WO2019122732A1 - Procede et systeme d'identification du type de gram d'une bacterie - Google Patents

Procede et systeme d'identification du type de gram d'une bacterie Download PDF

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WO2019122732A1
WO2019122732A1 PCT/FR2018/053434 FR2018053434W WO2019122732A1 WO 2019122732 A1 WO2019122732 A1 WO 2019122732A1 FR 2018053434 W FR2018053434 W FR 2018053434W WO 2019122732 A1 WO2019122732 A1 WO 2019122732A1
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WO
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gram
fermenting
light intensity
bacterial strain
type
Prior art date
Application number
PCT/FR2018/053434
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Inventor
Jordane LALLEMAND
Denis Leroux
Manuel PETIT
Original Assignee
bioMérieux
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Publication date
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Priority to US16/772,402 priority patent/US12006529B2/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/28—Investigating the spectrum
    • G01J3/2803—Investigating the spectrum using photoelectric array detector
    • G—PHYSICS
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    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/28—Investigating the spectrum
    • G01J3/2823—Imaging spectrometer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/12—Circuits of general importance; Signal processing
    • G01N2201/129—Using chemometrical methods

Definitions

  • the invention relates to the field of microbiological analysis, and in particular to the characterization of microorganisms, in particular the identification of yeasts and bacteria, and in the context of the latter, the identification of their Gram type and their identity. fermenting character or not.
  • the invention applies to the analysis of a hyperspectral or multispectral image of a bacterial colony or yeast grown in a non-chromogenic, non-fluorogenic and dye-free nutrient medium.
  • the characterization of a microorganism preferably consists in identifying its species and sensitivity to an antimicrobial agent (or "antibiogram"), in order to determine a treatment for the patient infected by this microorganism.
  • an antimicrobial agent or "antibiogram”
  • a complex microbiological process is usually carried out in the laboratory, a process that most often requires prior knowledge of other properties of the microorganism, particularly its reign (eg yeast or bacteria), and in the bacterial setting its type of microbiology. Gram or its fermental character or not.
  • this information makes it possible in particular to choose a culture medium or a type of antimicrobial agent adapted to the microorganism in order to determine, in fine, its species or its antibiogram.
  • the choice of an identification gallery API microorganisms ® marketed by the Applicant is based on the knowledge of the reign of the microorganism (eg yeast vs. bacterial) or the type of Gram of the bacterial strain to be identified.
  • the determination of the antibiogram of a bacterial strain by the Vitek ® 2 system marketed by the applicant is based on the choice of a map depending on the type of gram and the fermenting nature or not of said strain. It is also possible to mention the MALDI-TOF mass spectrometry identification using a different matrix depending on whether the microorganism to be identified is a yeast or a bacterium. Thus knowing this information as soon as possible makes it possible to optimize the microbiological process, in particular by accelerating the latter or reducing the number of consumables used.
  • the Gram classification of a bacterial strain makes it possible to characterize the wall thereof, for example its percentage of peptidoglycan, and is used in the taxonomy of bacteria or to evaluate as a first approximation their sensitivity to antibiotics.
  • bacteria There are two types of bacteria, namely Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria.
  • non-fermenting bacteria i.e. bacteria unable to catabolize glucose, have a special place in pathogenic bacteria. Indeed, they have a high level of natural resistance to antibiotics and are involved in many nosocomial infections.
  • each of the properties mentioned above is obtained by a dedicated technique.
  • the type of Gram of a bacterial strain was determined by a manual technique known as "Gram stain", which includes a large number of manual steps (fixation, staining, etching, washing, staining ...) , and therefore long to implement.
  • Gram stain a manual technique known as "Gram stain”
  • Various techniques have therefore been developed to automate the detection of Gram type bacteria, in particular to process a large number of samples.
  • these techniques essentially continue to modify the electromagnetic response of bacteria or their environment to make their Gram easily observable.
  • a first type of technique consists in automating the staining of the bacterial membrane on microscope slides, but the final decision step concerning the Gram type is always performed by a technician who observes the slides under a microscope.
  • This type of technique is not fully automated, and also difficult to automate. Indeed, the difference in color between Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria can be subtle, explaining why the intervention of a laboratory technician is still needed.
  • a second type of technique consists in putting bacteria in the presence of a substrate which is degraded by an enzymatic reaction initiated by the peptidoglycan membranes of bacteria. This reaction produces chromophores or fluorophores whose concentration is a indication of Gram. We usually speak of "marking" chromogenic or fluorogenic bacteria.
  • this type of state-of-the-art technique is automatable, for example by measuring the luminous intensity of the chromophores / fluorophores using an appropriate device (eg spectrometer / fluorometer) and then comparing the intensity by computer measured at predefined threshold values, they nonetheless assume the design of particular chromophoric or fluorogenic substrates, which are often expensive. Moreover, whatever the technique used, the bacteria undergo a modification of their natural state (eg they include dyes, fixed chromogenic or fluorescent markers, etc.), and are therefore no longer usable for subsequent characterization tests. (eg the determination of an antibiotic Gram).
  • the "Kligler-Hajna" test consists in growing the strain on a culture medium comprising a colorimetric indicator that changes color as a function of pH, lactose, glucose of the thiosulfate and ferrous ions. This medium detects the fermenting nature of the bacterium by the catabolization of glucose which results in a colorimetric shift of the pH indicator.
  • test media for tributyrin esterase activity of the bacterial strain which make it possible to characterize gram-negative and non-fermenting bacteria.
  • the object of the present invention is to propose a method for determining the type of Gram and the fermenting nature of a bacterial strain which is automatic and which does not require labeling or staining the bacterium or its culture medium to determine these characteristics.
  • the subject of the invention is a method for detecting the type of Gram and the fermenting nature of a bacterial strain, comprising:
  • the term "natural electromagnetic response" means that the bacterium is not modified using elements (dye, chromogenic, fluorogenic, etc.) which modify its electromagnetic response to at least one illumination. in the range of wavelengths of interest.
  • a colony of the strain is cultured in a non-chromogenic and non-fluorescent nutrient medium and the lighting / acquisition is done directly on the colony still present in its environment.
  • the inventors have discovered that in the 390nm-900nm wavelength range a bacterium has "naturally" an electromagnetic signature characteristic of its Gram type and its fermenting or non-fermenting nature.
  • the process according to the invention thus consists in measuring this signature and then in extracting the type of Gram and the fermenting nature of the bacterium.
  • it is not necessary to use a chromogenic or fluorogenic substrate or dyes.
  • the method according to the invention is fast insofar as it consists in illuminating, measuring a spectrum and performing a treatment, including computer processing, of this spectrum.
  • the invention it is possible to determine by the 390-900nm range whether the bacterial strain is Gram-positive or Gram-negative and fermenting or Gram-negative and non-fermenting, the knowledge of this information allowing for example to optimize a microbiological laboratory process as described above.
  • the determination of the type of Gram and fermenting character is carried out directly from the acquired light intensity, without requiring the prior determination of the species or genus or family of the bacterial strain.
  • the method of the invention differs from a method according to which the species of the bacterial strain is first identified, then Gram and the fermenting character are deduced from the knowledge of the species.
  • the fact of not having to identify at the species level the bacterial strain has the advantage of greatly simplifying the Gram prediction model and the fermenting nature.
  • a species-level identification requires a prediction model with a very high number of classes. As an example in case of urinary infection, it is estimated that an infection is caused in 99% of cases by a bacterial strain among fifty bacterial species. An identification at the species level therefore requires a prediction of about fifty classes.
  • the prediction model can be limited to four classes.
  • the process is applied to a petri dish comprising a nutrient agar medium on which colonies of microorganisms have grown.
  • the nutrient medium is inoculated with a biological sample containing, or suspected of containing, yeasts or bacteria, eg urine, and then cultured for growth. colonies.
  • a colony is detected on the nutrient medium, it is characterized according to the method of the invention.
  • the process does not require any transfer of material or addition of reagent following the seeding of the nutrient medium.
  • the detection of a colony is for example performed automatically by taking at regular intervals images of the petri dish and the implementation of a colony detection algorithm.
  • the method according to the invention is not based on the analysis of the auto fluorescence of the bacterial strain but on the analysis of the reflectance or the absorbance of said strain.
  • the illumination is generally too intense for the auto fluorescence to be observable on a hyperspectral or multispectral image.
  • the invention also relates to a method for producing an antibiogram of a bacterial strain with an antibiotic comprising:
  • the invention also relates to a method for identifying a bacterial strain with an antibiotic comprising:
  • the invention also relates to a system for implementing the method just described.
  • the subject of the invention is a Gram type detection detection system and the fermenting nature of a bacterial strain, comprising:
  • lighting configured to illuminate, in the 390nm-900 nm wavelength range, at least one bacterium of the strain; a sensor configured to acquire, in the range 390 nm-900 nm, a light intensity reflected by, or transmitted through, said illuminated bacteria; and
  • a computer unit configured to determine the type of Gram and the fermenting nature of the bacterial strain according to the light intensity acquired in the range 390nm-900nm.
  • the system is configured to illuminate, and acquire the image of, a sample comprising a colony of bacteria of said strain and nutrient medium on which said colony has grown, in particular a petri dish.
  • the invention also relates to a method of calibrating a system for implementing a method according to the invention, the system comprising:
  • lighting configured to illuminate, in the 390nm-900 nm wavelength range, at least one bacterium of the strain
  • a sensor configured to acquire, in the range 390 nm-900 nm, a light intensity reflected by, or transmitted through, said illuminated bacteria
  • a computer unit comprising a computer memory capable of containing instructions for analyzing the intensity acquired by the sensor and a microprocessor able to execute the analysis instructions contained in the computer memory
  • the calibration method comprising the steps:
  • a learning database comprising light intensities in the range 390nm-900nm of illuminated bacterial strains in said range, said strains being associated with different types of Gram and different fermenting characters;
  • the invention also relates to a therapeutic method comprising:
  • detecting one or more bacterial strains present in the sample advantageously by seeding an agar culture medium with the sample, culturing said seeded medium to grow bacterial colonies and detecting one or more bacterial colonies having grown; the detection of the type of Gram or the fermenting nature of the bacterial strains detected according to a process of the aforementioned type;
  • Figure 1 is a schematic view of a hyperspectral system according to the invention.
  • Figure 2 is a schematic view of a multispectral system according to the invention.
  • Fig. 3 is an exemplary transmission spectrum of a bandpass filter used in the system of Fig. 2;
  • FIG. 4 is a flowchart of a Y, GP, GNF, GNN classes prediction method implemented using the system of FIG. 1 or FIG. 2;
  • FIG. 5 is a flowchart of a method for selecting discriminating spectral channels using the step-forward approach
  • FIG. 6 is a flowchart of a method for learning Y, GP, GNF, GNN class prediction models
  • Fig. 7A is a graph illustrating a flat prediction model of classes Y, GP, GNF, GNN;
  • FIG. 7B is a graph illustrating a hierarchical prediction model according to a phylogenetic tree of classes Y, GP, GNF, GNN;
  • FIG. 7C is a graph illustrating a hierarchical prediction model according to an optimal tree of classes Y, GP, GNF, GNN;
  • FIG. 8 is a table describing the bacterial and yeast species used for prediction model learning of Y, GP, GNF, GNN classes;
  • FIGS. 9 and 10 are tables, respectively for the COS medium and the TSA medium, describing the number of pixels, and therefore of spectra, used for calibration and cross-validation of the prediction models;
  • FIG. 11 is a graph illustrating the calculation of a weighted prediction rate, or "balanced classification rate"
  • FIG. 12 is a graph illustrating the spatial distribution of the main discriminant spectral channels for the optimum tree of the COS medium
  • FIG. 13 is a graph illustrating the spatial distribution of the 5 main discriminating spectral channels of each model for the optimum tree of the CO S medium;
  • FIG. 14 is a graph individually illustrating the five main discriminant channels of each model of the optimum tree of the COS medium;
  • Fig. 15 is a graph illustrating the spatial distribution of the main discriminant spectral channels for the optimal tree of TSA medium
  • FIG. 16 is a graph illustrating the spatial distribution of the main discriminating spectral channels for the optimum tree of the COS medium.
  • FIG. 17 is a graph respectively illustrating the 12, 8 and 11 main discriminant channels associated respectively with the first, second and third prediction models of the optimal tree of the TSA medium;
  • FIGS. 18 to 20 are graphs respectively illustrating the first, second and third prediction models of the phylogenetic tree, the graph at the top of each figure corresponding to the TSA medium and the graph at the bottom of each figure corresponding to the COS mediums.
  • a hyperspectral system for characterizing colonies of yeasts or bacteria grown on agar plate in Petri dishes comprises:
  • a computer data processing unit 14 connected (e.g., via a wire or wireless link), to the device 12 for its control and for the reception and processing of the images acquired by the device 12.
  • the device 12 for example a hyperspectral imaging system of reference "Pika II" of the company Resonon, Montana USA, comprises:
  • a front lighting 24 for example consisting of one or more allogenic lamps, eg 2 or 4 lamps, capable of emitting light in the range [A mi ; To max ] and to realize a uniform front lighting of the petri dish 22.
  • the lights are white light lamps;
  • a rear light 26 for example consisting of a matrix of white light LEDs, to achieve uniform rear illumination of the petri dish 22 in the range
  • the device 12 is for example configured to acquire the image of a region of 90 millimeters by 90 millimeters with a sampling rate of 160 microns (spatial resolution estimated at 300 micrometers) and with a spectral resolution of 1.7 nanometers on the range 12 min ⁇ max ⁇ ⁇
  • the device 12 thus produces a digital image H SI of the light reflected by the petri dish, having N lines and M columns, the petri dish 22 being preferably open (i.e. without its lid):
  • the radiance of a pixel corresponds to the amount of light incident on the surface of the corresponding elementary sensitive site of the camera sensor 18 during the exposure time, as is known per se. field of digital photography for example.
