EP3799600A1 - Micro-organismes et procédé pour la production d'acide glycolique à partir de pentoses et d'hexoses - Google Patents

Micro-organismes et procédé pour la production d'acide glycolique à partir de pentoses et d'hexoses

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EP3799600A1
EP3799600A1 EP19756423.0A EP19756423A EP3799600A1 EP 3799600 A1 EP3799600 A1 EP 3799600A1 EP 19756423 A EP19756423 A EP 19756423A EP 3799600 A1 EP3799600 A1 EP 3799600A1
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EP
European Patent Office
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phosphate
microorganism
gene
activity
coli
Prior art date
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Pending
Application number
EP19756423.0A
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German (de)
English (en)
Inventor
Cléa LACHAUX
Thomas Walther
Jean-Marie Francois
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
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Filing date
Publication date
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
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    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01012—Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (phosphorylating) (1.2.1.12)
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    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01021—Glycolaldehyde dehydrogenase (1.2.1.21)
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    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/02—Aldehyde-lyases (4.1.2)
    • C12Y401/02013—Fructose-bisphosphate aldolase (4.1.2.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
    • C12Y503/01013—Arabinose-5-phosphate isomerase (5.3.1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars

Definitions

  • the present invention belongs to the technical field of bioconversion of a carbon source into at least one metabolite of interest and in particular of glycolic acid.
  • the present invention relates to a microorganism whose central carbon metabolism has been modified so as to convert the hexoses and pentoses, originating from a carbon source and, in particular, from plant biomass into glycolic acid.
  • the present invention also relates to a process for producing glycolic acid from hexoses and pentoses contained in plant biomass using such a microorganism.
  • Glycolic acid also makes it possible to produce polymers such as thermoplastic resins comprising poly (glycolic acid). Such polymers exhibit remarkable gas barrier properties and have the ability to hydrolyze in aqueous environments in a gradual and controllable manner, making these polymers good candidates for packaging materials or absorbable materials useful in the biomedical field. .
  • glycolic acid can be obtained from extract of sugar cane, beetroot or grape, its production on an industrial scale comes from the chemical synthesis.
  • Several of these syntheses use formaldehyde, which is an irritant and carcinogenic compound, as a starting reagent, which excludes all traces of this substance in preparations benefiting from Marketing Authorization.
  • poly (glycolic acid) and polymers containing poly (glycolic acid) could represent a new generation of packaging bio-plastics and bio-absorbable polymers [1] ⁇
  • poly (glycolic acid) and polymers containing poly (glycolic acid) could represent a new generation of packaging bio-plastics and bio-absorbable polymers [1] ⁇
  • Glycolic acid can be naturally produced in small amounts via the reduction of glyoxylate in bacteria and molds, including yeast [2].
  • the first engineering projects were inspired by natural metabolism.
  • the maximum theoretical yield that can be achieved by this natural route is 2 moles of glycolic acid (AG) per mole of hexose and 1.66 mole per mole of pentoses (or 0.84 g AG / g sugar).
  • Y E maximum energy efficiency
  • the yield of the pathway depends on the pathway or metabolic network and is calculated from the stoichiometry of the pathway considered.
  • Y p is equal to 2 and we find that Y E equals Y p .
  • This equality is not found in all cases.
  • the conversion of glucose to acetate results in a yield Y p of 2 but the maximum energy yield Y E is 3.
  • the team of Liao et al showed that it was possible to build viable metabolic pathways leading to the production of 3 moles of acetate per mole of glucose [10].
  • the inventors set themselves the goal of to propose a microorganism and a process making it possible to produce, in a simple, industrializable manner from plant biomass and in particular from the hexoses and pentoses contained in the latter, glycolic acid with improved yields compared to the processes of l prior art.
  • Table 1 presents the theoretical yields of the routes of the prior art for the production of glycolic acid (mol / mol) according to the carbon source used.
  • the present invention makes it possible to solve the technical problems of the methods of the prior art as defined above and to achieve the goal which the inventors have set themselves.
  • D-arabinose-5-phosphate isomerase an enzyme of the lipopolysaccharide synthesis pathway which converts D-ribulose-5-phosphate into D-arabinose-5-phosphate [11];
  • fructose-6-phosphate aldolase (FSA) which catalyzes the cleavage of D-arabinose-5-phosphate into D-glyceraldehyde-3-phosphate and glycolaldehyde; note that this enzyme was initially identified as catalyzing the aldolytic cleavage of fructose-6-phosphate into dihydroxyacetone and glyceraldehyde-3-phosphate, but showed aldolytic activity on D-arabinose-5-phosphate with an affinity 10 times more higher than for fructose-6-phosphate [12] and iii) aldehyde dehydrogenase (AldA) which oxidizes glycolaldehyde to glycolate [13].
  • FSA fructose-6-phosphate aldolase
  • the first substrate of this new path namely D-ribulose-5-phosphate
  • PP pentose phosphates
  • the activity of the FSA on D-arabinose-5-phosphate generates 3P (C3) glyceraldehyde which is taken up by oxidative glycolysis.
  • C3 3P
  • this molecule C3 can give glycolaldehyde but with loss of C0 2 at the level of the reaction catalyzed by pyruvate dehydrogenase.
  • the inventors have modified the central carbon metabolism in order to optimize the conservation of carbon by recovering this C3 in the PP path and this, by attenuating and even by inactivating the gapA gene encoding glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase.
  • glyceraldehyde-3-phosphate enters the PP pathway and participates in the synthesis of D-xylulose-5-phosphate, precursor of D-ribulose-5-phosphate.
  • the maximum theoretical yield is then 2.5 moles of glycolic acid per mole of pentose.
  • the present invention makes it possible to carry out the synthesis of glycolic acid from hexoses and pentoses by a single unnatural path, which makes it possible to make the best use of renewable carbon.
  • this approach removes the stoichiometric constraint imposed by the metabolism of f. coli.
  • the calculations on the theoretical yields of the unnatural way of assimilation of pentoses and hexoses described in the present invention, for the production of glycolic acid make it possible to foresee a significant improvement of the yields compared to the biosynthesis processes. based on the optimization of natural and / or semi-synthetic routes of the prior art.
  • the present invention relates to a recombinant microorganism which has
  • micro-organism any organism which exists in the form of a microscopic cell belonging both to the field of prokaryotes and to that of eukaryotes. Therefore, the term “microorganism” includes prokaryotic microalgae, bacteria, archaea and eubacteria of all species as well as eukaryotic microorganisms such as plant cells, eukaryotic microalgae, yeasts and mushrooms. The term also includes cell cultures of any species that can be grown for the production of glycolic acid.
  • bacteria which can be used in the context of the present invention, mention may be made of bacteria of the families Burkholderiaceae, Enterobacteriaceae, Brevibacteriaceae, Clostridiaceae, Bacillaceae, Moraxellaceae, Sphingomonadaceae, Lactobacillaceae, Streptomycetaceae, Streptococcaceae, Methylobeaceae.
  • bacteria which can be used in the context of the present invention, mention may be made of Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Zymomonas mobilis, Ralstonia eutropha, Clostridium acetobutylicum and Lactococcus lactis.
  • fungi which can be used in the context of the present invention, mention may be made of fungi of the genera Penicillium, Aspergillus, Chrysosporium and Trichoderma.
  • mushrooms which can be used in the context of the present invention, mention may be made of Penicillium notatum, Penicillium chrysogenum, Aspergillus niger, Chrysosporium pannorum and Trichoderma reesei.
  • the microorganism used in the context of the present invention is a bacterium of the E. coli type or a yeast of the Saccharomyces cerevisiae type.
  • recombinant microorganism is meant a microorganism as defined above which is not found in nature and which is genetically different from its equivalent in nature.
  • the terms “equivalent in nature”, “unmodified microorganism”, “natural microorganism” and “wild type microorganism” are equivalent and can be used interchangeably.
  • the recombinant microorganism is modified by introduction, deletion and / or modification of genetic elements.
  • the recombinant microorganism usable in the present invention can be modified to modulate the level of expression of an endogenous gene.
  • endogenous gene is meant a gene which was present in the microorganism before any genetic modification of the wild type microorganism.
  • Endogenous genes can be overexpressed by introducing additional heterologous sequences or by replacing endogenous regulatory elements, or by introducing one or more additional copies of the gene into a chromosome or onto one or more plasmids. Endogenous genes can also be modified to modulate their expression and / or activity. For example, mutations can be introduced into the coding sequence to modify the gene product or heterologous sequences can be introduced in addition or to replace endogenous regulatory elements. Modulation of an endogenous gene may result in upregulation and / or an increase in the activity of the endogenous gene product or, alternatively, downregulate and / or decrease the activity of the endogenous gene product.
  • Another way to modulate the expression of an endogenous gene is to exchange the endogenous promoter of the latter as the wild type promoter, with a stronger or weaker promoter to regulate the expression up or down. of the endogenous gene.
  • These promoters can be homologous or heterologous.
  • the recombinant microorganism usable in the present invention can also be modified to express an exogenous gene.
  • the recombinant microorganism usable in the present invention can be modified to express exogenous genes if these genes are introduced with all the elements allowing their expression in this microorganism.
  • Those skilled in the art know different methods of modifying, transforming or transfecting a microorganism with an exogenous gene.
  • this method can be a conjugation; electroporation; lipofection; micro injection; bombardment with particles (or biolistics); a biological transformation of a plant using Agrobacterium tumefasciens; transformation by chemical permeabilization; a transformation by the DEAE-dextran method or an introduction via a virus, a virion or a viral particle.
  • exogenous gene means a gene which has been introduced into a microorganism, by means well known to those skilled in the art while this gene is not found naturally in the microorganism.
  • Exogenous genes can be integrated into one or the chromosome of the microorganism or be expressed in an extra-chromosomal manner by means of plasmids, vectors, cosmids, bacteriophages or viruses such as a baculovirus.
  • An exogenous gene can be a homologous gene.
  • homologous gene is meant a gene homologous to a gene coding for a reference protein and which codes for a protein homologous to this reference protein.
  • protein homologous to a reference protein is meant a protein having a similar function and / or a similar structure as the reference protein. Thus, when the reference protein is an enzyme, a protein homologous to this reference protein catalyzes the same enzymatic reaction.
  • a homolog of a gene A can also be a gene encoding a variant of the protein encoded by the gene A. This homolog can be obtained synthetically.
  • a protein (or a gene) homologous to a reference protein (or a reference gene) has at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% and / or at least 99% identity respectively with the amino acid sequence of the reference protein (or the nucleotide sequence of the reference gene).
  • percentage of identity between two amino acid sequences (or between two nucleotide sequences) is meant, in the context of the present invention, a percentage of identical amino acid (or nucleotide) residues between the two compared sequences, this percentage being obtained after implementation of the best alignment (optimum alignment) between the two sequences.
  • Those skilled in the art know different techniques for obtaining such a percentage of identity and involving homology algorithms or computer programs such as the BLAST program.
  • the recombinant microorganism according to the invention has one or more increased enzymatic activity (s) compared to the same unmodified microorganism and at least one reduced enzymatic activity compared to the same unmodified microorganism.
  • the intracellular activity of certain enzymes is increased compared to the same microorganism unmodified and the intracellular activity of at least one other enzyme is decreased compared to the same unmodified microorganism.
  • the term "activity" of an enzyme is used interchangeably with the term “function” and denotes the reaction which is catalyzed by the enzyme.
  • Those skilled in the art know different techniques for measuring the enzymatic activity of a given enzyme.
  • the experimental part below presents various enzymatic tests which can be used to measure the activity of enzymes involved in the present invention.
  • the expression “increased activity” applied to an enzyme denotes a specific catalytic activity of the increased enzyme and / or an increased quantity or availability of the enzyme in the cell.
  • an increased enzymatic activity in the recombinant microorganism must be understood as an enzymatic activity which is increased by a factor of at least 2, in particular at least 5, in particular, at least 10 and, more particularly, at least 20 relative to the enzymatic activity of the same unmodified microorganism.
  • an increase in the enzymatic activity can be obtained (i a ) by increasing the number of copies of the gene coding for the enzyme in the microorganism, (ii a ) by increasing the expression of the gene coding for the enzyme in the microorganism, for example, by modifying the promoter, the regulatory regions and / or the ribosome binding site, (iii a ) by modifying the sequence of the gene encoding the enzyme so as to obtain a more active form or more resistant to inhibition and, optionally, (iv a ) by combining at least two of the alternatives (i a ), (ii a ) and (iii a ).
  • the gene can be coded chromosomally or extrachromosomally.
  • the gene When the gene is located on the chromosome, several copies of the gene can be introduced onto the chromosome by recombination methods, known to those skilled in the art (including via gene replacement).
  • the gene When the gene is located extra-chromosomally, it can be carried by a recombinant expression vector.
  • recombinant expression vector is meant a nucleic acid suitable for the expression, in a microorganism, of at least one enzyme encoded by a nucleotide sequence contained in this vector.
  • the expression vector according to the present invention comprises, in addition to the nucleotide sequence coding for an enzyme of interest, one (or more) element (s) which allow (s) expression ie transcription and translation of this sequence nucleotide.
  • the expression vector used in the present invention is advantageously chosen from a plasmid, a cosmid, a bacteriophage and a virus such as a baculovirus.
  • the vector of the invention is a vector with autonomous replication comprising elements allowing its maintenance and its replication in the microorganism as an origin of replication.
  • the vector may include elements allowing its selection in the microorganism. These elements are also known as "selection markers".
  • selection markers are well known to those skilled in the art and widely described in the literature.
  • An expression vector can also present one or more element (s) chosen from a promoter, an amplifier also known by the English term of “enhancer”, a 3 ′ UTR signal (for “UnTranslated Region”), an IRES signal (for “Internai Ribosome Entry Site”), a ribosome binding site (in English RBS, for “Ribosome Binding Site”), a transcription termination signal comprising a cleavage site and a polyA signal (for "Polyadenylation signal”).
  • the expression vector according to the invention can comprise 2, 3 or 4 elements listed above. A person skilled in the art is able to choose, from this list, the additional element (s) that the expression vector may include as a function of the microorganism in which the expression must be carried out.
  • selection marker is meant a marker chosen from a selection marker usable in prokaryotes or in eukaryotes such as a gene bacterial antibiotic resistance and a metabolism gene for use with an auxotrophic microorganism ie a selection gene which provides complementation with the respective gene deleted at the genome of the host microorganism.
  • the expression vector according to the present invention may contain a bacterial gene for resistance to an antibiotic such as amoxicillin, ampicillin, phleomycin, kanamycin, chloramphenicol, neomycin, hygromycin, or geneticin (or G418), carboxin, nursesothricin or triclosan.
  • genes for metabolism mention may be made of the trpl gene to be used with a microorganism devoid of the enzyme phosphoribosylanthranilate isomerase such as a trpl yeast or the URA3 gene to be used with a eukaryotic organism devoid of l orotidine 5-phosphate decarboxylase enzyme such as ura3 yeast.
  • promoter is meant, in the context of the present invention, both a promoter, constitutive or inducible, suitable for any microorganism as defined above as a promoter, constitutive or inducible, specific for a group of particular microorganisms.
  • the promoter which can be used can be homologous or heterologous.
  • a constitutive promoter which can be used in the context of the present invention is in particular chosen from the proD promoter, the proC promoter, the 35S promoter, the 19S promoter and the TEV promoter (for “Tobacco Etch Virus”).
  • An inducible promoter which can be used in the context of the present invention may be the galactose inducible GAL1 promoter, the methanol inducible promoter AOX1, the isopropyl bDl-thiogalactopyranoside (IPTG) inducible promoter PAllac0-l, the hybrid promoter pTac inducible by IPTG; the MET15 promoter inducible by methionine depletion or the CUP1 promoter inducible by copper ions.
  • the promoter can be associated with one or more transcriptional regulatory sequences which are the enhancers.
  • the expression vector used in the present invention comprises, operatively linked to each other, a promoter, a nucleotide sequence coding for an enzyme of interest and a transcription termination signal comprising a cleavage site and / or a polyA signal.
  • operatively linked to one another means elements linked to one another so that the operation of one of the elements is affected by that of another.
  • a promoter is operably linked to a coding sequence when it is able to affect the expression of the latter.
  • the regulatory elements for the transcription, translation and maturation of the peptides that the vector can understand are known to those skilled in the art and the latter is capable of choosing them as a function of the host microorganism in which the expression or the cloning must be performed.
  • plasmids which differ by their origin of replication and therefore by their number of copies in the cell.
  • these plasmids are present in the microorganism in 10 to 15 copies, or in approximately 30 to 50 copies, or even up to 100 copies, depending on the nature of the plasmid: plasmids with low number of copies with close replication, plasmids with number using copies or plasmids with a large number of copies.
  • plasmids which can be used in the context of the present invention, mention may be made of the plasmids pSC101, RK2, pACYC, pRSFIO10, pZ and pSK bluescript II.
  • the alternative (ii a ) above consists in using a promoter inducing a high level of expression of the endogenous gene.
  • a promoter inducing a high level of expression of the endogenous gene.
  • the alternative (ii a ) may be to attenuate the activity or expression of a transcription repressor, specific or non-specific for the endogenous gene.
  • the expression “reduced activity” or “reduced activity” applied to an enzyme designates a specific catalytic activity of the reduced enzyme and / or a reduced quantity or availability of the enzyme in the cell.
  • a reduced enzymatic activity in the recombinant microorganism must be understood as an enzymatic activity which is reduced by a factor of at most 0.5, in particular at most 0.1, in in particular, at most 0.01 and, more particularly, at most 0.001 with respect to the enzymatic activity of the same unmodified microorganism.
  • Those skilled in the art know different techniques of microbiology and molecular biology which can be used to obtain, in a given microorganism, the reduction of an enzymatic activity.
  • a decrease in the enzymatic activity can be obtained (i d ) by decreasing the expression of the gene encoding the enzyme in the microorganism, for example, by modifying the promoter, the regulatory regions and / or the site for fixing the ribosome, (ii d ) by modifying the sequence of the gene encoding the enzyme so as to obtain a reduced expression of the gene and / or the expression of an enzyme whose activity is reduced, (iii d ) using destabilizing elements the mRNA obtained following the transcription of the gene and, optionally, (iv d ) by inactivating the gene in particular by total or partial deletion of said gene, by total or partial deletion of the promoter preventing any expression of the gene and / or by inserting an external gene element into the coding region of the gene or into the promoter region.
  • the recombinant microorganism according to the invention exhibits an activity for converting D-ribulose-5-phosphate into D-arabinose-5-phosphate, increased by comparison with the same unmodified microorganism.
  • the intracellular activity of the enzyme which converts D-ribulose-5-phosphate to D-arabinose-5-phosphate in the recombinant microorganism is increased compared to the same unmodified microorganism.
  • the enzyme (E,) which converts D-ribulose-5-phosphate into D-arabinose-5-phosphate is in the form of a D-arabinose-5-phosphate isomerase (EC 5.3.1.13).
  • D-arabinose-5-phosphate aldose-ketose-isomerase is also known as "D-arabinose-5-phosphate aldose-ketose-isomerase”, “arabinose phosphate isomerase”, “D-arabinose-5-phosphate ketol-isomerase” and "phosphoarabinoisomerase”. All these designations refer to the same enzyme and can be used interchangeably.
  • the recombinant microorganism according to the invention has an activity of converting D-ribulose-5-phosphate into D-arabinose-5-phosphate catalyzed by an enzyme consisting of a D-arabinose-5-phosphate isomerase which converts the D-ribulose-5-phosphate to D-arabinose-5-phosphate, increased compared to the same unmodified microorganism.
  • the enzyme (E,) is encoded by the kdsD gene of E. coli or by a homolog of such a gene.
  • a homolog of the E. coli kdsD gene encodes a protein capable of converting D-ribulose-5-phosphate to D-arabinose-5-phosphate.
  • E. coli kdsD gene encodes a protein capable of converting D-ribulose-5-phosphate to D-arabinose-5-phosphate.
  • coli kdsD gene mention may be made of the gene of the strain K12 MG1655, the coding sequence of which is between nucleotides 2829813 and 2830778 in the sequence NC_000913.3 accessible on the NCBI website (for "National Center for Biotechnology Information") https: //www.ncbi, nim.nib.gov/ and corresponding to the complete genome of the strain K12 MG1655.
  • the 321 amino acid protein sequence encoded by this gene is referenced on the NCBI website, sequence NP_417188.4 and corresponds to the sequence SEQ. ID NO: 1 in the attached sequence listing.
  • the increase in the activity of conversion of D-ribulose-5-phosphate to D-arabinose-5-phosphate catalyzed by an enzyme consisting of D-arabinose-5 -phosphate isomerase is obtained by increasing the number of copies of a gene encoding this enzyme in the microorganism and / or by increasing the expression of a gene encoding this enzyme in the microorganism.
  • the recombinant microorganism which is the subject of the present invention exhibits an overexpression of a gene encoding a D-arabinose-5-phosphate isomerase which converts D-ribulose-5-phosphate to D-arabinose-5-phosphate.
  • the recombinant microorganism which is the subject of the present invention exhibits an overexpression of the kdsD gene of E. coli or of a homolog thereof.
  • the recombinant microorganism according to the invention exhibits an aldolic cleavage activity of D-arabinose-5-phosphate into D-glyceraldehyde-3-phosphate and glycolaldehyde, increased by comparison with the same unmodified microorganism.
  • the intracellular activity of the enzyme which catalyzes the cleavage of D-arabinose-5-phosphate into D-glyceraldehyde-3-phosphate and glycolaldehyde in the recombinant microorganism is increased compared to the same micro- unmodified organism.
  • the enzyme (E n ) which catalyzes the cleavage of D-arabinose-5-phosphate into D- glyceraldehyde-3-phosphate and glycolaldehyde is in the form of a fructose-6-phosphate aldolase (EC 4.1.2.-) [14].
  • the recombinant microorganism according to the invention exhibits an aldolic cleavage activity from D-arabinose-5-phosphate to D-glyceraldehyde-3-phosphate and glycolaldehyde catalyzed by an enzyme consisting of a fructose-6-phosphate aldolase which catalyzes the cleavage of D-arabinose-5-phosphate into D-glyceraldehyde-3-phosphate and glycolaldehyde, increased compared to the same unmodified microorganism.
  • the enzyme (En) is encoded by the E. coli gene / sa or by a homolog of such a gene.
  • an E. coli gene / sa homolog encodes a protein capable of catalyzing the cleavage of D-arabinose-5-phosphate into D-glyceraldehyde-3-phosphate and glycolaldehyde .
  • the E. coli gene / sa there may be mentioned:
  • FSAA 220 amino acid protein
  • FSAB 220 amino acid protein
  • homologs of an E. coli gene / sa mention may be made of the genes encoding the fructose-6-phosphate aldolases variants FSAA L107Y / A129G and FSAA A129T / A165G described by Szekrenyi et al, 2014 [15].
  • the increase in the aldolic cleavage activity of D-arabinose-5-phosphate into D-glyceraldehyde-3-phosphate and glycolaldehyde catalyzed by an enzyme consisting of a fructose- 6-phosphate aldolase is obtained by increasing the number of copies of a gene encoding this enzyme in the microorganism and / or by increasing the expression of a gene encoding this enzyme in the microorganism.
  • the recombinant microorganism which is the subject of the present invention exhibits an overexpression of a gene encoding a fructose-6-phosphate aldolase which catalyzes the cleavage of D-arabinose-5-phosphate into D-glyceraldehyde-3-phosphate and glycolaldehyde .
  • the recombinant microorganism which is the subject of the present invention exhibits overexpression of the gene / sa of E. coli or of a homolog thereof.
  • the recombinant microorganism according to the invention exhibits an activity for oxidizing glycolaldehyde to glycolate, increased by comparison with the same unmodified microorganism.
  • the intracellular activity of the enzyme that oxidizes the glycolaldehyde to glycolate in the recombinant microorganism is increased compared to the same unmodified microorganism.
  • the enzyme (EM,) which oxidizes glycolaldehyde to glycolate is in the form of a glycolaldehyde dehydrogenase and in particular a glycoaldehyde dehydrogenase whose activity requires the presence of the cofactor NAD + (EC 1.2.1.21).
  • the recombinant microorganism according to the invention exhibits an activity of oxidation of glycolaldehyde to glycolate catalyzed by an enzyme consisting of a glycolaldehyde dehydrogenase which oxidizes glycolaldehyde to glycolate, increased compared to the same unmodified microorganism.
  • the enzyme (EM,) is encoded by the aldA gene of E. coli or by a homolog of such a gene.
  • a homolog of the E. coli aldA gene codes for a protein capable of oxidizing glycolaldehyde to glycolate in the presence of a cofactor such as, for example, NAD + .
  • a cofactor such as, for example, NAD + .
  • an E. coli aldA gene mention may be made of the gene of the strain K12 MG1655, the coding sequence of which is between nucleotides 1488232 and 1489671 in the sequence NC_000913.3 accessible on the NCBI website.
  • the sequence of the protein of 479 amino acids, encoded by this gene is referenced, on the NCBI website, sequence NP_415933.1 and corresponds to the sequence SEQ. ID NO: 4 in the attached sequence listing.
  • the increase in the oxidation activity of glycolaldehyde to glycolate catalyzed by an enzyme consisting of glycolaldehyde dehydrogenase is obtained by increasing the number of copies of a gene encoding this enzyme in the microorganism and / or by increasing the expression of a gene encoding this enzyme in the microorganism.
  • the recombinant microorganism which is the subject of the present invention exhibits an overexpression of a gene encoding a glycolaldehyde dehydrogenase which oxidizes the glycolaldehyde to glycolate. More particularly, the recombinant microorganism which is the subject of the present invention exhibits overexpression of the aldA gene of E. coli or of a homolog thereof.
  • the recombinant microorganism according to the present invention comprises:
  • plasmids of identical nature but having compatible origins of replication or of different nature, one having two sequences, optionally cloned as an operon, chosen from the sequence of the E. coli kdsD gene or of a homolog of this, the sequence of the E. coli fsa gene or a homolog thereof and the sequence of the E. coli aldA gene or a homolog thereof and the other plasmid the third of these sequences.
  • plasmids identical or different, each having a different sequence chosen from the sequence of the kdsD gene of E. coli or of a homolog thereof, the sequence of the gene / sa of E. coli or a homolog thereof and the sequence of the aldA gene from E. coli or a homolog thereof.
  • the recombinant microorganism which is the subject of the invention comprises:
  • said first and second promoters being identical or different.
  • the recombinant microorganism according to the invention exhibits an oxidation activity of glyceraldehyde-3-phosphate to 1,3-bisphosphoglycerate, reduced by comparison with the same unmodified microorganism.
  • the intracellular activity of the enzyme which oxidizes glyceraldehyde-3-phosphate to 1,3-bisphosphoglycerate in the recombinant microorganism is decreased compared to the same unmodified microorganism.
  • the enzyme (Ej V ) which oxidizes glyceraldehyde-3-phosphate to 1,3-bisphosphoglycerate is in the form of a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and in particular of a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase whose cofactor is NAD + (EC 1.2.1.12).
  • Such an enzyme is also known as "D-glyceraldehyde-3-phosphate: NAD + oxidoreductase".
  • the recombinant microorganism according to the invention has an activity of oxidizing glyceraldehyde-3-phosphate to 1,3-bisphosphoglycerate catalyzed by an enzyme consisting of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase which oxidizes glyceraldehyde-3-phosphate to 1,3-bisphosphoglycerate, decreased compared to the same unmodified microorganism.
