FR3068893A1 - Extrait de tulipe - Google Patents

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Abstract

La présente invention a pour objet un extrait issu de tulipe comportant de 20 à 70% de sucres et de 15 à 30 % de composés phénoliques, ainsi que le procédé de préparation d'un tel extrait. Cet extrait de tulipe est utilisable dans une composition cosmétique pour améliorer l'inconfort cutané et pour améliorer la fonction barrière de la peau chez un mammifère.

Description

Extrait de tulipe
La présente invention a pour objet un extrait issu de tulipe comportant de 20 à 70% de sucres et de 15 à 30 % de composés phénoliques, ainsi que le procédé de préparation d’un tel extrait. Cet extrait de tulipe est utilisable dans une composition cosmétique pour améliorer l’inconfort cutané et pour améliorer la fonction barrière de la peau chez un mammifère.
La peau, organe de revêtement recouvrant la totalité de la surface du corps, est constituée de trois compartiments distincts superposés : l'épiderme, le derme et l'hypoderme.
L'épiderme est un épithélium squameux stratifié qui constitue la structure externe de la peau. L’épiderme comprend 90% de kératinocytes, lesquels sont constitués principalement de kératines, protéines fibreuses et insolubles dans l’eau, conférant aux cellules de l’épiderme leurs propriétés protectrices.
L’épaisseur moyenne de l’épiderme est de 100 pm mais peut varier de 50pm sur les paupières à 1 mm sur la paume des mains ou la plante des pieds.
Au sein de l’épiderme, quatre couches sont à distinguer :
- la couche cornée (Stratum corneum) constituée de cellules très épaisses, les cornéocytes qui sont anucléées.
- la couche granuleuse (Stratum granulosum) contenant 3 ou 4 assises de cellules.
- la couche des cellules à épines (Stratum spinosum) contenant des kératinocytes, des tonofilaments précurseurs de la kératine, des mélanocytes et des terminaisons nerveuses.
- la couche basale (Stratum germinativum) où les kératinocytes forment une seule assise de cellules, tenues entre elles par des desmosomes.
Ainsi, les cellules constituant l’épiderme subissent un processus de maturation continue et orienté qui aboutit à la formation de cornéocytes, qui sont des cellules mortes totalement dékératinisées constituées de kératinocytes au stade terminal de leur différenciation.
Le derme est un tissu de soutien. Il se compose de protéines fibreuses dont le collagène et l'élastine, qui participent à la résistance, l'élasticité et surtout à la tonicité de la peau et/ou des muqueuses. Le derme est irrigué par un réseau sanguin microcirculatoire qui prend en charge la nutrition de l'épiderme par diffusion. Outre son rôle nutritif, le derme joue également un rôle primordial dans la thermorégulation chez l’homme et dans la cicatrisation ainsi que dans l'élimination de produits toxiques par la sueur.
Au-dessous du derme se trouve un tissu conjonctif lâche richement vascularisé : l'hypoderme.
La peau humaine constitue une barrière contre les agressions extérieures, notamment chimiques, mécaniques ou infectieuses. Cette propriété, appelée fonction barrière, est principalement assurée par la couche la plus superficielle de l'épiderme, à savoir la couche cornée.
Dans les conditions physiologiques, la surface cutanée contient environ 20% d’eau, alors que l’épiderme profond présente une teneur en eau de l’ordre de 70%. La fonction de barrière hydrique de l’épiderme correspond au maintien d’un gradient de la teneur en eau entre les couches profondes de l’épiderme et la couche cornée. L’homéostasie hydrique est un élément indispensable à l’équilibre physiologique de la peau. En effet, outre son influence sur les paramètres macroscopiques apparents, tels que l’élasticité cutanée, le taux d’hydratation régule également les activités enzymatiques et la signalisation cellulaire au sein de l’épiderme.
Le maintien d’un gradient hydrique optimal est assuré par un mélange constitué principalement de céramides (45-50 % en masse), de cholestérol (25 % en masse) et d'acides gras libres (10-15 % en masse), synthétisés par les kératinocytes.
Ces composants sont organisés en une structure lamellaire spécifique dont l'intégrité dépend non seulement de la qualité des fractions présentes mais aussi de leurs proportions respectives. Cette structure lamellaire des lipides est responsable de la souplesse de la peau entre autres. Les lipides de la peau, particulièrement de l'épiderme, sont influencés par des facteurs génétiques environnementaux, les agressions et/ou certaines pathologies qui altèrent ou modifient la composition des lipides de la peau et en diminuent la quantité, conduisant à une peau sèche.
La qualité de la barrière cutanée est ainsi dépendante de mécanismes biologiques endogènes complexes faisant intervenir des facteurs de croissance, des molécules d'adhésion, des hormones et des enzymes du métabolisme des lipides.
Ainsi, une altération de la barrière cutanée peut se produire en présence d'agressions externes de type agents irritants (détergents, acides, bases, oxydants, réducteurs, solvants concentrés, gaz ou fumées toxiques), sollicitations mécaniques (frottement, choc, abrasion, arrachement de la surface, projections de poussières, de particules, rasage ou épilation), déséquilibres thermiques ou climatiques (froid, sécheresse, radiations), xénobiotiques (microorganismes indésirables, allergènes) ou d'agressions internes de type stress psychologique.
L'altération de la barrière cutanée peut notamment se traduire par des phénomènes sensoriels désagréables. Les terminaisons nerveuses sensorielles de la surface de la peau, les récepteurs ou capteurs chimiques, thermiques, mécaniques et/ou les barorécepteurs sont en effet partiellement mis à nu. La personne peut alors éprouver des sensations d'inconfort cutané qui peuvent se manifester notamment par des picotements, des tiraillements, des échauffements, des démangeaisons.
Ces sensations d'inconfort cutané sont plus fréquentes dans les zones les plus exposées de l'organisme, à savoir les mains, les pieds, et le visage.
Elles peuvent survenir notamment sur des zones soumises à certains gestes d'hygiène quotidienne ou fréquemment renouvelés tel que le rasage, l'épilation, la détersion par des produits de toilette ou ménagers, dans le cas de gestes sportifs, professionnels ou simplement liés au mode de vie et à l'utilisation de vêtements, d'outils ou d'équipements générant des frottements localisés. Elles peuvent également être amplifiées par le stress psychologique.
Ces sensations d'inconfort cutané concernent toutes les personnes, et en particulier :
-les personnes à peau dite fragile, délicate et vulnérable se déséquilibrant rapidement lors de variations de la température ou de l'humidité relative de grande amplitude (cas des peaux de bébé par exemple)
-les personnes à peau dite fragilisée regroupant notamment les personnes dont le film hydrolipidique protecteur composé de sueur, de sébum et de facteurs d'hydratation se raréfie, comme c'est le cas pour les personnes âgées de 60 ans et plus
-les personnes dont la composition du film hydrolipidique est modifiée, comme c'est le cas des personnes diabétiques et
-les personnes qui possèdent un seuil de réactivité abaissé dû à une hyperactivité neurogène : ces peaux vont donc présenter des sensations et des signes cliniques beaucoup plus rapidement et fréquemment que les autres types de peaux : ce sont les personnes dites à peau sensible.
On pourra également parler de personnes à peau agressée pour les peaux rasées par exemple.
L’épiderme est sans cesse exposé aux micro-organismes dont certains peuvent être pathogènes. Pour lutter contre cette agression, les cellules épidermiques impliquées dans l’immunité innée, à savoir les kératinocytes et les cellules de Langerhans, jouent un rôle majeur de barrière immunologique. Cette composante immunologique est complétée par une composante structurale : le processus de desquamation, qui assure l’élimination des cornéocytes de surface et des micro-organismes installés, et la structure quasi-infranchissable que représente la couche cornée. En plus de cette barrière physique, le PH acide, le faible taux d’humidité de la couche cornée, et la température de la peau inférieure à 37°C sont défavorables à la croissance bactérienne. Linalement, la présence de peptides et lipides antimicrobiens font de l’épiderme un véritable défenseur contre l’infection.
La raison d’être de l’épiderme est ainsi d’assurer un rôle de barrière multifonctionnelle grâce aux cellules immunitaires et aux kératinocytes qui le composent. La mise en place de cette barrière et son fonctionnement nécessitent des mécanismes physiques, chimiques et biochimiques complexes et finement régulés. Ses altérations, cause ou conséquence de nombreuses maladies de la peau comme certaines génodermatoses ou le psoriasis et l’eczéma, sont la preuve de son importance.
On cherche donc à améliorer et/ou renforcer la fonction barrière cutanée pour prévenir et/ou diminuer les sensations d'inconfort cutané, picotements, tiraillements, démangeaisons, en particulier chez les personnes à peau fragile et délicate, pour les personnes fragilisées, les personnes dont la composition du film hydrolipidique est modifiée ou des personnes à peau sensible.
Des compositions agissant sur la barrière cutanée sont connues dans l'état de la technique. Toutefois, ces compositions ne permettent pas de lutter, de manière systématique et prononcée, contre les effets d'une altération de la barrière cutanée de façon efficace.
Il subsiste donc un besoin de compositions permettant d'améliorer et/ou renforcer la fonction barrière cutanée pour prévenir les sensations désagréables d’inconfort de la peau en maintenant et améliorant son élasticité, sa fermeté et sa densité.
La demanderesse a ainsi mis au point des extraits de tulipe ainsi que des compositions cosmétiques à base de ces extraits de tulipe, permettant renforcer la barrière cutanée de la peau pour limiter les sensations d’inconfort de la peau, qui constitue l’objet de l’invention.
Un objet de l'invention est ainsi une composition pour son utilisation dans le maintien de la fonction barrière de la peau chez des sujets ressentant des sensations désagréables d’inconfort de la peau.
Un autre objet est un procédé de soin cosmétique de la peau chez des sujets comprenant l'administration de cette composition.
D'autres objets, caractéristiques, aspects et avantages de l'invention apparaîtront encore plus clairement à la lecture de la description et des exemples qui suivent.
La figure 1 est un chromatogramme de l'extrait avant (a en pointillés) et après hydrolyse (b en traits pleins).
La figure 2 représente l’étude des conditions de toxicité de l’extrait selon l'invention (sur kératinocytes primaires, figure 2a, sur fibroblastes primaires, figure 2b). Les mesures sont exprimées en pourcentage de vitalité cellulaire en fonction du pourcentage d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention dans le milieu de culture.
La figure 3 montre le résultat des tests de viabilité cellulaire au MTT sur des fibroblastes (3a) et des kératinocytes (3b) dans le cadre du modèle de paupière reconstruite. Ces cellules sont soumises à des traitements par l’extrait selon l’exemple 3 de l’invention, dans les conditions suivantes : a=sans traitement, b=0.005%, c=0.01%, d=0.05%, e=0.1%, f=0.5%, g=l% d’extrait selon l’invention, h=0.05% SDS.
La figure 4 montre l’épaisseur de l’épiderme reconstruit à J35 (Ligure 4a) et du derme à J42 (4b) en fonction de la quantité d’extrait selon l’invention. a= contrôle sans extrait, b=en présence de 0.005% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention, c= 0.01% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention, d=TGLbeta. Nombre d’images analysées : n=9. Analyse statistique : t-test. * p< 0.05, ** p<0.01 et *** p<0.001.
La figure 5 montre la présence d’acide hyaluronique dans des peaux traitées par l’extrait selon l’invention. a=contrôle, b=0.005% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention, c=0.01%, d=témoin TGLbeta
La figure 6 représente la surface d’acide hyaluronique par unité de longueur de feuillet de peau. Le nombre d’images analysées : n=12. Analyse statistique : t-test. * p< 0.05, ** p<0.01 et *** p<0.001.