  • Each pixel f? Ad £ J - (1) consists of a digital spectrum of the radiance of the box 22 corresponding to the pixel at different wavelengths A max ], the digital spectrum expressing itself according to the relation: where D l is the spectral resolution and p is a positive integer belonging to [n
  • the acquisition wavelengths At min + px D1 are usually referred to as "channels”.
  • the data processing unit 14 is, for example, a personal computer, a tablet, a smartphone, a server, a supercomputer, or more generally any system based on a microprocessor (s), in particular of the DSP ("digital signal processor") type. ), based on FPGA type circuits, based on circuits mixing these types of technology, etc., configured to implement a processing of the HSI images produced by the acquisition device 12.
  • the unit 14 is notably provided with all the memories (RAM, ROM, cache, mass memory, ...) for storing the images produced by the device 12, computer instructions for implementing the method according to the invention, useful parameters this implementation and for memorizing the results of the intermediate and final calculations.
  • the unit 14 optionally comprises a display screen for visualizing the final result of the characterization of the colonies, in particular the determination of the type of Gram and / or the fermenting nature, and / or the bacterial or yeast nature of the colonies studied. .
  • a processing unit eg a unit embedded in the camera 18 to implement a preprocessing of HSI images and a unit external to the device 12 for the implementation of the rest of the treatment).
  • the system may be supplemented by an interface making it possible to enter in the unit 14 data relating to the sample, in particular the type of culture medium used when the prediction depends on the medium, for example by means of a keyboard / mouse and a drop-down menu available to the operator, a bar code / QR code reader reading a barcode / QR code present on the petri dish and including information on the medium, etc.
  • the hyperspectral system of Figure 1 has the advantage of being agile in terms of acquisition wavelengths because it can adapt to different prediction models of the class of colonies and use a large number of spectral channels to increase the accuracy of the prediction.
  • a system is generally less resolute spatially a conventional CMOS or CCD camera whose purpose is only to acquire an image in intensity of the light incident on its sensor.
  • a multispectral system 32 differs from the hyperspectral system 10 by the camera 32, advantageously a CMOS or CCD camera of high spatial resolution, coupled to a set of spectral filters 36, for example arranged in front of the objective 20 between the objective 20 and the sensor of the camera 32.
  • the filter assembly 36 is constituted by a number N F of distinct band-pass filters, each configured to transmit only the light in a range [l-1 2 ] the range [A min) A max ⁇ , with a spectral width at half maximum height (or FWHM for "full width half maximum") less than or equal to 50nm, and preferably less than or equal to 20nm.
  • the transmission spectrum of such a filter is illustrated in FIG. 3.
  • the assembly 36 is for example a filter wheel capable of accommodating up to 24 different filters, wheel driven by the unit 14 which actuates it to scroll in front of the camera said filters and order an image for each of them.
  • each pixel Rad t j A) consists of a digital spectrum of the radiance of the box 22 corresponding to the pixel at the different spectral bands filtered by the set 36, the digital spectrum s 'expressing according to the relation:
  • l 1 , l 2 , ..., l Nr are respectively the central wavelengths of the spectral filters of the set 36.
  • a method 40 of characterizing microorganisms contained in a biological sample eg urine, blood, bronchoalveolar sample, etc.
  • a biological sample eg urine, blood, bronchoalveolar sample, etc.
  • this process advantageously finds application in the context of a more global process for identifying the microorganisms contained in said sample by means of MALDI-TOF mass spectrometry (eg Vitek® MS marketed by the Applicant) and an antibiogram of said microorganisms (eg using the platform Vitek® 2 marketed by the Applicant).
  • MALDI-TOF mass spectrometry eg Vitek® MS marketed by the Applicant
  • an antibiogram of said microorganisms eg using the platform Vitek® 2 marketed by the Applicant.
  • each of these techniques requires the choice of media and / or reagents and / or consumables. depending on the type of microorganism.
  • the identification of yeasts by MALDI-TOF mass spectrometry advantageously involves the use of formic acid in the matrix used in this type of technology.
  • the choice of the Vitek® 2 platform map depends on the bacterial nature of the microorganism tested. Notably, Gram-negative and fermenting bacteria require a special card to perform their antibiogram.
  • the characterization method of characterization described hereinafter makes it possible, from the first push on a petri dish, to obtain the necessary information on the microorganisms for the rest of the microbiological process, in particular whether a colony having a yeast ("Y”) or a bacterium, and in the case of a bacterium, whether that bacterium is Gram positive (“GP") or Gram negative (“GN”), and in the Gram-negative bacteria frame, if this bacterium is fermenting ("GNF”) or non-fermenting ("GNN”).
  • the method thus makes it possible to predict the class of a microorganism, to have the class Y, GP, GNF or GNN.
  • a petri dish is seeded with a biological sample, eg taken from a patient, so as to grow colonies of yeast or bacteria on the surface of a nutrient medium, or "culture Deposited in the Petri dish.
  • the main purpose of the nutrient medium is to grow the said colony, and optionally to enhance the accuracy of the characterization by limiting the light disturbances.
  • the nutrient medium is opaque, which increases the accuracy of the detection.
  • the opaque medium has a reflectance factor p less than or equal to 10%, and preferably less than or equal to 5%, and even more preferably less than or equal to 1%.
  • the culture medium a so-called “CPSO” agar (“CPS” agar comprising Si0 2 to opacify the medium), a "columbia” agar (or “CNA” agar), a Columbia agar with 5% blood mutton (or “COS” agar), Man, Rogosa, Sharpe agar (MRSM agar), chocolate agar (“PVX” agar), Tryptone-Soy agar (“TSA” agar) etc.
  • CPS CPSO
  • CNA CNA
  • COS Columbia agar with 5% blood mutton
  • MRSM Sharpe agar
  • PVX chocolate agar
  • TSA Tryptone-Soy agar
  • This type of colony shoot being conventional, it will not be described in more detail later. It can advantageously be implemented manually by an operator or automatically by means of a seeding automat in a manner known per se.
  • the preparation is carried out so that the colonies, on the basis of which the characterization of the microorganism is carried out, are spaced apart from each other and so that the surface of a colony corresponds to a plurality of pixels in the image acquired by the device 12. This allows in particular to facilitate their subsequent identification in the acquired image, and therefore their segmentation by means of an image processing algorithm or their extraction in the image by a user.
  • the Petri dish is preferably open, arranged on the carriage 28, the lights 24 and 26 are lit and at least one hyperspectral image (respectively multispectral) HSI of the petri dish is acquired, at 44, using the acquisition device 12 (respectively 32) and stored in the processing unit 14, which implements a computer processing to determine the microorganism type constituent of the colony from acquired images.
  • the unit 14 optionally starts, at 46, with a pretreatment of the noise, consisting of one of the following treatments or any combination of these treatments:
  • a treatment of parasitic reflections, especially specular forming "highlights" in the HSI image eg., a thresholding implemented to eliminate pixels having values greater than a predetermined threshold, eg greater than or equal to two-thirds of the maximum value that the pixels can take (ie greater than or equal to 170 in the case of coded pixels on 8 bits between 0 and 255);
  • a ratiometric treatment to attenuate the variations in the images caused by external fluctuations such as variations in illumination, by dividing the HSI image by a luminous intensity reflected at a wavelength that is invariant with the type of bacterium and the type of agar used;
  • the processing continues, at 48, by transforming the pretreated HSI image, which stores radiance values at different wavelengths, into a hyperspectral or multispectral reflectance image in order to extract the signal generated. by the petri dish alone.
  • This makes it possible, in particular, to filter the fluctuations of the emission spectrum of the light sources 24, 26.
  • a correction of the "flat field correction" (FFC) type is implemented to obtain the reflectance, which furthermore presents the advantage of correcting the pixel-to-pixel sensor response dispersions (dark current dispersion, gain dispersion, etc.).
  • this transformation is for example a correction according to the relations: V (ù j) e [1, N] x [1, M], Vp G [0, P]:
  • W is a hyperspectral image stored in the unit 14 of a high reflectance neutral object and illuminated by the illuminances 24, 26, e.g. a uniform reflectance sheet greater than 90% (Eg a sheet called "white” or a gray scale less than 10%)
  • B is a hyperspectral image stored in the unit 14 of a neutral object of low reflectance, for example the image of a cap black shutter equal to the average of the matrix W (At min + px
  • the transformation is for example a correction according to the relation:
  • W is a multispectral image stored in the unit 14 of a neutral object of high reflectance and illuminated by the lights 24, 26, for example a sheet of uniform reflectance greater than 90% (eg a so-called "white” sheet or a gray scale of less than 10%)
  • the unit 14 implements at 50, following step 38 or in parallel with the preceding steps, an algorithm for identifying the colonies of bacteria, eg from the image 57 (A) or U (FIG. ).
  • Any form recognition algorithm and conventional object can be implemented to extract an area of the image, called "Col (A)", corresponding to a colony.
  • this selection is made manually by an operator who selects this area with the help of the display screen and a pointing mechanism of the mouse type for example.
  • the Col (A) field consists of a list of pixel coordinates belonging to the colony. The selected pixel areas are stored by the unit 14.
  • the method continues, at 52, by predicting the Y, GP, GNF or GNN class of the microorganism of the colony according to at least one spectrum of the Col (A) zone by applying predefined decision rules, of which variants are described below.
  • this prediction is performed as a function of the spectrum Y £ (A) of each pixel (i, j) of the zone Col (l).
  • a first prediction of the class is made for each pixel (i, j) of the zone Col (A), then a majority vote is implemented for the final prediction of the class.
  • a simple majority vote is implemented, that is to say that the class predicted on the largest number of pixels in the Col (A) zone is the class finally selected.
  • a qualified vote is implemented, that is to say that the class finally selected is that which is predicted on more than X% of the number pixels constituting the area Col (A), with X strictly greater than 50%, and preferably greater than or equal to 70%. If no class fulfills this condition, then the process returns an absence of class prediction.
  • the class of the colony can be made using a single value, for example the average spectrum Y co £ (A) of spectra of the
  • the Y, GP, GNF or GNN class of each colony by the unit 14 is performed by applying predefined prediction rules, variants of which are described below.
  • the predicted classes are stored in the unit 14 and / or displayed on a screen for the user. This prediction is also advantageously delivered to another microbial analysis instrument for a subsequent identification and / or antibiogram step of the microorganisms that formed the colonies.
  • a learning database For each class Y, GP, GNF and GNN, bacteria and yeasts are selected and each of them is seeded on an agar plate in a petri dish, cultured for a predetermined time and a hyperspectral image of the box is acquired with the system described in Figure 1, and therefore under the same illumination conditions and in wavelength range 390nm-900nm.
  • the pixels of the colonies grown on the agar are extracted, for example as described in steps 46-50 of the method 40, and their associated spectra stored in the training database.
  • the latter thus comprises four sets of spectra ⁇ Y ⁇ (A) ⁇ , ⁇ Y p (A) ⁇ , ⁇ Y ⁇ F (A) ⁇ , ⁇ Y ⁇ (A) ⁇ respectively associated with classes Y, GP, GNF, GNN.
  • Each of these sets is split in two, a first part, called “calibration” being used for the learning itself and a second part, called “cross validation”, being used to evaluate the performance of the models. calculated prediction, as is known in itself from the state of the art.
  • a computer implemented learning is implemented for the learning of prediction models.
  • This type of learning relies on the step-by-step selection of the most discriminating spectral channels, so that it is intrinsically parsimonious and adapted to the search for a multispectral application as implemented by the system of FIG.
  • the training 60 begins with an initialization step 62 in which a maximum number R of discriminant channels is selected, this number being between 1 and the number P of spectral channels of the hyperspectral camera used. for the acquisition of spectra.
  • the list of selected discriminating channel is emptied and a list / candidate channel is initialized to the set ⁇ l, l 2, ..., P ⁇ A dcs hypespectrale channels of the camera.
  • the list / is filled step by step with the R most discriminating channels of the list L by implementing an iterative step 66. More particularly for a given iteration r of step 64, the step 66:
  • a performance criterion 5C7? (/? fe ) of the prediction model /? k for example the good classification rate of the cross validation spectra.
  • Step 64 then continues, at 72, by the identification of the prediction model giving the best performance criterion and consequently the identification of the channel r of the list / the most discriminating in combination with the channels of the list. L.
  • the list L is then completed with the channel l t and the latter is removed from the list / for the next iteration r + 1 of step 64.
  • the learning process then ends, in 74 by storing the list L and the prediction hyperplane (£ ./3 ⁇ 4 ') associated with the latter, namely the last model identified in step 72.
  • the prediction models calculated in step 68 are of SVM (for "vector support machine"), "one against all”, linear kernel (or “linear kernel”) and flexible margin (or " soft margin ").
  • the model is learned by solving an optimization problem according to the following relationships for an iteration k of step 66 and an iteration r of step 64:
  • Y m (A) belonging to the class Cl or to the set Cl
  • M is the number of calibration spectra Y m ( ⁇ ) belonging to class C1 or
  • the model predicting the membership of the class Cl of a spectrum of a pixel Y £ (A) is thus achieved according to the following steps: the transformation of the spectrum Y £ (A) into a vector U [(1);
  • the application of a prediction rule of the class C1 as a function of the distance S c u for example the spectrum belongs to the class C1 if the sign of S ci is positive, and to the set Ci if this sign is negative
  • the learning is non-parsimonious and consists of using all the channels at the same time, the resulting prediction model being particularly adapted to a hyperspectral application using the system of FIG.
