FR3083804A1

FR3083804A1 - Micro-organismes et procede pour la production d'acide glycolique a partir de pentoses et d'hexoses

Info

Publication number: FR3083804A1
Application number: FR1856511A
Authority: FR
Inventors: Clea Lachaux; Thomas Walther; Jean-Marie Francois
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse; Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Priority date: 2018-07-13
Filing date: 2018-07-13
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2038-07-13
Also published as: FR3083804B1; BR112021000517A2; EP3799600A1; CN112752840A; US11851696B2; US20210171989A1; CA3104953A1; WO2020012138A1

Abstract

La présente invention concerne un micro-organisme recombinant qui présente (i) une activité de conversion du D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose-5-phosphate , augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié ; (ii) une activité de catalyse du clivage du D-arabinose-5-phosphate en D-glycéraldéhyde-3-phosphate et glycolaldéhyde, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié ; (iii) une activité d'oxydation du glycolaldéhyde en glycolate, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié ; et (iv) une activité d'oxydation du glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3-bisphosphoglycérate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié. La présente invention concerne également un procédé pour préparer de l'acide glycolique à partir de pentoses et/ou d'hexoses, utilisant un tel micro-organisme recombinant. La présente invention concerne aussi un procédé de production de l'acide glycolique impliquant une phase de production de biomasse et une phase de bioconversion des hexoses et/ou pentoses en acide glycolique.

Description

MICRO-ORGANISMES ET PROCÉDÉ POUR LA PRODUCTION D'ACIDE GLYCOLIQUE À PARTIR DE PENTOSES ET D'HEXOSES

DESCRIPTION

DOMAINE TECHNIQUE

La présente invention appartient au domaine technique de la bioconversion d'une source carbonée en au moins un métabolite d'intérêt et notamment en acide glycolique.

Plus particulièrement, la présente invention concerne un microorganisme dont le métabolisme carboné central a été remanié de façon à convertir les hexoses et les pentoses, issus d'une source carbonée et, notamment, de la biomasse végétale en acide glycolique. La présente invention concerne également un procédé pour produire de l'acide glycolique à partir d'hexoses et de pentoses contenus dans la biomasse végétale mettant en œuvre un tel micro-organisme.

ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE

L'acide glycolique ou acide hydroxyacétique de formule HO-CH2-C(=O)OH trouve de nombreuses applications dans différents domaines. En effet, à titre illustratif, il peut être utilisé comme agent régulateur de pH ou agent kératolytique en cosmétique et en pharmaceutique, comme agent de teinture et de tannage dans l'industrie textile ou encore comme désinfectant dans l'industrie agro-alimentaire. L'acide glycolique permet également de produire des polymères comme des résines thermoplastiques comprenant du poly(acide glycolique). De tels polymères présentent des propriétés de barrière au gaz remarquables et ont la capacité de s'hydrolyser dans des environnements aqueux de façon graduelle et contrôlable, faisant de ces polymères de bons candidats pour des matériaux d'emballage ou matériaux résorbables utiles dans le domaine biomédical.

Même si l'acide glycolique peut être obtenu à partir d'extrait de canne à sucre, de betterave ou de raisin, sa production à l'échelle industrielle est issue de la synthèse chimique. Plusieurs de ces synthèses utilisent, comme réactif de départ, du formaldéhyde qui est un composé irritant et cancérogène, ce qui exclut toute trace de cette substance dans des préparations bénéficiant d'Autorisation de Mise sur le Marché.

Par conséquent l'acide glycolique bio-sourcé présente un intérêt dans les domaines pharmaceutiques, cosmétiques mais aussi textiles. Sous forme polymérisée, le poly(acide glycolique) et les polymères contenant du poly(acide glycolique) pourrait représenter une nouvelle génération de bio-plastiques d'emballage et de polymères biorésorbables [1], C'est pourquoi depuis quelques années, plusieurs équipes de recherche s'intéressent à sa production par voie microbienne.

L'acide glycolique peut être naturellement produit en faibles quantités via la réduction du glyoxylate chez les bactéries et les moisissures, y compris la levure [2], Les premiers projets d'ingénierie se sont inspirés du métabolisme naturel. Le rendement théorique maximum qui peut être atteint par cette voie naturelle est de 2 moles d'acide glycolique (AG) par mole d'hexose et 1,66 mole par mole de pentoses (ou 0,84 g AG/ g sucre).

Ainsi, un procédé de bioproduction d'acide glycolique basé sur l'amélioration du métabolisme naturel chez Escherichia coli a fait l'objet de la demande internationale WO 2007/141316 [3]. Cette voie est dénommée, par la suite, « voie du shunt du glyoxylate (SG) ». Dans le procédé décrit, les réactions consommant le glyoxylate et les enzymes métabolisant le glycolate ont été délétées, tandis que la NADPH glyoxylate reductase qui convertit le glyoxylate en glycolate a été surexprimée et ce, afin d'augmenter le rendement en acide glycolique. Le système de régulation du cycle glyoxylate a également été modifié pour lever les inhibitions et augmenter le flux de carbone vers le glyoxylate. Depuis le travail décrit dans [3], d'autres modifications ont été apportées pour améliorer la production d'acide glycolique à partir de (D)-glucose, ce qui a permis d'atteindre 92,9% du rendement théorique maximal [4],

Toutefois, d'un point de vue stoechiométrique, cette voie de synthèse n'est pas optimale, le rendement théorique est limité par la perte de carbone due à la décarboxylation du pyruvate en acétyl-CoA. Dans ce contexte, la substitution et/ou complémentation du métabolisme naturel par une voie synthétique pour l'assimilation des sucres et la production d'acide glycolique est une stratégie envisageable pour lever cette limitation.

Dans ce but, une voie semi-synthétique d'assimilation des pentoses a été décrite dans la demande internationale WO 2017/059236 [5]. Cette voie implique la phosphorylation en position 1 du cycle du (D)-ribulose ou du (L)-xylulose et est dénommée, par la suite, « voie de ribulose-l-P ». Cette voie synthétique permet l'assimilation des pentoses, plus particulièrement l'assimilation du (D)-xylose qui est le pentose majoritaire de l'hémicellulose. Le rendement sur (D)-xylose est de 0,44 g/g [6]. A noter toutefois que la voie décrite dans la demande internationale WO 2017/059236 [5] nécessite, pour être fonctionnelle, de réduire ou d'inactiver l'activité de la xylulokinase et de surexprimer les quatre enzymes suivantes : une épimérase qui interconvertit le xylulose et le ribulose, une (D)-ribulose-phosphate aldolase, une D-ribulokinase et une glycolaldéhyde déshydrogénase.

Une autre voie synthétique pour la production d'acide glycolique a été développée et a fait l'objet de la demande internationale WO 2016/079440 [7], Cette voie synthétique phosphoryle des sucres pentoses sur le premier carbone (Cl) au lieu du carbone 5 (C5) comme c'est le cas dans la voie des pentoses phosphate. Cette réaction de phosphorylation catalysée par une ketohexokinase hétérologue, issue de mammifères, est suivie d'une réaction de clivage par une aldolase conduisant à une molécule en C3 (dihydroxyacétone-P) et C2 (glycolaldéhyde). Ce dernier par une réaction d'oxydation catalysée par une glycoladéhyde déshydrogénase conduit à la synthèse d'acide glycolique ou par une réaction de réduction catalysée par une réductase endogène à l'éthylène glycol. Cette voie synthétique, dénommée, par la suite, « voie du xylulose-l-P » implique trois enzymes différentes et non cinq comme dans [5] et permet d'obtenir une production théorique molaire en acide glycolique et éthylène glycol (1 mole par mole de sucres pentoses).

Il convient de souligner que les voies synthétiques indépendantes de la voie du glyoxylate décrites dans [5] et [7] ne présentent pas d'étape de décarboxylation et donc de perte de CO2 mais génèrent, toutes deux, un composé en C3 à savoir de la dihydroxyacétone phosphate (DHAP), ce qui limite le rendement théorique maximal en acide glycolique.

Aussi, afin de pouvoir utiliser la DHAP pour la production d'acide glycolique, les voies synthétiques décrites dans [5] et [7] ont été couplées avec la voie naturelle optimisée décrite dans [3]. La combinaison des voies décrites dans [7] et [3] a abouti à un rendement de 0,63 g d'acide glycolique par g de sucres mais le rendement théorique maximal est encore limité du fait de la perte de CO₂, conséquence de l'utilisation de la voie naturelle optimisée [8].

Dans une correspondance adressée à Nature Biotechnology [9], Dugaret Stephanopolous ont introduit la notion de « rendement énergétique maximal (Y^E) ». Ce rendement est calculé purement sur la base de la balance énergétique entre le substrat et le produit, ce qui se traduit pratiquement en tenant compte de l'état redox du substrat et du produit. Ainsi, Y^E est déterminé par le ratio ys/yp où ys et ypsont les degrés de réduction du substrat et du produit. Par exemple, le degré de réduction du glucose ys est égal à 24 alors que celui du produit éthanol γρ est égal à 12. Donc le Y^E égale 2. D'autre part, le rendement de la voie métabolique (Y^p) dépend de la voie ou du réseau métabolique et il est calculé à partir de la stoechiométrie de la voie considérée. Ainsi, pour le cas de la fermentation de glucose en éthanol, Y^p est égal à 2 et on trouve que Y^E égale Y^p. Cette égalité n'est pas retrouvée pour tous les cas. Par exemple, la conversion de glucose en acétate se traduit par un rendement Y^p de 2 mais le rendement énergétique maximum Y^Eest de 3. Il y a donc une perte potentielle de 33% de matière qui s'explique par la voie métabolique naturelle. Cependant, l'équipe de Liao et al ont montré qu'il était possible de construire des voies métaboliques viables conduisant à la production de 3 moles d'acétate par mole de glucose [10]. Selon le même principe, on peut calculer que le rendement énergétique maximum d'acide glycolique (γρ = 6) produit à partir de glucose (y_s = 24) serait de 4 et à partir de pentose (γ_ρ = 20) serait de 3,3. Toutefois, ce rendement ne peut être atteint que si le système biologique est capable de capturer une mole de carbone sous forme de CO₂.

Partant de ce postulat et au vu de l'intérêt grandissant pour les produits issus de ressources carbone renouvelables, les inventeurs se sont fixés pour but de proposer un micro-organisme et un procédé permettant de produire, de façon simple, industrialisable à partir de biomasse végétale et notamment à partir des hexoses et pentoses contenus dans cette dernière, de l'acide glycolique avec des rendements améliorés par rapport aux procédés de l'art antérieur.

A cet effet, le Tableau 1 ci-après présente les rendements théoriques des voies de l'art antérieur de production d'acide glycolique (mol/mol) selon la source de carbone utilisée.

Tableau 1

	Xylose	Glucose	Référence
Voie du shunt glyoxylate (SG)	1,66	2	[3]
Voie Ribulose-lP	1	0	[5]
Voie Xylulose-lP	1	0	[7]
Voies Ribulose-lP + SG	2	2	[6]
Voies Xylulose-lP + SG	2	2	[8]

EXPOSÉ DE L'INVENTION

La présente invention permet de résoudre les problèmes techniques des procédés de l'art antérieur tels que précédemment définis et d'atteindre le but que se sont fixé les inventeurs.

En effet, les travaux des inventeurs ont identifié trois enzymes permettant de construire la voie non-naturelle de synthèse d'acide glycolique présentée à la Figure 1, lesdites enzymes étant :

i) la D-arabinose-5-phosphate isomérase (KdsD), enzyme de la voie de synthèse des lipopolysaccharides qui convertit le D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose5-phosphate [11];

ii) la fructose-6-phosphate aldolase (FSA) qui catalyse le clivage du Darabinose-5-phosphate en D-glycéraldéhyde-3-phosphate et glycolaldéhyde ; à noter que cette enzyme avait été initialement identifiée comme catalysant le clivage aldolytique du fructose-6-phosphate en dihydroxyacétone et glycéraldéhyde-3-phosphate, mais a montré une activité aldolytique sur le D-arabinose-5-phosphate avec une affinité 10 fois plus élevée que pour le fructose-6-phosphate [12] et iii) l'aldéhyde déshydrogénase (AldA) qui oxyde le glycolaldéhyde en glycolate [13].

A noter que le premier substrat de cette nouvelle voie à savoir le Dribulose-5-phosphate est naturellement obtenu à partir des pentoses par la voie des pentoses phosphates (PP).

Même si ces trois enzymes sont naturellement exprimées dans les microorganismes comme E. coli, elles ne permettent pas la synthèse d'acide glycolique puisque la surexpression des gènes kdsD,fsa et aldA et donc la surexpression de ces enzymes sont nécessaires pour produire de l'acide glycolique. En d'autres termes, la voie de synthèse selon l'invention n'existe pas à l'état naturel dans les micro-organismes comme E. coli. On peut donc parler de « voie non-naturelle » ou de « voie métabolique synthétique ».

Par ailleurs, l'activité de la FSA sur la D-arabinose-5-phosphate génère du glycéraldéhyde 3P (C3) qui est pris en charge par la glycolyse oxydative. Comme décrit dans [8], cette molécule C3 peut donner du glycolaldéhyde mais avec perte de CO2 au niveau de la réaction catalysée par la pyruvate déshydrogénase. Pour contourner cette limite métabolique, les inventeurs ont remanié le métabolisme carboné central afin d'optimiser la conservation du carbone en récupérant ce C3 dans la voie des PP et ce, en atténuant et voire en inactivant le gène gapA codant de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase. Suite à cette atténuation/inactivation, le glycéraldéhyde-3-phosphate entre dans la voie des PP et participe à la synthèse de D-xylulose-5-phosphate, précurseur du D-ribulose-5-phosphate. Le rendement théorique maximal est alors de 2,5 moles d'acide glycolique par mole de pentose.

De plus, pour qu'un procédé soit économiquement viable, il faut qu'il puisse convertir les sucres lignocellulosiques majoritaires, soit les pentoses comme le Dxylose et les hexoses comme le D-glucose. Ce dernier est naturellement assimilé par la voie de la glycolyse. Ainsi, en inactivant/délétant le gène gapA, le flux de carbone est redirigé dans la voie des PP ce qui rend possible la conversion du D-glucose en acide glycolique avec un rendement maximal théorique de 3 moles d'acide glycolique par mole de D-glucose.

Le Tableau 2 ci-après reprend les rendements théoriques des voies de l'art antérieur et présente le rendement théorique de la voie selon l'invention de production d'acide glycolique (mol/mol) selon la source de carbone utilisée.

