FR3102774A1 - Nouvelle souche de lactobacillus plantarum utile pour l’absorption intestinale du calcium - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne la souche isolée de Lactobacillus p lantarum VF46A déposée auprès de la CNCM sous le numéro CNCM I-5301 le 29 mars 2018 ainsi qu’une composition pharmaceutique, un complément alimentaire et un aliment comprenant ladite souche

Description

NOUVELLE SOUCHE DE LACTOBACILLUS PLANTARUM UTILE POUR L’ABSORPTION INTESTINALE DU CALCIUM
La présente invention concerne une nouvelle souche probiotique apte à moduler l’absorption intestinale du calcium. Plus particulièrement, la présente invention concerne une nouvelle souche deL actobacillus plantarum.
Comme indiqué dans la publication intitulée « Dietary and pharmacological compounds altering intestinal calcium absorption in humans and animals » de V. Areco et al, publiée en 2015 dans la revue Nutrition Research Reviews, volume 28, pages 83 à 99, le calcium joue un rôle important dans le maintien de nombreuses fonctions biologiques comme le métabolisme osseux, le système cardiovasculaire ou encore le fonctionnement des muscles et des neurones. Des pathologies telles que l’ostéoporose, la résistance à l’insuline, l’obésité, l’hypertension artérielle ou le syndrome métabolique, sont associées à des déficiences en calcium (ou hypocalcémie).
De plus, la publication précitée indique qu’une absorption du calcium perturbée peut être à l’origine de la survenue de cancers tels que le cancer du côlon, du sein, de la prostate et des ovaires.
La majorité du calcium consommé est absorbée au niveau intestinal, deux voies de transport du calcium ont été identifiées dans l’intestin, la voie paracellulaire et la voie transcellulaire. Le transport paracellulaire du calcium est une diffusion passive de cet élément du lumen de l’intestin (c’est-à-dire l’espace interne délimité par la paroi de l’intestin) à la muqueuse intestinale, selon le gradient formé entre ces deux compartiments. Deux protéines sont impliquées dans ce transport, les claudines 2 et 12 (CLD-2 -12) qui font partie des jonctions serrées entre les cellules et agissent comme des canaux calciques. Le mécanisme est décrit dans la publication intitulée « Tight Junction Proteins Claudin-2 and -12 Are Critical for Vitamin D-dependent Ca2 +Absorption between Enterocytes » de Fujitaet al. publiée en 2008 dans la revue Molecular Biology of the Cell (volume 19, 1912-1921, mai 2008).
Le transport transcellulaire du calcium est un transport actif impliquant l’incorporation du calcium au sein des cellules intestinales par un transporteur appelé TRPV6. Le calcium est par la suite transporté et excrété au pôle basal de la cellule dans la muqueuse intestinale. Ces deux voies de transport du calcium sont régulées par la vitamine D, une hormone qui, une fois fixée à son récepteur nucléaire le VDR (Vitamin D Receptor) agit comme un facteur de transcription contrôlant les gènes des CLD-2 -12 et de TRPV6. La publication intitulée « Mechanisms of Intestinal Absorption » de F. Bronner publiée en 2003 dans la revue Journal of Cellular Biochemistry, page 387-393 et la publication intitulée « The role of vitamin D in the endocrinology controlling calcium homeostasis » de J.C. Fleet, publiée en 2017 dans la revue Molecular and Cellular Endocrinology expliquent ces mécanismes. En contrôlant le métabolisme du calcium, le VDR agit sur le remodelage osseux et est impliqué dans les pathologies qui en découlent (ostéopénie, ostéoporose, ostéomalacie).
En outre, le VDR est également impliqué dans la défense de l’organisme contre les pathogènes, dans la détoxification des xénobiotiques, dans l’immunorégulation ; il exerce aussi une action anti-inflammatoire, anticancéreuse et une protection cardiovasculaire (voir la publication intitulée « The nuclear vitamin D receptor controls the expression of genes encoding factors which feed the “Fountain of Youth” de M.R Haussler et publiée dans la revue Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology en 2010). En régulant les niveaux de calcium intracellulaire, le transporteur TRPV6 lui-même va moduler des processus comme la prolifération et l’apoptose qui sont contrôlés par des voies de signalisation impliquant le calcium et jouent un rôle crucial dans l’apparition et le développement des cancers.
Les résultats indiqués dans la publication intitulée « Lack of Vitamin D Receptor Causes Dysbiosis and Changes the Functions of the Murine Intestinal Microbiome » de Jin et al, publiés en 2015, dans la revue Clinical Therapeutics, volume 37, numéro 5, ont montré qu’une diminution de l’activité du VDR entraine une dysbiose du microbiote conduisant elle-même à de profondes altérations du métabolisme intestinal.
Les Lactobacilles constituent une approche sure et prometteuse dans la prévention de l’hypocalcémie. Dans ce domaine, l’état de l’art montre que l’impact de souches deLactobacillussur l’absorption du calcium a déjà été démontré par expérimentationsin vitro .L’action d’une souche deL. salivariussur des cellules Caco-2 a déjà été étudiée. En outre, l’impact des souches bactériennes a été majoritairement étudié au travers d’étudesin vivooù l’action bénéfique des bactéries est démontrée au niveau du squelette et des os.
La publication intitulée « Vitamin D receptor pathway is required for probiotic protection in colitis » de Wu et publiée dans la revue Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 309: G341–G349, en juillet 2015 montre qu’une souche deL. plantaruma permis d’augmenter l’expression du VDR chez des cellules intestinales murines et humaines. La souche a également permis une augmentation dans l’expression de la cathelicidine, un peptide antimicrobien. Ce même traitement chez des souris atteintes de colite a permis de protéger l’intestin ; au travers du VDR, la souche deL. plantarumentraine une augmentation du nombre de cellules de Paneth (cellules immunitaires de l’intestin) ainsi qu’une diminution de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires.
La publication précitée indique que les bactéries peuvent interagir de diverses manières avec les cellules de leur hôte. Elle indique également qu’une souche deL. plantarumest capable d’augmenter l’expression du gène Cyp24, lequel est responsable de la transformation de la vitamine D présente dans la circulation sanguine, en la forme active de cette vitamine via la production d’une enzyme nommée la 24-hydroxylase. En d’autres termes, cette souche peut potentiellement favoriser la fixation du calcium sanguin par la masse osseuse
Un but de la présente invention est de proposer une nouvelle souche de bactérie lactique capable de favoriser l’absorption du calcium, chez un individu pouvant être un mammifère, en particulier un humain.
Un autre but de la présente invention est de proposer une composition pharmaceutique contenant une telle souche et pouvant être utilisée pour le traitement d’une condition physiologique anormale pouvant être une pathologie ou un syndrome, par exemple, et liée à l’absorption intestinale du calcium et plus particulièrement à une absorption altérée et trop faible du calcium par l’intestin.
Un autre but de la présente invention est de proposer un complément alimentaire et/ou un aliment contenant la souche de l’invention.
La présente invention concerne la souche isolée deLactobacillus plantarumVF46A déposée le 29 mars 2018 à la CNCM sous le numéro CNCM I-5301.
La Demanderesse a montré que de manière surprenante, cette souche est capable d’augmenter l’absorption du calcium au niveau de l’intestin en favorisant le passage du calcium présent dans la lumière intestinale (l’intérieur de l’intestin) vers la circulation sanguine à travers les cellules épithéliales de l’intestin.
