CA2309880A1

CA2309880A1 - Chimera gene having a light dependent promoter providing tolerance to hppd inhibitors

Info

Publication number: CA2309880A1
Application number: CA002309880A
Authority: CA
Inventors: Luc Reygnier; Alain Sailland
Original assignee: Individual
Current assignee: Bayer CropScience SA
Priority date: 1997-11-17
Filing date: 1998-11-13
Publication date: 1999-05-27
Also published as: AR017630A1; FR2771104A1; ID21668A; FR2771104B1; WO1999025842A1; MA24818A1; AU1162899A; EP1032681A1; BR9815628A; AU747634B2; CO4950591A1; ZA9810498B

Abstract

The invention concerns a chimera gene comprising at least an elementary chimera gene including, in the transcriptional direction, elements regulating in 5' necessary for its transcription into plants, at least one heterologous coding portion comprising a sequence coding for an enzyme providing plants with tolerance to herbicides inhibitors of HPPD and at least one terminator or polyadenylation regulating sequence, wherein the elements regulating in 5' ensure the transcription of the elementary chimera gene at the level of chlorophyllian tissues. The invention also concerns the transformation of plants and the plants transformed with said chimera gene. It further concerns a method for growing transformed plants which consists in applying a HPPD inhibitor for controlling weeds.

Description

Gène chimère avant un promoteur lumière dépendant conférant la tolérance aux inhibiteurs de l'HPPD
La présente invention a pour objet un gène chimère ayant un promoteur lumière dépendant lié de manière fonctionnelle à un gène codant pour une HPPD {hydroxy phényl pyruvate dioxygénase), conférant une tolérance améliorée aux herbicides inhibiteurs de fHPPD à une cellule végétale et une plante normalement sensibles.
L'invention concerne également les cellules végétales et palntes transformées avec le gène chimère selon l' invention, un procédé de transformation des cellules végétales et des plantes et un procédé de culture des plantes transformées dans lequel on applique un herbicide inhibiteur de l'HPPD pour éliminer les mauvaises herbes.
Les herbicides ayant pour cible l'HPPD sont notamment les isoxazoles (EP 418 175, EP 470 856, EP 487 352, EP 527 036, EP 560 482, EP 682 659, US 5 424 276) en particulier l'isoxaflutole, herbicide sélectif du maïs, les dicétonitriles (EP
496 630, EP
496 631), en particulier la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4-CF3 phényl) propane-1,3-dione et la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4-2,3 Cl2 phényl) propane-1, 3-dione, les tricétones (EP 625 505, EP 625 508, US 5,506,195), en particulier la sulcotrione ou encore les pyrazolinates. Des gènes codant pour une HPPD
conférant une tolérance à ces herbicides et les plantes transgéniques contenant ce gène montrent une tolérance significative aux dits herbicides sont décrits dans la demande de brevet WO 96/38567 et dans la demande de brevet FR 97 14264 déposée le 7 novembre 1997, dont le contenu est ici inclus par référence.
Jusqu'à maintenant tous les essais effectués pour conférer une bonne tolérance aux inhibiteurs de fHPPD font été en utilisant des promoteurs « constitutifs »
ou permettant une expression dans toutes sortes de tissus végétaux, tissus racinaires, tissus foliaires, zones en croissance plus ou moins rapides. Pour ce faire des plantes dicotylédones comme le tabac, Arabidopsis thaliana, le colza et le soja ont été
transformées soit avec:
- le gène chimère pRP T
Promoteur double histone I TEV I Région codante de l'HPPD I Terminateur nos - le cène chimère pRP V
Promoteur double histone I TEV I OTP I Réeion codante de l'HPPD I Terminateur nos Ces essais nous ont permis de confirmar que ce type d'expression permet dans les dicotylédones d'obtenir une très bonne tolérance. Chimeric gene before a dependent light promoter conferring tolerance to HPPD inhibitors The subject of the present invention is a chimeric gene having a light promoter dependent operably linked to a gene coding for HPPD {hydroxy phenyl pyruvate dioxygenase), providing improved tolerance to herbicides fHPPD inhibitors to a plant cell and a plant normally sensitive.
The invention also relates to transformed plant cells and palntes.
with the chimeric gene according to the invention, a process for transforming cells plants and plants and a method for growing transformed plants in which apply a HPPD inhibitor herbicide for weed control.
Herbicides targeting HPPD are in particular isoxazoles (EP 418 175, EP 470 856, EP 487 352, EP 527 036, EP 560 482, EP 682 659, US 5 424 276) in in particular isoxaflutole, a selective herbicide for corn, diketonitriles (EP
496 630, EP
496 631), in particular 2-cyano-3-cyclopropyl-1- (2-S02 CH3-4-CF3 phenyl) propane-1,3-dione and 2-cyano-3-cyclopropyl-1- (2-S02 CH3-4-2,3 Cl2 phenyl) propane-1, 3-dione, triketones (EP 625 505, EP 625 508, US 5,506,195), in especially sulcotrione or pyrazolinates. Genes encoding an HPPD
imparting tolerance to these herbicides and transgenic plants containing this gene show significant tolerance to said herbicides are described in the request WO 96/38567 and in patent application FR 97 14264 filed on 7 November 1997, the content of which is included here by reference.
Until now all the tests carried out to confer a good tolerance to fHPPD inhibitors have been using "constitutive" promoters or allowing expression in all kinds of plant tissue, tissue root, tissue leaves, areas growing more or less quickly. To do this plants dicots like tobacco, Arabidopsis thaliana, rapeseed and soybeans have summer transformed either with:
- the pRP T chimeric gene Double histone promoter I TEV I Coding region of HPPD I Terminator nos - the chimney supper pRP V
Double histone promoter I TEV I OTP I Coding meeting of HPPD I Terminator our These tests allowed us to confirm that this type of expression allows in the broadleaf weeds get very good tolerance.