Tableau 2

	Xylose	Glucose	Référence
Voie du shunt du glyoxylate (SG)	1,66	2	[3]
Voie Ribulose-lP	1	0	[5]
Voie Xylulose-lP	1	0	[7]
Voies Ribulose-lP+ SG	2	2	[6]
Voies Xylulose-lP + SG	2	2	[8]
Voie selon la présente invention	2,5	3

Ainsi, la présente invention permet de réaliser la synthèse d'acide glycolique à partir d'hexoses et pentoses par une seule voie non naturelle, ce qui permet de valoriser au mieux le carbone renouvelable. Enfin, cette démarche lève la contrainte stoechiométrique imposée par le métabolisme d'E. coli. En outre, les calculs sur les rendements théoriques de la voie non naturelle d'assimilation des pentoses et hexoses décrite dans la présente invention, pour la production d'acide glycolique, permettent d'entrevoir une amélioration importante des rendements par rapport aux procédés de biosynthèse basés sur l'optimisation de voies naturelles et/ou semi-synthétiques de l'art antérieur.

Plus particulièrement, la présente invention concerne un microorganisme recombinant qui présente

i) une activité de conversion du D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose5-phosphate, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;

ii) une activité de clivage aldolique du D-arabinose-5-phosphate en Dglycéraldéhyde-3-phosphate et glycolaldéhyde, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;

iii) une activité d'oxydation du glycolaldéhyde en glycolate, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié ; et iv) une activité d'oxydation du glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3bisphosphoglycérate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.

Par « micro-organisme », on entend tout organisme qui existe sous la forme d'une cellule microscopique appartenant aussi bien au domaine des procaryotes qu'à celui des eucaryotes. Par conséquent, le terme « micro-organisme » englobe des micro-algues procaryotes, des bactéries, des archées et des eubactéries de toutes les espèces ainsi que des micro-organismes eucaryotes tels que des cellules végétales, des micro-algues eucaryotes, des levures et des champignons. Le terme comprend également des cultures cellulaires de toute espèce qui peuvent être cultivées pour la production d'acide glycolique.

A titre d'exemples de bactéries utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer les bactéries des familles Burkholderiaceae, Enterobacteriaceae, Brevibacteriaceae, Clostridiaceae, Bacillaceae, Moraxellaceae, Sphingomonadaceae, Lactobacillaceae, Streptomycetaceae, Streptococcaceae, Methylobacteriacae et Corynebacteriaceae. A titre d'exemples plus particuliers de bactéries utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Zymomonas mobilis, Ralstonia eutropha, Clostridium acetobutylicum, Methylobacterium extorguens et Lactococcus lactis.

A titre d'exemples de levures utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer les levures des familles Saccharomycetaceae, Pichiaceae, Schizosaccharomycetaceae et Yarrowia. A titre d'exemples plus particuliers de levures utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Candida blankii, Candida rugosa, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Pichia jadinii, Scheffersomyces stipitis, Pichia pastoris et Yarrowia lipolytica.

A titre d'exemples de champignons utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer les champignons des genres Pénicillium, Aspergillus, Chrysosporium et Trichoderma. A titre d'exemples plus particuliers de champignons utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer Pénicillium notatum, Pénicillium chrysogenum, Aspergillus niger, Chrysosporium pannorum et Trichoderma reesei.

Plus particulièrement, le micro-organisme mis en œuvre dans le cadre de la présente invention est une bactérie du type E. coli ou une levure du type Saccharomyces cerevisiae.

Par « micro-organisme recombinant », on entend un micro-organisme tel que précédemment défini qui n'est pas trouvé dans la nature et qui est génétiquement différent de son équivalent dans la nature. Les expressions « équivalent dans la nature », « micro-organisme non modifié », « micro-organisme naturel » et « micro-organisme de type sauvage » sont équivalentes et utilisables de façon interchangeable. Le microorganisme recombinant est modifié par introduction, par délétion et/ou par modification d'éléments génétiques.

Le micro-organisme recombinant utilisable dans la présente invention peut être modifié pour moduler le niveau d'expression d'un gène endogène. Par « gène endogène », on entend un gène qui était présent dans le micro-organisme avant toute modification génétique du micro-organisme de type sauvage.

Des gènes endogènes peuvent être surexprimés en introduisant des séquences hétérologues en plus ou en remplaçant des éléments régulateurs endogènes, ou en introduisant une ou plusieurs copies supplémentaires du gène dans un chromosome ou sur un ou plusieurs plasmide(s). Les gènes endogènes peuvent également être modifiés pour moduler leur expression et/ou leur activité. Par exemple, des mutations peuvent être introduites dans la séquence codante pour modifier le produit génique ou des séquences hétérologues peuvent être introduites en plus ou pour remplacer des éléments régulateurs endogènes. La modulation d'un gène endogène peut entraîner une régulation positive et/ou une augmentation de l'activité du produit génique endogène ou, en variante, réguler à la baisse et/ou diminuer l'activité du produit génique endogène.

Une autre manière de moduler l'expression d'un gène endogène est d'échanger le promoteur endogène de ce dernier comme le promoteur de type sauvage, avec un promoteur plus fort ou plus faible pour réguler à la hausse ou à la baisse l'expression du gène endogène. Ces promoteurs peuvent être homologues ou hétérologues.

En variante, le micro-organisme recombinant utilisable dans la présente invention peut également être modifié pour exprimer un gène exogène. Le microorganisme recombinant utilisable dans la présente invention peut être modifié pour exprimer des gènes exogènes si ces gènes sont introduits avec tous les éléments permettant leur expression dans ce micro-organisme. L'homme du métier connaît différentes méthodes de modification, de transformation ou de transfection d'un microorganisme avec un gène exogène. A titre d'exemple et de façon non exhaustive, cette méthode peut être une conjugaison ; une électroporation ; une lipofection ; une microinjection ; un bombardement avec des particules (ou biolistique) ; une transformation biologique d'un végétal en utilisant Agrobacterium tumefasciens ; une transformation par une perméabilisation chimique ; une transformation par la méthode DEAE-dextran ou une introduction via un virus, un virion ou une particule virale.

Par « gène exogène », on entend un gène qui a été introduit dans un micro-organisme, par des moyens bien connus de l'homme du métier alors que ce gène ne se trouve pas naturellement dans le micro-organisme. Des gènes exogènes peuvent être intégrés dans un ou le chromosome du micro-organisme ou être exprimés de manière extra-chromosomique aux moyens de plasmides, de vecteurs, de cosmides, de bactériophages ou de virus tel qu'un baculovirus. Un gène exogène peut être un gène homologue.

Par « gène homologue », on entend un gène homologue à un gène codant une protéine de référence et qui code une protéine homologue à cette protéine de référence. Par « protéine homologue à une protéine de référence », on entend une protéine ayant une fonction similaire et/ou une structure similaire que la protéine de référence. Ainsi, lorsque la protéine de référence est une enzyme, une protéine homologue à cette protéine de référence catalyse la même réaction enzymatique.

En utilisant les références données dans les bases de données de séquences d'acides aminés ou nucléotidiques telles que Genbank ou NCBI BioProject pour des gènes ou des protéines connus, l'homme du métier est capable de déterminer des gènes ou des protéines homologues i.e. équivalents dans d'autres organismes comme des souches bactériennes, levures, champignons, mammifères ou encore plantes. Ce travail de routine est avantageusement réalisé en utilisant des séquences consensus identifiées par des alignements de séquences avec des gènes ou protéines, dérivés d'autres organismes.

Typiquement, une protéine (ou un gène) homologue à une protéine de référence (ou un gène de référence) présente au moins 40%, au moins 45%, au moins 50%, au moins 55%, au moins 60%, au moins 65%, au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95% et/ou au moins 99% d'identité respectivement avec la séquence en acides aminés de la protéine de référence (ou la séquence nucléotidique du gène de référence). Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides aminés (ou entre deux séquences nucléotidiques), on entend, dans le cadre de la présente invention, un pourcentage de résidus d'acides aminés (ou de nucléotides) identiques entre les deux séquences comparées, ce pourcentage étant obtenu après mise en œuvre du meilleur alignement (alignement optimum) entre les deux séquences. L'homme du métier connaît différentes techniques permettant d'obtenir un tel pourcentage d'identité et impliquant des algorithmes d'homologie ou des programmes d'ordinateur tels que le programme BLAST.

Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une ou plusieurs activités enzymatique(s) augmentée(s) par comparaison au même microorganisme non modifié et au moins une activité enzymatique diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de certaines enzymes est augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié et l'activité intracellulaire d'au moins une autre enzyme est diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.

Dans la présente invention, le terme « activité » d'une enzyme est utilisé de façon interchangeable avec le terme « fonction » et désigne la réaction qui est catalysée par l'enzyme. L'homme du métier connaît différentes techniques pour mesurer l'activité enzymatique d'une enzyme donnée. La partie expérimentale ci-après présente différents essais enzymatiques utilisables pour mesurer l'activité d'enzymes impliquées dans la présente invention.

Dans le cadre de la présente invention, l'expression « activité augmentée » appliquée à une enzyme désigne une activité catalytique spécifique de l'enzyme augmentée et/ou une quantité ou disponibilité augmentée de l'enzyme dans la cellule.

Dans le cadre de la présente invention, une activité enzymatique augmentée dans le micro-organisme recombinant doit s'entendre comme une activité enzymatique qui est augmentée par un facteur d'au moins 2, notamment d'au moins 5, en particulier, d'au moins 10 et, plus particulièrement, d'au moins 20 par rapport à l'activité enzymatique du même micro-organisme non modifié.

L'homme du métier connaît différentes techniques de microbiologie et de biologie moléculaire utilisables pour obtenir, dans un micro-organisme donné, l'augmentation d'une activité enzymatique.

En effet, une augmentation de l'activité enzymatique peut être obtenue (i_a) en augmentant le nombre de copies du gène codant l'enzyme dans le micro-organisme, (iia) en augmentant l'expression du gène codant l'enzyme dans le micro-organisme, par exemple, en modifiant le promoteur, les régions régulatrices et/ou le site de fixation du ribosome, (iii_a) en modifiant la séquence du gène codant l'enzyme de façon à obtenir une forme plus active ou plus résistante à l'inhibition et, éventuellement, (iv_a) en combinant au moins deux des alternatives (i_a), (ii_a) et (iii_a).

En ce qui concerne l'alternative (i_a) ci-dessus, le gène peut être codé de manière chromosomique ou extrachromosomique. Lorsque le gène est localisé sur le chromosome, plusieurs copies du gène peuvent être introduites sur le chromosome par des méthodes de recombinaison, connues de l'homme du métier (y compris via le remplacement de gènes). Lorsque le gène est localisé de manière extra-chromosomique, il peut être porté par un vecteur d'expression recombinant.

Par « vecteur d'expression recombinant », on entend un acide nucléique adapté pour l'expression, dans un micro-organisme, d'au moins une enzyme codée par une séquence nucléotidique contenue dans ce vecteur. Le vecteur d'expression eucaryote selon la présente invention comprend, en plus de la séquence nucléotidique codant une enzyme d'intérêt, un (ou plusieurs) élément(s) qui permet(tent) l'expression i.e. la transcription et la traduction de cette séquence nucléotidique.

Le vecteur d'expression mis en œuvre dans la présente invention est avantageusement choisi parmi un plasmide, un cosmide, un bactériophage et un virus tel qu'un baculovirus. En particulier, le vecteur de l'invention est un vecteur à réplication autonome comportant des éléments permettant son maintien et sa réplication dans le micro-organisme comme une origine de réplication. En outre, le vecteur peut comporter des éléments permettant sa sélection dans le micro-organisme. Ces éléments sont également connus sous le terme de « marqueurs de sélection ». De tels vecteurs d'expression sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.

Un vecteur d'expression peut en outre présenter un ou plusieurs élément(s) choisi(s) parmi un promoteur, un amplificateur également connu sous le terme anglais de « enhancer », un signal 3' UTR (pour « UnTranslated Region »), un signal 1RES (pour « Internai Ribosome Entry Site »), un site de fixation du ribosome (en anglais RBS, pour « Ribosome Binding Site »), un signal de terminaison de la transcription comprenant un site de clivage et un signal polyA (pour « signal de polyadénylation »). Le vecteur d'expression selon l'invention peut comprendre 2, 3 ou 4 éléments listés ci-dessus. L'homme du métier est capable de choisir, dans cette liste, le ou les élément(s) additionnel(s) que peut comprendre le vecteur d'expression en fonction du microorganisme dans lequel l'expression doit être réalisée.

Par « marqueur de sélection », on entend un marqueur choisi parmi un marqueur de sélection utilisable chez les procaryotes ou chez les eucaryotes tel qu'un gène bactérien de résistance à un antibiotique et un gène du métabolisme à utiliser avec un micro-organisme auxotrophe i.e. un gène de sélection qui assure la complémentation avec le gène respectif délété au niveau du génome du micro-organisme hôte. Ainsi, le vecteur d'expression selon la présente invention peut contenir un gène bactérien de résistance à un antibiotique comme l'amoxicilline, l'ampicilline, la phléomycine, la kanamycine, le chloramphénicol, la néomycine, l'hygromycine, la généticine (ou G418), la carboxine, la nourséothricine ou le triclosan. A titre d'exemples illustratifs de gènes du métabolisme, on peut citer le gène trpl à utiliser avec un micro-organisme dépourvu de l'enzyme phosphoribosylanthranilate isomérase tel qu'une levure trpl~ ou le gène URA3 à utiliser avec un organisme eucaryote dépourvu de l'enzyme orotidine 5-phosphate décarboxylase tel qu'une levure ura3~.

Par « promoteur », on entend, dans le cadre de la présente invention, aussi bien un promoteur, constitutif ou inductible, adapté pour tout micro-organisme tel que précédemment défini qu'un promoteur, constitutif ou inductible, spécifique d'un groupe de micro-organismes particuliers. Le promoteur utilisable peut être homologue ou hétérologue. Un promoteur constitutif utilisable dans le cadre de la présente invention est notamment choisi parmi le promoteur proD, le promoteur proC, le promoteur 35S, le promoteur 19S et le promoteurTEV (pour « Tobacco Etch Virus »). Un promoteur inductible utilisable dans le cadre de la présente invention peut être le promoteur GAL1 inductible par le galactose, le promoteur AOX1 inductible par le méthanol, le promoteur PAllacO-1 inductible par l'isopropyl β-D-l-thiogalactopyranoside (IPTG), le promoteur hybride pTac inductible par l'IPTG ; le promoteur MET15 inductible par déplétion en méthionine ou le promoteur CUP1 inductible par les ions cuivre. Dans le vecteur mis en œuvre dans la présente invention, le promoteur peut être associé à une ou plusieurs séquences régulatrices transcriptionnelles que sont les amplificateurs.

Avantageusement, le vecteur d'expression mis en œuvre dans la présente invention comprend, liés entre eux de façon opérationnelle, un promoteur, une séquence nucléotidique codant une enzyme d'intérêt et un signal de terminaison de la transcription comprenant un site de clivage et/ou un signal polyA. On entend par « liés entre eux de façon opérationnelle » selon l'invention, des éléments liés entre eux de façon à ce que le fonctionnement d'un des éléments soit affecté par celui d'un autre. A titre d'exemple, un promoteur est lié de façon opérationnelle à une séquence codante lorsqu'il est capable d'affecter l'expression de cette dernière. Les éléments régulateurs de la transcription, de la traduction et de la maturation des peptides que le vecteur peut comprendre sont connus de l'homme du métier et ce dernier est capable de les choisir en fonction du microorganisme hôte dans lequel l'expression ou le clonage doivent être réalisés.