  • Y m ( ⁇ ) is a calibration spectrum Y m ( ⁇ ) belonging to the class Cl or to the set CL ⁇ ,
  • b a and b are vectors of dimension equal to the dimension of the calibration spectra Y ⁇ fe (A), and consequently of dimension equal to P,
  • M is the number of calibration spectra Y m ( ⁇ ) belonging to the class Cl or to the set C1, numbered from 1 to M,
  • Y m (l). b is the dot product between the vector Y m ( ⁇ ) and the vector b,
  • the model predicting the membership of the class Cl of a spectrum of a pixel Y; (X) is thus realized according to the following steps: - the calculation of a distance between the spectrum Y £ (A) and the hyperplane
  • the spectrum belongs to the class Cl if the sign of S d is positive, and to the set Cl if this sign is negative.
  • the method 80 for learning the prediction models begins with the constitution, at 82, of a learning database for classes Y, GP, GNF and GNN, as previously described. .
  • the method 80 continues, at 84, by determining a structure of the prediction models.
  • two types of model are possible, as respectively illustrated in Figure 7A on the one hand and in Figures 6B and 6C on the other hand.
  • the first type of prediction model illustrated in Figure 7A, consists in learning four models of "one against all" predictions 90, 72, 74, 76, namely a prediction of class Y against classes GP, GNF , GNN, a prediction of the class GP against classes Y, GNF, GNN, a prediction of the class GNF against classes Y, GP, GNN and a prediction of class GNN against classes Y, GP, GNF.
  • each prediction model is learned according to the learning database by implementing one of the learning tools described above in relation to the relations (6) or (7), the class C1 being equal to Y, GP, GNF GNN and the set Cl consisting of the other three classes;
  • the prediction of the Gram type and of the fermenting nature of a pixel is obtained by calculating (steps 90-96) the distances Sy, SGP, SGNF, SGNN of the spectrum Y i j O of said pixel respectively to hyperplanes
  • hyperplane hyperplanes (b g , b), , then determining the class of the pixel, in 88, according to the calculated distances.
  • the class chosen is that corresponding to the maximum distance.
  • the classes Y, GP, GNF and GNN are considered of equal importance, and consequently the identification errors also.
  • identifying a yeast Y in place of a GNN bacterium is as serious as identifying a GNF bacteria in place of a bacterium GNN.
  • the prediction models are organized according to a phylogenic taxonomic tree, which makes it possible to no longer consider the different classes with equal importance and to introduce a priori information, namely a piece of information. evolution that can influence the shape of the spectra. More particularly, this prediction model tree comprises:
  • a first model 100 consisting of distinguishing Y yeasts from GP, GNF and GNF bacteria
  • a second model 102 consisting of distinguishing GP bacteria from GNF and GNN bacteria
  • a third model 104 consisting of distinguishing GNF bacteria from GNN bacteria.
  • Each of the models 100-104 is obtained in the manner described above in relation to the relations (6) or (7) and the prediction of the membership of a pixel spectrum Y £ (A) to one of the classes Y , GP, GNF and GNN thus consists in calculating its distance Sy to the hyperplane of the first model 100 and if the sign of this distance is positive, the class Y is then predicted. Otherwise, the distance S GP to the hyperplane of the second model 102 is calculated and if the sign thereof is positive, then the class GP is predicted. Otherwise, the distance S GNF to the hyperplane of the third model 104 is calculated while the GNF class is predicted. Otherwise the GNN class is predicted.
  • the phenotypic model makes it possible to improve the accuracy of the prediction with respect to a flat prediction structure as illustrated in FIG. 7A
  • the inventors have however noted that the phenotypic tree is not necessarily the tree giving better results.
  • a tree may be preferred depending on the culture medium on which the microorganisms to be characterized have grown, a medium that influences the shape of the spectra.
  • an optimal prediction structure is determined according to the calibration spectra.
  • a) Y against GP, GNF and GNN, b) GP against Y, GNF and GNN, c) GNF against Y, GP and GNN, and d) GNN against Y, GP and GNF are calculated as described above and the model with the best prediction performance is retained to be the first model 110 of the optimal tree.
  • the class of the first model is discarded, and the three prediction models corresponding to the remaining classes are calculated.
  • the three models of the second stage are a) Y against GP and GNF, b) GP against Y, and GNF and c) GNF against Y and GP as described above.
  • the best of the three models is then kept to be the second model 112 of the optimal tree.
  • the classes of the first and second models 110 and 112 are discarded, and a prediction model between the two remaining classes is calculated as described above and retained as the third model 114 of the optimal tree.
  • the prediction of the membership of a pixel spectrum Y £ (A) to one of the classes Y, GP, GNF and GNN is then obtained by traversing the tree in a manner similar to that described in relation to the Figure 7B.
  • the learning method 80 continues, optionally, at 84, by a reduction in the number of spectral channels used for the prediction, this reduction being carried out by selection and / or by grouping channels.
  • this reduction being carried out by selection and / or by grouping channels.
  • the number of channels used can be fixed directly by the parameter R Alternatively, or additionally, additional channels providing no significant increase in model performance can be discarded.
  • the grouping of channels may also alternatively or additionally be carried out by dividing the range 390 nm-900 nm into intervals whose width corresponds to that of the filters as described above in relation to FIGS. 2 and 3.
  • a new learning based on the acquisition of spectra with the system of FIG. 2, is implemented to refine the models. prediction, this learning being similar to that described in relation with FIGS. 6 and 7.
  • a predetermined number R of discriminating channels As a variant, this number is not fixed a priori and a stopping criterion for the search for slots is a stagnation of the gain in performance as a function of the number of channels. If, for example, the addition of at least one channel does not increase the performance, for example the BCR detailed below, by more than X%, then the search for channels is stopped, with for example X less than or equal to at 2%.
  • the performance of the class prediction is advantageously calculated as equal to the average of the sensitivities of the class predictions (well-ranked spectral rates).
  • This weighted criterion also known as the "balance classification rate” or "BCR” makes it possible to take into account the numbers in pixels which are unbalanced, which is the case because of the size of the colonies which is variable according to the species.
  • BCR balance classification rate
  • Table 1 below gives the BCRs for a flat prediction model shown in Figure 7A and for prediction models obtained using relationships (7).
  • Table 3 Reading is noted from Table 3 that the performance gain is limited from the 8 th channel to the first model, and the 4 th channel to the third model. To obtain a multispectral application using 24 spectral filters, corresponding to the filter systems of the market, it is thus advantageously selected respectively 8 channels, 14 channels and 4 channels for the first, second and third models 110, 112, 114.
  • the performance of this embodiment is summarized in Table 4.
  • the four classes Y, GP, GNF and GNN can be efficiently predicted using only using the spectral information in a first range 415-500nm and a second range 535-675nm. Using these ranges only, BCRs are greater than or equal to 90%. By limiting the first range to 575-675nm, 4 channels are used only by model for near BCRs or greater than 90%. Optionally a third range 850-875 nm, corresponding to the rank 5 channel of the second model is used. More particularly, the prediction in the first range 415-500nm can be achieved only on the 415-440 nm and 470-495 nm ranges.
  • the invention thus covers any method for predicting classes Y, GP, GNF and GNN consisting in acquiring spectra in said ranges and predicting classes as a function of said spectra only in said ranges. Note also that if the invention makes it possible to distinguish between classes Y, GP, GNF and GNN, it thus makes it possible to distinguish between yeasts and bacteria, and this using the spectral information contained in the aforementioned range.
  • the invention therefore also covers a method for predicting the yeast or bacterial nature of a microorganism to be characterized;
  • the prediction of the GNF class against Y + GP + GNN can be performed efficiently only on a first range 470-5 OOnm and a second range 575-645nm.
  • the invention thus covers any class prediction method, the GNF class consisting in acquiring spectra in said ranges and predicting the GNF class as a function of said spectra only in said ranges. It will be noted that when the bacterial character of the microorganism to be characterized is already known, the prediction then consists in predicting the GNF class against GP and GNN. The invention therefore also covers this type of prediction based solely on the ranges 470-5OOnm and 575-645nm;
  • the prediction of the GP class against Y + GNN can be efficiently performed only on the first range 535-675 nm, and more particularly on the range 585-675nm, and the second range 850-875nm.
  • the invention thus covers any method of class prediction GP class consisting of acquiring spectra in said ranges and predicting the class GP as a function of said spectra only in said ranges. It will be noted that when the bacterial character of the microorganism to be characterized is already known, the prediction then consists in predicting the GP class against the classes GNF and GNN, and consequently by the class GP against the class of Gram-negative bacteria (GN).
  • the invention therefore also covers this type of prediction based solely on the 535-675 nm ranges, and more particularly on the 585-675nm range, and the 850-875nm range;
  • Table 1 below gives the BCRs for a flat prediction model shown in Figure 7A and for prediction models obtained using relationships (7).
  • the optimal tree differs substantially from the phylogenetic tree, the influence of the COS medium probably being greater than the influence of differences carried by the phylogeny.
  • FIGS. 15 to 17 illustrate the spectral distribution of the main channels of the branches, in the same graph (FIG. 15), in a parsimonious approach with 12, 8 and 1 1 channels for the first, second and third models 110, 112 and 114, ( Figure 16) and by model ( Figure 17).
  • Table 10 Figures 18 to 20 illustrate the spectral distribution of the main spectral channels, model by model, with the TSA medium at the top of each of these figures and in comparison with the COS medium at the bottom of each of the figures.

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Abstract

Procédé de détection du type de Gram et du caractère fermentant d'une souche bactérienne, comportant: - l'éclairage dans la gamme de longueurs d'onde 390nm-900nm d'au moins une bactérie de ladite souche ayant une réponse électromagnétique naturelle dans ladite gamme; - l'acquisition, dans ladite gamme, d'une intensité lumineuse réfléchie par, ou transmise au travers de, ladite bactérie éclairée; et - la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne en fonction de l'intensité lumineuse acquise dans ladite gamme.

Description

PROCEDE ET SYSTEME D’IDENTIFICATION DU TYPE DE GRAM D’UNE BACTERIE
DOMAINE DE L’INVENTION
L’invention a trait au domaine de l’analyse microbiologique, et en particulier de la caractérisation de microorganismes, notamment l’identification de levures et de bactéries, et dans le cadre de ces dernières l’identification de leur type de Gram et de leur caractère fermentant ou non.
De manière avantageuse, l’invention s’applique à l’analyse d’une image hyperspectrale ou multispectrale d’une colonie bactérienne ou de levure ayant poussé dans un milieu nutritif non chromogène, non fluorogène et dépourvu de colorant.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Dans le domaine des microorganismes pathogènes, la caractérisation d’un microorganisme consiste préférentiellement à identifier son espèce et sa sensibilité à un agent antimicrobien, (ou « antibiogramme »), afin de déterminer un traitement pour le patient infecté par ce microorganisme. Pour ce faire, un processus microbiologique complexe est usuellement mis en œuvre en laboratoire, processus qui nécessite le plus souvent la connaissance préalable d’autres propriétés du microorganisme, notamment son règne (e.g. levure ou bactérie), et dans le cadre bactérien son type de Gram ou son caractère fermentaire ou non. En effet, ces informations permettent notamment de choisir un milieux de culture ou un type d’agents antimicrobien adaptés au microorganisme afin de déterminer, in fine, son espèce ou son antibiogramme. Par exemple, le choix d’une galerie d’identification de microorganismes API® commercialisée par la demanderesse se fonde sur la connaissance du règne du microorganisme (e.g. levure vs bactérie) ou du type de Gram de la souche bactérienne à identifier. De même la détermination de l’antibiogramme d’une souche bactérienne par le système Vitek ® 2 commercialisé par la demanderesse se fonde sur le choix d’une carte en fonction du type de Gram et du caractère fermentant ou non de ladite souche. Il est également possible de citer l’identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF employant une matrice différente selon que le microorganisme à identifier est une levure ou une bactérie. Ainsi connaître au plus tôt ces informations permet d’optimiser le processus microbiologique, notamment en accélérant ce dernier ou en réduisant le nombre de consommables employés.
La connaissance de ces propriétés permet également de réduire les faux positifs d’identification de souches bactériennes. A titre d’exemple, dans le cadre du milieu ChomID® Elite Medium commercialisé par la Demanderesse, la connaissance du caractère fermentant de la souche bactérienne testée robustifïe l’identification des salmonelles. En particulier, une salmonelle, bactérie fermentante, et une Pseudomonas, bactérie non fermentante, font toutes deux virer le substrat chromogène. Savoir si la bactérie est non fermentante permet ainsi d’écarter simplement la salmonelle sans test microbiologique supplémentaire.
Outre la caractérisation d’un microorganisme en vue d’orienter le processus microbiologique en laboratoire, ces informations ont également une utilité clinique. Notamment, la classification de Gram d’une souche de bactérie permet de caractériser la paroi celle-ci, par exemple son pourcentage en peptidoglycane, et est utilisé dans la taxonomie des bactéries ou pour évaluer en première approximation leur sensibilité aux antibiotiques. On distingue ainsi deux types de bactérie, à savoir les bactéries à Gram « positif » et les bactéries à Gram « négatif ». De même on observe que les bactéries non fermentantes, i.e. les bactéries incapables de cataboliser le glucose, occupent une place particulière chez les bactéries pathogènes. En effet, elles ont un niveau de résistance naturelle aux antibiotiques élevée et sont impliquées dans nombre d’infections nosocomiales. A titre d’exemple, on peut citer Pseudomonas aeruginosa et Acinetob acier. Connaître rapidement le caractère fermentant ou non d’une bactérie permet ainsi d’orienter plus efficacement l’antibiothérapie de première intention et de ralentir la diffusion de souches multirésitantes.