2 Des plantes monocotylédones comme le mâis ont également été transformées avec le gène chimère pRPA-RD-1004 (demande de brevet PCT/FR97/01256 déposée le iuillet 1997):
promoteur histoneIntron OTP Rgion codante de Terminateur 1 de l'HPPD nos H3C4 de mas Adhl On a maintenant trouvé qu'on pouvait conférer à une cellule végétale et à une 5 plante une tolérance herbicide améliorée par sur-expression de fHPPD par l'intermédiaire d'un promoteur " lumière dépendant " ( appelé ci-après promoteur LD).
L'utilisation de ces promoteurs LD conduit à l'expression du gène chimère dans les tissus chlorophylliens ou " tissus verts " sans aucune expression dans les tissus non chlorophylliens ou une expression très faible dans les tissus non chlorophylliens comme 10 les tissus racinaires, une telle expression étant suffisante pour améliorer la tolérance des plantes transformées aux herbicides inhibiteurs de l'HPPD.
La présente invention a donc d'abord pour objet un gène chimère comprenant au moins un gène chimère élémentaire contenant , dans le sens de la transcription, des éléments de régulation en S' nécessaires à sa transcription dans les plantes, au moins une partie codante hétérologue comprenant une séquence codante codant pour une enzyme conférant aux plantes la tolérance aux herbicides inhibiteurs de l'HPPD
et au moins une séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, les éléments de régulation en 5' assurant la transcription du gène chimère élémentaire au niveau des tissus chlorophylliens, les dits éléments de régulations en 5' comprenant de préférence au moins une séquence de régulation promotrice de type promoteur LD.
Par « promoteur LD », on entend selon l'invention tout promoteur de gène codant pour des peptides dont la transcription est induite par la lumière qui est fonctionnel comme promoteur dans les cellules végétales. Ces promoteurs LD
peuvent être d'origine bactérienne, virale ou végétale. De tels promoteurs sont notamment décrits par Terzaghi & coll. (Light-regulated transcription, Annu. Rev. Plant Physiol.
Plant Mol. Biol., 1995, 46:445-474) dont le contenu est incorporé ici par référence.
Comme promoteur LD ûtile selon l'invention, on citera plus particulièrement le promoteur d'un gène de la petite sous unité de ribulose-biscarboxylase (rbcs) de plante, de la protéine « light-harvesting chlrorophyll a/b binding » (LHCP), de la plastocyanine (pet E~ et de la phénylalanine ammonia lyase (pal). De préférence on a recours à une séquence de régulation promotrice qui favorise la surexpression de la séquence codante dans les tissus chlorophylliens, telle que par exemple, celle comprenant au moins un fragment fonctionnel du promoteur de la petite sous unité de la rbcs (SSU) d'une plante, plus particulièrement isolé d'Heliauthus annuus tel que décrit dans lebrevet US
5,559,024. 2 Monocotyledonous plants such as mace have also been transformed with the chimeric gene pRPA-RD-1004 (patent application PCT / FR97 / 01256 filed on July 1997):
histoneIntron promoter OTP Terminator coding region 1 of the HPPD nos H3C4 from mas Adhl We have now found that we could confer on a plant cell and a 5 plants improved herbicide tolerance by over-expression of fHPPD by through a "light dependent" promoter (hereinafter called LD promoter).
The use of these LD promoters leads to the expression of the chimeric gene in the chlorophyll tissues or "green tissues" without any expression in the fabrics no chlorophyll or very weak expression in non-tissue chlorophyllians like 10 root tissue, such expression being sufficient to enhance tolerance of plants transformed with herbicides that inhibit HPPD.
The present invention therefore firstly relates to a chimeric gene comprising at least minus one elementary chimeric gene containing, in the sense of transcription, S 'regulatory elements necessary for its transcription in plants, at least a heterologous coding part comprising a coding sequence coding for a enzyme conferring on plants tolerance to HPPD inhibitor herbicides and at minus a terminating regulatory or polyadenylation sequence, the elements of 5 'regulation ensuring the transcription of the elementary chimeric gene at level of chlorophyll tissues, the so-called 5 'regulatory elements comprising preference at least one promoter regulatory sequence of the LD promoter type.
By "LD promoter" is meant according to the invention any gene promoter coding for peptides whose transcription is induced by light which East functional as a promoter in plant cells. These LD promoters can be of bacterial, viral or vegetable origin. Such promoters are notably described by Terzaghi & coll. (Light-regulated transcription, Annu. Rev. Plant Physiol.
Plant Mol. Biol., 1995, 46: 445-474) the content of which is incorporated herein by reference.
As useful LD promoter according to the invention, mention will be made more particularly of promoter of a gene for the small plant, ribulose-biscarboxylase (rbcs) subunit protein "Light-harvesting chlrorophyll a / b binding" (LHCP), plastocyanine (pet E ~ and phenylalanine ammonia lyase (pal). Preferably we use a sequence of promoter regulation which promotes overexpression of the coding sequence in the chlorophyll tissues, such as, for example, that comprising at least one fragment promoter of the small rbcs subunit (SSU) of a plant plus particularly isolated from Heliauthus annuus as described in the US patent 5,559,024.