Par ailleurs, l'homme du métier connaît, comme vecteur d'expression, différents types de plasmides qui diffèrent par leur origine de réplication et donc par leur nombre de copies dans la cellule. Typiquement, ces plasmides sont présents dans le microorganisme en 10 à 15 copies, ou en environ 30 à 50 copies, voire jusqu'à 100 copies, selon la nature du plasmide: plasmides à faible nombre de copies avec réplication étroite, plasmides à nombre moyen de copies ou des plasmides à grand nombre de copies. A titre d'exemples de plasmides utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer les plasmides pSClOl, RK2, pACYC, pRSFIOlO, pZ et pSK bluescript II.

Typiquement, l'alternative (ii_a) ci-dessus consiste à utiliser un promoteur induisant un haut niveau d'expression du gène endogène. En fonction de la nature et des propriétés du promoteur endogène, l'homme du métier saura déterminer quel promoteur, homologue ou hétérologue, inductible ou constitutif, utiliser pour remplacer ledit promoteur endogène. En variante, l'alternative (ii_a) peut consister à atténuer l'activité ou l'expression d'un répresseur de transcription, spécifique ou non spécifique du gène endogène.

Dans le cadre de la présente invention, l'expression « activité diminuée » ou « activité réduite » appliquée à une enzyme désigne une activité catalytique spécifique de l'enzyme réduite et/ou une quantité ou disponibilité diminuée de l'enzyme dans la cellule.

Dans le cadre de la présente invention, une activité enzymatique diminuée dans le micro-organisme recombinant doit s'entendre comme une activité enzymatique qui est réduite par un facteur d'au plus 0,5, notamment d'au plus 0,1, en particulier, d'au plus 0,01 et, plus particulièrement, d'au plus 0,001 par rapport à l'activité enzymatique du même micro-organisme non modifié.

L'homme du métier connaît différentes techniques de microbiologie et de biologie moléculaire utilisables pour obtenir, dans un micro-organisme donné, la diminution d'une activité enzymatique.

En effet, une diminution de l'activité enzymatique peut être obtenue (id) en diminuant l'expression du gène codant l'enzyme dans le micro-organisme, par exemple, en modifiant le promoteur, les régions régulatrices et/ou le site de fixation du ribosome, (iid) en modifiant la séquence du gène codant l'enzyme de façon à obtenir une expression réduite du gène et/ou l'expression d'une enzyme dont l'activité est réduite, (iiid) en utilisant des éléments déstabilisants l'ARNm obtenu suite à la transcription du gène et, éventuellement, (ivd) en inactivant le gène notamment par délétion totale ou partielle dudit gène, par délétion totale ou partielle du promoteur empêchant toute expression du gène et/ou par insertion d'un élément génique externe dans la région codante du gène ou dans la région du promoteur. A noter que, dans certaines formes de l'alternative (ivd) et notamment dans le cas d'une délétion totale du gène, il est possible de n'avoir aucune activité enzymatique résiduelle. En d'autres termes, dans l'alternative (ivd), l'activité enzymatique est éteinte.

Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de conversion du D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose-5-phosphate, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui convertit le D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose-5phosphate dans le micro-organisme recombinant est augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié.

L'enzyme (E,) qui convertit le D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose-5phosphate se présente sous forme d'une D-arabinose-5-phosphate isomérase (EC 5.3.1.13). Une telle enzyme est également connue en tant que « D-arabinose-5-phosphate aldose-kétose-isomérase », « arabinose phosphate isomérase », « D-arabinose-5phosphate ketol-isomerase » et « phosphoarabinoisomerase ». Toutes ces désignations font référence à la même enzyme et sont utilisables de façon interchangeable.

Avantageusement, l'enzyme (Ei) est codée par le gène kdsD de E. coli ou par un homologue d'un tel gène. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène kdsD de E. coli code une protéine capable de convertir le D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose-5-phosphate. A titre d'exemple particulier de gène kdsD de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise entre les nucléotides 2829813 et 2830778 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI (pour « National Center for

Biotechnology Information ») https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ et correspondant au génome complet de la souche K12 MG1655. La séquence de la protéine de 321 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_417188.4 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 1 dans le listage de séquences annexé.

Toutes les variantes précédemment envisagées pour augmenter une activité enzymatique sont utilisables pour augmenter l'activité de l'enzyme (Et) qui convertit le D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose-5-phosphate.

Plus particulièrement, le micro-organisme recombinant objet de la présente invention présente une surexpression du gène kdsD de E. coli ou d'un homologue de celui-ci.

Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de clivage aldolique du D-arabinose-5-phosphate en D-glycéraldéhyde-3-phosphate et glycolaldéhyde, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui catalyse le clivage du D-arabinose5-phosphate en D-glycéraldéhyde-3-phosphate et glycolaldéhyde dans le micro-organisme recombinant est augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié.

L'enzyme (En) qui catalyse le clivage du D-arabinose-5-phosphate en Dglycéraldéhyde-3-phosphate et glycolaldéhyde se présente sous forme d'une fructose-6phosphate aldolase (EC 4.1.2.-) [14],

Avantageusement, l'enzyme (En) est codée par le gène fsa de E. coli ou par un homologue d'un tel gène. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène fsa de E. coli code une protéine capable de catalyser le clivage du D-arabinose-5-phosphate en D-glycéraldéhyde-3-phosphate et glycolaldéhyde. A titre d'exemple particulier de gène fsa de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise entre les nucléotides 863642 et 864304 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 220 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_415346.4 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 2 dans le listage de séquences annexé.

Toutes les variantes précédemment envisagées pour augmenter une activité enzymatique sont utilisables pour augmenter l'activité de l'enzyme (En) qui catalyse le clivage du D-arabinose-5-phosphate en D-glycéraldéhyde-3-phosphate et glycolaldéhyde.

Plus particulièrement, le micro-organisme recombinant objet de la présente invention présente une surexpression du gène fsa de E. coli ou d'un homologue de celui-ci.

Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité d'oxydation du glycolaldéhyde en glycolate, augmentée par comparaison au même microorganisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui oxyde le glycolaldéhyde en glycolate dans le micro-organisme recombinant est augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié.

L'enzyme (Em) qui oxyde le glycolaldéhyde en glycolate se présente sous forme d'une glycolaldéhyde déshydrogénase et notamment d'une glycoaldéhyde déshydrogénase dont l'activité requiert la présence du cofacteur NAD⁺ (EC 1.2.1.21).

Avantageusement, l'enzyme (En,) est codée par le gène aldA de E. coli ou par un homologue d'un tel gène. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène aldA de E. coli code une protéine capable d'oxyder le glycolaldéhyde en glycolate en présence d'un cofacteur comme, par exemple, NAD⁺. A titre d'exemple particulier de gène aldA de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise entre les nucléotides 1488232 et 1489671 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBL La séquence de la protéine de 479 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_415933.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 3 dans le listage de séquences annexé.

Toutes les variantes précédemment envisagées pour augmenter une activité enzymatique sont utilisables pour augmenter l'activité de l'enzyme (Em) qui oxyde le glycolaldéhyde en glycolate.

Plus particulièrement, le micro-organisme recombinant objet de la présente invention présente une surexpression du gène aldA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci.

En particulier, le micro-organisme recombinant selon la présente invention comprend :

- soit au moins un plasmide présentant la séquence du gène KdsD de E. coli ou d'un homologue de celui-ci, la séquence du gène fsa de E. coli ou d'un homologue de celui-ci et la séquence du gène aldA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci, lesdites séquences étant éventuellement clonées en opéron,

- soit au moins deux plasmides, de nature identique mais possédant des origines de réplication compatibles ou de nature différente, l'un présentant deux séquences, éventuellement clonées en opéron, choisies parmi la séquence du gène kdsD de E. coli ou d'un homologue de celui-ci, la séquence du gène fsa de E. coli ou d'un homologue de celui-ci et la séquence du gène aldA de E. coli ou d'un homologue de celuici et l'autre plasmide la troisième de ces séquences. Dans cette variante, on peut avoir (fsa + aldA) sur un plasmide et kdsD sur l'autre ; (fsa + kdsD) sur un plasmide et aldA sur l'autre ou encore (kdsD + aldA) sur un plasmide et fsa sur l'autre ;

- soit au moins trois plasmides, identiques ou différents, présentant chacun une séquence différente choisie parmi la séquence du gène kdsD de E. coli ou d'un homologue de celui-ci, la séquence du gène fsa de E. coli ou d'un homologue de celui-ci et la séquence du gène aldA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci.

Tout ce qui a été précédemment décrit sur les plasmides s'applique au ou aux plasmide(s) contenu(s) dans le micro-organisme recombinant objet de l'invention.

Plus particulièrement, le micro-organisme recombinant objet de l'invention comprend :

cc) un premier plasmide dans lequel se trouvent la séquence du gène kdsD de E. coli ou d'un homologue de celui-ci et la séquence du gène fsa de E. coli ou d'un homologue de celui-ci, lesdites séquences étant clonées en opéron et sous le contrôle d'un premier promoteur inductible ou constitutif et

β) un second plasmide dans lequel se trouve la séquence du gène aldA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci sous le contrôle d'un second promoteur inductible ou constitutif, lesdits premier et second promoteurs étant identiques ou différents.

Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité d'oxydation du glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3-bisphosphoglycérate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui oxyde le glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3bisphosphoglycérate dans le micro-organisme recombinant est diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.

L'enzyme (Εν) qui oxyde le glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3bisphosphoglycérate se présente sous forme d'une glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase et notamment d'une glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase dont le cofacteur est NAD⁺ (EC 1.2.1.12). Une telle enzyme est également connue en tant que « D-glycéraldéhyde-3-phosphate:NAD⁺ oxydoréductase ». Ces deux désignations font référence à la même enzyme et sont utilisables de façon interchangeable.

Avantageusement, l'enzyme (Ev) est codée par le gène gapA de E. coli ou par un homologue d'un tel gène. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène gapA de E. coli code une protéine capable d'oxyder le glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3-bisphosphoglycérate en présence d'un cofacteur comme, par exemple, NAD⁺. A titre d'exemple particulier de gène gapA de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise entre les nucléotides 1862771 et 1863766 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 331 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_416293.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 4 dans le listage de séquences annexé.

Toutes les variantes précédemment envisagées pour diminuer une activité enzymatique sont utilisables pour augmenter l'activité de l'enzyme (Ev) qui oxyde le glycolaldéhyde en glycolate.

Dans une forme de mise en œuvre particulière, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, l'expression du gène gapA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est diminuée mais non inactivée par rapport au micro-organisme non modifié. Dans ce cas, l'atténuation de l'activité gapA permet la croissance et, en même temps, la production d'acide glycolique. Toutefois, le maintien d'une glycolyse résiduelle ne permet pas d'atteindre le rendement maximum.

Dans une forme de mise en œuvre variante, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, l'expression du gène gapA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est inactivée par rapport au micro-organisme non modifié. Dans ce cas, la croissance et la production d'acide glycolique sont découplées. L'inactivation de gapA nécessite que le micro-organisme recombinant selon l'invention ait, un substrat de croissance, contenant, en plus des pentoses et/ou des hexoses, du glucose et des composés en C2, C3 ou C4 comme de l'acétate, du pyruvate, du malate ou du succinate ou qui entrent dans le métabolisme après le glycéraldéhyde-3-phosphate (GAP).

Avantageusement, le microorganisme recombinant selon la présente invention est modifié au niveau du transport de glucose en ce sens que le système phosphotransférase (PTS), qui dépend du phosphoénolpyruvate (PEP) est inactivé, alors qu'une activité de transporteur de glucose codée par galP de E. coli ou glf de Zymomonas mobilis ou un de leurs homologues et une activité de transformation du glucose en glucose6-phosphase sont augmentées par comparaison au même micro-organisme non modifié. Cette modification permet l'assimilation du D-glucose et du D-xylose [8,15,16].

Pour rappel, chez E. coli, le système phosphotransférase (PTS), qui dépend du phosphoénolpyruvate (PEP) est le système le plus efficace pour le transport du glucose. L'activité du système PTS a un effet sur la distribution du flux de carbone et joue un rôle clé dans la répression du catabolisme du carbone. Le système PTS cytoplasmique est codé par l'opéron ptsHIcrr. La délétion de l'opéron ptsHIcrr notamment dans E. coli est la stratégie la plus couramment employée pour inactiver le système PTS.

Le phénotype PTS^- se caractérise par une capacité très limitée de transport et de phosphorylation du glucose. Dans une souche PTS^-, le PEP n'est pas nécessaire à la phosphorylation du glucose. La glucokinase catalyse la phosphorylation-ATP dépendante du glucose dans le cytoplasme. La surexpression de la galactose perméase (GalP) pour le transport du glucose et de la glucokinase (Glk) pour la phosphorylation restaure le phénotype PTS⁺ [17], Une autre stratégie est de surexprimer les gènes glfzm et glkzm codant respectivement pour un transporteur facilité du glucose (Gif) et la glucokinase de Zymomonas mobilis dans E. coli [18].

Ainsi, dans le micro-organisme recombinant selon la présente invention, une activité de transport et de phosphorylation du glucose à partir du phosphoénolpyruvate par le système phosphotransférase phosphoénolpyruvate dépendant (PTS) est éteinte par comparaison au même micro-organisme non modifié.

A titre d'exemple particulier, l'inactivation du système PTS cytoplasmique codé par l'opéron ptsHIcrr chez E. coli conduit à la délétion des gènes :

- ptsH de l'opéron ptsHIcrr codant la protéine phosphohistidine Hpr, porteuse de phosphate, du système PTS. A titre d'exemple plus particulier de gène ptsH de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12-MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 2533764 et 2534021 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site NCBI. La séquence de la protéine de 85 acides aminés codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_416910.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 5 dans le listage de séquences annexé.

- ptsl de l'opéron ptsHIcrr codant l'enzyme I du système PTS (EC 2.7.3.9). A titre d'exemple plus particulier de gène ptsl de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12-MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 2534066 et 2535793 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site NCBI. La séquence de la protéine de 575 acides aminés codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_416911.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 6 dans le listage de séquences annexé.

- crr de l'opéron ptsHIcrr codant l'enzyme IIA du complexe II du système PTS (EC 2.7.1.69). A titre d'exemple plus particulier de gène crr de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12-MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 2535834 et 2536343 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site NCBI. La séquence de la protéine de 169 acides aminés codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_416912.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 7 dans le listage de séquences annexé.

