FR3075825A1

FR3075825A1 - Procede et systeme d'identificationdu type de gram d'une bacterie

Info

Publication number: FR3075825A1
Application number: FR1762814A
Authority: FR
Inventors: Jordane Lallemand; Denis Leroux; Manuel Petit
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2019-06-28
Anticipated expiration: 2037-12-21
Also published as: JP7534955B2; FR3075825B1; KR20200100790A; US12006529B2; JP2021506288A; CN111492065A; WO2019122732A1; EP3728623A1; US20210079441A1

Abstract

Procédé de détection du type de Gram et du caractère fermentant d'une souche bactérienne, comportant : - l'éclairage dans la gamme de longueurs d'onde 390nm-900nm d'au moins une bactérie de ladite souche ayant une réponse électromagnétique naturelle dans ladite gamme; - l'acquisition, dans ladite gamme, d'une intensité lumineuse réfléchie par, ou transmise au travers de, ladite bactérie éclairée; et - la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne en fonction de l'intensité lumineuse acquise dans ladite gamme.

Description

PROCEDE ET SYSTEME D’IDENTIFICATION DU TYPE DE G RAM D’UNE BACTERIE

Domaine de l’invention L’invention a trait au domaine de l’analyse microbiologique, et en particulier de la caractérisation de microorganismes, notamment l’identification de levures et de bactéries, et dans le cadre de ces dernières l’identification de leur type de Gram et de leur caractère fermentant ou non.

De manière avantageuse, l’invention s’applique à l’analyse d’une image hyperspectrale ou multispectrale d’une colonie bactérienne ou de levure ayant poussé dans un milieu nutritif non chromogène, non fluorogène et dépourvu de colorant.

Etat de la technique

Dans le domaine des microorganismes pathogènes, la caractérisation d’un microorganisme consiste préférentiellement à identifier son espèce et sa sensibilité à un agent antimicrobien, (ou « antibiogramme »), afin de déterminer un traitement pour le patient infecté par ce microorganisme. Pour ce faire, un processus microbiologique complexe est usuellement mis en œuvre en laboratoire, processus qui nécessite le plus souvent la connaissance préalable d’autres propriétés du microorganisme, notamment son règne (e.g. levure ou bactérie), et dans le cadre bactérien son type de Gram ou son caractère fermentaire ou non. En effet, ces informations permettent notamment de choisir un milieux de culture ou un type d’agents antimicrobien adaptés au microorganisme afin de déterminer, in fine, son espèce ou son antibiogramme. Par exemple, le choix d’une galerie d’identification de microorganismes API® commercialisée par la demanderesse se fonde sur la connaissance du règne du microorganisme (e.g. levure vs bactérie) ou du type de Gram de la souche bactérienne à identifier. De même la détermination de l’antibiogramme d’une souche bactérienne par le système Vitek ® 2 commercialisé par la demanderesse se fonde sur le choix d’une carte en fonction du type de Gram et du caractère fermentant ou non de ladite souche. Il est également possible de citer l’identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF employant une matrice différente selon que le microorganisme à identifier est une levure ou une bactérie. Ainsi connaître au plus tôt ces informations permet d’optimiser le processus microbiologique, notamment en accélérant ce dernier ou en réduisant le nombre de consommables employés.

La connaissance de ces propriétés permet également de réduire les faux positifs d’identification de souches bactériennes. A titre d’exemple, dans le cadre du milieu ChomID®

Elite Medium commercialisé par la Demanderesse, la connaissance du caractère fermentant de la souche bactérienne testée robustifie l’identification des salmonelles. En particulier, une salmonelle, bactérie fermentante, et une Pseudomonas, bactérie non fermentante, font toutes deux virer le substrat chromogène. Savoir si la bactérie est non fermentante permet ainsi d’écarter simplement la salmonelle sans test microbiologique supplémentaire.

Outre la caractérisation d’un microorganisme en vue d’orienter le processus microbiologique en laboratoire, ces informations ont également une utilité clinique. Notamment, la classification de Gram d’une souche de bactérie permet de caractériser la paroi celle-ci, par exemple son pourcentage en peptidoglycane, et est utilisé dans la taxonomie des bactéries ou pour évaluer en première approximation leur sensibilité aux antibiotiques. On distingue ainsi deux types de bactérie, à savoir les bactéries à Gram « positif » et les bactéries à Gram « négatif ». De même on observe que les bactéries non fermentantes, i.e. les bactéries incapables de cataboliser le glucose, occupent une place particulière chez les bactéries pathogènes. En effet, elles ont un niveau de résistance naturelle aux antibiotiques élevée et sont impliquées dans nombre d’infections nosocomiales. A titre d’exemple, on peut citer Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter. Connaître rapidement le caractère fermentant ou non d’une bactérie permet ainsi d’orienter plus efficacement l’antibiothérapie de première intention et de ralentir la diffusion de souches multirésitantes.

Historiquement, chacune des propriétés cités précédemment (règne, Gram et fermantant) est obtenu par une technique dédiée. Par exemple, le type de Gram d’une souche bactérienne était déterminé par une technique manuelle dite de « coloration de Gram », qui comprend un nombre important d’étapes manuelles (fixation, coloration, mordançage, lavage, surcoloration...), et donc longue à mettre en œuvre. Diverses techniques ont donc été mises au point pour automatiser la détection du type de Gram des bactéries, afin notamment de traiter un nombre important d’échantillons. Toutefois, ces techniques continuent pour l’essentiel à modifier la réponse électromagnétique des bactéries ou de leur milieu pour rendre leur Gram aisément observable. En particulier, un premier type de technique consiste à automatiser la coloration de la membrane bactérienne sur des lamelles de microscope, mais l’étape de décision finale concernant le type de Gram est toujours réalisée par un technicien qui observe les lamelles au microscope. Ce type de technique n’est donc pas entièrement automatisée, et par ailleurs difficilement automatisable. En effet, la différence de couleurs entre les bactéries de Gram positif et les bactéries de Gram négatif peut être subtil, expliquant pourquoi l’intervention d’un technicien de laboratoire est encore nécessaire. Un deuxième type de technique consiste à mettre des bactéries en présence d’un substrat qui se dégrade par une réaction enzymatique initiée par les peptidoglycanes des membranes des bactéries. Cette réaction produit des chromophores ou des fluorophores dont la concentration est une indication du Gram. On parle usuellement de « marquage » chromogène ou fluorogène des bactéries. Si ce type de techniques de l’état de l’art est automatisable, par exemple en mesurant l’intensité lumineuse des chromophores/fluorophores à l’aide d’un dispositif approprié (e.g. spectromètre/fluoromètre) puis en comparant informatiquement l’intensité mesurée à des valeurs de seuils prédéfinies, elles supposent néanmoins la conception de substrats chromophores ou fluorogènes particuliers, souvent coûteux. En outre, quelle que soit la technique employée, les bactéries subissent une modification de leur état naturel (e.g. elles comprennent des colorants, ont fixé des marqueurs chromogènes ou fluorescentes, etc.), et ne sont donc plus utilisables pour des tests de caractérisations ultérieurs (e.g. la détermination d’un antibioGramme).

Concernant la détermination du caractère fermentant ou non d’une bactérie, elle est usuellement mise en œuvre l’emploi de milieu chromogènes qui changent de couleur en fonction du caractère fermentant ou non de la souche bactérienne testée. Par exemple, le test de « Kligler-Hajna » consiste à faire pousser la souche sur un milieu de culture comprenant un indicateur colorimétrique changeant de couleur en fonction du pH, du lactose, du glucose du thiosulfate et des ions ferreux. Ce milieu détecte le caractère fermentant de la bactérie par la catabolisation du glucose qui se traduit par virage colorimétrique de l’indicateur de pH. On peut également citer les milieux de test de l’activité de l’estérase de tributyrine de la souche bactérienne qui permettent de caractériser les bactéries à Gram négatif et non fermentantes.