La figure 7 montre la présence de fibrilline dans des peaux traitées par l’extrait selon l’invention. a=contrôle, b=0.005% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention, c=0.01%, d=témoin TGFbeta
La figure 8 représente les surfaces de fibrilline (Figure 8a) et d’élastine (Figure 8b) par unité de longueur de feuillet de peau. Nombre d’images analysées : n=12. Analyse statistique : t-test. * p< 0.05, ** p<0.01 et *** p<0.001.
La figure 9 montre la présence de vimentine dans des peaux traitées par l’extrait selon l’invention. a=contrôle, b=0.005% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention, c=0.01%, d=témoin TGFbeta
La figure 10 représente les surfaces de vimentine par unité de longueur de feuillet de peau. Nombre d’images analysées : n=12. Analyse statistique : t-test. * p< 0.05, ** p<0.01 et *** p<0.001.
La figure 11 représente l’étude de l’impact du stress résultant du peroxyde d’hydrogène (figures lia - ImM et 11b - 2mM) sur les cellules.
La figure 12 représente l’effet de 0,01% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention sur un échantillon en présence d’une concentration de ImM de peroxyde d’hydrogène (figures 12a à 12c). Les expériences sont effectuées en triplicate.
La figure 13 représente l’effet de 0,01% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention sur un échantillon en présence d’une concentration de 2mM de peroxyde d’hydrogène (figures 13a à 13c). Les expériences sont effectuées en triplicate.
La figure 14 identifie le nombre de cellules stressées. Condition a : sans stress par peroxyde d’hydrogène, condition b : stress par ImM de peroxyde d’hydrogène, condition c : stress par ImM de peroxyde d’hydrogène en présence de 0.01% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention, condition d : stress par 2mM de peroxyde d’hydrogène, condition e : stress par 2mM de peroxyde d’hydrogène en présence de 0.01% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention.
La figure 15 schématise l’épaisseur de l’épiderme humain reconstruit et des couches nucléées. Condition a : sans stress par peroxyde d’hydrogène, condition b : stress par ImM de peroxyde d’hydrogène, condition c : stress par ImM de peroxyde d’hydrogène en présence de 0.01% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention, condition d : stress par 2mM de peroxyde d’hydrogène, condition e :
stress par 2mM de peroxyde d’hydrogène en présence de 0.01% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention.
La figure 16 schématise la perméabilité de l’épiderme au moyen de colorant Jaune de Lucifer. Condition a : sans stress par peroxyde d’hydrogène, condition b : stress par ImM de peroxyde d’hydrogène, condition c : stress par ImM de peroxyde d’hydrogène en présence de 0.01% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention, condition d : stress par 2mM de peroxyde d’hydrogène, condition e : stress par 2mM de peroxyde d’hydrogène en présence de 0.01% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention.
La figure 17 schématise la perte insensible en eau. Condition a : sans stress par peroxyde d’hydrogène, condition b : stress par ImM de peroxyde d’hydrogène, condition c : stress par ImM de peroxyde d’hydrogène en présence de 0.01% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention, condition d : stress par 2mM de peroxyde d’hydrogène, condition e : stress par 2mM de peroxyde d’hydrogène en présence de 0.01% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention.
La figure 18 représente une évaluation du pH de la barrière de la peau. Condition a : sans stress par peroxyde d’hydrogène, condition b : stress par ImM de peroxyde d’hydrogène, condition c : stress par ImM de peroxyde d’hydrogène en présence de 0.01% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention, condition d : stress par 2mM de peroxyde d’hydrogène, condition e : stress par 2mM de peroxyde d’hydrogène en présence de 0.01% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention.
La figure 19 représente la cornéométrie de chaque tissu. Condition a : sans stress par peroxyde d’hydrogène, condition b : stress par ImM de peroxyde d’hydrogène, condition c : stress par ImM de peroxyde d’hydrogène en présence de 0.01% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention, condition d : stress par 2mM de peroxyde d’hydrogène, condition e : stress par 2mM de peroxyde d’hydrogène en présence de 0.01% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention.
La figure 20 représente l’évaluation des céramides sur les épidermes humains reconstruits avec et sans stress en présence ou non de l’extrait selon l’invention. Condition a : sans stress par peroxyde d’hydrogène, condition b : stress par ImM de peroxyde d’hydrogène, condition c : stress par ImM de peroxyde d’hydrogène en présence de 0.01% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention, condition d : stress par 2mM de peroxyde d’hydrogène, condition e : stress par 2mM de peroxyde d’hydrogène en présence de 0.01% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention.
Les compositions cosmétiques utilisées dans l'invention, comportent dans un milieu cosmétiquement acceptable, au moins un extrait issu de tulipe de l’espèce Tulipa gesneriana autrement appelée tulipe des jardins, une espèce de plante de la famille des liliacées.
Dans la présente invention, par «extrait » de tulipe, on entend un extrait obtenu à partir de la plante et/ou d'une partie de la plante. Il peut s'agir par exemple d'un extrait obtenu à partir de fleurs ou sommités fleuries, feuilles, graines, racines, tiges, graines, péricarpe de tulipe.
L'extrait issu de tulipe de l’espèce Tulipa gesneriana conforme à l'invention, comprend, en poids, de 20 à 70% de sucres et de 15 à 30% de composés phénoliques, dont au moins 8% de ces composés phénoliques sont des flavonoïdes, par rapport au poids total de l'extrait sec.
Les sucres sont principalement des monosaccharides et/ou des polysaccharides. De préférence, les sucres sont principalement des monosaccharides et des polysaccharides.
De préférence, cet extrait comprend, outre des monosaccharides et des polysaccharides, de 50 à 90% de quercétine et de 10 à 50% de kampférol en poids par rapport au poids total de l'extrait sec. Plus préférentiellement, cet extrait comprend outre des monosaccharides et des polysaccharides, de 65 à 85% de quercétine et de 15 à 35% de kampférol en poids par rapport au poids total de l'extrait sec.
Un extrait particulièrement préféré est défini par les chromatogrammes de la figure 1.
L'extrait selon l'invention peut se présenter sous forme de poudre.
Le procédé d’obtention de l'extrait selon l'invention est le suivant : l’extrait est obtenu à partir de tulipe et plus particulièrement de tulipe de l'espèce Tulipa gesneriana, et de préférence une tulipe sombre : de couleur pourpre.
Le procédé d'extraction permettant l'extraction sélective d'un extrait issu de tulipe de l'espèce Tulipa gesneriana selon l'invention est caractérisé par le fait que l’on procède à une ou plusieurs macérations, l’extrait liquide est clarifié, filtré, puis le précipité est ensuite séché pour obtenir l’extrait.
De préférence, seuls les pétales de la tulipe sont utilisés pour la préparation de l’extrait.
De préférence, la ou les macérations s’effectuent dans un mélange eau/éthanol. Dans un mode de réalisation de ce procédé, le mélange pour la macération est composé de 70% d’eau stérile et de 30% d’éthanol. Les extraits sont susceptibles d’être obtenus à partir du procédé précédemment décrit à partir de tulipe de l’espèce Tulipa gesneriana.
L'invention est également relative à des compositions cosmétiques comprenant au moins un tel extrait et éventuellement un véhicule inerte cosmétiquement acceptable. Ces compositions sont appropriées pour une utilisation topique chez un mammifère, préférablement un humain et sont utiles pour améliorer l’inconfort cutané et pour améliorer la fonction barrière de la peau chez un mammifère, préférablement un humain.
Ces compositions sont également utiles pour améliorer le remodelage dermique de la peau ainsi que la réparation tissulaire chez un mammifère.
L’inconfort cutané peut être notamment caractérisé par des tiraillements, des picotements, des échauffements et/ou des démangeaisons. De par cette amélioration et de renforcement de la fonction barrière cutanée, toutes les peaux et en particulier les peaux fragiles ou fragilisées et les peaux sensibles sont mieux protégées des agressions extérieures, chimiques, mécaniques ou infectieuses.
Le rythme circadien est un système endogène généré à partir du noyau suprachiasmatique localisé dans l'hypothalamus.
Ce noyau montre des oscillations approximativement chaque 24h et coordonne des processus physiologiques et biologiques spécifiques. Les fonctions chronobiologiques de base du noyau sont le contrôle de la température et de l'expression des gènes de la mitose, régulant ainsi la différenciation cellulaire et la prolifération. Bien que le corps ait une horloge circadienne centrale, des organes spécifiques tels que la peau, contiennent des oscillateurs périphériques circadiens qui régulent des procédés locaux.
Les fonctions de la peau sont en particulier influencées par des gènes circadiens CLOCK (Circadian Locomotor Output Cycles Kaput). L'expression de ces gènes a été étudiée in vitro dans des cellules de peau humaine incluant des kératinocytes, des mélanocytes, et des fibroblastes dermiques. L'activité de ces gènes circadiens régulés permet à la peau de s'adapter à ses fonctions diurnes et nocturnes ainsi qu'aux variations des conditions environnementales. Une périodicité journalière a ainsi été observée dans les taux de prolifération des cellules de peau, l'hydratation et la perte insensible en eau, l'afflux de sang capillaire, la production de sébum, la température, le pH de surface, et l'apparence des rides chez les humains.
De plus, on a observé une décroissance des oscillations périodiques des gènes CLOCK avec l’âge, suggérant une altération des cycles circadiens ayant pour résultat d’altérer la physiologie globale de la peau.
Les compositions selon l’invention, en restaurant la périodicité des taux de prolifération des cellules de peau, permettent l’amélioration de la fonction barrière de la peau chez un mammifère.
Ces compositions sont également utiles pour l’amélioration de l’hydratation de la peau et de l’homéostasie cutanée chez un mammifère.
Ces compositions sont aussi utiles pour l’amélioration du remodelage dermique de la peau et l’amélioration de la réparation tissulaire chez un mammifère, préférentiellement un humain.
De telles compositions peuvent être utilisées à titre préventif ou curatif.
La composition utilisée dans l'invention est adaptée à une application topique sur la peau et comprend donc un milieu cosmétiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau. Il s’agit d’un milieu qui présente une couleur, une odeur et un toucher agréables et qui ne génère pas de désagréments inacceptables (picotements, tiraillements, rougeurs), susceptibles de détourner la consommatrice d'utiliser cette composition.
La composition utilisée dans l'invention peut comprendre avantageusement une phase aqueuse. La composition peut comprendre de l'eau en une teneur allant de 10% à 90% en poids par rapport au poids total de la composition, de préférence allant de 50% à 70% en poids par rapport au poids total de la composition.
La composition utilisée dans l'invention peut se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées pour une application topique sur la peau, notamment sous forme d'une émulsion huile-dans-eau ou eau-dans-huile ou multiple, éventuellement gélifiée, d'une émulsion siliconée, d'une microémulsion ou nanoémulsion, d'un produit anhydre liquide, pâteux ou solide, d'une dispersion d'huile dans une phase aqueuse en présence de sphérules, ces sphérules pouvant être des nanoparticules polymériques telles que les nanosphères et les nanocapsules ou, mieux, des vésicules lipidiques de type ionique et/ou non-ionique.
Cette composition peut être plus ou moins fluide et avoir l'aspect d'une crème blanche ou colorée, d'une pommade, d'un lait, d'une lotion, d'un sérum, d'une pâte, d'une mousse ou d'un gel. Elle peut éventuellement être appliquée sur la peau sous forme d'aérosol. Elle peut également se présenter sous forme solide, et par exemple sous forme de stick.
Avantageusement, la composition utilisée dans l'invention est sous forme d’une émulsion huile-dans-eau ou d’un gel, une crème ou un sérum.