  • the enzyme (E, n ) is encoded by the gapA gene from E. coli or by a homolog of such a gene.
  • a homolog of the E. coli gapA gene encodes a protein capable of oxidizing glyceraldehyde-3-phosphate to 1,3-bisphosphoglycerate in the presence of a cofactor such as, for example, NAD + .
  • a cofactor such as, for example, NAD + .
  • a gapA gene from E. coli mention may be made of the gene of the strain K12 MG1655, the coding sequence of which is between nucleotides 1862771 and 1863766 in the sequence NC_000913.3 accessible on the NCBI website.
  • the protein amino acid sequence of 331 encoded by this gene is referenced, on the NCBI website, sequence NP_416293.1 and corresponds to the sequence SEQ. ID NO: 5 in the attached sequence listing.
  • the reduction in the oxidation activity of glyceraldehyde-3-phosphate to 1,3-bisphosphoglycerate catalyzed by an enzyme consisting of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is obtained by decreasing the expression of the gene encoding this enzyme and / or by inactivating the gene encoding this enzyme.
  • the expression of the gapA gene of E. coli or of a homolog thereof is reduced but not inactivated with respect to the micro- unmodified organism.
  • the attenuation of the gapA activity allows growth and, at the same time, the production of glycolic acid.
  • maintaining a residual glycolysis does not make it possible to reach the maximum yield.
  • the expression of the gapA gene of E. coli or of a homolog thereof is inactivated relative to the unmodified microorganism .
  • the growth and production of glycolic acid are decoupled.
  • Inactivation of gapA requires that the recombinant microorganism according to the invention has a growth substrate, containing, in addition to pentoses and / or hexoses, C2, C3 or C4 compounds such as acetate, pyruvate, malate or succinate or which enter into metabolism after glyceraldehyde-3-phosphate (GAP).
  • GAP glyceraldehyde-3-phosphate
  • the recombinant microorganism according to the present invention is modified at the level of glucose transport in the sense that the phosphotransferase system (PTS), which depends on phosphoenolpyruvate (PEP) is inactivated, while a glucose transport activity coded by galP of E. coli or g If of Zymomonas mobilis or one of their counterparts and an activity for converting glucose into glucose- 6-phosphase are increased compared to the same unmodified microorganism.
  • PTS phosphotransferase system
  • PEP phosphoenolpyruvate
  • the phosphotransferase system which depends on phosphoenolpyruvate (PEP) is the most efficient system for transporting glucose.
  • PTS phosphotransferase system
  • PEP phosphoenolpyruvate
  • the activity of the PTS system has an effect on the distribution of carbon flux and plays a key role in the suppression of carbon catabolism.
  • the cytoplasmic PTS system is coded by the operon ptsHIcrr. Deletion of the ptsHIcrr operon, particularly in E. coli, is the most commonly used strategy to inactivate the PTS system.
  • the PTS phenotype is characterized by a very limited capacity for glucose transport and phosphorylation.
  • PEP is not necessary for glucose phosphorylation.
  • Glucokinase catalyzes glucose-dependent phosphorylation-ATP in the cytoplasm.
  • the overexpression of galactose permease (GalP) for glucose transport and glucokinase (Glk) for phosphorylation restores the PTS + phenotype [18].
  • Another strategy is to overexpress the genes gifz m and glkz m respectively coding for an easier transporter of glucose (Gif) and the glucokinase of Zymomonas mobilized in E. coli [19].
  • an activity of transport and phosphorylation of glucose from phosphoenolpyruvate by the phosphoenolpyruvate dependent phosphotransferase system is quenched by comparison with the same unmodified microorganism.
  • inactivation of the cytoplasmic PTS system encoded by the ptsHIcrr operon in E. coli leads to the deletion of genes:
  • E. coli ptsH of the operon ptsHIcrr encoding the phosphohistidine protein Hpr, phosphate carrier, of the PTS system.
  • E. coli ptsH gene there may be mentioned the gene of the strain K12-MG1655, the coding sequence of which is included, on the complementary strand, between nucleotides 2533764 and 2534021 in the sequence NC_000913.3 accessible on the NCBI website.
  • the 85 amino acid protein sequence encoded by this gene is referenced, on the NCBI website, sequence NP_416910.1 and corresponds to the sequence SEQ. ID NO: 6 in the attached sequence listing.
  • E. coli ptsl of the operon ptsHlcrr encoding the enzyme I of the PTS system (EC 2.7.3.9).
  • E. coli ptsl gene mention may be made of the gene of the strain K12-MG1655, the coding sequence of which is included, on the complementary strand, between nucleotides 2534066 and 2535793 in the sequence NC_000913.3 accessible on the NCBI website.
  • the 575 amino acid protein sequence encoded by this gene is referenced, on the NCBI website, sequence NP_416911.1 and corresponds to the sequence SEQ ID NO: 7 in the attached sequence listing.
  • E. coli crr of the operon ptsHlcrr encoding the MA enzyme of complex II of the PTS system (EC 2.7.1.69).
  • E. coli crr gene mention may be made of the gene of the strain K12-MG1655, the coding sequence of which is included, on the complementary strand, between nucleotides 2535834 and 2536343 in the sequence NC_000913.3 accessible on the NCBI website.
  • the sequence of the protein of 169 amino acids encoded by this gene is referenced, on the NCBI website, sequence NP_416912.1 and corresponds to the sequence SEQ. ID NO: 8 in the attached sequence listing.
  • the deletion of the ptsG gene from the PTS system which does not belong to the ptsHlcrr operon, is also required, since PtsG is strongly involved in catabolic repression in E. coli.
  • PtsG mutants are able to consume glucose, arabinose and xylose simultaneously while a wild strain consumes glucose then arabinose and finally xylose sequentially [20].
  • the ptsG gene encodes a large hydrophobic II B / C domain of complex II of the PTS system. As a more specific example of the E.
  • coli ptsG gene mention may be made of the gene of the strain K12-MG1655, the coding sequence of which is included, on the complementary strand, between nucleotides 1157869 and 1159302 in the sequence NC_000913.3 accessible on the NCBI website.
  • the 477 amino acid protein sequence encoded by this gene is referenced, on the NCBI website, sequence NP_415619.1 and corresponds to the sequence SEQ ID NO: 9 in the attached sequence listing.
  • the E. coli galP gene encodes a galactose permease. Based on the definition of “homolog” previously provided, a homolog of the E. coli galP gene codes for a protein of the galactose permease type.
  • the galP gene of E. coli there may be mentioned the gene of the strain K12 MG1655, the coding sequence of which is between nucleotides 3088284 and 3089678 in the sequence NC_000913.3 accessible on the NCBI website.
  • the 464 amino acid protein sequence encoded by this gene is referenced, on the NCBI website, sequence NP_417418.1 and corresponds to the sequence SEQ ID NO: 10 in the attached sequence listing.
  • the Z mobilis glf gene codes for a glucose transporter. Based on the definition of "homolog" previously provided, a homolog of the glf gene from Z. mobilis codes for a glucose transporter. As a particular example of the Z mobilis glf gene, mention may be made of the gene of the ATCC 31821 / ZM4 / CP4 strain which codes for the 473 amino acid protein referenced on the UniProtKB site (http: //www.uniprot. org /), sequence P21906 and corresponding to the sequence SEQ. ID NO: 11 in the attached sequence listing.
  • the recombinant microorganism according to the invention exhibits an activity for converting glucose into glucose-6-phosphase, increased by comparison with the same unmodified microorganism.
  • the intracellular activity of the enzyme which transforms glucose into glucose-6-phosphase in the recombinant microorganism is increased compared to the same unmodified microorganism.
  • the enzyme that turns glucose into glucose-6-phosphase is in the form of a glucokinase (EC 2.7.1.2).
  • the recombinant microorganism according to the invention exhibits an activity for converting glucose into glucose-6-phosphase catalyzed by an enzyme consisting of a glucokinase which transforms glucose into glucose-6-phosphase, increased compared to the same micro- unmodified organism.
  • this enzyme is coded by the glK gene of E. coli or by a homolog of such a gene.
  • a homolog of the E. coli glK gene encodes a protein capable of transforming glucose into glucose-6-phosphase.
  • an E. coli glK gene mention may be made of the gene of strain K12 MG1655, the coding sequence of which is between nucleotides 2508461 and 2509426 in the sequence NC_000913.3 accessible on the NCBI website.
  • the protein sequence of 321 amino acids, encoded by this gene is referenced, on the NCBI website, sequence NP_416889.1 and corresponds to the sequence SEQ. ID NO: 12 in the attached sequence listing.
  • the increase in glucose transport catalyzed by an enzyme consisting of a glucose transporter or a galactose permease is obtained by increasing the number of copies of a gene encoding this enzyme in the microorganism and / or by increasing the expression of a gene encoding this enzyme in the microorganism.
  • the recombinant microorganism which is the subject of the present invention exhibits an overexpression of a gene coding for a glucose transporter and / or an overexpression of a gene coding for a galactose permease which catalyzes the transport of glucose.
  • the increase in the transformation of glucose into glucose-6-phosphate catalyzed by an enzyme consisting of a glucokinase which transforms glucose into glucose-6-phosphase is obtained by increasing the number of copies of a gene encoding this enzyme in the microorganism and / or by increasing the expression of a gene encoding this enzyme in the microorganism.
  • the recombinant microorganism which is the subject of the present invention exhibits an overexpression of a gene encoding a glucokinase which transforms glucose into glucose-6-phosphase.
  • the recombinant microorganism which is the subject of the present invention exhibits an overexpression of the aldA gene of E. coli or of the glf gene of Z. mobilis or one of their counterparts and an overexpression of the glK gene of E. coli or d 'a counterpart of it.
  • the genes above listed are under the dependence of a strong constitutive promoter such as the proD promoter.
  • the microorganism recombinant object of the present invention may have at least one of the following characteristics:
  • the recombinant microorganism according to the invention has an activity of oxidizing glycolate to glyoxylate, reduced by comparison with the same unmodified microorganism.
  • the intracellular activity of the enzyme which oxidizes glycolate to glyoxylate in the recombinant microorganism is decreased compared to the same unmodified microorganism.
  • the enzyme (E v ) which oxidizes glycolate to glyoxylate is in the form of a glycolate dehydrogenase and in particular of a glycolate dehydrogenase whose cofactor is NAD + (EC 1.1.99.14).
  • Such an enzyme is also known as "glycolate oxidoreductase” and “glycolate oxidase”. All these designations refer to the same enzyme and can be used interchangeably.
  • the recombinant microorganism according to the invention exhibits an activity of oxidation of glycolate to glyoxylate catalyzed by an enzyme consisting of a glycolate dehydrogenase which oxidizes glycolate to glyoxylate, decreased compared to the same unmodified microorganism.
  • the glycolate dehydrogenase activity of E. coli is encoded by the glcDEF genes or by a homolog of such genes.
  • a homolog of the E. coli glcD, glcE and glcF genes encodes a protein capable of oxidizing glycolate to glyoxylate in the presence of a cofactor such as, for example, NAD + .
  • E. coli glcD gene As a particular example of an E. coli glcD gene, mention may be made of the gene of the strain K12 MG1655, the coding sequence of which is included, on the complementary strand, between nucleotides 3126522 and 3128021 in the sequence NC_000913.3 accessible from the NCBI website.
  • the 499 amino acid protein sequence encoded by this gene is referenced on the NCBI website, sequence NP_417453.1 and corresponds to the sequence SEQ ID NO: 13 in the attached sequence listing.
  • E. coli glcE gene As a particular example of an E. coli glcE gene, there may be mentioned the gene of the strain K12 MG1655, the coding sequence of which is included, on the complementary strand, between nucleotides 3125470 and 3126522 in the sequence NC_000913.3 accessible from the NCBI website.
  • the sequence of the protein of 350 amino acids, coded by this gene is referenced, on the site of the NCBI, sequence YP_026191.1 and corresponds to the sequence SEQ. ID NO: 14 in the attached sequence listing.
  • E. coli glcF gene As a specific example of an E. coli glcF gene, mention may be made of the gene of strain K12 MG1655, the coding sequence of which is included, on the complementary strand, between nucleotides 3124236 and 3125459 in the sequence NC_000913.3 accessible from the NCBI website.
  • the 407 amino acid protein sequence encoded by this gene is referenced, on the NCBI website, sequence YP_026190.1 and corresponds to the sequence SEQ ID NO: 15 in the attached sequence listing.
  • the decrease in the oxidative activity of the glycolate to glyoxylate catalyzed by an enzyme consisting of a glycolate dehydrogenase is obtained by decreasing the expression of the gene encoding this enzyme and / or by inactivating the gene encoding this enzyme.
  • the expression of the glcD, glcE and glcF genes of E. coli or of homologs thereof is reduced compared to the unmodified microorganism.
  • the E. coli glcD, glcE and glcF genes or the homologs thereof are deleted in the recombinant microorganism object of the present invention in order to allow the accumulation of glycolate [21 ].
  • the recombinant microorganism according to the invention exhibits increased aerobic respiratory activity by comparison with the same unmodified microorganism, this by reducing the repression of the genes involved in the regulation of aerobic respiratory metabolism. This repression does not call on an enzyme but on a transcriptional regulator.
  • the recombinant microorganism according to the invention has a repression of the genes involved in the regulation of aerobic respiratory metabolism induced by a transcriptional regulator capable of repressing the genes involved in the regulation of aerobic respiratory metabolism, reduced compared to the same microorganism not modified.
  • this transcriptional regulator is encoded by the arcA gene from E. coli or by a homolog of such a gene.
  • a homolog of the E. coli arcA gene encodes a protein capable of repressing the genes involved in aerobic respiratory metabolism
  • the arcA gene from E. coli mention may be made of the gene of the strain K12 MG1655, the coding sequence of which is included, on the complementary strand, between nucleotides 4639590 and 4640306 in the sequence NC_000913.3 accessible from the NCBI website.
  • the 238 amino acid protein sequence encoded by this gene is referenced on the NCBI website, sequence NP_418818.1 and corresponds to the sequence SEQ. ID NO: 16 in the attached sequence listing. All the variants previously envisaged for decreasing an enzymatic activity can be used, mutatis mutandis, for decreasing the activity of the transcriptional regulator repressing the genes involved in aerobic respiratory metabolism.
  • the reduction in the repression of the genes involved in the regulation of aerobic respiratory metabolism induced by a transcriptional regulator is obtained by decreasing the expression of the gene coding for this regulator and / or by inactivating the gene encoding this regulator.
  • the expression of the arcA gene of E. coli or of a homolog thereof is reduced compared to the unmodified microorganism.
  • the arcA gene of E. coli or the homolog thereof is deleted in the recombinant microorganism object of the present invention.
  • the recombinant microorganism according to the invention exhibits internalization of the glycolate, reduced by comparison with the same unmodified microorganism. This internalization calls for proteins important glycolate [23, 24, 25]
  • the recombinant microorganism according to the invention exhibits internalization of the glycolate induced by at least one important protein glycolate, reduced compared to the same unmodified microorganism.
  • proteins are encoded by the glcA, HdP or yjcG genes of E. coli or by homologs of such genes. Based on the definition of "homolog" previously provided, homologs of the E. coli gicA, HdP or yjcG genes encode proteins capable of internalizing the glycolate.
  • E. coli glcA gene As a specific example of an E. coli glcA gene, mention may be made of the gene of the strain K12 MG1655, the coding sequence of which is between nucleotides 1157869 and 1159302 in the sequence NC_000913.3 accessible on the NCBI website. The sequence of the protein of 477 amino acids, coded by this gene is referenced, on the site of NCBI, sequence NP_415619.1 and corresponds to the sequence SEQ ID NO: 17 in the attached sequence listing.
  • E. coli lldP gene As a particular example of the E. coli lldP gene, mention may be made of the gene of the strain K12 MG1655, the coding sequence of which is between nucleotides 3777399 and 3779054 in the sequence NC_000913.3 accessible on the NCBI website.
  • the 551 amino acid protein sequence encoded by this gene is referenced on the NCBI website, sequence NP_418060.1 and corresponds to the sequence SEQ. ID NO: 18 in the attached sequence listing.
  • E. coli yjcG gene As a specific example of an E. coli yjcG gene, mention may be made of the gene of strain K12 MG1655, the coding sequence of which is included, on the complementary strand, between nucleotides 4283253 and 4284902 in the sequence NC_000913.3 accessible from the NCBI website.
  • the 549 amino acid protein sequence encoded by this gene is referenced on the NCBI website, sequence NP_418491.1 and corresponds to the sequence SEQ ID NO: 19 in the attached sequence listing.
  • the decrease in the internalization of the glycolate induced by one or more important protein (s) the glycolate is obtained by decreasing the expression of the gene (s) encoding this or these protein (s) and / or by inactivating the gene (s) encoding this or these protein (s).
  • the expression of the glcA, lldP or yjcG genes of E. coli or of homologs thereof is reduced compared to the unmodified microorganism.
  • the gicA, lldP or yjcG genes of E. coli or of homologs thereof are deleted relative to the unmodified microorganism.
  • the recombinant microorganism according to the invention exhibits an irreversible methylglyoxal formation activity from dihydroxyacetone phosphate (DHAP), reduced by comparison with the same unmodified microorganism. In other words, the intracellular activity of the enzyme which forms, irreversibly, methylglyoxal, cytotoxic compound, from DHAP in the recombinant microorganism is decreased compared to the same unmodified microorganism.
  • DHAP dihydroxyacetone phosphate
  • the enzyme (E Vm ) which irreversibly forms methylglyoxal from DHAP is in the form of a methylglyoxal synthase (EC 4.2.3.3) [26].
  • the recombinant microorganism according to the invention has an activity of irreversible formation of methylglyoxal from DHAP catalyzed by an enzyme consisting of methylglyoxal synthase which forms, irreversibly, methylglyoxal from DHAP, decreased compared to same unmodified microorganism.
  • the enzyme (E Vm ) is encoded by the mgsA gene of E. coli or by a homolog of such a gene.
  • a homolog of the mgsA gene from E. coli encodes a protein capable of irreversibly forming methylglyoxal from DHAP.
  • E. coli mgsA gene mention may be made of the gene of strain K12 MG1655, the coding sequence of which is included, on the complementary strand, between nucleotides 1026557 and 1027015 in the sequence NC_000913.3 accessible from the NCBI website.
  • the 152 amino acid protein sequence encoded by this gene is referenced on the NCBI website, sequence NP_415483.2 and corresponds to the sequence SEQ. ID NO: 20 in the attached sequence listing.
  • the reduction in irreversible formation of methylglyoxal from DHAP catalyzed by an enzyme consisting of methylglyoxal synthase is obtained by decreasing the expression of the gene encoding this enzyme and / or by inactivating the gene encoding this enzyme.
  • the expression of the mgsA gene of E. coli or of a homolog thereof is reduced compared to the unmodified microorganism.
  • the mgsA gene of E. coli or the homolog thereof is deleted in the recombinant microorganism object of the present invention.
  • the recombinant microorganism according to the invention exhibits an activity for converting fructose-6-phosphate into fructose-1,6-biphosphate, reduced by comparison with the same unmodified microorganism.
  • the intracellular activity of the enzyme which converts fructose-6-phosphate into fructose-1,6-biphosphate in the recombinant microorganism is decreased compared to the same unmodified microorganism.
  • the enzyme (E, c) that converts fructose-6-phosphate to fructose-1,6-biphosphate is in the form of a phosphofructokinase (EC 2.7.1.11).
  • the recombinant microorganism according to the invention has an activity of converting fructose-6-phosphate into fructose-1,6-biphosphate catalyzed by an enzyme consisting of a phosphofructokinase which converts fructose-6-phosphate into fructose-l , 6-biphosphate, decreased compared to the same unmodified microorganism.
  • the enzyme (E, c ) is encoded by the pfKA gene from E. coli or by a homolog of such a gene.
  • a homolog of the E. coli pfKA gene encodes a protein capable of converting fructose-6-phosphate to fructose-1,6-biphosphate.
  • the E. coli pfKA gene mention may be made of the gene of the strain K12 MG1655, the coding sequence of which is included, on the complementary strand, between nucleotides 4107552 and 4108514 in the sequence NC_000913.3 accessible from the NCBI website.
  • sequence of the protein of 320 amino acids, coded by this gene is referenced, on the site of the NCBI, sequence NP_418351.1 and corresponds to the sequence SEQ. ID NO: 21 in the attached sequence listing. All the variants previously envisaged for decreasing an enzymatic activity can be used to decrease the activity of the enzyme (Ej X ) which converts fructose-6-phosphate into fructose-1,6-biphosphate.
  • the decrease in the activity of converting fructose-6-phosphate into fructose-1,6-biphosphate catalyzed by an enzyme consisting of a phosphofructokinase is obtained by decreasing the expression of the gene encoding this enzyme and / or by inactivating the gene encoding this enzyme.
  • the expression of the pfKA gene of E. coli or of a homolog thereof is reduced compared to the unmodified microorganism.
  • the pfKA gene of E. coli or the homolog thereof is deleted in the recombinant microorganism object of the present invention and this, to avoid a futile cycle with fructose-1, 6 -biphosphate [27].
  • the recombinant microorganism according to the invention has an activity for producing D-ribose-1-phosphate from dihydroxyacetone phosphate and glycolaldehyde, reduced by comparison with the same unmodified microorganism.
  • the intracellular activity of the enzyme which produces D-ribose-1-phosphate from dihydroxyacetone phosphate and glycolaldehyde in the recombinant microorganism is decreased compared to the same unmodified microorganism .
  • the enzyme (E x ) which produces D-ribose-1-phosphate from dihydroxyacetone phosphate and glycolaldehyde is in the form of an L-fuculose-phosphate aldolase (EC 4.1.2.17) [28].
  • the recombinant microorganism according to the invention has an activity for producing D-ribose-1-phosphate from dihydroxyacetone phosphate and glycolaldehyde catalyzed by an enzyme consisting of L-fuculose-phosphate aldolase which produces D- ribose-1-phosphate from dihydroxyacetone phosphate and glycolaldehyde, decreased compared to the same unmodified microorganism.
  • the enzyme (E x ) is encoded by the fucA gene from E. coli or by a homolog of such a gene. Based on the definition of “homolog” previously provided, a homolog of the E.
  • coli fucA gene encodes a protein capable of producing D-ribose-1-phosphate from dihydroxyacetone phosphate and glycolaldehyde.
  • the fucA gene from E. coli mention may be made of the gene of the strain K12 MG1655, the coding sequence of which is included, on the complementary strand, between nucleotides 2933041 and 2933688 in the sequence NC_000913.3 accessible on the NCBI website.
  • the sequence of the protein of 215 amino acids, coded by this gene is referenced, on the NCBI website, sequence NP_417280.1 and corresponds to the sequence SEQ. ID NO: 22 in the attached sequence listing.
  • the decrease in the activity of producing D-ribose-1-phosphate from dihydroxyacetone phosphate and glycolaldehyde catalyzed by an enzyme consisting of an L-fuculose-phosphate aldolase is obtained by decreasing the expression of the gene encoding this enzyme and / or by inactivating the gene encoding this enzyme.
  • the expression of the E. coli fucA gene or of a homolog thereof is reduced compared with the unmodified microorganism.
  • the E. coli fucA gene or the homolog thereof is deleted in the recombinant microorganism object of the present invention.
  • the recombinant microorganism according to the invention has an activity of production of 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone from D-glucose-6-phosphate decreased or increased compared to the same unmodified microorganism .
  • the recombinant microorganism according to the invention exhibits an activity for the production of 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone from D-glucose-6-phosphate decreased by comparison with the same unmodified microorganism.
  • the intracellular activity of the enzyme (E Xi ) which produces 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone from D-glucose-6-phosphate, in the recombinant microorganism is decreased compared to the same unmodified microorganism.
  • the enzyme (E Xj ) which produces 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone from D-glucose-6-phosphate is in the form of a NADP + dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase ( EC 1.1.1.49) [29].
  • the recombinant microorganism according to the invention has an activity of producing 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone from D-glucose-6-phosphate catalyzed by an enzyme consisting of glucose-6 cofactor-dependent phosphate dehydrogenase which produces 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone from D-glucose-6-phosphate, decreased compared to the same unmodified microorganism.
  • the enzyme (E Xi ) is coded by the zwf gene of E. coli or by a homolog thereof.
  • a homolog of the E. coli zwf gene encodes a protein capable of producing 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone from D-glucose- 6-phosphate in the presence of a cofactor such as, for example, NADP + .
  • a cofactor such as, for example, NADP + .
  • the E. coli zwf gene mention may be made of the gene of the strain K12 MG1655, the coding sequence of which is included, on the complementary strand, between nucleotides 1934839 and 1936314 in the sequence NC_000913.3 accessible from the NCBI website.
  • sequence of the protein of 491 amino acids, coded by this gene is referenced, on the site of the NCBI, sequence NP_416366 corresponds to the sequence SEQ. ID NO: 23 in the attached sequence listing.
  • the expression of the E. coli zwf gene or of a homolog thereof is reduced compared to the unmodified microorganism.
  • the E. coli zwf gene or the homolog thereof is deleted in the recombinant microorganism object of the present invention.
  • the recombinant microorganism according to the invention exhibits an activity for the production of 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone from D-glucose-6-phosphate increased by comparison with the same unmodified microorganism.
  • the intracellular activity of the enzyme (E Xi ) which produces 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone from D-glucose-6-phosphate, in the recombinant microorganism is increased compared to the same unmodified microorganism.
  • the recombinant microorganism according to the invention has an activity of producing 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone from D-glucose-6-phosphate catalyzed by an enzyme consisting of glucose-6 cofactor-dependent phosphate dehydrogenase which produces 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone from D-glucose-6-phosphate, increased compared to the same unmodified microorganism.
  • the increase in the activity of producing 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone from D-glucose-6-phosphate catalyzed by an enzyme consisting of glucose-6-phosphate Cofactor-dependent dehydrogenase is obtained by increasing the number of copies of a gene encoding this enzyme in the microorganism and / or by increasing the expression of a gene encoding this enzyme in the microorganism.
  • the recombinant microorganism which is the subject of the present invention exhibits an overexpression of a gene encoding a cofactor-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase which produces 6-phospho-D-glucono-1,5-lactone from D-glucose 6-phosphate.
  • the recombinant microorganism which is the subject of the present invention exhibits an overexpression of the zwf gene of E. coli or of a homolog thereof.
  • the recombinant microorganism which is the subject of the invention has the following characteristics:
  • the recombinant microorganism according to the invention exhibits a 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate formation activity reduced by comparison with D-gluconate-6-phosphate. to the same unmodified microorganism.
  • the intracellular activity of the enzyme which forms 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate from D-gluconate-6-phosphate in the recombinant microorganism is decreased compared to the same unmodified microorganism.
  • the enzyme (E XÜ ) which produces 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate from D-gluconate-6-phosphate is in the form of a phosphogluconate dehydratase (EC 4.2.1.12) [30].
  • the recombinant microorganism according to the invention exhibits a 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate activity from D-gluconate-6-phosphate catalyzed by an enzyme consisting of a phosphogluconate dehydratase which produces 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate from D-gluconate-6-phosphate, decreased compared to the same unmodified microorganism.
  • the enzyme (E XÜ ) is encoded by the edd gene of E. coli or by a homolog thereof.
  • a homolog of the E. coli edd gene encodes a protein capable of producing 2- dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate from D- gluconate-6-phosphate.