Avantageusement, la délétion du gène ptsG du système PTS, qui n'appartient pas à l'opéron ptsHIcrr, est également requise, car PtsG est fortement impliquée dans la répression catabolique chez E. coli. Les mutants PtsG^- sont capables de consommer simultanément le glucose, l'arabinose et le xylose tandis qu'une souche sauvage consomme le glucose puis l'arabinose et enfin le xylose de façon séquentielle [19]. Le gène ptsG code un large domaine hydrophobe IIB/C du complexe II du système PTS. A titre d'exemple plus particulier de gène ptsG de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12-MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 1157869 et 1159302 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site NCBI. La séquence de la protéine de 477 acides aminés codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_415619.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 8 dans le listage de séquences annexé.

Le gène galP de E. coli code une galactose perméase. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène galP de E. coli code une protéine du type galactose perméase. A titre d'exemple particulier de gène galP de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise entre les nucléotides 3088284 et 3089678 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 464 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_417418.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 9 dans le listage de séquences annexé.

Le gène gif de Z. mobilis code un transporteur du glucose. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène gif de Z. mobilis code un transporteur du glucose. A titre d'exemple particulier de gène g If de Z. mobilis, on peut citer le gène de la souche ATCC 31821 / ZM4 / CP4 qui code la protéine de 473 acides aminés référencée, sur le site UniProtKB (http://www.uniprot.org/), séquence P21906 et correspondant à la séquence SEQ ID NO: 10 dans le listage de séquences annexé.

Avantageusement, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité une activité de transformation du glucose en glucose-6-phosphase, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui transforme le glucose en glucose-6-phosphase dans le micro-organisme recombinant est augmentée par comparaison au même microorganisme non modifié.

L'enzyme qui transforme le glucose en glucose-6-phosphase se présente sous forme d'une glucokinase (EC 2.7.1.2). Avantageusement, cette enzyme est codée par le gène glK de E. coli ou par un homologue d'un tel gène. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène glK de E. coli code une protéine capable de transforme le glucose en glucose-6-phosphase. A titre d'exemple particulier de gène glK de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise entre les nucléotides 2508461 et 2509426 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 321 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_416889.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 11 dans le listage de séquences annexé.

Toutes les variantes précédemment envisagées pour augmenter une activité enzymatique sont utilisables pour augmenter l'activité de transporteur de glucose et l'activité de transformation du glucose en glucose-6-phosphase.

Plus particulièrement, le micro-organisme recombinant objet de la présente invention présente une surexpression du gène aldA de E. coli ou du gène glfde Z. mobilis ou d'un homologue de leurs homologues et une surexpression du gène glK de E. coli ou d'un homologue de celui-ci. A cet effet, dans le micro-organisme recombinant selon l'invention, les gènes ci-dessus listés sont sous la dépendance d'un promoteur constitutif fort comme le promoteur proD.

Avantageusement, afin d'optimiser encore la production d'acide glycolique via la voie de synthèse non-naturelle selon l'invention, le micro-organisme recombinant objet de la présente invention peut présenter au moins une des caractéristiques suivantes :

v) une activité d'oxydation du glycolate en glyoxylate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;

vi) une répression des gènes impliqués dans la régulation du métabolisme respiratoire aérobie, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;

vii) une internalisation du glycolate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;

viii) une activité de formation irréversible de méthylglyoxal à partir de dihydroxyacétone, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;

ix) une activité de conversion du fructose-6-phosphate en fructose-1,6biphosphate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;

x) une activité de production du D-ribose-l-phosphate à partir de dihydroxyacétone phosphate et de glycolaldéhyde, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ; et xi) une activité d'oxydation du D-glucose-6-phosphate en 6-phospho Dglucono-l,5-lactone, modifiée par comparaison au même micro-organisme non modifié.

Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité d'oxydation du glycolate en glyoxylate, diminuée par comparaison au même microorganisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui oxyde le glycolate en glyoxylate dans le micro-organisme recombinant est diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.

L'enzyme (E_v) qui oxyde le glycolate en glyoxylate se présente sous forme d'une glycolate déshydrogénase et notamment d'une glycolate déshydrogénase dont le cofacteur est NAD⁺ (EC 1.1.99.14). Une telle enzyme est également connue en tant que « glycolate oxydoréductase » et « glycolate oxydase ». Toutes ces désignations font référence à la même enzyme et sont utilisables de façon interchangeable.

Avantageusement, l'activité glycolate déshydrogénase de E. coli est codée par les gènes glcDEF ou par un homologue de tels gènes. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue des gènes glcD, glcE et glcF de E. coli code une protéine capable d'oxyder le glycolate en glyoxylate en présence d'un cofacteur comme, par exemple, NAD⁺.

A titre d'exemple particulier de gène glcD de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 3126522 et 3128021 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 499 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_417453.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 12 dans le listage de séquences annexé.

A titre d'exemple particulier de gène glcE de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 3125470 et 3126522 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 350 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence YP_026191.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 13 dans le listage de séquences annexé.

A titre d'exemple particulier de gène glcF de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 3124236 et 3125459 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 407 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence YP_026190.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO : 14 dans le listage de séquences annexé.

Toutes les variantes précédemment envisagées pour diminuer une activité enzymatique sont utilisables pour diminuer l'activité glycolate déshydrogénase.

Plus particulièrement, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, l'expression des gènes glcD, glcE et glcF de E. coli ou d'homologues de ceux-ci est diminuée par rapport au micro-organisme non modifié. Dans une forme de mise en œuvre particulière, les gènes glcD, glcE et glcF de E. coli ou les homologues de ceux-ci sont délétés dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention afin de permettre l'accumulation de glycolate [20].

Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité respiratoire aérobie augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié et ce, en diminuant la répression des gènes impliqués dans la régulation du métabolisme respiratoire aérobie. Cette répression ne fait pas appel à une enzyme mais à un régulateur transcriptionnel.

Avantageusement, ce régulateur transcriptionnel est codé par le gène arcA de E. coli ou par un homologue d'un tel gène. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène arcA de E. coli code une protéine capable de réprimer les gènes impliqués dans le métabolisme respiratoire aérobie [21]. A titre d'exemple particulier de gène arcA de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 4639590 et 4640306 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 238 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_418818.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 15 dans le listage de séquences annexé.

Toutes les variantes précédemment envisagées pour diminuer une activité enzymatique sont utilisables, mutatis mutandis, pour diminuer l'activité du régulateurtranscriptionnel réprimant les gènes impliqués dans le métabolisme respiratoire aérobie.

Plus particulièrement, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, l'expression du gène arcA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est diminuée par rapport au micro-organisme non modifié. Dans une forme de mise en œuvre particulière, le gène arcA de E. coli ou l'homologue de celui-ci est délété dans le microorganisme recombinant objet.

Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une internalisation du glycolate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié. Cette internalisation fait appel à des protéines important le glycolate [22, 23, 24],

Avantageusement, des protéines sont codées par les gènes glcA, lldP ou yjcG de E. coli ou par des homologues de tels gènes. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, des homologues des gènes glcA, lldP ou yjcG de E. coli codent des protéines capables d'internaliser le glycolate.

A titre d'exemple particulier de gène glcA de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise entre les nucléotides 1157869 et 1159302 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 477 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_415619.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 16 dans le listage de séquences annexé.

A titre d'exemple particulier de gène lldP de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise entre les nucléotides 3777399 et 3779054 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 551 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_418060.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 17 dans le listage de séquences annexé.

A titre d'exemple particulier de gène yjcG de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides4283253 et 4284902 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 549 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_418491.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 18 dans le listage de séquences annexé.

Toutes les variantes précédemment envisagées pour diminuer une activité enzymatique sont utilisables, mutatis mutandis, pour diminuer l'activité des protéines important le glycolate.

Plus particulièrement, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, l'expression des gènes glcA, lldP ou yjcG de E. coli ou d'homologues de ceux-ci est diminuée par rapport au micro-organisme non modifié. En variante, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, les gènes glcA, lldP ou yjcG de E. coli ou d'homologues de ceux-ci sont délétés par rapport au micro-organisme non modifié.

Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de formation irréversible de méthylglyoxal à partir de dihydroxyacétone phosphate (DHAP), diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui forme, de façon irréversible, le méthylglyoxal, composé cytotoxique, à partir de DHAP dans le micro-organisme recombinant est diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.

L'enzyme (Evin) qui forme, de façon irréversible, le méthylglyoxal à partir de DHAP se présente sous forme d'une méthylglyoxal synthase (EC 4.2.3.3) [25].

Avantageusement, l'enzyme (E_vni) est codée par le gène mgsA de E. coli ou par un homologue d'un tel gène. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène mgsA de E. coli code une protéine capable de former, de façon irréversible, le méthylglyoxal à partir de DHAP. A titre d'exemple particulier de gène mgsA de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 1026557 et 1027015 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 152 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_415483.2 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 19 dans le listage de séquences annexé.

Toutes les variantes précédemment envisagées pour diminuer une activité enzymatique sont utilisables pour diminuer l'activité de l'enzyme (E_vni) qui forme, de façon irréversible, le méthylglyoxal à partir de DHAP.

Plus particulièrement, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, l'expression du gène mgsA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est diminuée par rapport au micro-organisme non modifié. Dans une forme de mise en œuvre particulière, le gène mgsA de E. coli ou l'homologue de celui-ci est délété dans le microorganisme recombinant objet de la présente invention.

Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de conversion du fructose-6-phosphate en fructose-l,6-biphosphate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui convertit le fructose-6-phosphate en fructose-1,6biphosphate, dans le micro-organisme recombinant est diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.

L'enzyme (Ε,χ) qui convertit le fructose-6-phosphate en fructose-1,6biphosphate se présente sous forme d'une phosphofructokinase (EC 2.7.1.11).

Avantageusement, l'enzyme (E,_x) est codée par le gène pfKA de E. coli ou par un homologue d'un tel gène. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène pfKA de E. coli code une protéine capable de convertir le fructose-6-phosphate en fructose-l,6-biphosphate. A titre d'exemple particulier de gène pfKA de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 4107552 et 4108514 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 320 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_418351.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 20 dans le listage de séquences annexé.

Toutes les variantes précédemment envisagées pour diminuer une activité enzymatique sont utilisables pour diminuer l'activité de l'enzyme (Eî_x) qui convertit le fructose-6-phosphate en fructose-l,6-biphosphate.

Plus particulièrement, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, l'expression du gène pfKA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est diminuée par rapport au micro-organisme non modifié. Dans une forme de mise en œuvre particulière, le gène pfKA de E. coli ou l'homologue de celui-ci est délété dans le microorganisme recombinant objet de la présente invention et ce, éviter un cycle futile avec la fructose-l,6-biphosphate [26].

Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de production du D-ribose-l-phosphate à partir de dihydroxyacétone phosphate et de glycolaldéhyde, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui produit le D-ribose-l-phosphate à partir de dihydroxyacétone phosphate et de glycolaldéhyde, dans le micro-organisme recombinant est diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.

L'enzyme (E_x) qui produit le D-ribose-l-phosphate à partir de dihydroxyacétone phosphate et de glycolaldéhyde se présente sous forme d'une Lfuculose-phosphate aldolase (EC 4.1.2.17) [27],

Avantageusement, l'enzyme (E_x) est codée par le gènefucA de E. coli ou par un homologue d'un tel gène. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gènefucA de E. coli code une protéine capable de produire du D-ribose-l-phosphate à partir de dihydroxyacétone phosphate et de glycolaldéhyde. A titre d'exemple particulier de gènefucA de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 2933041 et 2933688 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 215 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_417280.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 21 dans le listage de séquences annexé.

Toutes les variantes précédemment envisagées pour diminuer une activité enzymatique sont utilisables pour diminuer l'activité de l'enzyme (E_x) qui catalyse l'interconversion réversible du D-ribose-l-phosphate en dihydroxyacétone phosphate et glycolaldéhyde.

Plus particulièrement, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, l'expression du gènefucA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est diminuée par rapport au micro-organisme non modifié. Dans une forme de mise en œuvre particulière, le gène fucA de E. coli ou l'homologue de celui-ci est délété dans le microorganisme recombinant objet de la présente invention.

Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de production du 6-phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate diminuée ou augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié.

Dans un premier mode de réalisation, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de production du 6-phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme (E_xî) qui produit le 6phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate, dans le microorganisme recombinant est diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.

L'enzyme (E_xî) qui produit le 6-phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate se présente sous forme d'une glucose-6-phosphate déshydrogénase NADP⁺dépendante (EC 1.1.1.49) [28].

Avantageusement, l'enzyme (E_Xi) est codée par le gène zwfde E. coli ou par un homologue de celui-ci. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène zwfde E. coli code une protéine capable de produire du 6phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate en présence d'un cofacteur comme, par exemple, NADP⁺. A titre d'exemple particulier du gène zwfde E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 1934839 et 1936314 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 491 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_416366 correspond à la séquence SEQ ID NO: 22 dans le listage de séquences annexé.

Toutes les variantes précédemment envisagées pour diminuer une activité enzymatique sont utilisables pour diminuer l'activité de l'enzyme (E_Xi) qui produit du 6-phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate.

Plus particulièrement, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, l'expression du gène zwfde E. coli ou d'un homologue de celui-ci est diminuée par rapport au micro-organisme non modifié. Dans une forme de mise en œuvre particulière, le gène zwfde E. coli ou l'homologue de celui-ci est délété dans le microorganisme recombinant objet de la présente invention.

Dans un second mode de réalisation, Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de production du 6-phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme (E_xî) qui produit le 6phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate, dans le microorganisme recombinant est augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié.

Toutes les variantes précédemment envisagées pour augmenter une activité enzymatique sont utilisables pour augmenter l'activité de l'enzyme (E_Xi) qui produit du 6-phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate.

Plus particulièrement, le micro-organisme recombinant objet de la présente invention présente une surexpression du gène zwfde E. coli ou d'un homologue de celui-ci.

Dans ce second mode de réalisation, le micro-organisme recombinant objet de l'invention présente les caractéristiques suivantes :

xi) une activité d'oxydation du D-glucose-6-phosphate en 6-phospho Dglucono-l,5-lactone, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;

xii) une activité de formation de 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6phosphate à partir de D-gluconate-6-phosphate, diminuée par comparaison au même microorganisme non modifié ; et xiii) une activité de formation de glycéraldéhyde-3-phosphate et de pyruvate à partir 2 dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate, diminuée par comparaison au même organisme non modifié.

Dans ce second mode de réalisation, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de formation de 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate6-phosphate à partir de D-gluconate-6-phosphate diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui forme du 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate à partir de D-gluconate-6 phosphate, dans le micro-organisme recombinant est diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.

L'enzyme (E_xü) qui produit du 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6phosphate à partir de D-gluconate-6-phosphate se présente sous forme d'une phosphogluconate déshydratase (EC 4.2.1.12) [29].

