FR3061208A1 - Adjuvants pour milieux de culture cellulaire, notamment pour fecondation in vitro, ou pour la culture de follicules, cellules germinales males ou embryons - Google Patents
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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-
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Abstract
La présente invention a pour objet des compositions pour la culture in vitro de cellules, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un facteur de croissance en association avec au moins un composé choisi parmi le groupe constitué par un sel de zinc, l'inositol sous l'une quelconque de ses formes stéréoisomériques et la carnitine ou un dérivé de la carnitine. L'invention a également pour objet des procédés de fécondation in vitro et des procédés de maturation de follicules, de cellules germinales mâles, ou d'embryons utilisant de tels adjuvants de milieux de culture, ainsi que des kits pour la mise en œuvre de ces procédés et comprenant un lyophilisat susmentionné et une solution aqueuse, contenant les autres constituants desdits milieux de culture.
Description
© Titulaire(s) : PATRICK CHOAY SAS Société actions simplifiée.
par
O Demande(s) d’extension :
© Mandataire(s) : GROSSET FOURNIER ET DEMACHY Société à responsabilité limitée.
FR 3 061 208 - A1 (54) ADJUVANTS POUR MILIEUX DE CULTURE CELLULAIRE, NOTAMMENT POUR FECONDATION IN VITRO, OU POUR LA CULTURE DE FOLLICULES, CELLULES GERMINALES MALES OU EMBRYONS.
(57) La présente invention a pour objet des compositions pour la culture in vitro de cellules, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un facteur de croissance en association avec au moins un composé choisi parmi le groupe constitué par un sel de zinc, l'inositol sous l'une quelconque de ses formes stéréoisomériques et la carnitine ou un dérivé de la carnitine.
L'invention a également pour objet des procédés de fécondation in vitro et des procédés de maturation de follicules, de cellules germinales mâles, ou d'embryons utilisant de tels adjuvants de milieux de culture, ainsi que des kits pour la mise en oeuvre de ces procédés et comprenant un lyophilisât susmentionné et une solution aqueuse, contenant les autres constituants desdits milieux de culture.
ADJUVANTS POUR MILIEUX DE CULTURE CELLULAIRE, NOTAMMENT
POUR FECONDATION IN VITRO, OU POUR LA CULTURE DE
FOLLICULES, CELLULES GERMINALES MALES OU EMBRYONS
La présente invention a pour objet des compositions utilisables en tant qu’adjuvants pour milieux de culture cellulaire, notamment pour follicules en cours de développement ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ainsi que pour la fécondation in vitro et le développement d'embryons, et plus particulièrement d'embryons de mammifères, notamment d'embryons humains, éventuellement congelés.
Après maturation du follicule de De Graaf, l'ovulation permet à l'ovocyte de passer dans la trompe de Fallope pour y être éventuellement fécondé. L'embryon qui en résulte y demeure 3 à 5 jours pour se développer et atteindre les stades morula, puis blastocyste.
Dans la trompe, les gamètes, l'embryon, la morula, puis le blastocyste sont environnés par le fluide tubaire. La composition de ce dernier est complexe : elle associe les composants fondamentaux du milieu intérieur de la mère à ceux du liquide folliculaire, et elle ne semble pas subir d'importants changements qualitatifs au cours des premiers jours de la phase post-ovulatoire. Parvenu au stade blastocyste, l'embryon passe dans l'utérus dont la muqueuse a alors atteint un état de développement favorable pour l'implantation et la nidation de l'œuf.
Le passage de l'embryon dans l'utérus ne s'effectue que lorsque l'un et l'autre sont parvenus au niveau de développement physiologique compatible avec l'implantation et la nidation : stade blastocyste pour l'embryon, endomètre proche de sa phase sécrétoire pour l'utérus.
Dans le cas de l'assistance médicale à la procréation, ces conditions physiologiques suggèrent un milieu de culture unique et constant, et non pas séquentiel comme il en existe actuellement, associant tous les éléments nécessaires au développement, de la fécondation in vitro, éventuellement consécutive à l'ICSI (intra cytoplasmic sperm injection, ou injection intracytoplasmique de spermatozoïdes), jusqu'au transfert de l'embryon.
La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs de compositions constantes utilisables aussi bien pour la culture de follicules ou de cellules de la lignée germinale mâle, que pour la fécondation de l'ovocyte et le développement de l'embryon jusqu'au stade blastocyste, et ce avec des rendements comparables, voire supérieurs, à ceux obtenus avec les compositions actuellement sur le marché.