  • the edd gene from E. coli mention may be made of the gene of the strain K12 MG1655, the coding sequence of which is included, on the complementary strand, between nucleotides 1932794 and 1934604 in the sequence NC_000913.3 accessible from the NCBI website.
  • the sequence of the protein of 603 amino acids, coded by this gene is referenced, on the site of the NCBI, sequence CAA45221 and corresponds to the sequence SEQ. ID NO: 24 in the attached sequence listing.
  • the reduction in the oxidation activity of glyceraldehyde-3-phosphate to 1,3-bisphosphoglycerate catalyzed by an enzyme consisting of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is obtained by decreasing the expression of the gene encoding this enzyme and / or by inactivating the gene encoding this enzyme.
  • the expression of the edd gene of E. coli or of a homolog thereof is reduced compared to the unmodified microorganism.
  • the edd gene of E. coli or the homolog thereof is deleted in the recombinant microorganism object of the present invention.
  • the recombinant microorganism according to the invention has an activity for producing D-glyceraldehyde-3-phosphate and pyruvate from 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate decreased compared to the same unmodified microorganism.
  • the intracellular activity of the enzyme that produces D-glyceraldehyde-3-phosphate and pyruvate to from 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate, in the recombinant microorganism is decreased compared to the same unmodified microorganism.
  • the enzyme (Exm) which produces D-glyceraldehyde-3-phosphate and pyruvate from 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate is in the form of a 2-dehydroxy-3- deoxy-phosphogluconate aldolase [31].
  • the recombinant microorganism according to the invention exhibits an activity for producing D-glyceraldehyde-3-phosphate and pyruvate from 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate catalyzed by a consistent enzyme into a 2-dehydroxy-3-deoxy-phosphogluconate aldolase which produces D-glyceraldehyde-3-phosphate and pyruvate from 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate, decreased compared to the same micro - unmodified organism.
  • the enzyme (E Xiü ) is encoded by the eda gene of E. coli or by a homolog thereof.
  • a homolog of the E. coli edd gene encodes a protein capable of producing D-glyceraldehyde-3-phosphate and pyruvate from 2-dehydroxy-3-deoxy -D-gluconate- 6-phosphate.
  • an eda gene from E. coli mention may be made of the gene of the strain K12 MG1655, the coding sequence of which is included, on the complementary strand, between nucleotides 1932115 and 1932756 in the sequence NC_000913.3 accessible from the NCBI website.
  • the sequence of the 213 amino acid protein, encoded by this gene is referenced, on the NCBI website, sequence NP_416364.1 and corresponds to the sequence SEQ. ID NO: 25 in the attached sequence listing.
  • the decrease in the activity of producing D-glyceraldehyde-3-phosphate and pyruvate from 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate catalyzed by an enzyme consisting of a 2-dehydroxy-3-deoxy-phosphogluconate aldolase is obtained by decreasing the expression of the gene encoding this enzyme and / or by inactivating the gene encoding this enzyme.
  • the expression of the eda gene of E. coli or of a homolog thereof is reduced compared to the unmodified microorganism.
  • the E. coli eda gene or the homolog thereof is deleted in the recombinant microorganism which is the subject of the present invention.
  • the present invention also relates to the use of a recombinant microorganism as defined above for the production of glycolic acid from a culture medium comprising, as carbon source, at least one pentose and / or at least one hexose.
  • the present invention relates to a process for producing glycolic acid comprising the steps consisting in:
  • the production process which is the subject of the present invention uses steps and devices conventionally used in the field of biofermentation.
  • the microorganism in step (a) of the method according to the present invention, can be cultivated in a culture medium according to the usual techniques used to cultivate this type of microorganism.
  • the culture medium can be a commercial medium or a medium prepared extemporaneously.
  • the culture medium used in the process of the invention is in the form of a sterile liquid containing a carbon source, a nitrogen source, a phosphate source, trace elements and optionally a sulfur source .
  • the carbon source comprises at least one pentose and / or at least one hexose.
  • this carbon source can comprise at least two different pentoses and at least one hexose, in particular at least xylose, arabinose and glucose and, in particular, D-xylose, L-arabinose and D-glucose.
  • These pentoses and hexose are typically derived from a renewable carbon material such as plant biomass and, in particular from lignocellulosic biomass.
  • the plant biomass is chosen from the group made up of agricultural products such as dedicated products called "energy” such as miscanthus, switchgrass (Panicum virgatum or switchgrass) and very short rotation coppices such as, for example, poplar or willow; agricultural production residues such as cereal straw, corn cane and sugar cane stalks; forest production; forest production residues such as wood processing residues.
  • energy such as miscanthus, switchgrass (Panicum virgatum or switchgrass) and very short rotation coppices such as, for example, poplar or willow
  • agricultural production residues such as cereal straw, corn cane and sugar cane stalks
  • forest production forest production residues such as wood processing residues.
  • Lignocellulose is composed of 75% carbohydrates and its hydrolysis releases fermentable sugars, mainly D-glucose, D-xylose and L-arabinose [32].
  • the recombinant microorganism cultured is a recombinant microorganism as defined above and in which the expression of the gapA gene from E. coli or a counterpart thereof is decreased but not inactivated compared to the unmodified microorganism.
  • the carbon source used may comprise only one element chosen from D-glucose, D-xylose, L-arabinose and one of their mixtures.
  • mixture is meant a mixture of D-glucose and D-xylose, a mixture of D-glucose and L-arabinose, a mixture of D-xylose and L-arabinose and a mixture of D-glucose, D-xylose and L-arabinose.
  • the recombinant microorganism cultured is a recombinant microorganism as defined above and in which the expression of the gapA gene from E. coli or a counterpart thereof is inactivated relative to the unmodified microorganism.
  • the carbon source used comprises, in addition to D-xylose and / or L-arabinose and / or D-glucose, one or more chosen C2, C3 or C4 compounds among malate, pyruvate, succinate, acetate and one of their mixtures.
  • the glycolic acid production process is done in two phases, with a first phase of biomass production, followed by a production phase which is triggered when the C2, C3 or C4 compounds arrive with exhaustion contributing to the bioconversion of hexoses and pentoses into glycolic acid.
  • the carbon source used can also comprise at least one other carbon element such as galactose, xylose, fructose, lactose, sucrose, maltose, molasses, starch and a starch hydrolyzate.
  • at least one other carbon element such as galactose, xylose, fructose, lactose, sucrose, maltose, molasses, starch and a starch hydrolyzate.
  • suitable nitrogen sources include ammonia, ammonium salts such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate and ammonium phosphate, other compounds containing nitrogen; a peptone such as tryptone; meat extract, yeast extract, corn liquor; a casein hydrolyzate; soy flour and soy flour hydrolyzate.
  • step (a) of the process according to the invention Those skilled in the art know different examples of sulfur sources, phosphate sources and trace elements which can be used in step (a) of the process according to the invention. He will be able to choose, without any inventive effort, the sources and trace elements best suited to the recombinant microorganism cultivated and the culture conditions.
  • the temperature during the culture of step (a) is typically between 15 and 45 ° C, and the pH during this culture is typically maintained at a value between 3.0 and 9.0.
  • the pH can be adjusted using, for example, an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea or calcium carbonate.
  • the recombinant microorganism is, in step (a) under conditions in which there are production of glycolic acid from the carbon source as defined above.
  • this culture is carried out under aerobic conditions, ie in the presence of oxygen.
  • the recombinant microorganisms are cultivated in the form of a suspension.
  • a "suspension" of cells is generally understood to include all types of suspended or dispersed cell cultures.
  • the expression “in the form of a suspension” is thus used to distinguish cells which are not cultivated in a liquid medium, such as cells cultured by adhering to a petri dish.
  • the term “suspension” includes both freely dispersed cells and agglomerated cells, regardless of whether agglomeration can occur spontaneously or not.
  • the recombinant microorganisms can be cultivated in the form attached to a solid phase such as microbeads, beads, capillaries, hollow fibers, these various elements being typically made of a material compatible with the microorganism such as, for example. for example, dextran, gelatin, glass and cellulose.
  • the culture methods which can be used during step (a) of the method according to the present invention include, but are not limited to, a batch culture, a continuous culture or a "fed-batch" culture.
  • a “continuous (cell) culture” is a cell culture characterized by both a continuous supply of a nutritious liquid supply and a continuous flow of liquid.
  • a continuous culture may constitute an "infusion culture", in which case the flow of liquid contains a culture medium which is substantially free of cells, or a cell concentration substantially lower than that in the bioreactor.
  • cells can be retained, for example, by filtration, centrifugation or sedimentation.
  • a “fed-batch” culture is a discontinuous cell culture to which a substrate, in concentrated form, solid or liquid, is added periodically or continuously during the analysis.
  • a “fed-batch” culture is initiated by inoculating cells into the medium, but, unlike a staple crop, there is a subsequent influx of nutrients, such as through a concentrated nutrient diet.
  • Unlike a continuous culture there is no systematic elimination of liquid originating from the culture or from the cells in a “fed-batch” culture.
  • Step (a) of the method according to the invention can be implemented in any container suitable for cell culture.
  • any container suitable for cell culture there may be mentioned an Erlenmeyer flask, a bioreactor or a biofermenter of different capacities. Additional information on these different containers can be found in [5].
  • steps (a) and (b) can take place one after the other or, on the contrary, simultaneously.
  • the glycolic acid is recovered from the culture medium.
  • Figure 3 is a schematic representation of the enzymatic test to verify the activity of arabinose-5P isomerase (KdsD), fructose-6P aldolase (FSA) and aldehyde dehydrogenase (aldA).
  • KdsD, FSA and aldA were purified, triose phosphate isomerase (Tpi) and glycerol-3P dehydrogenase (G3PDH) were ordered from Sigma.
  • Figure 4 shows the system comprising 7 purified enzymes (AraA, AraB, AraD, RPE, KdsD, FSA, AldA) which catalyze the conversion of L-arabinose to glycolic acid (Figure 4A).
  • the production of glycolic acid with this system in the presence of L- arabinose was compared to that with a system without AraA; the enzymatic reaction is based on the NADH assay at 340 nm ( Figure 4B).
  • Figure 5 shows the system comprising 6 purified enzymes (XylA, XylB, RPE, KdsD, FSA, AldA) which are capable of converting D-xylose to glycolic acid (Figure 5A).
  • the production of glycolic acid with this system in the presence of D-xylose was compared with that with a system without XylA; the enzymatic reaction is based on the NADH assay at 340 nm ( Figure 5B).
  • Figure 6 shows the system comprising 7 purified enzymes (Hxk, Pgi, Tkt, RPE, KdsD, FSA, AldA) which are capable of converting D-glucose into glycolic acid (Figure 6A).
  • Hxk purified enzymes
  • Pgi Pgi
  • Tkt RPE
  • KdsD KdsD
  • FSA AldA
  • FIG. 7 shows the demonstration of the in vivo functionality of the non-natural route according to the invention in E. coli MG1655 AtktA AtktB AglcD, with in bold: the non-natural route according to the invention, in dotted lines, the deletions.
  • Xu5P xylulose-5-phosphate
  • Ru5P ribulose-5-phosphate
  • R5P ribose-5-phosphate
  • S7P sedoheptulose-7- phosphate
  • F6P fructose-6-phosphate
  • F16BP Fructose-1, 6-bisphosphate
  • G6P glucose-6-phosphate
  • DHAP dihydroxyacetone phosphate
  • Glyald glycolaldehyde
  • E4P erythrose-4-phosphate
  • G3P glyceraldehyde-3-phosphate.
  • Figure 8 shows the production of glycolic acid from the f strain.
  • coli MG1655 AtktA AtktB AglcD expressing the non-natural pathway dependent on kdsD-fsa-aldA according to the invention from D-xylose or L-arabinose, at 37 ° C., 100 h.
  • Figure 9 shows the production of glycolic acid from the strain f. coli WC3G AgapA AglcD AarcA AmgsA AfucA Apkf proD-galP expressing the non-natural pathway dependent on kdsD-fsa-aldA according to the invention from glucose, xylose and arabinose, at 37 ° C., 50 h. DETAILED PRESENTATION OF PARTICULAR EMBODIMENTS
  • the oligonucleotides used for the amplification of the ORF of the enzymes of E. coli are listed in Table 3 below, the sequences SEQ. ID NO: referring to the sequence listing in the appendix.
  • the genomic DNA of E. coli which served as a matrix is that of the strain K12-MG1655.
  • XylA, XylB, AraA, AraB, AraD, AraB, Rpe, KdsD, FSA, AldA were constructed by HiFi assembly ® (NEB) with pET28a as recipient vector.
  • pET28a was previously linearized with the restriction enzymes HindIII and BamHI (NEB) (Table 4).
  • the strain of E. coli NEB5 ® derived from DH5 alpha, was used for the cloning and storage of the various plasmids.
  • the competent cells of f. coli BL21 have been used for the expression of labeled proteins since these cells express T7 RNA polymerase, and are therefore compatible with the T7 expression system of the vector pET28a.
  • the pET28a plasmids previously verified by sequencing were transformed into BL21 (DE3) according to the NEB protocol.
  • the strains obtained are stored in 50% glycerol at -80 ° C (Table 5).
  • All of the expressed proteins are soluble and were produced from the expression vector pET28a transformed into a strain of f. coli BL21 (DE3).
  • a preculture in LB medium for “Luria-Bertani”) added with the antibiotic kanamycin is carried out overnight at 37 ° C.
  • the preculture is used to seed a fresh culture of 200 ml of LB-Kanamycin at an optical density at 600 nm (DOeoo) of 0.1 (37 ° C., 200 rpm).
  • DOeoo optical density at 600 nm
  • the expression of the protein of interest is induced by the addition of IPTG to 1 mM final. Proteins are expressed overnight at 16 ° C.
  • the cells are collected in 50 ml fractions and centrifuged at 4800 rpm for 15 min at 4 ° C.
  • the cell pellets are stored at -20 ° C.
  • the purification of the proteins is carried out from the cell pellets obtained during the production stage. All steps are done cold to avoid degradation of proteins by proteases.
  • the cell pellets are resuspended in 1.5 ml of washing buffer (50 mM HEPES, pH 7.5; 0.3 M NaCl) and then sonicated on ice. A centrifugation step at 13,000 rpm, for 15 min at 4 ° C makes it possible to separate the cellular debris from the cytoplasmic liquid.
  • the clarified lysates are deposited on 600 ⁇ l of cobalt resin (Clontech) previously equilibrated with the washing buffer.
  • the tubes are centrifuged (700 rcf, 3 min, 4 ° C). The supernatant is removed, the resin is brought into contact with 3 ml of washing buffer for 10 min in order to eliminate non-specific interactions. After centrifugation (700 rcf, 3 min, 4 ° C) and removal of the supernatant, 3 mL of a 15 mM solution of imidazole are brought into contact with the resin for 5 min. The supernatant is separated from the resin by centrifugation, replaced by 500 mI of 200 mM imidazole. Imidazole elutes proteins carrying a polyhistidine label. To promote the stability of proteins at their optimal pH, the buffer has been modified.
  • the method used to measure the concentration of proteins in solution is based on the Bradford method.
  • the Protein assay ® reagent sold by BioRad is diluted to 1 ⁇ 4, the reaction mixture comprises 160 ⁇ l of reagent and 40 ml of diluted eluate (io th and 20 th ).
  • a standard range is produced with BSA from 12.5 to 100 mg / ml.
  • the hexokinase enzymes of Saccaromyces cerevisiae (Hxk), Escherichia coli transketolase (Tkt), Escherichia coli pyruvate kinase (PK) and Escherichia coli lactate dehydrogenase (LDH), and triose phosphate isomerase (Tpi) and glycerol -3-phosphate dehydrogenase (G3PDH) were ordered from Sigma.
  • Escherichia coli phosphoglucose isomerase (Pgi) from Megazyme.
  • AldA aldehyde dehydrogenase
  • FSA fructose-6P aldolase
  • D-arabinose-5-phosphate isomerase catalyzes the interconversion of D-ribulose-5-phosphate into D-arabinose-5-phsphate.
  • the activity of KdsD on D-ribulose-5-phosphate was determined by adding FSA, aldA in excess in the presence of 3 mM of NAD + .
  • Ribulose-5P is a metabolite common to the catabolism of arabinose, xylose and glucose in Escherichia coli.
  • the unnatural way of converting D-ribulose-5P into glycolic acid which is the subject of the present invention consists of the enzymes KdsD (D-arabinose 5P isomerase), FSA (Fructose-6P aldolase) and AldA (glycolaldehyde dehydrogenase) .
  • KdsD D-arabinose 5P isomerase
  • FSA Fetose-6P aldolase
  • AldA glycolaldehyde dehydrogenase
  • the catalytic constants of these 3 enzymes are presented in Table 6.
  • the proteins labeled polyhistidine KdsD, FSA and aldA are active.
  • the reaction mixture containing KdsD, FSA and AldA in the presence of 5 mM of D-ribulose-5P was analyzed by HPLC, 1.5 mM of glycolic acid were quantified.
  • the production of glycolic acid measured corresponds to the initial amount of NAD + in the reaction medium, indicating that the reaction has been complete.
  • the enzymes catalyzing the conversion of L-arabinose, D-xylose and D-glucose to glycolic acid have been purified (AraA, AraB, AraD, XylA, XylB, Rpe, KdsD, Fsa, AldA) or ordered (Tkt, Glk, Pgi ) in order to demonstrate the feasibility of producing glycolic acid from these 3 substrates in vitro. i. Conversion of L-arabinose to glycolic acid.
  • Table 8 Enzymatic activity measured for the conversion of D-xylose to glycolic acid at 340 nm, 37 ° C.
  • One unit of enzyme activity (U) is defined as the conversion of one micromole of substrate per minute.
  • the negative control is devoid of xylulose isomerase activity catalyzed by XylA.
  • Table 9 Enzymatic activity measured for the conversion of D-glucose into glycolic acid at 340 nm, 37 ° C. One unit of enzyme activity is defined as the conversion of 1 micromole of substrate per minute. The negative control is devoid of hexokinase (Hxk) activity.
  • Hxk hexokinase
  • the carbohydrates L-arabinose, D-xylose and D-glucose are naturally assimilated and converted to D-ribulose-5P in Escherichia coli, the unnatural conversion of D-ribulose-5P to glycolic acid enabled by the overexpression of KdsD, FSA and aldA has been demonstrated.
  • the implementation of the unnatural KdsD-FSA-aldA pathway is thermodynamically favorable, the complete pathways for assimilation and conversion of the reconstructed pentoses and hexoses have enabled glycolic acid synthesis in vitro.
  • the series of pZ vectors (Expressys) has the advantage of being modular: it is easy to change the origin of replication, the resistance marker and the promoter of the vectors by restriction / ligation.
  • the vectors pZA23, pZA33, pZE23 and pZS23 have the promoter PAllacO-1 which is a promoter derived from the promoter of the lactose operon including the operator o.
  • PAllac0-l is under the control of the lacl repressor: in its active form, the lacl repressor binds to the operator o and inhibits transcription whereas, complexed with IPTG, it changes conformation and is no longer able to attach to site o, transcription then becoming possible.
  • the PAllacO-1 promoter is said to be inducible to IPTG. Even if E.
  • coli naturally has a copy of the lacl gene in its genome upstream of the lac operon, the majority of IPTG-inducible bacterial expression vectors carry the lacl gene in order to ensure total inhibition of the transcription of genes that are under its dependence.
  • the pZ vectors have the particularity of having a light structure of the lacl gene which gives them a small size (2358 to 3764 bp).
  • the HiFi assembly ® (NEB) method was used to construct the vectors used below. This method allows the assembly of several fragments. She was validated for fragments of different sizes with variable regions of overlap (15-80 bp). In a single step, the fragments can be assembled, it is a method commonly used for its simplicity and flexibility.
  • the commercial mixture supplied by New England Biolabs contains different enzymes: (a) an exonuclease which creates 3 'single stranded ends, which facilitates the assembly of fragments which share sequence complementarity; (b) a polymerase which fills the voids after the fragments have assembled; and (c) a ligase which binds the fragments together.
  • kdsD, fsa and aldA were amplified by PCR from the genome DNA extracted from f. coli K12 MG1655 and inserted by HiFi assembly ® in pZ vectors previously linearized by PCR with primers hybridizing to either side of the MCS. All plasmids were checked by sequencing before use. iii. Expression vectors for overexpression of kdsD, fsa, aldA
  • KEIO strains carrying a single deletion and a resistance cassette to the antibiotic Kanamycin were infected with Plvir and high titer lysates 1 were obtained [35].
  • Donor strains (KEIO) were grown overnight in LB at 37 ° C. The following day, 5 ml of LB containing 0.2% of glucose and 5 mM of CaCl 2 were inoculated with 200 ml of the donor strain and cultured for 30 min at 37 ° C. Then, 100 ⁇ l of Plvir lysate ( ⁇ 5 x 10 8 phages / ml) was added to each donor culture and incubated again at 37 ° C for 2 to 3 hours until the culture was clear and the cells are completely lysed. Lysates were filtered using sterile syringe filters of 25 mm with a Supor ® membrane of 0.2 pm (Pall) and stored at 4 ° C.
  • the strain to be deleted was infected with Plvir containing a donor gene deletion cassette with resistance to kanamycin.
  • the receptor strain was cultured in 5 ml of LB medium at 37 ° C. The cells were centrifuged at 1,500 g for 10 min and resuspended in 1.5 ml of 10 mM MgSO 4 and 2 to 5 mM CaCl 2 .
  • Donor strain lysate (0.1 ml) is added to the cell suspension which is incubated for 30 min. Then 0.1 ml of 1 M sodium citrate is added to the cell and Plvir mixture. Then, 1 ml of LB is added to the homogenized suspension before a 1 h incubation at 37 ° C, 200 rpm.
  • the cell suspensions are spread on a solid LB medium with the appropriate antibiotic and then the colonies are screened by PCR to demonstrate successful transduction events.
  • the cells were transformed with a plasmid pCP20 carrying the FLP recombinase. Each step was checked by PCR.
  • the deleted strain is sensitive to kanamycin after removal from the cassette, it can again be used as a recipient strain in order to add a new deletion from a new phage lysate.
  • the competent non-commercial strains are prepared according to the protocol of Chung et al, 1989 slightly modified [36].
  • a preculture is carried out in LB overnight to inoculate the next day with a fresh culture of LB at a DO 6 oo of 0.1.
  • EOO 0.3 to 0, 5 the bacteria can be made competent to a D0 6 oo 1
  • an amount equivalent cell culture in a 6 oo D0 unit is removed and centrifuged (8000 rpm, 2 min). The supernatant is removed while the pellet is taken up in 300 mI of TSS buffer (2.5% ( W t / voi) PEG 3350, 1 M MgCl 2 , 5% ( VO i / voi) DMSO).
  • the mixture is incubated for 10 min on ice.
  • the plasmid can then be added to the competent cells. After an additional 30 min of incubation on ice, a thermal shock is carried out at 42 ° C for 90 seconds.
  • the transformed cells are placed in ice for 10 min. 400 mI of LB are added and the culture is incubated at 200 rpm for 1 h, at a suitable temperature (the temperature cannot exceed 30 ° C. in the case of a transformation with a plasmid whose origin of replication is thermosensitive).
  • the bacterial culture is centrifuged at 8000 rpm for 2.5 min. 600 ml of supernatant are removed, the remaining volume is inoculated on a solid LB dish with the appropriate antibiotic.
  • NEB5 fhuA2 A (argF-iacZ) U169 phoA glnV44 F80 A (lacZ) M15 NEB
  • the cells are cultured on the LB medium for the stages of molecular biology (cloning, deletions, transformation).
  • This rich medium is composed of 10 g / L of tryptone, 5 g / L of yeast extracts and 5 g / L of NaCl. 15 g / L of agar are added to obtain a solid medium.
  • the LB, with or without agar, is sterilized by autoclaving 20 min at 110 ° C before use.
  • glycolic acid The cultures for the production of glycolic acid are carried out in an M9 mineral medium (Table 12) containing a carbon source (glucose, xylose or arabinose) at a concentration of 10 g / L or 20 g / L and traces of LB so to reduce the latency phase (2 g / L tryptone, 1 g / L of yeast extracts and 1 g / L of NaCl).
  • a carbon source glucose, xylose or arabinose
  • the M9 medium with LB destroys is supplemented with 500 mM L-phenylalanine, 250 pM L-tyrosine, 200 pM L- tryptophan, 6 pM p-aminobenzoate, 6 pM p-hydroxydenzoate and 280 pM from shikimate.
  • the medium was made up with 0.4 g / L of malic acid adjusted to pH 7 with KOH beforehand.
  • the medium is buffered by the addition of 20 g / L of 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) at pH 7 and then filtered through membranes at 0.2 ⁇ m to obtain a sterile medium.
  • MOPS 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid
  • the appropriate antibiotics were added to the medium (ampicillin 100 pg / mL, kanamycin 50 pg / mL, chloramphenicol 25 pg / mL).
  • kanamycin 50 pg / mL kanamycin 50 pg / mL
  • chloramphenicol 25 pg / mL chloramphenicol 25 pg / mL
  • All products have been ordered from Sigma.
  • the cultures are placed in a shaker (Infors) at 200 rpm, 37 ° C. for the time of the experiment.
  • the strains are taken up from a glycerol stock stored at -80 ° C in 10 mL of LB, at 37 ° C overnight.
  • the precultures are centrifuged the following day at 4000 rpm for 5 min and resuspended in 20 mL of 1% M9 xylose or arabinose medium in 100 mL Erlenmeyer flasks.
  • An adaptation phase lasting 24 hours allows the strains to adapt to the use of pentose.
  • the cells are then centrifuged (4000 rpm, 5 min) and taken up again in the final culture conditions: at an initial ⁇ qeoo of 0.5 in 50 ml of the medium of composition identical to that used during the adaptation phase (M9 xylose or arabinose 1%). 250 ml culture flasks with baffles are used for optimal oxygenation. The cultures are agitated at 200 rpm, at 37 ° C.
  • the GA23 strain is taken up from a glycerol stock stored at -80 ° C in 10 mL of LB containing the following antibiotics: tetracycline (10 pg / ml), kanamycin (50 pg / ml) and chloramphenicol (25 pg / ml). The preculture is incubated at 37 ° C, 200 rpm overnight.
  • the process is divided into 2 phases: a growth phase dedicated to the production of biomass and a production phase dedicated to the production of glycolic acid.
  • the growth phase is carried out in 50 mL of M9 medium at pH 7 containing 1.5 g / L of xylose, 5 g / L of succinate, 73 mg / L of L-methionine, 73 mg / L of L-tryptophan and lg / L of casamino acids inoculated with the preculture at an ⁇ qeoo of 0.2 in a 250 ml baffled erlenmeyer flask.
  • the cells After 24 hours of culture at 37 ° C., 200 rpm, the cells are centrifuged, washed and taken up in 50 ml of M9 at pH 7 containing 10 g / L of lignocellulosic sugar (glucose, xylose or arabinose), 73 mg / L of L-methionine, 73 mg / L of L-tryptophan and lg / L of casamino acids in a 250 ml baffled Erlenmeyer flask.
  • the middle used for production is devoid of succinate and does not allow growth, the carbon source (glucose, xylose or arabinose) is used for the production of glycolic acid.
  • the production phase lasts 48 hours at 37 ° C, 200 rpm, samples are taken regularly in order to measure the pH, the optical density and follow the sugar consumption and the production of GA by HPLC.