En effet, même s’il était connu de la publication précité de Wu qu’une souche deL. plantarumétait capable d’augmenter la fixation du calcium présent dans le sang sur les os via l’augmentation de la forme de la vitamine D active, il n’était pas évident qu’un tel type de souche puisse agir directement sur l’absorption intestinale du calcium.
La présente invention concerne également la souche précitée pour son utilisation en tant que médicament.
Par ailleurs, la souche de l’invention a également une influence sur le VDR puisqu’elle active l’expression de la protéine au niveau intestinal. Potentiellement, la souche peut donc avoir un effet thérapeutique sur toutes les pathologies qui sont liées directement ou indirectement à un dérèglement impliquant le VDR et/ou les protéines dont il régule l’expression, comme le TRPV6, par exemple.
Ainsi, la souche de l’invention peut être utilisée comme un anti-inflammatoire, un immunorégulateur, pour la prévention ou le traitement des cancers, notamment du colon, ou pour le traitement des maladies résultant d’une altération du métabolisme intestinal, comme par exemple les MICI (maladies inflammatoires chroniques de l’intestin).
Du fait de l’effet de la souche de l’invention sur l’absorption du calcium, elle a potentiellement un effet thérapeutique sur toutes les pathologies cardiaques liées au taux de calcium sanguin, en particulier l’hypertension.
Le terme « traitement » englobe au sens de la présente invention le traitement curatif et le traitement préventif.
La présente invention concerne également la souche de l’invention pour son utilisation en tant que médicament dans le traitement d’une condition physiologique anormale liée à l’absorption intestinale du calcium, en particulier liée à un déficit de l’absorption intestinale du calcium et plus particulièrement pour le traitement d’une pathologie ou d’un syndrome choisi parmi l’ostéoporose, le diabète de type 2, l’hypertension, les pathologies cardiaques liées au calcium sanguin, l’obésité, le syndrome métabolique, le cancer, en particulier le cancer du côlon, le cancer de la prostate, le cancer des ovaires, le cancer du sein, les pathologies liées à une altération du métabolisme intestinal, en particulier les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, pour son utilisation en tant qu’immunorégulateur ou anti-inflammatoire ou pour son utilisation dans le traitement d’une condition physiologique anormale liée directement ou non à un disfonctionnement du récepteur de la vitamine D.
Par condition physiologique anormale est entendu au sens de la présente invention, tout état physiologique défini par au moins un paramètre considéré comme indicatif d’un désordre ou d’un dérèglement physiologique.
Ainsi, la condition physiologique anormale peut être une pathologie c’est-à-dire un ensemble de symptômes dont la cause ou les causes sont identifiées ou un syndrome c’est-à-dire un ou plusieurs dérèglements asymptomatiques dont la ou les causes ne sont pas identifiées.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique qui contient en tant qu’ingrédient actif, la souche selon l’invention et un excipient pharmaceuticalement acceptable.
Cette composition pharmaceutique peut être utilisée pour le traitement curatif ou préventif ou pour l’amélioration d’au moins un des symptômes des mêmes pathologies que celles citées en référence à la souche de l’invention.
L’excipient peut être un mélange d’excipients. Il peut être choisi parmi l’eau, le glycérol, l’éthanol, le propylène glycol, les huiles végétales, les cires, les sucres naturels ou synthétiques, la glycérine et leurs mélanges, la silice, le talc et les tensioactifs.
La composition pharmaceutique est formulée de préférence pour être ingérée ; elle est donc préférentiellement administrée par voie orale.
La composition pharmaceutique de l’invention peut se présenter sous la forme d’un gel, d’un liquide, d’une suspension, d’un comprimé, d’un lyophilisat ou d’une gélule.
A titre d’exemple, une dose unitaire de la préparation pharmaceutique de l’invention contient 105CFU de la souche de l’invention.
A titre d’exemple non limitatif, la dose journalière en souche selon l’invention est d’au moins 105CFU, de préférence de 109CFU à 1010CFU.
La présente invention concerne également un complément alimentaire contenant la souche de l’invention. Le complément alimentaire peut se présenter sous les mêmes formes que celles précitées en référence à la composition pharmaceutique de l’invention. Une dose unitaire du complément alimentaire de l’invention peut avantageusement contenir au moins 105 CFU de la souche selon l’invention.
Avantageusement, le complément alimentaire contient au moins 105CFU de ladite souche.
Avantageusement, le complément alimentaire contient du calcium et/ou de la vitamine D. La présence simultanée du calcium et de la souche de l’invention dans l’intestin favorise le passage du calcium vers la circulation sanguine et sa fixation sur les os.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le complément alimentaire contient pour une unité de dosage 109CFU ou 1010CFU de souche selon l’invention.
Le complément alimentaire peut être utilisé en complément d’un médicament et pour le traitement des mêmes pathologies que celles citées en référence à la souche de l’invention.
La présente invention concerne également un aliment à l’exception du yaourt obtenu à partir du lait de dzomo, qui contient la souche selon la présente invention.
L’aliment est avantageusement choisi parmi les aliments fermentés.
L’aliment de l’invention peut être choisi, par exemple, parmi les yaourts à l’exception des yaourts de lait de dzomo, les fromages frais ou fermentés obtenus à partir de lait d’origine animal ou végétal, les laits d’origines animales ou végétales, les kéfirs de lait d’origine animale ou végétale et les préparations obtenues par coagulation de la caséine.
Le terme aliment regroupe au sens de l’invention les boissons et les aliments plus solides. L’aliment selon l’invention est avantageusement choisi parmi les yaourts obtenus à partir de lait animal ou végétal à l’exception du lait de dzomo. Le yaourt de l’invention peut être obtenu à partir d’un mélange de laits d’origines animales ou végétales. L’aliment selon l’invention peut être un mélange de légume(s) lactofermenté(s) du type choucroute par exemple ou de la charcuterie, notamment un saucisson. De même le type de lait à partir duquel ou desquels est obtenu le fromage selon l’invention n’est pas limité.
Les aliments obtenus à base de lait d’origine animale ont l’avantage de contenir également du calcium qui agit en synergie avec la souche de l’invention.
L’aliment selon l’invention peut également être du lait d’origine animale ou végétale et contenant la souche de l’invention.
L’aliment peut, par exemple, contenir 103à 106CFU de la souche selon l’invention. En particulier, il peut contenir 105CFU ou plus de la souche selon l’invention.
Le lait d’origine animal peut être choisi parmi le lait de vache, le lait de chèvre, le lait de brebis, le lait de jument, le lait d’ânesse et les mélanges de deux ou plus de ces laits.
Le lait d’origine végétal peut être choisi parmi les laits de céréales tels que le lait d’avoine, le lait de blé Kamut, le lait d’épeautre, le lait de millet, le lait d’orge, le lait de seigle, le lait de riz, le lait d’amande, le lait de soja, le lait de noix, le lait de coco, le lait de chanvre, le lait d’oléagineux tels que la noisette, l’arachide, la noix de cajou ou la pistache, par exemple.