Historiquement, chacune des propriétés cités précédemment (règne, Gram et fermantant) est obtenu par une technique dédiée. Par exemple, le type de Gram d’une souche bactérienne était déterminé par une technique manuelle dite de « coloration de Gram », qui comprend un nombre important d’étapes manuelles (fixation, coloration, mordançage, lavage, sur coloration...), et donc longue à mettre en œuvre. Diverses techniques ont donc été mises au point pour automatiser la détection du type de Gram des bactéries, afin notamment de traiter un nombre important d’échantillons. Toutefois, ces techniques continuent pour l’essentiel à modifier la réponse électromagnétique des bactéries ou de leur milieu pour rendre leur Gram aisément observable. En particulier, un premier type de technique consiste à automatiser la coloration de la membrane bactérienne sur des lamelles de microscope, mais l’étape de décision finale concernant le type de Gram est toujours réalisée par un technicien qui observe les lamelles au microscope. Ce type de technique n’est donc pas entièrement automatisée, et par ailleurs difficilement automatisable. En effet, la différence de couleurs entre les bactéries de Gram positif et les bactéries de Gram négatif peut être subtil, expliquant pourquoi l’intervention d’un technicien de laboratoire est encore nécessaire. Un deuxième type de technique consiste à mettre des bactéries en présence d’un substrat qui se dégrade par une réaction enzymatique initiée par les peptidoglycanes des membranes des bactéries. Cette réaction produit des chromophores ou des fluorophores dont la concentration est une indication du Gram. On parle usuellement de « marquage » chromogène ou fluorogène des bactéries. Si ce type de techniques de l’état de l’art est automatisable, par exemple en mesurant l’intensité lumineuse des chromophores/fluorophores à l’aide d’un dispositif approprié (e.g. spectromètre/fluoromètre) puis en comparant informatiquement l’intensité mesurée à des valeurs de seuils prédéfinies, elles supposent néanmoins la conception de substrats chromophores ou fluorogènes particuliers, souvent coûteux. En outre, quelle que soit la technique employée, les bactéries subissent une modification de leur état naturel (e.g. elles comprennent des colorants, ont fixé des marqueurs chromogènes ou fluorescentes, etc.), et ne sont donc plus utilisables pour des tests de caractérisations ultérieurs (e.g. la détermination d’un antibio Gramme).
Concernant la détermination du caractère fermentant ou non d’une bactérie, elle est usuellement mise en œuvre l’emploi de milieu chromogènes qui changent de couleur en fonction du caractère fermentant ou non de la souche bactérienne testée. Par exemple, le test de « Kligler-Hajna » consiste à faire pousser la souche sur un milieu de culture comprenant un indicateur colorimétrique changeant de couleur en fonction du pH, du lactose, du glucose du thiosulfate et des ions ferreux. Ce milieu détecte le caractère fermentant de la bactérie par la catabolisation du glucose qui se traduit par virage colorimétrique de l’indicateur de pH. On peut également citer les milieux de test de l’activité de l’estérase de tributyrine de la souche bactérienne qui permettent de caractériser les bactéries à Gram négatif et non fermentantes.
EXPOSE DE L’INVENTION
Le but de la présente invention est de proposer un procédé de détermination du type de Gram et du caractère fermentant d’une souche de bactérie qui soit automatique et qui ne nécessite pas de marquer ou de colorer la bactérie ou son milieu de culture pour de déterminer ces caractéristiques.
A cet effet, l’invention a pour objet un procédé de détection du type de Gram et du caractère fermentant d’une souche bactérienne, comportant :
- l’éclairage dans la gamme de longueurs d’onde 390nm-900nm d’au moins une bactérie de ladite souche ayant une réponse électromagnétique naturelle dans ladite gamme;
- l’acquisition, dans ladite gamme, d’une intensité lumineuse réfléchie par, ou transmise au travers de, ladite bactérie éclairée; et
- la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne en fonction de l’intensité lumineuse acquise dans ladite gamme. Par réponse « électromagnétique naturelle », on entend au sens de l’invention que la bactérie n’est pas modifiée à l’aide d’éléments (colorant, chromogène, fluorogène, etc.) qui modifient sa réponse électromagnétique à un éclairage au moins dans la gamme de longueurs d’onde d’intérêt. Par exemple, une colonie de la souche est cultivée dans un milieu nutritif non chromogène et non fluorescent et l’éclairage/acquisition se fait directement sur la colonie encore présente dans son milieu.
En d’autres termes, les inventeurs ont découvert que dans la gamme de longueurs d’onde 390nm-900nm une bactérie a « naturellement » une signature électromagnétique caractéristique de son type de Gram et de son caractère fermentant ou non. Le procédé selon l’invention consiste ainsi à mesurer cette signature puis à en extraire le type de Gram et le caractère fermentant de la bactérie. Ainsi, il n’est pas nécessaire d’utiliser un substrat chromogène ou fluorogène ou des colorants. Par ailleurs, le procédé selon l’invention est rapide dans la mesure où il consiste à éclairer, mesurer un spectre et réaliser un traitement, notamment informatique, de ce spectre. En particulier, grâce à l’invention il est possible de déterminer grâce à la gamme 390-900nm si la souche bactérienne est de Gram positif ou de Gram négatif et fermentante ou de Gram négatif et non fermentante, la connaissance de cette information permettant par exemple d’optimiser un processus microbiologique de laboratoire tel que décrit précédemment.
On note que la détermination du type de Gram et du caractère fermentant est réalisée directement à partir de l’intensité lumineuse acquise, sans nécessiter la détermination préalable de l’espèce ou du genre ou de la famille de la souche bactérienne. En particulier, le procédé de l’invention diffère d’un procédé selon lequel l’espèce de la souche bactérienne est d’abord identifiée, puis le Gram et le caractère fermentant sont déduit de la connaissance de l’espèce. Le fait de ne pas avoir à identifier au niveau espèce la souche bactérienne présente l’avantage de grandement simplifier le modèle de prédiction du Gram et du caractère fermentant. En effet, une identification au niveau espèce requière un modèle de prédiction ayant un nombre de classes très élevé. A titre d’exemple en cas d’infection urinaire, on estime qu’une infection est causée dans 99% des cas par une souche bactérienne parmi une cinquantaine d’espèces bactériennes. Une identification au niveau espèce nécessite donc une prédiction à une cinquantaine de classes. Selon l’invention, le modèle de prédiction peut être limité à quatre classes.
Avantageusement, le procédé est appliqué à une boite de Pétri comprenant un milieu de nutritif gélosé sur lequel des colonies de microorganismes ont poussées. Par exemple, le milieu de nutritif est ensemencé à l’aide d’un échantillon biologique contenant, ou suspecté de contenir, des levures ou des bactéries, e.g. de l’urine, puis mis en culture pour faire pousser les colonies. Dès qu’une colonie est détectée sur le milieu nutritif, elle est caractérisée selon le procédé de l’invention. Ainsi, le procédé ne nécessite aucun transfert de matière ou d’ajout de réactif suite à l’ensemencement du milieu nutritif. La détection d’une colonie est par exemple réalisée de manière automatique par la prise à intervalle régulier d’images de la boite de Pétri et la mise en œuvre d’un algorithme de détection de colonies.
Avantageusement, le procédé selon l’invention ne se fonde pas sur l’analyse de l’auto fluorescence de la souche bactérienne mais sur l’analyse de la réflectance ou de l’absorbance de ladite souche. En particulier, l’éclairage est généralement trop intense pour que l’auto fluorescence soit observable sur une image hyperspectrale ou multispectrale.
L’invention a également pour objet un procédé de réalisation d’un antibiogramme d’une souche bactérienne à un antibiotique comprenant :
- la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne ;
- le réalisation d’au moins un échantillon comprenant la souche bactérienne, un milieu de culture et une concentration d’un antibiotique en fonction du type de Gram et du caractère fermentant choisi; et
- la détermination de la sensibilité de la souche bactérienne à l’antibiotique en fonction de la pousse de ladite souche dans l’échantillon,
procédé dans lequel la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne est réalisée selon un procédé du type précité.
L’invention a également pour objet un procédé d’identification d’une souche bactérienne à un antibiotique comprenant :
- la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne ;
- le choix d’au moins un milieu colorimétrique en fonction du type de Gram et du caractère fermentant choisi; et
- la mise en culture dans ledit milieu de la souche bactérienne,
procédé dans lequel la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne est réalisée selon un procédé du type précité.
L’invention a également pour objet un système pour la mise en œuvre du procédé venant d’être décrit. En particulier, l’invention a pour objet un système de détection de détection du type de Gram et du caractère fermentant d’une souche bactérienne, comprenant :
- un éclairage configuré pour éclairer, dans la gamme de longueurs d’onde 390nm-900 nm, au moins une bactérie de la souche; - un capteur configuré pour acquérir, dans la gamme 390nm-900nm, une intensité lumineuse réfléchie par, ou transmise au travers de, ladite bactérie éclairée; et
une unité informatique configurée pour déterminer du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne en fonction de l’intensité lumineuse acquise dans la gamme 390nm-900nm.
Selon un mode de réalisation, le système est configuré pour éclairer, et acquérir l’image de, un échantillon comprenant une colonie de bactéries de ladite souche et milieu nutritif sur lequel ladite colonie a poussé, en particulier une boite de Pétri.
L’invention a également pour objet un procédé de calibration d’un système pour la mise en œuvre d’un procédé selon l’invention, le système comprenant :
- un éclairage configuré pour éclairer, dans la gamme de longueurs d’onde 390nm-900 nm, au moins une bactérie de la souche;
- un capteur configuré pour acquérir, dans la gamme 390nm-900nm, une intensité lumineuse réfléchie par, ou transmise au travers de, ladite bactérie éclairée; et
- une unité informatique comprenant une mémoire informatique apte à contenir des instructions d’analyse de l’intensité acquise par le capteur et un microprocesseur apte à exécuter les instructions d’analyse contenues dans la mémoire informatique,
le procédé de calibration comprenant les étapes :
- de constitution d’une base de données d’apprentissage comprenant des intensités lumineuses dans la gamme 390nm-900nm de souches bactériennes éclairées dans ladite gamme, lesdites souches étant associées à différents types de Gram et différents caractères fermentants ;
- de mise en œuvre par ordinateur d’un apprentissage automatisé d’un modèle de prédiction du type de Gram et du caractère fermentant d’une souche bactérienne en fonction de ladite base de données ; et
- de mémorisation, dans la mémoire informatique du système, d’instructions d’analyse pour la mise en œuvre du modèle de prédiction appris.
L’invention a également pour objet un procédé thérapeutique comprenant :
- le prélèvement d’un échantillon sur un patient suspecté d’être atteint d’une infection bactérienne ;
- la détection d’une ou de plusieurs souches bactériennes présentes dans l’échantillon, avantageusement par l’ensemencement d’un milieu de culture gélosé avec l’échantillon, la mise en culture dudit milieu ensemencé pour faire pousser des colonies bactériennes et la détection d’une ou plusieurs colonies bactériennes ayant poussées ; - la détection du type de Gram ou du caractère fermentant de la ou des souches bactériennes détectées selon un procédé du type précité ;
- le choix d’un ou de plusieurs antibiotiques en fonction du Gram et du caractère fermentant détectés ; et
- l’administration au patient du ou des antibiotiques choisis.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
L’invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, donnée uniquement à titre d’exemple, et faire en relation avec les dessins annexés, dans lesquels des références identiques désignent des éléments identiques ou analogues, et dans lesquels
la figure 1 est une vue schématique d’un système hyperspectral selon l’invention ;
la figure 2 est une vue schématique d’un système multispectral selon l’invention ;
la figure 3 est un exemple de spectre en transmission d’un filtre passe-bande utilisée dans le système de la figure 2 ;
la figure 4 est un organigramme d’un procédé de prédiction des classes Y, GP, GNF, GNN mis en œuvre à l’aide du système de la figure 1 ou de la figure 2 ;
la figure 5 est un organigramme d’un procédé de sélection de canaux spectraux discriminants à l’aide de l’approche « step forward » ;
la figure 6 est un organigramme d’un procédé d’apprentissage des modèles de prédiction des classes Y, GP, GNF, GNN ;
la figure 7A est un graphique illustrant un modèle de prédiction à plat des classes Y, GP, GNF, GNN ;
la figure 7B est un graphique illustrant un modèle de prédiction hiérarchisé selon un arbre phylogénique des classes Y, GP, GNF, GNN ;
la figure 7C est un graphique illustrant un modèle de prédiction hiérarchisé selon un arbre optimal des classes Y, GP, GNF, GNN ;
la figure 8 est une table décrivant les espèces bactériennes et de levure utilisés pour l’apprentissage de modèle de prédiction des classes Y, GP, GNF, GNN ;
les figures 9 et 10 sont des tables, respectivement pour le milieu COS et le milieu TSA, décrivant le nombre de pixels, et donc de spectres, utilisés pour l’étalonnage et la validation croisée des modèles de prédiction ;
la figure 11 est un graphique illustrant le calcul d’un taux de prédiction pondéré, ou « balanced classification rate »
la figure 12 est un graphique illustrant la répartition spatiale des principaux canaux spectraux discriminants pour l’arbre optimal du milieu COS ;
la figure 13 est un graphique illustrant la répartition spatiale des 5 principaux canaux spectraux discriminants de chaque modèle pour l’arbre optimal du milieu CO S ; la figure 14 est un graphique illustrant individuellement les cinq canaux discriminants principaux de chaque modèle de l’arbre optimal du milieu COS ;
la figure 15 est un graphique illustrant la répartition spatiale des principaux canaux spectraux discriminants pour l’arbre optimal du milieu TSA ;
la figure 16 est un graphique illustrant la répartition spatiale des principaux canaux spectraux discriminants pour l’arbre optimal du milieu COS
la figure 17 est un graphique illustrant respectivement les 12, 8 et 11 canaux discriminant principaux associés respectivement aux premier, deuxième et troisième modèle de prédiction de l’arbre optimal du milieu TSA ;
les figures 18 à 20 sont des graphiques illustrant respectivement les premier, deuxième et troisième modèles de prédiction de l’arbre phylogénique, le graphique en haut de chaque figure correspondant au milieu TSA et le graphique en bas de chaque figure correspondant au milieux COS.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Dans ce qui suit la notation At se rapporte à l’élément de la ieme ligne et de la jieme colonne de la matrice A.