  • the LB precultures of the strains containing a vector with an inducible promoter are cultured at an initial ⁇ qeoo of 0.1 in 30 ml of 1% M9 glucose.
  • ⁇ qeoo reaches 0.6
  • 0.1 mM of IPTG are added to induce the expression of genes under the control of the promoter inducible to IPTG (plac or ptac).
  • the cells are centrifuged, washing with sterile water makes it possible to remove the traces of glucose, and resuspended in 20 ml of the medium chosen for the study (M9 xylose or arabinose 1%, 0.1 mM IPTG ) for the adaptation phase.
  • the rest of the culture protocol is identical to that for the strains with constitutive promoters. iii. Fermentation process in 2L BIOSTAT ® B Startorius bioreactor
  • the culture medium M9 (Table 12) contains 10 g / L of xylose or glucose, as well as LB (10%) and 0.4 g / L of malic acid.
  • the cultures were carried out at 37 ° C., with a agitation (300-1500 rpm) and aeration keeping the dissolved oxygen above 20% of the air flow.
  • the pH was maintained at 7 with a basic KOH solution.
  • the culture was carried out in batch mode for 40 hours.
  • the HPLC system is equipped with a cation exchange column (Aminex, HPX87H - 300 x 7.8 mm, 9 pm, BioRad), an automatic injector (WPS-3000RS, Dionex), an IR detector (RID 10A, Shimadzu) and a UV detector (SPD-20A, Shimadzu).
  • the mobile phase is a 1.25 mM sulfuric acid solution at a flow rate of 0.5 mL / min.
  • the samples are kept at 4 ° C. and the injection of 20 ⁇ l is carried out in the column at 35 ° C.
  • the inventors have demonstrated that the overexpression in E. coli of the 3 enzymes of the non-natural pathway according to the invention, ie arabinose-5-phosphate isomerase (KdsD), fructose-6-phosphate aldolase (FSA) and aldehyde dehydrogenase (AldA) is necessary and sufficient for the synthesis of glycolic acid from lignocellulosic monosaccharides.
  • KdsD arabinose-5-phosphate isomerase
  • FSA fructose-6-phosphate aldolase
  • AldA aldehyde dehydrogenase
  • transketolases are major enzymes in the pentose phosphate pathway. In their absence, growth on pentose is impossible, the pentose phosphate intermediates (D-ribose-5-phosphate and D-Xylulose-5-phosphate) accumulate and cannot be converted into glyceraldehyde-3phosphate for growth [38] This strain needs the non-natural route according to the invention to grow from pentoses.
  • the 3 genes were cloned into operons and expressed in a strain of f. coli MG1655 AtktA AtktB AglcD. To do this, an expression system with two vectors was used, the latter having been accepted by the strain without causing deleterious modifications for the expression of the synthetic route according to the invention.
  • the synthetic pathway expression system according to the invention therefore comprises a vector with a medium number of copies carrying kdsD-fsa co-expressed with a vector with a low number of copies carrying aldA.
  • Expression systems 9 and 23 were transformed into the strain of f. coli WC3G AgapA AglcD AarcA AmgsA AfucA Apkf proD-galP (GA00) designed for the production of glycolic acid from hexoses and pentoses with optimal carbon conservation, generating strains GA09 and GA23, respectively.
  • the bacterial cultures were carried out in an Erlenmeyer flask at 37 ° C. on D-glucose, L-arabinose and D-xylose for 46 h. Overexpression of the kdsD, fsa and aldA genes is necessary for the production of glycolic acid.
  • the GA00 strain with the constitutive expression system No. 23 or GA23 showed a production of glycolic acid from D-glucose (0.29 g / L), D-xylose (0.41 g / L) and L-arabinose (0.07 g / L).
  • the production of glycolic acid with the inducible expression system No. 9 or GA09 is less important on D-glucose (0.1 g / L), D-xylose (0.05 g / L) and L-arabinose ( 0.03 g / L) ( Figure 9).
  • the expression system comprising constitutive promoters is favorable.
  • the yield of the GA23 strain in glycolic acid is 0.09 g / g (0.21 mol / mol) from glucose, 0.18 g / g (0.36 mol / mol) from xylose and 0 , 16 g / g (0.32 mol / mol) from arabinose.
  • the yield of the GA23 strain in glycolic acid is 0.096 g / g

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Abstract

La présente invention concerne un micro-organisme recombinant qui présente (i) une activité de conversion du D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose-5- phosphate, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié; (ii) une activité de catalyse du clivage du D-arabinose-5-phosphate en D-glycéraldéhyde-3- phosphate et glycolaldéhyde, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié; (iii) une activité d'oxydation du glycolaldéhyde en glycolate, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié; et (iv) une activité d'oxydation du glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3-bisphosphoglycérate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié. La présente invention concerne également un procédé pour préparer de l'acide glycolique à partir de pentoses et/ou d'hexoses, utilisant un tel micro-organisme recombinant. La présente invention concerne aussi un procédé de production de l'acide glycolique impliquant une phase de production de biomasse et une phase de bioconversion des hexoses et/ou pentoses en acide glycolique.

Description

MICRO-ORGANISMES ET PROCÉDÉ POUR LA PRODUCTION D'ACIDE GLYCOLIQUE À PARTIR DE PENTOSES ET D'HEXOSES
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention appartient au domaine technique de la bioconversion d'une source carbonée en au moins un métabolite d'intérêt et notamment en acide glycolique.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un micro organisme dont le métabolisme carboné central a été remanié de façon à convertir les hexoses et les pentoses, issus d'une source carbonée et, notamment, de la biomasse végétale en acide glycolique. La présente invention concerne également un procédé pour produire de l'acide glycolique à partir d'hexoses et de pentoses contenus dans la biomasse végétale mettant en œuvre un tel micro-organisme.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE
L'acide glycolique ou acide hydroxyacétique de formule H0-CH2-C(=0)- OH trouve de nombreuses applications dans différents domaines. En effet, à titre illustratif, il peut être utilisé comme agent régulateur de pH ou agent kératolytique en cosmétique et en pharmaceutique, comme agent de teinture et de tannage dans l'industrie textile ou encore comme désinfectant dans l'industrie agro-alimentaire. L'acide glycolique permet également de produire des polymères comme des résines thermoplastiques comprenant du poly(acide glycolique). De tels polymères présentent des propriétés de barrière au gaz remarquables et ont la capacité de s'hydrolyser dans des environnements aqueux de façon graduelle et contrôlable, faisant de ces polymères de bons candidats pour des matériaux d'emballage ou matériaux résorbables utiles dans le domaine biomédical.
Même si l'acide glycolique peut être obtenu à partir d'extrait de canne à sucre, de betterave ou de raisin, sa production à l'échelle industrielle est issue de la synthèse chimique. Plusieurs de ces synthèses utilisent, comme réactif de départ, du formaldéhyde qui est un composé irritant et cancérogène, ce qui exclut toute trace de cette substance dans des préparations bénéficiant d'Autorisation de Mise sur le Marché.
Par conséquent l'acide glycolique bio-sourcé présente un intérêt dans les domaines pharmaceutiques, cosmétiques mais aussi textiles. Sous forme polymérisée, le poly(acide glycolique) et les polymères contenant du poly(acide glycolique) pourrait représenter une nouvelle génération de bio-plastiques d'emballage et de polymères bio résorbables [1]· C'est pourquoi depuis quelques années, plusieurs équipes de recherche s'intéressent à sa production par voie microbienne.
L'acide glycolique peut être naturellement produit en faibles quantités via la réduction du glyoxylate chez les bactéries et les moisissures, y compris la levure [2]. Les premiers projets d'ingénierie se sont inspirés du métabolisme naturel. Le rendement théorique maximum qui peut être atteint par cette voie naturelle est de 2 moles d'acide glycolique (AG) par mole d'hexose et 1,66 mole par mole de pentoses (ou 0,84 g AG/ g sucre).
Ainsi, un procédé de bioproduction d'acide glycolique basé sur l'amélioration du métabolisme naturel chez Escherichia coli a fait l'objet de la demande internationale WO 2007/141316 [3]. Cette voie est dénommée, par la suite, « voie du shunt du glyoxylate (SG) ». Dans le procédé décrit, les réactions consommant le glyoxylate et les enzymes métabolisant le glycolate ont été délétées, tandis que la NADPH glyoxylate reductase qui convertit le glyoxylate en glycolate a été surexprimée et ce, afin d'augmenter le rendement en acide glycolique. Le système de régulation du cycle glyoxylate a également été modifié pour lever les inhibitions et augmenter le flux de carbone vers le glyoxylate. Depuis le travail décrit dans [3], d'autres modifications ont été apportées pour améliorer la production d'acide glycolique à partir de (D)-glucose, ce qui a permis d'atteindre 92,9% du rendement théorique maximal [4].
Toutefois, d'un point de vue stoechiométrique, cette voie de synthèse n'est pas optimale, le rendement théorique est limité par la perte de carbone due à la décarboxylation du pyruvate en acétyl-CoA. Dans ce contexte, la substitution et/ou complémentation du métabolisme naturel par une voie synthétique pour l'assimilation des sucres et la production d'acide glycolique est une stratégie envisageable pour lever cette limitation.
Dans ce but, une voie semi-synthétique d'assimilation des pentoses a été décrite dans la demande internationale WO 2017/059236 [5]. Cette voie implique la phosphorylation en position 1 du cycle du (D)-ribulose ou du (L)-xylulose et est dénommée, par la suite, « voie de ribulose-l-P ». Cette voie synthétique permet l'assimilation des pentoses, plus particulièrement l'assimilation du (D)-xylose qui est le pentose majoritaire de l'hémicellulose. Le rendement sur (D)-xylose est de 0,44 g/g [6]. A noter toutefois que la voie décrite dans la demande internationale WO 2017/059236 [5] nécessite, pour être fonctionnelle, de réduire ou d'inactiver l'activité de la xylulokinase et de surexprimer les quatre enzymes suivantes : une épimérase qui interconvertit le xylulose et le ribulose, une (D)-ribulose-phosphate aldolase, une D-ribulokinase et une glycolaldéhyde déshydrogénase.
Une autre voie synthétique pour la production d'acide glycolique a été développée et a fait l'objet de la demande internationale WO 2016/079440 [7]. Cette voie synthétique phosphoryle des sucres pentoses sur le premier carbone (Cl) au lieu du carbone 5 (C5) comme c'est le cas dans la voie des pentoses phosphate. Cette réaction de phosphorylation catalysée par une ketohexokinase hétérologue, issue de mammifères, est suivie d'une réaction de clivage par une aldolase conduisant à une molécule en C3 (dihydroxyacétone-P) et C2 (glycolaldéhyde). Ce dernier par une réaction d'oxydation catalysée par une glycoladéhyde déshydrogénase conduit à la synthèse d'acide glycolique ou par une réaction de réduction catalysée par une réductase endogène à l'éthylène glycol. Cette voie synthétique, dénommée, par la suite, « voie du xylulose-l-P » implique trois enzymes différentes et non cinq comme dans [5] et permet d'obtenir une production théorique molaire en acide glycolique et éthylène glycol (1 mole par mole de sucres pentoses).
Il convient de souligner que les voies synthétiques indépendantes de la voie du glyoxylate décrites dans [5] et [7] ne présentent pas d'étape de décarboxylation et donc de perte de C02 mais génèrent, toutes deux, un composé en C3 à savoir de la dihydroxyacétone phosphate (DHAP), ce qui limite le rendement théorique maximal en acide glycolique.
Aussi, afin de pouvoir utiliser la DHAP pour la production d'acide glycolique, les voies synthétiques décrites dans [5] et [7] ont été couplées avec la voie naturelle optimisée décrite dans [3]. La combinaison des voies décrites dans [7] et [3] a abouti à un rendement de 0,63 g d'acide glycolique par g de sucres mais le rendement théorique maximal est encore limité du fait de la perte de C02, conséquence de l'utilisation de la voie naturelle optimisée [8].
Dans une correspondance adressée à Nature Biotechnology [9], Dugar et Stephanopolous ont introduit la notion de « rendement énergétique maximal (YE) ». Ce rendement est calculé purement sur la base de la balance énergétique entre le substrat et le produit, ce qui se traduit pratiquement en tenant compte de l'état redox du substrat et du produit. Ainsi, YE est déterminé par le ratio gd/gr où ys et yp sont les degrés de réduction du substrat et du produit. Par exemple, le degré de réduction du glucose ys est égal à 24 alors que celui du produit éthanol gr est égal à 12. Donc le YE égale 2. D'autre part, le rendement de la voie métabolique (Yp) dépend de la voie ou du réseau métabolique et il est calculé à partir de la stœchiométrie de la voie considérée. Ainsi, pour le cas de la fermentation de glucose en éthanol, Yp est égal à 2 et on trouve que YE égale Yp. Cette égalité n'est pas retrouvée pour tous les cas. Par exemple, la conversion de glucose en acétate se traduit par un rendement Yp de 2 mais le rendement énergétique maximum YE est de 3. Il y a donc une perte potentielle de 33% de matière qui s'explique par la voie métabolique naturelle. Cependant, l'équipe de Liao et al ont montré qu'il était possible de construire des voies métaboliques viables conduisant à la production de 3 moles d'acétate par mole de glucose [10]. Selon le même principe, on peut calculer que le rendement énergétique maximum d'acide glycolique (gr = 6) produit à partir de glucose (ys = 24) serait de 4 et à partir de pentose (gr = 20) serait de 3,3. Toutefois, ce rendement ne peut être atteint que si le système biologique est capable de capturer une mole de carbone sous forme de C02.
Partant de ce postulat et au vu de l'intérêt grandissant pour les produits issus de ressources carbone renouvelables, les inventeurs se sont fixés pour but de proposer un micro-organisme et un procédé permettant de produire, de façon simple, industrialisable à partir de biomasse végétale et notamment à partir des hexoses et pentoses contenus dans cette dernière, de l'acide glycolique avec des rendements améliorés par rapport aux procédés de l'art antérieur.
A cet effet, le Tableau 1 ci-après présente les rendements théoriques des voies de l'art antérieur de production d'acide glycolique (mol/mol) selon la source de carbone utilisée.
Tableau 1
EXPOSÉ DE L'INVENTION
La présente invention permet de résoudre les problèmes techniques des procédés de l'art antérieur tels que précédemment définis et d'atteindre le but que se sont fixé les inventeurs.
En effet, les travaux des inventeurs ont identifié trois enzymes permettant de construire la voie non-naturelle de synthèse d'acide glycolique présentée à la Figure 1, lesdites enzymes étant :
i) la D-arabinose-5-phosphate isomérase (KdsD), enzyme de la voie de synthèse des lipopolysaccharides qui convertit le D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose- 5-phosphate [11] ;
ii) la fructose-6-phosphate aldolase (FSA) qui catalyse le clivage du D- arabinose-5-phosphate en D-glycéraldéhyde-3-phosphate et glycolaldéhyde ; à noter que cette enzyme avait été initialement identifiée comme catalysant le clivage aldolytique du fructose-6-phosphate en dihydroxyacétone et glycéraldéhyde-3-phosphate, mais a montré une activité aldolytique sur le D-arabinose-5-phosphate avec une affinité 10 fois plus élevée que pour le fructose-6-phosphate [12] et iii) l'aldéhyde déshydrogénase (AldA) qui oxyde le glycolaldéhyde en glycolate [13].
A noter que le premier substrat de cette nouvelle voie à savoir le D- ribulose-5-phosphate est naturellement obtenu à partir des pentoses par la voie des pentoses phosphates (PP).
Même si ces trois enzymes sont naturellement exprimées dans les micro organismes comme E. coli, elles ne permettent pas la synthèse d'acide glycolique puisque la surexpression des gènes kdsD, fsa et aldA et donc la surexpression de ces enzymes sont nécessaires pour produire de l'acide glycolique. En d'autres termes, la voie de synthèse selon l'invention n'existe pas à l'état naturel dans les micro-organismes comme E. coli. On peut donc parler de « voie non-naturelle » ou de « voie métabolique synthétique ».
Par ailleurs, l'activité de la FSA sur la D-arabinose-5-phosphate génère du glycéraldéhyde 3P (C3) qui est pris en charge par la glycolyse oxydative. Comme décrit dans [8], cette molécule C3 peut donner du glycolaldéhyde mais avec perte de C02 au niveau de la réaction catalysée par la pyruvate déshydrogénase. Pour contourner cette limite métabolique, les inventeurs ont remanié le métabolisme carboné central afin d'optimiser la conservation du carbone en récupérant ce C3 dans la voie des PP et ce, en atténuant et voire en inactivant le gène gapA codant de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase. Suite à cette atténuation/inactivation, le glycéraldéhyde-3-phosphate entre dans la voie des PP et participe à la synthèse de D-xylulose-5-phosphate, précurseur du D-ribulose-5-phosphate. Le rendement théorique maximal est alors de 2,5 moles d'acide glycolique par mole de pentose.
De plus, pour qu'un procédé soit économiquement viable, il faut qu'il puisse convertir les sucres lignocellulosiques majoritaires, soit les pentoses comme le D- xylose et les hexoses comme le D-glucose. Ce dernier est naturellement assimilé par la voie de la glycolyse. Ainsi, en inactivant/délétant le gène gapA, le flux de carbone est redirigé dans la voie des PP ce qui rend possible la conversion du D-glucose en acide glycolique avec un rendement maximal théorique de 3 moles d'acide glycolique par mole de D-glucose. Le Tableau 2 ci-après reprend les rendements théoriques des voies de l'art antérieur et présente le rendement théorique de la voie selon l'invention de production d'acide glycolique (mol/mol) selon la source de carbone utilisée.
Tableau 2
Xylose _ Glucose _ Référence
Voie du shunt du glyoxylate (SG) 1,66 2 [3]
Voie Ribulose-lP 1 0 [5]
Voie Xylulose-lP 1 0 [7]
Voies Ribulose-lP+ SG 2 2 [6] Voies Xylulose-lP + SG 2 2 [8] Voie selon la présente invention 2,5 3
Ainsi, la présente invention permet de réaliser la synthèse d'acide glycolique à partir d'hexoses et pentoses par une seule voie non naturelle, ce qui permet de valoriser au mieux le carbone renouvelable. Enfin, cette démarche lève la contrainte stoechiométrique imposée par le métabolisme d'f. coli. En outre, les calculs sur les rendements théoriques de la voie non naturelle d'assimilation des pentoses et hexoses décrite dans la présente invention, pour la production d'acide glycolique, permettent d'entrevoir une amélioration importante des rendements par rapport aux procédés de biosynthèse basés sur l'optimisation de voies naturelles et/ou semi-synthétiques de l'art antérieur.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un micro organisme recombinant qui présente
i) une activité de conversion du D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose- 5-phosphate, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;
ii) une activité de clivage aldolique du D-arabinose-5-phosphate en D- glycéraldéhyde-3-phosphate et glycolaldéhyde, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;
iii) une activité d'oxydation du glycolaldéhyde en glycolate, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié ; et iv) une activité d'oxydation du glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3- bisphosphoglycérate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié, ledit micro-organisme recombinant produisant de l'acide glycolique à partir de pentoses et d'hexoses.
Par « micro-organisme », on entend tout organisme qui existe sous la forme d'une cellule microscopique appartenant aussi bien au domaine des procaryotes qu'à celui des eucaryotes. Par conséquent, le terme « micro-organisme » englobe des micro-algues procaryotes, des bactéries, des archées et des eubactéries de toutes les espèces ainsi que des micro-organismes eucaryotes tels que des cellules végétales, des micro-algues eucaryotes, des levures et des champignons. Le terme comprend également des cultures cellulaires de toute espèce qui peuvent être cultivées pour la production d'acide glycolique.
A titre d'exemples de bactéries utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer les bactéries des familles Burkholderiaceae, Enterobacteriaceae, Brevibacteriaceae, Clostridiaceae, Bacillaceae, Moraxellaceae, Sphingomonadaceae, Lactobacillaceae, Streptomycetaceae, Streptococcaceae, Methylobacteriacae et Corynebacteriaceae. A titre d'exemples plus particuliers de bactéries utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Zymomonas mobilis, Ralstonia eutropha, Clostridium acetobutylicum, Methylobacterium extorguens et Lactococcus lactis.
A titre d'exemples de levures utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer les levures des familles Saccharomycetaceae, Pichiaceae, Schizosaccharomycetaceae et Yarrowia. A titre d'exemples plus particuliers de levures utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Candida blankii, Candida rugosa, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Pichia jadinii, Scheffersomyces stipitis, Pichia pastoris et Yarrowia lipolytica. A titre d'exemples de champignons utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer les champignons des genres Pénicillium, Aspergillus, Chrysosporium et Trichoderma. A titre d'exemples plus particuliers de champignons utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer Pénicillium notatum, Pénicillium chrysogenum, Aspergillus niger, Chrysosporium pannorum et Trichoderma reesei.
Plus particulièrement, le micro-organisme mis en œuvre dans le cadre de la présente invention est une bactérie du type E. coli ou une levure du type Saccharomyces cerevisiae.
Par « micro-organisme recombinant », on entend un micro-organisme tel que précédemment défini qui n'est pas trouvé dans la nature et qui est génétiquement différent de son équivalent dans la nature. Les expressions « équivalent dans la nature », « micro-organisme non modifié », « micro-organisme naturel » et « micro-organisme de type sauvage » sont équivalentes et utilisables de façon interchangeable. Le micro organisme recombinant est modifié par introduction, par délétion et/ou par modification d'éléments génétiques.
Le micro-organisme recombinant utilisable dans la présente invention peut être modifié pour moduler le niveau d'expression d'un gène endogène. Par « gène endogène », on entend un gène qui était présent dans le micro-organisme avant toute modification génétique du micro-organisme de type sauvage.
Des gènes endogènes peuvent être surexprimés en introduisant des séquences hétérologues en plus ou en remplaçant des éléments régulateurs endogènes, ou en introduisant une ou plusieurs copies supplémentaires du gène dans un chromosome ou sur un ou plusieurs plasmide(s). Les gènes endogènes peuvent également être modifiés pour moduler leur expression et/ou leur activité. Par exemple, des mutations peuvent être introduites dans la séquence codante pour modifier le produit génique ou des séquences hétérologues peuvent être introduites en plus ou pour remplacer des éléments régulateurs endogènes. La modulation d'un gène endogène peut entraîner une régulation positive et/ou une augmentation de l'activité du produit génique endogène ou, en variante, réguler à la baisse et/ou diminuer l'activité du produit génique endogène. Une autre manière de moduler l'expression d'un gène endogène est d'échanger le promoteur endogène de ce dernier comme le promoteur de type sauvage, avec un promoteur plus fort ou plus faible pour réguler à la hausse ou à la baisse l'expression du gène endogène. Ces promoteurs peuvent être homologues ou hétérologues.
En variante, le micro-organisme recombinant utilisable dans la présente invention peut également être modifié pour exprimer un gène exogène. Le micro organisme recombinant utilisable dans la présente invention peut être modifié pour exprimer des gènes exogènes si ces gènes sont introduits avec tous les éléments permettant leur expression dans ce micro-organisme. L'homme du métier connaît différentes méthodes de modification, de transformation ou de transfection d'un micro organisme avec un gène exogène. A titre d'exemple et de façon non exhaustive, cette méthode peut être une conjugaison ; une électroporation ; une lipofection ; une micro injection ; un bombardement avec des particules (ou biolistique) ; une transformation biologique d'un végétal en utilisant Agrobacterium tumefasciens ; une transformation par une perméabilisation chimique ; une transformation par la méthode DEAE-dextran ou une introduction via un virus, un virion ou une particule virale.
Par « gène exogène », on entend un gène qui a été introduit dans un micro-organisme, par des moyens bien connus de l'homme du métier alors que ce gène ne se trouve pas naturellement dans le micro-organisme. Des gènes exogènes peuvent être intégrés dans un ou le chromosome du micro-organisme ou être exprimés de manière extra-chromosomique aux moyens de plasmides, de vecteurs, de cosmides, de bactériophages ou de virus tel qu'un baculovirus. Un gène exogène peut être un gène homologue.
Par « gène homologue », on entend un gène homologue à un gène codant une protéine de référence et qui code une protéine homologue à cette protéine de référence. Par « protéine homologue à une protéine de référence », on entend une protéine ayant une fonction similaire et/ou une structure similaire que la protéine de référence. Ainsi, lorsque la protéine de référence est une enzyme, une protéine homologue à cette protéine de référence catalyse la même réaction enzymatique. En utilisant les références données dans les bases de données de séquences d'acides aminés ou nucléotidiques telles que Genbank ou NCBI BioProject pour des gènes ou des protéines connus, l'homme du métier est capable de déterminer des gènes ou des protéines homologues i.e. équivalents dans d'autres organismes comme des souches bactériennes, levures, champignons, mammifères ou encore plantes. Ce travail de routine est avantageusement réalisé en utilisant des séquences consensus identifiées par des alignements de séquences avec des gènes ou protéines, dérivés d'autres organismes.
Un homologue d'un gène A peut également être un gène codant une variante de la protéine codée par le gène A. Cet homologue peut être obtenu par voie synthétique.
Typiquement, une protéine (ou un gène) homologue à une protéine de référence (ou un gène de référence) présente au moins 40%, au moins 45%, au moins 50%, au moins 55%, au moins 60%, au moins 65%, au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95% et/ou au moins 99% d'identité respectivement avec la séquence en acides aminés de la protéine de référence (ou la séquence nucléotidique du gène de référence). Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides aminés (ou entre deux séquences nucléotidiques), on entend, dans le cadre de la présente invention, un pourcentage de résidus d'acides aminés (ou de nucléotides) identiques entre les deux séquences comparées, ce pourcentage étant obtenu après mise en œuvre du meilleur alignement (alignement optimum) entre les deux séquences. L'homme du métier connaît différentes techniques permettant d'obtenir un tel pourcentage d'identité et impliquant des algorithmes d'homologie ou des programmes d'ordinateur tels que le programme BLAST.
Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une ou plusieurs activité(s) enzymatique(s) augmentée(s) par comparaison au même micro organisme non modifié et au moins une activité enzymatique diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de certaines enzymes est augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié et l'activité intracellulaire d'au moins une autre enzyme est diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.
Dans la présente invention, le terme « activité » d'une enzyme est utilisé de façon interchangeable avec le terme « fonction » et désigne la réaction qui est catalysée par l'enzyme. L'homme du métier connaît différentes techniques pour mesurer l'activité enzymatique d'une enzyme donnée. La partie expérimentale ci-après présente différents essais enzymatiques utilisables pour mesurer l'activité d'enzymes impliquées dans la présente invention.
Dans le cadre de la présente invention, l'expression « activité augmentée » appliquée à une enzyme désigne une activité catalytique spécifique de l'enzyme augmentée et/ou une quantité ou disponibilité augmentée de l'enzyme dans la cellule.
Dans le cadre de la présente invention, une activité enzymatique augmentée dans le micro-organisme recombinant doit s'entendre comme une activité enzymatique qui est augmentée par un facteur d'au moins 2, notamment d'au moins 5, en particulier, d'au moins 10 et, plus particulièrement, d'au moins 20 par rapport à l'activité enzymatique du même micro-organisme non modifié.
L'homme du métier connaît différentes techniques de microbiologie et de biologie moléculaire utilisables pour obtenir, dans un micro-organisme donné, l'augmentation d'une activité enzymatique.
