FR3041260A1

FR3041260A1 - Utilisation d'un tripeptide cyclique pour stimuler l'activite mitochondriale de cellules

Info

Publication number: FR3041260A1
Application number: FR1558899A
Authority: FR
Inventors: Jean Philippe Wolf; Anne Lombes; Morgane Bomsel
Original assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Current assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Priority date: 2015-09-21
Filing date: 2015-09-21
Publication date: 2017-03-24
Anticipated expiration: 2035-09-21
Also published as: RU2737116C2; WO2017050854A1; CN109069579B; BR112018005457A8; ES2969739T3; IL258178B1; JP2018536013A; MA42928B1; MA42928A; BR112018005457A2; EP3352775B1; AU2016325378A1; AU2016325378B2; RU2018114660A; IL258178B2; CN109069579A; RU2018114660A3; ZA201802132B; CA2998747A1; US11278589B2

Abstract

La présente invention porte sur l'utilisation d'un peptide cyclique comprenant le tripeptide reproduisant un site de liaison de la fertiline béta à l'intégrine de l'ovocyte, pour améliorer l'activité mitochondriale. Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation d'un peptide cyclique comprenant le tripeptide FEE pour stimuler l'activité mitochondriale des gamètes ou des cellules embryonnaires dans le cadre de protocoles d'assistance médicale à la procréation (AMP).

Description

D*ÜN TRÎPËPtïm POUR STIMULER L’ACTIVITÉ DE CEULUfLÉ^

La puésentë hwention concerne le domaine de l’assistance médicale à la procréation (AMP) et plus généiMement tontes les applications médicales, vétérinaires ou autres danslesquelles ünë stimülation dé l’activité mitoclïdhdriàië dés cellules est souhaitée, en particulier lors dé protocoles comportant une étape de cültüre cellulaire ou de maintien de cellules ex vivo.

Plus de 15% dèscouples ont recours à l’Assistance Médicale à la Procréation au cours dé Teiirvië gêiiitale. Lorsque que lé Sperme est altéré, il est fréquent de recourir aux techniques demictongécrion pour obtenir des fondations. Cette technique est très invasive pour l’ovocyte. Par ailleurs, lors de fécondations in vitro (FIV) avec sperme normal, on retrouve régulièrement 3 à 5% d’échecs de fécondation inexpliqués.

Dans une demande dé brevet antérieure (WO 2005/051799 A2), i’ëqüipè des inventeurs a décrit un trïpeptide cyclique (Phe, Ac Glu, Ac Glu) de formule C-S-F-E-E-C (SEQ ID No : 1)avecuneliaison de cyclisation entre les deux cystéines terminales (FEEc), ainsi que son action augmentant les capacités fécondantes des gamètes humains. Il existe des équivalents de la molécule dans les différentes espèces animales ayant les mêmes propriétés et également décrits dans ce document v El g; Poursuivant leurs recherches, les inventeurs ont mis en évidence que la molécule FEEc â üil impact sur les spermatozoïdes (exemple 1 ci-dessous), En particulier, elle améliore lesépârâmètïës du mouvëmënt spërihatiqüë tels qu’analysés par CASA (Computor Aided Sperin^nâtysiify'·. Ainsi, par exemple, la vitesse linéaire et l'amplitude du débattement latéral de la tête sont respectivement augmentés de 7 et 8 % (P<0,05 etP<0,002) (exemple I). Il en résulte une augmentation de près de 30% du pourcentage de spermatozoïdes hyperaetivés (P<0,009). Ce sont ces spermàtOZoïdes hyperactivés qui sont les spermatozoïdes fécondants. Pour que le spêrmatôzoïdë augmente sa vitesse de progression, il est logique de penser qu'il augmente sa consommation d’ATP, puisque son mouvement est créé par des liaisons de bras de dynéines aux tubules voisins de l’axonème, Les dynéines sont des ÂTPases. En étudiant le mëtabôîisme^mhôchondrial des spermatozoïdes exposés au FEE, les inventeurs ;oM mis en éyidëncë qüe cehüAii induit une augmentation du potentiel de membrane mhûëhohdrif témoin d’ïunë augmentation de la synthèse d’ATP par les mitochondries ou d’une moindre consommation. Ainsi, le FEEc améliore le métabolisme énergétique mitochondrial des spermatozoïdesy soit en améliorant la production d’ATP, soit entationnalisant son üriïisâtidn pmlaeélhile.