En se référant à la figure 1, un système hyperspectral 10 de caractérisation de colonies de levures ou de bactéries ayant poussées sur une gélose coulée dans une boite de Pétri comporte :
- un dispositif 12 d’acquisition d’image hyperspectrale ; et
une unité 14 informatique de traitement de données connectée (e.g. par une liaison fïlaire ou sans fil), au dispositif 12 pour son pilotage et pour la réception et le traitement des images acquises par le dispositif 12.
Le dispositif 12, par exemple un système d’imagerie hyperspectrale de référence « Pika II » de la société Resonon, Montana USA, comporte :
une caméra dite « hyperspectrale » 18, constituée d’un capteur numérique comprenant un réseau de capteurs élémentaires, par exemple un capteur numérique de type CCD ou CMOS, sensible dans la gamme de longueurs d’onde [Amin; Àmax] = [390; 900] nanomètres, et d’un élément dispersif de lumière ou d’un spectrographe pour sélectionner une longueur d’onde à acquérir par le capteur ;
- un objectif 20 pour focaliser sur le capteur numérique de la caméra 18, l’image optique d’une boite de Pétri 22, dont on cherche à acquérir une image hyperspectrale ;
- un éclairage avant 24, par exemple constitué d’une ou plusieurs lampes allogènes, e.g. 2 ou 4 lampes, apte à émettre de la lumière dans la gamme [Ami ; Àmax] et pour réaliser un éclairage avant uniforme de la boite de Pétri 22. Par exemple, les éclairages sont des lampes à lumière blanche ;
un éclairage arrière 26, par exemple constitué d’une matrice de LED à lumière blanche, pour réaliser un éclairage arrière uniforme de la boite de Pétri 22 dans la gamme
Figure imgf000011_0001
un chariot 28 sur lequel repose boite de Pétri 22 et permettant à cette dernière de défiler devant l’objectif 20 afin d’obtenir une image entière de la boite 22 par balayage.
Un éclairage est ainsi réalisé dans toute la gamme
Figure imgf000011_0002
Àmax].
Le dispositif 12 est par exemple configuré pour acquérir l’image d’une région de 90 millimètres par 90 millimètres avec un pas d’échantillonnage de 160 micromètres (résolution spatiale estimée à 300 micromètres) et avec une résolution spectrale de 1,7 nano mètre sur la gamme 12 min ^ max\ ·
Le dispositif 12 produit ainsi une image numérique H SI de la lumière réfléchie par la boite de Pétri, ayant N lignes et M colonnes, la boite de Pétri 22 étant préférablement ouverte (i.e. sans son couvercle):
Figure imgf000011_0003
La radiance d’un pixel, communément appelée « intensité lumineuse », correspond ici à la quantité de lumière incidente sur la surface du site sensible élémentaire correspondant du capteur de la caméra 18 pendant la durée d’exposition, comme cela est connu en soi du domaine de la photographie numérique par exemple.
Chaque pixel f?ad£ J-( 1) se compose d’un spectre numérique de la radiance de la boite 22 correspondant au pixel à différentes longueurs d’onde
Figure imgf000011_0004
Amax] , le spectre numérique s’exprimant selon la relation :
Figure imgf000012_0001
où D l est la résolution spectrale et p est un entier positif appartenant à [n
Figure imgf000012_0002
Les longueurs d’onde d’acquisition Àmin + p x Dl sont usuellement désignés sous le termes de « canaux ».
L’unité 14 de traitement de données est par exemple un ordinateur personnel, une tablette, un smartphone, un serveur, un supercalculateur, ou plus généralement tout système à base de microprocesseur(s), notamment de type DSP (« digital signal processor »), à base de circuits de type FPGA, à base de circuits mixant ces types de technologie, etc., configuré pour mettre en œuvre un traitement des images HSI produites par le dispositif d’acquisition 12. L’unité 14 est notamment pourvue de l’ensemble des mémoires (RAM, ROM, cache, mémoire de masse,...) pour la mémorisation des images produites par le dispositif 12, d’instructions informatiques pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention, de paramètres utiles à cette mise en œuvre et pour la mémorisation des résultats des calculs intermédiaires et finaux. L’unité 14 comporte optionnellement un écran d’affichage pour la visualisation du résultat final de la caractérisation des colonies, en particulier la détermination du type de Gram et/ou du caractère fermentant, et/ou du caractère bactérien ou de levure des colonies étudiées. Bien qu’une seule unité de traitement soit décrite, l’invention s’applique évidemment à un traitement réalisé par plusieurs unités de traitement (e.g. une unité embarquée dans la caméra 18 pour mettre en œuvre un prétraitement de images HSI et une unité externe au dispositif 12 pour la mise en œuvre du reste du traitement). Par ailleurs, le système peut être complété par une interface permettant d’entrer dans l’unité 14 des données relatives à l’échantillon, notamment le type de milieu de culture utilisé lorsque la prédiction dépend du milieu, par exemple au moyen d’un clavier/souris et d’un menu déroulant à disposition de l’opérateur, un lecteur de code barre/QR code lisant un code barre/QR code présent sur la boite de Pétri et comprenant des informations sur le milieu, etc.
Le système hyperspectral de la figure 1 a pour avantage d’être agile en termes de longueurs d’onde d’acquisition car il peut s’adapter à différents modèles de prédiction de la classe des colonies et utiliser un nombre important de canaux spectraux pour augmenter la précision de la prédiction. Outre un prix élevé, un tel système est toutefois généralement moins résolu spatialement qu’une caméra CMOS ou CCD classique dont le but est uniquement d’acquérir une image en intensité de la lumière incidente sur son capteur.
En se référant à la figure 2, un système multispectral 32 diffère du système hyperspectral 10 par la caméra 32, avantageusement une caméra CMOS ou CCD de haute résolution spatiale, couplée à un ensemble de filtres spectraux 36, par exemple disposé devant l’objectif 20 entre l’objectif 20 et le capteur de la caméra 32. L’ensemble de filtres 36 est constitué d’un nombre N F de filtres passe-bandes distincts, chacun configuré pour transmettre uniquement la lumière dans une gamme [l- l2] de la gamme [Amin) Amax\, avec une largeur spectrale à mi-hauteur du maximum (ou FWHM pour « full width half maximum ») inférieure ou égale à 50nm, et de préférence inférieure ou égale à 20nm. Le spectre en transmission d’un tel filtre, e.g. un filtre de la société Edmund Optics centrée sur 420nm, est illustré à la figure 3. L’ensemble 36 est par exemple une roue à filtres pouvant accueillir jusqu’à 24 filtres différents, roue pilotée par l’unité 14 qui l’actionne pour faire défiler devant la caméra lesdits filtres et commander une prise d’image pour chacun d’entre eux.
Il est ainsi acquis une image multispectrale HSI( ) dont chaque pixel Radt j A ) se compose d’un spectre numérique de la radiance de la boite 22 correspondant au pixel aux différentes bandes spectrales filtrées par l’ensemble 36, le spectre numérique s’exprimant selon la relation :
Figure imgf000013_0001
Où l1, l2, ..., lNr sont respectivement les longueurs d’onde centrales des filtres spectraux de l’ensemble 36.
Un procédé 40 de caractérisation de microorganismes contenus dans un échantillon biologique (e.g. urine, sang, prélèvement broncho-alvéolaire, etc.) au moyen du système venant d’être décrit est à présent détaillé en relation avec l’organigramme de la figure 4. En particulier, ce procédé trouve avantageusement application dans le cadre d’un procédé plus global d’identification des microorganismes contenus dans ledit échantillon à l’aide d’une spectrométrie de masse MALDI-TOF (e.g. Vitek® MS commercialisée par la Demanderesse) et d’un antibiogramme desdits microorganismes (e.g. à l’aide de la plateforme Vitek® 2 commercialisée par la Demanderesse). Comme cela est connu en soi, chacune de ces techniques nécessite de choisir des milieux et/ou des réactifs et/ou des consommables particuliers en fonction du type de microorganisme. A titre d’exemple, l’identification de levures par spectrométrie de masse MALDI-TOF implique avantageusement l’emploi d’acide formique dans la matrice utilisée dans ce type de technologie. De même, le choix de la carte de la plateforme Vitek® 2 (carte comprenant un milieu de pousse et un ou plusieurs antimicrobiens testés lors de l’antibiogramme) dépend du caractère bactérien du microorganisme testé. Notamment, les bactéries à Gram négatif et fermentantes nécessitent une carte particulière pour réaliser leur antibiogramme.
De manière avantageuse, le procédé de caractérisation 40 de caractérisation décrit ci-après permet, dès la première pousse sur boite de Pétri, d’obtenir les informations nécessaires sur les microorganismes pour la suite du processus microbiologique, en particulier de savoir si une colonie ayant poussé correspond à une levure (« Y ») ou une bactérie, et dans le cas d’une bactérie, si cette bactérie est de type Gram positif (« GP ») ou de type Gram négatif (« GN »), et dans le cadre de bactérie de type Gram négatif, si cette bactérie est fermentante (« GNF ») ou non fermentante (« GNN »). Le procédé permet ainsi de prédire la classe d’un microorganisme, à s’avoir la classe Y, GP, GNF ou GNN.
Dans une première étape 42 du procédé, une boite de Pétri est ensemencée par un échantillon biologique, e.g. prélevé sur un patient, de sorte à faire pousser des colonies de levure ou de bactérie à la surface d’un milieu nutritif, ou « de culture », déposé dans la boîte de Pétri . Le milieu nutritif, a pour but principal de faire pousser ladite colonie, et optionnellement de renforcer la précision de la caractérisation en limitant les perturbations lumineuses. De préférence concernant une détection du type de Gram en fonction de l’intensité lumineuse réfléchie, le milieu nutritif est opaque, ce qui augmente le degré de précision de la détection. Notamment, le milieu opaque a un facteur de réflectance p inférieur ou égal à 10%, et de préférence inférieur ou égal à 5%, et de manière encore plus préférentielle inférieur ou égal à 1%. Par exemple, le milieu de culture une gélose dite « CPSO » (gélose « CPS » comprenant du Si02 pour opacifier le milieu), une gélose dite « columbia » (ou gélose « CNA »), une gélose Columbia avec 5% de sang de mouton (ou gélose dite « COS »), une gélose de Man, Rogosa, Sharpe (gélose dite « MRSM »), une gélose chocolat (gélose dite « PVX »), une gélose Tryptone-Soja (gélose dite « TSA »), etc.
Ce type de pousse de colonies étant classique, il ne sera pas décrit plus en détail par la suite. Il peut avantageusement être mis en œuvre manuellement par un opérateur ou automatiquement à l’aide d’un automate d’ensemencement d’une manière connue en soi. De manière avantageuse, la préparation est réalisée de sorte que les colonies, sur la base desquels la caractérisation du microorganisme est réalisée, sont distancées les unes des autres et de sorte que la surface d’une colonie corresponde à une pluralité de pixels dans l’image acquise par le dispositif 12. Ceci permet notamment de faciliter leur identification ultérieure dans l’image acquise, et donc leur segmentation au moyen d’une algorithme de traitement d’image ou leur extraction dans l’image par un utilisateur.
Une fois la pousse des colonies terminée, par exemple après une durée de 24h, 36h ou 48h, la boite de Pétri est de préférence ouverte, disposée sur le chariot 28, les éclairages 24 et 26 sont allumés et au moins une image hyperspectrale (respectivement multispectrale) HSI de la boite de Pétri est acquise, en 44, à l’aide du dispositif d’acquisition 12 (respectivement 32) et mémorisée dans l’unité de traitement 14, qui met en œuvre un traitement informatique pour déterminer le type microorganisme constitutif de la colonie à partir des images acquises.
L’unité 14 débute optionnellement, en 46, par un prétraitement du bruit, consistant en l’un des traitements suivants ou une combinaison quelconque de ces traitements :
a. une correction du bruit du capteur de la caméra, notamment son offset, son bruit spatial, etc., d’une manière connu en soi ;
b. un traitement des réflexions parasites, notamment spéculaire formant des « surbrillances » dans l’image HSI. Par exemple, un seuillage mis en œuvre pour éliminer les pixels ayant des valeurs supérieures à un seuil prédéterminé, e.g. supérieures ou égales aux deux tiers de la valeur maximale que peuvent prendre les pixels (i.e. supérieures ou égales à 170 dans le cas de pixels codés sur 8 bits entre 0 et 255) ;
c. une traitement ratiométrique permettant d’aténuer les variations dans les images provoquées par des fluctuations extérieures telles que de variations de l’illumination, en divisant l’image HSI par une intensité lumineuse réfléchie à une longueur d’onde qui est invariante avec le type de bactérie et le type de gélose utilisé ;
d. si plusieurs images HSI ont été acquises, la recherche et l’élimination de valeurs de pixels aberrantes et/ou la moyenne des images acquises.