Expose de l’invention

Le but de la présente invention est de proposer un procédé de détermination du type de Gram et du caractère fermentant d’une souche de bactérie qui soit automatique et qui ne nécessite pas de marquer ou de colorer la bactérie ou son milieu de culture pour de déterminer ces caractéristiques. A cet effet, l’invention a pour objet un procédé de détection du type de Gram et du caractère fermentant d’une souche bactérienne, comportant : - l’éclairage dans la gamme de longueurs d’onde 390nm-900nm d’au moins une bactérie de ladite souche ayant une réponse électromagnétique naturelle dans ladite gamme; - l’acquisition, dans ladite gamme, d’une intensité lumineuse réfléchie par, ou transmise au travers de, ladite bactérie éclairée; et - la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne en fonction de l’intensité lumineuse acquise dans ladite gamme.

Par réponse « électromagnétique naturelle », on entend au sens de l’invention que la bactérie n’est pas modifiée à l’aide d’éléments (colorant, chromogène, fluorogène, etc.) qui modifient sa réponse électromagnétique à un éclairage au moins dans la gamme de longueurs d’onde d’intérêt. Par exemple, une colonie de la souche est cultivée dans un milieu nutritif non chromogène et non fluorescent et l’éclairage/acquisition se fait directement sur la colonie encore présente dans son milieu.

En d’autres termes, les inventeurs ont découvert que dans la gamme de longueurs d’onde 390nm-900nm une bactérie a « naturellement » une signature électromagnétique caractéristique de son type de Gram et de son caractère fermentant ou non. Le procédé selon l’invention consiste ainsi à mesurer cette signature puis à en extraire le type de Gram et le caractère fermentant de la bactérie. Ainsi, il n’est pas nécessaire d’utiliser un substrat chromogène ou fluorogène ou des colorants. Par ailleurs, le procédé selon l’invention est rapide dans la mesure où il consiste à éclairer, mesurer un spectre et réaliser un traitement, notamment informatique, de ce spectre. En particulier, grâce à l’invention il est possible de déterminer grâce à la gamme 390-900nm si la souche bactérienne est de Gram positif ou de Gram négatif et fermentante ou de Gram négatif et non fermentante, la connaissance de cette information permettant par exemple d’optimiser un processus microbiologique de laboratoire tel que décrit précédemment. L’invention a également pour objet un procédé de réalisation d’un antibiogramme d’une souche bactérienne à un antibiotique comprenant : - la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne ; - le réalisation d’au moins un échantillon comprenant la souche bactérienne, un milieu de culture et une concentration d’un antibiotique en fonction du type de Gram et du caractère fermentant choisi; et - la détermination de la sensibilité de la souche bactérienne à l’antibiotique en fonction de la pousse de ladite souche dans l’échantillon, procédé dans lequel la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne est réalisée selon un procédé du type précité. L’invention a également pour objet un procédé d’identification d’une souche bactérienne à un antibiotique comprenant : - la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne ; - le choix d’au moins un milieu colorimétrique en fonction du type de Gram et du caractère fermentant choisi; et - la mise en culture dans ledit milieu de la souche bactérienne, procédé dans lequel la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne est réalisée selon un procédé du type précité. L’invention a également pour objet un système pour la mise en œuvre du procédé venant d’être décrit. En particulier, l’invention a pour objet un système de détection de détection du type de Gram et du caractère fermentant d’une souche bactérienne, comprenant : - un éclairage configuré pour éclairer, dans la gamme de longueurs d’onde 390nm-900 nm, au moins une bactérie de la souche; - un capteur configuré pour acquérir, dans la gamme 390nm-900nm, une intensité lumineuse réfléchie par, ou transmise au travers de, ladite bactérie éclairée; et une unité informatique configurée pour déterminer du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne en fonction de l’intensité lumineuse acquise dans la gamme 390nm-900nm.

Selon un mode de réalisation, le système est configuré pour éclairer, et acquérir l’image de, un échantillon comprenant une colonie de bactéries de ladite souche et milieu nutritif sur lequel ladite colonie a poussé, en particulier une boite de Pétri.

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES L’invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, donnée uniquement à titre d’exemple, et faire en relation avec les dessins annexés, dans lesquels des références identiques désignent des éléments identiques ou analogues, et dans lesquels la figure 1 est une vue schématique d’un système hyperspectral selon l’invention ; la figure 2 est une vue schématique d’un système multispectral selon l’invention ; - la figure 3 est un exemple de spectre en transmission d’un filtre passe-bande utilisée dans le système de la figure 2 ; - la figure 4 est un organigramme d’un procédé de prédiction des classes Y, GP, GNF, GNN mis en œuvre à l’aide du système de la figure 1 ou de la figure 2 ; - la figure 5 est un organigramme d’un procédé de sélection de canaux spectraux discriminants à l’aide de l’approche « step forward » ; - la figure 6 est un organigramme d’un procédé d’apprentissage des modèles de prédiction des classes Y, GP, GNF, GNN ; - la figure 7A est un graphique illustrant un modèle de prédiction à plat des classes Y, GP, GNF, GNN ; - la figure 7B est un graphique illustrant un modèle de prédiction hiérarchisé selon un arbre phylogénique des classes Y, GP, GNF, GNN ; - la figure 7C est un graphique illustrant un modèle de prédiction hiérarchisé selon un arbre optimal des classes Y, GP, GNF, GNN ; - la figure 8 est une table décrivant les espèces bactériennes et de levure utilisés pour l’apprentissage de modèle de prédiction des classes Y, GP, GNF, GNN ; - les figures 9 et 10 sont des tables, respectivement pour le milieu COS et le milieu TSA, décrivant le nombre de pixels, et donc de spectres, utilisés pour l’étalonnage et la validation croisée des modèles de prédiction ; la figure 11 est un graphique illustrant le calcul d’un taux de prédiction pondéré, ou « balanced classification rate » - la figure 12 est un graphique illustrant la répartition spatiale des principaux canaux spectraux discriminants pour l’arbre optimal du milieu COS ; - la figure 13 est un graphique illustrant la répartition spatiale des 5 principaux canaux spectraux discriminants de chaque modèle pour l’arbre optimal du milieu COS ; la figure 14 est un graphique illustrant individuellement les cinq canaux discriminants principaux de chaque modèle de l’arbre optimal du milieu COS ; la figure 15 est un graphique illustrant la répartition spatiale des principaux canaux spectraux discriminants pour l’arbre optimal du milieu TSA ;

la figure 16 est un graphique illustrant la répartition spatiale des principaux canaux spectraux discriminants pour l’arbre optimal du milieu COS - la figure 17 est un graphique illustrant respectivement les 12, 8 et 11 canaux discriminant principaux associés respectivement aux premier, deuxième et troisième modèle de prédiction de l’arbre optimal du milieu TSA ; les figures 18 à 20 sont des graphiques illustrant respectivement les premier, deuxième et troisième modèles de prédiction de l’arbre phylogénique, le graphique en haut de chaque figure correspondant au milieu TSA et le graphique en bas de chaque figure correspondant au milieux COS.

Description detaillee de l’invention

Dans ce qui suit la notation Αί ;· se rapporte à l’élément de la ieme ligne et de la jieme colonne de la matrice Æ

En se référant à la figure 1, un système hyperspectral 10 de caractérisation de colonies de levures ou de bactéries ayant poussées sur une gélose coulée dans une boite de Pétri comporte : - un dispositif 12 d’acquisition d’image hyperspectrale ; et - une unité 14 informatique de traitement de données connectée (e.g. par une liaison filaire ou sans fil), au dispositif 12 pour son pilotage et pour la réception et le traitement des images acquises par le dispositif 12.

Le dispositif 12, par exemple un système d’imagerie hyperspectrale de référence « Pika II » de la société Resonon, Montana USA, comporte : - une caméra dite « hyperspectrale » 18, constituée d’un capteur numérique comprenant un réseau de capteurs élémentaires, par exemple un capteur numérique de type CCD ou CMOS, sensible dans la gamme de longueurs d’onde

nanomètres, et d’un élément dispersif de lumière ou d’un spectrographe pour sélectionner une longueur d’onde à acquérir par le capteur ; - un objectif 20 pour focaliser sur le capteur numérique de la caméra 18, l’image optique d’une boite de Pétri 22, dont on cherche à acquérir une image hyperspectrale ; - un éclairage avant 24, par exemple constitué d’une ou plusieurs lampes allogènes, e.g. 2 ou 4 lampes, apte à émettre de la lumière dans la gamme

et pour réaliser un éclairage avant uniforme de la boite de Pétri 22. Par exemple, les éclairages sont des lampes à lumière blanche ; - un éclairage arrière 26, par exemple constitué d’une matrice de LED à lumière blanche, pour réaliser un éclairage arrière uniforme de la boite de Pétri 22 dans la gamme

; et - un chariot 28 sur lequel repose boite de Pétri 22 et permettant à cette dernière de défiler devant l’objectif 20 afin d’obtenir une image entière de la boite 22 par balayage.