La présente invention a pour objet des compositions pour la culture in vitro de cellules, caractérisées en ce qu'elles comprennent :
au moins un facteur de croissance, de préférence au moins deux facteurs de croissance, en association avec au moins un composé choisi parmi le groupe constitué par :
- un sel de zinc, de préférence un sel hydrosoluble tel que le chlorure de zinc ou le sulfate de zinc, notamment à une concentration de 0,1 à 3 pg/ml, de préférence à une concentration de 0,5 à 1,5 pg/ml, exprimée en zinc élément,
- l’inositol sous l’une quelconque de ses formes stéréo-isomériques, de préférence le myo-inositol, notamment sous forme de sel, par exemple sous forme de phosphate, de préférence l’inositol tri-phosphate, notamment à une concentration de 1,8 à 18 mg/ml, de préférence à une concentration de 5 à 10 mg/ml, exprimée en molécule d’inositol, et
- la carnitine sous l’une de ses formes stéréo-isomériques, de préférence la Lcamitine, un sel de carnitine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de carnitine de préférence l’acétyl-carnitine ou un sel d’un dérivé de carnitine, de préférence sous la forme de chlorhydrate, notamment à une concentration de 0,1 à 2 mg/ml, de préférence à une concentration de 0,5 à 1 mg/ml, exprimée en carnitine base, et, le cas échéant, avec un ou plusieurs composés choisis parmi les composés de la famille des corticoïdes impliqués dans la production énergétique chez les mammifères et au moins un coenzyme clé du métabolisme énergétique, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH.
Les compositions selon l’invention peuvent comporter de préférence un facteur de croissance, deux facteurs de croissance ou trois facteurs de croissance.
Les compositions de l’invention peuvent être assimilées à des adjuvants ou des compléments ou des boosters. Il s’agit de compositions qui, une fois associées à d’autres éléments, permettent d’obtenir des milieux de culture.
Dans les compositions de l’invention, les concentrations en sel de zinc correspondent à la quantité d’élément par volume.
De préférence, les concentrations en sel de zinc dans les compositions susmentionnées de l'invention sont comprises de 0,1 pg/ml à 3 pg/ml, de préférence de 0,5 pg/ml à 1,5 pg/ml exprimées en zinc élément.
Les concentrations en sel de zinc dans les compositions susmentionnées de l'invention sont notamment de 0,1 ; 0,2 ; 0,3 ; 0,4 ; 0,5 ; 0,6 ; 0,7 ; 0,8 ; 0,9 ; 1,0 ; 1,1 ; 1,2 ; 1,3 ; 1,4 ou 1,5 pg/ml.
Dans les compositions de l’invention, l’inositol peut notamment être présent sous forme de dérivés phosphatés d’inositol, tels que l’inositol mono-, di- ou tri-phosphate, ou sous forme de sels. Les concentrations en inositol correspondent à la quantité d’élément par volume.
De préférence, les concentrations en inositol dans les compositions susmentionnées de l'invention sont comprises de 1,8 mg/ml à 18 mg/ml, de préférence de 5 à 10 mg/ml.
Les concentrations en inositol dans les compositions susmentionnées de l'invention sont notamment de 1,8 ; 2 ; 3 ; 4 ; 5 ; 6 ; 7 ; 8 ; 9 ; 10 ; 11 ; 12 ; 13 ; 14 ; 15 ; 16 ; 17 ou 18 mg/ml.
Dans les compositions de l’invention, la carnitine est sous la forme d’un énantiomère L et les concentrations en carnitine correspondent à la quantité de base par volume.
De préférence, les concentrations en carnitine dans les compositions susmentionnées de l'invention sont comprises de 0,1 mg/ml à 2 mg/ml, de préférence de 0,5 mg/ml à 1 mg/ml.
Les concentrations en carnitine dans les compositions susmentionnées de l'invention sont notamment de 0,1 ; 0,2 ; 0,3 ; 0,4 ; 0,5 ; 0,6 ; 0,7 ; 0,8 ; 0,9 ; 1,0 ; 1,1 ; 1,2 ; 1,3 ; 1,4 ; 1,5 ; 1,6 ; 1,7 ; 1,8 ; 1,9 ou 2,0 mg/ml.
L'invention a plus particulièrement pour objet des compositions susmentionnées pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules, cellules mâles, ou embryons.
Avantageusement, les facteurs de croissance contenus dans les compositions de l'invention appartiennent à 5 familles de cytokines. Les hormones et les facteurs de croissance sont présents à des concentrations équilibrées, compatibles avec les conditions physiologiques. Les compositions de l'invention apportent aux cellules en croissance et en différenciation les molécules régulatrices dont elles ont impérativement besoin. Ainsi, ces compositions sont susceptibles de permettre la maturation des ovocytes humains immatures cultivés en présence de cellules folliculaires, ainsi que la maturation des cellules de la lignée germinale mâle. Elles peuvent aussi assurer le développement de l'embryon humain jusqu'au stade blastocyste. Or, ce stade a un plus fort pourcentage d'implantation dans l'utérus que lorsque le transfert de l'embryon a lieu à un stade moins avancé, notamment aux stades de deux à environ huit cellules.