De façon connue, la composition de l'invention peut contenir également les adjuvants habituels dans les domaines cosmétique et dermatologique, tels que les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les actifs hydrophiles ou lipophiles, les agents hydratants (tels que la glycérine, le propylène glycol, le butylène glycol, le pentylène glycol, l'hexylène glycol, le dipropylène glycol, le diéthylène glycol), les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les parfums, les charges, les pigments, les filtres hydrophiles, les absorbeurs d'odeur et les matières colorantes. Les quantités de ces différents adjuvants sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés, et par exemple de 0,01 à 20 % du poids total de la composition. Ces adjuvants, selon leur nature, peuvent être introduits dans la phase grasse, dans la phase aqueuse, dans les vésicules lipidiques et/ou dans les nanoparticules.
Lorsque la composition selon l'invention est une émulsion, la proportion de la phase grasse peut aller de 5 à 50 % en poids, et de préférence de 5 à 30 % en poids par rapport au poids total de la composition.
Comme matières grasses utilisables dans l'invention, on peut utiliser les huiles minérales, les huiles d'origine animale, les huiles de synthèse, les huiles siliconées et les huiles fluorées. On peut aussi utiliser comme matières grasses des acides gras, des cires et des gommes et en particulier les gommes de silicone.
Les émulsionnants et les coémulsionnants éventuellement utilisés dans la composition sous forme d'émulsion sont choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Ces émulsionnants et coémulsionnants sont de préférence présents, dans la composition, en une proportion allant de 0,3 à 20 % en poids, et de préférence de 0,5 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition. Comme émulsionnants et coémulsionnants utilisables dans l'invention, il est particulièrement avantageux d'utiliser les esters d'acide gras et de polyol tels que le stéarate de PEG-100, le stéarate de
PEG-50 et le stéarate de PEG-40, le tristéarate de sorbitane, les stéarates de sorbitane oxyéthylénés disponibles sous les dénominations commerciales Tween 20 ou Tween 60, par exemple et leurs mélanges.
Comme gélifiants hydrophiles, on peut citer en particulier les polymères carboxyvinyliques (carbomer), les copolymères acryliques tels que les copolymères d'acrylates/alkylacrylates, les polyacrylamides, les polysaccharides, les gommes naturelles et les argiles, et, comme gélifiants lipophiles, on peut citer les argiles modifiées comme les bentones, les sels métalliques d'acides gras et la silice hydrophobe.
Bien entendu, l'homme de l'art veillera à choisir le ou les éventuels composés à ajouter aux compositions selon l'invention, ainsi que leur concentration, de manière telle que les propriétés avantageuses attachées intrinsèquement aux compositions conformes à l'invention ne soient pas, ou substantiellement pas, altérées par l'addition envisagée.
L'invention est également relative à un procédé de soin cosmétique de la peau comprenant au moins une étape d'application sur la peau d'un mammifère de la composition de l'invention, ainsi qu'à l'utilisation cosmétique de cette composition pour améliorer la fonction barrière de la peau, maintenir et renforcer la barrière cutanée de la peau et ainsi limiter les sensations d’inconfort de la peau chez des sujets ressentant ces sensations désagréables.
L'application sur la peau peut être réalisée en fonction de la forme galénique utilisée. II peut s'agir, par exemple d'une simple application sur la peau ou d'une application accompagnée, par exemple, d'un massage de la peau avec la composition de la présente invention. L'application est de préférence réalisée avec une quantité suffisante de la composition afin que toute la surface de la peau à traiter soit traitée. II peut s'agir par exemple d'une application classique, comme une crème sur la peau. II peut s'agir par exemple aussi d'une application pour former un masque traitant. L'application peut être toute application souhaitée par l'utilisateur/l'utilisatrice, par exemple une application quotidienne, biquotidienne, hebdomadaire et/ou bi-mensuelle. Il peut s'agir par exemple d'une application une fois par jour, deux fois par jour ou plus.
L'invention sera maintenant illustrée à l'aide des exemples non limitatifs suivants.
Exemple 1 : Obtention de l'extrait brut de tulipe selon l'invention
Un kilogramme de pétales de tulipe de couleur pourpre foncé (Tulipa gesneriana) est mis à macérer à température ambiante pendant 24h sous agitation mécanique dans 10 litres d’une solution composés de 30% d’éthanol (Sigma, France) dans de l’eau stérile. La solution est ensuite clarifiée à l’aide d’un filtre à cadres creux (Colombo, Rover Pompe, Italie) avec un seuil de coupure de 10 à 15 qm. le filtrat est ensuite refiltré sur un filtre qui possède un seuil de coupure de 0.15 à 0.25 qm. l’éthanol est ensuite éliminé par filtration sous vide (Bûchi R-153, Suisse). On obtient une solution de 80 grammes d’extrait brut de tulipe.
Exemple 2 : Caractérisation de l’extrait brut
L’extrait brut de tulipe de l’exemple 1 obtenu à partir de tulipe (Tulipa gesneriana) de couleur pourpre foncé a été analysé et les sucres totaux de cet extrait ont été dosés par la méthode au résorcinol.
L'extrait brut de tulipe selon l’invention présente une teneur en sucres totaux de 66,3% en équivalent glucose.
L'extrait est ensuite analysé en HPLC-UV avant et après hydrolyse acide. Avant l’étape d’hydrolyse acide, on observe les flavonoïdes aglycones présents. Après l'étape d'hydrolyse, on met en évidence les génines correspondant aux flavonoïdes glycosilés. Les chromatogrammes de l'extrait avant et après hydrolyse sont présentés dans la Figure 1 :
L'extrait de tulipe analysé avant hydrolyse est constitué principalement de composés sous forme glycosilée élués en début de gradient.
L'extrait brut de tulipe contient sous formes libre et glycosilée les noyaux flavonoïdiques suivants : la quercétine, le kaempférol, la myricétine et l'isorhamnétine.
La quercétine représente 70% de la totalité des noyaux flavonoïdiques présents dans l'extrait testé. Le kaempférol est le deuxième noyau le plus présent (environ 20%) tandis que la myricétine et l'isorhamnétine représentent chacune environ 5% des composés formés sur un noyau flavone/flavonol.
Des composés non flavonoïdiques sont observés après hydrolyse. Un premier composé possède un spectre UV caractéristique d'une anthocyane (maxima à 276 et 525 nm). Un second composé (temps de rétention = 8,47 minutes) dont l'unique maximum d'absorbance est 290nm est un tanin. Ces pics de composés n'absorbant pas à 350nm n'apparaissent pas sur la Figure 1.
L'extrait est analysé en chromatographie liquide en phase inverse et détecté par une barrette de diode DAD-UV ainsi que par un spectromètre de masse à haute résolution (HRMS).
Une colonne WATERS Acquity BEH C18 -150 x 2,1mm l,7pm est utilisée avec un débit de 0,2 mL/min à la température de 30°C. La concentration injectée est de 1000 ppm dans du méthanol comme solvant d’injection.
Le gradient d’élution est le suivant :
Temps (min) % acide formique 0,1% % (méthanol + acide formique 0,1%)
0 90 10
3 90 10
30 20 80
35 20 80
L'extrait possède un riche profil UV à 254nm.
Pour le composé majoritaire observé en UV, les données obtenues en HRMS indiquent que la génine a une masse de 302,04122 g/mol, ce qui correspond à la masse monoisopique d'une pentahydroxyflavone dans le groupe des aglycones de flavonoïdes.
L'analyse de l'extrait après hydrolyse détermine que c’est la quercétine. Les données de fragmentation obtenues en AutoMS/MS permettent de déterminer que les monosaccharides portés sont un hexose et un désoxyhexose.
La molécule sous forme sodée est fragmentée en AutoMS/MS. On observe un premier ion à 487,07348 g/mol, qui est la molécule ayant perdu le désoxyhexose. C'est donc l'hexose qui est lié à la génine. Un second ion fragment à 331.099217590 g/mol est observé. Cet ion représente la perte de la génine. Ceci indique que les deux unités glycosilées sont liées entre elles et que le composé est une quercétine diglycosilée sur une seule position avec l'hexose sur la génine et le désoxyhexose en position terminale.
Ainsi, les composés identifiés dans l'extrait brut de tulipe selon l’exemple 1 sont en grande partie des flavonols glycosilés, dont la rutine 7-o-beta-d-glucopyranoside, la populnin-3-O-rutinoside, risoquercitrine (ou quercétine 3-O-glucoside), le kaempférol-3-Orutinoside, le kaempférol 3-0 et/ou 7-O-glucoside, et la 3-o-(2(g)alpha-l-rhamnopyranosylrutinoside quercimeritrine.
Exemple 3 : Extrait prêt à l’emploi
720 grammes de maltodextrines (Tate&Lyle, Slovaquie) sont dissoutes avec l’extrait brut de l’exemple 1, puis la solution obtenue est atomisée (Bûchi 190, Suisse) et l’extrait sec final est obtenu.
Environ 650 grammes d’extrait de tulipe selon l’invention sont ainsi obtenus sous la forme d’une poudre fine de couleur violette.
Exemple 4 : Détermination des conditions non cytotoxiques
Les cellules utilisées proviennent d'un prélèvement de cellules normales après plastie au niveau de la peau du lobe de l’oreille d’une femme caucasienne de 46 ans. Les fibroblastes sont réceptionnés à P3 (réf NE154) et les kératinocytes sont réceptionnés à P2 (réf. NK154).
Les cellules proviennent de Cell Research Corp (Singapour).
a) Mode opératoire
Pour les fibroblastes, les milieux utilisés sont le Fibroblasts Basal Medium réf. catalogue : 95115500 (Cell Application distribué par tebu-bio - France) et le Fibroblasts Growth Supplément réf catalogue : 095116GS (Cell Application)
Pour les kératinocytes, les milieux utilisés sont le EpiLife® Medium, avec 60 μΜ de calcium réf. catalogue : M-EPI-500-CA et EpiLife® Defined Growth Supplément (EDGS) réf. catalogue : S-012-5 (Cascade distribué par Life Technologie - France).
L'extrait selon l'invention sous forme de poudre de l'exemple 3 est dilué dans le milieu de culture respectif de chacune des cellules aux proportions suivante, 0.1%, 0.05%, 0.025%, 0.01%, 5.10-3% ,
2.5.10- 3%, 1.10-3%, 5.10-4%, 2.5.10-4%, 1.10-4%, 5.10-s%, 2.5.10-s%,
1.10- 5%, 5.10-6%, 2.5.10-6%, 1.10-6%, 5.10-7%.
b) Réalisation du test MTT :
Ce test est basé sur l'activité d'une enzyme mitochondriale, la succinate déshydrogénase.
En présence du substrat MTT (3-[4,5-diméthylthiazol-2yl]-2,5diphényltétrazolium bromide), les sels de tétrazolium du substrat sont transformés en cristaux insolubles de formazan grâce à l'activité de la succinate déshydrogénase.
La quantité de sel formazan produite par les cellules à partir du MTT est mesurée par spectrophotométrie à 570 nm.
Brièvement, on ensemence des cellules en plaques de 96 puits dans leurs milieux de culture respectifs à 8500 cellules/puits, puis on incube 24h (37C, 5% CO2, saturation humidité) pour permettre l’adhésion cellulaire. Après 24h, on ôte le milieu de culture et on ajoute 200pL de milieu respectif pour chaque type cellulaire avec l'extrait selon l'invention dilué aux concentrations indiquées.
Les cellules sont incubées 20h avec l'extrait selon l'invention à 37C, 5% CO2, saturation humidité.