La présente invention concerne également une Composition choisie parmi les compositions alimentaires ou pharmaceutiques caractérisée en ce qu’elle contient la souche selon la revendication 1 et la souche deLactobacillus helveticusVFH049 déposée à la CNCM sous le numéro d’ordre CNCM-I-5403.
Une telle composition s’est avérée efficace dans l’absorption intestinale du calcium du fait de la synergie des deux souches.
La représente le logarithme de la concentration de cellules viables de la souche VF46A en fonction des stades de la digestion gastro-intestinale simulée in vitro ; le rectangle le plus à gauche correspond à la concentration dans la bouche, le rectangle central correspond à la concentration dans l’estomac tandis que le rectangle le plus à droite correspond à la concentration dans l’intestin grêle ;
La représente le pourcentage de lactate déshydrogénase (LDH) libérée suite à l’éventuelle lyse des cellules (Caco-2 ou HT-29 MTX) après un contact de 24 heures avec la souche VF46A par rapport au contrôle ;
La représente la mesure de la résistance électrique transépithéliale (TEER) d’une monocouche de cellules Caco-2 cultivées sur insert soit avec la souche VF46A soit avec du PBS, en fonction du temps ;
La représente le ratio de la concentration basale en calcium (concentration basale mesurée/concentration basale à t = 0h) en fonction du temps obtenu avec une monocouche de cellules Caco-2 cultivées avec du PBS ou la souche de l’invention ;
La représente le ratio de l’émission de fluorescence (EMIt/EMIt0-9s) obtenu en fonction du temps sur une monocouche de cellules Caco-2 cultivées avec du PBS (courbes en pointillés) ou avec la souche de l’invention (courbes en trait plein) ;
La représente le taux d’ARNm du VDR par rapport au contrôle obtenu pour des cellules HT-29 MTX cultivées en présence de PBS ou en présence de la souche de l’invention ; et
La représente le taux d’ARNm de trpv6 par rapport au contrôle obtenu pour des cellules HT-29 MTX cultivées en présence de PBS ou en présence de la souche de l’invention ; et.
La représente le niveau de prolifération cellulaire au sein d’une culture de cellules HT-29 MTX (lignée cellulaire de cellules cancéreuses du côlon) (pourcentage de cellules en phase G2/M) dans un milieu de contrôle (DMEM) ou dans un milieu contenant la souche VF46A.
PARTIE EXPERIMENTALE
Isolation de la souche
La souche de l’invention a été isolée à partir d’un yaourt obtenu par fermentation du lait d’une dzomo en Mongolie et plus particulièrement dans la région mongole de l’Altaï. Une dzomo est une femelle issue du croisement entre un yak et une vache domestique. Le yaourt précité contenait également d’autres lactobacilles et notamment desLactobacillus delbrueckii subsp. b ulgaricuset desStreptococcus thermophilus.  
Les échantillons de yaourt ont été récoltés dans des contenants stériles et conservés maximum 2 jours à -4°C avant analyse. Les échantillons ont été successivement dilués dans une solution saline de NaCl à 0.85 % (m/v) puis étalés sur gélose De Man Rogosa et Sharpe (MRS) (De Manet al., 1960). Après 2 jours d’incubation à 37°C en condition anaérobie, les colonies distinctes morphologiquement ont été sélectionnées puis étalées à nouveau jusqu’à la purification. Les souches ont été examinées au microscope après coloration de Gram. Une recherche de la catalase a été réalisée par ajout de peroxyde d’hydrogène (H2O2) sur les cultures.
La souche isolée est ensuite stockée dans du milieu MRS supplémenté en glycérol à une concentration finale de 15 % (v/v) à -80°C.
L’identification de la souche a été réalisée par amplification et séquençage du gène codant l’ADNr 16S. L’ADN des souches a été extrait à partir des colonies en utilisant le kit QIAamp DNA (Qiagen, Hilden, Allemagne).
L’amplification de l’ADN a été réalisée par la société GATC Biotech (Constance, Allemagne) en utilisant les amorces 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (SEQ ID NO 7) et 534R (5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3' (SEQ ID NO 8). Cette technique est décrite dans la publication de Muyzeret al., datée de 19 93. Le séquençage a été réalisé par cette même société en utilisant l’amorce 27F. Les espèces bactériennes ont été identifiées en comparant la séquence du gène 16S avec les séquences de la base de données Medline, un score supérieur à 99 % a été considéré comme significatif.
La souche VF46A a été identifiée comme étant une souchede L actobacillus plantarumest a été déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes INSTITUT PASTEUR 25 rue du Docteur Roux, F 75724 PARIS CEDEX 15 sous le numéro CNCM I-5301.
Evaluation des caractéristiques de la souche
Tolérance à l’acidité
Le principe de ce test repose sur la comparaison de la survie d’une souche bactérienne entre une incubation de 2 h à pH 2 et une incubation au pH du milieu MRS (pH 6,2). Pour cette expérience, la souche a été cultivée en milieu MRS liquide pendant 24 h à 37°C en condition anaérobie. Un volume de 200 µL de culture a ensuite été dilué (1/10) soit dans le même milieu MRS à pH 6,2 (appelé tube A), soit dans un milieu MRS ajusté à pH 2 par de l’acide chlorhydrique (HCl) (appelé tube B). Les tubes A et B ont été incubés à 37°C pendant 2 h puis 10 µL de chaque tube ont été étalés sur gélose MRS. Les boites ensemencées ont été incubées pendant 48h à 37°C en condition anaérobie.
La tolérance à l’acidité a été évaluée en comparant les nombres de colonies entre les boites A et B. Un barème de classes de tolérance à l’acidité a été défini selon le résultat du ratio B/A. La classe 0 regroupe les souches non tolérantes à l’acidité (aucune colonie sur la boite B). La classe 1 correspond aux souches faiblement tolérantes (boite B = 0 à 30 % des colonies sur la boite A). La classe 2 regroupe les souches présentant une tolérance à l’acidité modérée (boite B = 30 à 80 % des colonies sur la boite A). Enfin la classe 3 correspond aux souches tolérantes à l’acidité (boite B présente plus de 80 % des colonies de la boite A).
La souche de l’invention a survécu après un passage à pH 2 pendant 2 h. Les résultats montrent que la souche VF46A est catégorisée en classe 3 de tolérance à l’acidité c’est-à-dire que plus de 80 % des cellules bactériennes ont résisté au traitement acide.
Hydrophobie pariétale
L’objectif de ce test est d’évaluer le caractère hydrophobe de la paroi de la souche. Un test simple a déjà été mis au point pour évaluer ce critère, il s’agit du test MATS (Microbial Adhesion To Solvents). Il consiste à mesurer l’affinité d’une souche bactérienne pour un hydrocarbure apolaire (le n-hexadécane le plus souvent) afin d’estimer l’hydrophobie de la paroi, un paramètre de la capacité de la souche à adhérer à l’épithélium intestinal.
Pour l’expérience, la souche bactérienne VF46A est cultivée en milieu MRS liquide pendant 24 h à 37°C en condition anaérobie. Les cellules sont ensuite lavées deux fois en répétant successivement une étape de centrifugation à 10.000 rpm pendant 10 min, suivi d’une étape de resuspension des cellules dans un tampon Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7,4.