L'invention a plus particulièrement pour objet les compositions susmentionnées comprenant au moins deux facteurs de croissance choisis parmi :
- les facteurs de croissance semblables à l'insuline, encore désignés IGF (insuline-Uke growth factor) tels que l'IGF-1 et/ou l'IGF-2,
- le facteur épidermique de croissance, encore désigné EGF (epidermal growth factor) et/ou ΗΒ-EGF (heparin-binding epidermalgrowth factor),
- le facteur de croissance de transformation alpha, encore désigné TGF alpha (transforming growth factor),
- le facteur de croissance de transformation bêta, encore désigné TGF bêta (transforming growth factor beta), sous formes des TGF-bêta 1, 2 et 3, de préférence le TGF-bêta-1,
- le facteur de croissance hépatique, encore désigné HGF (hépatocyte growth factor),
- le facteur de stimulation de colonies de granulocytes et de macrophages, encore désigné GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor),
- les facteurs de croissance et de différenciation, encore désignés GDF (growth différentiation factor) de préférence le GDF-9,
- le facteur inhibiteur de la leucémie, encore désignés LIF (leukemia inhibitory factor).
Avantageusement, les compositions de l'invention contiennent au moins trois facteurs de croissance choisis parmi ceux listés ci-dessus.
Des compositions particulièrement préférées contiennent au moins de l'IGF-1 et/ou de l'IGF-2.
De préférence encore, les compositions susmentionnées de l'invention comprennent tous les facteurs de croissance susmentionnés.
De préférence, les concentrations en facteurs de croissance et de différenciation dans les compositions susmentionnées de l'invention sont nanomolaires, et notamment comprises entre environ 0,25 pg/L et environ 100 pg/L, de préférence entre 0,25 pg/L et environ 60 pg/L ou entre environ 0,5 pg/L et environ 50 pg/L.
De préférence, les concentrations en facteurs de croissance et de différenciation dans les compositions susmentionnées de l'invention sont nanomolaires, et notamment comprises de 0,25 pg/L à 100 pg/L, de préférence de 0,25 pg/L à 60 pg/L ou de 0,5 pg/L à 50 pg/L.
De préférence, les concentrations en facteurs de croissance et de différenciation dans les compositions susmentionnées de l'invention sont de0,5;l;2;3;4;5;6;7; 8 ; 9 ; 10 ; 12,5 ; 20 ; 25 ; 30 ; 40 ; 50 ; 60 ; 70 ; 80 ; 90 ou 100 pg/L.
Avantageusement les concentrations des facteurs de croissance et de différenciation contenus dans les compositions de l'invention sont telles que :
- la concentration d'EGF est d'environ 10 pg/L à environ 100 pg/L, en particulier d'environ 40 pg/L à environ 60 pg/L, notamment d'environ 50 pg/L,
- la concentration de IGF-1 est d'environ 10 pg/L à environ 100 pg/L, en particulier d’environ 12,5 pg/L à environ 25 pg/L, notamment d'environ 15 pg/L,
- la concentration de IGF-2 est d'environ 10 pg/L à environ 100 pg/L, en particulier d’environ 12,5 pg/L à environ 25 pg/L, notamment d'environ 15 pg/L,
- la concentration de TGFoc est d'environ 10 pg/L à environ 50 pg/L, en particulier d'environ 20 pg/L à environ 30 pg/L, notamment d'environ 25 pg/L,
- la concentration d'HGF est d'environ 10 pg/L à environ 100 pg/L, en particulier d'environ 40 pg/L à environ 60 pg/L, notamment d'environ 50 pg/L,
- la concentration de GM-CSF est d'environ 1 pg/L à environ 5 pg/L, en particulier d'environ 1,25 pg/L à environ 2,5 pg/L, notamment d'environ 2 pg/L,
- la concentration de GDF-9 est d'environ 2 pg/L à environ 10 pg/L, en particulier d’environ 4 pg/L à environ 6 pg/L, notamment d'environ 5 pg/L,
- la concentration de TGF-bêta-1 est d’environ 10 pg/L à environ 100 pg/L, notamment d’environ 50 pg/L,
- la concentration du LIF est d’environ 10 pg/L à environ 100 pg/L, notamment d’environ 50 pg/L,
- la concentration en Zinc, particulièrement sous forme de chlorure ou de sulfate de Zinc est d'environ 1 pg/ml,
- la concentration en Inositol, particulièrement sous forme de myo-inositol est d'environ 5 mg/ml,
- la concentration en L-carnitine, particulièrement sous forme de base ou de chlorhydrate est d'environ 0,6 mg/ml, exprimée en camitine base.
Une forme préférée de composition selon l’invention comprend environ 12,5 pg/L d’IGF-l, 50 pg/L d’EGF, 1 pg/ml de Zinc, 5mg/ml d’inositol, 0,6 mg/ml de L-carnitine base.
L'invention a également pour objet les compositions susmentionnées pour culture in vitro, comprenant un composé de la famille des corticoïdes tel que défini ci-dessus, et de préférence de l'hydrocortisone.
L'invention a également pour objet les compositions susmentionnées pour culture in vitro, comprenant au moins un composé de la famille des corticoïdes impliqués dans la production énergétique chez les mammifères, de préférence de l’hydrocortisone sous forme de sel hydrosoluble tel que l’hémisuccinate d’hydrocortisone, le succinate de sodium d’hydrocortisone et le phosphate de sodium d’hydrocortisone.