Pour le test MTT, on prépare 2 mL de solution fraîche de MTT en diluant la poudre à 5mg/mL dans du PBS (tampon phosphate salin) (MTT (Thiazolyl Blue Tétrazolium Bromide, ref. M 5655, Sigma
France).
Stérilement, on ajoute 20pL de solution de MTT dans chaque puits. On homogénéise, puis on remet la plaque à incuber (37C, 5%
CO2) pour permettre la métabolisation du MTT pendant 3 à 4 heures.
On prépare la solution de solubilisation du MTT (diméthylsulfoxide) /Isopropanol - 1 :1).
On ôte le milieu par aspiration et on sèche la plaque avec du papier absorbant. On resuspend les cristaux de formazan avec 150pL de solution de solubilisation de MTT en agitant à 150rpm pendant 15 minutes à température ambiante.
On lit au spectrophotomètre la densité optique à 570nm, en retirant la mesure de densité optique à 670nm (bruit de fond).
Les résultats s'expriment en fonction du % d’absorption par rapport aux % d’absorption relevé pour les cellules contrôles, c'est-àdire non traitées par un composé.
Les résultats sont présentés sur la figure 2. L'extrait selon l'invention présente un effet prolifératif net, sur kératinocytes et fibroblastes, dès 0.1%, avec un réel effet dose pour les deux types cellulaires et une forme gaussienne suggérant une forte activité biologique.
L'extrait selon l'invention peut ainsi être utilisé sur kératinocytes jusqu'à une concentration de 0,25% (soit 2,5mg/mL) (figure 2a) et sur fibroblastes jusqu'à une concentration de 0,1% (soit 0,lmg/mL) (Figure 2b).
Exemple 5 : Effet de la composition selon l’invention sur l’identification et l’expression de gènes de fibroblastes.
a. Cellules utilisées
Les fibroblastes primaires humains sont réceptionnés à P3 (Cell
Research Corp réf NF154). Ils proviennent d’une biopsie de la peau du lobe de l’oreille d'une femme caucasienne de 46 ans. Les cellules sont cultivées et incubées à 36.5°C / 5% CO2 dans le milieu DMEM sans sérum (Fibroblast Basal Medium: réf. : 95115500 - Tebu-bio)
Ensuite, on ensemence des flasques T25 (Greiner - France) avec 1 million de fibroblastes par flasque à JO. On traite ensuite avec
0.001% de la composition selon l’exemple 3 directement diluée dans le milieu de culture des cellules. Différents temps de mise en contact avec la composition sont effectués à 3 heures, 9 heures et 24 heures.
Ensuite, on trypsinise les cellules, on les compte et on les transfère dans 350 pl de tampon de lyse.
Les ARNs sont extraits des cellules par une solution de RNAeasy (RNAesasy®, Qiagen - France). Les ARNs sont ensuite validés qualitativement et quantitativement (Experion BioRad France).
b. Analyse des profils d’expression
L’objectif de cette étude est l’identification de la modulation de l’expression génique sur des échantillons traités par la composition selon l’invention via une étude du profil des ARN messagers extraits ainsi traités sur puces Agilent 8X60K.
c. Vérification de la qualité des ARNs
Au préalable, l'intégrité et la qualité des ARNs ont été vérifiés par électrophorèse capillaire avec le kit Experion de BioRad (Réf 7007106).
Dans chaque échantillon, un profil électrophorétique des ARNs ribosomaux est réalisé et l'absence de contamination par de l’ADN génomique est validée.
d. Amplification, marquage, hybridation des ARNs sur puces à ADN, et données brutes
Les échantillons ARNs ont été hybridés sur des lames humaines Agilent 8X60K v2 (AMADID 039494, Agilent Technologies - France) selon l’approche simple couleur. Cette approche permet une comparaison directe des intensités de fluorescence entre les puces sans avoir recours à une référence commune.
Brièvement, les marquages sont réalisés sur 200ng d’ARNs totaux. Le kit utilisé, Low Input Quick Amp Labeling Kit, One color (Agilent Technologies, Erance), permet la synthèse d’ARNc marqués par amplification linéaire et consiste en :
- une synthèse d’ADNc par transcription inverse en utilisant comme amorce un oligonucléotide de type oligo-dT qui possède à son extrémité 5’ le site pour l’enzyme T7 ARN polymérase ;
- une synthèse de l’ARNc avec incorporation simultanée de CTP couplés à la cyanine 3 puis une purification sur colonne RNeasy 10 Mini kit (QIAgen, Erance).
Les résultats suivants sont obtenus:
Intensités
Gène CTRL24h LP3h LP9h LP24h
ARNTL 3,85519642 5,99077367 3,96974786 7,03226241
ARNTL2 87,116017 92,6411345 135,391166 62,7917873
CDKN1C 4596,258 3124,655 1803,809 5480,757
CLOCK 187,231364 213,603243 261,443154 200,421185
COL5A3 635,11 1046,472 1066,471 824,6328
CYP51A1 2552,869 3430,275 3640,976 2855,704
DDIT3 2988,494 1182,891 2470,983 3010,254
DDIT4 10468,19 3790,874 9421,314 10508,67
DHCR24 595,38 917,5137 1318,265 729,5543
DHCR7 3126,678 3549,045 4849,219 2969,283
LOSL1 427,4487 675,6 1036,742 499,5877
GADD45B 10524,2 5177,673 8523,914 10882,67
HAS2 749,2322 2908,225 1755,235 691,1525
HMGCR 1920,815 3653,678 3679,566 2178,773
HSD17B7 50,40838 99,4955 114,2697 62,08262
INSIG1 1389,301 4990,682 2894,731 1497,743
MMPI 19766,88 18414,9 45802,3 14410,81
MMP3 15987,36 17846,41 22535,31 18808,79
MVD 512,4022 683,0981 747,589 577,0654
MVK 4071,306 4178,21 5830,39 4235,792
NPAS2 260,810458 263,448921 446,313629 237,695147
NR1D1 98,2465547 42,6491607 73,9664465 91,6951987
PTGS2 73,56258 545,6229 226,0038 167,6678
SERPINB2 49,39019 137,5425 179,4255 53,77186
SERPINB8 197,4007 420,2482 339,6446 240,1873
SESN1 646,5373 378,2203 405,8692 518,2435
TGFB1 834,9971 1195,998 1138,577 970,3627
SESN2 1227,157 498,921 1521,516 1160,809
Seuls les gènes présentant des intensités relatives distinctes du bruit de fond ont été sélectionnés. A partir des intensités obtenues, les rapports des intensités (Ri) échantillons traités versus le contrôle ont été calculés pour chaque gène et chaque condition de traitement.
Les gènes modulés ont été sélectionnés pour un Ri supérieur ou égal à 1,5 ou inférieur ou égal à 0,6, en conservant les séquences géniques dont l’expression est induite ou inhibée au moins aux deux temps de cinétique (3-9h, 9-24h, 3-9-24h). Les gènes induits ou inhibés à un seul temps de cinétique ont été sélectionnés avec un Ri 10 supérieur ou égal à 2 ou inférieur ou égal à 0,5 respectivement.
Fibroblastes
Rapports calculés entre la condition traitée versus contrôle
Gène FP3hv CTRL24h FP9hv CTRL24h FP24hv CTRL24h
ARNTL 1,55 1,03 1,82
ARNTL2 1,06 1,55 0,72
CDKN1C 0,68 0,39 1,19
CLOCK 1,14 1,40 1,07
COL5A3 1,65 1,68 1,30
CYP51A1 1,34 1,43 1,12
DDIT3 0,40 0,83 1,01
DDIT4 0,36 0,90 1,00
DHCR24 1,54 2,21 1,23
DHCR7 1,14 1,55 0,95
FOSL1 1,58 2,43 1,17
GADD45B 0,49 0,81 1,03
HAS2 3,88 2,34 0,92
HMGCR 1,90 1,92 1,13
HSD17B7 1,97 2,27 1,23
INSIG1 3,59 2,08 1,08
MMPI 0,93 2,32 0,73
MMP3 1,12 1,41 1,18
MVD 1,33 1,46 1,13
MVK 1,03 1,43 1,04
NPAS2 1,01 1,71 0,91
NR1D1 0,43 0 ,75 0,93
PTGS2 7,42 3,07 2,28
SERPINB2 2,78 3,63 1,09
SERPINB8 2,13 1,72 1,22
SESN1 0,58 0,63 0,80
SESN2 0,41 1,24 0,95
TGEB1 1,43 1,36 1,16
Les gènes sélectionnés ont été soumis à l’analyse fonctionnelle par PredictSearchTM afin d’identifier les effets biologiques induits.
Parmi les gènes fortement induits dès 3h de traitement, on note les gènes /KROX24 et EGR2/KROX20 qui codent pour des facteurs de la famille early growth response, impliqués dans les processus de prolifération et différenciation. Parmi les gènes codant pour le collagène, seul COL5A3 est induit par le traitement. Il a été montré que l’expression transitoire de COL5A3 est nécessaire lors de l’initiation de la réparation cutanée et du développement des tissus. Le gène PTGS2, prostaglandin-endoperoxide synthase 2/COX2, enzyme clef de la synthèse d’acide arachidonique, qui assure le maintien de la barrière de perméabilité est également fortement induit.
Les métalloprotéinases codées par MMP3, MMP et les gènes SERPINB2/PAI2, SERPINB8 et SERPINE 1/PAI1, connus pour être des gènes cibles de la voie de signalisation du TGEB1 et impliqués dans le remodelage de la matrice extracellulaire lors du renouvèlement ou de la réparation tissulaire sont également induits.
Ainsi, l'action précoce de la composition selon l’invention conduit à l’activation de l’expression de plusieurs enzymes contribuant à la synthèse de prostaglandines qui jouent un rôle important lors des processus de réparation.
Les gènes LIL (leukemia inhibitory factor) et LOSL1 (LOS-like antigen 1) sont fortement induits en réponse à l’action de la composition selon l’invention. Les expressions de LIE et de EOSL1 sont corrélées avec la réparation tissulaire au niveau des kératinocytes. LIE participe également à la prolifération et à la différenciation des mélanocytes.
L’acide hyaluronique de haut poids moléculaire dont la synthèse est assurée par HAS2 (hyaluronan synthase 2), gène induit par l’action de la composition selon l’invention, entre dans la composition des matrices extra cellulaires. Il est synthétisé par différentes cellules, principalement les fibroblastes, les kératinocytes, les cellules endothéliales et les cellules synoviales. En dehors de ses propriétés hydratantes, l’acide hyaluronique assure le maintien de l'élasticité et le soutien des tissus au niveau de la peau. En effet, dans les fibroblastes dermiques, la différenciation est associée à une induction accrue d’ARNm d’HAS2.
Ainsi, l’induction d’HAS2 résulte en une production d’acide hyaluronique, composant essentiel de la matrice extracellulaire qui contribue à l’élasticité et à l’hydratation de la peau.
Les gènes MVK, MVD, HSD17B7, CYP51A1, HMGCR, DHCR7 et DHCR24 sont également induits principalement à 3 et/ou 9h. Leurs fonctions concourent à une augmentation précoce et transitoire de la teneur en cholestérol en réponse au traitement.
Ainsi, l’activité de la composition selon l’invention cible la biosynthèse de cholestérol via l’induction des gènes codant pour des enzymes cruciales de cette chaîne métabolique. En effet, le taux élevé de cholestérol cellulaire augmente l’expression d’ACAT2, qui code pour une enzyme favorisant la formation d’ester de cholestérol, qui est le précurseur de tous les autres stéroïdes de l’organisme telles que la Vitamine D ou les hormones stéroïdiennes.