Le dispositif 12 est par exemple configuré pour acquérir l’image d’une région de 90 millimètres par 90 millimètres avec un pas d’échantillonnage de 160 micromètres (résolution spatiale estimée à 300 micromètres) et avec une résolution spectrale de 1,7 nanomètre sur la gamme

Le dispositif 12 produit ainsi une image numérique HSI de la lumière réfléchie par la boite de Pétri, ayant N lignes et M colonnes, la boite de Pétri 22 étant préférablement ouverte (i.e. sans son couvercle):

La radiance d’un pixel, communément appelée « intensité lumineuse », correspond ici à la quantité de lumière incidente sur la surface du site sensible élémentaire correspondant du capteur de la caméra 18 pendant la durée d’exposition, comme cela est connu en soi du domaine de la photographie numérique par exemple.

Chaque pixel RadijÇX) se compose d’un spectre numérique de la radiance de la boite 22 correspondant au pixel à différentes longueurs d’onde [Amin^aJ, le spectre numérique s’exprimant selon la relation :

où ΔΛ. est la résolution spectrale et p est un entier positif appartenant à

Les longueurs d’onde d’acquisition

sont usuellement désignés sous le termes de « canaux ». L’unité 14 de traitement de données est par exemple un ordinateur personnel, une tablette, un smartphone, un serveur, un supercalculateur, ou plus généralement tout système à base de microprocesseur(s), notamment de type DSP (« digital signal processor »), à base de circuits de type FPGA, à base de circuits mixant ces types de technologie, etc., configuré pour mettre en œuvre un traitement des images HSI produites par le dispositif d’acquisition 12. L’unité 14 est notamment pourvue de l’ensemble des mémoires (RAM, ROM, cache, mémoire de masse,...) pour la mémorisation des images produites par le dispositif 12, d’instructions informatiques pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention, de paramètres utiles à cette mise en œuvre et pour la mémorisation des résultats des calculs intermédiaires et finaux. L’unité 14 comporte optionnellement un écran d’affichage pour la visualisation du résultat final de la caractérisation des colonies, en particulier la détermination du type de Gram et/ou du caractère fermentant, et/ou du caractère bactérien ou de levure des colonies étudiées. Bien qu’une seule unité de traitement soit décrite, l’invention s’applique évidemment à un traitement réalisé par plusieurs unités de traitement (e.g. une unité embarquée dans la caméra 18 pour mettre en œuvre un prétraitement de images HSI et une unité externe au dispositif 12 pour la mise en œuvre du reste du traitement). Par ailleurs, le système peut être complété par une interface permettant d’entrer dans l’unité 14 des données relatives à l’échantillon, notamment le type de milieu de culture utilisé lorsque la prédiction dépend du milieu, par

exemple au moyen d’un clavier/souris et d’un menu déroulant à disposition de l’opérateur, un lecteur de code barre/QR code lisant un code barre/QR code présent sur la boite de Pétri et comprenant des informations sur le milieu, etc.

Le système hyperspectral de la figure 1 a pour avantage d’être agile en termes de longueurs d’onde d’acquisition car il peut s’adapter à différents modèles de prédiction de la classe des colonies et utiliser un nombre important de canaux spectraux pour augmenter la précision de la prédiction. Outre un prix élevé, un tel système est toutefois généralement moins résolu spatialement qu’une caméra CMOS ou CCD classique dont le but est uniquement d’acquérir une image en intensité de la lumière incidente sur son capteur.

En se référant à la figure 2, un système multispectral 32 diffère du système hyperspectral 10 par la caméra 32, avantageusement une caméra CMOS ou CCD de haute résolution spatiale, couplée à un ensemble de filtres spectraux 36, par exemple disposé devant l’objectif 20 entre l’objectif 20 et le capteur de la caméra 32. L’ensemble de filtres 36 est constitué d’un nombre NF de filtres passe-bandes distincts, chacun configuré pour transmettre uniquement la lumière dans une gamme

de la gamme

, avec une largeur spectrale à mi-hauteur du maximum (ou FWHM pour « full width half maximum ») inférieure ou égale à 50nm, et de préférence inférieure ou égale à 20nm. Le spectre en transmission d’un tel filtre, e.g. un filtre de la société Edmund Optics centrée sur 420nm, est illustré à la figure 3. L’ensemble 36 est par exemple une roue à filtres pouvant accueillir jusqu’à 24 filtres différents, roue pilotée par l’unité 14 qui l’actionne pour faire défiler devant la caméra lesdits filtres et commander une prise d’image pour chacun d’entre eux.

Il est ainsi acquis une image multispectrale HSI(X) dont chaque pixel Radij(X) se compose d’un spectre numérique de la radiance de la boite 22 correspondant au pixel aux différentes bandes spectrales filtrées par l’ensemble 36, le spectre numérique s’exprimant selon la relation :

Où λ±, λ2, ..., λΝρ sont respectivement les longueurs d’onde centrales des filtres spectraux de l’ensemble 36.

Un procédé 40 de caractérisation de microorganismes contenus dans un échantillon biologique (e.g. urine, sang, prélèvement broncho-alvéolaire, etc.) au moyen du système venant d’être décrit est à présent détaillé en relation avec l’organigramme de la figure 4. En particulier, ce procédé trouve avantageusement application dans le cadre d’un procédé plus global d’identification des microorganismes contenus dans ledit échantillon à l’aide d’une spectrométrie de masse MALDI-TOF (e.g. Vitek® MS commercialisée par la Demanderesse) et d’un antibiogramme desdits microorganismes (e.g. à l’aide de la plateforme Vitek® 2 commercialisée par la Demanderesse). Comme cela est connu en soi, chacune de ces techniques nécessite de choisir des milieux et/ou des réactifs et/ou des consommables particuliers en fonction du type de microorganisme. A titre d’exemple, l’identification de levures par spectrométrie de masse MALDI-TOF implique avantageusement l’emploi d’acide formique dans la matrice utilisée dans ce type de technologie. De même, le choix de la carte de la plateforme Vitek® 2 (carte comprenant un milieu de pousse et un ou plusieurs antimicrobiens testés lors de l’antibiogramme) dépend du caractère bactérien du microorganisme testé. Notamment, les bactéries à Gram négatif et fermentantes nécessitent une carte particulière pour réaliser leur antibiogramme.

De manière avantageuse, le procédé de caractérisation 40 de caractérisation décrit ci-après permet, dès la première pousse sur boite de Pétri, d’obtenir les informations nécessaires sur les microorganismes pour la suite du processus microbiologique, en particulier de savoir si une colonie ayant poussé correspond à une levure (« Y ») ou une bactérie, et dans le cas d’une bactérie, si cette bactérie est de type Gram positif (« GP ») ou de type Gram négatif (« GN »), et dans le cadre de bactérie de type Gram négatif, si cette bactérie est fermentante (« GNF ») ou non fermentante (« GNN »). Le procédé permet ainsi de prédire la classe d’un microorganisme, à s’avoir la classe Y, GP, GNF ou GNN.

Dans une première étape 42 du procédé, une boite de Pétri est ensemencée par un échantillon biologique, e.g. prélevé sur un patient, de sorte à faire pousser des colonies de levure ou de bactérie à la surface d’un milieu nutritif, ou « de culture », déposé dans la boîte de Pétri. Le milieu nutritif, a pour but principal de faire pousser ladite colonie, et optionnellement de renforcer la précision de la caractérisation en limitant les perturbations lumineuses. De préférence concernant une détection du type de Gram en fonction de l’intensité lumineuse réfléchie, le milieu nutritif est opaque, ce qui augmente le degré de précision de la détection. Notamment, le milieu opaque a un facteur de réflectance p inférieur ou égal à 10%, et de préférence inférieur ou égal à 5%, et de manière encore plus préférentielle inférieur ou égal à 1%. Par exemple, le milieu de culture une gélose dite « CPSO » (gélose « CPS » comprenant du S1O2 pour opacifier le milieu), une gélose dite « columbia » (ou gélose « CNA »), une gélose Columbia avec 5% de sang de mouton (ou gélose dite « COS »), une gélose de Man,

Rogosa, Sharpe (gélose dite « MRSM »), une gélose chocolat (gélose dite « PVX »), une gélose Tryptone-Soja (gélose dite « TSA »), etc.