La Densité Optique (DO) à 630 nm (DO630nminitiale) a été déterminée au spectrophotomètre ELx808 (BioTek Instruments Inc., Vermont, Etats-Unis). Un volume de 1 mL de suspension a ensuite été mélangé avec 100 µL de n-hexadécane (Acros Organics, Geel, Belgique) en vortexant le mélange pendant 1 min. La solution a ensuite été mise au repos à température ambiante pendant 15 min puis 100 µL de la phase aqueuse ont été récupérés pour une nouvelle détermination de la DO à 630 nm (DO630nmfinale). L’hydrophobie pariétale a été calculée selon la formule suivante :
Avec %H : le pourcentage d’hydrophobie pariétale, DO630nminitiale : la DO initiale de la suspension et DO630nmfinale : la DO mesuré après ajout et mélange de la suspension avec le n-hexadécane.
En mesurant l’affinité de la souche VF46A pour un hydrocarbure non polaire, l’hydrophobie pariétale de la souche a pu être estimée. Les résultats indiquent un pourcentage d’hydrophobie pariétale égale à 32 % pour cette souche.
Etude des caractères probiotiques
Pour cette partie, différents critères ont été étudiés. Ces critères regroupent différentes caractéristiques définissant les probiotiques notamment la capacité d’adhésion à l’épithélium intestinal, l’innocuité des souches ainsi que leur tolérance à la digestion gastro-intestinale (DGI).
Test d’auto-agrégation
Ce test permet d’évaluer la capacité des cellules bactériennes à s’agréger entre elles dans un milieu liquide. Il repose sur la comparaison de la concentration bactérienne au-dessus d’une suspension au temps 0 avec la concentration bactérienne de la même suspension incubée pendant un temps donné sans aucune agitation. Les souches capables d’une forte auto-agrégation vont s’agréger entre elles augmentant ainsi leur vitesse de sédimentation.
Les souches sont cultivées en MRS pendant 24 h à 37°C puis lavées et resuspendues dans un tampon PBS à une DO à 600 nm de 1. Un volume de 4 mL de suspension est vortexé pendant 10 sec puis incubé à température ambiante sans agitation. Après 2,5 et 5 h d’incubation, 100 µL de milieu sont soigneusement prélevés à la surface de la suspension. Les échantillons prélevés sont ensuite dilués (1/10) dans du tampon PBS pour une mesure de la DO à 600 nm.
Le pourcentage d’auto-agrégation (%A) est ensuite calculé selon la relation :
Avec A0 : l’absorbance à 600 nm initiale de la suspension, mesurée au début de l’expérience (et égale à 1) et At : l’absorbance à 600 nm mesurée à 2,5 ou 5 h d’incubation.
S’agissant de la souche VF46A, on observe une augmentation de l’auto-agrégation entre 2,5 et 5 h. En effet après 5 h d’incubation, la souche présente un pourcentage d’auto-agrégation égal à 28,27 % (contre 12,74 % à 2,5 h).
En parallèle, la capacité d’adhésion de la souche VF46A (voir ci-après) a été mesurée en utilisant la lignée cellulaire Caco-2. La souche VF46A est particulièrement adhérente aux cellules intestinales avec 4,63 % (± 1.22) de cellules adhérentes après contact.
L’auto-agrégation et la capacité d’adhésion de la souche VF46A indiquent que cette dernière a une très bonne capacité de colonisation de l’épithélium intestinal.
Evaluation de la tolérance à la digestion gastro-intestinale
Afin d’évaluer la survie de la souche bactérienne pendant et après son passage au sein du tube digestif, un modèle de digestion statique a été utilisé. Ce modèle simule les 3 premiers compartiments du tube digestif à savoir la bouche, l’estomac et l’intestin de façon séquentielle. Chaque compartiment est simulé par l’ajout d’un fluide mimant les conditions physiologiques de cette étape. L’ensemble de la digestion est réalisé en condition stérile, tous les fluides sont autoclavés à 121°C pendant 20 min avant l’expérience, l’ajout des enzymes a lieu après stérilisation et est suivi d’une filtration stérilisante (à 0,2 µm).
La souche est cultivée dans un milieu MRS pendant 24 h à 37°C. Les cellules bactériennes sont lavées deux fois puis resuspendues dans un tampon PBS à une concentration de 109Colony Forming Unit (CFU).mL-1. Pour la digestion, la phase buccale est simulée par l’addition de 8 mL de PBS, ajusté à pH 6.8, à 1 mL de la suspension bactérienne. Le mélange est incubé sous une agitation constante à 200 rpm pendant 5 min à 37°C. La phase gastrique est simulée par l’ajout de 12 mL de PBS à pH 3 supplémenté de pepsine bovine (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis) à 1,56 mg.mL-1. La suspension est incubée 2 h à 37°C en agitation à 200 rpm. Durant l’incubation, le pH de la solution est maintenu entre 3 et 3,5 par l’addition d’acide chlorhydrique (HCl) (1 M) ou d’hydroxyde de sodium (NaOH) (1 M). Pour la phase intestinale, 1 mL de carbonate de sodium (NaHCO3) à 1 M est ajouté au mélange afin de remonter le pH à environ 7 et d’inactiver la pepsine. Un volume de 12 mL de PBS à pH 8,2 supplémenté des enzymes pancréatiques bovines (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis) à 0,28 mg.mL-1, puis un volume de 6 mL de PBS à pH 8,1 contenant 60 g.L-1d’Ox-bile (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis) sont ajoutés au mélange afin de simuler les conditions intestinales. Cette étape se déroule pendant 2 h à 37°C en agitation à 200 rpm en maintenant le pH entre 7 et 7,5.
A la fin de chaque étape de la digestion, un prélèvement de 100 µL du mélange réactionnel est réalisé, ainsi pour une même digestion, 4 échantillons sont obtenus comprenant le prélèvement du tube mère (TM), de la phase salivaire (S), de la phase gastrique après 2 h d’incubation (G2), et enfin celui après 2 h de phase intestinale (I2). Chaque prélèvement est ensuite dilué (1/10) successivement dans un tampon PBS. Pour la détermination de la concentration bactérienne dans les échantillons, 100 µL des dilutions adéquates sont étalés sur une gélose MRS. Les plaques ensemencées sont ensuite incubées à 37°C pendant 48 h en condition anaérobie. Après incubation, le dénombrement des CFU permet la détermination de la concentration bactérienne dans les échantillons. Les résultats sont exprimés en CFU.mL-1.
Les résultats obtenus pour la souche VF46A sont représentés sur la Fig. 1. Le nombre initial de cellules bactériennes viables est de 109CFU.mL-1dans la phase salivaire (rectangle le plus à gauche). Au cours de la DGI, la quantité de bactéries diminue, la phase gastrique étant la plus délétère (rectangle central). En fin de DGI (rectangle le plus à droite), le nombre de cellules bactériennes viables perd 3 points de log en comparaison avec le nombre initialement ajouté au départ (106CFU.mL-1en fin de DGI).
Néanmoins, les résultats précités indiquent que la souche supporte la digestion et peut donc se retrouver non altérée dans l’intestin grêle d’un sujet.
Test de cytotoxicité
Ce test a pour objectif d’évaluer l’éventuelle toxicité de la souche vis-à-vis de la barrière intestinale. Les cellules Caco-2 et HT-29 MTX sont utilisées dans ce but.