Avantageusement, l'enzyme (Ε_χπ) est codée par le gène edd de E. coli ou par un homologue de celui-ci. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène edd de E. coli code une protéine capable de produire du 2dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate à partir de D-gluconate-6-phosphate. A titre d'exemple particulier du gène edd de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 1932794 et 1934604 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 603 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence CAA45221 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 23 dans le listage de séquences annexé.

Dans ce second mode de réalisation, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de production du D-glycéraldéhyde-3-phosphate et du pyruvate à partir de 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui produit du D-glycéraldéhyde-3-phosphate et du pyruvate à partir de 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate, dans le micro-organisme recombinant est diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.

L'enzyme (E_Xiü) qui produit du D-glycéraldéhyde-3-phosphate et du pyruvate à partir de 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate se présente sous forme d'une 2-dehydroxy-3-deoxy-phosphogluconate aldolase [30].

Avantageusement, l'enzyme (E_xni) est codée par le gène eda de E. coli ou par un homologue de celui-ci. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène edd de E. coli code une protéine capable de produire du Dglycéraldéhyde-3-phosphate et du pyruvate à partir de 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate6-phosphate. A titre d'exemple particulier de gène eda de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 1932115 et 1932756 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 213 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_416364.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 24 dans le listage de séquences annexé.

La voie cyclique de synthèse d'acide glycolique à partir de principaux monosaccharides lignocellulosiques, avec une conservation optimale du carbone, conformément à la présente invention est représentée dans la Figure 2.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un microorganisme recombinant tel que précédemment défini pour la production d'acide glycolique à partir d'un milieu de culture comprenant, comme source de carbone, au moins un pentose et/ou au moins un hexose.

Ainsi, la présente invention concerne un procédé de production d'acide glycolique comprenant les étapes consistant à :

a) mettre en culture un micro-organisme recombinant tel que précédemment défini dans un milieu de culture comprenant, comme source de carbone, au moins un pentose et/ou au moins un hexose ; et

b) récupérer l'acide glycolique à partir du micro-organisme et/ou dans le milieu de culture.

Le procédé de production objet de la présente invention met en œuvre des étapes et dispositifs classiquement utilisés dans le domaine de la biofermentation.

Ainsi, dans l'étape (a) du procédé selon la présente invention, le microorganisme peut être cultivé dans un milieu de culture selon les techniques habituelles utilisées pour cultiver ce type de micro-organisme. Le milieu de culture peut être un milieu commercial ou un milieu préparé de façon extemporanée.

Avantageusement, le milieu de culture mis en œuvre dans le procédé de l'invention se présente sous forme d'un liquide stérile contenant une source de carbone, une source d'azote, une source de phosphate, des oligoéléments et éventuellement une source de soufre.

Dans le cadre de la présente invention, la source de carbone comprend au moins un pentose et/ou au moins un hexose. A titre d'exemple, cette source de carbone peut comprendre au moins deux pentoses différents et au moins un hexose, notamment au moins du xylose, de l'arabinose et du glucose et, en particulier, du D-xylose, du Larabinose et du D-glucose. Ces pentoses et hexose sont typiquement issus d'une matière carbonée renouvelable telle que de la biomasse végétale et, en particulier de la biomasse lignocellulosique.

La biomasse végétale est choisie dans le groupe constitué par les productions agricoles telles que des productions dédiées appelées « énergétiques » comme le miscanthus, le panic érigé (Panicum virgatum ou switchgrass) et les taillis à très courte rotation comme, par exemple, le peuplier ou le saule ; les résidus de productions agricoles tels que la paille des céréales, les cannes de maïs et les tiges de canne à sucre ; les productions forestières ; les résidus de productions forestières tels que les résidus de la transformation du bois.

Un des principaux éléments de la biomasse végétale est la lignocellulose, qui correspond au principal constituant de la paroi cellulaire végétale. La lignocellulose est composée à 75% de carbohydrates et son hydrolyse libère des sucres fermentescibles, majoritairement du D-glucose, D-xylose et L-arabinose [31].

Dans une première forme de mise en œuvre de l'étape (a) du procédé selon l'invention, le micro-organisme recombinant mis en culture est un micro-organisme recombinant tel que précédemment défini et dans lequel l'expression du gène gapA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est diminuée mais non inactivée par rapport au microorganisme non modifié. Dans cette première forme de mise en œuvre, la source de carbone mise en œuvre peut ne comprendre qu'un élément choisi parmi du D-glucose, du D-xylose, du L-arabinose et un de leurs mélanges. Par « mélange », on entend un mélange de D-glucose et de D-xylose, un mélange de D-glucose et de L-arabinose, un mélange de Dxylose et de L-arabinose et un mélange de D-glucose, de D-xylose et de L-arabinose.

Dans une seconde forme de mise en œuvre de l'étape (a) du procédé selon l'invention, le micro-organisme recombinant mis en culture est un micro-organisme recombinant tel que précédemment défini et dans lequel l'expression du gène gapA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est inactivée par rapport au micro-organisme non modifié. Dans cette seconde forme de mise en œuvre, la source de carbone mise en œuvre comprend, en plus du D-xylose et/ou du L-arabinose, du D-glucose et un ou plusieurs composés en C2, C3 ou C4 choisis parmi le malate, le pyruvate, le succinate, l'acétate et un de leurs mélanges. Dans cette seconde forme de mise, le procédé de production d'acide glycolique se fait en deux phases, avec une première phase de production de biomasse, suivie d'une phase de production qui est déclenchée lorsque les composés en C2, C3 ou C4 arrivent à épuisement concourant à la bioconversion des hexoses et des pentoses en acide glycolique.

Dans la première et la seconde formes de mise en œuvre du procédé selon l'invention, la source de carbone mise en œuvre peut en outre comprendre au moins un autre élément carboné tel que du galactose, du xylose, du fructose, du lactose, du saccharose, du maltose, de la mélasse, de l'amidon et un hydrolysat d'amidon.

Des exemples de sources d'azote adaptées comprennent l'ammoniac, les sels d'ammonium comme le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, l'acétate d'ammonium et le phosphate d'ammonium, d'autres composés contenant de l'azote ; une peptone comme la tryptone ; un extrait de viande, un extrait de levure, une liqueur de maïs; un hydrolysat de caséine; une farine de soja et un hydrolysat de farine de soja.

L'homme du métier connaît différents exemples de sources de soufre, de sources de phosphate et d'oligoéléments utilisables lors de l'étape (a) du procédé selon l'invention. Il saura choisir, sans effort inventif, les sources et oligoéléments les mieux adaptés en fonction du micro-organisme recombinant cultive et des conditions de culture.

La température lors de la culture de l'étape (a) est typiquement comprise entre 15 et 45°C, et le pH durant cette culture est typiquement maintenu à une valeur comprise entre 3,0 et 9,0. Le pH peut être ajusté en utilisant, par exemple, un acide inorganique ou organique, une solution alcaline, de l'urée ou un carbonate de calcium.

A noter que, en fonction du micro-organisme cultivé, l'homme du métier saura adapter le milieu de culture et les conditions de culture aux exigences particulières de ce dernier, éventuellement au moyen de tests de routine. De ce fait, le micro-organisme recombinant se trouve, lors de l'étape (a) dans des conditions dans lesquelles il y a production d'acide glycolique à partir de la source de carbone telle que précédemment définie. Typiquement, cette culture est réalisée dans des conditions aérobies i.e. en présence d'oxygène.

Avantageusement, les micro-organismes recombinants sont cultivés sous forme de suspension. Une « suspension » de cellules s'entend, de façon générale, comme incluant tous les types de cultures cellulaires en suspension ou dispersées. L'expression « sous forme de suspension » est ainsi utilisée pour distinguer les cellules qui ne sont pas cultivées dans un milieu liquide, telles que les cellules cultivées en adhérant sur une boîte de Pétri. Par ailleurs, le terme « suspension » comprend à la fois des cellules librement dispersées et des cellules agglomérées, indépendamment du fait que l'agglomération puisse se produire spontanément ou non.

En variante, les micro-organismes recombinants peuvent être cultivés sous forme attachés à une phase solide telle que des microbilles, des billes, des capillaires, des fibres creuses, ces différents éléments étant typiquement en un matériau compatible avec le micro-organisme comme, par exemple, du dextrane, de la gélatine, du verre et de la cellulose.

De plus, les procédés de culture qui peuvent être utilisés lors de l'étape (a) du procédé selon la présente invention comprennent, mais sans y être limités, une culture discontinue, une culture continue ou une culture « fed-batch ».

Une « culture (cellulaire) continue » est une culture cellulaire caractérisée à la fois par un apport continu d'une alimentation liquide nutritive et un écoulement continu de liquide. En variante, une culture continue peut constituer une « culture de perfusion », auquel cas l'écoulement de liquide contient un milieu de culture qui est sensiblement dépourvu de cellules, ou une concentration cellulaire sensiblement inférieure à celle dans le bioréacteur. Dans une culture de perfusion, les cellules peuvent être retenues, par exemple, par filtration, centrifugation ou sédimentation.

Une culture « fed-batch » est une culture de cellules discontinue à laquelle un substrat, sous forme concentrée, solide ou liquide, est ajouté périodiquement ou de manière continue pendant l'analyse. Tout comme dans une culture discontinue, une culture « fed-batch » est initiée en inoculant des cellules au milieu, mais, contrairement à une culture discontinue, il y a un afflux subséquent de nutriments, comme par le biais d'une alimentation concentrée en nutriments. Contrairement à une culture continue, il n'y a pas d'élimination systématique de liquide provenant de la culture ou des cellules dans une culture « fed-batch ».

L'étape (a) du procédé selon l'invention peut être mise en œuvre dans tout récipient adapté à une culture cellulaire. A titre d'exemples particuliers, on peut citer un erlenmeyer, un bioréacteur ou un biofermenteur de différentes contenances. Des informations additionnelles sur ces différents récipients peuvent être trouvées dans [5].

Dans le procédé selon l'invention, les étapes (a) et (b) peuvent se dérouler l'une après l'autre ou, au contraire, simultanément. Avantageusement, lors de l'étape (b) du procédé selon l'invention, l'acide glycolique est récupéré dans le milieu de culture.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées.

BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS

La Figure 1 déjà citée présente les trois réactions clefs pour la production d'acide glycolique, isolées du métabolisme carboné central d'E. coli.

La Figure 2 déjà citée présente la voie non-naturelle pour la production d'acide glycolique à partir de D-glucose, de D-xylose et de L-arabinose.

La Figure 3 est une représentation schématique de l'essai enzymatique de vérification de l'activité de l'arabinose-5P isomérase (KdsD), la fructose-6P aldolase (FSA) et l'aldéhyde déshydrogénase (aldA). KdsD, FSA et aldA ont été purifiées, la triose phosphate isomérase (Tpi) et la glycérol-3P déshydrogénase (G3PDH) ont été commandées chez Sigma.

La Figure 4 présente le système comprenant 7 enzymes purifiées (AraA, AraB, AraD, RPE, KdsD, FSA, AldA) qui catalysent la conversion de L-arabinose en acide glycolique (Figure 4A). La production d'acide glycolique avec ce système en présence de Larabinose a été comparée à celle avec un système ne présentant pas AraA; la réactionenzymatique est basée sur le dosage de NADH à 340 nm (Figure 4B).

La Figure 5 présente le système comprenant 6 enzymes purifiées (XylA, XylB, RPE, KdsD, FSA, AldA) qui sont capables de convertir le D-xylose en acide glycolique (Figure 5A). La production d'acide glycolique avec ce système en présence de D-xylose a été comparée à celle avec un système ne présentant pas XylA ; la réaction enzymatique est basée sur le dosage de NADH à 340 nm (Figure 5B).

La Figure 6 présente le système comprenant 7 enzymes purifiées (Hxk, Pgi, Tkt, RPE, KdsD, FSA, AldA) qui sont capables de convertir le D-glucose en acide glycolique (Figure 6A). La production d'acide glycolique avec ce système en présence de Dglucose a été comparée à celle avec un système ne présentant pas Hxk; le dosage enzymatique est basé sur le dosage de NADH à 340 nm (Figure 6B).

La Figure 7 présente la mise en évidence de la fonctionnalité in vivo de la voie non-naturelle selon l'invention dans E. coli MG1655 AtktA AtktB AglcD, avec en gras : la voie non-naturelle selon l'invention, en pointillés, les délétions. Xu5P : xylulose-5phosphate, Ru5P : ribulose-5-phosphate, R5P : ribose-5-phosphate, S7P : sedoheptulose-7phosphate, F6P : fructose-6-phosphate, F16BP : Fructose-l,6-bisphosphate, G6P : glucose6-phosphate, DHAP : dihydroxyactone phosphate, Glyald : glycolaldéhyde, E4P : erythrose4-phosphate, G3P : glyceraldéhyde-3-phosphate.

La Figure 8 présente la production d'acide glycolique de la souche d'E. coli MG1655 AtktA AtktB AglcD exprimant la voie non naturelle dépendante de kdsD-fsa-aldA selon l'invention à partir de D-xylose ou de L-arabinose, à 37°C, lOOh.

La Figure 9 présente la production d'acide glycolique de la souche d'E. coli WC3G AgapA AglcD AarcA AmgsA AfucA Apkf proD-galP exprimant la voie non-naturelle dépendante de kdsD-fsa-aldA selon l'invention à partir de glucose, xylose et arabinose, à 37°C, 50h.

EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS

I. Preuve de faisabilité in vitro.

1.1. Matériel et Méthodes.

A. Construction de plasmides.

Pour construire un système in vitro, les inventeurs ont cloné les ORFs (pour « Open Reading Frames ») des xylose isomérase (XylA), xylulokinase (XylB), arabinose isomérase (AraA), ribulose kinase (AraB), L-ribulose-5-phosphate 4-epimérase (AraD), ribulose-5-phosphate-3-epimérase (RPE), D-arabinose-5-phosphate isomérase (KdsD), fructose-6-phosphate aldolase (FSA) et aldéhyde déshydrogénase (AldA) d'E. coli K12 MG1655 avec une étiquette polyhistidine pour une purification facilitée. Les oligonucléotides utilisés pour l'amplification des ORF des enzymes d'E. coli sont listés dans le Tableau 3 ci-dessous, les séquences SEQ ID NO: faisant référence au listage de séquences en annexe. L'ADN génomique d'E. coli qui a servi de matrice est celui de la souche K12M G1655.

Les plasmides pour l'expression des protéines étiquetées polyhistidine en C-terminal XylA, XylB, AraA, AraB, AraD, AraB, Rpe, KdsD, FSA, AldA ont été construits par HiFi assembly® (NEB) avec pET28a comme vecteur receveur. pET28a a été préalablement linéarisé avec les enzymes de restriction Hind 111 et BamHI (NEB) (Tableau 4). La souche d'E. coli NEB5®, dérivée de DH5 alpha, a été utilisée pour le clonage et le stockage des différents plasmides.