L'invention a également pour objet les compositions susmentionnées pour culture in vitro, comprenant au moins un sel de zinc sous forme hydratée ou anhydre choisi parmi les sels suivants : chlorure de zinc, sulfate de zinc, gluconate de zinc, picolinate de zinc, citrate de zinc, acétate de zinc, lactate de zinc, stéarate de zinc, de préférence un sel hydrosoluble comme le sulfate de zinc ou le chlorure de zinc.
Avantageusement, l'hydrocortisone susmentionnée se présente sous forme de sel hydrosoluble, notamment sous forme d'hémisuccinate d'hydrocortisone. De préférence, la concentration du sel d'hydrocortisone dans les compositions susmentionnées, est comprise entre environ 5 x 10'7 M et environ 10'6 M, et est notamment d'environ 7 x ΙΟ'7 M, soit environ 350 pg/L pour l’hémisuccinate d'hydrocortisone.
Avantageusement, les compositions définies ci-dessus contiennent des coenzymes clé du métabolisme énergétique susmentionnés, notamment à des concentrations telles que :
- la concentration de NAD/NADH soit d'environ 1 mg/L,
- la concentration de NADP/NADPH soit d'environ 1 mg/L.
L’invention a également pour objet les compositions susmentionnées pour culture in vitro, comprenant :
- au moins deux facteurs de croissance,
- au moins un sel hydrosoluble de zinc choisi parmi le sulfate de zinc ou le chlorure de zinc et/ou du myo-inositol et/ou de la camitine ou un sel de camitine,
- de l’hémisuccinate d’hydrocortisone, et
- du NAD/NADH et/ou du NADP/NADPH.
L'invention concerne également les compositions définies ci-dessus se présentant sous forme de lyophilisât, à savoir sous forme de compositions dont les différents constituants sont amenés à l'état sec, et sont susceptibles d'être remis en solution en gardant leurs propriétés physico-chimiques et biologiques.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet les lyophilisais susmentionnés, contenant :
- au moins un facteur de croissance tels que définis ci-dessus, ou la totalité de ces facteurs, au moins un composé choisi parmi le groupe constitué par :
- un sel de zinc, notamment à une concentration de 0,1 à 3 pg/ml, de préférence à une concentration de 0,5 à 1,5 pg/ml, exprimée en zinc élément
- l’inositol sous l’une quelconque de ses formes stéréo-isomériques, de préférence le myo-inositol, notamment à une concentration de 1,8 à 18 mg/ml, de préférence à une concentration de 5 à 10 mg/ml, exprimée en molécule d’inositol, et
- la camitine sous l’une de ses formes stéréo-isomèrique, de préférence la Lcamitine, un sel de camitine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de camitine de préférence l’acétyl-carnitine ou un sel d’un dérivé de camitine, notamment à une concentration de 0,1 à 2 mg/ml, de préférence de 0,5 à 1 mg/ml, exprimée en camitine base, et éventuellement
- au moins un composé de la famille des corticoïdes défini ci-dessus, tel que l'hémisuccinate d'hydrocortisone,
- et/ou au moins un coenzyme clé du métabolisme énergétique défini ci-dessus, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH.
L'invention a également pour objet l'application des compositions ou lyophilisats susmentionnés, en tant qu'adjuvants effecteurs pour la préparation de milieux de culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits milieux de culture in vitro comprenant une composition telle que définie ci-dessus, en association avec les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits éléments étant choisis notamment parmi les sérums albumines humaine ou bovine, le cas échéant recombinantes, et/ou les sels minéraux, et/ou les molécules énergétiques telles que le glucose, le pyruvate, le citrate et le lactate, et/ou les aminoacides pour la biosynthèse des protéines, et/ou les bases puriques et pyrimidiques pour la biosynthèse des acides nucléiques, et/ou des phospholipides ou du cholestérol pour la formation des membranes cellulaires, et/ou des vitamines, telles que des vitamines du groupe B, notamment la vitamine Bl, la vitamine B2, la vitamine B3, la vitamine B5, la vitamine B6, la vitamine B9, la vitamine B12 et/ou de la vitamine C et/ou de la vitamine E, et éventuellement de l’insuline et/ou au moins une autre substance contribuant au procédé en particulier un facteur de croissance et notamment le GM-CSF, et/ou au moins un antibiotique.
Les sels minéraux précités peuvent être choisis parmi KC1, NaCl, MgSO4, NaHCCh, Na2HPO4, KH2PO4.
L'invention a également pour objet l'application des compositions ou lyophilisais susmentionnés, en tant qu'adjuvants effecteurs pour la préparation de milieux de culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits milieux de culture in vitro comprenant une composition telle que définie ci-dessus, en association avec de l’insuline.
L'invention concerne également un procédé de préparation d’adjuvants de milieux de culture in vitro définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mélange d'une composition telle que définie ci-dessus, le cas échéant après dissolution dans un volume approprié d'une composition susmentionnée sous forme de lyophilisât, avec une solution contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits éléments étant tels que définis ci-dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet les milieux de culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits milieux étant caractérisés en ce qu'ils comprennent une composition telle que définie ci-dessus, en association avec les éléments susmentionnés utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons.