3 ~VO 99/25842 PCT/FR98/02414 Parmi les promoteurs SSU, on peut également citer le promoteur SSU de pétunia décrit dans le brevet US 4,962,028.
Par fragment fonctionnel, on entend selon l'invention toute séquence d'ADN
issue de la séquence du promoteur SSU reproduisant la fonction de la séquence d'où elle est issue.
Selon un mode préférentiel de réalisation de l' invention, la séquence du promoteur SSU d'Heliauthus annuus comprend la séquence d'ADN représentée par l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID NO:1) ou une séquence homologue de ladite séquence. Plus préférentiellement, la séquence du promoteur SSU consiste en la séquence d'ADN représentée par l'identificateur de séquence n° 1.
Par " homologue ", on entend selon l'invention une séquence d'ADN présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence d'ADN de référence décrite par l'identificateur de séquence n° l, et reproduisant la fonction de cette séquence. Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation, ou encore en choisissant les oligonucléotides synthétiques pouvant être employés dans la préparation de ladite séquence par hybridation. De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de référence, de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %.
Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante monocotyledone et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes monocotyledones, des plantes monocotyledones ou des semences.
On entend par " plante " selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, plus particulièrement des plantes monocotyledones ou dicotyledones, de préférence de culture destinées ou non à
l'alimentation animale ou humaine, comme par exemple le blé, l'orge, l'avoine, le riz, le maïs, le sorgho, la canne à sucre, le soja, le colza, le coton, le tabac, la betterave ou encore desplantes de cultures maraichères ou florales.
Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice de type LD, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de trancription "enhancer", comme par exemple l'activateur de traduction du virus etch du tabac (TEV) décrit dans l'article de Carrington and Freed, 1990; J. Virol. 64: 1590-1597, ou des séquences codant pour des peptides de transit, soit simples, soit doubles, et dans ce cas éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est à dire comprenant, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à
localisation 3 ~ VO 99/25842 PCT / FR98 / 02414 Among the SSU promoters, we can also cite the SSU promoter of petunia describes in US patent 4,962,028.
By functional fragment is meant according to the invention any DNA sequence from the SSU promoter sequence reproducing the function of the sequence where she is from.
According to a preferred embodiment of the invention, the sequence of the SSU promoter of Heliauthus annuus comprises the DNA sequence represented by sequence identifier no.1 (SEQ ID NO: 1) or a sequence counterpart of said sequence. More preferably, the sequence of the SSU promoter consists of the DNA sequence represented by sequence identifier # 1.
By "homologous" is meant according to the invention a DNA sequence having one or more sequence changes from the DNA sequence of reference described by sequence identifier No. 1, and reproducing the function of this sequence. These modifications can be obtained according to the techniques usual of mutation, or by choosing the synthetic oligonucleotides that can to be employed in the preparation of said sequence by hybridization. So advantageous, the degree of homology will be at least 70% compared to the sequence of reference, preferably at least 80%, more preferably at least 90%.
By "plant cell" is meant according to the invention any cell originating from a monocotyledonous plant and which can constitute undifferentiated tissues such as calluses, differentiated tissues such as embryos, parts of plants monocotyledons, monocotyledonous plants or seeds.
The term "plant" according to the invention means any multicellular organism differentiated capable of photosynthesis, especially plants monocotyledons or dicotyledons, preferably cultured or not intended for animal or human food, such as wheat, barley, oats, rice, corn, sorghum, sugar cane, soy, rapeseed, cotton, tobacco, beet or still plants of vegetable or floral cultures.
According to the invention, it is also possible to use, in combination with the sequence of LD type promoter regulation, other regulatory sequences, which are located between the promoter and the coding sequence, such as activators of trancription "enhancer", such as the translation activator for the etch virus tobacco (VTE) described in the article by Carrington and Freed, 1990; J. Virol. 64: 1590-1597, or some sequences encoding transit peptides, either single or double, and in that case possibly separated by an intermediate sequence, i.e.
including, in the sense of transcription, a sequence coding for a transit peptide of a uncomfortable plant coding for a plastid localized enzyme, part of sequence of the mature N-terminal part of a plant gene encoding an enzyme to location

4 plastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, constituée d'une partie de séquence de la partie mature N terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à
localisation plastidiale, tels que décrit dans la demande demande de brevet EP
508 909.
Comme séquence codante pour une enzyme conférant aux plantes la tolérance aux herbicides inhibiteurs de l'HPPD, on peut notamment utiliser toutes celles connues pour conférer la tolérance de plantes à certains inhibiteurs de l'HPPD telles que les séquences codant pour une HPPD décrites dans la demande de brevet WO 96/38567 et dans la demande de brevet FR 9714264 déposée le 7 novembre 1997. Cette HPPD
peut être de toute nature.
Plus particulièrement cette séquence peut être d'origine bactérienne, telle que notamment le genre Pseudomonas ou encore d'origine végétale, telle que notamment de plante monocotylédone ou dicotylédone, notamment d'Arabidopsis ou d'ombellifères comme par exemple la carotte (Daucus carota). Elle peut être native ou sauvage ou éventuellement mutée tout en gardant fondamentalement une propriété de tolérance herbicide contre les inhibiteurs de fHPPD, tels que les herbicides de la famille des isoxazoles ou de celle des tricétones ou des pyrazinolates.
Comme séquence de régulation tenminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande européenne EP