Tableau 3

Gène	Amorce	Séquence de l'amorce
xylA	Sens	ctggtgccgcgcggcagccatATGCAAGCCTAl l l ibAC (SEQ ID NO: 25)
Antisens	gtcgacggagctcgaattcgTTATTTGTCGAACAGATAATGG (SEQ ID NO: 26)

xylB	Sens	ctggtgccgcgcggca gcca t ATGT ATATCG G G ATAG ATCTTG (SEQ ID NO: 27)
Antisens	gtcga cggagctcga a ttcgTT ACG CC ATT AAT G GC AG (SEQ ID NO: 28)

ara A	Sens	ctggtgccgcgcggcagccatATGACGAl l l l l bATAATTATGAAG (SEQ ID NO: 29)
Antisens	gtcgacggagctcgaattcgTTAGCGACGAAACCCGTAATAC (SEQ ID NO: 30)

ara B -	Sens	ctggtgccgcgcggcagccat AT GGCG ATT GCAATT GG (SEQ ID NO: 31)
Antisens	gtcga cggagctcga a ttcgTT AT AG AGT CG CAACGG CC (SEQ ID NO: 32)

araD -	Sens	ctggtgccgcgcggcagccatATGTTAGAAGATCTCAAACG (SEQ ID NO: 33)
Antisens	gtcgacggagctcgaattcgTTACTGCCCGTAATATGC (SEQ ID NO: 34)

rpe	Sens	ctggtgccgcgcggcagccat ATGAAACAGT ATTTG ATTGC (SEQ ID NO: 35)
Antisens	gtcgacggagctcgaattcgTTATTCATGACTTACCl l iGC (SEQ ID NO: 36)

kdsD	Sens	gccgcgcggcagccatat AT GT CGCACGT AG AGTT AC (SEQ ID NO: 37)
Antisens	gtcgacggagctcgaattcgTTACACTACGCCTGCACG (SEQ ID NO: 38)

fsa	Sens	gccgcgcggcagccatatATGGAACTGTATCTGGATACTTC (SEQ ID NO: 39)
Antisens	gtcga cggagctcga a ttcgTT AAATCG ACGTT CT G CC (SEQ ID NO: 40)

aldA	Sens	ctggtgccgcgcggcagccat AT GTCAGT ACCCGTT CAAC (SEQ ID NO: 41)
Antisens	gtcgacggagctcgaattcgTT AAG ACT GT AAAT AAACCACC (SEQ ID NO: 42)

Tableau 4 : Plasmides utilisés pour la démonstration de faisabilité in vitro

Nom	Descriptif	Référence
pET28	Kan ^R, CoIEl ori	Novagen ®
pVT-FSA	pET28 portant fsa	Cette étude
pVT-KDSD	pET28 portant kdsD	Cette étude
pVT-ALDA	pET28 portant aldA	Cette étude
pVT-RPE	pET28 portant rpe	Cette étude
pVT-XYLA	pET28 portant xylA	Cette étude
pVT-XYLB	pET28 portant xy/B	Cette étude
pVT-ARAA	pET28 portant araA	Cette étude
pVT-ARAB	pET28 portant araB	Cette étude
pVT-ARAD	pET28 portant araC	Cette étude

B. Construction des souches.

Les cellules compétentes d'E. coli BL21 (DE3) ont été utilisées pour l'expression des protéines étiquetées puisque ces cellules expriment l'ARN polymérase T7, et sont donc compatibles avec le système d'expression T7 du vecteur pET28a. Les plasmides pET28a préalablement vérifiés par séquençage ont été transformés dans les BL21 (DE3) selon le protocole NEB. Les souches obtenues sont stockées dans 50% de glycérol à -80°C (Tableau 5).

Tableau 5 : Souches d’Escherichia coli utilisées pour la démonstration de faisabilité in vitro

Souche	Genotype	Référence
MG1655	F- À-ilvG-rfb-50 rph-1	ATCC 47076
BL21 (DE3)	fhuA2 [Ion] ompT gal (λ DE3) [dcm] AhsdS	Invitrogen ®
prodFSA	BL21 contenant pVT-FSA	Cette étude
prodKDSD	BL21 contenant pVT-KDSD	Cette étude
prodALDA	BL21 contenant pVT-ALDA	Cette étude
prodRPE	BL21 contenant pVT-RPE	Cette étude
prodXYLA	BL21 contenant pVT-XYLA	Cette étude
prodXYLB	BL21 contenant pVT-XYLB	Cette étude
prodARA	BL21 contenant pVT-ARAA	Cette étude

prodARAB BL21 contenant pVT-ARAB Cette étude prodARAC BL21 contenant pVT-ARAC Cette étude

C. Expression et purification des protéines étiquetées polyhistidine.

Toutes les protéines exprimées sont solubles et ont été produites à partir du vecteur d'expression pET28a transformé dans une souche d'E. coli BL21 (DE3). Une préculture en milieu LB (pour « Luria-Bertani ») additionnée de l'antibiotique kanamycine est réalisée sur la nuit à 37°C. La pré-culture est utilisée pour ensemencée une culture fraîche de 200 mL de LB-Kanamycine à une densité optique à 600 nm (DOeoo) de 0,1 (37°C, 200 rpm). Lorsque la DOeoo est comprise entre 0,6 et 0,8, l'expression de la protéine d'intérêt est induite par l'ajout d'IPTG à 1 mM final. Les protéines sont exprimées sur la nuit à 16°C. Les cellules sont collectées par fractions de 50 ml et centrifugées à 4800 rpm pendant 15 min à 4°C. Les culots cellulaires sont conservés à -20°C.

La purification des protéines est réalisée à partir des culots cellulaires obtenus lors de l'étape de production. Toutes les étapes sont faites à froid pour éviter la dégradation des protéines par des protéases. Les culots cellulaires sont remis en suspension dans 1,5 mL de tampon de lavage (50 mM HEPES, pH 7,5 ; 0,3 M NaCI) puis soniqués sur glace. Une étape de centrifugation à 13000 rpm, pendant 15 min à 4°C permet de séparer les débris cellulaires du liquide cytoplasmique. Les lysats clarifiés sont déposés sur 600 pl de résine cobalt (Clontech) préalablement équilibrée avec le tampon de lavage. Après 20 min à température ambiante au contact de la résine, les tubes sont centrifugés (700 rcf, 3 min, 4°C). Le surnageant est retiré, la résine est mise en contact avec 3 mL de tampon de lavage pendant 10 min afin d'éliminer les interactions non spécifiques. Après centrifugation (700 rcf, 3 min, 4°C) et élimination du surnageant, 3 mL d'une solution à 15 mM d'imidazole sont mis en contact avec la résine pendant 5 min. Le surnageant est séparé de la résine par centrifugation, remplacé par 500 pl d'imidazole à 200 mM. L'imidazole entraîne l'élution des protéines porteuses d'une étiquette polyhistidine. Pour favoriser la stabilité des protéines à leur pH optimal, le tampon a été modifié.

La méthode utilisée pour mesurer la concentration des protéines en solution est basée sur la méthode de Bradford. Le réactif Protein assay® commercialisé par BioRad est dilué au %, le mélange réactionnel comprend 160 pl de réactif et 40 μΙ d'éluat dilué (au io^ème et au 20^ème). Une gamme standard est réalisé avec de la BSA de 12,5 à 100 pg/ml.

D. Essais enzymatiques.

Toutes les enzymes ont été testées dans 100 mM Tris, pH 7.5, 10 mM MgCb, à 37°C. Les co-facteurs et activateurs ont été ajoutés si nécessaire.

Les enzymes hexokinase de Soccoromyces cerevisioe (Hxk), transcétolate d'Escherichio coli (Tkt), pyruvate kinase d'Escherichio coli (PK) et lactate déshydrogénase d'Escherichio coli (LDH), la triose-phosphate isomérase (Tpi) et la glycérol-3-phosphate déshydrogénase (G3PDH) ont été commandées chez Sigma. La phosphoglucose isomérase d'Escherichio coli (Pgi) chez Megazyme.

Tous les substrats enzymatiques ont été achetés chez Sigma-Aldrich. Les tests enzymatiques sont couplés à une réaction redox avec pour co-facteur, le NADH qui absorbe l'ultraviolet avec un pic à 340 nm avec un coefficient d'extinction molaire de 6 220 Le spectrophotomètre Epoch 2 de Bio Tek a été utilisé pour le suivi des réactions en UV.

Mesure d'activité de l'aldéhyde déshydrogénase (AldA) : Cette activité a été mesurée en présence de 5 mM de glycoaldéhyde, 3 mM de NAD⁺ et 3 mM d'ATP. Pour une molécule de glycoaldéhyde oxydée en glycolate, une molécule de NAD⁺ est réduite en NADH.

Mesure d'activité la fructose-6P aldolase (FSA) :L'enzyme FSA clive le Darabinose-5-phosphate en glycolaldéhyde et glycéraldéhyde-3-phosphate (GAP). La vitesse d'apparition de glycolaldéhyde a été mesurée en présence d'AldA avec 2 mM de NAD+. Pour suivre l'apparition de GAP, la TPI et la G3PDH ont été ajoutées, en présence de 0,4 mM de NADH.

Mesure d'activité de la D-orobinose-5-phosphote isomérase (KdsD) : La Darabinose-5-phosphate isomérase catalyse l'interconversion du D-ribulose-5-phosphate en

D-arabinose-5-phsphate. L'activité de KdsD sur D-ribulose-5-phosphate a été déterminée en ajoutant FSA, aldA en excès en présence de 3 mM de NAD⁺.

Conversion du D-xylose en acide glycolique in vitro : La conversion du Dxylose en acide glycolique requiert XylA, XylB, Rpe, KdsD, FSA et aldA (Figure 5A). La conversion du D-xylose en acide glycolique est démontrée dans un mélange réactionnel contenant 100 mM Tris HCl pH 7,5, 10 mM MgCb, 0,5 mM MnCb, 3 mM ATP, 2 mM NAD⁺, 1-10 pg de chaque enzyme et 5 mM de D-xylose.

Conversion du L-arabinose en acide glycolique in vitro : La conversion du L-arabinose en acide glycolique requiert AraA, AraB, AraD, Rpe, KdsD, FSA et aldA (Figure 4A). La conversion du L-arabinose en acide glycolique est démontrée dans 100 mM Tris HCl, pH7,5, 10 mM MgCb, 0,5 mM MnCb, 3 mM ATP, 2 mM NAD⁺, 1-10 pg de chaque enzyme et 5 mM de L-arabinose.

Conversion du D-qlucose en acide glycolique in vitro : La conversion du Dglucose en acide glycolique requiert les enzymes Hxk, Pgi, Tkt, Rpe, KdsD, FSA et aldA (Figure 6A). La démonstration de faisabilité est réalisée dans 100 mM Tris HCl, pH 7,5, 10 mM MgCb, 0,5 mM MnCb, 1 mM TPP (pour « Thiamine Pyrophosphate »), 3 mM ATP, 2 mM NAD, 5 mM Glycéraldéhyde-3P, 1-10 pg de chaque enzyme et 5 mM de D-glucose.

1.2. Résultats.

A. Conversion in vitro du D-ribulose-5P en acide glycolique.

Le ribulose-5P est un métabolite commun au catabolisme de l'arabinose, du xylose et du glucose chez Escherichia coli. La voie non-naturelle de conversion du Dribulose-5P en acide glycolique faisant l'objet de la présente invention est constituée des enzymes KdsD (D-arabinose 5P isomérase), FSA (Fructose-6P aldolase) et AldA (glycolaldéhyde déshydrogénase). La démonstration de faisabilité in vitro a consisté à reconstruire cette voie avec des enzymes purifiées dans un tampon adapté. Premièrement aldA a été caractérisée sur glycolaldéhyde, puis l'activité de FSA sur D-arabinose-5P a été vérifiée par couplage avec aldA afin de vérifier la formation de glycolaldéhyde et par couplage avec la triose phosphate isomérase et la glycérol-3P déshydrogénase pour mettre en évidence la synthèse de glycéraldéhyde-3P (Figure 3). Les mesures d'activités de FSA obtenues par ces 2 méthodes sont identiques. Enfin l'activité de KdsD sur D-ribulose-5P a été mesurée par couplage avec les enzymes FSA et AldA en excès. Ce dernier essai enzymatique a permis de vérifier la fonctionnalité de KdsD et de reconstituer la voie de synthèse d'acide glycolique entière. Le NADH est produit en quantité équimolaire avec l'acide glycolique. Afin de vérifier que le NADH soit réellement un témoin de la production d'acide glycolique la production d'acide glycolique a été mesurée en HPLC.

Les constantes catalytiques de ces 3 enzymes sont présentées dans le Tableau 6. Les protéines étiquetées polyhistidine KdsD, FSA et aldA sont actives. Le mélange réactionnel contenant KdsD, FSA et AldA en présence de 5 mM de D-ribulose-5P a été analysé en HPLC, 1,5 mM d'acide glycolique ont été quantifiés. La production d'acide glycolique mesurée correspond à la quantité initiale de NAD+ dans le milieu de réaction, indiquant que la réaction a été complète.

Tableau 6 : Constantes catalytiques de l'arabinose-5P isomérase (KdsD), la fructose-6P aldolase (FSA), l'aldéhyde déshydrogénase (AldA) étiquetées polyhistidine

Enzyme	Substrat	Km (mM)	Vmax(U mg^{1 * *})	Vmax/Km(.10⁶) (min¹ mg¹)
KdsD-His	D-ribulose-5P	1,34 ±0,12	1,14 ±0,17	850
FSA-His	D-arabinose-5P	0,652 ±0,15	0,26 ± 0,09	398
aldA-His	glycolaldéhyde	0,21 ±0,05	1,16 ±0,31	5552

B. Conversion de L-arabinose ou du D-xylose ou du D-glucose en acide alycolique.

Les enzymes catalysant la conversion du L-arabinose, D-xylose et Dglucose en acide glycolique ont été purifiées (AraA, AraB, AraD, XylA, XylB, Rpe, KdsD, Fsa, AldA) ou commandées (Tkt, Glk, Pgi) afin de démontrer la faisabilité de la production d'acide glycolique à partir de ces 3 substrats in vitro.

i. Conversion du L-arabinose en acide glycolique.

La conversion du L-arabinose en acide glycolique et glycéraldéhyde 3P est catalysée par AraA, araB, araD, Rpe, KdsD, FSA et aldA (Figure 4A). La synthèse de NADH observée lors de l'essai enzymatique en présence de L-arabinose est le témoin indirect de la production d'acide glycolique (Tableau 7, Figure 4B).

La conversion du L-arabinose en acide glycolique est démontrée et cette voie métabolique est donc thermodynamiquement possible.

Tableau 7 : Activité enzymatique mesurée pour la conversion de Larabinose en acide glycolique à 340 nm, 37°C. Une unité d'activité enzymatique (U) est définie comme la conversion d'une micromole de substrat par minute. Le contrôle négatif est dépourvu de l'activité arabinose isomérase catalysée par AraA.

Substrat (5mM)	Enzymes	Activité (U)
L-arabinose	AraA, AraB, AraD, Rpe, KdsD, FSA, AldA	11,59
	AraB, AraD, Rpe, KdsD, FSA, AldA	0,00

ii. Conversion de D-xylose en acide glycolique.