Après 3 h de traitement, plusieurs gènes cibles du facteur p53, DDIT3, DDIT4, CDKN1C, GADD45B, SESN1, SESN2 sont réprimés en réponse au traitement. La fonction majeure de ces gènes est de contribuer à l’arrêt du cycle cellulaire conduisant les cellules vers
Γ apoptose.
Parmi les gènes marqueurs du rythme circadien, l’expression des gènes ARNTL/BMAL1 (brain and muscle ARNT-like 1), ARNTL2/BMAL2 (brain and muscle ARNT-like 2), NPAS2 (neuronal PAS domain protein 2), CLOCK (circadian locomotor output cycles kaput), CRY1 (cryptochrome-1 ) est modulée positivement en réponse au traitement.
Les rythmes circadiens du comportement et de la physiologie des mammifères sont synchronisés par des signaux de lumière reçus par la rétine et communiqués aux noyaux supra-chiasmatiques.
Des oscillations journalières des gènes horloges ont été observées in vitro, dans des cultures de fibroblastes de rat mais aussi in vivo, dans des tissus périphériques tels que le foie, le muscle, les reins, les poumons, suggérant que la plupart des cellules somatiques sont dotées d’horloges circadiennes moléculaires.
Le mécanisme moléculaire de l’horloge est formé principalement d’une boucle de rétrocontrôle comprenant une composante positive (CLOCK-ARNTL/BMAL1 ) et une composante négative (hétérodimère PER/CRY).
Ces oscillateurs moléculaires imposent une rythmicité circadienne à de nombreuses fonctions physiologiques et comportementales de l’organisme, comme par exemple, le métabolisme lipidique et glucidique, la sécrétion hormonale (corticostérone, leptine, insuline) et le cycle veille-sommeil.
Le nouveau-né humain ne possède pas l’organisation temporelle présente chez l’enfant et l’adulte. La rythmicité des propriétés électriques cutanées apparaît dès la première semaine de la vie et celle des mitoses épidermiques, dès la deuxième semaine. Ainsi donc, la peau assure précocement ses fonctions protectrices pendant la ph ase diurne du nycthémère, avant même que ne s’établissent les rythmes du sommeil nocturne et de la veille diurne.
Les corrélations observées en présence de l’extrait selon l’invention montrent que la synthèse du cholestérol et des acides gras comme leur rétrocontrôle en réponse au traitement au niveau des fibroblastes est sous la régulation de la boucle circadienne et dépendante de l’expression du gène Reverba/NRIDI et de l’induction du gène INSIG1.
Le gène Reverba/NRIDI contrôle également l’inflammation au niveau de la cellule musculaire via la modulation des gènes cible de NEkB comme PTGS2.
Ainsi, la régulation différentielle observée entre 9 et 24h de traitement est le reflet d’une régulation du rythme circadien.
Conclusion
Les gènes modulés par l’extrait de tulipe selon l’invention sont fortement corrélés à des mécanismes régulant plusieurs voies de signalisation, qui mettent en jeu des facteurs impliqués au niveau des différentes étapes de la réparation cutanée, dont les processus proinflammatoires, la synthèse des prostaglandines, le remodelage de la matrice extracellulaire et la prolifération.
Ces observations montrent que la composition selon l’invention n’induit pas de stress génotoxique mais stimule un effet hormétique. Ces événements contribuent ainsi à la synthèse d’acide hyaluronique via l’induction d’HAS2, et au remodelage de la matrice extracellulaire via l’augmentation de certaines métalloprotéinases (MMPI, MMP9) conduisant à la migration et à la prolifération cellulaire.
Ces processus biologiques médiés par la composition selon l’invention au niveau des fibroblastes et aux différents temps de cinétique concourent à des effets réparateurs et régénérateurs permettant de maintenir l’homéostasie cutanée. De plus, ces étapes conduisant à la régénération sont sous contrôle du rythme circadien activé par l’extrait testé.
Exemple 6: Etude de l’effet de l’extrait selon l’invention sur un modèle de peau de paupière reconstruite
L’effet de l’extrait selon l’invention a été testé sur un modèle de peau de paupière reconstruite in vitro pour son action sur ces cellules. En effet, le contour de l’œil est la zone la plus fine (0.5 à 1 mm d’épaisseur) et la plus fragile de tout le visage.
a) Test de toxicité de l’extrait selon l’invention sur les cellules
Les cellules utilisées pour les tests de cytotoxicité, à savoir des fibroblastes humains primaires au passage 8 et des kératinocytes humains au passage 3, sont les mêmes que celles utilisées pour l’établissement de la peau reconstruite.
Un test de cytotoxicité au MTT sur kératinocytes et fibroblastes primaires cultivés en monocouche a été réalisé afin d’évaluer un effet cytotoxique potentiel de l’ingrédient actif appliqué pendant 96h sur les cellules d’intérêt.
Pour ce faire, les cellules sont utilisées à une densité cellulaire de 10 000 cellules/puits et 6 concentrations différentes d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention sont testées, de 0.05% à 1%. Le Sodium Dodécyl Sulfate (SDS) a été utilisé comme témoin positif de cytotoxicité à 0,05 %, dissous dans le milieu de culture. Un témoin non traité ne contenant aucun actif a été utilisé pour déterminer les 100 % de viabilité.
Brièvement, les kératinocytes et les fibroblastes humains normaux ont été trypsinés et ensemencés dans des plaques 96 puits à la densité de 10000 cellules/puits et cultivés jusqu’à confluence dans du milieu de culture (Pour kératinocytes : Milieu Keratinocyte-SFM (Thermo Fisher Scientific), Pour fibroblastes : milieu DMEM + sérum de veau 10% + antibiotiques (Sigma Merck, France). Le produit à tester a ensuite été appliqué et laissé en contact pendant 96 heures avant d’effectuer un test au MTT par mise en contact pendant 3 heures avec du MTT à 0,5 mg/ml (Sigma Merck, France) puis dilution des cristaux de formazan avec 100 pl d’isopropanol acide sous agitation pendant environ 30 minutes. Pour chaque condition et chaque type cellulaire, au moins 8 puits ont été traités.
Après lecture de l’absorbance des plaques, le pourcentage de viabilité de chaque condition a été calculé par rapport au témoin non traité qui représente les 100 % de viabilité.
Les résultats de l’étude de viabilité des fibroblastes traités avec l’extrait selon l’invention montrent que cet extrait est cytotoxique pour les fibroblastes à des concentrations supérieures ou égales à 0.01% avec un taux de viabilité autour de 80% (Ligure 3a).
Les résultats de l’étude de viabilité des kératinocytes (Ligure 3b) montrent qu’entre 0.5% et 1%, l’extrait selon l’invention a un effet cytotoxique sur les kératinocytes. En revanche entre 0.005% et 0.1%, aucun effet cytotoxique n’est observé sur les kératinocytes.
La dose utilisée pour les expériences sur peau de paupière reconstruite sera donc de 0.01% d’extrait selon l’invention.
b) Coloration histologique sur peau de paupière reconstruite
Le modèle de peau reconstruite en 3D utilise des cellules primaires humaines (fibroblastes et kératinocytes) de paupières.
Ces cellules sont extraites de 5 biopsies de paupière inférieures et supérieures de patientes âgées de 49 à 63 ans, de phototype I, II ou III. Les modèles de peau reconstruite du contour de l’œil, contenant des fibroblastes et des kératinocytes sont obtenus selon le protocole décrit dans les publications suivantes : Michel, M., L’Heureux, N., Pouliot, R. et al. In Vitro Cell.Dev.Biol.-Animal (1999) 35: 318, Pouliot, R., Larouche, D., Auger, F. A., Juhasz, J., Xu, W., Li, H., & Germain, L. (2002). Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymie mice 1, 2. Transplantation, 73(11), 1751-1757.
À partir de J3, les cellules ont été cultivées en présence de l’extrait selon l’exemple 3 de l’invention, dissous dans le milieu de culture normal des cellules. L’étude a été réalisée en comparaison avec des peaux reconstruites cultivées dans du milieu normal sans extrait, et dans du milieu de culture normal avec le témoin positif TGFbetal.
Des échantillons ont été prélevés à J35 et J42, correspondant à respectivement à 2 et 3 semaines d’épidermisation. 3 échantillons de chaque temps et chaque condition ont été fixés en solution de formol tamponné 4% (Alphapath, France) puis inclus en paraffine ou congelés et fixés en OCT (VWR, France).
Les colorations histologiques (HPS et Trichrome de Masson) ont été observées avec le système microscope optique Axio Observer DI / caméra haute résolution Axiocam (Zeiss, Le Pecq, France). Les images ont été acquises à l’aide du logiciel ZEN pro 2012 et sauvegardées en format « tif » (haute résolution).
Les résultats des peaux reconstruites contrôles non traitées montrent que les fibroblastes ont synthétisé leur propre matrice extracellulaire (MEC) et forment un derme équivalent fin. L’épiderme est pluristratifié et différencié de la couche basale à la couche cornée.
Les peaux reconstruites traitées avec le témoin TGFbetal montrent un épiderme et un derme spectaculairement plus épais (+400%, lOx plus que le contrôle positif TGFbl pour la condition b correspondant à 0.01%) respectivement aux temps de culture J35 et J42 par rapport aux peaux reconstruites contrôles (Figures 4a et 4b).
L’analyse histologique des peaux reconstruites de 42 jours traitées ou non avec l’extrait selon l’exemple 3 de l’invention après une coloration au Trichrome de Masson confirme les résultats des colorations HPS. Au temps de culture J42, les peaux reconstruites traitées avec l’extrait selon l’invention à 0.01% montrent un derme beaucoup plus épais avec une augmentation du nombre de fibroblastes et de la synthèse de la matrice extra-cellulaire par rapport aux peaux reconstruites contrôles et traitées avec TGFbeta.
L’extrait selon l’invention procure donc à la peau un effet de régénération, repulpant, redensifiant et gonflant.
cjanalyse immunohistologique des prélèvements
Le marquage s’effectue sur coupes paraffine avec la « hyaluronic acid binding protein » biotinylée (Millipore-France)
Pour le marquage Fibrilline/élastine, ce marquage s’effectue en immunofluorescence sur coupes cryocongelées avec un anticorps monoclonal murin anti-Fibrillin-1 (Clone 11C1.3) et un anticorps polyclonal de lapin (Novotec - France).
Pour la Vimentine, le marquage s’effectue en immunofluorescence sur coupes paraffine avec anticorps monoclonal murin Anti-Vimentin (Clone RV202 - Novotec)
La figure 5 montre l’effet de l’extrait selon l’invention sur la peau au niveau de la quantité d’acide hyaluronique présent dans le derme (Figure 5, a, b, c, d et Figure 6).
On remarque que la quantité d’acide hyaluronique est très fortement augmentée dans les peaux traitées avec l’extrait selon l’invention, en particulier avec une quantité de 0.01% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention, avec un effet 4 fois plus important que le contrôle positif.
La figure 7 montre l’effet de l’extrait selon l’invention sur la peau au niveau de la quantité de fibrilline (figure 7a à 7d) et des surfaces respectives de fibrilline-1 (Figure 8a) et élastine (Figure 8b) dans le derme.
On remarque que les surfaces par unité de longueur de fibrilline et d’élastine sont fortement augmentées dans les peaux traitées avec l’extrait selon l’invention, en particulier avec une quantité de 0.01% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention, avec respectivement des améliorations de 19% et de 12% par rapport au témoin positif TGFbl.
La figure 9 montre l’effet de l’extrait selon l’invention sur la peau au niveau de la quantité de vimentine présente dans l’épiderme (Figure 9a, b, c, d et Figure 10).