Ce type de pousse de colonies étant classique, il ne sera pas décrit plus en détail par la suite. Il peut avantageusement être mis en œuvre manuellement par un opérateur ou automatiquement à l’aide d’un automate d’ensemencement d’une manière connue en soi. De manière avantageuse, la préparation est réalisée de sorte que les colonies, sur la base desquels la caractérisation du microorganisme est réalisée, sont distancées les unes des autres et de sorte que la surface d’une colonie corresponde à une pluralité de pixels dans l’image acquise par le dispositif 12. Ceci permet notamment de faciliter leur identification ultérieure dans l’image acquise, et donc leur segmentation au moyen d’une algorithme de traitement d’image ou leur extraction dans l’image par un utilisateur.

Une fois la pousse des colonies terminée, par exemple après une durée de 24h, 36h ou 48h, la boite de Pétri est de préférence ouverte, disposée sur le chariot 28, les éclairages 24 et 26 sont allumés et au moins une image hyperspectrale (respectivement multispectrale) HSI de la boite de Pétri est acquise, en 44, à l’aide du dispositif d’acquisition 12 (respectivement 32) et mémorisée dans l’unité de traitement 14, qui met en œuvre un traitement informatique pour déterminer le type microorganisme constitutif de la colonie à partir des images acquises. L’unité 14 débute optionnellement, en 46, par un prétraitement du bruit, consistant en l’un des traitements suivants ou une combinaison quelconque de ces traitements : a. une correction du bruit du capteur de la caméra, notamment son offset, son bruit spatial, etc., d’une manière connu en soi ; b. un traitement des réflexions parasites, notamment spéculaire formant des « surbrillances » dans l’image HSI. Par exemple, un seuillage mis en œuvre pour éliminer les pixels ayant des valeurs supérieures à un seuil prédéterminé, e.g. supérieures ou égales aux deux tiers de la valeur maximale que peuvent prendre les pixels (i.e. supérieures ou égales à 170 dans le cas de pixels codés sur 8 bits entre 0 et 255) ; c. une traitement ratiométrique permettant d’atténuer les variations dans les images provoquées par des fluctuations extérieures telles que de variations de l’illumination, en divisant l’image HSI par une intensité lumineuse réfléchie à une longueur d’onde qui est invariante avec le type de bactérie et le type de gélose utilisé ; d. si plusieurs images HSI ont été acquises, la recherche et l’élimination de valeurs de pixels aberrantes et/ou la moyenne des images acquises.

De manière avantageuse, le traitement se poursuit, en 48, par la transformation de l’image HSI prétraitée, qui mémorise des valeurs de radiance à différentes longueurs d’onde, en une image hyperspectrale ou multispectrale de réflectance afin d’extraire le signal généré par la boite de Pétri seule. Ceci permet notamment de filtrer les fluctuations du spectre d’émission des sources d’éclairage 24, 26. Par exemple, une correction du type « flat field correction » (FFC) est mise en œuvre pour obtenir la réflectance, ce qui présente en outre l’avantage de corriger les dispersions de réponse du capteur de pixel à pixel (dispersion du courant d’obscurité, dispersion du gain, etc.).

Dans le cadre d’une image hyperspectrale, cette transformation est par exemple une correction selon les relations :

où Υ(λ) est une image en réflectance, W est une image hyperspectrale mémorisée dans l’unité 14 d’un objet neutre de réflectance élevée et illuminé par les éclairages 24, 26, par exemple une feuille de réflectance uniforme supérieure à 90% (e.g. une feuille dite « blanche » ou à une charte de gris inférieur à 10%), et B est une image hyperspectrale mémorisée dans l’unité 14 d’un objet neutre de réflectance faible, par exemple l’image d’un capuchon noir obturant l’objectif 20 et ;

ou égal à la moyenne de la matrice

De manière analogue, dans le cadre d’une image multispectrale, la transformation est par exemple une correction selon la relation :

où W est une image multispectrale mémorisée dans l’unité 14 d’un objet neutre de réflectance élevée et illuminé par les éclairages 24, 26, par exemple une feuille de réflectance uniforme supérieure à 90% (e.g. une feuille dite « blanche » ou à une charte de gris inférieur à 10%), et B est une image multispectrale mémorisée dans l’unité 14 d’un objet neutre de réflectance

faible, par exemple l’image d’un capuchon noir obturant l’objectif 20 et

ou égal à la moyenne de la matrice

L’unité 14 met en œuvre en 50, suite à l’étape 38 ou en parallèle des étapes précédentes, un algorithme d’identification des colonies de bactéries, e.g. à partir de l’image HSI(X) ou Υ(λ). Tout algorithme de reconnaissance de forme et d’objet classique peut être mis en œuvre pour extraire une zone de l’image, nommée « Col(À) », correspondant à une colonie. En variante, cette sélection est faite manuellement par un opérateur qui sélectionne cette zone en s’aidant de l’écran d’affichage et d’un mécanisme de pointage du type souris par exemple. A titre d’exemple, la zone Col(À) consiste en une liste des coordonnées de pixel appartenant à la colonie. Les zones de pixels sélectionnées sont mémorisées par l’unité 14.

Le procédé se poursuit, en 52, par la prédiction de la classe Y, GP, GNF ou GNN du microorganisme de la colonie en fonction d’au moins un spectre de la zone Col(À) en appliquant des règles de décision prédéfinies, dont des variantes sont décrites ci-après. En particulier, cette prédiction est réalisée en fonction du spectre \ j (λ) de chaque pixel (i,j) de la zone Col(À). A cet effet, une première prédiction de la classe est réalisée pour chaque pixel (i,j) de la zone Col(À), puis un vote majoritaire est mis en œuvre pour la prédiction finale de la classe. Dans une première variante, un vote majoritaire simple est mise en œuvre, c’est-à-dire que la classe prédite sur le plus grand nombre de pixels de la zone Col(A) est la classe finalement retenue. Dans une seconde variante, afin d’augmenter la certitude dans la prédiction de la classe, un vote qualifié est mis en œuvre, c’est-à-dire que la classe finalement retenue est celle qui est prédite sur plus de X% du nombre de pixels constitutifs de la zone Col(À), avec X supérieur strictement à 50%, et de préférence supérieur ou égal à 70%. Si aucune classe ne remplit cette condition, le procédé renvoie alors une absence de prédiction de classe. Bien entendu, la classe de la colonie peut être réalisée à l’aide d’une seule valeur, par exemple le spectre moyen Ycoi(À) de l’ensemble

des spectres de la zone Col (λ).

La classe Y, GP, GNF ou GNN de chaque colonie par l’unité 14 est réalisée en appliquant des règles de prédiction prédéfinies, dont des variantes sont décrites ci-après. Les classes prédites sont mémorisées dans l’unité 14 et/ou affichées sur un écran à l’attention de l’utilisateur. Cette prédiction est également avantageusement délivrée à un autre instrument d’analyse microbienne pour une étape ultérieure d’identification et/ou d’antibiogramme des microorganismes ayant formé les colonies.

Il va à présent être décrit différents modèles de prédiction d’une classe Y, GP, GNF ou GNN en fonction d’un spectre YijOO d’un pixel d’une colonie, notamment des modèles de

prédiction basés sur un apprentissage automatique supervisé (« SML », pour « supervised machine learning »). Les outils SML utilisés sont tout d’abord décrits en relation avec la figure 5 puis les modèles de prédiction sont décrits ci-dessous au travers de leur procédé d’apprentissage illustré aux figures 6 et 7. A. Outils d’apprentissage automatique supervise

Quel que soit l’apprentissage considéré, celui-ci débute par la constitution d’une base de données d’apprentissage. Pour chaque classe Y, GP, GNF et GNN, des bactéries et des levures sont sélectionnées et chacune d’entre elle est ensemencée sur une gélose coulée dans une boite de Pétri, mise en culture pendant une durée prédéterminée et une image hyperspectrale de la boite est acquise avec le système décrit à la figure 1, et par conséquent sous les mêmes conditions d’illumination et dans gamme de longueurs d’onde 390nm-900nm. Les pixels des colonies ayant poussé sur la gélose sont extraits, par exemple de la manière décrite aux étapes 46-50 du procédé 40, et leurs spectres associés mémorisés dans la base de données d’apprentissage. Cette dernière comprend ainsi quatre ensemble de spectres

respectivement associés aux classes Y, GP, GNF, GNN. Chacun de ces ensembles est scindé en deux, une première partie, dite « d’étalonnage » étant utilisé pour l’apprentissage lui-même et une deuxième partie, dite « de validation croisée », étant utilisée pour d’évaluer la performance des modèles de prédiction calculés, comme cela est connu en soi de l’état de la technique.