La conversion du D-xylose en acide glycolique et glycéraldéhyde 3P est catalysée par XylA, XylB, Rpe, KdsD, FSA et AldA (Figure 5A). Lorsque que ces enzymes sont mises en présence de D-xylose, le D-xylose est converti en acide glycolique in vitro comme l'atteste la production de NADH (Figure 5B, Tableau 8).

Tableau 8 : Activité enzymatique mesurée pour la conversion de D-xylose en acide glycolique à 340 nm, 37°C. Une unité d'activité enzymatique (U) est définie comme la conversion d'une micromole de substrat par minute. Le contrôle négatif est dépourvu d'activité xylulose isomérase catalysée par XylA.

Substrat (5mM)	Enzyme(s)	Activité (U)
	XylA, XylB, Rpe, KdsD, FSA, AldA	15,07
u-xyiose	XylB, Rpe, KdsD, FSA, AldA	0,00
La voie	de conversion du D-xylose en	glycolate est fonctionnelle

thermodynamiquement possible.

iii. Conversion de D-glucose en acide glycolique.

La conversion du D-glucose en acide glycolique a été démontrée en mettant en présence le D-glucose et le DL-glycéraldéhyde-3P (GAP) avec Hxk, Pgi, Tkt, Rpe, KdsD, FSA et AldA (Figure 6A). Le contrôle négatif présente une activité importante (Figure 6B, Tableau 9). Le GAP est une molécule relativement instable, il se déphosphoryle alors spontanément en glycéraldéhyde. Baldoma étal. (1987) a démontré qu'AldAd'Escherichia coli était active sur glycolaldéhyde, lactaldéhyde, méthylglyoxal et L-glycéraldéhyde [13]. La synthèse de NADH dans le contrôle négatif n'est donc pas corrélée à la synthèse de glycolate mais de glycérate provenant de l'oxydation du glycéraldéhyde. Cette activité secondaire n'est pas pertinente in vivo, d'autant plus que le L-glycéraldéhyde n'est pas formé chez Escherichia coli.

Tableau 9 : Activité enzymatique mesurée pour la conversion du Dglucose en acide glycolique à 340 nm, 37°C. Une unité d'activité enzymatique est définie comme la conversion de 1 micromole de substrat par minute. Le contrôle négatif est dépourvu d'activité hexokinase (Hxk).

Substrats (5mM)	Enzymes	Activité (U)	Activité corrigée (U)
D-glucose, GAP	Hxk, Pgi, Tkt, Rpe, KdsD, Fsa, AldA	23,5	6,2
Pgi, Tkt, Rpe, KdsD, Fsa, AldA	17,3

D'après ces résultats, la voie de conversion du D-glucose en acide glycolique est fonctionnelle in vitro et donc thermodynamiquement favorable.

Les glucides L-arabinose, D-xylose et D-glucose sont naturellement assimilés et convertis en D-ribulose-5P dans Escherichia coli, la conversion non-naturelle du D-ribulose-5P en acide glycolique permise par la surexpression de KdsD, FSA et aldA a été démontrée. L'implémentation de la voie non-naturelle KdsD-FSA-aldA est thermodynamiquement favorable, les voies complètes d'assimilation et de conversion des pentoses et hexose reconstruites ont permis la synthèse d'acide glycolique in vitro.

Cependant la démonstration in vitro est par définition isolée du métabolisme naturel d’E. coli, ces résultats ne tiennent pas compte des réactions impliquant les intermédiaires, de l'efficacité du transport transmembranaire des substrats et de l'excrétion d'acide glycolique, de la disponibilité en co-facteurs,... Une démonstration de faisabilité in vivo complémentaire a été réalisée pour solidifier ces résultats préliminaires.

II. Preuve de faisabilité in vivo.

11.1. Matériel et Méthodes.

A. Construction des plasmides.

i. Choix des vecteurs

La série de vecteurs pZ (Expressys) a l'avantage d'être modulable : il est facile de changer l'origine de réplication, le marqueur de résistance et le promoteur des vecteurs par restriction/ligation.

Les vecteurs pZA23, pZA33, pZE23 et pZS23 possèdent le promoteur PAllacO-1 qui est un promoteur dérivé du promoteur de l'opéron lactose comprenant l'opérateur o. PAllacO-1 est sous le contrôle du répresseur lacl : sous sa forme active, le répresseur lacl se lie à l'opérateur o et inhibe la transcription alors que, complexé avec l'IPTG, il change de conformation et n'est plus capable de se fixer au site o, la transcription devenant alors possible. Le promoteur PAllacO-1 est dit inductible à l'IPTG. Même si E. coli possède naturellement une copie du gène lacl dans son génome en amont de l'opéron lac, la majorité des vecteurs d'expression bactériens inductibles à l'IPTG portent le gène lacl afin d'assurer l'inhibition totale de la transcription de gènes qui sont sous sa dépendance. Les vecteurs pZ ont la particularité d'avoir une structure allégée du gène lacl ce qui leur confère une faible taille (2358 à 3764 pb).

Des modifications ont été apportées au vecteur pZA33, le promoteur PAllacO-1 a été remplacé par le promoteur constitutif proD et par le promoteur inductible Ptac, générant les vecteurs pZA36 et pZA38 respectivement. Le promoteur PAllacO-1 de pZS23 a été modifié pour le promoteur proD générant les vecteurs pZS27.

ii. Méthode de clonage : HiFi Assembly

La méthode de l'HiFi assembly® (NEB) a été retenue pour construire les vecteurs utilisés ci-après. Cette méthode permet l'assemblage de plusieurs fragments. Elle a été validée pour des fragments de tailles différentes avec des régions de chevauchement variables (15-80 pb). En une seule étape, les fragments peuvent être assemblés, c'est une méthode couramment utilisée pour sa simplicité et sa flexibilité.

Le mélange commercial fournit par New England Biolabs contient différentes enzymes : (a) une exonucléase qui crée des extrémités simple brin en 3', ce qui facilite l'assemblage des fragments qui partagent une complémentarité de séquences ; (b) une polymérase qui comble les espaces vides après que les fragments se sont assemblés ; et (c) une ligase qui lie les fragments entre eux.

Les gènes de la voie synthétique de production de l'acide glycolique selon l'invention kdsD,fsa et aldA ont été amplifiés par PCR à partir de l'ADN génome extrait d'E. coli K12 MG1655 et insérés par HiFi assembly® dans les vecteurs pZ, préalablement linéarisés par PCR avec des amorces s'hybridant de part et d'autre du MCS. Tous les plasmides ont été vérifiés par séquençage avant utilisation.

iii. Vecteurs d'expression pour la surexpression de kdsD, fsa, aldA

Les vecteurs utilisés pour la surexpression de kdsD, fsa et aldA sont présentés dans le Tableau 10 ci-après.

Tableau 10

Nom	Description	Source
pZA23	Kan^R, ori pl5A, PAllacO-1	Expressys
pZA33	Chm ^R, ori pl5A, PAllac0-l	Expressys
pZS23	Kan ^R, ori pSClOl, PAllacO-1	Expressys
pZA36	Chm ^R, ori pl5A, Ptac	Cette étude
pZA37	Chm ^R, ori pl5A, proC	Cette étude
pZS28	Kan^R, ori pSClOl, proD	Cette étude
pEXT20	Amp^R, ori CoIEl, Ptac	[32]
pET28a	Kan ^R'ori CoIEl, Ptac	Novagen
pKF3	pZA36 kdsD fsa	Cette étude
pA4	pZS23 aldA	Cette étude
pKF5	pZA37 kdsD fsa	Cette étude

pA8 pZS28aldA

Cette étude

B. Construction des souches.

i. Délétions des gènes

Les délétions ont été réalisées par transduction, en utilisant le phage Plvir. La préparation des lysats Plvir et les procédures de transduction ont été réalisées comme décrit précédemment avec peu de modifications [33].

Ainsi, les souches KEIO portant une délétion unique et une cassette de résistance à l'antibiotique Kanamycine (souche donneuse) ont été infectées avec Plvir et des lysats λ de titre élevé ont été obtenus [34], Les souches donneuses (KEIO) ont été cultivées sur une nuit dans du LB à 37°C. Le lendemain, 5 ml de LB contenant 0,2% de glucose et 5 mM de CaCF ont été inoculés avec 200 μΙ de la souche donneuse et cultivés pendant 30 min à 37°C. Ensuite, 100 μΙ de lysat de Plvir (~ 5 x 10⁸ phages/ml) ont été ajoutés à chaque culture de donneur et incubés de nouveau à 37°C pendant 2 à 3 heures jusqu'à ce que la culture soit claire et les cellules soient complètement lysées. Les lysats ont été filtrés en utilisant des filtres à seringue stériles de 25 mm avec une membrane Supor® de 0,2 pm (Pali) et conservés à 4°C.

La souche à déléter (souche réceptrice) a été infectée avec Plvir contenant une cassette de délétion de gène donneur avec une résistance à la kanamycine. Pour cela, la souche réceptrice a été cultivée dans 5 ml de milieu LB à 37°C. Les cellules ont été centrifugées à 1 500 g pendant 10 min et remises en suspension dans 1,5 ml de MgSCU à 10 mM et de CaCF à 5 mM. Du lysat de la souche donneuse (0,1 ml) est ajouté à la suspension cellulaire qui est incubée pendant 30 min. Ensuite, 0,1 ml de citrate de sodium à 1 M est ajouté au mélange cellules et Plvir. Ensuite, 1 mL de LB est ajouté à la suspension homogénéisée avant une incubation de lh à 37°C, 200 rpm.

Les suspensions cellulaires sont étalées sur un milieu LB solide avec l'antibiotique approprié puis les colonies sont criblées par PCR pour mettre en évidence des événements de transduction réussis.

Pour éliminer la cassette à l'antibiotique, les cellules ont été transformées avec un plasmide pCP20 portant la FLP recombinase. Chaque étape a été vérifiée par PCR. Lorsque la souche délétée est sensible à la kanamycine après le retrait de la cassette, elle peut de nouveau être utilisée comme souche réceptrice afin d'ajouter une nouvelle délétion à partir d'un nouveau lysat de phage.

ii. Préparation de bactéries compétentes et transformation

Les souches non commerciales compétentes sont préparées selon le protocole de Chung et al, 1989 légèrement modifié [35]. Une pré-culture est réalisée en LB sur la nuit pour inoculer le lendemain une culture fraîche de LB à une DOeoo de 0,1. Lorsque la DOeoo atteint 0,3-0,5 (les bactéries peuvent être rendues compétentes jusqu'à une DOeoo de 1), une quantité de culture cellulaire équivalente à une unité DOeoo est prélevée et centrifugée (8000 rpm, 2 min). Le surnageant est retiré tandis que le culot est repris dans 300 μΙ de tampon TSS (2,5 %<_wt/voi) PEG 3350, 1 M MgCE, 5% (_voi/voi) DMSO). Le mélange est incubé pendant 10 min sur glace. Le plasmide peut alors être ajouté aux cellules compétentes. Après 30 min supplémentaires d'incubation sur glace, un choc thermique est réalisé à 42°C pendant 90 secondes. Les cellules transformées sont mises dans la glace min. 400 μΙ de LB sont ajoutés et la culture est incubée à 200 rpm pendant lh, à une température adaptée (la température ne peut excéder 30°C dans le cas d'une transformation avec un plasmide dont l'origine de réplication est thermosensible). La culture bactérienne est centrifugée à 8000 rpm pendant 2,5 min. 600 μΙ de surnageant sont retirés, le volume restant est inoculé sur une boîte de LB solide avec l'antibiotique approprié.

iii. Souches pour la production d'acide glycolique

Les souches d’E. coli utilisées dans cette étude sont listées dans le Tableau ci-après.

Tableau 11

Souche	Génotype Référence
MG1655	F- À- ilvG- rfb-50 rph-1 ATCC 407076
NEB5	fhuA2 A(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Φ80 A(lacZ)M15 N EB gyrA96 recAl relAl end Al thi-1 hsdR17
BL21 (DE3) ScreenOO	huA2 [Ion] ompT gai (λ DE3) [dcm] AhsdS) NEB MG1655 AtktA AtktB AglcD Cette étude
Screen09	ScreenOO contenant pZA36 kdsD fsa (pKF3) et pZS23 Cette étude aldA (pA4)
Screen23	ScreenOO contenant pZA37 kdsD fsa (pKF5) et pZA28 Cette étude aldA (pA8)
WC3G gapABW25113	W3CG F-, LAM-, gapA 10 ::Τη10,1 N(rrnD-rrnE), rph-1 [36] F-,A(araD-araB)567,AlacZ4787(::rmB-3),A',rph-l,A(rhaD- [25] rhaB)568, hsdR514
JW2771	BW25113 AfucA [25]
JW4364	BW25113 AarcA [25]
JW5129	BW25113 AmgsA [25]
JW2946	BW25113 AglcD [25]
JW2771	BW25113 AfucA [25]
JW3887	BW25113 ApfkA [25]
GA00	WC3G gapA- AglcD AarcA AmgsA AfucA ApfkA proD galP Cette étude
GA09	GA00 contenant pZA36 kdsD fsa (pKF3) et pZS23 aldA Cette étude (pA4)
GA23	GA00 contenant pZA37 kdsD fsa (pKF5) et pZA28 aldA Cette étude (pA8) C. Milieux et conditions de culture. i. Composition des milieux
5	Les cellules sont cultivées sur le milieu LB pour les étapes de biologie

moléculaire (clonage, délétions, transformation). Ce milieu riche est composé de 10 g/L de tryptone, 5 g/L d'extraits de levure et 5 g/L de NaCI. 15 g/L d'agar sont ajoutés pour l'obtention d'un milieu solide. Le LB, avec ou sans agar, est stérilisé par autoclavage 20 min à 110°C avant utilisation.

Les cultures pour la production d'acide glycolique sont réalisés en milieu minéral M9 (Tableau 12) contenant une source de carbone (glucose, xylose ou arabinose) à une concentration de 10 g/L ou 20 g/L et des traces de LB afin de réduire la phase de latence (2 g/L tryptone, 1 g/L d'extraits de levure et 1 g/L de NaCI).

Tableau 12 : Composition du milieu M9

Composé	Concentration finale (g/L)
Na₂HPO₄ * 12 H₂O	18
KH2PO4	3
NaCI	0,5
NH4CI	2
MgSO₄ * 7 H₂O	0,5
CaCI₂ * 2 H₂O	0,015
FeCI₃	0,010
Thiamine HCl	6.10^-3
NaEDTA	0,49.10³
C0CI2 * 6 H₂O	1,8.10³
ZnCI₂SO₄ * 7 H₂O	1,8.10³
Na₂MoO₄ * 2 H₂O	0,4 .10^-3
H3BO3	0,1.10³
MnSO₄ * H₂O	1,2.10^-3
1,2 mg/LCuCb * 2 H₂O	1,2.10^-3

Pour la souche MG1655 AtktA AtktB AglcD, le milieu M9 avec destraces de LB est complémenté avec 500 pM L-phénylalanine, 250 pM L-tyrosine, 200 pM L10 tryptophane, 6 pM p-aminobenzoate, 6 pM p-hydroxydenzoate et 280 pM de shikimate.