En effet, une augmentation de l'activité enzymatique peut être obtenue (ia) en augmentant le nombre de copies du gène codant l'enzyme dans le micro-organisme, (iia) en augmentant l'expression du gène codant l'enzyme dans le micro-organisme, par exemple, en modifiant le promoteur, les régions régulatrices et/ou le site de fixation du ribosome, (iiia) en modifiant la séquence du gène codant l'enzyme de façon à obtenir une forme plus active ou plus résistante à l'inhibition et, éventuellement, (iva) en combinant au moins deux des alternatives (ia), (iia) et (iiia).
En ce qui concerne l'alternative (ia) ci-dessus, le gène peut être codé de manière chromosomique ou extrachromosomique. Lorsque le gène est localisé sur le chromosome, plusieurs copies du gène peuvent être introduites sur le chromosome par des méthodes de recombinaison, connues de l'homme du métier (y compris via le remplacement de gènes). Lorsque le gène est localisé de manière extra-chromosomique, il peut être porté par un vecteur d'expression recombinant.
Par « vecteur d'expression recombinant », on entend un acide nucléique adapté pour l'expression, dans un micro-organisme, d'au moins une enzyme codée par une séquence nucléotidique contenue dans ce vecteur. Le vecteur d'expression selon la présente invention comprend, en plus de la séquence nucléotidique codant une enzyme d'intérêt, un (ou plusieurs) élément(s) qui permet(tent) l'expression i.e. la transcription et la traduction de cette séquence nucléotidique.
Le vecteur d'expression mis en œuvre dans la présente invention est avantageusement choisi parmi un plasmide, un cosmide, un bactériophage et un virus tel qu'un baculovirus. En particulier, le vecteur de l'invention est un vecteur à réplication autonome comportant des éléments permettant son maintien et sa réplication dans le micro-organisme comme une origine de réplication. En outre, le vecteur peut comporter des éléments permettant sa sélection dans le micro-organisme. Ces éléments sont également connus sous le terme de « marqueurs de sélection ». De tels vecteurs d'expression sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
Un vecteur d'expression peut en outre présenter un ou plusieurs élément(s) choisi(s) parmi un promoteur, un amplificateur également connu sous le terme anglais de « enhancer », un signal 3' UTR (pour « UnTranslated Région »), un signal 1RES (pour « Internai Ribosome Entry Site »), un site de fixation du ribosome (en anglais RBS, pour « Ribosome Binding Site »), un signal de terminaison de la transcription comprenant un site de clivage et un signal polyA (pour « signal de polyadénylation »). Le vecteur d'expression selon l'invention peut comprendre 2, 3 ou 4 éléments listés ci-dessus. L'homme du métier est capable de choisir, dans cette liste, le ou les élément(s) additionnel(s) que peut comprendre le vecteur d'expression en fonction du micro organisme dans lequel l'expression doit être réalisée.
Par « marqueur de sélection », on entend un marqueur choisi parmi un marqueur de sélection utilisable chez les procaryotes ou chez les eucaryotes tel qu'un gène bactérien de résistance à un antibiotique et un gène du métabolisme à utiliser avec un micro-organisme auxotrophe i.e. un gène de sélection qui assure la complémentation avec le gène respectif délété au niveau du génome du micro-organisme hôte. Ainsi, le vecteur d'expression selon la présente invention peut contenir un gène bactérien de résistance à un antibiotique comme l'amoxicilline, l'ampicilline, la phléomycine, la kanamycine, le chloramphénicol, la néomycine, l'hygromycine, la généticine (ou G418), la carboxine, la nourséothricine ou le triclosan. A titre d'exemples illustratifs de gènes du métabolisme, on peut citer le gène trpl à utiliser avec un micro-organisme dépourvu de l'enzyme phosphoribosylanthranilate isomérase tel qu'une levure trpl ou le gène URA3 à utiliser avec un organisme eucaryote dépourvu de l'enzyme orotidine 5-phosphate décarboxylase tel qu'une levure ura3 .
Par « promoteur », on entend, dans le cadre de la présente invention, aussi bien un promoteur, constitutif ou inductible, adapté pour tout micro-organisme tel que précédemment défini qu'un promoteur, constitutif ou inductible, spécifique d'un groupe de micro-organismes particuliers. Le promoteur utilisable peut être homologue ou hétérologue. Un promoteur constitutif utilisable dans le cadre de la présente invention est notamment choisi parmi le promoteur proD, le promoteur proC, le promoteur 35S, le promoteur 19S et le promoteurTEV (pour « Tobacco Etch Virus »). Un promoteur inductible utilisable dans le cadre de la présente invention peut être le promoteur GAL1 inductible par le galactose, le promoteur AOX1 inductible par le méthanol, le promoteur PAllac0-l inductible par l'isopropyl b-D-l-thiogalactopyranoside (IPTG), le promoteur hybride pTac inductible par l'IPTG ; le promoteur MET15 inductible par déplétion en méthionine ou le promoteur CUP1 inductible par les ions cuivre. Dans le vecteur mis en œuvre dans la présente invention, le promoteur peut être associé à une ou plusieurs séquences régulatrices transcriptionnelles que sont les amplificateurs.
Avantageusement, le vecteur d'expression mis en œuvre dans la présente invention comprend, liés entre eux de façon opérationnelle, un promoteur, une séquence nucléotidique codant une enzyme d'intérêt et un signal de terminaison de la transcription comprenant un site de clivage et/ou un signal polyA. On entend par « liés entre eux de façon opérationnelle » selon l'invention, des éléments liés entre eux de façon à ce que le fonctionnement d'un des éléments soit affecté par celui d'un autre. A titre d'exemple, un promoteur est lié de façon opérationnelle à une séquence codante lorsqu'il est capable d'affecter l'expression de cette dernière. Les éléments régulateurs de la transcription, de la traduction et de la maturation des peptides que le vecteur peut comprendre sont connus de l'homme du métier et ce dernier est capable de les choisir en fonction du micro organisme hôte dans lequel l'expression ou le clonage doivent être réalisés.
Par ailleurs, l'homme du métier connaît, comme vecteur d'expression, différents types de plasmides qui diffèrent par leur origine de réplication et donc par leur nombre de copies dans la cellule. Typiquement, ces plasmides sont présents dans le micro organisme en 10 à 15 copies, ou en environ 30 à 50 copies, voire jusqu'à 100 copies, selon la nature du plasmide: plasmides à faible nombre de copies avec réplication étroite, plasmides à nombre moyen de copies ou des plasmides à grand nombre de copies. A titre d'exemples de plasmides utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer les plasmides pSClOl, RK2, pACYC, pRSFIOlO, pZ et pSK bluescript II.
Typiquement, l'alternative (iia) ci-dessus consiste à utiliser un promoteur induisant un haut niveau d'expression du gène endogène. En fonction de la nature et des propriétés du promoteur endogène, l'homme du métier saura déterminer quel promoteur, homologue ou hétérologue, inductible ou constitutif, utiliser pour remplacer ledit promoteur endogène. En variante, l'alternative (iia) peut consister à atténuer l'activité ou l'expression d'un répresseur de transcription, spécifique ou non spécifique du gène endogène.
Dans le cadre de la présente invention, l'expression « activité diminuée » ou « activité réduite » appliquée à une enzyme désigne une activité catalytique spécifique de l'enzyme réduite et/ou une quantité ou disponibilité diminuée de l'enzyme dans la cellule.
Dans le cadre de la présente invention, une activité enzymatique diminuée dans le micro-organisme recombinant doit s'entendre comme une activité enzymatique qui est réduite par un facteur d'au plus 0,5, notamment d'au plus 0,1, en particulier, d'au plus 0,01 et, plus particulièrement, d'au plus 0,001 par rapport à l'activité enzymatique du même micro-organisme non modifié. L'homme du métier connaît différentes techniques de microbiologie et de biologie moléculaire utilisables pour obtenir, dans un micro-organisme donné, la diminution d'une activité enzymatique.
En effet, une diminution de l'activité enzymatique peut être obtenue (id) en diminuant l'expression du gène codant l'enzyme dans le micro-organisme, par exemple, en modifiant le promoteur, les régions régulatrices et/ou le site de fixation du ribosome, (iid) en modifiant la séquence du gène codant l'enzyme de façon à obtenir une expression réduite du gène et/ou l'expression d'une enzyme dont l'activité est réduite, (iiid) en utilisant des éléments déstabilisants l'ARNm obtenu suite à la transcription du gène et, éventuellement, (ivd) en inactivant le gène notamment par délétion totale ou partielle dudit gène, par délétion totale ou partielle du promoteur empêchant toute expression du gène et/ou par insertion d'un élément génique externe dans la région codante du gène ou dans la région du promoteur. A noter que, dans certaines formes de l'alternative (ivd) et notamment dans le cas d'une délétion totale du gène, il est possible de n'avoir aucune activité enzymatique résiduelle. En d'autres termes, dans l'alternative (ivd), l'activité enzymatique est éteinte.
Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de conversion du D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose-5-phosphate, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui convertit le D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose-5- phosphate dans le micro-organisme recombinant est augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié.
L'enzyme (E,) qui convertit le D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose-5- phosphate se présente sous forme d'une D-arabinose-5-phosphate isomérase (EC 5.3.1.13). Une telle enzyme est également connue en tant que « D-arabinose-5-phosphate aldose-kétose-isomérase », « arabinose phosphate isomérase », « D-arabinose-5- phosphate ketol-isomerase » et « phosphoarabinoisomerase ». Toutes ces désignations font référence à la même enzyme et sont utilisables de façon interchangeable. Ainsi, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de conversion du D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose-5-phosphate catalysée par une enzyme consistant en une D-arabinose-5-phosphate isomérase qui convertit le D- ribulose-5-phosphate en D-arabinose-5-phosphate, augmentée par rapport au même micro-organisme non modifié.
Avantageusement, l'enzyme (E,) est codée par le gène kdsD de E. coli ou par un homologue d'un tel gène. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène kdsD de E. coli code une protéine capable de convertir le D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose-5-phosphate. A titre d'exemple particulier de gène kdsD de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise entre les nucléotides 2829813 et 2830778 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI (pour « National Center for Biotechnology Information ») https://www.ncbi, nim.nib.gov/ et correspondant au génome complet de la souche K12 MG1655. La séquence de la protéine de 321 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_417188.4 et correspond à la séquence SEQ. ID NO: 1 dans le listage de séquences annexé.
Toutes les variantes précédemment envisagées pour augmenter une activité enzymatique sont utilisables pour augmenter l'activité de l'enzyme (E,) qui convertit le D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose-5-phosphate.
Typiquement, dans le micro-organisme recombinant selon l'invention, l'augmentation de l'activité de conversion du D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose-5- phosphate catalysée par une enzyme consistant en une D-arabinose-5-phosphate isomérase est obtenue en augmentant le nombre de copies d'un gène codant cette enzyme dans le micro-organisme et/ou en augmentant l'expression d'un gène codant cette enzyme dans le micro-organisme. En particulier, le micro-organisme recombinant objet de la présente invention présente une surexpression d'un gène codant une D-arabinose-5- phosphate isomérase qui convertit le D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose-5- phosphate. Plus particulièrement, le micro-organisme recombinant objet de la présente invention présente une surexpression du gène kdsD de E. coli ou d'un homologue de celui-ci.
Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de clivage aldolique du D-arabinose-5-phosphate en D-glycéraldéhyde-3-phosphate et glycolaldéhyde, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui catalyse le clivage du D-arabinose- 5-phosphate en D-glycéraldéhyde-3-phosphate et glycolaldéhyde dans le micro-organisme recombinant est augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié.
L'enzyme (En) qui catalyse le clivage du D-arabinose-5-phosphate en D- glycéraldéhyde-3-phosphate et glycolaldéhyde se présente sous forme d'une fructose-6- phosphate aldolase (EC 4.1.2.-) [14].
Ainsi, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de clivage aldolique du D-arabinose-5-phosphate en D-glycéraldéhyde-3- phosphate et glycolaldéhyde catalysée par une enzyme consistant en une fructose-6- phosphate aldolase qui catalyse le clivage du D-arabinose-5-phosphate en D- glycéraldéhyde-3-phosphate et glycolaldéhyde, augmentée par rapport au même micro organisme non modifié.
Avantageusement, l'enzyme (En) est codée par le gène /sa de E. coli ou par un homologue d'un tel gène. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène/sa de E. coli code une protéine capable de catalyser le clivage du D-arabinose-5-phosphate en D-glycéraldéhyde-3-phosphate et glycolaldéhyde. A titre d'exemples particuliers de gène/sa de E. coli, on peut citer :
- le gène fsaA de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise entre les nucléotides 863642 et 864304 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 220 acides aminés (FSAA), codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_415346.4 et correspond à la séquence SEQ. ID NO: 2 dans le listage de séquences annexé et - le gèn e fsaB de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 4139046 et 4139708 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 220 acides aminés (FSAB), codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_418381.1 et correspond à la séquence SEQ. ID NO: 3 dans le listage de séquences annexé.
A titre d'exemples particuliers d'homologue d'un gène /sa de E. coli, on peut citer les gènes codant les fructose-6-phosphate aldolases variantes FSAA L107Y/A129G et FSAA A129T/A165G décrites par Szekrenyi et al, 2014 [15].
Toutes les variantes précédemment envisagées pour augmenter une activité enzymatique sont utilisables pour augmenter l'activité de l'enzyme (En) qui catalyse le clivage du D-arabinose-5-phosphate en D-glycéraldéhyde-3-phosphate et glycolaldéhyde.
Typiquement, dans le micro-organisme recombinant selon l'invention, l'augmentation de l'activité de clivage aldolique du D-arabinose-5-phosphate en D- glycéraldéhyde-3-phosphate et glycolaldéhyde catalysée par une enzyme consistant en une fructose-6-phosphate aldolase est obtenue en augmentant le nombre de copies d'un gène codant cette enzyme dans le micro-organisme et/ou en augmentant l'expression d'un gène codant cette enzyme dans le micro-organisme. En particulier, le micro-organisme recombinant objet de la présente invention présente une surexpression d'un gène codant une fructose-6-phosphate aldolase qui catalyse le clivage du D-arabinose-5-phosphate en D-glycéraldéhyde-3-phosphate et glycolaldéhyde.
Plus particulièrement, le micro-organisme recombinant objet de la présente invention présente une surexpression du gène /sa de E. coli ou d'un homologue de celui-ci.
Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité d'oxydation du glycolaldéhyde en glycolate, augmentée par comparaison au même micro organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui oxyde le glycolaldéhyde en glycolate dans le micro-organisme recombinant est augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié.
L'enzyme (EM,) qui oxyde le glycolaldéhyde en glycolate se présente sous forme d'une glycolaldéhyde déshydrogénase et notamment d'une glycoaldéhyde déshydrogénase dont l'activité requiert la présence du cofacteur NAD+ (EC 1.2.1.21).
Ainsi, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité d'oxydation du glycolaldéhyde en glycolate catalysée par une enzyme consistant en une glycolaldéhyde déshydrogénase qui oxyde le glycolaldéhyde en glycolate, augmentée par rapport au même micro-organisme non modifié.
Avantageusement, l'enzyme (EM,) est codée par le gène aldA de E. coli ou par un homologue d'un tel gène. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène aldA de E. coli code une protéine capable d'oxyder le glycolaldéhyde en glycolate en présence d'un cofacteur comme, par exemple, NAD+. A titre d'exemple particulier de gène aldA de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise entre les nucléotides 1488232 et 1489671 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 479 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_415933.1 et correspond à la séquence SEQ. ID NO: 4 dans le listage de séquences annexé.
Toutes les variantes précédemment envisagées pour augmenter une activité enzymatique sont utilisables pour augmenter l'activité de l'enzyme (Em) qui oxyde le glycolaldéhyde en glycolate.
Typiquement, dans le micro-organisme recombinant selon l'invention, l'augmentation de l'activité d'oxydation du glycolaldéhyde en glycolate catalysée par une enzyme consistant en une glycolaldéhyde déshydrogénase est obtenue en augmentant le nombre de copies d'un gène codant cette enzyme dans le micro-organisme et/ou en augmentant l'expression d'un gène codant cette enzyme dans le micro-organisme. En particulier, le micro-organisme recombinant objet de la présente invention présente une surexpression d'un gène codant une glycolaldéhyde déshydrogénase qui oxyde le glycolaldéhyde en glycolate. Plus particulièrement, le micro-organisme recombinant objet de la présente invention présente une surexpression du gène aldA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci.
En particulier, le micro-organisme recombinant selon la présente invention comprend :
- soit au moins un plasmide présentant la séquence du gène KdsD de E. coli ou d'un homologue de celui-ci, la séquence du gène /sa de E. coli ou d'un homologue de celui-ci et la séquence du gène aldA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci, lesdites séquences étant éventuellement clonées en opéron,
- soit au moins deux plasmides, de nature identique mais possédant des origines de réplication compatibles ou de nature différente, l'un présentant deux séquences, éventuellement clonées en opéron, choisies parmi la séquence du gène kdsD de E. coli ou d'un homologue de celui-ci, la séquence du gène fsa de E. coli ou d'un homologue de celui-ci et la séquence du gène aldA de E. coli ou d'un homologue de celui- ci et l'autre plasmide la troisième de ces séquences. Dans cette variante, on peut avoir (fsa + aldA) sur un plasmide et kdsD sur l'autre ; (fsa + kdsD) sur un plasmide et aldA sur l'autre ou encore (kdsD + aldA) sur un plasmide et fsa sur l'autre ;
- soit au moins trois plasmides, identiques ou différents, présentant chacun une séquence différente choisie parmi la séquence du gène kdsD de E. coli ou d'un homologue de celui-ci, la séquence du gène/sa de E. coli ou d'un homologue de celui-ci et la séquence du gène aldA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci.
Tout ce qui a été précédemment décrit sur les plasmides s'applique au ou aux plasmide(s) contenu(s) dans le micro-organisme recombinant objet de l'invention.
Plus particulièrement, le micro-organisme recombinant objet de l'invention comprend :
a) un premier plasmide dans lequel se trouvent la séquence du gène kdsD de E. coli ou d'un homologue de celui-ci et la séquence du gène fsa de E. coli ou d'un homologue de celui-ci, lesdites séquences étant clonées en opéron et sous le contrôle d'un premier promoteur inductible ou constitutif et b) un second plasmide dans lequel se trouve la séquence du gène aldA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci sous le contrôle d'un second promoteur inductible ou constitutif,
lesdits premier et second promoteurs étant identiques ou différents.
Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité d'oxydation du glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3-bisphosphoglycérate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui oxyde le glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3- bisphosphoglycérate dans le micro-organisme recombinant est diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.
L'enzyme (EjV) qui oxyde le glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3- bisphosphoglycérate se présente sous forme d'une glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase et notamment d'une glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase dont le cofacteur est NAD+ (EC 1.2.1.12). Une telle enzyme est également connue en tant que « D-glycéraldéhyde-3-phosphate:NAD+ oxydoréductase ». Ces deux désignations font référence à la même enzyme et sont utilisables de façon interchangeable.
Ainsi, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité d'oxydation du glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3-bisphosphoglycérate catalysée par une enzyme consistant en une glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase qui oxyde le glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3-bisphosphoglycérate, diminuée par rapport au même micro-organisme non modifié.
Avantageusement, l'enzyme (E,n) est codée par le gène gapA de E. coli ou par un homologue d'un tel gène. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène gapA de E. coli code une protéine capable d'oxyder le glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3-bisphosphoglycérate en présence d'un cofacteur comme, par exemple, NAD+. A titre d'exemple particulier de gène gapA de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise entre les nucléotides 1862771 et 1863766 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 331 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_416293.1 et correspond à la séquence SEQ. ID NO: 5 dans le listage de séquences annexé.
Toutes les variantes précédemment envisagées pour diminuer une activité enzymatique sont utilisables pour diminuer l'activité de l'enzyme (EjV) qui oxyde le glycolaldéhyde en glycolate.
Typiquement, dans le micro-organisme recombinant selon l'invention, la diminution de l'activité d'oxydation du glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3- bisphosphoglycérate catalysée par une enzyme consistant en une glycéraldéhyde-3- phosphate déshydrogénase est obtenue en diminuant l'expression du gène codant cette enzyme et/ou en inactivant le gène codant cette enzyme.
Dans une forme de mise en œuvre particulière, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, l'expression du gène gapA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est diminuée mais non inactivée par rapport au micro-organisme non modifié. Dans ce cas, l'atténuation de l'activité gapA permet la croissance et, en même temps, la production d'acide glycolique. Toutefois, le maintien d'une glycolyse résiduelle ne permet pas d'atteindre le rendement maximum.
Dans une forme de mise en œuvre variante, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, l'expression du gène gapA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est inactivée par rapport au micro-organisme non modifié. Dans ce cas, la croissance et la production d'acide glycolique sont découplées. L'inactivation de gapA nécessite que le micro-organisme recombinant selon l'invention ait, un substrat de croissance, contenant, en plus des pentoses et/ou des hexoses, des composés en C2, C3 ou C4 comme de l'acétate, du pyruvate, du malate ou du succinate ou qui entrent dans le métabolisme après le glycéraldéhyde-3-phosphate (GAP).
Avantageusement, le microorganisme recombinant selon la présente invention est modifié au niveau du transport de glucose en ce sens que le système phosphotransférase (PTS), qui dépend du phosphoénolpyruvate (PEP) est inactivé, alors qu'une activité de transport de glucose codée par galP de E. coli ou g If de Zymomonas mobilis ou un de leurs homologues et une activité de transformation du glucose en glucose- 6-phosphase sont augmentées par comparaison au même micro-organisme non modifié. Cette modification permet l'assimilation du D-glucose et du D-xylose [8, 16, 17].
Pour rappel, chez E. coli, le système phosphotransférase (PTS), qui dépend du phosphoénolpyruvate (PEP) est le système le plus efficace pour le transport du glucose. L'activité du système PTS a un effet sur la distribution du flux de carbone et joue un rôle clé dans la répression du catabolisme du carbone. Le système PTS cytoplasmique est codé par l'opéron ptsHIcrr. La délétion de l'opéron ptsHIcrr notamment dans E. coli est la stratégie la plus couramment employée pour inactiver le système PTS.
Le phénotype PTS se caractérise par une capacité très limitée de transport et de phosphorylation du glucose. Dans une souche PTS , le PEP n'est pas nécessaire à la phosphorylation du glucose. La glucokinase catalyse la phosphorylation-ATP dépendante du glucose dans le cytoplasme. La surexpression de la galactose perméase (GalP) pour le transport du glucose et de la glucokinase (Glk) pour la phosphorylation restaure le phénotype PTS+ [18]. Une autre stratégie est de surexprimer les gènes gifzm et glkzm codant respectivement pour un transporteur facilité du glucose (Gif) et la glucokinase de Zymomonas mobilis dans E. coli [19].
Ainsi, dans le micro-organisme recombinant selon la présente invention, une activité de transport et de phosphorylation du glucose à partir du phosphoénolpyruvate par le système phosphotransférase phosphoénolpyruvate dépendant (PTS) est éteinte par comparaison au même micro-organisme non modifié.
A titre d'exemple particulier, l'inactivation du système PTS cytoplasmique codé par l'opéron ptsHIcrr chez E. coli conduit à la délétion des gènes :
- ptsH de l'opéron ptsHIcrr codant la protéine phosphohistidine Hpr, porteuse de phosphate, du système PTS. A titre d'exemple plus particulier de gène ptsH de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12-MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 2533764 et 2534021 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site NCBI. La séquence de la protéine de 85 acides aminés codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_416910.1 et correspond à la séquence SEQ. ID NO: 6 dans le listage de séquences annexé. - ptsl de l'opéron ptsHlcrr codant l'enzyme I du système PTS (EC 2.7.3.9). A titre d'exemple plus particulier de gène ptsl de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12-MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 2534066 et 2535793 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site NCBI. La séquence de la protéine de 575 acides aminés codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_416911.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 7 dans le listage de séquences annexé.
- crr de l'opéron ptsHlcrr codant l'enzyme MA du complexe II du système PTS (EC 2.7.1.69). A titre d'exemple plus particulier de gène crr de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12-MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 2535834 et 2536343 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site NCBI. La séquence de la protéine de 169 acides aminés codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_416912.1 et correspond à la séquence SEQ. ID NO: 8 dans le listage de séquences annexé.
Avantageusement, la délétion du gène ptsG du système PTS, qui n'appartient pas à l'opéron ptsHlcrr, est également requise, car PtsG est fortement impliquée dans la répression catabolique chez E. coli. Les mutants PtsG sont capables de consommer simultanément le glucose, l'arabinose et le xylose tandis qu'une souche sauvage consomme le glucose puis l'arabinose et enfin le xylose de façon séquentielle [20]. Le gène ptsG code un large domaine hydrophobe II B/C du complexe II du système PTS. A titre d'exemple plus particulier de gène ptsG de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12-MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 1157869 et 1159302 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site NCBI. La séquence de la protéine de 477 acides aminés codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_415619.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 9 dans le listage de séquences annexé.
Le gène galP de E. coli code une galactose perméase. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène galP de E. coli code une protéine du type galactose perméase. A titre d'exemple particulier de gène galP de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise entre les nucléotides 3088284 et 3089678 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 464 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_417418.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 10 dans le listage de séquences annexé.
Le gène glf de Z mobilis code un transporteur du glucose. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène glf de Z. mobilis code un transporteur du glucose. A titre d'exemple particulier de gène glf de Z mobilis, on peut citer le gène de la souche ATCC 31821 / ZM4 / CP4 qui code la protéine de 473 acides aminés référencée, sur le site UniProtKB (http://www.uniprot.org/), séquence P21906 et correspondant à la séquence SEQ. ID NO: 11 dans le listage de séquences annexé.
Avantageusement, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de transformation du glucose en glucose-6-phosphase, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui transforme le glucose en glucose-6-phosphase dans le micro-organisme recombinant est augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié. L'enzyme qui transforme le glucose en glucose-6-phosphase se présente sous forme d'une glucokinase (EC 2.7.1.2).
Ainsi, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de transformation du glucose en glucose-6-phosphase catalysée par une enzyme consistant en une glucokinase qui transforme le glucose en glucose-6-phosphase, augmentée par rapport au même micro-organisme non modifié.
Avantageusement, cette enzyme est codée par le gène glK de E. coli ou par un homologue d'un tel gène. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène glK de E. coli code une protéine capable de transforme le glucose en glucose-6-phosphase. A titre d'exemple particulier de gène glK de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise entre les nucléotides 2508461 et 2509426 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 321 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_416889.1 et correspond à la séquence SEQ. ID NO: 12 dans le listage de séquences annexé.
Toutes les variantes précédemment envisagées pour augmenter une activité enzymatique sont utilisables pour augmenter l'activité de transporteur de glucose et l'activité de transformation du glucose en glucose-6-phosphase.
Typiquement, dans le micro-organisme recombinant selon l'invention, l'augmentation du transport de glucose catalysé par une enzyme consistant en un transporteur du glucose ou en une galactose perméase est obtenue en augmentant le nombre de copies d'un gène codant cette enzyme dans le micro-organisme et/ou en augmentant l'expression d'un gène codant cette enzyme dans le micro-organisme. En particulier, le micro-organisme recombinant objet de la présente invention présente une surexpression d'un gène codant un transporteur du glucose et/ou une surexpression d'un gène codant une galactose perméase qui catalyse le transport du glucose. De plus, dans le micro-organisme recombinant selon l'invention, l'augmentation de la transformation du glucose en glucose-6-phosphate catalysée par une enzyme consistant en une glucokinase qui transforme le glucose en glucose-6-phosphase est obtenue en augmentant le nombre de copies d'un gène codant cette enzyme dans le micro-organisme et/ou en augmentant l'expression d'un gène codant cette enzyme dans le micro-organisme. En particulier, le micro-organisme recombinant objet de la présente invention présente une surexpression d'un gène codant une glucokinase qui transforme le glucose en glucose-6-phosphase.