La présente invention porte donc, de manière générale, stn rutilisation ^un peptide cliqué letnpëptide reproduisant un site de liaison de la fertiline béta à l’intégrine de Γovocyte ou d’un tripeptide de fonnule EEP (SEQ ID No : 2), pour son utilisation eomine médicament pour améliorer l’activité mitochondriale. 0ans: ce: pm précède, le "peptide cyclique comprenant de' 'tripeptide reproduisant un/shte de '.liaison de la fertiline béta à l’intégrine de l’ovocyte" correspond au peptide décrit'd^sï'â,'déffiàïide de brevet WO 2005/051799 A2 mentionnée ci-desSüS. Comme : : mentionné dans cette demande antérieure, notamment dans la Table 1, le tripeptide varie selon ν/:ΐ65':!6$ρέθ68^Ι1''Ρβηΐ·'έίΓθ:'.95|,ε1Ϊ8έ par tout moyen connu de l’homme du métier, en particulier par ;:l.,iïitiertifï'éâiâite''.'-d cystéines situés de part et d’autre du tripeptide,;Qe manière //générale* foutes lès: déclinaisons décrites dans la demande WO 2005/0517.99//A2 sont //.considéréés'· Pomme/'répondant "à la définition du "peptide cyclique comprenant /lé· tripeptide //.:fermant/un'site de l:iatsottde;la fertiline béta à l’intégrine de l’ovocyte" au sens de; là·présente V. ; invention, : Pour. faciliter ; la;/lecture du présent texte, ce peptide cyclique, 'ainsi /que le ^^';méâiCamerit Îè-':.-CO'iiféiiafÎt/:à/fî^^ cle principe actif, seront désigné ici par la fbrfhülë/;"FEEc". //'Τ,ΡθΜώθΡη:'δέΐΐ6ί.ΰοηίρΐ6η.(ΐΓΰ'ΡΗΓΐ'3ΪίεΐΏ6ηί que cette notation couvre égalemeht/les/formes "/utilisables chez d'autres; espèces que l’homme, telles que, par exemple, le tripeptidereyclique ;;/;/./' //TDE qui devrait être utilisé ehézles bovins. ./;/;//.rt;/'.;:;;/."/.'//"//-.^-Mon enInsénmaiwnlnim&érhtè^' / : ; /';/// :;/'/Hn'/atiiéliorant les paramètres du mouvement spermatique, elle est également '/ Susceptible/d’améliorer les 'aux de grossesses en Insémination Intra Utérine (IIU). Selon un '/premier/aspect;/particulier de l’invention, le FEEc est utilisé pour augmenter la vitesse de progression des spermatozoïdes clans un protocole de procréation médicalement assistée (PMA). Toujours dans le cadre d’une AMP, le FEEc peut être utilisé pour augmenter le taux de spermatozoïdes hyperactivés,/Aussi, Tutilisation du FEEc est particulièrement intéressante dans un/protocole d’inséminâtiott intra utérine (IIU)S tam chèz l’hommeque chez vîtes;////;·.;/···/' mammifères non tiumains. Lois de la mise en œuvre de cet aspect de l’învcntion, les spermatozoïdes sont de préférence incubés pendant une minute à 3 heures en présence de 10 à 100 pM de peptide avant l’insémination intra utérine.