Selon un premier mode de réalisation privilégié, un apprentissage mis en œuvre par ordinateur, dit « step forward », est mis en œuvre pour l’apprentissage des modèles de prédiction. Ce type d’apprentissage repose sur la sélection pas à pas des canaux spectraux les plus discriminants, de sorte qu’il est intrinsèquement parcimonieux et adapté à la recherche d’une application multispectrale telle que mise en œuvre par le système de la figure 2.

En se référant à la figure 5, l’apprentissage 60 débute par une étape d’initialisation 62 dans laquelle un nombre maximal R de canaux discriminants est sélectionné, ce nombre étant compris entre 1 et le nombre P de canaux spectraux de la caméra hyperspectrale utilisée pour l’acquisition des spectres. Une liste L des canaux discriminants sélectionnés est vidée et une liste / des canaux candidats est initialisée à l’ensemble

des canaux de la caméra hypespectrale.

Dans une étape itérative 64 suivante, la liste / est remplie pas à pas avec les R canaux les plus discriminants de la liste L en mettant en œuvre une étape itérative 66. Plus particulièrement pour une itération r donnée de l’étape 64, l’étape 66 :

- extrait chaque canal Xk de la liste / ; - détermine, en 68, pour le canal extrait Xk et les canaux {XltX2, < Λ--1) de la liste Z, un modèle de prédiction

- calcule, en 70, un critère de performance

du modèle de prédiction

, par exemple le taux de bonne classification des spectres de validation croisée. L’étape 64 se poursuit alors, en 72, par l’identification du modèle de prédiction donnant le meilleurs critère de performance et par conséquent l’identification du canal Xr de la liste / le plus discriminant en combinaison avec les canaux de la liste Z. En 74, la liste Z est alors complétée avec le canal Xr et ce dernier est retiré de la liste / pour l’itération r+1 suivante de l’étape 64. Une fois les R canaux les plus discriminants identifiés, le procédé d’apprentissage se termine alors, en 74, par la mémorisation de la liste L et de l’hyperplan prédiction

associé à cette dernière, à savoir le dernier modèle identifié lors de l’étape 72.

De manière avantageuse, les modèles de prédiction calculés à l’étape 68 sont de type SVM (pour « support vector machine »), « un contre tous », à noyau linéaire (ou « linear kernel ») et à marge souple (ou « soft margin »). Ce type d’apprentissage consiste à calculer, en fonction des spectres d’étalonnage, un hyperplan

séparant une classe Cl {Cl = Y, GP, GNF ou GNN) de l’ensemble Cl formé d’une, deux ou trois parmi les autres classes, comme cela sera décrit ci-après. Par exemple, le modèle est appris en résolvant un problème d’optimisation selon les relations suivantes pour une itération k de l’étape 66 et une itération r de l’étape 64 :

sous les contraintes :

expressions dans lesquelles : - pour un spectre d’étalonnage Ym (À) appartenant à la classe Cl ou à l’ensemble Cl,

est égal au vecteur des composantes de Ym (À) correspondant aux canaux spectraux de la liste

et du canal Xk extrait de la liste / au cours de l’itération k, de préférence un vecteur dont les composantes sont ordonnées en fonction de la valeur des canaux ; -

et β sont des vecteurs de dimension égale à la dimension des spectres

, et par conséquent de dimension égale à r,

- M est le nombre de spectres d’étalonnage Ym (λ) appartenant à la classe Cl ou à l’ensemble Cl, numérotés de 1 à M, -

. β est le produit scalaire entre le vecteur

et le vecteur /?, -

et

sont des scalaires ; -

avec qm= 1 si le mieme spectre d’apprentissage est associé à la classe Cl, et qm = -1 si le mieme spectre est associé à l’ensemble Cl des autres classes ; et - C est un scalaire prédéfini.

Le modèle prédisant l’appartenance à la classe Cl d’un spectre d’un pixel Y¢,/(λ) est ainsi réalisé selon les étapes suivantes : - la transformation du spectre YijOO en un vecteur

; - le calcul d’une distance

entre le spectre

et l’hyperplan

> - l’application d’une règle de prédiction de la classe Cl en fonction de la distance S ch par exemple le spectre appartient à la classe Cl si le signe de Sel est positif, et à l’ensemble Cl si ce signe est négatif.

Selon un deuxième mode de réalisation, l’apprentissage est non parcimonieux et consiste à utiliser tous les canaux en même temps, le modèle de prédiction en découlant étant particulièrement adapté à une application hyperspectrale à l’aide du système de la figure 1. Par exemple, cet apprentissage est de type SVM, « un contre tous », à noyau linéaire et à marge souple, et consiste à calculer, en fonction des spectres d’étalonnage, un hyperplan

séparant une classe Cl (Cl = Y, GP, GNF ou GNN) de l’ensemble Cl formé d’une, deux ou trois parmi les autres classes, en résolvant un problème d’optimisation selon la relation :

sous les contraintes :

expressions dans lesquelles : - Ym (λ) est un spectre d’étalonnage Ym (λ) appartenant à la classe Cl ou à l’ensemble Cl; -

et β sont des vecteurs de dimension égale à la dimension des spectres d’étalonnage

, et par conséquent de dimension égale à P,

- M est le nombre de spectres d’étalonnage Ym (λ) appartenant à la classe Cl ou à l’ensemble Cl, numérotés de 1 àM, - Ym (λ)./? est le produit scalaire entre le vecteur Ym (λ) et le vecteur β, -

et

sont des scalaires ;

Le modèle prédisant l’appartenance à la classe Cl d’un spectre d’un pixel Υέ>;· (λ) est ainsi réalisé selon les étapes suivantes : - le calcul d’une distance

entre le spectre Υί;· (λ) et l’hyperplan

- l’application d’une règle de prédiction de la classe Cl en fonction de la distance Scb par exemple le spectre appartient à la classe Cl si le signe de Scl est positif, et à l’ensemble Cl si ce signe est négatif.

B. PROCEDE D’APPRENTISSAGE DES MODELES DE PREDICTON

En se référant à la figure 6, le procédé 80 d’apprentissage des modèles de prédiction débute par la constitution, en 82, d’une base de données d’apprentissage pour les classes Y, GP, GNF et GNN, tel que décrit précédemment. Le procédé 80 se poursuit, en 84, par la détermination d’une structure des modèles de prédiction. En particulier, deux types de modèle sont possibles, tels que respectivement illustrés à la figure 7A d’une part et aux figures 6B et 6C d’autre part.

Le premier type de modèle de prédiction, illustré à la figure 7A, consiste à apprendre quatre modèles de prédictions de type « un contre tous » 90, 72, 74, 76, à savoir une prédiction de la classe Y contre les classes GP, GNF, GNN, une prédiction de la classe GP contre les classes Y, GNF, GNN, une prédiction de la classe GNF contre les classes Y, GP, GNN et une prédiction de la classe GNN contre les classes Y, GP, GNF. A cette fin : - chaque modèle de prédiction est appris en fonction de la base de données d’apprentissage en mettant en œuvre un des outils d’apprentissage décrits ci-dessus en relation avec les relations (6) ou (7), la classe Cl étant égale à Y, GP, GNF GNN et l’ensemble Cl étant constitué des trois autres classes; - La prédiction du type de Gram et du caractère fermentant d’un pixel (étape 52 de la figure 3) est obtenue en calculant (étapes 90-96), les distance SY, Sgp, Sgnf, Sgnn du spectre YÉJ-(À) dudit pixel respectivement aux hyperplans

, ou aux hyperplans hyperplans

, puis en déterminant la classe du pixel, en 88, en fonction des distances calculées. Notamment, la classe retenue est celle correspondant à la distance maximale.