On remarque que la quantité de vimentine est très fortement augmentée dans les peaux traitées avec l’extrait selon l’invention, en particulier avec une quantité de 0.01% d’extrait selon l’exemple 3 de l’invention, avec une amélioration de 40% par rapport au témoin positif TGFbl.
Le modèle de peau reconstruite contour de l’œil contenant des fibroblastes et des kératinocytes de paupières âgées met en évidence un effet marqué de l’extrait selon l’invention à 0,01 et 0,005% sur l’épaisseur de l’épiderme, ce qui montre un effet régénérant de l’extrait.
De plus, on note une augmentation nette de l’épaisseur du derme à 0,01% d’extrait, reflet d’une régénération à effet repulpant. De plus, les augmentations de l’acide hyaluronique et de la fibrillineélastine - vimentine sont le reflet d’un effet hydratant et tenseur de l’extrait selon l’invention sur la peau.
Exemple 7 : étude de l'intégrité de la barrière
L’objectif de cette étude est d’évaluer l’efficacité de l’extrait de tulipe selon l’invention sur la fonction barrière dans un modèle d’épiderme humain reconstruit en utilisant le peroxyde d’hydrogène pour induire un stress.
Les évaluations sont effectuées en triplicates sur un modèle d'épiderme humain reconstruit.
a) culture
L’épiderme humain reconstruit normal est produit jusqu’au jour 10 dans le milieu d’intérêt. Différents épidermes humains reconstruits stressés ont été produits. Le contrôle positif 1 a été effectué de la façon suivante : au jour 9 de l’exposition à l’air, une solution de peroxyde d’hydrogène à 1 mM est ajoutée dans le milieu de culture pendant deux heures. Le milieu est alors changé et l’épiderme et le médium sont collectés au jour 10. Un épiderme humain reconstruit a été traité dans les mêmes conditions avec une solution de peroxyde d’hydrogène à 2 mM (contrôle positif 2). Pour l’épiderme humain reconstruit traité par l’extrait actif puis stressé, les conditions sont les suivantes : au jour 8 de l’exposition à l’air, un extrait de tulipe selon l’exemple 3 de l’invention est ajouté dans le milieu à la concentration de 0,01% finale pendant 24 heures. Au jour 9, le milieu est changé et une solution de peroxyde d’hydrogène à 1 mM est ajoutée dans le milieu pendant 2 heures. Le milieu est alors changé et l’épiderme et le milieu sont collectés au jour 10.
L’épiderme humain reconstruit stressé avec une solution de peroxyde d’hydrogène à 2 mM a été préparé selon le même protocole.
L’épiderme humain reconstruit est produit en triplicates à partir de kératinocytes selon le protocole décrit dans Erankart., A. et al . Epidermal morphogenesis during progressive in vitro 3D reconstruction at the air-liquid interface, Experimental Dermatology, 2012, 21, 871-875. Les céramides standard sont fournis par Matreya (Matreya LLC - Pennsylvania, United States). Les solvants et les réactifs utilisés proviennent de Sigma Aldrich Erance. Les cartouches d’extraction de phases solides (gel de silice et gel de silice amino propyl) proviennent de Phenomenec.
b) Approche histologique et biologique
L’épiderme humain reconstruit est, après traitement, fixé dans la paraffine et coloré à l’éosine hémalin. Sa morphologie est alors estimée en termes d’épaisseur d’épiderme, de nombre de couches de kératinocytes et de nombre de cellules.
L’évaluation de la perméabilité de l’extérieur vers l’intérieur de la barrière s’effectue par le test Jaune de Lucifer, la perte insensible en eau, le pH et l’hydratation.
L’analyse biochimique normalisée en termes de quantité de protéines totales concerne la mesure des céramides et en particulier des sphingosines, des hydrosphingosines, et des cytosphingosines avec une longueur de chaîne de 16 et 18 atomes de carbone.
Au niveau de la couche basale de cellules, un impact du stress résultant de peroxyde d’hydrogène est observé et est plus net à une concentration de 2 mM de peroxyde d’hydrogène (figures lia et 11b).
Au niveau de la coloration d’éosine hémalin, les épidermes humains reconstruits sont vraiment complètement différenciés et comportent quatre couches, la couche basale, la couche épineuse, la couche granulaire et la couche cornée. Des granules de kératohyalin sont présents dans des kératinocytes différenciés de la couche granulaire.
Quand on considère le contrôle positif contenant du peroxyde d’hydrogène à 2 mM, la morphologie de ces épidermes humains reconstruits est différente de la morphologie d’un épiderme humain reconstruit normal. En effet, ces épidermes sont complètement différenciés mais les espaces intercellulaires ont augmenté au niveau des couches basales et épineuses, ce qui conduit à une spongiosité.
Quand on considère l’échantillon traité avec 0,01% d’extrait selon l’invention, puis une solution de peroxyde d’hydrogène à 1 ou 2mM, les différentes illustrations sur chaque épiderme humain reconstruit sont similaires et semblent réduire l’impact du peroxyde d’hydrogène au niveau de la couche basale (Figures 12a, b et c et Figures 13a, b et c).
La quantité de cellules marquées dues à la présence du peroxyde d’hydrogène est déterminée et représentée dans la Figure 14. Le nombre de cellules tuées est inférieur avec l’application de l’extrait selon l’invention, ce qui signifie que l’effet du peroxyde d’hydrogène est contrecarré par l’application de l‘extrait selon l’invention pour les deux doses testées.
Le stress au peroxyde d’hydrogène réduit l’épaisseur de l’épiderme humain reconstruit de 20% comparé à une condition normale. L’épaisseur de l’épiderme humain reconstruit et des couches nucléées a donc été déterminée dans ces conditions de stress, et avec ou sans extrait selon l’invention (Figure 15). Selon ces résultats, l’extrait selon l’invention :
- Permet une légère amélioration de l’épaisseur de l’épiderme après l’application d’un stress de ImM de peroxyde d’hydrogène qui n’a pas d’effet sur l’épaisseur de l’épiderme
- Permet de rétablir l’épaisseur de l’épiderme et des couches nucléées après l’application d’un stress de 2 mM de peroxyde d’hydrogène qui entraîne une baisse significative de l’épaisseur de l’épiderme et des couches nucléées.
Ce résultat démontre la capacité de l’extrait à rétablir le développement de l’épiderme reconstruit, notamment en maintenant en vie les couches nucléées, lors d’une agression au l’impact du peroxyde d’hydrogène impactant significativement la différenciation tissulaire.
La perméabilité de l’épiderme est évaluée au moyen du test du Jaune de Lucifer dans le milieu. Les résultats sont présentés à la figure 16. Le stress au peroxyde d’hydrogène induit une augmentation de la perméabilité de l’épiderme humain reconstruit de 31% et de 37% après application respective de ImM et 2mM comparé à une condition normale. On note que l’extrait selon l’invention limite l’impact du peroxyde d’hydrogène sur la perméabilité de l’épiderme reconstruit en rapportant l’augmentation de la perméabilité à des valeurs autour de 20%. Ce résultat démontre une amélioration de la fonction barrière avec une meilleure capacité des épidermes reconstruits à résister à la pénétration du colorant après traitement de l’extrait selon l’invention.
c) Evaluation de la perte insensible en eau
La perte insensible en eau est un indicateur important de la qualité de la fonction barrière de la peau.
Brièvement, des épidermes humains reconstruits ont été placés 30 mn avant analyse dans une pièce dans laquelle la température et l’hygrométrie sont de 20 à 25°C et 50 à 60% d’humidité relative.
Les chambres de mesure cylindriques sont scellées sur la peau et comportent un anneau entre l’épiderme et la chambre pour limiter les échanges d’air ambiant. La valeur du taux d’évaporation en g/h est automatiquement calculée à partir de l’augmentation de l’hygrométrie. La perte insensible en eau de chaque tissu est déterminée et schématisée sur la figure 17.
Il faut une concentration de 2 mM de peroxyde d’hydrogène pour augmenter significativement la perte insensible en eau de 13% comparé à une condition normale. Les résultats montrent que l’extrait selon l’exemple 3 de l’invention limite l’impact du peroxyde d’hydrogène sur la perte insensible en eau en la rapportant à un niveau statistiquement équivalent à la condition normale.
Le pH de la barrière a également été évalué car il influe sur l’efficacité de la fonction barrière, sur l’hydratation, et sur l’adhésion de la microflore sur la peau. Les épidermes humains reconstruits ont été placés 10 mn avant la détermination de l’analyse dans des chambres cellulaires dans lesquelles la température et l’hygrométrie sont de 20 à 25°C et 50 à 60% d’humidité relative.
L’électrode est appliquée sur la surface de la peau en utilisant un anneau entre l’épiderme et la zone de mesure dans lequel on introduit 5 mL d’eau purifiée pour faciliter l’échange. Le pH de chaque tissu est déterminé et les résultats sont illustrés dans la figure
18. Selon ces résultats, la valeur de pH est significativement réduite en présence d’un stress par au peroxyde d’hydrogène, à ImM ou 2mM, mais est rétablie à une valeur normale après traitement avec l’extrait selon l’invention.
d) Evaluation de la perméabilité de la barrière au niveau de l’hydratation
La cornéométrie est un indicateur de l’état de la peau. Les épidermes humains reconstruits sont placés 15 mn avant la détermination de l’analyse au laboratoire dans des conditions de température et d’hygrométrie de 20 à 25°C et 50 à 60% d’humidité relative.
La chambre est alors appliquée sur la peau en utilisant un anneau entre l’épiderme et la zone de mesure. La cornéométrie de chaque tissu est déterminée et les résultats sont illustrés sur la figure
19.
L’utilisation de l’extrait selon l’invention améliore significativement l’hydratation d’une peau malgré l’application d’un stress préalable par l’action d’une solution de ImM de peroxyde d’hydrogène.
A un stress induit suite à l’action d’une solution de peroxyde d’hydrogène à 2mM, on note une dégradation du tissu au niveau basal, conduisant à une spongiose. La présence d’extrait selon l’invention prévient la spongiose et normalise l’hydratation de la peau.
e) Analyse biochimique
Le stratum corneum contient des quantités importantes de lipides dont des céramides, du cholestérol et des acides gras libres permettant une organisation en structure membranaire lamellaire responsable de l’homéostasie de la barrière épidermique.
Les céramides de la classe des lipides polaires sont analysés par un système de chromatographie liquide (Dionex ultimate 3000) combiné avec un détecteur MS (MSQ) avec la sphingosine, la dihydrosphingosine ou la cytosphingosine ayant des longueurs de chaîne de 16 à 18 atomes de carbone. Les céramides ont en effet d’importants rôles physicochimiques dans la fonction barrière et dans les propriétés de rétention de l’eau de la peau dans les espaces intercellulaires du stratum corneum.
Les principaux céramides identifiés sont liés à des chaînes de 16 à 24 atomes de carbone pour les acides gras et des chaînes de 18 atomes pour la partie non grasse.
L’évaluation des céramides a également été effectuée sur les épidermes humains reconstruits avec et sans stress en présence ou non de l’extrait selon l’invention. Les résultats présentés dans la figure 20 montrent que le peroxyde d’hydrogène seul à des concentrations respectives de 1 mM et 2 mM limite significativement la quantité de céramides de 17% et 19% comparé à une condition normale. L’extrait testé limite l’impact du peroxyde d’hydrogène sur ces mêmes céramides puisqu’on observe une diminution de seulement 4% par rapport à une condition normale. Ainsi, l’extrait selon l’invention inhibe l’effet du stress au peroxyde d’hydrogène sur la synthèse de céramides.
Toutes les analyses sont effectuées en utilisant le test statistique de Bonferonni pour comparer chaque condition.