Plus particulièrement, le micro-organisme recombinant objet de la présente invention présente une surexpression du gène aldA de E. coli ou du gène glf de Z. mobilis ou d'un de leurs homologues et une surexpression du gène glK de E. coli ou d'un homologue de celui-ci. A cet effet, dans le micro-organisme recombinant selon l'invention, les gènes ci-dessus listés sont sous la dépendance d'un promoteur constitutif fort comme le promoteur proD.
Avantageusement, afin d'optimiser encore la production d'acide glycolique via la voie de synthèse non-naturelle selon l'invention, le micro-organisme recombinant objet de la présente invention peut présenter au moins une des caractéristiques suivantes :
v) une activité d'oxydation du glycolate en glyoxylate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;
vi) une répression des gènes impliqués dans la régulation du métabolisme respiratoire aérobie, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;
vii) une internalisation du glycolate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;
viii) une activité de formation irréversible de méthylglyoxal à partir de dihydroxyacétone, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;
ix) une activité de conversion du fructose-6-phosphate en fructose-1,6- biphosphate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;
x) une activité de production du D-ribose-l-phosphate à partir de dihydroxyacétone phosphate et de glycolaldéhyde, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ; et
xi) une activité d'oxydation du D-glucose-6-phosphate en 6-phospho D- glucono-l,5-lactone, modifiée par comparaison au même micro-organisme non modifié.
Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité d'oxydation du glycolate en glyoxylate, diminuée par comparaison au même micro organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui oxyde le glycolate en glyoxylate dans le micro-organisme recombinant est diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.
L'enzyme (Ev) qui oxyde le glycolate en glyoxylate se présente sous forme d'une glycolate déshydrogénase et notamment d'une glycolate déshydrogénase dont le cofacteur est NAD+ (EC 1.1.99.14). Une telle enzyme est également connue en tant que « glycolate oxydoréductase » et « glycolate oxydase ». Toutes ces désignations font référence à la même enzyme et sont utilisables de façon interchangeable.
Ainsi, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité d'oxydation du glycolate en glyoxylate catalysée par une enzyme consistant en une glycolate déshydrogénase qui oxyde le glycolate en glyoxylate, diminuée par rapport au même micro-organisme non modifié.
Avantageusement, l'activité glycolate déshydrogénase de E. coli est codée par les gènes glcDEF ou par un homologue de tels gènes. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue des gènes glcD, glcE et glcF de E. coli code une protéine capable d'oxyder le glycolate en glyoxylate en présence d'un cofacteur comme, par exemple, NAD+.
A titre d'exemple particulier de gène glcD de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 3126522 et 3128021 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 499 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_417453.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 13 dans le listage de séquences annexé.
A titre d'exemple particulier de gène glcE de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 3125470 et 3126522 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 350 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence YP_026191.1 et correspond à la séquence SEQ. ID NO: 14 dans le listage de séquences annexé.
A titre d'exemple particulier de gène glcF de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 3124236 et 3125459 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 407 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence YP_026190.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO : 15 dans le listage de séquences annexé.
Toutes les variantes précédemment envisagées pour diminuer une activité enzymatique sont utilisables pour diminuer l'activité glycolate déshydrogénase.
Typiquement, dans le micro-organisme recombinant selon l'invention, la diminution de l'activité d'oxydation du glycolate en glyoxylate catalysée par une enzyme consistant en une glycolate déshydrogénase est obtenue en diminuant l'expression du gène codant cette enzyme et/ou en inactivant le gène codant cette enzyme.
Plus particulièrement, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, l'expression des gènes glcD, glcE et glcF de E. coli ou d'homologues de ceux-ci est diminuée par rapport au micro-organisme non modifié. Dans une forme de mise en œuvre particulière, les gènes glcD, glcE et glcF de E. coli ou les homologues de ceux-ci sont délétés dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention afin de permettre l'accumulation de glycolate [21].
Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité respiratoire aérobie augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié et ce, en diminuant la répression des gènes impliqués dans la régulation du métabolisme respiratoire aérobie. Cette répression ne fait pas appel à une enzyme mais à un régulateur transcriptionnel.
Ainsi, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une répression des gènes impliqués dans la régulation du métabolisme respiratoire aérobie induite par un régulateur transcriptionnel apte à réprimer les gènes impliqués dans la régulation du métabolisme respiratoire aérobie, diminuée par rapport au même micro organisme non modifié.
Avantageusement, ce régulateur transcriptionnel est codé par le gène arcA de E. coli ou par un homologue d'un tel gène. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène arcA de E. coli code une protéine capable de réprimer les gènes impliqués dans le métabolisme respiratoire aérobie
[22]
A titre d'exemple particulier de gène arcA de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 4639590 et 4640306 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 238 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_418818.1 et correspond à la séquence SEQ. ID NO: 16 dans le listage de séquences annexé. Toutes les variantes précédemment envisagées pour diminuer une activité enzymatique sont utilisables, mutatis mutandis, pour diminuer l'activité du régulateur transcriptionnel réprimant les gènes impliqués dans le métabolisme respiratoire aérobie.
Typiquement, dans le micro-organisme recombinant selon l'invention, la diminution de la répression des gènes impliqués dans la régulation du métabolisme respiratoire aérobie induite par un régulateur transcriptionnel est obtenue en diminuant l'expression du gène codant ce régulateur et/ou en inactivant le gène codant ce régulateur.
Plus particulièrement, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, l'expression du gène arcA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est diminuée par rapport au micro-organisme non modifié. Dans une forme de mise en œuvre particulière, le gène arcA de E. coli ou l'homologue de celui-ci est délété dans le micro organisme recombinant objet de la présente invention.
Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une internalisation du glycolate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié. Cette internalisation fait appel à des protéines important le glycolate [23, 24, 25]
Ainsi, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une internalisation du glycolate induite par au moins une protéine important le glycolate, diminuée par rapport au même micro-organisme non modifié.
Avantageusement, des protéines sont codées par les gènes glcA, HdP ou yjcG de E. coli ou par des homologues de tels gènes. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, des homologues des gènes gicA, HdP ou yjcG de E. coli codent des protéines capables d'internaliser le glycolate.
A titre d'exemple particulier de gène glcA de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise entre les nucléotides 1157869 et 1159302 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 477 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_415619.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 17 dans le listage de séquences annexé.
A titre d'exemple particulier de gène lldP de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise entre les nucléotides 3777399 et 3779054 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 551 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_418060.1 et correspond à la séquence SEQ. ID NO: 18 dans le listage de séquences annexé.
A titre d'exemple particulier de gène yjcG de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 4283253 et 4284902 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 549 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_418491.1 et correspond à la séquence SEQ ID NO: 19 dans le listage de séquences annexé.
Toutes les variantes précédemment envisagées pour diminuer une activité enzymatique sont utilisables, mutatis mutandis, pour diminuer l'activité des protéines important le glycolate.
Typiquement, dans le micro-organisme recombinant selon l'invention, la diminution de l'internalisation du glycolate induite par une ou plusieurs protéine(s) important le glycolate est obtenue en diminuant l'expression du ou des gène(s) codant cette ou ces protéine(s) et/ou en inactivant le ou les gène(s) codant cette ou ces protéine(s).
Plus particulièrement, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, l'expression des gènes glcA, lldP ou yjcG de E. coli ou d'homologues de ceux-ci est diminuée par rapport au micro-organisme non modifié. En variante, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, les gènes gicA, lldP ou yjcG de E. coli ou d'homologues de ceux-ci sont délétés par rapport au micro-organisme non modifié. Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de formation irréversible de méthylglyoxal à partir de dihydroxyacétone phosphate (DHAP), diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui forme, de façon irréversible, le méthylglyoxal, composé cytotoxique, à partir de DHAP dans le micro-organisme recombinant est diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.
L'enzyme (EVm) qui forme, de façon irréversible, le méthylglyoxal à partir de DHAP se présente sous forme d'une méthylglyoxal synthase (EC 4.2.3.3) [26].
Ainsi, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de formation irréversible de méthylglyoxal à partir de DHAP catalysée par une enzyme consistant en une méthylglyoxal synthase qui forme, de façon irréversible, le méthylglyoxal à partir de DHAP, diminuée par rapport au même micro-organisme non modifié.
Avantageusement, l'enzyme (EVm) est codée par le gène mgsA de E. coli ou par un homologue d'un tel gène. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène mgsA de E. coli code une protéine capable de former, de façon irréversible, le méthylglyoxal à partir de DHAP. A titre d'exemple particulier de gène mgsA de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 1026557 et 1027015 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 152 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_415483.2 et correspond à la séquence SEQ. ID NO: 20 dans le listage de séquences annexé.
Toutes les variantes précédemment envisagées pour diminuer une activité enzymatique sont utilisables pour diminuer l'activité de l'enzyme (EVm) qui forme, de façon irréversible, le méthylglyoxal à partir de DHAP.
Typiquement, dans le micro-organisme recombinant selon l'invention, la diminution de formation irréversible de méthylglyoxal à partir de DHAP catalysée par une enzyme consistant en une méthylglyoxal synthase est obtenue en diminuant l'expression du gène codant cette enzyme et/ou en inactivant le gène codant cette enzyme. Plus particulièrement, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, l'expression du gène mgsA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est diminuée par rapport au micro-organisme non modifié. Dans une forme de mise en œuvre particulière, le gène mgsA de E. coli ou l'homologue de celui-ci est délété dans le micro organisme recombinant objet de la présente invention.
Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de conversion du fructose-6-phosphate en fructose-l,6-biphosphate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui convertit le fructose-6-phosphate en fructose-1,6- biphosphate, dans le micro-organisme recombinant est diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.
L'enzyme ( E,c) qui convertit le fructose-6-phosphate en fructose-1,6- biphosphate se présente sous forme d'une phosphofructokinase (EC 2.7.1.11).
Ainsi, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de conversion du fructose-6-phosphate en fructose-l,6-biphosphate catalysée par une enzyme consistant en une phosphofructokinase qui convertit le fructose-6-phosphate en fructose-l,6-biphosphate, diminuée par rapport au même micro-organisme non modifié.
Avantageusement, l'enzyme (E,c) est codée par le gène pfKA de E. coli ou par un homologue d'un tel gène. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène pfKA de E. coli code une protéine capable de convertir le fructose-6-phosphate en fructose-l,6-biphosphate. A titre d'exemple particulier de gène pfKA de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 4107552 et 4108514 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 320 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_418351.1 et correspond à la séquence SEQ. ID NO: 21 dans le listage de séquences annexé. Toutes les variantes précédemment envisagées pour diminuer une activité enzymatique sont utilisables pour diminuer l'activité de l'enzyme (EjX) qui convertit le fructose-6-phosphate en fructose-l,6-biphosphate.
Typiquement, dans le micro-organisme recombinant selon l'invention, la diminution de l'activité de conversion du fructose-6-phosphate en fructose-1,6- biphosphate catalysée par une enzyme consistant en une phosphofructokinase est obtenue en diminuant l'expression du gène codant cette enzyme et/ou en inactivant le gène codant cette enzyme.
Plus particulièrement, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, l'expression du gène pfKA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est diminuée par rapport au micro-organisme non modifié. Dans une forme de mise en œuvre particulière, le gène pfKA de E. coli ou l'homologue de celui-ci est délété dans le micro organisme recombinant objet de la présente invention et ce, éviter un cycle futile avec la fructose-l,6-biphosphate [27].
Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de production du D-ribose-l-phosphate à partir de dihydroxyacétone phosphate et de glycolaldéhyde, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui produit le D-ribose-l-phosphate à partir de dihydroxyacétone phosphate et de glycolaldéhyde, dans le micro-organisme recombinant est diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.
L'enzyme (Ex) qui produit le D-ribose-l-phosphate à partir de dihydroxyacétone phosphate et de glycolaldéhyde se présente sous forme d'une L- fuculose-phosphate aldolase (EC 4.1.2.17) [28].
Ainsi, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de production du D-ribose-l-phosphate à partir de dihydroxyacétone phosphate et de glycolaldéhyde catalysée par une enzyme consistant en une L-fuculose-phosphate aldolase qui produit le D-ribose-l-phosphate à partir de dihydroxyacétone phosphate et de glycolaldéhyde, diminuée par rapport au même micro-organisme non modifié. Avantageusement, l'enzyme (Ex) est codée par le gèn e fucA de E. coli ou par un homologue d'un tel gène. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gèn e fucA de E. coli code une protéine capable de produire du D-ribose-l-phosphate à partir de dihydroxyacétone phosphate et de glycolaldéhyde. A titre d'exemple particulier de gèn e fucA de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 2933041 et 2933688 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 215 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_417280.1 et correspond à la séquence SEQ. ID NO: 22 dans le listage de séquences annexé.
Toutes les variantes précédemment envisagées pour diminuer une activité enzymatique sont utilisables pour diminuer l'activité de l'enzyme (Ex) qui catalyse l'interconversion réversible du D-ribose-l-phosphate en dihydroxyacétone phosphate et glycolaldéhyde.
Typiquement, dans le micro-organisme recombinant selon l'invention, la diminution de l'activité de production du D-ribose-l-phosphate à partir de dihydroxyacétone phosphate et de glycolaldéhyde catalysée par une enzyme consistant en une L-fuculose-phosphate aldolase est obtenue en diminuant l'expression du gène codant cette enzyme et/ou en inactivant le gène codant cette enzyme.
Plus particulièrement, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, l'expression du gèn e fucA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est diminuée par rapport au micro-organisme non modifié. Dans une forme de mise en œuvre particulière, le gèn e fucA de E. coli ou l'homologue de celui-ci est délété dans le micro organisme recombinant objet de la présente invention.
Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de production du 6-phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate diminuée ou augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié. Dans un premier mode de réalisation, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de production du 6-phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme (EXi) qui produit le 6- phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate, dans le micro organisme recombinant est diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.
L'enzyme (EXj) qui produit le 6-phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate se présente sous forme d'une glucose-6-phosphate déshydrogénase NADP+ dépendante (EC 1.1.1.49) [29].
Ainsi, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de production du 6-phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6- phosphate catalysée par une enzyme consistant en une glucose-6-phosphate déshydrogénase cofacteur-dépendante qui produit le 6-phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate, diminuée par rapport au même micro-organisme non modifié.
Avantageusement, l'enzyme (EXi) est codée par le gène zwf de E. coli ou par un homologue de celui-ci. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène zwf de E. coli code une protéine capable de produire du 6- phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate en présence d'un cofacteur comme, par exemple, NADP+. A titre d'exemple particulier du gène zwf de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 1934839 et 1936314 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 491 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_416366 correspond à la séquence SEQ. ID NO: 23 dans le listage de séquences annexé.
Toutes les variantes précédemment envisagées pour diminuer une activité enzymatique sont utilisables pour diminuer l'activité de l'enzyme (Ex,) qui produit du 6-phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate. Typiquement, dans le micro-organisme recombinant selon l'invention, la diminution de l'activité de production du 6-phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D- glucose-6-phosphate catalysée par une enzyme consistant en une glucose-6-phosphate déshydrogénase cofacteur-dépendante est obtenue en diminuant l'expression du gène codant cette enzyme et/ou en inactivant le gène codant cette enzyme.
Plus particulièrement, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, l'expression du gène zwf de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est diminuée par rapport au micro-organisme non modifié. Dans une forme de mise en œuvre particulière, le gène zwf de E. coli ou l'homologue de celui-ci est délété dans le micro organisme recombinant objet de la présente invention.
Dans un second mode de réalisation, Le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de production du 6-phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme (EXi) qui produit le 6- phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate, dans le micro organisme recombinant est augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié.
Ainsi, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de production du 6-phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6- phosphate catalysée par une enzyme consistant en une glucose-6-phosphate déshydrogénase cofacteur-dépendante qui produit le 6-phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate, augmentée par rapport au même micro-organisme non modifié.
Toutes les variantes précédemment envisagées pour augmenter une activité enzymatique sont utilisables pour augmenter l'activité de l'enzyme (EXi) qui produit du 6-phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate.
Typiquement, dans le micro-organisme recombinant selon l'invention, l'augmentation de l'activité de production du 6-phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate catalysée par une enzyme consistant en une glucose-6-phosphate déshydrogénase cofacteur-dépendante est obtenue en augmentant le nombre de copies d'un gène codant cette enzyme dans le micro-organisme et/ou en augmentant l'expression d'un gène codant cette enzyme dans le micro-organisme. En particulier, le micro-organisme recombinant objet de la présente invention présente une surexpression d'un gène codant une glucose-6-phosphate déshydrogénase cofacteur-dépendante qui produit le 6- phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D-glucose-6-phosphate.
Plus particulièrement, le micro-organisme recombinant objet de la présente invention présente une surexpression du gène zwf de E. coli ou d'un homologue de celui-ci.
Dans ce second mode de réalisation, le micro-organisme recombinant objet de l'invention présente les caractéristiques suivantes :
xi) une activité d'oxydation du D-glucose-6-phosphate en 6-phospho D- glucono-l,5-lactone, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;
xii) une activité de formation de 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6- phosphate à partir de D-gluconate-6-phosphate, diminuée par comparaison au même microorganisme non modifié ; et
xiii) une activité de formation de glycéraldéhyde-3-phosphate et de pyruvate à partir 2 dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate, diminuée par comparaison au même organisme non modifié.
Dans ce second mode de réalisation, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de formation de 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate- 6-phosphate à partir de D-gluconate-6-phosphate diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui forme du 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate à partir de D-gluconate-6- phosphate, dans le micro-organisme recombinant est diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.
L'enzyme (EXÜ) qui produit du 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6- phosphate à partir de D-gluconate-6-phosphate se présente sous forme d'une phosphogluconate déshydratase (EC 4.2.1.12) [30]. Ainsi, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de formation de 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate à partir de D- gluconate-6-phosphate catalysée par une enzyme consistant en une phosphogluconate déshydratase qui produit du 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate à partir de D- gluconate-6-phosphate, diminuée par rapport au même micro-organisme non modifié.
Avantageusement, l'enzyme (EXÜ) est codée par le gène edd de E. coli ou par un homologue de celui-ci. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène edd de E. coli code une protéine capable de produire du 2- dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate à partir de D-gluconate-6-phosphate. A titre d'exemple particulier du gène edd de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 1932794 et 1934604 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI. La séquence de la protéine de 603 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence CAA45221 et correspond à la séquence SEQ. ID NO: 24 dans le listage de séquences annexé.
Typiquement, dans le micro-organisme recombinant selon l'invention, la diminution de l'activité d'oxydation du glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3- bisphosphoglycérate catalysée par une enzyme consistant en une glycéraldéhyde-3- phosphate déshydrogénase est obtenue en diminuant l'expression du gène codant cette enzyme et/ou en inactivant le gène codant cette enzyme.
Plus particulièrement, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, l'expression du gène edd de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est diminuée par rapport au micro-organisme non modifié. Dans une forme de mise en œuvre particulière, le gène edd de E. coli ou l'homologue de celui-ci est délété dans le micro organisme recombinant objet de la présente invention.
Dans ce second mode de réalisation, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de production du D-glycéraldéhyde-3-phosphate et du pyruvate à partir de 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié. En d'autres termes, l'activité intracellulaire de l'enzyme qui produit du D-glycéraldéhyde-3-phosphate et du pyruvate à partir de 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate, dans le micro-organisme recombinant est diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.
L'enzyme (Exm) qui produit du D-glycéraldéhyde-3-phosphate et du pyruvate à partir de 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate se présente sous forme d'une 2-dehydroxy-3-deoxy-phosphogluconate aldolase [31].
Ainsi, le micro-organisme recombinant selon l'invention présente une activité de production du D-glycéraldéhyde-3-phosphate et du pyruvate à partir de 2- dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate catalysée par une enzyme consistant en une 2-dehydroxy-3-deoxy-phosphogluconate aldolase qui produit du D-glycéraldéhyde-3- phosphate et du pyruvate à partir de 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate, diminuée par rapport au même micro-organisme non modifié.
Avantageusement, l'enzyme (EXiü) est codée par le gène eda de E. coli ou par un homologue de celui-ci. Sur la base de la définition d'« homologue » précédemment fournie, un homologue du gène edd de E. coli code une protéine capable de produire du D- glycéraldéhyde-3-phosphate et du pyruvate à partir de 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate- 6-phosphate. A titre d'exemple particulier de gène eda de E. coli, on peut citer le gène de la souche K12 MG1655 dont la séquence codante est comprise, sur le brin complémentaire, entre les nucléotides 1932115 et 1932756 dans la séquence NC_000913.3 accessible sur le site du NCBI . La séquence de la protéine de 213 acides aminés, codée par ce gène est référencée, sur le site du NCBI, séquence NP_416364.1 et correspond à la séquence SEQ. ID NO: 25 dans le listage de séquences annexé.
Typiquement, dans le micro-organisme recombinant selon l'invention, la diminution de l'activité de production du D-glycéraldéhyde-3-phosphate et du pyruvate à partir de 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate catalysée par une enzyme consistant en une 2-dehydroxy-3-deoxy-phosphogluconate aldolase est obtenue en diminuant l'expression du gène codant cette enzyme et/ou en inactivant le gène codant cette enzyme.
Plus particulièrement, dans le micro-organisme recombinant objet de la présente invention, l'expression du gène eda de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est diminuée par rapport au micro-organisme non modifié. Dans une forme de mise en œuvre particulière, le gène eda de E. coli ou l'homologue de celui-ci est délété dans le micro organisme recombinant objet de la présente invention.
La voie cyclique de synthèse d'acide glycolique à partir de principaux monosaccharides lignocellulosiques, avec une conservation optimale du carbone, conformément à la présente invention est représentée dans la Figure 2.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un micro organisme recombinant tel que précédemment défini pour la production d'acide glycolique à partir d'un milieu de culture comprenant, comme source de carbone, au moins un pentose et/ou au moins un hexose.
Ainsi, la présente invention concerne un procédé de production d'acide glycolique comprenant les étapes consistant à :
a) mettre en culture un micro-organisme recombinant tel que précédemment défini dans un milieu de culture comprenant, comme source de carbone, au moins un pentose et/ou au moins un hexose ; et
b) récupérer l'acide glycolique à partir du micro-organisme et/ou dans le milieu de culture.
Le procédé de production objet de la présente invention met en œuvre des étapes et dispositifs classiquement utilisés dans le domaine de la biofermentation.
Ainsi, dans l'étape (a) du procédé selon la présente invention, le micro organisme peut être cultivé dans un milieu de culture selon les techniques habituelles utilisées pour cultiver ce type de micro-organisme. Le milieu de culture peut être un milieu commercial ou un milieu préparé de façon extemporanée.
Avantageusement, le milieu de culture mis en œuvre dans le procédé de l'invention se présente sous forme d'un liquide stérile contenant une source de carbone, une source d'azote, une source de phosphate, des oligoéléments et éventuellement une source de soufre. Dans le cadre de la présente invention, la source de carbone comprend au moins un pentose et/ou au moins un hexose. A titre d'exemple, cette source de carbone peut comprendre au moins deux pentoses différents et au moins un hexose, notamment au moins du xylose, de l'arabinose et du glucose et, en particulier, du D-xylose, du L- arabinose et du D-glucose. Ces pentoses et hexose sont typiquement issus d'une matière carbonée renouvelable telle que de la biomasse végétale et, en particulier de la biomasse lignocellulosique.
La biomasse végétale est choisie dans le groupe constitué par les productions agricoles telles que des productions dédiées appelées « énergétiques » comme le miscanthus, le panic érigé (Panicum virgatum ou switchgrass) et les taillis à très courte rotation comme, par exemple, le peuplier ou le saule ; les résidus de productions agricoles tels que la paille des céréales, les cannes de maïs et les tiges de canne à sucre ; les productions forestières ; les résidus de productions forestières tels que les résidus de la transformation du bois.
Un des principaux éléments de la biomasse végétale est la lignocellulose, qui correspond au principal constituant de la paroi cellulaire végétale. La lignocellulose est composée à 75% de carbohydrates et son hydrolyse libère des sucres fermentescibles, majoritairement du D-glucose, D-xylose et L-arabinose [32].
Dans une première forme de mise en œuvre de l'étape (a) du procédé selon l'invention, le micro-organisme recombinant mis en culture est un micro-organisme recombinant tel que précédemment défini et dans lequel l'expression du gène gapA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est diminuée mais non inactivée par rapport au micro organisme non modifié. Dans cette première forme de mise en œuvre, la source de carbone mise en œuvre peut ne comprendre qu'un élément choisi parmi du D-glucose, du D-xylose, du L-arabinose et un de leurs mélanges. Par « mélange », on entend un mélange de D-glucose et de D-xylose, un mélange de D-glucose et de L-arabinose, un mélange de D- xylose et de L-arabinose et un mélange de D-glucose, de D-xylose et de L-arabinose.
Dans une seconde forme de mise en œuvre de l'étape (a) du procédé selon l'invention, le micro-organisme recombinant mis en culture est un micro-organisme recombinant tel que précédemment défini et dans lequel l'expression du gène gapA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est inactivée par rapport au micro-organisme non modifié. Dans cette seconde forme de mise en œuvre, la source de carbone mise en œuvre comprend, en plus du D-xylose et/ou du L-arabinose et/ou du D-glucose, un ou plusieurs composés en C2, C3 ou C4 choisis parmi le malate, le pyruvate, le succinate, l'acétate et un de leurs mélanges. Dans cette seconde forme de mise, le procédé de production d'acide glycolique se fait en deux phases, avec une première phase de production de biomasse, suivie d'une phase de production qui est déclenchée lorsque les composés en C2, C3 ou C4 arrivent à épuisement concourant à la bioconversion des hexoses et des pentoses en acide glycolique.
Dans la première et la seconde formes de mise en œuvre du procédé selon l'invention, la source de carbone mise en œuvre peut en outre comprendre au moins un autre élément carboné tel que du galactose, du xylose, du fructose, du lactose, du saccharose, du maltose, de la mélasse, de l'amidon et un hydrolysat d'amidon.
Des exemples de sources d'azote adaptées comprennent l'ammoniac, les sels d'ammonium comme le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, l'acétate d'ammonium et le phosphate d'ammonium, d'autres composés contenant de l'azote ; une peptone comme la tryptone ; un extrait de viande, un extrait de levure, une liqueur de maïs; un hydrolysat de caséine; une farine de soja et un hydrolysat de farine de soja.
L'homme du métier connaît différents exemples de sources de soufre, de sources de phosphate et d'oligoéléments utilisables lors de l'étape (a) du procédé selon l'invention. Il saura choisir, sans effort inventif, les sources et oligoéléments les mieux adaptés en fonction du micro-organisme recombinant cultive et des conditions de culture.
La température lors de la culture de l'étape (a) est typiquement comprise entre 15 et 45°C, et le pH durant cette culture est typiquement maintenu à une valeur comprise entre 3,0 et 9,0. Le pH peut être ajusté en utilisant, par exemple, un acide inorganique ou organique, une solution alcaline, de l'urée ou un carbonate de calcium.