Selon le premier type de structure illustré à la figure 7 A, dite « à plat », les classes Y, GP, GNF et GNN sont considérées d’égale importance, et par conséquent les erreurs d’identifications également. Par exemple, identifier une levure Y en lieu et place d’une bactérie GNN est aussi grave qu’identifier une bactérie GNF en lieu et place d’une bactérie GNN. Selon la structure illustrée à la figure 7B, les modèles de prédiction sont organisés selon un arbre taxonomique phylogénique, ce qui permet de ne plus considérer les différentes classes avec une égale importance et d’introduire une information a priori, à savoir une information d’évolution pouvant influencer la forme des spectres. Plus particulièrement, cet arbre de modèle de prédiction comporte : - un premier modèle 100 consistant à distinguer les levures Y des bactéries GP, GNF, GNF ; - un deuxième modèle 102 consistant à distinguer les bactéries GP des bactéries GNF et GNN ; et - un troisième modèle 104 consistant à distinguer les bactéries GNF des bactéries GNN.

Chacun des modèles 100-104 est obtenu de la manière décrite précédemment en relation avec les relations (6) ou (7) et la prédiction de l’appartenance d’un spectre de pixel YÉj(A) à l’une des classes Y, GP, GNF et GNN consiste ainsi à calculer sa distance Sy à l’hyperplan du premier modèle 100 et si le signe de cette distance est positif, la classe Y est alors prédite. Sinon, la distance Sgp à l’hyperplan du second modèle 102 est calculé et si le signe de celle-ci est positif, alors la classe GP est prédite. Sinon, la distance Sgnf à l’hyperplan du troisième modèle 104 est calculé alors la classe GNF est prédite. Sinon la classe GNN est prédite.

Si le modèle phénotypique permet d’améliorer la précision de la prédiction par rapport à un structure de prédiction à plat telle qu’illustrée à la figure 7A, les inventeurs ont cependant noté que l’arbre phénotypique n’est pas nécessairement l’arbre donnant de meilleurs résultats. Notamment, un arbre peut être privilégié en fonction du milieu de culture sur lequel les microorganismes à caractériser ont poussé, milieu qui influence la forme des spectres. De préférence, une structure de prédiction optimale, telle qu’illustrée à la figure 7C, est déterminée en fonction des spectres d’étalonnage. Plus particulièrement, dans une première étape, les quatre modèles de prédiction a) Y contre GP, GNF et GNN, b) GP contre Y, GNF

et GNN, c) GNF contre Y, GP et GNN, et d) GNN contre Y, GP et GNF sont calculés de la manière décrite ci-dessus et le modèle ayant la meilleure performance de prédiction est conservé pour être le premier modèle 110 de l’arbre optimal. Dans une seconde étape, la classe du premier modèle est écarté, et les trois modèles de prédiction correspondant aux classes restantes sont calculés. Par exemple, si le premier modèle correspond à la classe GNN, alors les trois modèles de la seconde étape sont a) Y contre GP et GNF, b) GP contre Y, et GNF et c) GNF contre Y et GP de la manière décrite ci-dessus. Le meilleur des trois modèles est alors conservé pour être le second modèle 112 de l’arbre optimal. Dans une troisième étape, les classes des premier et deuxième modèles 110 et 112 sont écartés, et un modèle de prédiction entre les deux classes restantes est calculé de la manière décrite ci-dessus et conservé en tant que troisième modèle 114 de l’arbre optimal. La prédiction de l’appartenance d’un spectre de pixel Υί;·(λ) à l’une des classes Y, GP, GNF et GNN est alors obtenue en parcourant l’arbre d’une manière analogue à celle décrite en relation avec la figure 7B.

En revenant à la figure 6, une fois la structure du modèle de prédiction déterminée, le procédé d’apprentissage 80 se poursuit, optionnellement, en 84, par une diminution du nombre de canaux spectraux utilisés pour la prédiction, cette diminution étant réalisée par sélection et/ou par regroupement de canaux. En particulier, lorsque les modèles de prédiction précédemment décrits en relation avec les figures 7A, 7B et 7C, sont calculés grâce à l’approche « step forward » de la figure 5, le nombre de canaux utilisés peut être fixé directement par le paramètre R. En variante, ou de manière supplémentaire, les canaux supplémentaires n’apportant aucune augmentation significative de la performance des modèles peuvent être écartés. Le regroupement de canaux peut être également, en variante ou de manière supplémentaire, réalisée en divisant la gamme 390nm-900nm en intervalles dont la largeur correspond à celle des filtres tels que décrit ci-dessus en relation avec les figures 2 et 3. Un seul canal spectral est alors retenu par intervalle. Un nombre final de canaux OùAl5 λ2, ..., λΝρ sont ainsi sélectionnés et définissent les longueurs d’onde centrales des filtres spectraux de l’ensemble 36 du système multispectral de la figure 2. Comme cela sera décrit ci-dessous, il est possible d’obtenir une prédiction des classes de grandes précision à l’aide uniquement de 24 canaux, et donc de 24 filtres spectraux.

De manière optionnelle, ayant sélectionné les canaux finaux pour l’application multispectrale et construit le système multispectrale de manière correspondante, un nouvel apprentissage, basé sur l’acquisition de spectres avec le système de la figure 2, est mis en œuvre pour affiner les modèles de prédiction, cet apprentissage étant analogue à celui décrit en relation avec les figures 6 et 7.

De même, il a été décrit la sélection d’un nombre R prédéterminé de canaux discriminant. En variante, ce nombre n’est pas fixé a priori et un critère d’arrêt pour la recherche des créneaux est une stagnation du gain en performance en fonction du nombre de canaux. Si par exemple, l’ajout d’au moins un canal n’augmente pas la performance, par exemple le BCR détaillé ci-après, de plus de X%, alors la recherche de canaux est stoppée, avec par exemple X inférieur ou égale à 2%. C. Exemples

Il va à présent être décrit une application des prédictions des classes Y, GP, GNF et GNN venant d’être décrite. A cette fin, 21 souches bactériennes et de levures sont utilisées, ces espèces microbiennes étant décrite à la figure 8. Ces espèces ont été mises en culture pendant 24 heures sur une gélose COS et une gélose TSA, donnant lieu à une base de données d’apprentissage pour chacun de ces milieux. Le nombre de colonies et de pixels pour chacune des espèces et des milieux sont décrits respectivement à la figure 9 (COS) et à la figure 10 (TSA), le bloc 1 correspondant aux données d’étalonnage et le bloc 2 correspondant aux données de validation croisée.

La performance de la prédiction des classes est avantageusement calculée comme égale à la moyenne des sensibilités des prédictions de classe (taux de spectres bien classés). Ce critère pondéré, également appelé « balance classification rate » ou « BCR », permet de tenir compte des effectifs en pixels qui sont déséquilibrés, ce qui est le cas en raison de la taille des colonies qui est variable en fonction des espèces. Le calcul du BCR est rappelé à la figure 11.

C.l. Résultats CO S C.l.l. modèle à plat

La table 1 ci-dessous donne les BCR pour un modèle de prédiction à plat illustré à la figure 7A et pour des modèles de prédiction obtenus à l’aide des relations (7).

Table 1

On note d’emblée à la lecture de la table 1 qu’il est possible de prédire avec précision les différentes souches de bactéries. Notamment, connaissant que le microorganisme à caractériser est une bactérie, il est possible de prédire son type de Gram et son caractère fermentant ou non, en mettant en œuvre une première prédiction GP contre GNN et GNF et une seconde prédiction GNN contre GP et GNF. Ce type de prédiction est notamment utile pour la sélection de consommable pour la réalisation d’un antibiogramme avec la plateformeVitek®2 commercialisée par la demanderesse. C.1.2. Arbre optimal

Les BCR des modèles 110, 112, 114 illustrés à la figure 7C et obtenus à l’aide des relations (7) sont résumés à la table 2.

Table 2

On note que l’arbre optimal diffère sensiblement de l’arbre phylogénique, l’influence du milieu COS étant vraisemblablement supérieure à l’influence de différences portées par la phylogénie.

