, characterized in that the vector suitable for the transformation of plastids is a vector according to one of claims from 18.20 to 23.
  25. 25. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques selon la revendication 24 caractérisé en ce que la transformation des cellules est effectuée par biolistique. 25. A method of obtaining transplastomic plants according to claim 24 characterized in that the transformation of cells is performed by biolistics.
  26. 26. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques comprenant au moins les étapes suivantes : - transformation de cellules végétales avec un vecteur adapté à la transformation des plastes, - sélection des cellules comprenant les plastes transformés, régénération de plantes transplastomiques à partir des cellules transformées, 26. A method of obtaining transplastomic plants comprising at least the steps of: - transforming plant cells with a vector suitable for the transformation of plastids, - selection of the cells comprising the transformed plastids, regeneration of transplastomic plants from the transformed cells,
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    caractérisé en ce que le vecteur adapté à la transformation des plastes est un vecteur selon l'une des revendications 19 à 23. characterized in that the vector suitable for the transformation of plastids is a vector according to one of claims 19 to 23.
  27. 27. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques selon la revendication 26 caractérisé en ce que la transformation des cellules est effectuée par biolistique. 27. A method of obtaining transplastomic plants according to claim 26 characterized in that the transformation of cells is performed by biolistics.
  28. 28. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques selon l'une des revendications 24 à 27 caractérisé en ce que la sélection des plantes transformées est réalisée à l'aide d'un inhibiteur de l'HPPD. 28. A method of obtaining transplastomic plants according to one of claims 24 to 27 characterized in that the selection of transformed plants is performed using a HPPD inhibitor.
  29. 29. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques selon l'une des revendications 26 ou 29. A method of obtaining transplastomic plants according to one of claims 26 or
    27 dans lequel la sélection des cellules transformées est réalisée avec un inhibiteur de l'HPPD associé à un autre agent de sélection. 27 wherein the selection of transformed cells is carried out with an HPPD inhibitor in combination with another selection agent.
  30. 30. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques selon la revendication 29 dans lequel on applique de façon simultanée un inhibiteur de l'HPPD et de la spectinomycine. 30. A method of obtaining transplastomic plants according to claim 29 wherein simultaneously applying a HPPD inhibitor and spectinomycin.
  31. 31. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques selon la revendication 29 dans lequel on applique de façon simultanée un inhibiteur de l'HPPD et de la streptomycine. 31. A method of obtaining transplastomic plants according to claim 29 wherein simultaneously applying a HPPD inhibitor and streptomycin.
  32. 32. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques selon la revendication 29 dans lequel on applique de façon simultanée un inhibiteur de l'HPPD, de la spectinomycine et de la streptomycine. 32. A method of obtaining transplastomic plants according to claim 29 wherein simultaneously applying an HPPD inhibitor, spectinomycin and streptomycin.
  33. 33. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques selon l'une des revendications 26 ou 33. A method of obtaining transplastomic plants according to one of claims 26 or
    27 comprenant en outre une étape de sélection supplémentaire effectuée sur les plantes régénérées. 27 further comprising a further selection step carried out on the regenerated plants.
  34. 34. Procédé d'obtention de plantes transplastomiques selon la revendication 33 caractérisé en ce que l'étape de sélection supplémentaire consiste en l'application d'un inhibiteur de l'HPPD. 34. A method of obtaining transplastomic plants according to claim 33 characterized in that the additional selection step consists in applying an HPPD inhibitor.
  35. 35. Cellule végétale transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un gène chimère selon l'une des revendications 1 ou 14. 35. transplastomic plant cell tolerant to herbicides having HPPD as target, characterized in that it comprises at least one chimeric gene according to one of claims 1 or 14.
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  36. 36. Plante transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD, caractérisée en ce qu'elle est régénérée à partir des cellules transformées selon la revendication 35. 36. transplastomic plant tolerant to herbicides having HPPD as target, characterized in that it is regenerated from the transformed cells according to claim 35.
  37. 37. Plante transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD comprenant un gène chimère selon la revendication 1. 37. transplastomic plant tolerant to herbicides having HPPD as target comprising a chimeric gene according to claim 1.
  38. 38. Plante transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD comprenant un gène chimère selon la revendication 14. 38. transplastomic plant tolerant to herbicides having HPPD as target comprising a chimeric gene of claim 14.
  39. 39. Plante transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD selon les revendications 36 à 38 caractérisée en ce que la plante est hétéroplasmique. 39. transplastomic plant tolerant to herbicides having HPPD as the target according to claims 36-38 characterized in that the plant is heteroplasmic.