La table ci-dessous présente chaque correspondance entre la valeur de p et sa signification.
Valeur de p Signification Notation
< 0.001 Extrêmement significatif * * *
De 0.001 à 0.01 Très significatif * *
De 0.01 à 0.05 Significatif *
>0.05 Non significatif ns
f) Conclusion
L’approche histologique montre que les épidermes humains reconstruits dans des conditions normales sont complètement différenciés et possèdent quatre couches, la couche basale, la couche épineuse, la couche granulaire et la couche cornée.
L’impact du peroxyde d’hydrogène au niveau de la couche basale est réduit sur les différents épidermes humains reconstruits traités par l’extrait selon l’invention. De plus, l’extrait selon l’invention limite l’impact du peroxyde d’hydrogène sur l’épaisseur de l’épiderme humain reconstruit.
En ce qui concerne l’évaluation de la perméabilité de la barrière, l’extrait selon l’invention limite la propagation de fluorescence en Jaune de Lucifer dans l’épaisseur des épidermes humains reconstruits suite à une altération de la fonction barrière par H2O2. Cette expérience montre l’amélioration de la capacité d’imperméabilité du tissu en présence de l’extrait selon l’invention, signe d’une barrière efficace.
Pour la perte insensible en eau, l’extrait selon l’invention limite l’impact du peroxyde d’hydrogène et rétablit à la normale un pH préalablement abaissé sous l’effet du stress induit par le peroxyde d’hydrogène.
La cornéométrie est significativement modifiée par le stress au peroxyde d’hydrogène alors que l’extrait selon l’invention inhibe les effets de ce stress
Au niveau des analyses biochimiques, l’extrait selon l’invention rétablit la teneur en céramides et ainsi limite l’impact négatif préalable du peroxyde d’hydrogène sur les céramides. Ainsi, suite à l’agression de la peau par le peroxyde d’hydrogène, l’extrait selon l’invention exerce une fonction réparatrice sur la peau agressée.
Exemple 8: Effet de l'extrait de tulipe selon l’exemple 3 de l'invention sur l'expression de protéines de fibroblastes humains.
Des fibroblastes issus d’un prélèvement du derme facial d’une femme caucasienne de 49 ans ont été mis en culture dans des boîtes de Pétri de 100 mm de diamètre à 10000 cellules/cm2. Après 7 jours de culture, les cellules ont été traitées avec l’échantillon de l'exemple 3 à 0,001%; 0,005% et 0,01% (p/v) dans le milieu de culture (Cell Applications, réf. 116-500). Les cellules non traitées, incubées dans le milieu de culture sans échantillon, ont été utilisées comme contrôle négatif. Après 24h d’incubation, les fibroblastes ont été lavés avec du PBS et détachés par raclage. Les culots secs ont été conservés à -80°C pour l’essai de profilage de protéines.
a) Extraction des protéines
Les cellules sont lavées avec du PBS IX froid, puis on ajoute des billes de lyse et du tampon d’extraction sur les cellules. Celles-ci sont agitées vigoureusement pendant 30 secondes, puis incubées sur glace pendant 10 minutes.
Les cellules sont ensuite agitées à nouveau pendant 30 secondes à 10 minutes d’intervalle, le tout pendant 60 minutes, tout en incubant le mélange sur glace entre les phases de mélange. On centrifuge le mélange à 10000 x g pendant 20 minutes à 4°C, puis on transfère le surnageant dans un tube propre.
On utilise des colonnes Pro-Spin (Kit KAS02 (Full Moon Biosystems, USA) et protocole associé (Antibody Array user’s guide) pour changer le tampon d’extraction en tampon de marquage et on effectue la mesure de la concentration en protéine par absorbance UV (1 DO280nm=l mg/mL (Kit KAS02).
b) Marquage des protéines
Pour effectuer le marquage des protéines, on ajoute 100 pU de diméthylformamide (DMF, Sigma France) à 1 mg de biotine (Sigma France) pour obtenir une concentration finale de 10 pg/pL.
On aliquote 10-25μ1 du lysat de protéines (40-100 pg à une concentration de 2-10 pg/pl) et on ajoute du tampon de marquage (labeling buffer du Kit KAS02) pour atteindre le volume de 75 pL. On ajoute ensuite 3 pL du mélange biotine/DMF au tampon de marquage contenant l’échantillon.
On mélange et on incube à température ambiante pendant deux heures sous agitation, on ajoute 35 pL de réactif Stop (Kit KAS02) puis on incube pendant 30 minutes à température ambiante sous agitation.
c) Couplage via le Kit KAS02
Pour l'étape de blocage, on recouvre la lame de la puce à anticorps (Signalling explorer Array SET100, Full Moon Biosystems USA) de tampon de blocage (Kit KAS02) puis on agite 40 minutes à température ambiante.
On rince ensuite la lame avec de l’eau Milli-Q, puis on incube la lame dans la chambre de couplage avec 65 pg de protéines marquées dans 6 mL de solution de couplage sur un agitateur orbital pendant 2 heures à température ambiante.
On retire ensuite la lame de la chambre de couplage et on la lave 3 fois avec du tampon de lavage, puis on rince abondamment avec de l’eau Milli-Q.
d) Détection
Pour la détection, on ajoute 30 pl de Cy3-Streptavidine (1 mg/ml, Réf : PA43001 GE Healthcare USA) dans 60-ml de tampon de détection. On recouvre la lame avec 30 ml de cette solution de Cy3Streptavidine.
On incube sur un agitateur orbital pendant 20 minutes à température ambiante dans le noir, puis on lave la lame 3 fois avec du tampon de lavage. On rince abondamment avec de l’eau Milli-Q et on sèche la lame par centrifugation.
La lame est ensuite lue avec un scanner compatible (InnoScan710, LaboMIX instrumentation, France).
e) Résultats
Pour chaque spot de la puce, la médiane de l’intensité du signal est extraite de l’image. Pour chaque anticorps, en utilisant cette intensité médiane du signal, la moyenne de l’intensité des signaux des réplicats est calculée.
L’analyse visuelle des images permet d’exclure les signaux non conformes (bruit de fond élevé ou présence de tache) du calcul de la moyenne.
Pour la normalisation, la médiane des signaux de tous les anticorps est déterminée pour chaque lame. En utilisant les données normalisées, c’est-à-dire la moyenne de l’intensité du signal des réplicats / médiane des signaux totaux, le changement d’expression entre les échantillons contrôles et traités est calculé :
Une variation de l’expression des protéines est considérée comme significative quand la valeur est inférieure à 0,5 ou supérieure à 2. Une valeur de 0,5 indique que la quantité de protéine est diminuée de 50% et une valeur de 2 signifie que la quantité de protéines a doublé.
Les protéines modulées sont répertoriées dans les tableaux cidessous et peuvent être regroupées en différents groupes, témoignant de l’activité de l’ingrédient sur différentes fonctions :
i. Amélioration directe de la qualité de la matrice extracellulaire (protéine de structure de la matrice) :
protéine 0,001% vs cellules non traitées 0,005% vs cellules non traitées 0,01% vs cellules non traitées
CD44 1,101048817 1,057922184 2,3328245
Fibronectine 0,85879101 1,805511339 2,048204826
FSH 0,993038959 2,232469085 3,444631394
On note que les expressions de CD44, la fibronectine et la FSH sont significativement augmentées dans des cellules dont le milieu contient une concentration de 0,01% d’extrait selon l’invention par rapport à des cellules non traitées.
CD44 est le récepteur de l’acide hyaluronique. Il est impliqué dans les interactions cellules-cellules et cellule-matrice de par son affinité pour l’acide hyaluronique. Son adhésion avec l'acide hyaluronique joue un rôle important dans la migration cellulaire.
La fibronectine se lie à la surface des cellules et à d’autres composants dont le collagène, la fibrine, l’héparine, l’ADN et l’actine. Les fibronectines sont impliquées dans l’adhésion cellulaire, les mobilités cellulaires, la réparation des blessures, l’opsonisation et le maintien de la forme de la cellule.
La FSH est l’hormone de stimulation du follicule.
Ainsi ces trois marqueurs indiquent que l’extrait selon l’invention améliore directement la qualité de la matrice cellulaire (protéines de structure de la matrice).
ii. Réorganisation/restructuration de la matrice extra cellulaire :
Protéine 0,001% vs cellules non traitées 0,005% vs cellules non traitées 0,01% vs cellules non traitées
CD37 0,626346824 1,755151267 2,140791189
CSF-1 (MCSF) 1,129866091 2,297721592 3,373092218
ERK2 1,109950617 1,197900342 3,723738364
MPS1 1,096056938 2,16899122 1,763890603
Le marqueur CD37 est le médiateur d’évènements de transduction du signal qui jouent un rôle dans la régulation du développement, l’activation, la croissance et la mobilité de la cellule.
CSF-1 (ou MCSF) est une cytokine qui joue un rôle essentiel dans la régulation de la survie, de la prolifération et la différenciation des cellules des précurseurs hématopoïétiques. Le MCSL favorise en particulier le relargage de chimiokines proinflammatoires, favorise la réorganisation du cytosquelette d'actine, et régule l’adhésion et la migration cellulaire.
ERK2 est une kinase à sérine/thréonine qui joue un rôle critique dans la régulation de la croissance cellulaire et de la différenciation.
Ces différents marqueurs sont fortement activés dans les cellules traitées avec l’extrait selon l’invention, ce qui montre un effet de cet extrait sur la réorganisation et la restructuration de la matrice cellulaire.
iii. Amélioration de la qualité de la synthèse protéique :
Protéine 0,001% vs cellules non traitées 0,005% vs cellules non traitées 0,01% vs cellules non traitées
Calréticuline 0,877162205 1,225109544 2,519418676
ERN1 (IRE1) 1,055464377 2,426000549 1,509856511
La calréticuline est une protéine chaperonne dépendante du calcium qui favorise le repliement et l'assemblage oligomérique dans le réticulum endoplasmique de la cellule.
L’une des fonctions fondamentales du réticulum endoplasmique est la synthèse et le repliement des protéines qui y sont synthétisées. L’exécution de cette fonction est le reflet d’une bonne homéostasie. Le stress du réticulum endoplasmique est déclenché quand cette homéostasie est perturbée. Ce stress se matérialise par une accumulation de protéines mal/non repliées dans ce compartiment, qui est détectée, chez les mammifères, par le domaine luminal de trois protéines transmembranaires du réticulum endoplasmique dont l’Inositol-requiring enzyme 1 (IRE1).
On note que la synthèse de ces deux protéines est augmentée dès la concentration de 0,005% d’extrait dans les cellules.
iv. Protéines impliquées dans les mécanismes antioxydants endogènes / réponses aux stress:
protéine 0,001% vs cellules non traitées 0,005% vs cellules non traitées 0,01% vs cellules non traitées
CIB1 1,002191719 1,14118061 2,802099967
C-Kit 1,416606426 2,023380104 1,742513903
Cytochrome P450 1A1/2 1,200201739 2,231982086 1,245434139
MEKKK 1 1,06332576 2,065564074 1,085557987
CIB1 et C-kit sont deux protéines impliquées dans la survie cellulaire et la prolifération.
Le cytochrome P450 1A1/2 est une enzyme oxydase terminale à fonction détoxifiante et MEKKKI est une kinase sérine/thréonine jouant un rôle dans la réponse à un stress environnemental.