Les BCR des modèles 110, 112, 114 illustrés à la figure 7C et obtenus à l’aide de l’approche « step forward » de la figure 4 et des relations (6), avec R = 24 pour chacun des modèles, sont résumés à la table 3.

Table 3

On note à la lecture de la table 3 que le gain en performance est limité à partir du 8e canal pour le premier modèle, et du 4e canal pour le troisième modèle. Pour obtenir une application multispectral à l’aide de 24 filtres spectraux, correspondant aux systèmes de filtre du marché, il est ainsi avantageusement sélectionné respectivement 8 canaux, 14 canaux et 4 canaux pour les premier, deuxième et troisième modèles 110, 112, 114. Les performances de ce mode de réalisation sont résumés à la table 4.

Table 4

Evidemment d’autres nombres de canaux peuvent être sélectionnés en fonction du nombre de filtres spectraux disponibles pour le système de la figure 2.

On note par ailleurs que l’approche « step forward » permet de déterminer les gammes spectrales comprenant contenant les informations nécessaires à la prédiction des classes. En se limitant aux cinq premiers canaux de chaque modèle, il est obtenu respectivement des BCR proches ou supérieurs à 90%. La répartition spectrale de ces canaux est illustrée aux figures 12 à 14. On distingue ainsi nettement des bandes spectrales distinctes et distantes les unes des autres de plus de 50 nm. En particulier : A. les quatre classes Y, GP, GNF et GNN peuvent être prédites efficacement en utilisant uniquement en utilisant les informations spectrale dans une première gamme 415-500nm et une deuxième gamme 535-675 nm. A l’aide de ces gammes uniquement, les BCR sont supérieurs ou égaux à 90%. En limitant la première gamme à 575-675nm, 4 canaux sont utilisés uniquement par modèle pour des BCR proches ou supérieur à 90%. Optionnellement une troisième gamme 850-875 nm, correspondant au canal de rang 5 du deuxième modèle est utilisé. Plus particulièrement, la prédiction dans la première gamme 415-500nm peut être réalisée uniquement sur les gamme 415-440 nm et 470-495 nm. L’invention couvre ainsi tout procédé de prédiction des classes Y, GP, GNF et GNN consistant à acquérir des spectres dans lesdites gammes et à prédire les classes en fonction desdits spectres uniquement dans lesdites gammes. On note par ailleurs que si l’invention permet de distinguer entre les classes Y, GP, GNF et GNN, elle permet donc de distinguer entre des levures et des bactéries, et ce à l’aide des informations spectrales contenues dans les gamme susvisées. L’invention couvre donc également un procédé de prédiction du caractère de levure ou de bactérie d’un microorganisme à caractériser ;

B. la prédiction de la classe GNF contre Y+GP+GNN peut être réalisée efficacement uniquement sur une première gamme 470-500nm et une seconde gamme 575-645nm. L’invention couvre ainsi tout procédé de prédiction des classes la classe GNF consistant à acquérir des spectres dans lesdites gammes et à prédire la classe GNF en fonction desdits spectres uniquement dans lesdites gammes. On notera que lorsque le caractère bactérien du microorganisme à caractériser est déjà connu, la prédiction consiste alors à prédire la classe GNF contre GP et GNN. L’invention couvre donc également ce type de prédiction en se basant uniquement sur les gammes 470-500nm et 575-645nm ; C. la prédiction de la classe GP contre Y+GNN peut être réalisée efficacement uniquement sur la première gamme 535-675 nm, et plus particulièrement sur la gamme 585-675nm, et la deuxième gamme 850-875nm. L’invention couvre ainsi tout procédé de prédiction des classes la classe GP consistant à acquérir des spectres dans lesdites gammes et à prédire la classe GP en fonction desdits spectres uniquement dans lesdites gammes. On notera que lorsque le caractère bactérien du microorganisme à caractériser est déjà connu, la prédiction consiste alors à prédire la classe GP contre les classes GNF et GNN, et par conséquent par la classe GP contre la classe des bactéries à Gram négatif (GN). L’invention couvre donc également ce type de prédiction en se basant uniquement sur les gammes 535-675 nm, et plus particulièrement sur la gamme 585-675nm, et la gamme 850-875nm; D. En combinant les prédictions décrites aux points B et C ci-dessous, on note ainsi qu’avec trois gammes, et connaissant le caractère bactérien du microorganisme à caractérisé, il est possible de déterminer si une colonie bactérienne est GP, GNF ou GNN. Ce type de prédiction est notamment utile pour la sélection de consommable pour la réalisation d’un antibiogramme avec la plateformeVitek®2 commercialisée par la demanderesse. C.1.3. Arbre phylogénique

Les BCR des modèles 100, 102, 104 illustrés à la figure 7B et obtenus à l’aide des relations (7) sont résumés à la table 5.

Table 5

C.2. Résultats TSA C.2.1. modèle à plat

Table 6 C.2.2. Arbre optimal

Les BCR des modèles 110, 112, 114 illustrés à la figure 7C et obtenus à l’aide des relations (7) sont résumés à la table 7.

Table 7

Les BCR des modèles 110, 112, 114 illustrés à la figure 7C et obtenus à l’aide de l’approche « step forward » de la figure 5 et des relations (6), avec R = 24 pour chacun des modèles, sont résumés à la table 8.

Table 8

Les figures 15 à 17 illustrent les répartition spectrale des principaux canaux des branches, dans un même graphique (figure 15), dans une approche parcimonieuse avec 12, 8 et 11 canaux pour les premier, deuxième et troisième modèles 110, 112 et 114, (figure 16) et par modèle (figure 17). C.2.3. Arbre phylogénique

Les BCR des modèles 100, 102, 104 illustrés à la figure 7B et obtenus à l’aide des relations (7) sont résumés à la table 9.

Table 9

Les BCR des modèles 100, 102, 104 illustrés à la figure 7B et obtenus à l’aide de l’approche « step forward » de la figure 4 et des relations (6), avec R = 24 pour chacun des modèles, sont résumés à la table 10.