De manière avantageuse, le traitement se poursuit, en 48, par la transformation de l’image HSI prétraitée, qui mémorise des valeurs de radiance à différentes longueurs d’onde, en une image hyperspectrale ou multispectrale de réflectance afin d’extraire le signal généré par la boite de Pétri seule. Ceci permet notamment de filtrer les fluctuations du spectre d’émission des sources d’éclairage 24, 26. Par exemple, une correction du type « flat field correction » (FFC) est mise en œuvre pour obtenir la réflectance, ce qui présente en outre l’avantage de corriger les dispersions de réponse du capteur de pixel à pixel (dispersion du courant d’obscurité, dispersion du gain, etc.).
Dans le cadre d’une image hyperspectrale, cette transformation est par exemple une correction selon les relations : V(ù j)e[l, N] x [1, M], Vp G [0 , P]:
Figure imgf000016_0001
où Y (À) est une image en réflectance, W est une image hyperspectrale mémorisée dans l’unité 14 d’un objet neutre de réflectance élevée et illuminé par les éclairages 24, 26, par exemple une feuille de réflectance uniforme supérieure à 90% (e.g. une feuille dite « blanche » ou à une charte de gris inférieur à 10%), et B est une image hyperspectrale mémorisée dans l’unité 14 d’un objet neutre de réflectance faible, par exemple l’image d’un capuchon noir obturant égal à la moyenne de la matrice W (Àmin + p x
Figure imgf000016_0002
De manière analogue, dans le cadre d’une image multispectrale, la transformation est par exemple une correction selon la relation :
V(t, j)e[l, N] x [l, M], Vn G [l, Nf\:
Figure imgf000016_0003
où W est une image multispectrale mémorisée dans l’unité 14 d’un objet neutre de réflectance élevée et illuminé par les éclairages 24, 26, par exemple une feuille de réflectance uniforme supérieure à 90% (e.g. une feuille dite « blanche » ou à une charte de gris inférieur à 10%), et B est une image multispectrale mémorisée dans l’unité 14 d’un objet neutre de réflectance faible, par exemple l’image d’un capuchon noir obturant l’objectif 20 et m(An) = 1 ou égal à la moyenne de la matrice W (An)— B(lh).
L’unité 14 met en œuvre en 50, suite à l’étape 38 ou en parallèle des étapes précédentes, un algorithme d’identification des colonies de bactéries, e.g. à partir de l’image //57(A) ou U(l). Tout algorithme de reconnaissance de forme et d’objet classique peut être mis en œuvre pour extraire une zone de l’image, nommée « Col(À) », correspondant à une colonie. En variante, cette sélection est faite manuellement par un opérateur qui sélectionne cette zone en s’aidant de l’écran d’affichage et d’un mécanisme de pointage du type souris par exemple. A titre d’exemple, la zone Col(À) consiste en une liste des coordonnées de pixel appartenant à la colonie. Les zones de pixels sélectionnées sont mémorisées par l’unité 14.
Le procédé se poursuit, en 52, par la prédiction de la classe Y, GP, GNF ou GNN du microorganisme de la colonie en fonction d’au moins un spectre de la zone Col (À) en appliquant des règles de décision prédéfinies, dont des variantes sont décrites ci-après. En particulier, cette prédiction est réalisée en fonction du spectre Y£ (À) de chaque pixel ( i,j ) de la zone Col (l). A cet effet, une première prédiction de la classe est réalisée pour chaque pixel (i,j) de la zone Col (À), puis un vote majoritaire est mis en œuvre pour la prédiction finale de la classe. Dans une première variante, un vote majoritaire simple est mise en œuvre, c’est-à- dire que la classe prédite sur le plus grand nombre de pixels de la zone Col (À) est la classe finalement retenue. Dans une seconde variante, afin d’augmenter la certitude dans la prédiction de la classe, un vote qualifié est mis en œuvre, c’est-à-dire que la classe finalement retenue est celle qui est prédite sur plus de X% du nombre de pixels constitutifs de la zone Col(À), avec X supérieur strictement à 50%, et de préférence supérieur ou égal à 70%. Si aucune classe ne remplit cette condition, le procédé renvoie alors une absence de prédiction de classe. Bien entendu, la classe de la colonie peut être réalisée à l’aide d’une seule valeur, par exemple le spectre moyen Yco£ (À) de des spectres de la
Figure imgf000017_0001
zone Col (À).
La classe Y, GP, GNF ou GNN de chaque colonie par l’unité 14 est réalisée en appliquant des règles de prédiction prédéfinies, dont des variantes sont décrites ci-après. Les classes prédites sont mémorisées dans l’unité 14 et/ou affichées sur un écran à l’attention de l’utilisateur. Cette prédiction est également avantageusement délivrée à un autre instrument d’analyse microbienne pour une étape ultérieure d’identification et/ou d’antibiogramme des microorganismes ayant formé les colonies.
Il va à présent être décrit différents modèles de prédiction d’une classe Y, GP, GNF ou GNN en fonction d’un spectre Y £ (À) d’un pixel d’une colonie, notamment des modèles de prédiction basés sur un apprentissage automatique supervisé (« SMF », pour « supervised machine leaming »). Fes outils SMF utilisés sont tout d’abord décrits en relation avec la figure 5 puis les modèles de prédiction sont décrits ci-dessous au travers de leur procédé d’apprentissage illustré aux figures 6 et 7.
A. OUTILS D’APPRENTISSAGE AUTOMATIQUE SUPERVISE
Quel que soit l’apprentissage considéré, celui-ci débute par la constitution d’une base de données d’apprentissage. Pour chaque classe Y, GP, GNF et GNN, des bactéries et des levures sont sélectionnées et chacune d’entre elle est ensemencée sur une gélose coulée dans une boite de Pétri, mise en culture pendant une durée prédéterminée et une image hyperspectrale de la boite est acquise avec le système décrit à la figure 1, et par conséquent sous les mêmes conditions d’illumination et dans gamme de longueurs d’onde 390nm-900nm. Les pixels des colonies ayant poussé sur la gélose sont extraits, par exemple de la manière décrite aux étapes 46-50 du procédé 40, et leurs spectres associés mémorisés dans la base de données d’apprentissage. Cette dernière comprend ainsi quatre ensemble de spectres {Y^ (À)}, {Y p (À)}, {Y^F (À)} , {Y^ (À)} respectivement associés aux classes Y, GP, GNF, GNN. Chacun de ces ensembles est scindé en deux, une première partie, dite « d’étalonnage » étant utilisé pour l’apprentissage lui-même et une deuxième partie, dite « de validation croisée », étant utilisée pour d’évaluer la performance des modèles de prédiction calculés, comme cela est connu en soi de l’état de la technique.
Selon un premier mode de réalisation privilégié, un apprentissage mis en œuvre par ordinateur, dit « step forward », est mis en œuvre pour l’apprentissage des modèles de prédiction. Ce type d’apprentissage repose sur la sélection pas à pas des canaux spectraux les plus discriminants, de sorte qu’il est intrinsèquement parcimonieux et adapté à la recherche d’une application multispectrale telle que mise en œuvre par le système de la figure 2.
En se référant à la figure 5, l’apprentissage 60 débute par une étape d’initialisation 62 dans laquelle un nombre maximal R de canaux discriminants est sélectionné, ce nombre étant compris entre 1 et le nombre P de canaux spectraux de la caméra hyperspectrale utilisée pour l’acquisition des spectres. Une liste L des canaux discriminants sélectionnés est vidée et une liste / des canaux candidats est initialisée à l’ensemble {l , l2, ... , AP}dcs canaux de la caméra hypespectrale.
Dans une étape itérative 64 suivante, la liste / est remplie pas à pas avec les R canaux les plus discriminants de la liste L en mettant en œuvre une étape itérative 66. Plus particulièrement pour une itération r donnée de l’étape 64, l’étape 66 :
- extrait chaque canal k de la liste / ;
- détermine, en 68, pour le canal extrait Àk et les canaux {l1, l2, ... , Xr-1} de la liste L, un modèle de prédiction /?k;
- calcule, en 70, un critère de performance 5C7?(/?fe) du modèle de prédiction /?k, par exemple le taux de bonne classification des spectres de validation croisée.
L’étape 64 se poursuit alors, en 72, par l’identification du modèle de prédiction donnant le meilleurs critère de performance et par conséquent l’identification du canal Àr de la liste / le plus discriminant en combinaison avec les canaux de la liste L. En 74, la liste L est alors complétée avec le canal lt et ce dernier est retiré de la liste / pour l’itération r+1 suivante de l’étape 64. Une fois les R canaux les plus discriminants identifiés, le procédé d’apprentissage se termine alors, en 74, par la mémorisation de la liste L et de l’hyperplan prédiction (£ ./¾') associé à cette dernière, à savoir le dernier modèle identifié lors de l’étape 72.
De manière avantageuse, les modèles de prédiction calculés à l’étape 68 sont de type SVM (pour « support vector machine »), « un contre tous », à noyau linéaire (ou « linear kernel ») et à marge souple (ou « soft margin »). Ce type d’apprentissage consiste à calculer, en fonction des spectres d’étalonnage, un hyperplan
Figure imgf000019_0001
séparant une classe Cl {Cl = Y,
GP, GNF ou GNN) de l’ensemble Cl formé d’une, deux ou trois parmi les autres classes, comme cela sera décrit ci-après. Par exemple, le modèle est appris en résolvant un problème d’optimisation selon les relations suivantes pour une itération k de l’étape 66 et une itération r de l’étape 64 :
Figure imgf000019_0002
sous les contraintes :
Figure imgf000019_0003
expressions dans lesquelles :
- pour un spectre d’étalonnage Ym (À) appartenant à la classe Cl ou à l’ensemble Cl, Y ,£ (À) est égal au vecteur des composantes de Ym (À) correspondant aux canaux spectraux de la liste L = {l1, l2, ... , lt-1} et du canal Àk extrait de la liste / au cours de l’itération k, de préférence un vecteur dont les composantes sont ordonnées en fonction de la valeur des canaux ;
- (3k l et b sont des vecteurs de dimension égale à la dimension des spectres Y^fe(À), et par conséquent de dimension égale à r,
- M est le nombre de spectres d’étalonnage Ym (À) appartenant à la classe Cl ou à
Cl, numérotés de 1 à M,
- est le produit scalaire entre le vecteur Y^fe(À) et le vecteur b,
- sont des scalaires ;
- l} avec qm = 1 si le mieme spectre d’apprentissage est associé à la classe Cl,
Figure imgf000019_0004
si le mieme spectre est associé à l’ensemble Cl des autres classes ; et - C est un scalaire prédéfini.
Le modèle prédisant l’appartenance à la classe Cl d’un spectre d’un pixel Y£ (À) est ainsi réalisé selon les étapes suivantes : - la transformation du spectre Y £ (À) en un vecteur U[ (l) ;
- le calcul d’une distance Sci— Y† (l) . /?k + b0 entre le spectre Y 'k (À) et l’hyperplan
[iï' . P ) ;
- l’application d’une règle de prédiction de la classe Cl en fonction de la distance Scu par exemple le spectre appartient à la classe Cl si le signe de Sci est positif, et à l’ensemble Ci si ce signe est négatif
Selon un deuxième mode de réalisation, l’apprentissage est non parcimonieux et consiste à utiliser tous les canaux en même temps, le modèle de prédiction en découlant étant particulièrement adapté à une application hyperspectrale à l’aide du système de la figure 1. Par exemple, cet apprentissage est de type SVM, « un contre tous », à noyau linéaire et à marge souple, et consiste à calculer, en fonction des spectres d’étalonnage, un hyperplan
Figure imgf000020_0001
séparant une classe Cl (Cl = Y, GP, GNF ou GNN) de l’ensemble Cl formé d’une, deux ou trois parmi les autres classes, en résolvant un problème d’optimisation selon la relation :
Figure imgf000020_0002
sous les contraintes :
Figure imgf000020_0003
expressions dans lesquelles :
- Ym (À) est un spectre d’étalonnage Ym (À) appartenant à la classe Cl ou à l’ensemble CL·,
- ba et b sont des vecteurs de dimension égale à la dimension des spectres d’étalonnage Y^fe(À), et par conséquent de dimension égale à P,
- M est le nombre de spectres d’étalonnage Ym (À) appartenant à la classe Cl ou à l’ensemble Cl, numérotés de 1 à M,
- Ym (l) . b est le produit scalaire entre le vecteur Ym (À) et le vecteur b,
- xth et b i sont des scalaires ;
- qm e {-1, l} avec qm = 1 si le mieme spectre d’apprentissage est associé à la classe Cl, et qm = - 1 si le mieme spectre est associé à l’ensemble Cl des autres classes ; et - C est un scalaire prédéfini.
Le modèle prédisant l’appartenance à la classe Cl d’un spectre d’un pixel Y; (X) est ainsi réalisé selon les étapes suivantes : - le calcul d’une distance
Figure imgf000021_0001
entre le spectre Y£ (À) et l’hyperplan
Figure imgf000021_0002
- l’application d’une règle de prédiction de la classe Cl en fonction de la distance
Figure imgf000021_0003
par exemple le spectre appartient à la classe Cl si le signe de Sd est positif, et à l’ensemble Cl si ce signe est négatif.