317.
La présente invention concerne également un vecteur de clonage ou d'expression pour la transformation d'une cellule végétale ou d'une plante monocotyledone ou dicotyledone. Le vecteur selon l'invention comprend outre le gène chimère ci-dessus, au moins une origine de réplication. Ce vecteur peut être constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus, transformés par l'introduction du gène chimère selon l'invention. De tels vecteurs de transformation de cellules végétales et de plantes monocotyledones sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'invention est un plasmide.
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des cellules végétales par intégration d'au moins un fragment d'acide nucléique ou un gène chimère tels que définis ci-dessus, transformation qui peut être obtenue par tout moyen connu approprié avec le vecteur selon l'invention.
Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules ou des protoplastes avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d Agrobacterium rhizogenes. D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation, ou encore la précipitation directe au moyen de PEG.
L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la 4 plastidiale, then a sequence coding for a second transit peptide of a uncomfortable plant coding for a plastid localization enzyme, consisting of part of sequence of the mature N terminal part of a plant gene coding for a enzyme to plastid localization, as described in the patent application EP
508 909.
As coding sequence for an enzyme which confers tolerance on plants with herbicides that inhibit HPPD, it is possible in particular to use all those known to confer plant tolerance to certain HPPD inhibitors such as that sequences coding for an HPPD described in patent application WO 96/38567 and in patent application FR 9714264 filed on November 7, 1997. This HPPD
can be of any kind.
More particularly, this sequence can be of bacterial origin, such than in particular the genus Pseudomonas or of plant origin, such as especially from monocotyledonous or dicotyledonous plant, in particular Arabidopsis or umbelliferae such as the carrot (Daucus carota). She can be native or wild or possibly mutated while basically keeping a property of tolerance herbicide against fHPPD inhibitors, such as family of isoxazoles or that of triketones or pyrazinolates.
As a regulatory or polyadenylation sequence, it is possible to use any corresponding sequence of bacterial origin, such as example the terminator nos of Agrobacterium tumefaciens, or of plant origin, like example a histone terminator as described in the European application EP

317.
The present invention also relates to a cloning or expression vector for the transformation of a plant cell or a monocotyledonous plant or dicotyledonous. The vector according to the invention comprises, in addition to the chimeric gene ci-above, at minus an origin of replication. This vector can consist of a plasmid, a cosmid, a bacteriophage or a virus, transformed by the introduction of the gene chimera according to the invention. Such plant cell transformation vectors and of plants monocotyledons are well known to those skilled in the art and widely described in the literature. Preferably, the transformation vector of plant cells or plants according to the invention is a plasmid.
The invention also relates to a method for transforming cells.
plants by integration of at least one nucleic acid fragment or a gene chimera as defined above, transformation which can be obtained by any known means suitable with the vector according to the invention.
A series of methods involves bombarding cells or protoplasts with particles to which the DNA sequences are attached. Another series of methods consists in using a gene as a means of transferring into the plant chimera inserted into a Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens or Ri of Agrobacterium rhizogenes. Other methods can be used such as micro-injection or electroporation, or even direct precipitation using PEG.
Those skilled in the art will choose the appropriate method depending on the

5 nature de la cellule végétale ou de la plante.
La présente invention a encore pour objet les cellules végétales ou plantes, transformées tolérantes aux herbicides ayant pour cible l'HPPD et contenant au moins un gène chimère selon l'invention défini ci-dessus.
La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules transformées, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépende de la nature de l'espèce.
Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants: US
4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US
5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US
5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP
486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128.
La présente invention concerne également les plantes transformées issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées ci-dessus, ainsi que les graines de plantes transformées.
La présente invention concerne également un procédé de contrôle des mauvaises herbes dans une surface d'un champ comprenant des graines ou des plantes transformées avec le gène chimère selon l'invention, lequel procédé consiste à
appliquer dans la dite surface du champ une dose toxique pour les dites mauvaises herbes d'un herbicide ayant pour cible l'HPPD, sans toutefois affecter de manière substantielle les graines ou plantes transformée avec le dit gène chimère selon l' invention.
La présente invention concerne également un procédé de culture des plantes transformées selon l'invention avec un gène chimère selon l'invention lequel procédé
consiste à planter les graines des dites plantes transformées dans une surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface du dit champ une dose toxique pour les mauvaises herbes d'un herbicide ayant pour cible l'HPPD défini ci-dessus en cas de présence de mauvaises herbes, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsquelles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à
séparer les graines des plantes récoltées. 5 nature of the plant cell or plant.
The present invention also relates to plant cells or plants, herbicide tolerant transformants targeting HPPD and containing less a chimeric gene according to the invention defined above.
The present invention also relates to plants containing cells transformed, especially plants regenerated from cells transformed. The regeneration is obtained by any suitable process which depends on the nature of the species.
For plant cell transformation and regeneration processes of plants, in particular the following patents and patent applications: US
4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672,752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US
5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US
5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP
486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 and WO 95/06128.
The present invention also relates to the transformed plants derived from the cultivation and / or crossing of the above regenerated plants, as well as seeds transformed plants.
The present invention also relates to a method for controlling bad grasses in a surface of a field including seeds or plants transformed with the chimeric gene according to the invention, which method consists in apply in the said field surface a toxic dose for the said bad herbs of a herbicide targeting HPPD, without however affecting way substantial seeds or plants transformed with the so-called chimeric gene according to the invention.
The present invention also relates to a method for cultivating plants.
transformed according to the invention with a chimeric gene according to the invention which process consists in planting the seeds of said transformed plants in a surface of a field suitable for growing said plants, to be applied to said said surface field a weed toxic dose of a herbicide with the target the HPPD defined above in the presence of weeds, without affecting of substantially said seeds or said transformed plants, then to harvest the plants cultivated when they reach the desired maturity and possibly at separate the seeds from the harvested plants.