Pour le test de cytotoxicité, les cellules sont ensemencées en plaque 96 puits à une densité de 8.000 cellules par puits dans un volume de 150 µL de milieu et cultivées pendant 7 jours à 37°C, 5 % de CO2. Avant l’ajout des souches bactériennes, les cellules intestinales sont lavées deux fois avec du tampon PBS. Les souches bactériennes quant à elles, sont cultivées comme décrit précédemment et suspendues dans le milieu DMEM sans ajout à une concentration de 107CFU.mL-1. Pour chaque puits, 150 µL de suspension bactérienne sont ajoutés. Du tampon PBS, dilué avec du DMEM sans ajout tout comme pour la souche, est utilisé comme contrôle négatif. Le contact entre la souche et les cellules intestinales a lieu pendant 24 h à 37°C, 5 % de CO2. La souche est mise en contact à la fois avec les cellules Caco-2 et les cellules HT-29 MTX de façon indépendante.
La détermination de la mortalité des cellules intestinales est utilisée ici pour évaluer l’éventuelle toxicité des souches bactériennes. La mortalité des cellules est évaluée par dosage de l’activité de la lactate dehydrogenase (LDH). Cette activité est dosée par le kit LDH activity assay (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis), ce kit est basé sur la réaction de réduction du Nicotinamide Adénine Dinucléotide oxydé (NAD) en sa forme réduite (NADH) par la lactate dehydrogenase, le NADH pouvant être détecté à 450 nm.
Après contact, 50 µL de surnageant sont prélevés dans chaque puits et l’activité de la LDH est dosée en suivant le protocole du kit. L’absorbance de la plaque est lue à 450 nm par un spectrofluorimètre Xenius XC (Safas Monaco, Monaco, France). La mortalité des cellules intestinales est calculée en pourcentage de la moyenne des absorbances de la condition contrôle (la proportion de LDH libérée dans cette condition est prise pour référence à 100 %).
Le tampon PBS a été utilisé comme référence (contrôle) pour représenter le niveau basal de LDH libérée. Les résultats montrent une absence de toxicité significative envers les deux lignées cellulaires, ce qui suggère que dans ces conditions d’expérience, la souche bactérienne de l’invention n’est pas délétère pour les cellules intestinales.
Evaluation de l’adhésion des souches aux cellules intestinales
L’objectif de ce test est d’évaluer la capacité de la souche à adhérer aux cellules intestinales. Il est basé sur la comparaison entre la quantité de cellules bactériennes adhérentes à la monocouche de cellules Caco-2 par rapport à la quantité de bactéries initialement ajoutée.
Le souche est cultivée et préparée comme décrit précédemment, une suspension en milieu DMEM sans ajout est préparée à une concentration de 107CFU.mL-1. Les cellules Caco-2 sont ensemencées en plaques 24 puits à une concentration de 40.000 cellules par puits dans un volume de 500 µL de DMEM complet. Après incubation pendant 7 jours à 37°C, 5 % de CO2, les cellules sont lavées deux fois avec un tampon PBS.
Un volume de 300 µL de suspension bactérienne est ajouté dans chaque puits, la plaque est ensuite incubée à 37°C, 5 % de CO2, pendant 2 h. La suspension bactérienne utilisée est conservée pour détermination de la concentration en CFU. Après 2 h de contact, les cellules Caco-2 sont lavées deux fois avec du tampon PBS afin de retirer les bactéries non adhérentes. Les cellules intestinales sont ensuite lysées par l’ajout de 100 µL de tampon PBS supplémenté avec du Triton X-100 à 0,1 % (v/v). Après incubation pendant 15 min à température ambiante, le lysat et la suspension mère utilisée sont dilués successivement (1/10) en PBS, puis étalés sur une gélose MRS. Les plaques ensemencées sont incubées 48 h à 37°C en condition anaérobie. Après dénombrement et détermination de la concentration bactérienne en CFU.mL-1, le pourcentage de cellules bactériennes adhérentes est calculé par rapport à la concentration obtenue dans la suspension mère représentant la quantité de bactéries ajoutée au début de l’expérience (fixée à 100 %).
Comme indiqué précédemment, la souche VF46A est particulièrement adhérente aux cellules intestinales avec 4,63 % de cellules adhérentes après contact.
Etude de l’impact des souches sur le métabolisme du calcium et de la vitamine D
Protocole général de contact entre les souches bactériennes et les cellules intestinales
Ce protocole de contact est utilisé pour chaque technique employée dans cette partie. La souche bactérienne est cultivée en MRS pendant 24 h à 37°C en condition anaérobie. Les cellules sont récupérées par centrifugation à 10.000 rpm pendant 10 min puis resuspendues dans un tampon PBS, cette étape est répétée une seconde fois pour laver les cellules bactériennes. Une suspension bactérienne est finalement préparée avec du milieu DMEM sans ajout à une concentration de 107CFU.mL-1.
Les cellules HT-29 MTX sont ensemencées en plaque 24 puits à une concentration de 40.000 cellules par puits dans un volume de 500 µL de DMEM complet. Les cellules Caco-2 sont ensemencées en plaque 96 puits à une concentration de 8.000 cellules par puits dans un volume de 200 µL de milieu DMEM complet. Pour une autre expérience, les cellules Caco-2 sont ensemencées sur inserts placés en plaque 12 puits (membrane en polyester, 0,4 µm, Costar®, Corning, New-York, Etats-Unis) côté apical dans un volume de 500 µL de milieu DMEM complet, un volume de 1.500 µL de ce même milieu est ajouté du côté basal de l’insert. Toutes les cultures cellulaires sont cultivées pendant 15 jours avec un renouvellement du milieu tous les 2 jours lors de la deuxième semaine de culture.
Les cellules intestinales sont lavées deux fois avec du tampon PBS avant le contact avec la souche bactérienne. Un volume de 150 µL de suspension bactérienne est ajouté dans chaque puits pour une culture en plaque 96 puits, et un volume de 300 µL est quant à lui ajouté pour un contact en plaque 24 puits ou en inserts sur plaque 12 puits. Dans tous les cas, le contact a lieu pendant 24 h à 37°C, 5 % de CO2. Le contrôle négatif utilisé est un tampon PBS dilué dans du milieu DMEM complet.
Mesure du transport total du calcium
Le transport total du calcium est défini comme étant la part de calcium passant du pôle apical (qui correspond à l’intérieur de l’intestin) au pôle basal (qui correspond à la circulation sanguine) en traversant la barrière épithéliale. Ce transport est évalué par la variation de la concentration en calcium au pôle basal de la barrière cellulaire au cours du temps. Les cellules Caco-2 cultivées en inserts en plaque 12 puits sont utilisées pour cette expérience.
Au début du contact avec la souche bactérienne (t = 0 h), 10 µL d’une solution de chlorure de calcium (CaCl2) à 250 mM sont ajoutés côté apical de l’insert. Durant le contact, des prélèvements de 100 µL sont réalisés du côté basal de l’insert à 30 min, 7 et 24 h de contact. Les échantillons sont conservés à -20°C jusqu’à analyse.