B. PROCEDE D’APPRENTISSAGE DES MODELES DE PREDICTION
En se référant à la figure 6, le procédé 80 d’apprentissage des modèles de prédiction débute par la constitution, en 82, d’une base de données d’apprentissage pour les classes Y, GP, GNF et GNN, tel que décrit précédemment. Le procédé 80 se poursuit, en 84, par la détermination d’une structure des modèles de prédiction. En particulier, deux types de modèle sont possibles, tels que respectivement illustrés à la figure 7 A d’une part et aux figures 6B et 6C d’autre part.
Le premier type de modèle de prédiction, illustré à la figure 7A, consiste à apprendre quatre modèles de prédictions de type « un contre tous » 90, 72, 74, 76, à savoir une prédiction de la classe Y contre les classes GP, GNF, GNN, une prédiction de la classe GP contre les classes Y, GNF, GNN, une prédiction de la classe GNF contre les classes Y, GP, GNN et une prédiction de la classe GNN contre les classes Y, GP, GNF. A cette fin :
- chaque modèle de prédiction est appris en fonction de la base de données d’apprentissage en mettant en œuvre un des outils d’apprentissage décrits ci-dessus en relation avec les relations (6) ou (7), la classe Cl étant égale à Y, GP, GNF GNN et l’ensemble Cl étant constitué des trois autres classes;
- La prédiction du type de Gram et du caractère fermentant d’un pixel (étape 52 de la figure 3) est obtenue en calculant (étapes 90-96), les distance Sy, SGP, SGNF, SGNN du spectre Y ijO dudit pixel respectivement aux hyperplans
Figure imgf000021_0004
hyperplans hyperplans (bg , b ) ,
Figure imgf000021_0005
, puis en déterminant la classe du pixel, en 88, en fonction des distances calculées. Notamment, la classe retenue est celle correspondant à la distance maximale.
Selon le premier type de structure illustré à la figure 7A, dite « à plat », les classes Y, GP, GNF et GNN sont considérées d’égale importance, et par conséquent les erreurs d’identifications également. Par exemple, identifier une levure Y en lieu et place d’une bactérie GNN est aussi grave qu’identifier une bactérie GNF en lieu et place d’une bactérie GNN. Selon la structure illustrée à la figure 7B, les modèles de prédiction sont organisés selon un arbre taxonomique phylogénique, ce qui permet de ne plus considérer les différentes classes avec une égale importance et d’introduire une information a priori, à savoir une information d’évolution pouvant influencer la forme des spectres. Plus particulièrement, cet arbre de modèle de prédiction comporte :
- un premier modèle 100 consistant à distinguer les levures Y des bactéries GP, GNF, GNF ;
- un deuxième modèle 102 consistant à distinguer les bactéries GP des bactéries GNF et GNN ; et
- un troisième modèle 104 consistant à distinguer les bactéries GNF des bactéries GNN.
Chacun des modèles 100-104 est obtenu de la manière décrite précédemment en relation avec les relations (6) ou (7) et la prédiction de l’appartenance d’un spectre de pixel Y £ (À) à l’une des classes Y, GP, GNF et GNN consiste ainsi à calculer sa distance Sy à l’hyperplan du premier modèle 100 et si le signe de cette distance est positif, la classe Y est alors prédite. Sinon, la distance SGP à l’hyperplan du second modèle 102 est calculé et si le signe de celle- ci est positif, alors la classe GP est prédite. Sinon, la distance SGNF à l’hyperplan du troisième modèle 104 est calculé alors la classe GNF est prédite. Sinon la classe GNN est prédite.
Si le modèle phénotypique permet d’améliorer la précision de la prédiction par rapport à un structure de prédiction à plat telle qu’illustrée à la figure 7A, les inventeurs ont cependant noté que l’arbre phénotypique n’est pas nécessairement l’arbre donnant de meilleurs résultats. Notamment, un arbre peut être privilégié en fonction du milieu de culture sur lequel les microorganismes à caractériser ont poussé, milieu qui influence la forme des spectres. De préférence, une structure de prédiction optimale, telle qu’illustrée à la figure 7C, est déterminée en fonction des spectres d’étalonnage. Plus particulièrement, dans une première étape, les quatre modèles de prédiction a) Y contre GP, GNF et GNN, b) GP contre Y, GNF et GNN, c) GNF contre Y, GP et GNN, et d) GNN contre Y, GP et GNF sont calculés de la manière décrite ci-dessus et le modèle ayant la meilleure performance de prédiction est conservé pour être le premier modèle 110 de l’arbre optimal. Dans une seconde étape, la classe du premier modèle est écarté, et les trois modèles de prédiction correspondant aux classes restantes sont calculés. Par exemple, si le premier modèle correspond à la classe GNN, alors les trois modèles de la seconde étape sont a) Y contre GP et GNF, b) GP contre Y, et GNF et c) GNF contre Y et GP de la manière décrite ci-dessus. Le meilleur des trois modèles est alors conservé pour être le second modèle 112 de l’arbre optimal. Dans une troisième étape, les classes des premier et deuxième modèles 110 et 112 sont écartés, et un modèle de prédiction entre les deux classes restantes est calculé de la manière décrite ci-dessus et conservé en tant que troisième modèle 114 de l’arbre optimal. La prédiction de l’appartenance d’un spectre de pixel Y£ (À) à l’une des classes Y, GP, GNF et GNN est alors obtenue en parcourant l’arbre d’une manière analogue à celle décrite en relation avec la figure 7B.
En revenant à la figure 6, une fois la structure du modèle de prédiction déterminée, le procédé d’apprentissage 80 se poursuit, optionnellement, en 84, par une diminution du nombre de canaux spectraux utilisés pour la prédiction, cette diminution étant réalisée par sélection et/ou par regroupement de canaux. En particulier, lorsque les modèles de prédiction précédemment décrits en relation avec les figures 7A, 7B et 7C, sont calculés grâce à l’approche « step forward » de la figure 5, le nombre de canaux utilisés peut être fixé directement par le paramètre R. En variante, ou de manière supplémentaire, les canaux supplémentaires n’apportant aucune augmentation significative de la performance des modèles peuvent être écartés. Le regroupement de canaux peut être également, en variante ou de manière supplémentaire, réalisée en divisant la gamme 390nm-900nm en intervalles dont la largeur correspond à celle des filtres tels que décrit ci-dessus en relation avec les figures 2 et 3. Un seul canal spectral est alors retenu par intervalle. Un nombre final de canaux Où lL , l2, ..., lNr sont ainsi sélectionnés et définissent les longueurs d’onde centrales des filtres spectraux de l’ensemble 36 du système multispectral de la figure 2. Comme cela sera décrit ci-dessous, il est possible d’obtenir une prédiction des classes de grandes précision à l’aide uniquement de 24 canaux, et donc de 24 filtres spectraux.
De manière optionnelle, ayant sélectionné les canaux finaux pour l’application multispectrale et construit le système multispectrale de manière correspondante, un nouvel apprentissage, basé sur l’acquisition de spectres avec le système de la figure 2, est mis en œuvre pour affiner les modèles de prédiction, cet apprentissage étant analogue à celui décrit en relation avec les figures 6 et 7.
De même, il a été décrit la sélection d’un nombre R prédéterminé de canaux discriminant. En variante, ce nombre n’est pas fixé a priori et un critère d’arrêt pour la recherche des créneaux est une stagnation du gain en performance en fonction du nombre de canaux. Si par exemple, l’ajout d’au moins un canal n’augmente pas la performance, par exemple le BCR détaillé ci- après, de plus de X%, alors la recherche de canaux est stoppée, avec par exemple X inférieur ou égale à 2%.
C. EXEMPLES
Il va à présent être décrit une application des prédictions des classes Y, GP, GNF et GNN venant d’être décrite. A cette fin, 21 souches bactériennes et de levures sont utilisées, ces espèces microbiennes étant décrite à la figure 8. Ces espèces ont été mises en culture pendant 24 heures sur une gélose COS et une gélose TSA, donnant lieu à une base de données d’apprentissage pour chacun de ces milieux. Le nombre de colonies et de pixels pour chacune des espèces et des milieux sont décrits respectivement à la figure 9 (COS) et à la figure 10 (TSA), le bloc 1 correspondant aux données d’étalonnage et le bloc 2 correspondant aux données de validation croisée.
La performance de la prédiction des classes est avantageusement calculée comme égale à la moyenne des sensibilités des prédictions de classe (taux de spectres bien classés). Ce critère pondéré, également appelé « balance classification rate » ou « BCR », permet de tenir compte des effectifs en pixels qui sont déséquilibrés, ce qui est le cas en raison de la taille des colonies qui est variable en fonction des espèces. Le calcul du BCR est rappelé à la figure 11.
C. l . RÉSULTATS COS
C. l .l . modèle à plat
La table 1 ci-dessous donne les BCR pour un modèle de prédiction à plat illustré à la figure 7 A et pour des modèles de prédiction obtenus à l’aide des relations (7).
Figure imgf000024_0001
Table 1
On note d’emblée à la lecture de la table 1 qu’il est possible de prédire avec précision les différentes souches de bactéries. Notamment, connaissant que le microorganisme à caractériser est une bactérie, il est possible de prédire son type de Gram et son caractère fermentant ou non, en mettant en œuvre une première prédiction GP contre GNN et GNF et une seconde prédiction GNN contre GP et GNF. Ce type de prédiction est notamment utile pour la sélection de consommable pour la réalisation d’un antibiogramme avec la plateformeVitek®2 commercialisée par la demanderesse.
C.1.2. Arbre optimal Les BCR des modèles 110, 112, 114 illustrés à la figure 7C et obtenus à l’aide des relations (7) sont résumés à la table 2.
Figure imgf000025_0002
Table 2 On note que l’arbre optimal diffère sensiblement de l’arbre phylogénique, l’influence du milieu COS étant vraisemblablement supérieure à l’influence de différences portées par la phylogénie.
Les BCR des modèles 110, 112, 114 illustrés à la figure 7C et obtenus à l’aide de l’approche « step forward » de la figure 4 et des relations (6), avec R = 24 pour chacun des modèles, sont résumés à la table 3.
Figure imgf000025_0001
Table 3 On note à la lecture de la table 3 que le gain en performance est limité à partir du 8e canal pour le premier modèle, et du 4e canal pour le troisième modèle. Pour obtenir une application multispectral à l’aide de 24 filtres spectraux, correspondant aux systèmes de filtre du marché, il est ainsi avantageusement sélectionné respectivement 8 canaux, 14 canaux et 4 canaux pour les premier, deuxième et troisième modèles 110, 112, 114. Les performances de ce mode de réalisation sont résumés à la table 4.
Figure imgf000026_0001
Table 4
Evidemment d’autres nombres de canaux peuvent être sélectionnés en fonction du nombre de filtres spectraux disponibles pour le système de la figure 2. On note par ailleurs que l’approche « step forward » permet de déterminer les gammes spectrales comprenant contenant les informations nécessaires à la prédiction des classes. En se limitant aux cinq premiers canaux de chaque modèle, il est obtenu respectivement des BCR proches ou supérieurs à 90%. La répartition spectrale de ces canaux est illustrée aux figures 12 à 14. On distingue ainsi nettement des bandes spectrales distinctes et distantes les unes des autres de plus de 50 nm. En particulier :
A. les quatre classes Y, GP, GNF et GNN peuvent être prédites efficacement en utilisant uniquement en utilisant les informations spectrale dans une première gamme 415- 500nm et une deuxième gamme 535-675 nm. A l’aide de ces gammes uniquement, les BCR sont supérieurs ou égaux à 90%. En limitant la première gamme à 575-675nm, 4 canaux sont utilisés uniquement par modèle pour des BCR proches ou supérieur à 90%. Optionnellement une troisième gamme 850-875 nm, correspondant au canal de rang 5 du deuxième modèle est utilisé. Plus particulièrement, la prédiction dans la première gamme 4l5-500nm peut être réalisée uniquement sur les gamme 415-440 nm et 470-495 nm. L’invention couvre ainsi tout procédé de prédiction des classes Y, GP, GNF et GNN consistant à acquérir des spectres dans lesdites gammes et à prédire les classes en fonction desdits spectres uniquement dans lesdites gammes. On note par ailleurs que si l’invention permet de distinguer entre les classes Y, GP, GNF et GNN, elle permet donc de distinguer entre des levures et des bactéries, et ce à l’aide des informations spectrales contenues dans les gamme susvisées. L’invention couvre donc également un procédé de prédiction du caractère de levure ou de bactérie d’un microorganisme à caractériser ;
B. la prédiction de la classe GNF contre Y+GP+GNN peut être réalisée efficacement uniquement sur une première gamme 470-5 OOnm et une seconde gamme 575-645nm. L’invention couvre ainsi tout procédé de prédiction des classes la classe GNF consistant à acquérir des spectres dans lesdites gammes et à prédire la classe GNF en fonction desdits spectres uniquement dans lesdites gammes. On notera que lorsque le caractère bactérien du microorganisme à caractériser est déjà connu, la prédiction consiste alors à prédire la classe GNF contre GP et GNN. L’invention couvre donc également ce type de prédiction en se basant uniquement sur les gammes 470-5 OOnm et 575-645nm ;
C. la prédiction de la classe GP contre Y+GNN peut être réalisée efficacement uniquement sur la première gamme 535-675 nm, et plus particulièrement sur la gamme 585-675nm, et la deuxième gamme 850-875nm. L’invention couvre ainsi tout procédé de prédiction des classes la classe GP consistant à acquérir des spectres dans lesdites gammes et à prédire la classe GP en fonction desdits spectres uniquement dans lesdites gammes. On notera que lorsque le caractère bactérien du microorganisme à caractériser est déjà connu, la prédiction consiste alors à prédire la classe GP contre les classes GNF et GNN, et par conséquent par la classe GP contre la classe des bactéries à Gram négatif (GN). L’invention couvre donc également ce type de prédiction en se basant uniquement sur les gammes 535-675 nm, et plus particulièrement sur la gamme 585-675nm, et la gamme 850-875nm;
D. En combinant les prédictions décrites aux points B et C ci-dessous, on note ainsi qu’avec trois gammes, et connaissant le caractère bactérien du microorganisme à caractérisé, il est possible de déterminer si une colonie bactérienne est GP, GNF ou GNN. Ce type de prédiction est notamment utile pour la sélection de consommable pour la réalisation d’un antibiogramme avec la plateformeVitek®2 commercialisée par la demanderesse.