6 Dans les deux procédés ci-dessus, l'application de l'herbicide ayant pour cible l'HPPD peut être faite selon l'invention, tant en présemis, en prélevée qu'en postlevée de la culture.
Par herbicide au sens de la présente invention on entend une matière active herbicide seule ou associée à un additif qui modifie son efficacité comme par exemple un agent augmentant (activité (synergiste) ou limitant l'activité (en anglais safener).
Bien entendu, pour leur application pratique, les herbicides ci-dessus sont associée de manière en soi connue aux adjuvants de formulations utilisés habituellement en agrochimie Les différents aspects de l'invention seront mieux compris à l'aide des exemples expérimentaux ci-dessous.
Exemple 1: Construction d'un gène chimère avec une séquence HPPD et un promoteur LD.
Pour conférer la tolérance de plantes aux herbicides inhibant l'HPPD, on construit un gène chimère appelé pRPA-RD-2005:
Il consiste à mettre la partie codante du gène de fHPPD de P. fluorescens A32 sous le contrôle du promoteur de la petite sous unité de la RuBisCO isolé
d'Heliauthus annuus (US 5,559,024), du peptide de transit optimisé (OTP) (EP 508 909), lui même suivi de la région codante de fHPPD de Pseudomonas fluorescens (WO 96/38567) à
son tour suivie du terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens. L'HPPD sera alors localisée dans le chloroplaste et le gène s'exprime essentiellement dans les tissus chlorophylliens.
Le pRPA-RD-2005 est un vecteur binaire de type pRPA-BL-150Aa2 (EP 508 909) contenant une cassette d'expression de fHPPD: promoteur de la petite sous unité
de la ribulose discarboxylase-OTP-gène HPPD-terminateur nos -Pour le construire, on a utilisé le pRPA-RD 2004 qui contient la cassette d'expression de fHPPD
Construction du pRPA-RD-2004 - pRD-207 est un pBluescript SK(-) (stratagène catalog#21 2206) contenant le gène de la nopaline synthase (terminateur nos). Le pRD-207 est utilisé comme vecteur de base pour la construction du pRPA-RD-2004 - pRD-208 contient la cassette OTP/HPPD:nos. Il est obtenu à partir du plasmide pRPA S, décrit dans WO 96/38567, digéré par XbaI/CIaI, traitement à la polymérase type pfu. La cassette est introduite dans le pRD-207 ouvert par une digestion SaII, traitement klenow.
- Le promoteur de la petite sous unité de la ribulose biscarboxylase d'Heliauthus annuus (SSU HA; SEQ ID NO:1) provient du plasmide pRD-127 décrit dans WO 6 In the above two processes, the application of the herbicide having as its target HPPD can be made according to the invention, both in pre-planting, pre-emergence and post-emergence of the culture.
By herbicide within the meaning of the present invention means an active material herbicide alone or combined with an additive which modifies its effectiveness as for example an agent increasing (activity (synergistic) or limiting activity (in English safener).
Of course, for their practical application, the above herbicides are associate of manner known per se to the adjuvants of formulations usually used in agrochemical The various aspects of the invention will be better understood using the examples below.
Example 1: Construction of a chimeric gene with an HPPD sequence and a LD promoter.
To confer plant tolerance to herbicides that inhibit HPPD, builds a chimeric gene called pRPA-RD-2005:
It consists in putting the coding part of the fHPPD gene of P. fluorescens A32 under the control of the promoter of the small, isolated RuBisCO subunit of heliauthus annuus (US 5,559,024), of the optimized transit peptide (OTP) (EP 508,909), even monitoring of the fHPPD coding region of Pseudomonas fluorescens (WO 96/38567) at its turn followed by the terminator nos of Agrobacterium tumefaciens. The HPPD will so localized in the chloroplast and the gene is mainly expressed in fabrics chlorophyllians.
PRPA-RD-2005 is a binary vector of pRPA-BL-150Aa2 type (EP 508 909) containing an fHPPD expression cassette: promoter of small sub unit of ribulose discarboxylase-OTP-HPPD gene-terminator nos -To build it, we used pRPA-RD 2004 which contains the cassette fHPPD expression Construction of pRPA-RD-2004 - pRD-207 is a pBluescript SK (-) (stratagene catalog # 21 2206) containing the nopaline synthase gene (nos terminator). PRD-207 is used as vector for the construction of pRPA-RD-2004 - pRD-208 contains the OTP / HPPD cassette: nos. It is obtained from plasmid pRPA S, described in WO 96/38567, digested with XbaI / CIaI, treatment with polymerase pfu type. The cassette is introduced into the open pRD-207 by digestion SaII, klenow treatment.
- The promoter of the small subunit of ribulose biscarboxylase of heliauthus annuus (SSU HA; SEQ ID NO: 1) comes from the plasmid pRD-127 described in WO