Action surTMûcytë .-La.moléctidë://-e^/ejg^èm efficace sur les ovocytes. La maturation in vitro des ovocytes humains bloqués en vésicule germinale passe de 33,5% à 42,5% en présence de FEEc (exemple 2)i Chez les patientes âgées de 37 ans et plus, ce taux passe de 23,20% à 49,ô%v qui montre que la molécule est particulièrement efficace dans cette tranche d’âge. /Les ovocytes dès /liâmes de 37 à 40 ans sont aneuploïdes dans 50% des cas du fait d’une chute de leur activifé mitochondriale, La molécule est donc susceptible d’améliorer la ploïdie des ovocytes et par là même celle des embryons dom lë potentiel de développement et la capacité implantatoire dépend également de l'activité mitochondriale des ovocytes. L'augmentation significative des taux de grossesse chez les femmes de moins de 37 ans, dans y le cadre de l'étude Fertiline décrite ci-dessous, montre que cet effet bénéfique a lieu sur tout ovocyte et notamment lors de sa fécondation et du développement embryonnaire précoce. Là supplémentation dés milieux de culture de fécondation in vitro avec la molécule permet donc d’améliorer la maturation ovocytaire (notamment pour les femmes de 37 ans et plus) et le taux de fécondation en FIV classique, ainsi qu’en FIV avec ICSI (injection intracytoplasmique de spermatozoïde). Là supplémentation dés milieux de culture lors de la fécondation in vitro, avec ou sans micromanipulation, avec la molécule FEEc permet donc d’améliorer le faux de grossesse et d’enfants nés.

Action dans les protocoles de Maturation In Vitro (MIV)

La molécule FEEc est aussi susceptible d’être efficace dans les protocoles de maturation in vitro des ovocytes pour la préservation de la fertilité (MIV).

Dans un protocole de fécondation in vitro, la maturation de l’ovocyte est en général achevée lors du recueil des ovocytes. Toutefois, il arrive que des ovocytes soient encore immatures. F.n outre, certaines femmes présentent des anomalies de là fonction ovarienne qui fendent les stimulations difficiles. Les ponctions ont alors volontairement lieu à un stade immature pour une maturation in vitro. Le peptide pourrait efficacement aider à cette maturation (maturation in vitro pour la préservation de là fertilité). L’ovocyte totalement immature présente un grand noyau appelé vésicule germinale (VG); L’ovocyte mature se caractérisé par la présence du 1er globule polaire (GP) dans l’espacepërfvitellin (entre la surface de l’ôvocyte et la zone pellucide). Seuls les ovocytesmatiifëaSôntfécondables:;-L^'f-----(;''·'·/····.'-'·'·'·:·:·'.··' "fLLës inventeurs ont mis ën évidence que le FEEc permet d’améliorer la maturation des ôvbcÿtes · in vitro. Ceci s’ëxplicpe par l’effet du tripeptide sur l’activité mitochondriale. En effet, l’activité mitochondriale diminue avec l’âge, et la maturation de Tovocyte comporte phffieufs ëtapfs tiès comommatrices d’énergie : - Rupture de ïâ Vësittties Germiii^ - itettnatibn dés^GltiômoSdmëa - Formation de lâ plaqué Métaphasique - Formation - Synthêse des proteines deGheck-Point - Lélophasé

- ExpiÜsidnduiffiL

Or ccs troüblëadë la maturation ovocytaire qui apparaissent avec l’âge sont corrigés par la mierairqectionde mitochondries provenant de cellules jeunes (ovocytes de donneuses jeunes ou cellules soucia ovogoniales). Cela renforce la probabilité selon laquelle le FEEc corrige ë^iriivenraû ledéiaut cellulaire lié a une insuffisance nutôchondriale.