Exemple 9 : crème de jour
Phase INCI UE % Matière
A AQUA QSP 100
A TETRASODIUM EDTA 0,10
A CONSERVATEUR 0,30
A GLYCERIN 2,00
B NYLON-12 0,50
C AMMONIUM ACRYLOYLDIMETHYLTAURATE/VP COPOLYMER 0,20
Dl CETYL ALCOHOL & GLYCERYL STEARATE & PEG-75 STEARATE & CETETH-20 & STEARETH-20 3,00
Dl CETEARYL ALCOHOL 0,50
Dl C10-18 TRIGLYCERIDES 1,00
Dl PENTAERYTHRITYL TETRAETHYLHEXANOATE 4,00
Dl COCO-CAPRYLATE & TOCOPHEROL & HELIANTHUS ANNUUS SEED OIL 3,00
D2 BUTYROSPERMUM PARKII BUTTER 3,50
D2 COCOS NUCIEERA OIL & GARDENIA TAITENSIS ELOWER & TOCOPHEROL 4,00
D2 TOCOPHEROL 0,01
E CITRIC ACID 0,03
E AQUA 1,00
E AQUA 20,00
E TULIPA GESNERIANA FLOWER EXTRACT (exemple 3) 1,00
100,00
Le mode opératoire de cette composition est le suivant : Dans un fondoir/bain marie, on introduit les ingrédients de la phase Dl, puis on les fait fondre à 70-75°C.
Pour la préparation de la phase E, dans une cuve annexe, on introduit l'eau et on incorpore l’acide citrique. On mélange ensuite jusqu’à homogénéisation.
Pour la préparation de la phase F, dans une cuve annexe, on introduit l’eau et on incorpore l’extrait de tulipe de l’exemple 3 en le saupoudrant en surface afin de le laisser s’hydrater. On mélange ensuite jusqu’à homogénéisation.
Dans la cuve de fabrication, on introduit l'eau de la phase A puis on chauffe à 70-75°C. On incorpore successivement les ingrédients de la phase A. On mélange ensuite sous agitation rapide jusqu’à homogénéisation, puis on incorpore la phase B et on mélange sous agitation moyenne jusqu'à homogénéisation. On incorpore ensuite la phase C et on mélange sous agitation rapide jusqu'à homogénéisation, tout en vérifiant l’absence d’amas de gel.
On incorpore la phase D2 dans la phase Dl et on mélange jusqu’à homogénéisation.
On incorpore ensuite au mélange précédemment obtenu, le mélange D1+D2. On mélange sous agitation rapide pendant 15 minutes minimum et jusqu'à homogénéisation.
Ensuite, on commence le refroidissement sous agitation lente. Il se produit un fort épaississement de l’émulsion pendant le refroidissement.
A une température du mélange de 30-35°C, on incorpore la ph ase E et on mélange sous agitation moyenne jusqu'à homogénéisation. On vérifie ensuite la valeur du pH qui doit se situer à 5,6.
On incorpore ensuite la phase F et on mélange sous agitation moyenne jusqu'à homogénéisation.
On vidange ensuite en fût muni d'un sac stérile.
Exemple 10 : Crème de nuit
Phase INCI UE % Matière
A AQUA QSP 100
A TETRASODIUM EDTA 0,02
A GLYCERIN 5,00
A CONSERVATEUR 0,50
B AMMONIUM ACRYLOYLDIMETHYLTAURATE/VP COPOLYMER 5,00
C HYDROXYETHYL ACRYLATE/SODIUM ACRYLOYLDIMETHYL TAURATE COPOLYMER & POLYSORBATE 60 & SORBITAN ISOSTEARATE & AQUA 1,00
D SODIUM STEAROYL GLUTAMATE 0,30
El CETEARYL ALCOHOL & CETEARYL GLUCOSIDE 5,00
El SQUALANE 5,00
El PENTAERYTHRITYL TETRAETHYLHEXANOATE 1,00
El CETEARYL ALCOHOL 0,50
E2 BUTYROSPERMUM PARKII BUTTER 6,00
E2 TOCOPHEROL 0,03
F DIMETHICONE & DIMETHICONOL 0,50
G PARFUM 0,30
G AQUA & PROPYLENE GLYCOL & CI 17200 0,05
H CITRIC ACID 0,15
H AQUA 1,00
I AQUA 2,00
I TULIPA GESNERIANA FLOWER EXTRACT (exemple 3) 0,10
100,00
Pour préparer cette crème, dans un fondoir/bain marie, on introduite les ingrédients de la phase El et on fait fondre à 70-75°C.
Pour la préparation de la phase H, dans une cuve annexe, on introduit l'eau et on chauffe à 30-35°C, puis on incorpore l’acide citrique et on remélange jusqu’à homogénéisation.
Pour la préparation de la phase I, dans une cuve annexe, on introduit l'eau et on chauffe à 30-35°C. Ensuite, on incorpore l’extrait de tulipe de l’exemple 3 en le saupoudrant en surface. On le laisse s’hydrater tout en mélangeant jusqu’à homogénéisation.
Dans la cuve de fabrication, on introduit l'eau de la phase A et on chauffe à 70-75°C. Puis on incorpore successivement les ingrédients de la phase A. On mélange sous agitation jusqu'à homogénéisation, puis on incorpore la phase B. On mélange sous agitation jusqu'à homogénéisation, puis on incorpore la phase C et on remélange sous agitation jusqu'à homogénéisation.
On vérifie l’absence d’amas de gel avant d’incorporer la phase D. On mélange sous agitation jusqu'à homogénéisation. On incorpore la phase E2 dans la phase El et on mélange jusqu’à homogénéisation.
On incorpore ensuite la phase E1+E2 au mélange sous agitation pendant 15 minutes minimum et jusqu'à homogénéisation, puis on commence le refroidissement sous agitation lente. A 60-65°C, on incorpore la phase F, tout en mélangeant sous agitation pendant 5 minutes et jusqu'à homogénéisation. On poursuit le refroidissement sous agitation lente. On note un fort épaississement de l’émulsion pendant le refroidissement. Il est alors nécessaire d’augmenter la vitesse de l’agitation si besoin.
A 30-35°C, on incorpore successivement les ingrédients de la ph ase G et on mélange sous agitation jusqu'à homogénéisation. On vérifie la valeur du pH qui doit être à 7,2, puis on incorpore la phase
H. On mélange sous agitation jusqu'à homogénéisation. A ce moment, la valeur du pH est de 5,2.
On incorpore alors la phase I tout en mélangeant sous agitation jusqu'à homogénéisation.
On vidange alors en fût muni d'un sac stérile.
Exemple 11 : Gel contour des yeux
Phase INCI UE % Matière
A AQUA QSP 100
A TETRASODIUM EDTA 0,05
A GLYCERIN 5,00
A CONSERVATEUR 0,20
B AMMONIUM ACRYLOYLDIMETHYLTAURATE/VP COPOLYMER 0,50
C HEXYLDECANOL HEXYLDECYL LAURATE 1,00
C PENTAERYTHRITYL TETRAETHYLHEXANOATE 2,00
C SQUALANE 5,00
D AQUA 1,00
D CITRIC ACID 0,05
E AQUA 2,00
E TULIPA GESNERIANA FLOWER EXTRACT (exemple 3) 0,50
Le mode de préparation de la composition ci-dessus est le suivant :
Dans une cuve, on introduit les ingrédients de la phase C et on mélanger sous agitation lente jusqu’à homogénéisation.
Dans une cuve annexe, on introduit l’eau et on chauffe à 3035°C, puis on incorpore l’extrait de tulipe selon l’invention sous agitation lente, jusqu'à homogénéisation.
Dans une autre cuve, on introduit l’eau et on chauffe à 3035°C, on incorpore l’acide citrique et on mélange jusqu’à homogénéisation.
Dans la cuve de fabrication, on introduit l’eau de la phase A et on chauffe à 70-75°C, puis on incorpore successivement les ingrédients de la phase A. On mélange sous agitation rapide jusqu'à homogénéisation avant d’incorporer la phase B. On remélange sous agitation rapide jusqu'à homogénéisation, puis on commence le refroidissement jusqu’à 50-60°C.
A cette température, on incorpore successivement les ingrédients de la phase B tout en mélangeant sous agitation rapide jusqu'à homogénéisation. On vérifie l’absence d’amas de gel dans la solution. A la température de 50-60°C, on incorpore la phase C. On mélange sous agitation rapide pendant 10 minutes minimum et jusqu'à homogénéisation et on poursuit le refroidissement sous agitation lente.
A 30-35°C, on incorpore la phase E, puis on incorpore successivement les ingrédients de la phase F. on mélange sous agitation moyenne jusqu'à homogénéisation.
On vérifie le pH qui doit être à 6,6 et on incorpore la phase D. On mélange sous agitation moyenne jusqu'à homogénéisation. La valeur du pH doit alors être de 5,0. On incorpore alors la phase E tout en mélangeant sous agitation moyenne jusqu'à homogénéisation.
On vidange alors en fût muni d'un sac stérile.

Claims (19)

  1. REVENDICATIONS
    1. Extrait issu de tulipe de l’espèce des Tulipa gesneriana caractérisé par le fait qu’il comprend, en poids, de 20 à 70% de sucres et de 15 à 30 % de composés phénoliques, dont au moins 8% de ces composés phénoliques sont des flavonoïdes, par rapport au poids total de l'extrait sec.
  2. 2. Extrait selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les sucres comprennent des monosaccharides et des polysaccharides.
  3. 3. Extrait selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que les flavonoïdes comprennent en poids de 50 à 90 % de quercétine et de 10 à 50% de kampférol.
  4. 4. Extrait selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que les flavonoïdes comprennent en poids de 65 à 85 % de quercétine et de 15 à 35% de kampférol.
  5. 5. Extrait selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée par le fait que la tulipe utilisée est une tulipe pourpre
  6. 6. Extrait selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé par le fait qu’il se présente sous forme de poudre.
  7. 7. Extrait selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, défini par les chromatogrammes de la figure 1.
  8. 8. Procédé de préparation d’un extrait issu de tulipe selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que l’on procède, à partir de tulipe de l’espèce des Tulipa gesneriana, à une ou plusieurs macérations, l’extrait liquide est clarifié, filtré, puis le précipité est ensuite séché pour obtenir l’extrait.
  9. 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel la macération s’effectue dans un mélange eau/éthanol.
  10. 10. Extrait selon l’une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée par le fait qu’il est susceptible d’être obtenu par le procédé tel que défini dans l’une quelconque des revendications 8 ou 9.
  11. 11. Composition cosmétique caractérisée par le fait qu'elle contient, dans un milieu cosmétiquement acceptable, au moins un extrait tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 7 et 10.
  12. 12. Composition cosmétique selon la revendication 11, caractérisée en ce que la composition est appropriée pour une utilisation topique.
  13. 13. Utilisation cosmétique de l'extrait tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 7 et 10 pour améliorer l’inconfort cutané chez un mammifère.
  14. 14. Utilisation cosmétique de l'extrait tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7 et 10 pour améliorer la fonction barrière de la peau chez un mammifère.
  15. 15. Utilisation cosmétique de l'extrait tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7 et 10 pour améliorer le remodelage dermique de la peau d’un mammifère.
  16. 16. Utilisation cosmétique de l'extrait tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7 et 10 pour l’amélioration de la réparation tissulaire chez un mammifère.
  17. 17. Utilisation cosmétique de l'extrait tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 7 et 10 pour améliorer l’hydratation de la peau chez un mammifère.
  18. 18. Utilisation cosmétique de l'extrait tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7 et 10 pour l’amélioration de l’homéostasie cutanée.
  19. 19. Composition contenant au moins un extrait de tulipe selon l’une quelconque des revendications 1 à 7 et 10 pour son utilisation dans le traitement de la peau d’un mammifère, destinée à améliorer la fonction barrière de la peau de ce mammifère.
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