C.1.3. Arbre phylogénique
Les BCR des modèles 100, 102, 104 illustrés à la figure 7B et obtenus à l’aide des relations
(7) sont résumés à la table 5.
Figure imgf000028_0001
Table 5
C.2. RÉSULTATS TSA
C.2.I. modèle à plat
La table 1 ci-dessous donne les BCR pour un modèle de prédiction à plat illustré à la figure 7 A et pour des modèles de prédiction obtenus à l’aide des relations (7).
Figure imgf000028_0002
Table 6
C.2.2. Arbre optimal Les BCR des modèles 110, 112, 114 illustrés à la figure 7C et obtenus à l’aide des relations (7) sont résumés à la table 7.
Figure imgf000029_0002
Table 7
On note que l’arbre optimal diffère sensiblement de l’arbre phylogénique, l’influence du milieu COS étant vraisemblablement supérieure à l’influence de différences portées par la phylogénie.
Les BCR des modèles 110, 112, 114 illustrés à la figure 7C et obtenus à l’aide de l’approche « step forward » de la figure 5 et des relations (6), avec R = 24 pour chacun des modèles, sont résumés à la table 8.
Figure imgf000029_0001
144» ·c 7 : 7· ί· »<34&K54»
Table 8
Les figures 15 à 17 illustrent les répartition spectrale des principaux canaux des branches, dans un même graphique (figure 15), dans une approche parcimonieuse avec 12, 8 et 1 1 canaux pour les premier, deuxième et troisième modèles 110, 112 et 114, (figure 16) et par modèle (figure 17). C.2.3. Arbre phylogénique
Les BCR des modèles 100, 102, 104 illustrés à la figure 7B et obtenus à l’aide des relations (7) sont résumés à la table 9.
Figure imgf000030_0002
Table 9
Les BCR des modèles 100, 102, 104 illustrés à la figure 7B et obtenus à l’aide de l’approche « step forward » de la figure 4 et des relations (6), avec R = 24 pour chacun des modèles, sont résumés à la table 10.
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000030_0003
Figure imgf000030_0004
Figure imgf000030_0005
Table 10 Les figures 18 à 20 illustrent la répartition spectrale des principaux canaux spectraux, modèle par modèle, avec le milieu TSA en haut de chacune de ces figures et en comparaison avec le milieu COS en bas de chacune des figures.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection du type de Gram et du caractère fermentant d’une souche bactérienne, comportant :
- l’éclairage dans la gamme de longueurs d’onde 390nm-900nm d’au moins une bactérie de ladite souche ayant une réponse électromagnétique naturelle dans ladite gamme;
- l’acquisition, dans ladite gamme, d’une intensité lumineuse réfléchie par, ou transmise au travers de, ladite bactérie éclairée; et
- la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne en fonction de l’intensité lumineuse acquise dans ladite gamme.
2. Procédé de détection selon la revendication 1 , dans lequel la détermination du type de Gram et du caractère fermentant comporte l’application d’une classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une souche bactérienne de type Gram négatif et fermentante.
3. Procédé de détection selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la détermination du type de Gram et du caractère fermentant comporte l’application d’une classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une souche bactérienne du type Gram positif ou l’application d’une classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une souche bactérienne du type Gram négatif.
4. Procédé de détection selon la revendication 1, 2 ou 3, dans lequel la détermination du type de Gram et du caractère fermentant comporte en outre l’application d’une classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une levure ou d’un test microbiologique distinguant la souche bactérienne d’une levure.
5. Procédé de détection selon la revendication 2, dans lequel :
- l’éclairage et l’acquisition sont réalisés directement sur un échantillon comprenant une colonie de la souche bactérienne et un milieu nutritif sur lequel ladite colonie a poussé, le milieu nutritif étant une gélose au sang, en particulier un columbia de sang de mouton ;
- si l’intensité lumineuse acquise n’est pas celle d’une souche bactérienne de type Gram négatif et fermentante, la détermination du type de Gram et du caractère fermentant comporte en outre l’application d’une classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une souche bactérienne du type Gram positif.
6. Procédé de détection selon la revendication 5, dans lequel, si l’intensité lumineuse acquise n’est pas celle d’une souche bactérienne de type Gram positif, la détermination du type de Gram et du caractère fermentant comporte en outre l’application d’une classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une levure.
7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel
- la classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une souche bactérienne de type Gram négatif et fermentante est une classification distinguant l’intensité lumineuse des souches bactériennes de type Gram négatif et fermentantes de l’intensité lumineuse de l’ensemble constitué des souches bactérienne de type négatif et non fermentantes, des souches bactérienne de type Gram positif et des levures ;
- la classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une souche bactérienne de type Gram positif est une classification distinguant l’intensité lumineuse des souches bactérienne de type Gram positif de l’intensité lumineuse de l’ensemble constitué des souches bactérienne de type négatif et non fermentantes et des levures.
- la classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une levure est une classification distinguant l’intensité lumineuse des levures de l’intensité lumineuse de l’ensemble constitué des souches bactérienne de type Gram négatif et non fermentantes.
8. Procédé selon la revendication 4, dans lequel, si l’intensité lumineuse acquise n’est pas celle d’une levure, la détermination du type de Gram et du caractère fermentant comporte en outre l’application d’une classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une souche bactérienne de type Gram positif.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel, si l’intensité lumineuse acquise n’est pas celle d’une souche bactérienne de type Gram positif, la détermination du type de Gram et du caractère fermentant comporte en outre l’application d’une classification prédisant si l’intensité lumineuse est celle d’une souche bactérienne de type Gram négatif et fermentante ou d’une souche bactérienne de type Gram négatif et non fermentante.
10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel :
- la classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une levure est une classification distinguant l’intensité lumineuse des levures de l’intensité lumineuse de l’ensemble constitué des souches bactériennes de type Gram positif, des souches bactériennes de type Gram négatif et non fermentantes et des souches bactériennes de type Gram négatif et fermentantes ;
- la classification prédisant si l’intensité lumineuse est celle d’une souche bactérienne de type Gram positif est une classification distinguant l’intensité lumineuse des souches bactériennes de type Gram positif de l’intensité lumineuse de l’ensemble constitué des souches bactériennes de type Gram négatif et non fermentantes et des souches bactériennes de type Gram négatif et fermentantes ;
- la classification si l’intensité lumineuse est celle d’une souche bactérienne de type Gram négatif et fermentante ou d’une souche bactérienne de type Gram négatif et non fermentante est une classification distinguant l’intensité lumineuse des souches bactériennes de type Gram négatif et non fermentantes de l’intensité lumineuse du groupe constitué des souches bactériennes de type Gram négatif et fermentantes ;
11. Procédé selon la revendication 3, dans lequel :
- l’éclairage et l’acquisition sont réalisés directement sur un échantillon comprenant une colonie de la souche bactérienne et un milieu nutritif sur lequel ladite colonie a poussé, le milieu nutritif étant une gélose Tryptone-Soja ;
- si l’intensité lumineuse acquise n’est pas celle d’une souche bactérienne de type Gram positif, la détermination du type de Gram et du caractère fermentant comporte en outre l’application d’une classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle d’une levure.
12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel, si l’intensité lumineuse acquise n’est pas celle d’une levure, la détermination du type de Gram et du caractère fermentant comporte en outre l’application d’une classification prédisant si l’intensité lumineuse est celle d’une souche bactérienne de type Gram négatif et fermentante ou d’une souche bactérienne de type Gram négatif et non fermentante.
13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel :
- la classification prédisant si l’intensité lumineuse est celle d’une souche bactérienne de type Gram positif est une classification distinguant l’intensité lumineuse des souches bactériennes de type Gram positif de l’intensité lumineuse de l’ensemble constitué des souches bactériennes de type Gram négatif et non fermentantes, des souches bactériennes de type Gram négatif et fermentantes et des levures;
- la classification prédisant si l’intensité lumineuse acquise est celle levure est une classification distinguant l’intensité lumineuse des levures de l’intensité de l’ensemble constitué des souches bactérienne de type négatif et non fermentantes et des souches bactérienne de type négatif et fermentantes; - la classification si l’intensité lumineuse est celle d’une souche bactérienne de type Gram négatif et fermentante ou d’une souche bactérienne de type Gram négatif et non fermentante est une classification distinguant l’intensité lumineuse des souches bactériennes de type Gram négatif et non fermentantes de l’intensité lumineuse du groupe constitué des souches bactériennes de type Gram négatif et fermentantes .
14. Procédé selon l’une des revendications 2 à 13, dans chaque classification est apprise sur des images hyperspectrales de la gamme 390nm-900 nm et selon une approche consistant à augmenter pas-à-pas un ensemble de canaux spectraux utilisés dans la classification jusqu’à obtention d’un seuil de précision prédéterminé ou d’un nombre maximal de canaux prédéterminé.
15. Procédé de détection selon la revendications 2, dans laquelle la première classification distingue les intensités lumineuses en fonction de la gamme de longueurs d’onde 470nm-500 nm et de la gamme de longueurs d’onde 575-645 nm uniquement.
16. Procédé de détection selon la revendication 3, dans laquelle la seconde classification distingue les intensités lumineuses en fonction de la gamme de longueurs d’onde 535nm
- 675 nm et de la gamme de longueurs d’onde 850 nm-875 nm uniquement.
17. Procédé de détection selon l’une des revendications 5 à 7, dans laquelle la seconde classification distingue les intensités lumineuses en fonction de la gamme de longueurs d’onde 4l5nm - 500nm et de la gamme de longueurs d’onde 535 nm - 675 nm uniquement.
18. Procédé de détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l’intensité lumineuse est acquise sur un nombre de canaux spectraux inférieur ou égal à 24.
19. Procédé de détection selon l’une quelconque des revendications 5 à 7, dans laquelle l’intensité lumineuse est acquise sur un nombre de canaux spectraux inférieur ou égal à 5 pour chacune des première et seconde classifications, et de préférence inférieur ou égal à 4.
20. Procédé de détection selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l’acquisition de l’intensité lumineuse comporte l’acquisition d’une image hyperspectrale ou multispectrale d’une colonie de bactérie de la souche, et dans laquelle l’intensité lumineuse est déterminée en fonction d’au moins un pixel de ladite image correspondant à la colonie.
21. Procédé de détection selon la revendication 20, dans laquelle la détermination du type de Gram et du caractère fermentant est réalisée en fonction de l’intensité lumineuse de chaque pixel d’un ensemble de pixels de la colonie, et dans laquelle le type de Gram et le caractère fermentant sont déterminés par un vote majoritaire des résultats desdites premières détections.
22. Procédé de détection selon la revendication 21, dans laquelle la vote majoritaire est un vote à 70% des pixels ou plus ou un vote à la majorité simple.
23. Procédé de réalisation d’un antibiogramme d’une souche bactérienne à un antibiotique comprenant :
- la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne ;
- le réalisation d’au moins un échantillon comprenant la souche bactérienne, un milieu de culture et une concentration d’un antibiotique en fonction du type de Gram et du caractère fermentant choisi; et
- la détermination de la sensibilité de la souche bactérienne à l’antibiotique en fonction de la pousse de ladite souche dans l’échantillon,
procédé dans lequel la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne est réalisée selon un procédé conforme à l’une quelconque des revendications précédentes.
24. Procédé d’identification d’une souche bactérienne à un antibiotique comprenant :
- la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne ;
- le choix d’au moins un milieu colorimétrique en fonction du type de Gram et du caractère fermentant choisi; et
- la mise en culture dans ledit milieu de la souche bactérienne,
procédé dans lequel la détermination du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne est réalisée selon un procédé conforme l’une quelconque des revendications 1 à 22.
25. Système de détection du type de Gram et du caractère fermentant d’une souche bactérienne, comprenant : - un éclairage configuré pour éclairer, dans la gamme de longueurs d’onde 390nm- 900 nm, au moins une bactérie de la souche;
- un capteur configuré pour acquérir, dans la gamme 390nm-900nm, une intensité lumineuse réfléchie par, ou transmise au travers de, ladite bactérie éclairée; et - une unité informatique configurée pour déterminer du type de Gram et du caractère fermentant de la souche bactérienne en fonction de l’intensité lumineuse acquise dans la gamme 390nm-900nm.
26. Système selon la revendication 25, configuré pour mettre en œuvre un procédé conforme à l’une des revendications 2 à 22.
27. Système selon la revendication 25 ou 26, configuré pour éclairer, et acquérir l’image de, un échantillon comprenant une colonie de bactéries de ladite souche et un milieu nutritif sur lequel ladite colonie a poussé, en particulier une boite de Pétri.
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