7 96/38567 digéré NcoI/XbaI est introduit dans le pRD-208. Cette construction constitue le pRPA-RD-2004 Construction dupRD-2005 - Pour construire le pRPA-RD-2005, on ouvre le vecteur pRPA-BL-150Aa2 par les enzymes de restriction XbaI/HindIII auquel on insert la cassette d'expression de l'HPPD du pRPA-RD-2004 (décrit ci-dessus)par les même enzymes Il a donc comme structure:
Promoteur SSU OTP Région codante de fHPPD Terminateur nos Exemple 2: Transformation du tabac industriel PBD6.
Afin de déterminer l'efficacité du ce gène chimère de l'exemple 1, il a été
transféré dans du tabac industriel PBD6 selon les procédures de transformation et de régénération déjà décrites dans la demande de brevet EP 508 909.
1 ) Transformation:
Le vecteur est introduit dans la souche non oncogène d'Agrobacterium EHA 101 ou LBA 4404 (flood et a1,1987) porteuse du cosmide pTVK 291 (Komari et a1,1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh R. et al.
(1985) Science, 227, 1229-1231.
2} Ré;~énération:
La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'expiants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30g/1 de saccharose ainsi que 350 mg/1 de cefotaxime et 1 mg/1 du dicétonitrile dérivant de fisoxaflutole ou 10 mg/1 de 1-[4-(trifluorométhyl)-2-(méthylsulfonyl)phényl]-2-cyano-3-(1-méthylcyclopropyl)-propan-1,3-dione, autre inhibiteur de l'HPPD. Les expiants foliaires sont prélevés sur des plants en serre ou in vitro et transformés selon la technique des disques foliaires (Science 1985,Vo1 227,p.1229-1231.) en trois étapes successives: la première comprend l'induction des pousses sur un milieu MS
additionné
de 30g/1 de saccharose contenant O.OSmg/1 d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours et 1 mg/1 d'isoxaflutole. Les pousses vertes formées au cours de cette étape sont ensuite développées par culture sur un milieu MS
additionné de 30 g/1 de saccharose et 1 mg/1 d'isoxaflutole ou 10 mg/1 de 1-[4-(trifluorométhyl)-2-(méthylsulfonyl)phényl]-2-cyano-3-( 1-méthylcyclopropyl)-propan-1,3-dione mais ne contenant pas d'hormone, pendant 10 jours. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié
3 S en sels, vitamines et sucres et 1 mg/1 d'isoxaflutole ou 10 mg/I de 1-[4-(trifluorométhyl)-7 96/38567 digested NcoI / XbaI is introduced into pRD-208. This construction constitutes pRPA-RD-2004 Construction of PDR-2005 - To build pRPA-RD-2005, we open the vector pRPA-BL-150Aa2 by XbaI / HindIII restriction enzymes to which the cassette is inserted expression of the HPPD of pRPA-RD-2004 (described above) by the same enzymes Its structure is therefore:
Promoter SSU OTP fHPPD coding region Terminator nos Example 2: Processing of PBD6 industrial tobacco.
In order to determine the effectiveness of this chimeric gene of Example 1, it was transferred to PBD6 industrial tobacco according to processing procedures and of regeneration already described in patent application EP 508 909.
1) Transformation:
The vector is introduced into the non-oncogenic strain of Agrobacterium EHA 101 or LBA 4404 (flood and A1,1987) carrying the cosmid pTVK 291 (Komari and a1.1986). The transformation technique is based on the procedure of Horsh R. et al.
(1985) Science, 227, 1229-1231.
2} D; ~ generation:
The regeneration of PBD6 tobacco (from SEITA France) from explants foliar is carried out on a Murashige and Skoog (MS) base medium including 30g / 1 sucrose as well as 350 mg / 1 cefotaxime and 1 mg / 1 diketonitrile deriving from fisoxaflutole or 10 mg / 1 of 1- [4- (trifluoromethyl) -2- (methylsulfonyl) phenyl] -2-cyano-3- (1-methylcyclopropyl) -propan-1,3-dione, another inhibitor of HPPD. The explants leaves are taken from plants in the greenhouse or in vitro and transformed according to technique of leaf discs (Science 1985, Vo1 227, p.1229-1231.) in three steps successive: the first includes the induction of shoots on an MS medium added 30g / 1 sucrose containing O.OSmg / 1 naphthylacetic acid (ANA) and 2 mg / 1 of benzylaminopurine (BAP) for 15 days and 1 mg / 1 of isoxaflutole. The shoots green formed during this stage are then developed by culture on a middle MS
supplemented with 30 g / 1 of sucrose and 1 mg / 1 of isoxaflutole or 10 mg / 1 of 1- [4-(trifluoromethyl) -2- (methylsulfonyl) phenyl] -2-cyano-3- (1-methylcyclopropyl) -propan-1,3-dione but not containing hormone, for 10 days. Then we take of sprouts developed and cultivated on a medium of MS rooting content half 3 S in salts, vitamins and sugars and 1 mg / 1 of isoxaflutole or 10 mg / I of 1- [4-(trifluoromethyl) -