Au moment des différents prélèvements, une mesure de la résistance électrique transépithéliale (TEER) est réalisée pour vérifier l’intégrité de la barrière de cellules Caco-2. Cette résistance est mesurée par un voltmètre/ohmmètre MilliCell Electrical Resistance System (Merck Millipore, Burlington, Etats-Unis). Un insert vide sans cellules est utilisé comme blanc pour obtenir la résistance de la barrière cellulaire. La résistance (en Ω) de chaque puits mesurée est ensuite multipliée par l’aire de l’insert (égale à 1,12 cm² pour l’insert utilisé) pour donner une résistance en Ω.cm-2. Les résultats sont exprimés en pourcentage de la valeur obtenue à 30 min de contact (fixée à 100 %) pour chaque puits.
Afin de mesurer le transport total du calcium, un dosage de la concentration en calcium est réalisé dans les prélèvements réalisés au pôle basal de la membrane de cellules Caco-2 au cours du contact. La détermination de la concentration en calcium est réalisée en utilisant le kit calcium colorimetric assay (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis). Ce kit est basé sur la réaction colorimétrique entre les ions calcium et l’ortho-crésolphtaléine formant un complexe coloré pouvant être détecté à 575 nm (Morin, 1974). Le dosage est réalisé à partir de 25 µL d’échantillons dilués (1/2) dans l’H2O Milli-Q®, en suivant le protocole du kit. La mesure de l’absorbance des échantillons à 575 nm est réalisée par un spectrofluorimètre Xenius XC (Safas Monaco, Monaco, France). La concentration en calcium dans les échantillons est déterminée au moyen d’une gamme étalon de CaCl2, elle est ensuite exprimée en fonction du ratio de la concentration à l’instant t sur la concentration au temps t = 30 min de contact.
Les résultats représentés sur la fig. 3 montrent que la TEER augmente au cours du temps d’incubation avec la souche ainsi que dans la condition contrôle (tampon PBS). Néanmoins, aucune différence significative n’a été constatée entre une incubation avec la souche bactérienne et le tampon PBS ce qui suggère que la souche VF46A n’entraine pas de perturbations dans l’intégrité de la membrane de cellules Caco-2 durant l’expérience.
Concernant le transport total du calcium, les résultats de la fig. 4 indiquent que la souche VF46A ne permet pas de moduler significativement l’absorption du calcium après 7 h de contact par rapport au tampon PBS. Cependant, après 24 h d’incubation, la concentration en calcium diminue dans le compartiment basal pour la condition contrôle, tandis qu’une augmentation significative de la quantité de calcium est observée pour la souche VF46A. Ces résultats suggèrent que la souche est capable de moduler positivement le transport total du calcium de l’intérieur de l’intestin vers la circulation sanguine à travers la paroi intestinale, après 24 h d’incubation avec les cellules Caco-2.
Mesure de l’incorporation du calcium au sein des cellules intestinales
Contrairement à l’expérience précédente, l’objectif ici est de déterminer la capacité des cellules à incorporer du calcium dans le compartiment intracellulaire. Le calcium incorporé est détecté par spectrofluorimétrie au moyen d’une sonde fluorescente présente dans le cytoplasme des cellules. Les cellules Caco-2 ensemencées en plaques 96 puits sont utilisées pour cette expérience, après contact avec la souche bactérienne, les cellules sont lavées deux fois avec un tampon PBS avant d’incorporer la sonde fluorescente.
La molécule utilisée pour détecter le calcium est une sonde Green FluoForte® fournie avec le kit FluoForte® calcium assay (Enzo Life Sciences, Farmingdale, Etats-Unis). Cette sonde est ajoutée sur les cellules sous une forme estérifiée acetoxyméthyle (AM) non fluorescente, une fois incorporée, le groupement lipophile bloquant la fluorescence est clivé par des estérases cellulaires non spécifiques, ceci entraine l’activation de la sonde qui va émettre une fluorescence une fois liée au calcium. Sous sa forme active la sonde ne peut être rejetée par les cellules du fait de la présence d’un inhibiteur d’efflux (ajouté au même moment).
Après rinçage des cellules Caco-2, la sonde est ajoutée en suivant les instructions du kit, la plaque est ensuite incubée à température ambiante pendant 1 h le temps de pénétration de la sonde. L’émission de fluorescence est ensuite suivie par un spectrofluorimètre Xenius XC (Safas Monaco, Monaco, France) avec une longueur d’onde d’excitation à 490 nm pour une émission suivie à 525 nm. L’émission est mesurée pendant 30 sec avec une injection de 25 µL d’une solution de CaCl2à 250 mM entre 9 et 10 sec de cinétique au moyen d’un module d’injecteurs couplé au spectrofluorimètre. Cette injection provoque une entrée brutale de calcium au sein des cellules intestinales conduisant à une augmentation de l’émission de fluorescence. La capacité de la souche à moduler l’incorporation du calcium est déterminée par cette augmentation de fluorescence après injection du calcium. Les résultats sont ainsi exprimés pour chaque puits en fonction de la moyenne de fluorescence mesurée entre 0 et 9 sec de cinétique qui est considérée comme la fluorescence basale d’un puits. Un ratio d’augmentation de fluorescence, pour les différentes conditions de contact, est donc obtenu.
Les résultats visibles sur la fig. 5 indiquent qu’une incubation avec un tampon PBS (courbes en pointillés) entraine une augmentation du ratio de fluorescence de 1 à 1,3-1,4. En comparaison la souche VF46A (trait plein) conduit elle à une augmentation significative de l’incorporation du calcium par rapport au contrôle, le ratio de fluorescence passant en effet de 1 à 1,4-1,5 suggérant une capacité de modulation de l’incorporation de calcium par les cellules intestinales.
Etude de l’expression de différents gènes impliqués dans le métabolisme du calcium et de la vitamine D
Dans cette partie, les changements dans l’expression de plusieurs gènes après contact de 24 h entre la souche et les cellules HT-29 MTX ont été étudiés. Le contact a eu lieu en plaque 24 puits comme décrit précédemment.
Après contact, les cellules HT-29 MTX sont rincées deux fois avec du tampon PBS. L’extraction des ARN est ensuite réalisée par le réactif TRIzol™ (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis).
Les échantillons d’ARN ont d’abord été traités à la DNase pour éliminer les éventuels fragments d’ADN co-extrait et/ou restant suite à l’extraction. Un volume de 8 µL contenant 1.000 ng d’ARN est mélangé avec 1 µL de DNase, et 1 µL de tampon DNase (ThermoScientific, Waltham, Etats-Unis). La réaction a lieu à 37°C pendant 30 min dans un thermocycler Mastercycler gradient (Eppendorf, Hambourg, Allemagne), elle est stoppée par l’ajout d’1 µL de solution d’EDTA à 50 mM (ThermoScientific, Waltham, Etats-Unis) suivi d’une incubation à 65°C pendant 10 min. Par la suite, les échantillons ont été rétro-transcrits en ADNc en utilisant le kit RevertAid H minus first strand cDNA synthesis (ThermoScientific, Waltham, Etats-Unis), selon les instructions fournies.