L'invention a également pour objet un procédé de maturation des follicules de mammifères en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, et plus particulièrement de follicules humains, le cas échéant après décongélation de follicules préalablement congelés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro de follicules prélevés chez la femelle, et plus particulièrement chez la femme, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, avantageusement pendant environ 24 à 48 heures.
L'invention concerne également un procédé de maturation de cellules de la lignée germinale mâle de mammifères, et plus particulièrement humaines, le cas échéant après décongélation de cellules préalablement congelées, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro desdites cellules, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, notamment pendant plusieurs jours, avantageusement de 1 à 5 jours.
L'invention a également pour objet un procédé de fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, et plus particulièrement d'ovocytes et de spermatozoïdes d'origine humaine, le cas échéant après décongélation des spermatozoïdes préalablement congelés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro des ovocytes et spermatozoïdes susmentionnés, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, avantageusement pendant environ 1 jour à environ 2 jours.
L'invention concerne également un procédé de développement d'embryons de mammifères, et plus particulièrement d'embryons humains, le cas échéant après décongélation d'embryons préalablement congelés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro desdits embryons, dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, de préférence pendant les 6 premiers jours suivant la ίο fécondation in vitro, le cas échéant après décongélation, avantageusement de manière à obtenir des embryons au stade de blastocystes.
De manière non limitative, l’invention concerne notamment les procédés tels que définis ci-dessus dans lesquels les mammifères sont choisis parmi :
- les primates, y compris les êtres humains,
- les ovins,
- les bovins.
Avantageusement, les compositions de l'invention peuvent être utilisées à la fois pour la maturation des ovocytes ou celle des cellules de la lignée germinale mâle, la fécondation in vitro des ovocytes, et la maturation des embryons issus de ladite fécondation, notamment jusqu'au stade de blastocyste, éventuellement après décongélation des follicules, des cellules mâles, ou des embryons.
L'invention a également pour objet un kit (ou trousse) pour la préparation extemporanée d'un milieu de culture tel que défini ci-dessus selon l'invention, notamment dans le cadre de la mise en œuvre d'un procédé susmentionné, ce kit comprenant :
- une composition telle que décrite ci-dessus, ou
- une composition sous forme de lyophilisât telle que décrite ci-dessus,
- et, le cas échéant, une solution aqueuse contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, tels que les éléments définis ci-dessus, notamment un milieu commercial.
La présente invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée suivante d’exemples de milieux de culture préparés selon l'invention.
A titre de solution aqueuse telle que définie ci-dessus, un milieu de culture préparé à partir des compositions selon l’invention peut comprendre principalement les composés suivants :
- des sels minéraux : KC1, NaCl, MgSO4, NaHCO3, Na2HPO4, KH2PO4,
- les acides aminés essentiels, ainsi que d'autres acides aminés tels que l'acide glutamique, la glycine, la taurine, la cystéine et la glutamine,
- des oses et dérivés métaboliques, tels que glucose, pyruvate, lactate, acétate,
- des vitamines, notamment des vitamines du groupe B et de la vitamine C,
- des bases puriques et pyrimidiques,
- de l’albumine,
- des phospholipides,
- du cholestérol,
- de l’insuline et/ou au moins une autre substance contribuant au procédé, en particulier un facteur de croissance,
- des antibiotiques, tels que la pénicilline G, la streptomycine, la gentamycine ou un autre aminoside.
PARTIE EXPERIMENTALE :
Dans toutes les expérimentations suivantes, les principes actifs sont utilisés aux concentrations suivantes :
IGF-1 = 12.5 pg/l
TGF-oc = 25 pg/l
EGF = 50 pg/l
Zinc exprimé en élément = 1 pg/ml
Inositol exprimé en molécule = 5 mg/ml
L-camitine exprimée en base = 0,6 mg/ml
Sont décrites ci-après des compositions de formulations de l’adjuvant effecteur objet de la présente invention qui peuvent être utilisés pour la préparation de milieux de culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits milieux de culture in vitro.
Toutes les opérations sont effectuées avec des matières premières stériles et en milieu stérile.
Composition 1
Une solution aqueuse préparée extemporanément contenant deux facteurs de croissance est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 500 ng d’EGF et 125 ng d’IGF-l. Cette solution est à diluer au l/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 2
Une solution aqueuse préparée extemporanément contenant deux facteurs de croissance est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 500 ng d’EGF et 125 ng d’IGF-l et 10 pg de zinc élément.
Cette solution est à diluer au 1/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 3
Une solution aqueuse préparée extemporanément contenant deux facteurs de croissance est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 500 ng d’EGF et 125 ng d’IGF-l et 50 mg d’inositol.
Cette solution est à diluer au 1/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 4
Une solution aqueuse préparée extemporanément contenant deux facteurs de croissance est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 500 ng d’EGF et 125 ng d’IGF-l et 6 mg de L-camitine base.