Selon un autre de ses aspects, la présente invention porte donc sur l’utilisation du FEEc pour améliorer la maturation in vitro d’un ovocyte. Selon une mise en œuvre particulière de cet aspect de l’invention, les ovocytes proviennent de femmes âgées: de 35, 36, 38, 3¾ 40 ans ou: davantage. L’amélioration dé là qualité de la méiose est probablement a Éorigine dé îà baissé du taux de fausses couches observée également chez des femmes plus jeunes, si bien que cet aspect de l’invention est également intéressant pour améliorer la mamration in vitro des ovocytes de femmes de moins de 37 ans. Dans la mise en œuvre de cëf aspect de Γinvention, l’ovocyte est incubé pendant une durée comprise:entre 1 hèÏ3re ét:24;hémës ën présence de 10 à 100 μΜ de peptide.

Action sur J’aciiwiion de Vovocyte fécondé

Les în mis en évidence une augmentation de la décondensatiohdë la tête des spermatozoïdes. Cela traduit une amélioration de l’ætivation de l’ovocyte lors de la fécondation. Cèlle-ci est d’ailleurs liée à l’activité mitochondriale de rovocyté.·:.';.'.·;::.' '['Action sur la biastoformation ·::'.: Lealnventeurs ont également mis en évidence (cbëz la souris) que le FEEc permet une amélioration de la biastoformation. Ceci 'petit également être attribué à l’effet du tripeptide sur l’activité mitochondriale. En effeLdbestrcomuôqu’îl :itfÿ.;a-,pas de réplication d’ADN mitochondrial pendant ' l’embryogénèse:^pféiBiplântatôifë,',.Pendant" :1a."première-y semaine de développement, le ':zÿgote (ou œüQ.:;se;divise par mitoses successives;·:en: ' commençant par;':2ypttis 4 cellules, en passant par ië Stâdè de morula jusqu'à atteindre lestadè de blastocyste, : en''Utilisant uniquement les mitochondries initialement présentes dansyl. l’ovocyte. Un défeeif':'tnifechondriàl'::(ëri:nombre'.:ou'èPfendement) peut donc être à l'origine d’une instabilité chromosomique dèsblastomèrès lors de la méiose et des: mitoses^ et: conduire à un .arrêt de révolution: du zygote,; de l’èmbryoh,: voire de la grossesse,· CeCiesfunë:: Cause fréquente de fausse couche spontanée : après; fécondation naturelle ou après transfert; dès embryons lors d%ne.FIV'.; ...(La présente invention: porte donc également sur; l’utilisation du FEEc'pour;';..', améliotèr la ploïdie des blastomères; pendant; la première semaine de développement du :;: '·' zygote,.· Dans lamise en œuvre de:.c.et;:aspëCt'''del’mvention, l’embryon est incubé;pendant une '.''.durée' comprise':entre;:2'4..;heures et 6:'j0urs;eh.;prëseùce de 10 à.l.Ô'Q'pM de peptide,;·;:·'···::. ' ': i^ës :i'ütïiîsalions décrites ci-dessus sont particulièrement utiles daiis/mn:v.'.'.'.v.v;/:; protocole de fécondation'· m vitro (FIV). Chez l’humain, elles permettent notamment à :dés : tv i : femmes de 37, 38^-3:9^40 ans et davantage d’avoir des enfants par AMP avec leurs propesiv.viff ovocytes sans recourir aux injections7 de mitochondries décrites dans la littérature;. (ié'fïet·;. ' majeur le plus documenté jusqu’àprésent).

Diminution des risques dë fausses couches

La présente invention porte également suri’ütilisation dufFÈËc/.pour diminuer lés risques de fausse couche, comme cela est illustré dans lâ partie expérimentale ci- '.dessous;·'";;

Diminution dë^risquesMfnsomiëi/'y ''''i:'.. La présente:^:iHÿention;/:porte'i;ëgalemêiit sur^IMlisation^^dU'.'FËËc pour diminuer les risques de trisomiëlors: d.’:ühe:ËÎV,.'hOtamJhent ëhë£;.dëS'feMmesid’MtmOins 35. //3¾. 37, 38, 39dd40':.ans.