Pour la réaction de qPCR, les échantillons d’ADNc sont dilués (1/16) dans l’H2O. Pour un volume de 2 µL d’échantillon, 18 µL de mélange qPCR sont ajoutés contenant 10 µL de Power SYBR® Green PCR Master Mix (2×) (Applied Biosystems, Life Technologies, Foster City, Etats-Unis), 0,6 µL de chaque amorce (10 µM) et 6,8 µL d’H2O. La fluorescence est suivie pendant la réaction dans un thermocycler CFX Connect Real Time Detection System (Bio-Rad, Hercules, Etats-Unis). Après une étape de dénaturation à 95°C pendant 10 min, 40 cycles de PCR sont réalisés successivement, un cycle comprend une dénaturation à 95°C pendant 15 sec, une hybridation de 58°C à 61°C en fonction du couple d’amorces utilisé pendant 30 sec et une élongation à 72°C pendant 30 sec. La réalisation d’une courbe de fusion (melting curve) termine la réaction.
Dans cette partie, 2 gènes sont étudiés, il s’agit du gène codant pour le récepteur à la vitamine D (vitamin D receptor) (vdr) et enfin le gène codant pour le transporteur du calcium (transient receptor potential selective for calcium) (trpv6) également appelé CaT1 (calcium transporter 1). L’expression de ces gènes est normalisée par rapport à celle du gène codant pour la peptidylprolyl isomerase A (ppiA) pris pour référence. Les couples d’amorces utilisés pour les gènes étudiés, ainsi que leurs températures d’hybridation, sont présentés dans le tableau ci-dessous :
Gène Amorces (5’-3’) Taille de l’amplicon (pb) Tm (°C)
vdr Forward : GCCACCTGCTCTATGCCAAG
(SEQ ID NO1)
Reverse : CAGGCTGTCCTAGTCAGGAGAT
(SEQ ID NO 2)		 171 61
trpv6 Forward : TGATGCGGCTCATCAGTGCCAGC
(SEQ ID NO 3)
Reverse : GTAGAAGTGGCCTAGCTCCTCG
(SEQ ID NO 4)		 251 58
ppia Forward : TGCTGACTGTGGACAACTCG
(SEQ ID NO 5)
Reverse : TGCAGCGAGAGCACAAAGAT
(SEQ ID NO 6)		 136 60
Les résultats visibles sur les figures 6a et 6b montrent que l’expression du gène codant pour le récepteur à la vitamine D (vdr) est significativement augmentée en présence de la souche VF46A. Elle est augmentée de 1,8 fois par rapport à l’expression en présence d’un tampon PBS (Figure 6a). De plus, le traitement par la souche de l’invention entraine une augmentation dans l’expression du gène codant pour le transporteur du calcium (trpv6). L’expression de ce gène en présence de la souche de l’invention est au moins 3 fois supérieure au contrôle (Figure 6b). En résumé, la souche VF46A module l’expression des gènes trpv6 et vdr chez les cellules HT-29 MTX. Au regard des précédents résultats, la souche a également permis d’améliorer l’incorporation du calcium par les cellules Caco-2. L’ensemble de ces données suggèrent ainsi une capacité de la souche VF46A à moduler l’absorption du calcium intestinal en agissant sur la voie transcellulaire de l’absorption.
Test de prolifération cellulaire sur des cellules cancéreuses
La souche de l’invention est cultivée et préparée comme décrit précédemment ; une suspension en milieu DMDM est préparée à une concentration de 107CFU.mL-1. Les cellules HT-29 MTX sont ensemencées en plaques 24 puits à une concentration de 40.000 cellules par puits dans un volume de 500 µL de DMEM. Après incubation pendant 11 jours à 37°C, 5 % de CO2, les cellules sont lavées deux fois avec un tampon PBS puis incubées pendant 24h dans un milieu DMEM. Après incubation, un volume de 500 µL de suspension bactérienne est ajouté dans chaque puit et la plaque est à nouveau incubée 24h à 37°C, 5 % de CO2. La condition contrôle correspond à une incubation dans un milieu DMEM sans bactéries. Après contact avec les cellules bactériennes de la souche de l’invention, les cellules HT-29 MTX sont lavées deux fois avec un tampon PBS puis récupérées par l’ajout de 200 µL d’un mélange de trypsine/EDTA. Après centrifugation à 1.500 rpm pendant 5 min, 3 mL de milieu DMEM sont ajoutés afin d’inactiver la trypsine puis les cellules sont lavées dans un tampon PBS en répétant les étapes de centrifugation et resuspension. Les cellules sont finalement fixées dans une solution d’éthanol à 66 % pendant 12h à 4°C. L’évaluation de la prolifération cellulaire a été évaluée via le kit FxCycle™ PI/RNase Staining Solution (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Etats-Unis) suivi d’une analyse au cytomètre en flux (Attune NxT Flow Cytometer, Thermo Fisher Scientific) permettant de différencier les cellules en phases G0/G1 des celles en phases G2/M. Les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules en phase G2/M par rapport au nombre total de cellules analysées. Les résultats sont visibles sur la Fig. 7. Au vu des résultats représentés sur la Fig. 7, on constate que les cellules cancéreuses qui ont été mises au contact de la souche de l’invention se divisent moins que les cellules cancéreuses qui n’ont pas été mises au contact des cellules de la souche de l’invention. Le pourcentage de cellules entrant en phase G2/M est réduit d’environ 45% avec la souche de l’invention.
Analyses statistiques
La significativité des résultats précités a été évaluée par une analyse de la variance (ANOVA) à un facteur suivi d’un test de Tukey pour la comparaison multiple des moyennes. Concernant l’expérience de transport du calcium au travers d’une membrane de cellules Caco-2, le test post-ANOVA est un test de Dunn aboutissant à une comparaison à la moyenne de la condition contrôle. La différence entre les moyennes est considérée comme significative pour une p value < 0,05. Les tests statistiques ont été conduits sous le logiciel R (R core team, 2016, Vienne, Autriche), sur le package R Commander.
Résultats concernant la souche VFH049
La soucheLactobacillus helveticusVFH049 a été déposée par la Demanderesse, le 19 février 2019 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), cis au 25 rue du Docteur ROUX 75724 Paris Cedex 15 sous le numéro d’ordre CNCM-I-5403 (dépôt selon le traité de Budapest).
Cette souche est décrite dans la demande de brevet FR 1902851 dont le contenu est incorporé par référence à la présente demande. Elle a été isolée à partir de lait de jument provenant de Mongolie.
La souche VFH049 produit par fermentation du lait de vache des molécules (peptides) capables d’inhiber l’ACE. La fermentation est conduite de la manière suivante :
La souche est cultivée en bioréacteur de 500 mL (MiniBio 500, my-Control, Applikon Biotechnology, Delft, Pays-Bas). Le milieu est constitué de lait écrémé (10 g/L (voir paragraphe précédent), autoclavé 30 min à 110°C. La souche est inoculée à une DO600égale à 0,3. La fermentation est conduite pendant 72h à une température constante de 40°C avec une agitation de 300 rpm dans un volume final de 330 mL. La condition anaérobie est obtenue par injection de N2dans le bioréacteur à un débit de 20 mL/min. Tout au long de l’expérience, le pH est maintenu à 6 grâce à des solutions d’HCl (1 M) et de NaOH (3 M), l’approvisionnement est réalisé au moyen de deux pompes péristaltiques localisées sur l’unité de contrôle du bioréacteur. Des prélèvements d’environ 5 mL sont réalisés en condition d’asepsie à 0, 2, 17, 24, 41, 48, 65 et 72h de fermentation pour analyse de la croissance des souches bactériennes ainsi que de l’évolution de la concentration en peptides. Cette dernière est évaluée par un dosage au réactif FC après une précipitation au TCA. Un volume de 1 mL de fermentât est dilué (1/10) dans une solution d’EDTA 2 % (m/v) à pH 12 puis centrifugé à 13.400 rpm pendant 10 min, et 25 µL de surnageant sont analysés par SEC. Le culot bactérien est re suspendu dans 1 mL de tampon PBS pour mesure de la DO600afin d’évaluer la croissance bactérienne. Après 72h de fermentation, l’intégralité du fermentat est récupérée puis centrifugée à 10.000 rpm pendant 10 min, le surnageant est ensuite stocké à -20°C jusqu’à analyse. La concentration en matière sèche dans les fermentats est mesurée au dessiccateur (XM60, Precisa, Poissy, France) et est toujours égale à 100 g/L. Afin de pouvoir confirmer l’impact de la fermentation bactérienne sur les propriétés du produit final, un contrôle est réalisé (CTLF). Il s’agit du milieu de fermentation incubé dans les mêmes conditions mais non inoculé. Après 72h d’incubation, ce milieu est centrifugé et stocké.