Table 10

Les figures 18 à 20 illustrent la répartition spectrale des principaux canaux spectraux, modèle par modèle, avec le milieu TSA en haut de chacune de ces figures et en comparaison avec le milieu COS en bas de chacune des figures.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de détection du type de Gram et du caractère fermentant d’une souche bactérienne, comportant : - l’éclairage dans la gamme de longueurs d’onde 390nm-900nm d’au moins une bactérie de ladite souche ayant une réponse électromagnétique naturelle dans ladite gamme; - l’acquisition, dans ladite gamme, d’une intensité lumineuse réfléchie par, ou transmise au travers de, ladite bactérie éclairée; et - la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne en fonction de l’intensité lumineuse acquise dans ladite gamme.
2. Procédé de détection selon la revendication 1, dans lequel la détermination du type de Gram et du caractère fermentant comporte l’application d’une classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une souche bactérienne de type Gram négatif et fermentante.
3. Procédé de détection selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la détermination du type de Gram et du caractère fermentant comporte l’application d’une classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une souche bactérienne du type Gram positif ou l’application d’une classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une souche bactérienne du type Gram négatif.
4. Procédé de détection selon la revendication 1, 2 ou 3, dans lequel la détermination du type de Gram et du caractère fermentant comporte en outre l’application d’une classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une levure ou d’un test microbiologique distinguant la souche bactérienne d’une levure.
5. Procédé de détection selon la revendication 2, dans lequel : - l’éclairage et l’acquisition sont réalisés directement sur un échantillon comprenant une colonie de la souche bactérienne et un milieu nutritif sur lequel ladite colonie a poussé, le milieu nutritif étant une gélose au sang, en particulier un columbia de sang de mouton ; - si l’intensité lumineuse acquise n’est pas celle d’une souche bactérienne de type Gram négatif et fermentante, la détermination du type de Gram et du caractère fermentant comporte en outre l’application d’une classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une souche bactérienne du type Gram positif.
6. Procédé de détection selon la revendication 5, dans lequel, si l’intensité lumineuse acquise n’est pas celle d’une souche bactérienne de type Gram positif, la détermination du type de Gram et du caractère fermentant comporte en outre l’application d’une classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une levure.
7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel - la classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une souche bactérienne de type Gram négatif et fermentante est une classification distinguant l’intensité lumineuse des souches bactériennes de type Gram négatif et fermentantes de l’intensité lumineuse de l’ensemble constitué des souches bactérienne de type négatif et non fermentantes, des souches bactérienne de type Gram positif et des levures ; - la classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une souche bactérienne de type Gram positif est une classification distinguant l’intensité lumineuse des souches bactérienne de type Gram positif de l’intensité lumineuse de l’ensemble constitué des souches bactérienne de type négatif et non fermentantes et des levures. - la classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une levure est une classification distinguant l’intensité lumineuse des levures de l’intensité lumineuse de l’ensemble constitué des souches bactérienne de type Gram négatif et non fermentantes.
8. Procédé selon la revendication 4, dans lequel, si l’intensité lumineuse acquise n’est pas celle d’une levure, la détermination du type de Gram et du caractère fermentant comporte en outre l’application d’une classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une souche bactérienne de type Gram positif.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel, si l’intensité lumineuse acquise n’est pas celle d’une souche bactérienne de type Gram positif, la détermination du type de Gram et du caractère fermentant comporte en outre l’application d’une classification prédisant si l’intensité lumineuse est celle d’une souche bactérienne de type Gram négatif et fermentante ou d’une souche bactérienne de type Gram négatif et non fermentante.
10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel : - la classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une levure est une classification distinguant l’intensité lumineuse des levures de l’intensité lumineuse de l’ensemble constitué des souches bactériennes de type Gram positif, des souches bactériennes de type Gram négatif et non fermentantes et des souches bactériennes de type Gram négatif et fermentantes ; - la classification prédisant si l’intensité lumineuse est celle d’une souche bactérienne de type Gram positif est une classification distinguant l’intensité lumineuse des souches bactériennes de type Gram positif de l’intensité lumineuse de l’ensemble constitué des souches bactériennes de type Gram négatif et non fermentantes et des souches bactériennes de type Gram négatif et fermentantes ; - la classification si l’intensité lumineuse est celle d’une souche bactérienne de type Gram négatif et fermentante ou d’une souche bactérienne de type Gram négatif et non fermentante est une classification distinguant l’intensité lumineuse des souches bactériennes de type Gram négatif et non fermentantes de l’intensité lumineuse du groupe constitué des souches bactériennes de type Gram négatif et fermentantes ;
11. Procédé selon la revendication 3, dans lequel : - l’éclairage et l’acquisition sont réalisés directement sur un échantillon comprenant une colonie de la souche bactérienne et un milieu nutritif sur lequel ladite colonie a poussé, le milieu nutritif étant une gélose Tryptone-Soja ; - si l’intensité lumineuse acquise n’est pas celle d’une souche bactérienne de type Gram positif, la détermination du type de Gram et du caractère fermentant comporte en outre l’application d’une classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une levure.
12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel, si l’intensité lumineuse acquise n’est pas celle d’une levure, la détermination du type de Gram et du caractère fermentant comporte en outre l’application d’une classification prédisant si l’intensité lumineuse est celle d’une souche bactérienne de type Gram négatif et fermentante ou d’une souche bactérienne de type Gram négatif et non fermentante.
13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel : - la classification prédisant si l’intensité lumineuse est celle d’une souche bactérienne de type Gram positif est une classification distinguant l’intensité lumineuse des souches bactériennes de type Gram positif de l’intensité lumineuse de l’ensemble constitué des souches bactériennes de type Gram négatif et non fermentantes, des souches bactériennes de type Gram négatif et fermentantes et des levures; - la classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle levure est une classification distinguant l’intensité lumineuse des levures de l’intensité de l’ensemble constitué des souches bactérienne de type négatif et non fermentantes et des souches bactérienne de type négatif et fermentantes; - la classification si l’intensité lumineuse est celle d’une souche bactérienne de type Gram négatif et fermentante ou d’une souche bactérienne de type Gram négatif et non fermentante est une classification distinguant l’intensité lumineuse des souches bactériennes de type Gram négatif et non fermentantes de l’intensité lumineuse du groupe constitué des souches bactériennes de type Gram négatif et fermentantes .
14. Procédé selon l’une des revendications 2 à 13, dans chaque classification est apprise sur des images hyperspectrales de la gamme 390nm-900 nm et selon une approche consistant à augmenter pas-à-pas un ensemble de canaux spectraux utilisés dans la classification jusqu’à obtention d’un seuil de précision prédéterminé ou d’un nombre maximal de canaux prédéterminé.
15. Procédé de détection selon la revendications 2, dans laquelle la première classification distingue les intensités lumineuses en fonction de la gamme de longueurs d’onde 470nm-500 nm et de la gamme de longueurs d’onde 575-645 nm uniquement.
16. Procédé de détection selon la revendication 3, dans laquelle la seconde classification distingue les intensités lumineuses en fonction de la gamme de longueurs d’onde 535nm - 675 nm et de la gamme de longueurs d’onde 850 nm-875 nm uniquement.
17. Procédé de détection selon l’une des revendications 5 à 7, dans laquelle la seconde classification distingue les intensités lumineuses en fonction de la gamme de longueurs d’onde 415nm - 500nm et de la gamme de longueurs d’onde 535 nm - 675 nm uniquement.
18. Procédé de détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l’intensité lumineuse est acquise sur un nombre de canaux spectraux inférieur ou égal à 24.
19. Procédé de détection selon l’une quelconque des revendications 5 à 7, dans laquelle l’intensité lumineuse est acquise sur un nombre de canaux spectraux inférieur ou égal à 5 pour chacune des première et seconde classifications, et de préférence inférieur ou égal à 4.
20. Procédé de détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l’acquisition de l’intensité lumineuse comporte l’acquisition d’une image hyperspectrale ou multispectrale d’une colonie de bactérie de la souche, et dans laquelle l’intensité lumineuse est déterminée en fonction d’au moins un pixel de ladite image correspondant à la colonie.
21. Procédé de détection selon la revendication 20, dans laquelle la détermination du type de Gram et du caractère fermentant est réalisée en fonction de l’intensité lumineuse de chaque pixel d’un ensemble de pixels de la colonie, et dans laquelle le type de Gram et le caractère fermentant sont déterminés par un vote majoritaire des résultats desdites premières détections.
22. Procédé de détection selon la revendication 21, dans laquelle la vote majoritaire est un vote à 70% des pixels ou plus ou un vote à la majorité simple.
23. Procédé de réalisation d’un antibiogramme d’une souche bactérienne à un antibiotique comprenant : - la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne ; - le réalisation d’au moins un échantillon comprenant la souche bactérienne, un milieu de culture et une concentration d’un antibiotique en fonction du type de Gram et du caractère fermentant choisi; et - la détermination de la sensibilité de la souche bactérienne à l’antibiotique en fonction de la pousse de ladite souche dans l’échantillon, procédé dans lequel la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne est réalisée selon un procédé conforme à l’une quelconque des revendications précédentes.
24. Procédé d’identification d’une souche bactérienne à un antibiotique comprenant : - la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne ; - le choix d’au moins un milieu colorimétrique en fonction du type de Gram et du caractère fermentant choisi; et - la mise en culture dans ledit milieu de la souche bactérienne, procédé dans lequel la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne est réalisée selon un procédé conforme l’une quelconque des revendications 1 à 22.
25. Système de détection du type de Gram et du caractère fermentant d’une souche bactérienne, comprenant : - un éclairage configuré pour éclairer, dans la gamine de longueurs d'onde 390nm-900 nm, au moins une bactérie de la souche; - un capteur configuré pour acquérir, dans la gamme 390nm-9Q0nm, une intensité lumineuse réfléchie par, ou transmise au travers de, ladite bactérie éclairée; et - une unité informatique configurée pour déterminer du type de Gram et du caractères fermentant de la souche bactérienne en fonction de l'intensité lumineuse acquise dans la gamme 390nm-900nm.
26. Système selon la revendication 25, configuré pour mettre en œuvre pu procédé conforme à l'une des revendications 2 à 22.
27. Système selon la revendication 25 ou 26, configuré pour éclairer, et acquérir l'image de, un échantillon comprenant une colonie dé bactéries de ladite souche et milieu nutritif sur lequel ladite colonie a poussé, en particulier une boite de Pétri.