Cette solution est à diluer au 1/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 5
Une solution aqueuse préparée extemporanément contenant deux facteurs de croissance est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 500 ng d’EGF et 125 ng d’IGF-l, 10 pg de zinc élément et 50 mg d’inositol.
Cette solution est à diluer au 1/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 6
Une solution aqueuse préparée extemporanément contenant deux facteurs de croissance est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 500 ng d’EGF et 125 ng d’IGF-l, 10 pg de zinc élément, 50 mg d’inositol et 6 mg de Lcamitine base.
Cette solution est à diluer au 1/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 7
Une solution aqueuse préparée extemporanément contenant un facteur de croissance est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 500 ng d’EGF.
Cette solution est à diluer au 1/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 8
Une solution aqueuse préparée extemporanément contenant un facteur de croissance est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 500 ng d’EGF et 10 pg de zinc élément.
Cette solution est à diluer au 1/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 9
Une solution aqueuse préparée extemporanément contenant un facteur de croissance est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 500 ng d’EGF et 50 mg d’inositol.
Cette solution est à diluer au 1/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 10
Une solution aqueuse préparée extemporanément contenant un facteur de croissance est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 500 ng d’EGF et 6 mg de L-camitine base.
Cette solution est à diluer au 1/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Composition 11
Une solution aqueuse préparée extemporanément contenant un facteur de croissance est répartie dans des flacons de 1 ml, de telle façon que chaque flacon contienne 500 ng d’EGF et 10 pg de zinc élément et 50 mg d’inositol.
Cette solution est à diluer au 1/10eme dans un milieu de culture lors de la réalisation des procédés.
Tous les flacons sont immédiatement lyophilisés et le lyophilisât est conservé à + 4°C. L’ensemble des essais est réalisé en double à la fois avec un facteur de croissance (à savoir l’EGF) d’une part et avec 2 facteurs de croissance l’EGF, et l’IGF-l d’autre part.
Selon l’invention, il est également possible de préparer la composition comportant du GM-CSF avec ou sans EGF, et des compositions contenant trois facteurs de croissance.
Maturation in vitro des ovocytes de la femme.
Le but de cette étude est d’établir la cinétique de maturation des ovocytes immatures surnuméraires dans différentes conditions. Selon la loi de Bioéthique, les patientes ont donné leur consentement à ce que les ovocytes surnuméraires puissent être utilisés pour la recherche.
En fonction du stade de la maturation des ovocytes, les « ovocytes au stade de la vésicule germinative » ou les « ovocytes au stade de la métaphase I » sont mis en culture dans un milieu classique de maturation in vitro supplémenté avec une ou plusieurs substances.
Essai la) : Ovocytes au stade de la vésicule germinative (VG)
On détermine le nombre d’ovocytes VG qui évolue au stade de la métaphase I (MI) ou de la métaphase II (Mil).
Dans cette expérience, 6 groupes sont utilisés et les essais sont effectués une fois avec deux facteurs de croissance et une autre fois avec un facteur de croissance.
Groupe n°l (témoin), 10 ovocytes VG sont placés dans des puits ne contenant que le milieu de culture
Groupe n°2, 10 ovocytes VG sont placés dans des puits contenant le milieu de culture plus les 2 facteurs de croissance (IGF-1, EGF).
Groupe n°3, 10 ovocytes VG sont placés dans des puits contenant le milieu de culture plus les 2 facteurs de croissance (IGF-1, EGF) et du zinc.
Groupe n°4, 10 ovocytes VG sont placés dans des puits contenant le milieu de culture plus les 2 facteurs de croissance (IGF-1, EGF) et de l’inositol.
Groupe n°5, 10 ovocytes VG sont placés dans des puits contenant le milieu de culture plus les 2 facteurs de croissance (IGF-1, EGF) et de la L-camitine.
Groupe n°6, 10 ovocytes VG sont placés dans des puits contenant le milieu de culture plus les 2 facteurs de croissance (IGF-1, EGF) du zinc et d’inositol.
Les mêmes essais sont ensuite répétés comme décrits précédemment en utilisant un facteur de croissance à savoir l’EGF.
Les ovocytes sont mis en culture dans la même étuve à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.
Résultats
On observe que l’ajout du zinc aux 2 facteurs de croissance IGF-1, EGF entraîne une augmentation de la maturation des ovocytes VG au stade MI et Mil au bout de 12H et 24H de culture par rapport aux ovocytes VG mis en culture dans le milieu ne comportant que les 2 facteurs de croissance.
De plus on observe également une amélioration lorsque l’on effectue le même essai comparatif avec 1 facteur de croissance l’EGF.
Les mêmes améliorations de la maturation sont observées avec l’ajout d’inositol ou de la L-carnitine aux 2 facteurs de croissance.
De plus on observe également des améliorations lorsque l’on effectue les essais comparatifs avec un facteur de croissance l’EGF.