Pour les souches dont l'activité glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase a été supprimée, le milieu a été complété avec 0,4 g/L d'acide malique ajusté à pH 7 avec du KOH au préalable. Le milieu est tamponné par l'addition de 20 g/L d'acide 3-(Nmorpholino)propanesulfonique (MOPS) à pH 7 puis filtré sur des membranes à 0,2 pm pour 15 obtenir un milieu stérile. Si besoin, les antibiotiques appropriés ont été ajoutés au milieu (ampicilline 100 pg/mL, kanamycine 50 pg/mL, chloramphenicol 25 pg/mL). Pour les souches contenant un vecteur inductible à l'IPTG, une concentration finale de 0,1 mM d'IPTG est utilisée. Tous les produits ont été commandés chez Sigma. Les cultures sont placées dans un agitateur (Infors) à 200 rpm, 37°C le temps de l'expérience. La croissance des cultures est suivie par la mesure de la densité optique à 600 nm (DOeoo) au spectrophotomètre (Biochrom Libra SU).

ii. Procédé de fermentation en fioles Erlenmeyer à baffles de 250 mL

Souches contenant des promoteurs constitutifs

Les souches sont reprises à partir d'un stock glycérol conservé à -80°C dans 10 mL de LB, à 37°C sur la nuit. Les pré-cultures sont centrifugées le lendemain à 4000 rpm pendant 5 min et resuspendues dans 20 mL de milieu M9 xylose ou arabinose 1% en flacons d'Erlenmeyer de 100 mL. Une phase d'adaptation d'une durée de 24h permet aux souches de s'adapter à l'utilisation de pentose. Les cellules sont ensuite centrifugées (4000 rpm, 5 min) et reprises dans les conditions de culture finales : à une DOeoo initiale de 0,5 dans 50 mL du milieu de composition identique à celui utilisé pendant la phase d'adaptation (M9 xylose ou arabinose 1%). Des flacons de culture à baffles de 250 mL sont utilisés pour une oxygénation optimale. Les cultures sont agitées à 200 rpm, à 37°C.

Souches contenant des promoteurs inductibles

Les précultures en LB des souches contenant un vecteur avec promoteur inductible sont mises en culture à une DOeoo initiale de 0,1 dans 30 mL de M9 glucose 1%. Lorsque la DOeoo atteint 0,6, 0,1 mM d'IPTG sont ajoutés pour induire l'expression des gènes sous le contrôle du promoteur inductible à l'IPTG (plac ou ptac). 24 h après, les cellules sont centrifugées, un lavage à l'eau stérile permet d'enlever les traces de glucose, et resuspendues dans 20 mL du milieu choisi pour l'étude (M9 xylose ou arabinose 1%, 0,1 mM IPTG) pour la phase d'adaptation. Le reste du protocole de mise en culture est identique à celui pour les souches avec promoteurs constitutifs.

iii. Procédé de fermentation en bioréacteur 2L BIOSTAT® B Startorius Stedim Biotech

Des cultures de la souche GA23 décrite précédemment ont été réalisées en bioréacteur de 2L. Les précultures ont été réalisées dans du LB additionné de kanamycine, chloramphénicol et tétracycline, mise en culture à 37°C, 200 rpm. Une première préculture de 3 mL a été réalisée la nuit, celle-ci a servi à l'inoculation d'une deuxième préculture de 15 mL mise en culture pendant 24h. Celle-ci a servi à l'inoculation d'une troisième et dernière préculture en erlenmeyer de 150 mL cultivée pendant 8h. En phase exponentielle, cette dernière préculture a été utilisée pour inoculer la culture en fermenteur à une DO de 0,3. Le milieu de culture M9 (Tableau 12) contient 10 g/L de xylose ou glucose, ainsi que du LB (10%) et 0,4 g/L d'acide malique Les cultures ont été réalisées à 37°C, avec une agitation (300-1500 rpm) et une aération maintenant l'oxygène dissous au-dessus de 20% du débit d'air. Le pH a été maintenu à 7 avec une solution de base KOH. La culture a été conduite en mode batch pendant 40h.

D. Quantification des concentrations des métabolites extracellulaires.

La consommation de sucre et la production d'acide glycolique sont suivies en prélevant régulièrement des échantillons en conditions stériles qui sont centrifugés à 13,000 rpm pendant 5 min dans une centrifugeuse de paillasse (Eppendorf 5415D), filtrés à travers un filtre de 0,2 pm et stockés à -20°C. La quantification des métabolites extracellulaires est réalisée par chromatographie liquide haute performance (CLHP) avec un chromatographe Ultimate 3000 (Dionex, Sunnyvale, USA). Le système de CLHP est équipé d'une colonne à échange de cations (Aminex, HPX87H - 300 x 7,8 mm, 9 pm, BioRad), d'un injecteur automatique (WPS-3000RS, Dionex), d'un détecteur IR (RID 10A, Shimadzu) et d'un détecteur UV (SPD-20A, Shimadzu). La phase mobile est une solution de d'acide sulfurique à 1,25 mM à un débit de 0,5 mL/min. Les échantillons sont maintenus à 4°C et l'injection de 20 pl se fait dans la colonne à 35°C.

11.2. Résultats obtenus en erlenmeyer à baffles.

Les inventeurs ont démontré que la surexpression dans E. coli des 3 enzymes de la voie non-naturelle selon l'invention i.e. l'arabinose-5-phosphate isomérase (KdsD), la fructose-6-phosphate aldolase (FSA) et l'aldéhyde déshydrogénase (AldA) est nécessaire et suffisante à la synthèse d'acide glycolique à partir de monosaccharides lignocellulosiques.

A. Avec des pentoses comme source de carbone.

Pour cela, une souche d'E. coli K12-MG1655 délétée des gènes tktA, tktB codant pour les transcétolases a été construite pour mettre en évidence la fonctionnalité de la voie selon l'invention. Les transcétolases sont des enzymes majeures de la voie des pentoses phosphate. En leur absence, la croissance sur pentose est impossible, les intermédiaires pentose phosphate (D-ribose-5-phosphate et D-Xylulose-5-phosphate) s'accumulent et ne peuvent être convertis en glycéraldéhyde-3phosphate pour la croissance [37], Cette souche a besoin de la voie non-naturelle selon l'invention pour croître à partir de pentoses. En effet, seule l'activité couplée de KdsD et FSA peut générer du glycéraldéhyde-3-phosphate entrant dans la glycolyse pour la production des précurseurs nécessaires à la croissance [38]. Ainsi un crible fonctionnel par test de croissance est envisageable dans lequel la croissance serait un indicateur de l'efficacité de la voie synthétique in vivo (Figure 7).

Les 3 gènes ont été clonés en opéron et exprimés dans une souche d’E. coli MG1655 AtktA AtktB AglcD. Pour ce faire, un système d'expression à deux vecteurs a été utilisé, ce dernier ayant été accepté par la souche sans engendrer de modifications délétères pour l'expression de la voie synthétique selon l'invention. Le système d'expression de la voie synthétique selon l'invention comporte donc un vecteur à moyen nombre de copies portant kdsD-fsa co-exprimé avec un vecteur à faible nombre de copies portant aldA.

Deux systèmes d'expressions ont été étudiés, l'un avec des vecteurs aux promoteurs inductibles à l'IPTG (pZA36 kdsD fsa et pZS23 aldA, système d'expression n°9) et l'autre avec des vecteurs aux promoteurs constitutifs (pZA37 kdsD fsa et pZS28 aldA, système d'expression n°23).

Les cultures des souches MG1655 AtktA AtktB AglcD exprimant les systèmes 9 (Screen09) et 23 (Screen23) ont été réalisées 37°C et ont montré une croissance significative indiquant que la surexpression des gènes kdsD et fsa est fonctionnelle. Les analyses HPLC de l'exométabolome des cultures bactériennes sur L- arabinose et le Dxylose ont confirmé la présence d'acide glycolique avec les deux systèmes d'expressions. Ce résultat démontre la faisabilité de la synthèse d'acide glycolique à partir de pentoses par la voie synthétique in vivo (Figure 8). Le Tableau 13 ci-après présente le rendement en acide glycolique à partir de xylose et arabinose des souches Screen09 et Screen23.

Tableau 13

	Souche	acide glycolique/xylose (mol/mol)	acide glycolique/arabinose (mol/mol)
ScreenOO		0,14 ±0,03	0,14 ± 0,03
Screen09		0,43 ± 0,02	0,32 ± 0,01
Screen23		0,42 ± 0,02	0,20 ± 0,03

	Souche	Acide glycolique /xylose (g/g)	Acide glycolique/arabinose (g/g)
ScreenOO		0,07± 0,03	0,07 ± 0,03
Screen09		0,22 ± 0,02	0,16 ± 0,01
Screen23		0,21 ± 0,02	0,10 ± 0,03

B. Avec des pentoses et des hexoses comme source de carbone.

Les systèmes d'expression 9 et 23 ont été transformés dans la souche d'E. coli WC3G AgapA AglcD AarcA AmgsA AfucA Apkf proD-galP (GA00) conçue pour la production d'acide glycolique à partir d'hexoses et de pentoses avec une conservation optimale du carbone, générant les souches GA09 et GA23, respectivement.

Les cultures bactériennes ont été réalisées en erlenmeyer à 37°C sur Dglucose, L-arabinose et D-xylose pendant 46h. La surexpression des gènes kdsD,fsa et aldA est nécessaire pour la production d'acide glycolique.

La souche GA00 avec le système d'expression constitutif n°23 soit GA23 a montré une production d'acide glycolique à partir de D-glucose (0,29 g/L), D-xylose (0,41 g/L) et L-arabinose (0,07 g/L). La production d'acide glycolique avec le système d'expression inductible n°9 soit GA09 est moins importante sur D-glucose (0,1 g/L), Dxylose (0,05 g/L) et L-arabinose (0,03 g/L) (Figure 9). Le système d'expression comportant des promoteurs constitutifs est favorable. Le rendement de la souche GA23 en acide glycolique est de 0,09 g/g (0,21 mol/mol) à partir glucose, 0,18 g/g (0,36 mol/mol) à partir de xylose et 0,16 g/g (0,32 mol/mol) à partir d'arabinose.

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Claims

REVENDICATIONS

1) Micro-organisme recombinant qui présente

i) une activité de conversion du D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose5-phosphate, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;

ii) une activité de clivage aldolique du D-arabinose-5-phosphate en Dglyceraldéhyde-3-phosphate et glycolaldéhyde, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;

iii) une activité d'oxydation du glycolaldéhyde en glycolate, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié ; et iv) une activité d'oxydation du glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3bisphosphoglycérate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.
2) Micro-organisme recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit micro-organisme présente une surexpression du gène kdsD de E. coli ou d'un homologue de celui-ci.
3) Micro-organisme recombinant selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit micro-organisme présente une surexpression du gène fsa de E. coli ou d'un homologue de celui-ci.
4) Micro-organisme recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit micro-organisme présente une surexpression du gène aldA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci.
5) Micro-organisme recombinant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit micro-organisme comprend :

a) un premier plasmide dans lequel se trouvent la séquence du gène kdsD de E. coli ou d'un homologue de celui-ci et la séquence, du gène fsa de E. coli ou d'un homologue de celui-ci, lesdites séquences étant clonées en opéron et sous le contrôle d un premier promoteur inductible ou constitutif et

β) un second plasmide dans lequel se trouve la séquence du gène aldA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci sous le contrôle d'un second promoteur inductible ou constitutif, lesdits premier et second promoteurs étant identiques ou différents.
6) Micro-organisme recombinant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'expression du gène gapA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est diminuée mais non inactivée par rapport au microorganisme non modifié.
7) Micro-organisme recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'expression du gène gapA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est inactivée par rapport au micro-organisme non modifié.
8) Micro-organisme recombinant selon I une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le système phosphotransférase (PTS), qui dépend du phosphoénolpyruvate (PEP) est inactivé, alors qu'une activité de transporteur de glucose codée par galP de E. coli ou glf de Zimomonas mobilis ou un de leurs homologues et une activité de transformation du glucose en glucose-6-phosphase sont augmentées par comparaison au même micro-organisme non modifié.
9) Micro-organisme recombinant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit micro-organisme présente au moins une des caractéristiques suivantes ;

v) une activité d'oxydation du glycolate en glyoxylate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;

vi) une répression des gènes impliqués dans la régulation du métabolisme respiratoire aérobie, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifie ;

vii) une internalisation du glycolate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;

viii) une activité de formation irréversible de méthylglyoxal à partir de dihydroxyacétone, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;

ix) une activité de conversion du fructose-6-phosphate en fructose-1,6biphosphate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;

x) une activité de production du D-ribose-l-phosphate à partir de dihydroxyacétone phosphate et de glycolaldéhyde, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ; et xi) une activité d'oxydation du D-glucose-6-phosphate en 6-phospho Dglucono-l,5-lactone, modifiée par comparaison au même micro-organisme non modifié.
10) Micro-organisme recombinant selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite activité de production du 6-phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de Dglucose-6-phosphate est diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.
11) Micro-organisme recombinant selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit micro-organisme recombinant présente les caractéristiques suivantes :

xi) une activité d'oxydation du D-glucose-6-phosphate en 6-phospho Dglucono-l,5-lactone, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;

xii) une activité de formation de 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6phosphate à partir de D-gluconate-6-phosphate, diminuée par comparaison au même microorganisme non modifié ; et xiii) une activité de formation de glycéraldéhyde-3-phosphate et de pyruvate à partir 2 dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate, diminuée par comparaison au même organisme non modifié.
12) Procédé de production d'acide glycolique comprenant les étapes consistant à :

a) mettre en culture un micro-organisme recombinant tel que défini dans l'une quelconque des revendications précédentes dans un milieu de culture comprenant,

5 comme source de carbone, au moins un pentose et/ou au moins un hexose et

b) récupérer l'acide glycolique à partir du micro-organisme et/ou dans le milieu de culture.
13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit micro-

10 organisme recombinant mis en culture est un micro-organisme recombinant tel que défini à la revendication 6 et en ce que la source de carbone mise en œuvre ne comprend qu'un élément choisi parmi du D-glucose, du D-xylose, du L-arabinose et un de leurs mélanges.
14) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit micro-
15 organisme recombinant mis en culture est un micro-organisme recombinant tel que défini à la revendication 7 et en ce que la source de carbone comprend, en plus du D-xylose et/ou du L-arabinose, du D-glucose et un ou plusieurs composés en C2, C3 et C4 choisis parmi le malate, le pyruvate, le succinate, l'acétate et un de leurs mélanges.