A noter que, en fonction du micro-organisme cultivé, l'homme du métier saura adapter le milieu de culture et les conditions de culture aux exigences particulières de ce dernier, éventuellement au moyen de tests de routine. De ce fait, le micro-organisme recombinant se trouve, lors de l'étape (a) dans des conditions dans lesquelles il y a production d'acide glycolique à partir de la source de carbone telle que précédemment définie. Typiquement, cette culture est réalisée dans des conditions aérobies i.e. en présence d'oxygène.
Avantageusement, les micro-organismes recombinants sont cultivés sous forme de suspension. Une « suspension » de cellules s'entend, de façon générale, comme incluant tous les types de cultures cellulaires en suspension ou dispersées. L'expression « sous forme de suspension » est ainsi utilisée pour distinguer les cellules qui ne sont pas cultivées dans un milieu liquide, telles que les cellules cultivées en adhérant sur une boîte de Pétri. Par ailleurs, le terme « suspension » comprend à la fois des cellules librement dispersées et des cellules agglomérées, indépendamment du fait que l'agglomération puisse se produire spontanément ou non.
En variante, les micro-organismes recombinants peuvent être cultivés sous forme attachés à une phase solide telle que des microbilles, des billes, des capillaires, des fibres creuses, ces différents éléments étant typiquement en un matériau compatible avec le micro-organisme comme, par exemple, du dextrane, de la gélatine, du verre et de la cellulose.
De plus, les procédés de culture qui peuvent être utilisés lors de l'étape (a) du procédé selon la présente invention comprennent, mais sans y être limités, une culture discontinue, une culture continue ou une culture « fed-batch ».
Une « culture (cellulaire) continue » est une culture cellulaire caractérisée à la fois par un apport continu d'une alimentation liquide nutritive et un écoulement continu de liquide. En variante, une culture continue peut constituer une « culture de perfusion », auquel cas l'écoulement de liquide contient un milieu de culture qui est sensiblement dépourvu de cellules, ou une concentration cellulaire sensiblement inférieure à celle dans le bioréacteur. Dans une culture de perfusion, les cellules peuvent être retenues, par exemple, par filtration, centrifugation ou sédimentation.
Une culture « fed-batch » est une culture de cellules discontinue à laquelle un substrat, sous forme concentrée, solide ou liquide, est ajouté périodiquement ou de manière continue pendant l'analyse. Tout comme dans une culture discontinue, une culture « fed-batch » est initiée en inoculant des cellules au milieu, mais, contrairement à une culture discontinue, il y a un afflux subséquent de nutriments, comme par le biais d'une alimentation concentrée en nutriments. Contrairement à une culture continue, il n'y a pas d'élimination systématique de liquide provenant de la culture ou des cellules dans une culture « fed-batch ».
L'étape (a) du procédé selon l'invention peut être mise en œuvre dans tout récipient adapté à une culture cellulaire. A titre d'exemples particuliers, on peut citer un erlenmeyer, un bioréacteur ou un biofermenteur de différentes contenances. Des informations additionnelles sur ces différents récipients peuvent être trouvées dans [5].
Dans le procédé selon l'invention, les étapes (a) et (b) peuvent se dérouler l'une après l'autre ou, au contraire, simultanément. Avantageusement, lors de l'étape (b) du procédé selon l'invention, l'acide glycolique est récupéré dans le milieu de culture.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
La Figure 1 déjà citée présente les trois réactions clefs pour la production d'acide glycolique, isolées du métabolisme carboné central d'f. coli.
La Figure 2 déjà citée présente la voie non-naturelle pour la production d'acide glycolique à partir de D-glucose, de D-xylose et de L-arabinose.
La Figure 3 est une représentation schématique de l'essai enzymatique de vérification de l'activité de l'arabinose-5P isomérase (KdsD), la fructose-6P aldolase (FSA) et l'aldéhyde déshydrogénase (aldA). KdsD, FSA et aldA ont été purifiées, la triose phosphate isomérase (Tpi) et la glycérol-3P déshydrogénase (G3PDH) ont été commandées chez Sigma.
La Figure 4 présente le système comprenant 7 enzymes purifiées (AraA, AraB, AraD, RPE, KdsD, FSA, AldA) qui catalysent la conversion de L-arabinose en acide glycolique (Figure 4A). La production d'acide glycolique avec ce système en présence de L- arabinose a été comparée à celle avec un système ne présentant pas AraA ; la réactionenzymatique est basée sur le dosage de NADH à 340 nm (Figure 4B).
La Figure 5 présente le système comprenant 6 enzymes purifiées (XylA, XylB, RPE, KdsD, FSA, AldA) qui sont capables de convertir le D-xylose en acide glycolique (Figure 5A). La production d'acide glycolique avec ce système en présence de D-xylose a été comparée à celle avec un système ne présentant pas XylA ; la réaction enzymatique est basée sur le dosage de NADH à 340 nm (Figure 5B).
La Figure 6 présente le système comprenant 7 enzymes purifiées (Hxk, Pgi, Tkt, RPE, KdsD, FSA, AldA) qui sont capables de convertir le D-glucose en acide glycolique (Figure 6A). La production d'acide glycolique avec ce système en présence de D- glucose a été comparée à celle avec un système ne présentant pas Hxk ; le dosage enzymatique est basé sur le dosage de NADH à 340 nm (Figure 6B).
La Figure 7 présente la mise en évidence de la fonctionnalité in vivo de la voie non-naturelle selon l'invention dans E. coli MG1655 AtktA AtktB AglcD, avec en gras : la voie non-naturelle selon l'invention, en pointillés, les délétions. Xu5P : xylulose-5- phosphate, Ru5P : ribulose-5-phosphate, R5P : ribose-5-phosphate, S7P : sedoheptulose-7- phosphate, F6P : fructose-6-phosphate, F16BP : Fructose-l,6-bisphosphate, G6P : glucose- 6-phosphate, DHAP : dihydroxyacétone phosphate, Glyald : glycolaldéhyde, E4P : erythrose-4-phosphate, G3P : glyceraldéhyde-3-phosphate.
La Figure 8 présente la production d'acide glycolique de la souche d'f. coli MG1655 AtktA AtktB AglcD exprimant la voie non naturelle dépendante de kdsD-fsa-aldA selon l'invention à partir de D-xylose ou de L-arabinose, à 37°C, lOOh.
La Figure 9 présente la production d'acide glycolique de la souche d'f. coli WC3G AgapA AglcD AarcA AmgsA AfucA Apkf proD-galP exprimant la voie non-naturelle dépendante de kdsD-fsa-aldA selon l'invention à partir de glucose, xylose et arabinose, à 37°C, 50h. EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS
I. Preuve de faisabilité in vitro.
1.1. Matériel et Méthodes.
A. Construction de plasmides.
Pour construire un système in vitro, les inventeurs ont cloné les ORFs
(pour « Open Reading Frames ») des xylose isomérase (XylA), xylulokinase (XylB), arabinose isomérase (AraA), ribulose kinase (AraB), L-ribulose-5-phosphate 4-epimérase (AraD), ribulose-5-phosphate-3-epimérase (RPE), D-arabinose-5-phosphate isomérase (KdsD), fructose-6-phosphate aldolase (FSA correspondant à FSAA telle que précédemment définie) et aldéhyde déshydrogénase (AldA) d'E. coli K12 MG1655 avec une étiquette polyhistidine pour une purification facilitée. Les oligonucléotides utilisés pour l'amplification des ORF des enzymes d'E. coli sont listés dans le Tableau 3 ci-dessous, les séquences SEQ. ID NO: faisant référence au listage de séquences en annexe. L'ADN génomique d'E. coli qui a servi de matrice est celui de la souche K12-MG1655.
Les plasmides pour l'expression des protéines étiquetées polyhistidine en
C-terminal XylA, XylB, AraA, AraB, AraD, AraB, Rpe, KdsD, FSA, AldA ont été construits par HiFi assembly® (NEB) avec pET28a comme vecteur receveur. pET28a a été préalablement linéarisé avec les enzymes de restriction Hindlll et BamHI (NEB) (Tableau 4). La souche d'E. coli NEB5®, dérivée de DH5 alpha, a été utilisée pour le clonage et le stockage des différents plasmides.
Amorce Séquence de l'amorce
Gène
Sens ctggtgccgcgcggcagccat ATGCAAGCCT ATTTT G AC
(SEQ ID NO: 26) _
xylA
Antisens gtcgacggagctcgaattcgTTATTTGTCGAACAGATAATGG
(SEQ ID NO: 27) _
Sens ctggtgccgcgcggca gcca t ATGT ATATCG G G ATAG AT CTT G
(SEQ ID NO: 28) _
xylB
Antisens gtcga cggagctcga a ttcgTTACG CC ATT AAT G G C AG
(SEQ ID NO: 29) _
Sens ctggtgccgcgcggcagccatATGACGATTTTTGATAATTATGAAG
(SEQ ID NO: 30) _
ara A
Antisens gtcgacggagctcgaattcgTTAGCGACGAAACCCGTAATAC
(SEQ ID NO: 31) _
Sens ctggtgccgcgcggcagccat ATGG CG ATTGCAATTGG
(SEQ ID NO: 32) _
araB
Antisens gtcgacggagctcgaattcgTTATAGAGTCGCAACGGCC
(SEQ ID NO: 33) _
Sens ctggtgccgcgcggcagccatATGTTAGAAGATCTCAAACG
(SEQ ID NO: 34) _
araD
Antisens gtcgacggagctcgaattcgTTACTGCCCGTAATATGC
(SEQ ID NO: 35) _
Sens ctggtgccgcgcggcagccat AT G AAACAGT ATTTG ATTG C
(SEQ ID NO: 36) _
rpe
Antisens gtcgacggagctcgaattcgTTATTCATGACTTACCTTTGC
(SEQ ID NO: 37) _
Sens gccgcgcggcagccatat AT GT CG CACGT AG AGTT AC
(SEQ ID NO: 38) _
kdsD
Antisens gtcgacggagctcgaattcgTTACACTACGCCTGCACG
(SEQ ID NO: 39) _
Sens gccgcgcggcagccatatATGGAACTGTATCTGGATACTTC
(SEQ ID NO: 40) _
fsa
Antisens gtcgacggagctcgaattcgTTAAATCGACGTTCTGCC
(SEQ ID NO: 41) _
Sens ctggtgccgcgcggcagccatATGTCAGTACCCGTTCAAC
(SEQ ID NO: 42) _
aldA
Antisens gtcga cggagctcga a ttcgTT AAG ACTGTAAAT AAACC ACC
(SEQ ID NO: 43)
Tableau 3 Tableau 4 : Plasmides utilisés pour la démonstration de faisabilité in vitro
Nom Descriptif Référence pËT28
Kan R, ColEl ori Novagen ®
p VT- FSA
pET28 portant fsa Cette étude pVT-KDSD Cette étude
pET28 portant kdsD
pVT-ALDA Cette étude
pET28 portant aldA
pVT-RPE Cette étude
pET28 portant rpe
pVT-XYLA Cette étude
pET28 portant xy/A
pVT-XYLB Cette étude
pET28 portant xy/B
pVT-ARAA Cette étude
pET28 portant araA
pVT-ARAB Cette étude
pET28 portant araB
pVT-ARAD Cette étude
pET28 portant araC
B. Construction des souches.
Les cellules compétentes d'f. coli BL21 (DE3) ont été utilisées pour l'expression des protéines étiquetées puisque ces cellules expriment l'ARN polymérase T7, et sont donc compatibles avec le système d'expression T7 du vecteur pET28a. Les plasmides pET28a préalablement vérifiés par séquençage ont été transformés dans les BL21 (DE3) selon le protocole NEB. Les souches obtenues sont stockées dans 50% de glycérol à -80°C (Tableau 5).
Tableau 5 : Souches d’Escherichia coli utilisées pour la démonstration de faisabilité in vitro
Souche Génotype _ Référence
MG1655 F- A-ilvG-rfb-50 rph-1 ATCC 47076
BL21 (DE3) fhuA2 [Ion] ompT gai (l DE3) [dcm] AhsdS Invitrogen ® prodFSA BL21 contenant pVT-FSA Cette étude prodKDSD BL21 contenant pVT-KDSD Cette étude prodALDA BL21 contenant pVT-ALDA Cette étude prodRPE BL21 contenant pVT-RPE Cette étude prodXYLA BL21 contenant pVT-XYLA Cette étude prodXYLB BL21 contenant pVT-XYLB Cette étude prodARA BL21 contenant pVT-ARAA Cette étude prodARAB BL21 contenant pVT-ARAB Cette étude prodARAC BL21 contenant pVT-ARAC Cette étude
C. Expression et purification des protéines étiquetées polyhistidine.
Toutes les protéines exprimées sont solubles et ont été produites à partir du vecteur d'expression pET28a transformé dans une souche d'f. coli BL21 (DE3). Une pré culture en milieu LB (pour « Luria-Bertani ») additionnée de l'antibiotique kanamycine est réalisée sur la nuit à 37°C. La pré-culture est utilisée pour ensemencée une culture fraîche de 200 mL de LB-Kanamycine à une densité optique à 600 nm (DOeoo) de 0,1 (37°C, 200 rpm). Lorsque la ϋqeoo est comprise entre 0,6 et 0,8, l'expression de la protéine d'intérêt est induite par l'ajout d'IPTG à 1 mM final. Les protéines sont exprimées sur la nuit à 16°C. Les cellules sont collectées par fractions de 50 ml et centrifugées à 4800 rpm pendant 15 min à 4°C. Les culots cellulaires sont conservés à -20°C.
La purification des protéines est réalisée à partir des culots cellulaires obtenus lors de l'étape de production. Toutes les étapes sont faites à froid pour éviter la dégradation des protéines par des protéases. Les culots cellulaires sont remis en suspension dans 1,5 mL de tampon de lavage (50 mM HEPES, pH 7,5 ; 0,3 M NaCI) puis soniqués sur glace. Une étape de centrifugation à 13000 rpm, pendant 15 min à 4°C permet de séparer les débris cellulaires du liquide cytoplasmique. Les lysats clarifiés sont déposés sur 600 pl de résine cobalt (Clontech) préalablement équilibrée avec le tampon de lavage. Après 20 min à température ambiante au contact de la résine, les tubes sont centrifugés (700 rcf, 3 min, 4°C). Le surnageant est retiré, la résine est mise en contact avec 3 mL de tampon de lavage pendant 10 min afin d'éliminer les interactions non spécifiques. Après centrifugation (700 rcf, 3 min, 4°C) et élimination du surnageant, 3 mL d'une solution à 15 mM d'imidazole sont mis en contact avec la résine pendant 5 min. Le surnageant est séparé de la résine par centrifugation, remplacé par 500 mI d'imidazole à 200 mM. L'imidazole entraîne l'élution des protéines porteuses d'une étiquette polyhistidine. Pour favoriser la stabilité des protéines à leur pH optimal, le tampon a été modifié. La méthode utilisée pour mesurer la concentration des protéines en solution est basée sur la méthode de Bradford. Le réactif Protein assay® commercialisé par BioRad est dilué au ¼, le mélange réactionnel comprend 160 pl de réactif et 40 mI d'éluat dilué (au ioème et au 20ème). Une gamme standard est réalisé avec de la BSA de 12,5 à 100 mg/ml.
D. Essais enzymatiques.
Toutes les enzymes ont été testées dans 100 mM Tris, pH 7.5, 10 mM MgCh, à 37°C. Les co-facteurs et activateurs ont été ajoutés si nécessaire.
Les enzymes hexokinase de Saccaromyces cerevisiae (Hxk), transcétolase d'Escherichia coli (Tkt), pyruvate kinase d'Escherichia coli (PK) et lactate déshydrogénase d'Escherichia coli (LDH), la triose-phosphate isomérase (Tpi) et la glycérol-3-phosphate déshydrogénase (G3PDH) ont été commandées chez Sigma. La phosphoglucose isomérase d'Escherichia coli (Pgi) chez Megazyme.
Tous les substrats enzymatiques ont été achetés chez Sigma-Aldrich. Les tests enzymatiques sont couplés à une réaction redox avec pour co-facteur, le NADH qui absorbe l'ultraviolet avec un pic à 340 nm avec un coefficient d'extinction molaire de 6 220 IVTTcrrr1. Le spectrophotomètre Epoch 2 de Bio Tek a été utilisé pour le suivi des réactions en UV.
Mesure d'activité de l'aldéhyde déshydrogénase (AldA) : Cette activité a été mesurée en présence de 5 mM de glycoaldéhyde, 3 mM de NAD+ et 3 mM d'ATP. Pour une molécule de glycoaldéhyde oxydée en glycolate, une molécule de NAD+ est réduite en NADH.
Mesure d'activité la fructose-6P aldolase (FSA) :L'enzyme FSA clive le D- arabinose-5-phosphate en glycolaldéhyde et glycéraldéhyde-3-phosphate (GAP). La vitesse d'apparition de glycolaldéhyde a été mesurée en présence d'AldA avec 2 mM de NAD+. Pour suivre l'apparition de GAP, la TPI et la G3PDH ont été ajoutées, en présence de 0,4 mM de NADH.
Mesure d'activité de la D-arabinose-5-phosphate isomérase ( KdsD ) : La D- arabinose-5-phosphate isomérase catalyse l'interconversion du D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose-5-phsphate. L'activité de KdsD sur D-ribulose-5-phosphate a été déterminée en ajoutant FSA, aldA en excès en présence de 3 mM de NAD+.
Conversion du D-xylose en acide glycoliciue in vitro : La conversion du D- xylose en acide glycolique requiert XylA, XylB, Rpe, KdsD, FSA et aldA (Figure 5A). La conversion du D-xylose en acide glycolique est démontrée dans un mélange réactionnel contenant 100 mM Tris HCl pH 7,5, 10 mM MgCI2, 0,5 mM MnCI2, 3 mM ATP, 2 mM NAD+, 1-10 pg de chaque enzyme et 5 mM de D-xylose.
Conversion du L-arabinose en acide alycoligue in vitro : La conversion du L-arabinose en acide glycolique requiert AraA, AraB, AraD, Rpe, KdsD, FSA et aldA (Figure 4A). La conversion du L-arabinose en acide glycolique est démontrée dans 100 mM Tris HCl, pH7,5, 10 mM MgCI2, 0,5 mM MnCI2, 3 mM ATP, 2 mM NAD+, 1-10 pg de chaque enzyme et 5 mM de L-arabinose.
Conversion du D-glucose en acide alycoligue in vitro : La conversion du D- glucose en acide glycolique requiert les enzymes Hxk, Pgi, Tkt, Rpe, KdsD, FSA et aldA (Figure 6A). La démonstration de faisabilité est réalisée dans 100 mM Tris HCl, pH 7,5, 10 mM MgCI2, 0,5 mM MnCI2, 1 mM TPP (pour « Thiamine Pyrophosphate »), 3 mM ATP, 2 mM NAD, 5 mM Glycéraldéhyde-3P, 1-10 pg de chaque enzyme et 5 mM de D-glucose.
1.2. Résultats.
A. Conversion in vitro du D-ribulose-5P en acide glycoliaue.
Le ribulose-5P est un métabolite commun au catabolisme de l'arabinose, du xylose et du glucose chez Escherichia coli. La voie non-naturelle de conversion du D- ribulose-5P en acide glycolique faisant l'objet de la présente invention est constituée des enzymes KdsD (D-arabinose 5P isomérase), FSA (Fructose-6P aldolase) et AldA (glycolaldéhyde déshydrogénase). La démonstration de faisabilité in vitro a consisté à reconstruire cette voie avec des enzymes purifiées dans un tampon adapté. Premièrement aldA a été caractérisée sur glycolaldéhyde, puis l'activité de FSA sur D-arabinose-5P a été vérifiée par couplage avec aldA afin de vérifier la formation de glycolaldéhyde et par couplage avec la triose phosphate isomérase et la glycérol-3P déshydrogénase pour mettre en évidence la synthèse de glycéraldéhyde-3P (Figure 3). Les mesures d'activités de FSA obtenues par ces 2 méthodes sont identiques. Enfin l'activité de KdsD sur D-ribulose-5P a été mesurée par couplage avec les enzymes FSA et AldA en excès. Ce dernier essai enzymatique a permis de vérifier la fonctionnalité de KdsD et de reconstituer la voie de synthèse d'acide glycolique entière. Le NADH est produit en quantité équimolaire avec l'acide glycolique. Afin de vérifier que le NADH soit réellement un témoin de la production d'acide glycolique la production d'acide glycolique a été mesurée en HPLC.
Les constantes catalytiques de ces 3 enzymes sont présentées dans le Tableau 6. Les protéines étiquetées polyhistidine KdsD, FSA et aldA sont actives. Le mélange réactionnel contenant KdsD, FSA et AldA en présence de 5 mM de D-ribulose-5P a été analysé en HPLC, 1,5 mM d'acide glycolique ont été quantifiés. La production d'acide glycolique mesurée correspond à la quantité initiale de NAD+ dans le milieu de réaction, indiquant que la réaction a été complète.
Tableau 6 : Constantes catalytiques de l'arabinose-5P isomérase (KdsD), la fructose-6P aldolase (FSA), l'aldéhyde déshydrogénase (AldA) étiquetées polyhistidine
Enzyme Substrat Km (mM) Vmax(U mg 1) Vmax/Km(.10 6)
(min 1 mg 1)
KdsD-His D-ribulose-5P 1,34 ± 0,12 1,14 ± 0,17 850
FSA-His D-arabinose-5P 0,652 ±0,15 0,26 ± 0,09 398
aldA-His glycolaldéhyde 0,21 ±0,05 1,16 ± 0,31 5552
B. Conversion de L-arabinose ou du D-xylose ou du D-glucose en acide glycoliciue.
Les enzymes catalysant la conversion du L-arabinose, D-xylose et D- glucose en acide glycolique ont été purifiées (AraA, AraB, AraD, XylA, XylB, Rpe, KdsD, Fsa, AldA) ou commandées (Tkt, Glk, Pgi) afin de démontrer la faisabilité de la production d'acide glycolique à partir de ces 3 substrats in vitro. i. Conversion du L-arabinose en acide glycolique.
La conversion du L-arabinose en acide glycolique et glycéraldéhyde 3P est catalysée par AraA, araB, araD, Rpe, KdsD, FSA et aldA (Figure 4A). La synthèse de NADH observée lors de l'essai enzymatique en présence de L-arabinose est le témoin indirect de la production d'acide glycolique (Tableau 7, Figure 4B).
La conversion du L-arabinose en acide glycolique est démontrée et cette voie métabolique est donc thermodynamiquement possible.
Tableau 7 : Activité enzymatique mesurée pour la conversion de L- arabinose en acide glycolique à 340 nm, 37°C. Une unité d'activité enzymatique (U) est définie comme la conversion d'une micromole de substrat par minute. Le contrôle négatif est dépourvu de l'activité arabinose isomérase catalysée par AraA.
Substrat (5mM) Enzymes Activité (U)
AraA, AraB, AraD, Rpe, KdsD, FSA,
L-arabinose 11,59
AldA
AraB, AraD, Rpe, KdsD, FSA, AldA 0,00 ii. Conversion de D-xylose en acide glycolique.
La conversion du D-xylose en acide glycolique et glycéraldéhyde 3P est catalysée par XylA, XylB, Rpe, KdsD, FSA et AldA (Figure 5A). Lorsque que ces enzymes sont mises en présence de D-xylose, le D-xylose est converti en acide glycolique in vitro comme l'atteste la production de NADH (Figure 5B, Tableau 8).
Tableau 8 : Activité enzymatique mesurée pour la conversion de D-xylose en acide glycolique à 340 nm, 37°C. Une unité d'activité enzymatique (U) est définie comme la conversion d'une micromole de substrat par minute. Le contrôle négatif est dépourvu d'activité xylulose isomérase catalysée par XylA.
Substrat (5mM) Enzyme(s) Activité (U)
XylA, XylB, Rpe, KdsD, FSA, AldA _ 15,07
D-xylose
XylB, Rpe, KdsD, FSA, AldA 0,00
La voie de conversion du D-xylose en glycolate est fonctionnelle et thermodynamiquement possible. iii. Conversion de D-glucose en acide glycolique. La conversion du D-glucose en acide glycolique a été démontrée en mettant en présence le D-glucose et le DL-glycéraldéhyde-3P (GAP) avec Hxk, Pgi, Tkt, Rpe, KdsD, FSA et AldA (Figure 6A). Le contrôle négatif présente une activité importante (Figure 6B, Tableau 9). Le GAP est une molécule relativement instable, il se déphosphoryle alors spontanément en glycéraldéhyde. Baldoma ét al. (1987) a démontré qu'AldA d'Escherichia coli était active sur glycolaldéhyde, lactaldéhyde, méthylglyoxal et L-glycéraldéhyde [13]. La synthèse de NADH dans le contrôle négatif n'est donc pas corrélée à la synthèse de glycolate mais de glycérate provenant de l'oxydation du glycéraldéhyde. Cette activité secondaire n'est pas pertinente in vivo, d'autant plus que le L-glycéraldéhyde n'est pas formé chez Escherichia coli.
Tableau 9 : Activité enzymatique mesurée pour la conversion du D- glucose en acide glycolique à 340 nm, 37°C. Une unité d'activité enzymatique est définie comme la conversion de 1 micromole de substrat par minute. Le contrôle négatif est dépourvu d'activité hexokinase (Hxk).
Activité Activité
Substrats (5mM) Enzymes
(U) corrigée (U)
Hxk. Pgi, Tkt, Rpe, KdsD, Fsa, AldA 23,5 6,2
D-glucose, GAP
Pgi, Tkt, Rpe, KdsD, Fsa, AldA 17,3
D'après ces résultats, la voie de conversion du D-glucose en acide glycolique est fonctionnelle in vitro et donc thermodynamiquement favorable.
Les glucides L-arabinose, D-xylose et D-glucose sont naturellement assimilés et convertis en D-ribulose-5P dans Escherichia coli, la conversion non-naturelle du D-ribulose-5P en acide glycolique permise par la surexpression de KdsD, FSA et aldA a été démontrée. L'implémentation de la voie non-naturelle KdsD-FSA-aldA est thermodynamiquement favorable, les voies complètes d'assimilation et de conversion des pentoses et hexose reconstruites ont permis la synthèse d'acide glycolique in vitro.
Cependant la démonstration in vitro est par définition isolée du métabolisme naturel d'f. coli, ces résultats ne tiennent pas compte des réactions impliquant les intermédiaires, de l'efficacité du transport transmembranaire des substrats et de l'excrétion d'acide glycolique, de la disponibilité en co-facteurs,... Une démonstration de faisabilité in vivo complémentaire a été réalisée pour solidifier ces résultats préliminaires.
II. Preuve de faisabilité in vivo.
11.1. Matériel et Méthodes.
A. Construction des plasmides.
i. Choix des vecteurs
La série de vecteurs pZ (Expressys) a l'avantage d'être modulable : il est facile de changer l'origine de réplication, le marqueur de résistance et le promoteur des vecteurs par restriction/ligation.