Essai lb) Ovocytes au stade métaphase I
Dans cette expérimentation, on détermine le nombre d’ovocytes qui évolue en Μ II. On utilise le même protocole que précédemment en sélectionnant des ovocytes au stade MI.
Résultats
On observe des améliorations de la maturation des ovocytes MI évoluant au stade Mil avec l’ajout aux 2 facteurs de croissance, du zinc, d’inositol ou de la L-carnitine.
De plus on observe également des améliorations lorsque l’on effectue les essais comparatifs avec un facteur de croissance l’EGF.
Conclusion
L’ajout du zinc, d’inositol ou de la L-carnitine aux 2 facteurs de croissance (IGF-1 et EGF) apporte un effet bénéfique sur la maturation in vitro des ovocytes à la fois au stade VG et au stade MI par rapport aux ovocytes mis en culture uniquement en présence de ces 2 facteurs de croissance.
On observe également des améliorations lorsque l’on effectue les essais comparatifs avec un facteur de croissance l’EGF.
Essai 2) Fécondation in vitro
Pour évaluer l’influence des différentes substances (zinc, inositol, L-camitine) sur la fécondation in vitro (FIV), les expérimentations sont réalisées chez l’animal et en particulier chez la souris.
Pour ce faire, on sélectionne les ovules les plus matures et les spermatozoïdes les plus compétents pour faciliter la fécondation et on évalue le nombre d’embryon formé après 48 heures de culture.
Comme pour l’évaluation de la maturation in vitro, dans cette expérimentation on utilise 6 groupes.
Dans chaque groupe, 20 ovules sont mis en présence de 106 spermatozoïdes compétents dans un milieu de culture auquel on ajoute les 2 facteurs de croissance IGF-1 et EGF et au moins un composé choisi parmi le groupe constitué par le zinc, l’inositol et la Lcamitine.
Les mêmes essais ont été réalisés en présence d’un facteur de croissance à savoir l’EGF.
Résultats
L’ajout du zinc, de l’inositol et/ou de la L-camitine à un ou deux facteurs de croissance améliore le pourcentage des ovules fécondés par rapport au groupe contenant uniquement un ou deux facteurs de croissance.
Essai 3) Développement embryonnaire précoce
Pour évaluer les effets de ces différentes substances (zinc, inositol et L-camitine) sur le développement embryonnaire précoce on utilise la souche CF-1 de souris, car le nombre d’embryon évoluant au stade de blastocyste dans un milieu de culture standard est faible et avoisine les 30 %. Ce modèle permettra d’apprécier les effets bénéfices de ces substances sur le développement embryonnaire précoce.
Il est connu que chez la majorité des autres souches de souris utilisées pour le développement embryonnaire précoce, le taux d’embryon évoluant au stade blastocyste spontané dans un milieu classique est proche de 90 %.
Dans cette expérimentation, on utilise le même protocole : 6 groupes de 20 embryons 1cellule mis en culture dans différentes conditions.
Résultats
On observe que l’ajout du zinc aux facteurs de croissance entraîne une amélioration du développement des embryons à différents stades par rapport au groupe contenant uniquement les 1 ou 2 facteurs croissance. En effet on note plus d’embryons évoluant aux stades plus avancés comme le stade de « blastocystes », de blastocyste expansé 15 « Expanded blastocysts » et d’éclosion du blastocyste « hatching blastocysts ».
De tels résultats ont été observés avec l’ajout d’inositol ou de la L-carnitine aux facteurs de croissance.
Claims (11)
- REVENDICATIONS1. Composition pour la culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour le développement d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules ou embryons, caractérisée en ce qu'elle comprend :au moins un facteur de croissance, de préférence au moins deux facteurs de croissance, en association avec au moins un composé choisi parmi le groupe constitué par :cm sel de zinc, de préférence un sel hydrosoluble tel que le chlorure de zinc ou le sulfate de zinc, notamment à une concentration de 0,1 à 3 pg/ml, de préférence à une concentration de 0,5 à 1,5 pg/ml, exprimée en zinc élément, l’inositol sous l’une quelconque de ses formes stéréo-isomériques, de préférence le myo-inositol, notamment sous forme de sel, par exemple sous forme de phosphate, de préférence l’inositol tri-phosphate, notamment à une concentration de 1,8 à 18 mg/ml, de préférence à une concentration de 5 à 10 mg/ml, exprimée en molécule d’inositol, et la camitine sous l’une de ses formes stéréo-isomèriques, de préférence la Lcamitine, un sel de camitine de préférence le chlorhydrate, un dérivé de camitine de préférence l’acétyl-camitine ou un sel d’un dérivé de camitine, de préférence-sous la forme de chlorhydrate, notamment à une concentration de 0,1 à 2 mg/ml, de préférence à une concentration de 0,5 à 1 mg/ml, exprimée en camitine base, et, le cas échéant, avec un ou plusieurs composés choisis parmi les composés de la famille des corticoïdes impliqués dans la production énergétique chez les mammifères et au moins un coenzyme clé du métabolisme énergétique, tel que le NAD/NADH et le NADP/NADPH.