  40. 40. Plante transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD selon les revendications 36 à 38 caractérisée en ce que la plante est homoplasmique. 40. transplastomic plant tolerant to herbicides having HPPD as the target according to claims 36 to 38 characterized in that the plant is homoplasmic.
  41. 41. Plante transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD selon l'une quelconque des revendications 36 à 40 caractérisée en ce qu'elle est du type monocotylédones telles que les céréales, la canne à sucre, le riz et le maïs ou dicotylédones comine le tabac, le soja, le colza, le coton, la betterave, le trèfle. 41. transplastomic plant tolerant to herbicides having HPPD as target according to any one of claims 36-40 characterized in that it is of the type monocotyledons, such as cereals, sugar cane, rice and maize or dicot Comine tobacco, soybean, canola, cotton, beets, clover.
  42. 42. Graine de plante transplastomique tolérante aux herbicides ayant pour cible l'HPPD selon l'une des revendications 36 à 41. 42. Seed transplastomic plant tolerant to herbicides having HPPD as the target according to one of claims 36-41.
  43. 43. Procédé de désherbage sélectif de plantes à l'aide d'un herbicide inhibiteur de l'HPPD, caractérisé en ce qu'on applique cet herbicide sur des plantes selon l'une des revendications 36 à 41. 43. A method for selective weeding of plants with a herbicidal HPPD inhibitor, characterized in that this herbicide is applied to plants according to any of claims 36-41.
  44. 44. Procédé de contrôle des mauvaises herbes dans une surface d'un champ comprenant des graines selon la revendication 42 ou des plantes transplastomiques selon l'une des revendications 36 à 41, caractérisé en ce qu'il consiste à appliquer dans la dite surface du champ une dose toxique pour les dites mauvaises herbes d'un herbicide inhibiteur d'HPPD, sans toutefois affecter de manière substantielle les graines ou plantes transformée avec le dit gène chimère selon l'une des renvendications 1 ou 14. 44. weed control method in an area of ​​a field comprising seeds according to claim 42 or transplastomic plants according to one of claims 36 to 41, characterized in that it consists in applying to the said area of ​​the field a toxic dose for said weeds, of an HPPD-inhibiting herbicide, without however substantially affecting the seeds or plants transformed with the said chimeric gene according to one of renvendications 1 or 14.
  45. 45. Procédé de culture des plantes transplastomiques selon l'une des revendications 36 à 45. A method for cultivation of transplastomic plants according to one of claims 36 to
    41, caractérisé en ce qu'il consiste à semer les graines des dites plantes dans une 41, characterized in that it consists in planting seeds of said plants in an
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    surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface du dit champ une dose toxique pour les mauvaises herbes d'un herbicide ayant pour cible l'HPPD en cas de présence de mauvaises herbes, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées. surface of a field suitable for growing said plants, applying to said area of ​​said field a dose toxic to weeds of a herbicide having HPPD as the target in case of presence of weeds, without affecting substantially said seeds or said transformed plants, then harvesting the plants grown when they reach the desired maturity and optionally in separating the seeds from the harvested plants.
  46. 46. Procédé selon l'une des revendications 44 ou 45, caractérisé en ce que l'application de l'herbicide ayant pour cible l'HPPD est faite en présemis, en prélevée et/ou en postlevée de la culture. 46. ​​A method according to one of claims 44 or 45, characterized in that the application of herbicide having HPPD as the target is made of pre-plant, preemergence and / or postemergence culture.
  47. 47. Procédé selon l'une des revendications 43 à 46, caractérisé en ce que les herbicides inhibiteurs d'HPPD sont choisis parmi les isoxazoles en particulier l'isoxaflutole, les dicétonitriles en particulier la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4-CF3 phényl) propane-1,3-dione et la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4-2,3 CI2 phényl) propane- 47. A method according to one of claims 43 to 46, characterized in that the HPPD-inhibiting herbicides are selected from isoxazoles, in particular isoxaflutole, diketonitriles, in particular 2-cyano-3-cyclopropyl-1- ( S02 2-CH3-4-CF3 phenyl) propane-1,3-dione and 2-cyano-3-cyclopropyl-1- (2-S02 CH3-4-2,3 Cl2 phenyl) propane-
    1,3-dione, les tricétones, en particulier la sulcotrione ou la mésotrione, ou les pyrazolinates. 1,3-dione, triketones, in particular sulcotrione or mesotrione, or pyrazolinates.
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