Les vecteurs pZA23, pZA33, pZE23 et pZS23 possèdent le promoteur PAllacO-1 qui est un promoteur dérivé du promoteur de l'opéron lactose comprenant l'opérateur o. PAllac0-l est sous le contrôle du répresseur lacl : sous sa forme active, le répresseur lacl se lie à l'opérateur o et inhibe la transcription alors que, complexé avec l'IPTG, il change de conformation et n'est plus capable de se fixer au site o, la transcription devenant alors possible. Le promoteur PAllacO-1 est dit inductible à l'IPTG. Même si E. coli possède naturellement une copie du gène lacl dans son génome en amont de l'opéron lac, la majorité des vecteurs d'expression bactériens inductibles à l'IPTG portent le gène lacl afin d'assurer l'inhibition totale de la transcription de gènes qui sont sous sa dépendance. Les vecteurs pZ ont la particularité d'avoir une structure allégée du gène lacl ce qui leur confère une faible taille (2358 à 3764 pb).
Des modifications ont été apportées au vecteur pZA33, le promoteur PAllacO-1 a été remplacé par le promoteur constitutif proD et par le promoteur inductible Ptac, générant les vecteurs pZA36 et pZA38 respectivement. Le promoteur PAllacO-1 de pZS23 a été modifié pour le promoteur proD générant les vecteurs pZS27. ii. Méthode de clonage : HiFi Assembly
La méthode de l'HiFi assembly® (NEB) a été retenue pour construire les vecteurs utilisés ci-après. Cette méthode permet l'assemblage de plusieurs fragments. Elle a été validée pour des fragments de tailles différentes avec des régions de chevauchement variables (15-80 pb). En une seule étape, les fragments peuvent être assemblés, c'est une méthode couramment utilisée pour sa simplicité et sa flexibilité.
Le mélange commercial fournit par New England Biolabs contient différentes enzymes : (a) une exonucléase qui crée des extrémités simple brin en 3', ce qui facilite l'assemblage des fragments qui partagent une complémentarité de séquences ; (b) une polymérase qui comble les espaces vides après que les fragments se sont assemblés ; et (c) une ligase qui lie les fragments entre eux.
Les gènes de la voie synthétique de production de l'acide glycolique selon l'invention kdsD, fsa et aldA ont été amplifiés par PCR à partir de l'ADN génome extrait d'f. coli K12 MG1655 et insérés par HiFi assembly® dans les vecteurs pZ, préalablement linéarisés par PCR avec des amorces s'hybridant de part et d'autre du MCS. Tous les plasmides ont été vérifiés par séquençage avant utilisation. iii. Vecteurs d'expression pour la surexpression de kdsD, fsa, aldA
Les vecteurs utilisés pour la surexpression de kdsD, fsa et aldA sont présentés dans le Tableau 10 ci-après.
Tableau 10
Nom Description Source
pZA23 Kan R, ori pl5A, PAllacO-1 Expressys
pZA33 Chm R , ori pl5A, PAllacO-1 Expressys
pZS23 Kan R, ori pSClOl, PAllacO-1 Expressys
pZA36 Chm R, ori pl5A, Ptac Cette étude
pZA37 Chm R, ori pl5A, proC Cette étude
pZS28 Kan R, ori pSClOl, proD Cette étude
pEXT20 AmpR, ori ColEl, Ptac [33]
pET28a Kan R' ori ColEl, Ptac Novagen
pKF3 pZA36 kdsD fsa Cette étude
pA4 pZS23 aldA Cette étude
pKF5 pZA37 kdsD fsa Cette étude pA8 pZS28 aldA Cette étude
B. Construction des souches.
i. Délétions des gènes
Les délétions ont été réalisées par transduction, en utilisant le phage Plvir. La préparation des lysats Plvir et les procédures de transduction ont été réalisées comme décrit précédemment avec peu de modifications [34].
Ainsi, les souches KEIO portant une délétion unique et une cassette de résistance à l'antibiotique Kanamycine (souche donneuse) ont été infectées avec Plvir et des lysats l de titre élevé ont été obtenus [35]. Les souches donneuses (KEIO) ont été cultivées sur une nuit dans du LB à 37°C. Le lendemain, 5 ml de LB contenant 0,2% de glucose et 5 mM de CaCI2 ont été inoculés avec 200 mI de la souche donneuse et cultivés pendant 30 min à 37°C. Ensuite, 100 pl de lysat de Plvir (~ 5 x 108 phages/ml) ont été ajoutés à chaque culture de donneur et incubés de nouveau à 37°C pendant 2 à 3 heures jusqu'à ce que la culture soit claire et les cellules soient complètement lysées. Les lysats ont été filtrés en utilisant des filtres à seringue stériles de 25 mm avec une membrane Supor® de 0,2 pm (Pall) et conservés à 4°C.
La souche à déléter (souche réceptrice) a été infectée avec Plvir contenant une cassette de délétion de gène donneur avec une résistance à la kanamycine. Pour cela, la souche réceptrice a été cultivée dans 5 ml de milieu LB à 37°C. Les cellules ont été centrifugées à 1 500 g pendant 10 min et remises en suspension dans 1,5 ml de MgS04 à 10 mM et de CaCI2 à 5 mM. Du lysat de la souche donneuse (0,1 ml) est ajouté à la suspension cellulaire qui est incubée pendant 30 min. Ensuite, 0,1 ml de citrate de sodium à 1 M est ajouté au mélange cellules et Plvir. Ensuite, 1 mL de LB est ajouté à la suspension homogénéisée avant une incubation de lh à 37°C, 200 rpm.
Les suspensions cellulaires sont étalées sur un milieu LB solide avec l'antibiotique approprié puis les colonies sont criblées par PCR pour mettre en évidence des événements de transduction réussis.
Pour éliminer la cassette à l'antibiotique, les cellules ont été transformées avec un plasmide pCP20 portant la FLP recombinase. Chaque étape a été vérifiée par PCR. Lorsque la souche délétée est sensible à la kanamycine après le retrait de la cassette, elle peut de nouveau être utilisée comme souche réceptrice afin d'ajouter une nouvelle délétion à partir d'un nouveau lysat de phage. ii. Préparation de bactéries compétentes et transformation
Les souches non commerciales compétentes sont préparées selon le protocole de Chung et al, 1989 légèrement modifié [36]. Une pré-culture est réalisée en LB sur la nuit pour inoculer le lendemain une culture fraîche de LB à une D06oo de 0,1. Lorsque la DO eoo atteint 0,3-0, 5 (les bactéries peuvent être rendues compétentes jusqu'à une D06oo de 1), une quantité de culture cellulaire équivalente à une unité D06oo est prélevée et centrifugée (8000 rpm, 2 min). Le surnageant est retiré tandis que le culot est repris dans 300 mI de tampon TSS (2,5 %(Wt/voi) PEG 3350, 1 M MgCI2, 5% (VOi/voi) DMSO). Le mélange est incubé pendant 10 min sur glace. Le plasmide peut alors être ajouté aux cellules compétentes. Après 30 min supplémentaires d'incubation sur glace, un choc thermique est réalisé à 42°C pendant 90 secondes. Les cellules transformées sont mises dans la glace 10 min. 400 mI de LB sont ajoutés et la culture est incubée à 200 rpm pendant lh, à une température adaptée (la température ne peut excéder 30°C dans le cas d'une transformation avec un plasmide dont l'origine de réplication est thermosensible). La culture bactérienne est centrifugée à 8000 rpm pendant 2,5 min. 600 mI de surnageant sont retirés, le volume restant est inoculé sur une boîte de LB solide avec l'antibiotique approprié. iii. Souches pour la production d'acide glycolique
Les souches d'f. coli utilisées dans cette étude sont listées dans le Tableau
11 ci-après. Tableau 11
Souche Génotype Référence
MG 1655 F- l- ilvG- r/6-50 rph-1 ATCC 407076
NEB5 fhuA2 A(argF-iacZ)U169 phoA glnV44 F80 A(lacZ)M15 NEB
gyrA96 recAl relAl end Al thi-1 hsdR17
BL21 (DE3) huA2 [Ion] ompT gai (l DE3) [dcm] AhsdS) NEB
ScreenOO MG1655 AtktA AtktB AglcD Cette étude
Screen09 ScreenOO contenant pZA36 kdsD fsa (pKF3) et pZS23 Cette étude aldA (pA4)
Screen23 ScreenOO contenant pZA37 kdsD fsa (pKF5) et pZA28 Cette étude aldA (pA8)
WC3G W3CG F-, LAM-, gapA 10 ::TnlO, IN(rrnD-rrnE), rph-1 [37]
gapA-
BW25113 F-,A(araD-araB)567,AlacZ4787[::rrnB-3),À~,rph-l,A(rhaD- [26]
rhaB)568, hsdR514
JW2771 BW25113 AfucA [26]
JW4364 BW25113 AarcA [26]
JW5129 BW25113 AmgsA [26]
JW2946 BW25113 AglcD [26]
JW2771 BW25113 AfucA [26]
JW3887 BW25113 ApfkA [26]
GAOO WC3G gapA- AglcD AarcA AmgsA AfucA ApfkA proD galP Cette étude
GA09 GAOO contenant pZA36 kdsD fsa (pKF3) et pZS23 aldA Cette étude
(pA4)
GA23 GAOO contenant pZA37 kdsD fsa (pKF5) et pZA28 aldA Cette étude
(pA8)
C. Milieux et conditions de culture.
i. Composition des milieux
Les cellules sont cultivées sur le milieu LB pour les étapes de biologie moléculaire (clonage, délétions, transformation). Ce milieu riche est composé de 10 g/L de tryptone, 5 g/L d'extraits de levure et 5 g/L de NaCI. 15 g/L d'agar sont ajoutés pour l'obtention d'un milieu solide. Le LB, avec ou sans agar, est stérilisé par autoclavage 20 min à 110°C avant utilisation. Les cultures pour la production d'acide glycolique sont réalisés en milieu minéral M9 (Tableau 12) contenant une source de carbone (glucose, xylose ou arabinose) à une concentration de 10 g/L ou 20 g/L et des traces de LB afin de réduire la phase de latence (2 g/L tryptone, 1 g/L d'extraits de levure et 1 g/L de NaCI).
Tableau 12 : Composition du milieu M9
Composé Concentration finale (g/L)
Na2HP04 * 12 H20 18
KH2P04 3
NaCI 0,5
NH4CI 2
MgS04 * 7 H20 0,5
CaCI2 * 2 H20 0,015
FeCI3 0,010
Thiamine HCl 6.10 3
NaEDTA 0,49.10 3
CoCI2 * 6 H20 1,8.10 3
ZnCI2S04 * 7 H20 1,8.10 3
Na2Mo04 * 2 H20 0,4 .10 3
H3BO3 O,I.IO 3
MnS04 * H20 1,2.10 3
1,2 mg/L CuCI2 * 2 H20_ 1,2.10~3
Pour la souche MG1655 AtktA AtktB AglcD, le milieu M9 avec destraces de LB est complémenté avec 500 mM L-phénylalanine, 250 pM L-tyrosine, 200 pM L- tryptophane, 6 pM p-aminobenzoate, 6 pM p-hydroxydenzoate et 280 pM de shikimate. Pour les souches dont l'activité glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase a été supprimée, le milieu a été complété avec 0,4 g/L d'acide malique ajusté à pH 7 avec du KOH au préalable. Le milieu est tamponné par l'addition de 20 g/L d'acide 3-(N- morpholino)propanesulfonique (MOPS) à pH 7 puis filtré sur des membranes à 0,2 pm pour obtenir un milieu stérile. Si besoin, les antibiotiques appropriés ont été ajoutés au milieu (ampicilline 100 pg/mL, kanamycine 50 pg/mL, chloramphenicol 25 pg/mL). Pour les souches contenant un vecteur inductible à l'IPTG, une concentration finale de 0,1 mM d'IPTG est utilisée. Tous les produits ont été commandés chez Sigma. Les cultures sont placées dans un agitateur (Infors) à 200 rpm, 37°C le temps de l'expérience. La croissance des cultures est suivie par la mesure de la densité optique à 600 nm (DOeoo) au spectrophotomètre (Biochrom Libra SU). ii. Procédé de fermentation en fioles Erlenmeyer à baffles de 250 mL
Souches contenant des promoteurs constitutifs
Protocole 1
Les souches sont reprises à partir d'un stock glycérol conservé à -80°C dans 10 mL de LB, à 37°C sur la nuit. Les pré-cultures sont centrifugées le lendemain à 4000 rpm pendant 5 min et resuspendues dans 20 mL de milieu M9 xylose ou arabinose 1% en flacons d'Erlenmeyer de 100 mL. Une phase d'adaptation d'une durée de 24h permet aux souches de s'adapter à l'utilisation de pentose. Les cellules sont ensuite centrifugées (4000 rpm, 5 min) et reprises dans les conditions de culture finales : à une ϋqeoo initiale de 0,5 dans 50 mL du milieu de composition identique à celui utilisé pendant la phase d'adaptation (M9 xylose ou arabinose 1%). Des flacons de culture à baffles de 250 mL sont utilisés pour une oxygénation optimale. Les cultures sont agitées à 200 rpm, à 37°C.
Protocole 2
La souche GA23 est reprise à partir d'un stock glycérol conservé à -80°C dans 10 mL de LB contenant les antibiotiques suivants : tétracycline (10 pg/ml), kanamycine (50 pg/ml) et du chloramphénicol (25 pg/ml). La pré-culture est incubée à 37°C, 200 rpm sur la nuit.
Le procédé se découple en 2 phases : une phase de croissance dédiée à la fabrication de biomasse et une phase de production dédiée à la production d'acide glycolique. La phase de croissance est réalisée dans 50 mL de milieu M9 à pH 7 contenant 1,5 g/L de xylose, 5 g/L de succinate, 73 mg/L de L-méthionine, 73 mg/L de L-tryptophane et l g/L de casaminoacides inoculé avec la pré-culture à une ϋqeoo de 0,2 dans un erlenmeyer bafflé de 250 ml. Après 24h de culture à 37°C, 200 rpm, les cellules sont centrifugées, lavées et reprises dans 50 mL de M9 à pH 7 contenant 10 g/L d'un sucre lignocellulosique (glucose, xylose ou arabinose), 73 mg/L de L-méthionine, 73 mg/L de L- tryptophane et l g/L de casaminoacides dans un erlenmeyer bafflé de 250 ml. Le milieu utilisé pour la production est dépourvu de succinate et ne permet pas la croissance, la source de carbone (glucose, xylose ou arabinose) est utilisée pour la production d'acide glycolique. La phase de production dure 48h à 37°C, 200 rpm, des échantillons sont pris régulièrement afin de mesurer le pH, la densité optique et suivre la consommation de sucre et la production d'AG par HPLC.
Souches contenant des promoteurs inductibles
Les précultures en LB des souches contenant un vecteur avec promoteur inductible sont mises en culture à une ϋqeoo initiale de 0,1 dans 30 mL de M9 glucose 1%. Lorsque la ϋqeoo atteint 0,6, 0,1 mM d'IPTG sont ajoutés pour induire l'expression des gènes sous le contrôle du promoteur inductible à l'IPTG (plac ou ptac). 24 h après, les cellules sont centrifugées, un lavage à l'eau stérile permet d'enlever les traces de glucose, et resuspendues dans 20 mL du milieu choisi pour l'étude (M9 xylose ou arabinose 1%, 0,1 mM IPTG) pour la phase d'adaptation. Le reste du protocole de mise en culture est identique à celui pour les souches avec promoteurs constitutifs. iii. Procédé de fermentation en bioréacteur 2L BIOSTAT ® B Startorius
Stedim Biotech
Des cultures de la souche GA23 décrite précédemment ont été réalisées en bioréacteur de 2L. Les précultures ont été réalisées dans du LB additionné de kanamycine, chloramphénicol et tétracycline, mise en culture à 37°C, 200 rpm. Une première préculture de 3 mL a été réalisée la nuit, celle-ci a servi à l'inoculation d'une deuxième préculture de 15 mL mise en culture pendant 24h. Celle-ci a servi à l'inoculation d'une troisième et dernière préculture en erlenmeyer de 150 mL cultivée pendant 8h. En phase exponentielle, cette dernière préculture a été utilisée pour inoculer la culture en fermenteur à une DO de 0,3. Le milieu de culture M9 (Tableau 12) contient 10 g/L de xylose ou glucose, ainsi que du LB (10%) et 0,4 g/L d'acide malique Les cultures ont été réalisées à 37°C, avec une agitation (300-1500 rpm) et une aération maintenant l'oxygène dissous au-dessus de 20% du débit d'air. Le pH a été maintenu à 7 avec une solution de base KOH. La culture a été conduite en mode batch pendant 40h. D. Quantification des concentrations des métabolites extracellulaires.
La consommation de sucre et la production d'acide glycolique sont suivies en prélevant régulièrement des échantillons en conditions stériles qui sont centrifugés à 13,000 rpm pendant 5 min dans une centrifugeuse de paillasse (Eppendorf 5415D), filtrés à travers un filtre de 0,2 pm et stockés à -20°C. La quantification des métabolites extracellulaires est réalisée par chromatographie liquide haute performance (CLHP) avec un chromatographe Ultimate 3000 (Dionex, Sunnyvale, USA). Le système de CLHP est équipé d'une colonne à échange de cations (Aminex, HPX87H - 300 x 7,8 mm, 9 pm, BioRad), d'un injecteur automatique (WPS-3000RS, Dionex), d'un détecteur IR (RID 10A, Shimadzu) et d'un détecteur UV (SPD-20A, Shimadzu). La phase mobile est une solution de d'acide sulfurique à 1,25 mM à un débit de 0,5 mL/min. Les échantillons sont maintenus à 4°C et l'injection de 20 pl se fait dans la colonne à 35°C.
11.2. Résultats obtenus en erlenmeyer à baffles.
Les inventeurs ont démontré que la surexpression dans E. coli des 3 enzymes de la voie non-naturelle selon l'invention i.e. l'arabinose-5-phosphate isomérase (KdsD), la fructose-6-phosphate aldolase (FSA) et l'aldéhyde déshydrogénase (AldA) est nécessaire et suffisante à la synthèse d'acide glycolique à partir de monosaccharides lignocellulosiques.
A. Avec des pentoses comme source de carbone.
Pour cela, une souche d'E. coli K12-MG1655 délétée des gènes tktA, tktB codant pour les transcétolases a été construite pour mettre en évidence la fonctionnalité de la voie selon l'invention. Les transcétolases sont des enzymes majeures de la voie des pentoses phosphate. En leur absence, la croissance sur pentose est impossible, les intermédiaires pentose phosphate (D-ribose-5-phosphate et D-Xylulose-5-phosphate) s'accumulent et ne peuvent être convertis en glycéraldéhyde-3phosphate pour la croissance [38] Cette souche a besoin de la voie non-naturelle selon l'invention pour croître à partir de pentoses. En effet, seule l'activité couplée de KdsD et FSA peut générer du glycéraldéhyde-3-phosphate entrant dans la glycolyse pour la production des précurseurs nécessaires à la croissance [39]. Ainsi un crible fonctionnel par test de croissance est envisageable dans lequel la croissance serait un indicateur de l'efficacité de la voie synthétique in vivo (Figure 7).
Les 3 gènes ont été clonés en opéron et exprimés dans une souche d'f. coli MG1655 AtktA AtktB AglcD. Pour ce faire, un système d'expression à deux vecteurs a été utilisé, ce dernier ayant été accepté par la souche sans engendrer de modifications délétères pour l'expression de la voie synthétique selon l'invention. Le système d'expression de la voie synthétique selon l'invention comporte donc un vecteur à moyen nombre de copies portant kdsD-fsa co-exprimé avec un vecteur à faible nombre de copies portant aldA.
Deux systèmes d'expressions ont été étudiés, l'un avec des vecteurs aux promoteurs inductibles à l'IPTG (pZA36 kdsD fsa et pZS23 aldA, système d'expression n°9) et l'autre avec des vecteurs aux promoteurs constitutifs (pZA37 kdsD fsa et pZS28 aldA, système d'expression n°23).
Les cultures des souches MG1655 AtktA AtktB AglcD exprimant les systèmes 9 (Screen09) et 23 (Screen23) ont été réalisées 37°C et ont montré une croissance significative indiquant que la surexpression des gènes kdsD et fsa est fonctionnelle. Les analyses HPLC de l'exométabolome des cultures bactériennes sur L- arabinose et le D- xylose ont confirmé la présence d'acide glycolique avec les deux systèmes d'expressions. Ce résultat démontre la faisabilité de la synthèse d'acide glycolique à partir de pentoses par la voie synthétique in vivo (Figure 8). Le Tableau 13 ci-après présente le rendement en acide glycolique à partir de xylose et arabinose des souches Screen09 et Screen23.
Tableau 13
acide acide
Souche glycolique/xylose glycolique/arabinose
_ (mol/mol) _ (mol/mol)
ScreenOO 0,14 ± 0,03 0,14 ± 0,03
Screen09 0,43 ± 0,02 0,32 ± 0,01
Screen23 0,42 ± 0,02 0,20 ± 0,03 Acide glycolique Acide
Souche /xylose (g/g) glycolique/arabinose
(g/g)
ScreenOO 0,07± 0,03 0,07 ± 0,03
Screen09 0,22 ± 0,02 0,16 ± 0,01
Screen23 0,21 ± 0,02 0,10 ± 0,03
B. Avec des pentoses et des hexoses comme source de carbone.
Les systèmes d'expression 9 et 23 ont été transformés dans la souche d'f. coli WC3G AgapA AglcD AarcA AmgsA AfucA Apkf proD-galP (GA00) conçue pour la production d'acide glycolique à partir d'hexoses et de pentoses avec une conservation optimale du carbone, générant les souches GA09 et GA23, respectivement.
Les cultures bactériennes ont été réalisées en erlenmeyer à 37°C sur D- glucose, L-arabinose et D-xylose pendant 46h. La surexpression des gènes kdsD,fsa et aldA est nécessaire pour la production d'acide glycolique.
Avec le protocole 1 tel gue précédemment décrit :
La souche GA00 avec le système d'expression constitutif n°23 soit GA23 a montré une production d'acide glycolique à partir de D-glucose (0,29 g/L), D-xylose (0,41 g/L) et L-arabinose (0,07 g/L). La production d'acide glycolique avec le système d'expression inductible n°9 soit GA09 est moins importante sur D-glucose (0,1 g/L), D- xylose (0,05 g/L) et L-arabinose (0,03 g/L) (Figure 9). Le système d'expression comportant des promoteurs constitutifs est favorable. Le rendement de la souche GA23 en acide glycolique est de 0,09 g/g (0,21 mol/mol) à partir de glucose, 0,18 g/g (0,36 mol/mol) à partir de xylose et 0,16 g/g (0,32 mol/mol) à partir d'arabinose.
Avec le protocole 2 tel gue précédemment décrit :
Le rendement de la souche GA23 en acide glycolique est de 0,096 g/g
(0,19 mol/mol) à partir de glucose, 0,3 g/g (0,60 mol/mol) à partir de xylose et 0,34 g/g (0,68 mol/mol) à partir d'arabinose. RÉFÉRENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1) Micro-organisme recombinant qui présente
1) une activité de conversion du D-ribulose-5-phosphate en D-arabinose- 5-phosphate, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;
ii) une activité de clivage aldolique du D-arabinose-5-phosphate en D- glycéraldéhyde-3-phosphate et glycolaldéhyde, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;
iii) une activité d'oxydation du glycolaldéhyde en glycolate, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié ; et
iv) une activité d'oxydation du glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3- bisphosphoglycérate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié, ledit micro-organisme recombinant produisant de l'acide glycolique à partir de pentoses et d'hexoses.
2) Micro-organisme recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit micro-organisme présente une surexpression du gène kdsD de E. coli ou d'un homologue de celui-ci.
3) Micro-organisme recombinant selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit micro-organisme présente une surexpression du gène /sa de E. coli ou d'un homologue de celui-ci.
4) Micro-organisme recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit micro-organisme présente une surexpression du gène aldA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci.
5) Micro-organisme recombinant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit micro-organisme comprend : а) un premier plasmide dans lequel se trouvent la séquence du gène kdsD de E. coli ou d'un homologue de celui-ci et la séquence du gène /sa de E. coli ou d'un homologue de celui-ci, lesdites séquences étant clonées en opéron et sous le contrôle d'un premier promoteur inductible ou constitutif et
b) un second plasmide dans lequel se trouve la séquence du gène aldA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci sous le contrôle d'un second promoteur inductible ou constitutif,
lesdits premier et second promoteurs étant identiques ou différents. б) Micro-organisme recombinant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'expression du gène gapA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est diminuée mais non inactivée par rapport au micro organisme non modifié.
7) Micro-organisme recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'expression du gène gapA de E. coli ou d'un homologue de celui-ci est inactivée par rapport au micro-organisme non modifié.
8) Micro-organisme recombinant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le système phosphotransférase (PTS), qui dépend du phosphoénolpyruvate (PEP) est inactivé, alors qu'une activité de transport de glucose codée par galP de E. coli ou glfde Zimomonas mobilis ou un de leurs homologues et une activité de transformation du glucose en glucose-6-phosphase sont augmentées par comparaison au même micro-organisme non modifié.
9) Micro-organisme recombinant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit micro-organisme présente au moins une des caractéristiques suivantes :
v) une activité d'oxydation du glycolate en glyoxylate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ; vi) une répression des gènes impliqués dans la régulation du métabolisme respiratoire aérobie, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;
vii) une internalisation du glycolate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;
viii) une activité de formation irréversible de méthylglyoxal à partir de dihydroxyacétone, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;
ix) une activité de conversion du fructose-6-phosphate en fructose-1,6- biphosphate, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;
x) une activité de production du D-ribose-l-phosphate à partir de dihydroxyacétone phosphate et de glycolaldéhyde, diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié ; et
xi) une activité d'oxydation du D-glucose-6-phosphate en 6-phospho D- glucono-l,5-lactone, modifiée par comparaison au même micro-organisme non modifié.
10) Micro-organisme recombinant selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite activité de production du 6-phospho-D-glucono-l,5-lactone à partir de D- glucose-6-phosphate est diminuée par comparaison au même micro-organisme non modifié.
11) Micro-organisme recombinant selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit micro-organisme recombinant présente les caractéristiques suivantes :
xi) une activité d'oxydation du D-glucose-6-phosphate en 6-phospho D- glucono-l,5-lactone, augmentée par comparaison au même micro-organisme non modifié ;
xii) une activité de formation de 2-dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6- phosphate à partir de D-gluconate-6-phosphate, diminuée par comparaison au même microorganisme non modifié ; et
xiii) une activité de formation de glycéraldéhyde-3-phosphate et de pyruvate à partir 2 dehydroxy-3-deoxy-D-gluconate-6-phosphate, diminuée par comparaison au même organisme non modifié. 12) Procédé de production d'acide glycolique comprenant les étapes consistant à :
a) mettre en culture un micro-organisme recombinant tel que défini dans l'une quelconque des revendications précédentes dans un milieu de culture comprenant, comme source de carbone, et
b) récupérer l'acide glycolique à partir du micro-organisme et/ou dans le milieu de culture. 13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit micro organisme recombinant mis en culture est un micro-organisme recombinant tel que défini à la revendication 6 et en ce que la source de carbone mise en œuvre ne comprend qu'un élément choisi parmi du D-glucose, du D-xylose, du L-arabinose et un de leurs mélanges. 14) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit micro organisme recombinant mis en culture est un micro-organisme recombinant tel que défini à la revendication 7 et en ce que la source de carbone comprend, en plus du D-xylose et/ou du L-arabinose et/ou du D-glucose, un ou plusieurs composés en C2, C3 et C4 choisis parmi le malate, le pyruvate, le succinate, l'acétate et un de leurs mélanges.
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