- 2. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux facteurs de croissance choisis parmi :- les facteurs de croissance semblables à l'insuline, encore désignés IGF (jnsuline-like growth factor) tels que l'IGF-1 et/ou l'IGF-2,- le facteur épidermique de croissance, encore désigné EGF (epidermal growth factor) et/ou ΗΒ-EGF (heparin-binding epidermal growth factor),- le facteur de croissance de transformation alpha, encore désigné TGF alpha (transforming growth factor),- le facteur de croissance de transformation bêta, encore désigné TGF béta (transforming growth factor b et a), sous formes des TGF-bêta 1, 2 et 3, de préférence le TGF-bêta-1,- le facteur de croissance hépatique, encore désigné HGF (hépatocyte growth factor),- le facteur de stimulation de colonies de granulocytes et de macrophages, encore désigné GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor),- les facteurs de croissance et de différenciation, encore désignés GDF (growth différentiation factor) de préférence le GDF-9,- le facteur inhibiteur de la leucémie, encore désigné LIF (leukemia inhibitory factor).
- 3. Composition selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce qu’elle comprend au moins un composé de la famille des corticoïdes impliqués dans la production énergétique chez les mammifères, de préférence de l’hydrocortisone sous forme de sel hydrosoluble tel que l’hémisuccinate d’hydrocortisone, le succinate de sodium d’hydrocortisone et le phosphate de sodium d’hydrocortisone.
- 4. Composition selon la revendication 1, 2 ou 3 caractérisée en ce qu’elle comprend au moins un sel de zinc sous forme hydratée ou anhydre choisi parmi les sels suivants : chlorure de zinc, sulfate de zinc, gluconate de zinc, picolinate de zinc, citrate de zinc, acétate de zinc, lactate de zinc, stéarate de zinc, de préférence un sel hydrosoluble comme le sulfate de zinc ou le chlorure de zinc.
- 5. Composition selon l’une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que les concentrations en facteurs de croissance sont notamment comprises entre environ 0,25pg/L et 100pg/L, et de préférence entre environ O,5pg/L et environ 50pg/L.
- 6. Composition selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce qu’elle contient :- au moins deux facteurs de croissance, au moins un sel hydrosoluble de zinc choisi parmi le sulfate de zinc ou le chlorure de zinc et/ou du myo-inositol et/ou de la carnitine ou un sel de carnitine, de l’hémisuccinate d’hydrocortisone, et- du NAD/NADH et/ou du NADP/NADPH.
- 7. Composition selon l’une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce qu’elle se présente sous forme de lyophilisât.
- 8. Application des compositions selon l'une des revendications 1 à 7, en tant qu'adjuvants effecteurs pour la préparation de milieux de culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, ou pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits milieux de culture in vitro comprenant une composition selon l'une des revendications 1 à 6, en association avec les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits éléments étant choisis parmi les sérums albumines humaine ou bovine, le cas échéant recombinantes, et/ou les sels minéraux, et/ou les molécules énergétiques telles que le glucose, le pyruvate, le citrate et le lactate, et/ou les aminoacides pour la biosynthèse des protéines, et/ou les bases puriques et pyrimidiques pour la biosynthèse des acides nucléiques, et/ou des phospholipides ou du cholestérol pour la formation des membranes cellulaires, et/ou des vitamines, telles que des vitamines du groupe B, notamment la vitamine Bl, la vitamine B2, la vitamine B3, la vitamine B5, la vitamine B6, la vitamine B9, la vitamine B12, et/ou de la vitamine C et/ou de la vitamine E, et éventuellement de l’insuline et/ou au moins une autre substance contribuant au procédé et/ou au moins un antibiotique.
- 9. Milieux de culture in vitro de follicules en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules, ou pour la maturation de cellules de la lignée germinale mâle, ou pour la fécondation in vitro des ovocytes par les spermatozoïdes, où pour la culture d'embryons, éventuellement après décongélation des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits milieux étant caractérisés en ce qu'ils comprennent une composition selon l'une des revendications 1 à 6, en association avec les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la fécondation in vitro, ou de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, lesdits éléments étant tels que définis dans la revendication 8.
- 10. Procédé in vitro de maturation des follicules de mammifères en cours de développement en vue de la maturation des ovocytes contenus dans lesdits follicules et plus particulièrement de follicules humains, le cas échéant après décongélation des follicules préalablement congelées, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture in vitro de follicules prélevés chez la femelle et plus particulièrement chez la femme, dans un milieu de culture selon la revendication 9, avantageusement pendant environ 24 à 48 heures.
- 11. Kit pour la préparation extemporanée d'un milieu selon la revendication 9, notamment dans le cadre de la mise en œuvre d'un procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend :- une composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, ou- une composition sous forme de lyophilisât selon la revendication 7,- et, le cas échéant, une solution aqueuse contenant les éléments utilisés classiquement dans le cadre de la culture des follicules, cellules mâles, ou embryons, tels que définis dans la revendication 8.
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