Bien':, que'.'les .:êffâs:'dü;:FËBc zygote aient été démontrés pat les inventeurs dans mhjcdiltèxtë/de:/FIV,./il/'èstfëviderit que ces effets pourraient être obtenus également lors des fécondations naturelles, par exemple par administration, au moment de l’ovulation, de FEEc par voie vaginale, le tripepfide étant couplé à des moyens aptes à le vectoriser jusqu’à l’ovocyte.

Action lors de lu cryopréservation des gamètes et des embryons Il a également été montré que le taux de survie des ovocytes cryopréservës dépend entre autre de leur activité mitochondriale. Il est probable qu’il en soit de même pour dés embryons. Le peptide FEEc est donc susceptible d’améliorer lès taux de survie et/ou la :;quàlitë'':ëst'gamètesdt::èmbryons cryopréservës lors de leur décongélation,/··:..··.

ActiOtirSur d'autres types cellulaires

Le''''tripëptide cyclique a été fabriqué pour se lîér' r-à^l^ititejgirm '."άόβί sur/; l’ovocyte. II.est capable:: de se lier à la membrane cytoplasmique:''dë'difféfentS:dütrëS'';type'S::. cellulaires car cette intégrine est très ubiquitaire. Cette molécule est dÔnë::V'M'semblâfclèméttt: capable d’augmenter Inactivité énergétique de nombreux types: eellulairesv Elle: est donc potentiellement susceptible d’utilisations multiples en dehors de la FÏV- λ Le mode d’action de la molécule se faisant probablement par F intermédiaire de F intégrine ΐχ6β!, le FËEc est susceptible d’avoir des effets sur beaucoup d’autreS types cellulaires. Cette molécule pourrait être utilisé pour améliorer le rendement de toute culture cellulaire.

Comme mentionné plus haut, le FEEc agit possiblement par P intermédiaire de Piritégrihe αόβΐ ou d'un autre récepteur^ présent sur de nombreux types cellulaires. Il peut donc être utilisé pour améliorer P activité rnitocHondriale de toute cellule porteuse de cette intégrine ou de cet autre récepteur. Une application immédiate de cette propriété est P amélioration du rendement de toute culture cellulaire. La présente invention porte donc également sur un procédé d’amélioration de Pactivité mitochondriale de cellules in vitro, comportant une étape de mise en présence dés cellules en question avec le FEEc. Ce procédé peut avantageusement ,;être 'ûtoen œuvre sur des cellules primaires cultivées ex vivo dans P optique d’être administrées à un patient dans le cadre d’une thérapie cellulaire. A titre d’exemples non limitatifs de cultures cellulaires susceptibles de bénéficier de ce procédé, on peut citer les cultures de peau en vue de greffes de peau, les cultures de lymphocytes en vue d’immunothérapieS:éellulairës:j::e&ï*' ddddy.'. 'ÀùtiôH dans le monde animal des mammifères

La molécule présenté;mÛè';'^écifi#éed’ê^ècê.dSës isoformes sont déclinables pour une utilisation chez tous lés animaux ^domestiques y compris les animaux de ferme dont certaines espèces se reproduisent .'difficilement' (chevaux de course, vache Holstein).

Action sur les pathologies mitochondriales et contre le vieillissement

Les propriétés du FEEc comme molécule stimulant Pactivité mitochondriale peuvent également être utilisées in vivo dans tout type de pathologie lice à un defaut d’activité mitochondriale, A ce titre, on peut citer, de façon générale, les pathologies du vieillissement. L a rel ation entre une dysfonction dés mitochondries et les; maladies neurodégëhératives, par exemple, a été établie par plusieurs équipes. Aussi, le FEEc pourrait être utilisé ebirime médicament pour trmfer les maladies toiamdëgënëtoives telles qw la màltoie d’AIzhéimër ou la maladie de Parkinson. Il a également été montré une relation entre la longueur des télomères dès chromosomes et l’activité mitochondriale de la cellule. Or le raccourcissement des tëlomeres est lie aux proèësStfôdé yiëiltosëmërit. Il et donc^ possible pù’to sfimülant PacüviiuriütochondrîaléOn soit à même de retarder les effets du vieillissement.