8 2-(méthylsulfonyl)phényl]-2-cyano-3-(I-méthylcyclopropyl)-propan-1,3-dione et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours, les pousses enracinées sont passées en terre.
Exemple 3: Tolérance du tabac transformé avec le gène chimère pItPA-RD-2005 Au sortir de l'étape in-vitro de l'exemple 2, les plantules de tabac transformées ont été acclimatées à la serre (60% d'humidité relative; température:
20°C la nuit et 23°C la jour) pendant trois semaines puis traitées au 4-[4-(trifluorométhyl)-2-(méthylsulfonyl)benzoyl]-5-cyclopropylisoxazole (isoxafutole).
IO Le tabac témoin, non transformé et traité à l'isoxafutole à la doses de 400 g/ha, développe en environ 72 heures des chloroses, qui s'intensifient pour évoluer vers des nécroses très prononcées en une semaine (couvrant environ 80% des feuilles terminales).
Le tabac transformé correspondant, ci-après tabac 2005, qui surexprime l'HPPD
de P. fluorescens, est très bien protégé contre un traitement à l'isoxafutole à la dose de 400 g/ha.
Exemple 4: Tolérance en serre du tabac 2005 Dans cet exemple on compare la tolérance en serre du tabac 2005 à celle du tabac COl I, transformé avec le gène chimère pRPA-V décrit dans la demande de brevet WO 96/38567 et à celle du tabac non transformé.
Description des essais tabac.
Des graines de chacun de ces types de tabac sont semées en terrine et le jour même un traitement à des doses d'isoxaflutole de 0/30/200/400 g/ha appliqué
donc en pré-emergence sont effectués.
Constructions testées Coll: Double histone~TEV~OTP~HPPD Pseudomonas Nos 2005: SSU~OTP~HPPD Pseudomonas Nos PBD6: non transformé.
Bilan Pour le tabac PBD6, la germination se fait normalement à 0 g /ha et aucune germination n'a lieu dès la dose de 30 g/ ha. Si par hasard une plantule arrive à levée elle est blanche et meurt très rapidement.
Pour des graines issues d'un tabac CO I 1, la levée est normale et sans symptômes de phytotoxicité pour les doses allant de 0 à 200 g/ ha. A 400 g/ha, les graines germent, la levée a lieu normalement mais il y a un retard de croissance ou " stunting ", assez net par rapport aux plantes non traitées. 8 2- (methylsulfonyl) phenyl] -2-cyano-3- (I-methylcyclopropyl) -propan-1,3-dione and born containing no hormone. After about 15 days, the rooted shoots are passed into the earth.
EXAMPLE 3 Tolerance of Tobacco Transformed with the Chimeric Gene pItPA-RD-2005 Leaving the in vitro step of Example 2, the tobacco seedlings transformed have been acclimatized in the greenhouse (60% relative humidity; temperature:
20 ° C at night and 23 ° C the day) for three weeks then treated with 4- [4-(trifluoromethyl) -2-(methylsulfonyl) benzoyl] -5-cyclopropylisoxazole (isoxafutole).
IO Control tobacco, unprocessed and treated with isoxafutole at doses of 400 g / ha, develops chloroses in about 72 hours, which intensify to evolve towards very pronounced necrosis in a week (covering about 80% of the leaves final).
The corresponding processed tobacco, hereafter tobacco 2005, which overexpresses HPPD
of P. fluorescens, is very well protected against treatment with isoxafutole at the dose of 400 g / ha.
Example 4: Greenhouse tolerance of tobacco 2005 In this example we compare the greenhouse tolerance of 2005 tobacco to that of COl I tobacco, transformed with the pRPA-V chimeric gene described in the application for patent WO 96/38567 and that of unprocessed tobacco.
Description of tobacco trials.
Seeds of each of these types of tobacco are sown in the ground and the day even a treatment with isoxaflutole doses of 0/30/200/400 g / ha applied so in pre-emergence are carried out.
Buildings tested Coll: Double histone ~ TEV ~ OTP ~ HPPD Pseudomonas Nos 2005: SSU ~ OTP ~ HPPD Pseudomonas Nos PBD6: not transformed.
Balance sheet For PBD6 tobacco, germination is normally at 0 g / ha and no germination takes place from the dose of 30 g / ha. If by chance a seedling gets up she is white and dies very quickly.
For seeds from a CO I 1 tobacco, the emergence is normal and without symptoms phytotoxicity for doses ranging from 0 to 200 g / ha. At 400 g / ha, the seeds germinate, emergence takes place normally but there is stunting or "stunting ", fairly clear compared to untreated plants.

9 Pour des graines issues d'un tabac 2005, la levée est normale et sans symptômes de phytotoxicité pour les doses allant de 0 à 400 g/ ha. A aucune des trois doses d'isoxaflutole, en serre, ne provoque de symptôme de phytotoxicité ou de "
stunting ".
Exemple 5: Tolérance au champ du tabac du tabac 2005 Les essais comparatifs de tolérance de l'exemple 4 sont reproduits au champ pour les même tabacs 2005, CO11 et PBD6.
Description des essais tabac.
Des jeunes plantes issues de semis ont été repiquées individuellement en minimottes pour être une deuxième fois repiquées au champ. Le traitement de post a été
réalisé une semaine après à des doses d'isoxaflutole de 0/100/200/300/400/500/600 g/ha.
Bilan Le diagramme ci-dessous comparant les tabacs de type CO11 et 2005, montre clairement que le promoteur SSU confère une meilleure tolérance que le double histone associé au TEV " enhancer ".
~ 2005 ~ COl 1 ~ Wild type I

,~ 90 '~~ 70 ~, 30 ô 10 Ainsi, 13 jours après traitement à 400g/ha, on observe 15 % de phytotoxicité
sur les tabacs CO11 alors que les tabacs 2005 ne présentent pas ou peu de phytotoxicité.
De même, 20 jours après un traitement à 400g/ha, on observe plus de 20 % de 20 phytotoxicité sur les tabacs CO11 alors que les tabacs 2005 présentent moins de 10% de phytotoxicité.
Dans les conditions de culture en champs, les plantes transformées avec le gène pRPA-RD-2005 comprenant le promoteur SSU ont une meilleure tolérance aux inhibiteurs de fHPPD que celles transformées avec le gène pRPA-V comprenant le promoteur double histone combiné au TEV " enhancer " de l'état de la technique.

LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC AGROCHIMIE
(B) RUE: 14-20 Rue Pierre BAIZET
(C) VILLE: LYON
(E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 69009 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Gène chimère ayant un promoteur lumière dépendant confêrant la tolérance aux inhibiteurs de l'HPPD
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 1 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 766 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: 9 For 2005 tobacco seeds, emergence is normal and without symptoms phytotoxicity for doses ranging from 0 to 400 g / ha. None of the three doses of isoxaflutole, in a greenhouse, does not cause symptoms of phytotoxicity or "
stunting ".
Example 5: Tolerance in the field of tobacco tobacco 2005 The comparative tolerance tests of Example 4 are reproduced in the field for the same tobacco 2005, CO11 and PBD6.
Description of tobacco trials.
Young seedlings were transplanted individually in minimottes to be transplanted a second time in the field. Processing post was a week later with doses of isoxaflutole 0/100/200/300/400/500/600 g / ha.
Balance sheet The diagram below comparing CO11 and 2005 tobacco, shows clearly that the promoter SSU confers better tolerance than double histone associated with TEV "enhancer".
~ 2005 ~ COl 1 ~ Wild type I

, ~ 90 '~~ 70 ~, 30 oh 10 Thus, 13 days after treatment at 400g / ha, 15% phytotoxicity is observed sure CO11 tobacco while 2005 tobacco has little or no phytotoxicity.
Similarly, 20 days after a 400g / ha treatment, more than 20% of 20 phytotoxicity on CO11 tobacco whereas 2005 tobacco presents less than 10% of phytotoxicity.
Under field culture conditions, plants transformed with the uncomfortable pRPA-RD-2005 including the promoter SSU have better tolerance to fHPPD inhibitors than those transformed with the pRPA-V gene including double histone promoter combined with TEV "enhancer" of the state of technical.

LIST OF SEQUENCES
(1) GENERAL INFORMATION:
(i) DEPOSITOR:
(A) NAME: RHONE-POULENC AGROCHEMISTRY
(B) STREET: 14-20 Rue Pierre BAIZET
(C) CITY: LYON
(E) COUNTRY: France (F) POSTAL CODE: 69009 (ii) TITLE OF THE INVENTION: Chimeric gene having a light promoter dependent conferring tolerance to HPPD inhibitors (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 1 (iv) COMPUTER-DETACHABLE FORM:
(A) TYPE OF SUPPORT: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Version # 1.30 (EPO) (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 766 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: DNA (genomics) (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

Claims

1. Chimeric gene comprising at least one elementary chimeric gene comprising, in the direction of transcription, 5' regulatory elements required to its transcription in plants, at least one heterologous coding part including a coding sequence encoding an enzyme conferring tolerance to plants to the HPPD inhibitor herbicides and at least one regulatory sequence terminator or for polyadenylation, characterized in that the regulatory elements at 5' ensure the transcription of the elementary chimeric gene at the tissue level chlorophyllians.

2. chimeric gene according to claim 1, characterized in that said 5' regulatory elements include at least one regulatory sequence LD promoter-like promoter.

3. chimeric gene according to claim 2, characterized in that the LD promoter is of bacterial, viral or plant origin.

4. chimeric gene according to claim 3, characterized in that the LD promoter is selected from a functional sequence of the promoter of a gene small subunit of plant RuBisCO, light-harvesting chlrorophyll a/b binding protein (LHCP), plastocyanin (pet E) and phenylalanine ammonia lyase (pal).

5. chimeric gene according to claim 4, characterized in that the LD promoter comprises a functional fragment of the promoter of the small sub unity of the RuBisCO of a plant.

6. chimeric gene according to claim 5, characterized in that the LD promoter comprises a functional functional fragment of the promoter of the small RuBisCO subunit of Helianthus annuus.

7. chimeric gene according to claim 6, characterized in that the LD promoter comprises the DNA sequence represented by the identifier of sequence No. 1 (SEQ ID NO:1) or a homologous sequence of said sequence.

8. chimeric gene according to one of claims 1 to 7, characterized in that the elementary chimeric gene comprises in association with the elements of regulation in 5' at least one regulatory sequence, located between the promoter and the sequence coding, chosen from transcription activators and/or sequences coding for transit peptides.

9. Chimeric gene according to one of claims 1 to 8, characterized in that the coding sequence for an enzyme conferring on plants tolerance to herbicides HPPD inhibitors is chosen from sequences encoding an HPPD
original bacterial or vegetable origin.

10. Cloning or expression vector for transformation of a cell plant or of a monocotyledonous or dicotyledonous plant, characterized in that that he further comprises the chimeric gene according to one of claims 1 to 9, at least a origin of replication.

11. Vector according to claim 10, characterized in that it is a plasmid.

12. Process for transforming plant cells, characterized in that integrating into said plant cell at least one chimeric gene according to one from claims 1 to 9.

13. Transformed Herbicide Tolerant Plant Cell Targeting HPPD, characterized in that it comprises at least one chimeric gene according to one of claims 1 to 9.

14. Transformed plant tolerant to herbicides targeting HPPD, characterized in that it comprises cells transformed according to the claim 13.

15. Transformed plant according to claim 14, characterized in that it is regenerated regenerated from transformed cellsaccording to the claim 14.

16. Transformed plant tolerant to herbicides targeting HPPD, characterized in that it is derived from the cultivation and/or crossing of plants regenerated according to claim 15.

17. Seeds of transformed plants according to one of claims 14 to 16.

18. Method for controlling weeds in an area of a field comprising seeds or plants transformed according to one of claims 14 to 17, characterized in that one applies to the said surface of the field a dose toxic for said weeds of a herbicide targeting HPPD, without Nevertheless substantially affect said seeds or transformed plants.

19. Process for growing plants transformed according to one of claims 14 to 16, characterized in that it consists in planting the seeds according to claim 17 in an area of a field suitable for the cultivation of say transformed plants, to be applied to said surface of said field a dose toxic to weeds of an HPPD-targeted herbicide if present of weeds, without substantially affecting said seeds or say them transformed plants, then harvesting the cultivated transformed plants when they reach the desired maturity and eventually separate the seeds from the plants transformed harvested.

20. Method according to one of claims 18 or 19, characterized in that the HPPD-targeted herbicide is applied pre-plant and/or withdrawn and/or post-emergence of the crop.