Afin d’éliminer les protéines non hydrolysées, une partie du fermentat brut est fractionnée au moyen d’une membrane d’ultrafiltration. La membrane est une cassette Hydrosart® (Sartocon® Slice Hydrosart® Cassette, Sartorius, Göttingen, Allemagne) de 0,1 m² avec un seuil de coupure de 10 kDa branchée sur un système Sartocon® Slice 200 Holder (Sartorius, Göttingen, Allemagne). L’alimentation du fermentat est réalisée par une pompe péristaltique et la pression du rétentat est maintenue à environ 1 bar pendant la filtration. Ainsi, le perméat d’ultrafiltration (UFP) contenant les molécules inférieures à 10 kDa est séparé du rétentat (UFR). Les deux sous-fractions sont ensuite conservées à -20°C jusqu’à analyse. Les perméats d’ultrafiltration sont séchés jusqu’à 10 % du volume initial par évaporation centrifuge (miVac, Gene Vac, Ipswich, Royaume-Uni) pendant 15h à 40°C. La concentration en matière sèche dans les produits (fermentat et fermentat ultrafiltre) est ensuite mesurée au dessiccateur (XM60, Precisa, Poissy, France).
Le filtrat précité qui est un mélange de peptides à une activité inhibitrice de l’ACE.
Absorption du calcium par la souche V F H049
Les mêmes expérimentations que précitées ont été réalisées avec la souche VFH049.
Les résultats montrent que la TEER augmente au cours du temps d’incubation avec les souches ainsi que dans la condition contrôle (tampon PBS). Ainsi, pour la souche VFH049, la TEER passe de 100% à t=0 à 245% au bout de 24h de manière quasi linéaire. Par ailleurs, on constate que la souche VFH049 ne permettent pas de moduler significativement l’absorption après 7h de contact par rapport au tampon PBS. Cependant, après 24h d’incubation, la concentration en calcium diminue dans le compartiment basal pour la condition contrôle, tandis qu’une augmentation significative de la quantité de calcium est observée pour la souche VFH049. Ainsi, pour la souche VFH049, le ratio concentration à t=2h / concentration à t=0 atteint la valeur de 1,08.
Le ratio d’émission de fluorescence sur l’émission basale est de 1,08 pour le PBS, de 1,23 pour le fermentat contrôle et de 1,31 pour le fermentat produit par la souche VFH049. Lorsque les fermentats ultrafiltrés sont testés, l’effet est prononcé pour la souche VFH049. La souche VFH049 favorise donc l’absoprtion du calcium.
Les échantillons de fermentat obtenus par fermentation de la souche VFH049 ont été mis en contact avec les cellules Caco-2 et les variations de l’expression du gènetrpv6ont ensuite été étudiées par qPCR.
Le fermentat produit par la souche VFH049 entraîne une surexpression du gène 20 fois supérieure au contrôle. L’effet des fermentats ultrafiltrés est moins prononcé, non significatif même si une tendance à l’induction du gène est clairement visible (résultats non présentés). Les fermentats souches sont donc capables de moduler à la fois l’incorporation du calcium et l’expression detrpv6par rapport au lait non fermenté.
S’agissant de la souche VFH049, elle entraîne une augmentation dans l’expression du gène codant pour le transporteur du calcium (trpv6) d’au moins 3 fois supérieure au contrôle (résultats non représentés).
Par ailleurs, le % de cellules adhérentes aux cellules Caco-2 est de 1,48 ±0,41 pour la souche VFH049. La souche VFH049 est beaucoup plus adhérente aux cellules intestinales ce qui tend à indiquer qu’elle est davantage susceptible d’avoir une action probiotique.

Claims (10)

  1. Souche isolée deLactobacillus p lantarumVF46A déposée auprès de la CNCM sous le numéro CNCM I-5301 le 29 mars 2018.
  2. Souche selon la revendication 1 pour son utilisation en tant que médicament.
  3. Souche selon la revendication 2 pour son utilisation dans le traitement d’une condition physiologique anormale liée à l’absorption intestinale du calcium et notamment liée à un déficit de l’absorption intestinale du calcium, et en particulier pour le traitement d’une pathologie ou d’un syndrome choisi parmi l’ostéoporose, le diabète de type 2, l’hypertension, les pathologies cardiaques liées au calcium sanguin, l’obésité et le syndrome métabolique, le cancer, en particulier le cancer du côlon, le cancer de la prostate, le cancer des ovaires et le cancer du sein, les pathologies liées à une altération du métabolisme intestinal, en particulier les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, pour son utilisation en tant qu’immunorégulateur ou anti-inflammatoire ou pour son utilisation dans le traitement d’une condition physiologique anormale liée directement ou non à un dysfonctionnement du récepteur de la vitamine D, du transporteur TRPV6 ou d’une dérégulation des mécanismes de signalisation cellulaire impliquant le calcium, en particulier l’apoptose et la prolifération cellulaire.
  4. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu’elle contient en tant qu’ingrédient actif, une souche selon l’une quelconque des revendications précédentes et un excipient pharmaceuticalement acceptable.
  5. Complément alimentaire caractérisé en ce qu’il contient la souche selon la revendication 1.
  6. Complément alimentaire selon la revendication 5 caractérisé en ce qu’il contient au moins 105CFU de ladite souche.
  7. Complément alimentaire selon les revendications 5 ou 6, caractérisé en ce qu’il contient du calcium et/ou de la vitamine D.
  8. Aliment notamment fermenté, à l’exception du yaourt de lait de dzomo, caractérisé en ce qu’il contient la souche selon la revendication 1.
  9. Aliment selon la revendication 8, caractérisé en ce qu’il est choisi parmi les yaourts obtenus à partir de lait animal ou végétal, les fromages frais ou fermentés obtenus à partir de lait animal ou végétal, les laits d’origines animales ou végétales, les kéfirs de lait d’origine animale ou végétale et les préparations obtenues par coagulation de la caséine.
  10. Composition choisie parmi les compositions alimentaires ou pharmaceutiques caractérisée en ce qu’elle contient la souche selon la revendication 1 et la souche deLactobacillus helveticusVFH049 déposée à la CNCM sous le numéro d’ordre CNCM-I-5403.
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