Les maladies rmÎûçhoridrialës présentent un tableau varié triais associent fréquemment des manilestations oculaires à type de rétinites pigmentaires ou d’ophMiriOplégie. Pour ces dernières, une administration topique du FEEc dans P œil, par éxerriple dans un collyre, pourrait améliorer les symptômes liés à l’insuffisance mitochondriale. Un autre objet de l’invention est donc un collyre comprenant un peptide cyclique comprenant le tripeptideibriftant un site de liaison de la fertiline béta à l’intégrine de POvocyte; Un tel collyre peut comprendre, outre le FEEc, un autre agent tel qu’un agent épaississant, un agent MfisepÎique,mn:antibiotique; omtout autre composé utilisable pour ce genre de produit. Les miliiëf'üûi·: ;'dë^acits dans la/dëmândè WC) 2005/051799 A2 sont bien entendu exclus de la définition·dULertnè: "collyre"nüvsënxde la présente invention.

Action enrmsmétiqm':-··

La présente itlventipit porte également sur rutilisation du FEEc, dans une composition cosmétique PU/'tfai^pëûtique destinée à une application topîqüe. A titre d’exemples, on peut citera l’Mlisàtion du FEEc pour stimuler' les fibroblastes pour la production de collagène, ou pour stimuler les follicules pileux pour favoriser la croissance des cheveux, par exemple pour prévenir pu ralentir l’alopécie, La présente invention porte donc ëgâiemërit sur une eoiripositioP cosrnétiqtié ou dermatologique comprenant du FEEc à titre de principe actif. Par "composition cosmétique ou dermatologique", on entend ici une composition qui, outre le FEEc^ comprend des ingrédients usuellement utilisés dans le domaine de la cosmétologie. Selon l'invention, la composition cosmétique ou dermatologique pêüt se présenter sous toute forme connue de l'homme du métier. Il peut s'agir, par exemple, χ d'üïiè émulsion huile-dans-l'eau, eau-dans-l'huile, eau dans silicone, d'une émulsion multiple, d'une microémulsion, d'une nano-émulsion, d’une émulsion solide, d'un gel aqueux pu/hydroalcoolique, d'une crème, d'un lait, d'une lotion, d’une pommade, d'une huile, d'un baume, d'un onguent, d'un masqué, d'une poudre, d'un support imbibé, par exemple un patch iransdermique, d'une lotion aqueuse ou hydroalcoolique et/ou une cire, d'un produit dé maquillage, par exemple un fond de teint, d'un shampooing, d'un après-shampooing, d'un masque^ d’une sérum pour application topique, d’une lotion capillaire. Les milieux décrits dans la demande WO 2005/051799 A2 sont bien entenduexclusde la défimfion/'fies;/\/"/··/··;···;.' compositions cosmétiques ou dermatologiques au sens de Îa présèntë invention.

Selon l'invention, la composition cosmétique Pu dermatologique peut être, par exemple une composition pour le soin du visage, du corps, des cheveux, par exemple des compositions pour le visage et/ou le corps et/ou les cheveux.

Les exemples suivants illustrent l’invention saris toutefois limiter son étendue. Légendes des figures

Figure 1 : Variation du potentiel de membrane mitochondrial en présence du FEEc (à droite) versus peptide témoin "scramble" (à gauche). Noter F augmentation du potentiel de membrane chez les spermatozoïdes exposés.

Figure 2 : Comptage après excitation aux UV des spermatozoïdes humains fusionnés avec des ovocytes humains dépellucidés, incubés enï’absettee (A) Pu en présence de FEEc à lÔÜjlM (B). Noter l'augmentation du nombre de spermatozoïdes fusionnes et la dëeüîidehsatiôhplus rapide de leurtête.

Figure3/:Proportion d’ovocytes matures à J1 de Maturation In Vitro (MIV). Représentation schématique des proportions d’ovocytes humains en métaphase II (Mil) à partir du stade VG après MIVdans le milieu témoin ou supplémenté en FEEc à 100μΜ.*ρ=0,02. ** p-0,003.

Jl=24h de MTV,

Figure 4 : Proportion, d’ovocytes atrétiques à J1 de Maturation In Vitro (MIV). Représentation Schématique des proportions d’ovocytes humains atrétiques. Résultats observés à''J4':à.pâttii':'dü.:lstadëiVG après maturation in vitro (MIV) dans le milieu témoin ou supplëttiehtë::ëm.FËEc:â·' Ι ΟΟμΜ. J1 =24h de MIV.

Figure 5 : Marquage du luseau méiotique obtenu sur un ovocyte humain en Mil après MIV dans le (milieu /standard: ;(24h);;:..Marquage;'dü: .'.fuseau par un anticorps anti-a-tubuline et des éehrbfflbSbïfieS '.-aù /DAPÎ, (Image /.obtenue: iMimicroscope confocal. A ; ovocyte entier. B;

'. agiandissëment dé .la.piaqüeffiëtàphasiqiiè.:: ; 2 F

Figure 6 r Comparmsoû du taux de iecondation à JI entre les souris jeunes et âgées, en 'V.préseneeouett l’'âbsenee::de:iertÎlitte, quleorrespond' au; peptide QDEc. /'JeuiiesT:sbœi'S.2E6CBM.I deT deTmois v Figure 2?2:'/Ç.ômpàïâisôh/dieS2'.pUié^ J2 et à J4 entre les souris jeuhès^ëf.âgées,iempésènee ou en' l’absence du peptide QDEc.

Jeunes P souris B6CBAF1 de 7 semaines (n=108 ovocytes, 56 témoins, 52 QDEc) ; Agées : 22SonfiS2B'6ÜBÂFl de 7 mois (n-128édVocytes. 65 témoins, 63 QDEc).*; p=0,02. **p=0,008. é'FigurëiSé'iCômparaison des pourcentages, moyens d’atrésie (ATR) à .12 entre les souris jeunes /2/:-2 2 etâgéëSi enprésence ou en l’absence du peptide QDEc. '.'-'Jeunes ; isburis; B6CBAF1: de: 7. :sêmâmes/:(ttr=108 ovocytes, 56 témoins, 52 QDEc) :; Agées : 2 s0üris':B6CBAFi.;dé::7.''m:ois(ü-l'28.o^ témoins. 63 QDEc).

Figure::? :'Rëpésëntaiohischémâtiqüë':'dédâfflëthodologie de l’étude réalisée dans l’exemple

Figure 10 : Résultats préliminaires des critères de jugement principal et secondaire dans le cadre de l’étude clinique. Taux de grossesse pm: transfert d’embryon frais/ou congelé (groupe témoin, n=172:tïâttSfëiÎs/pdüi>ë· FEEc, nM32 transferts). Pourcentage de « top embryon » (groupe témoin*·'.n-75.· nmbrydns clivés/graüpeiFEEc,in-72). Taux de fécondation (groupe témoin, n=259 MŒI/graupe-'FEEc, n=246 Mil).'/-·'.·::

Figure 11 : Taux:.de::grO'S'seS'Se'obtenus dans le cadre de/l’étude clinique. '--AMàtéri'ëig-et Méthodes

Les exemples experimentaux présents ci-dessous ont été obtenus en /utilisant lés :'.mâtéti:ëïstét;·;·;·'·::··:·^'··;· méthodes suivants : /;'·.'// Observation.desparamètresidu mouvement spertnati^üè:···'·:::· A···:···:·: .'.'.'tes spermes··'étudiés ont chacun été divisés en 2 aliquotes dont l’uneaiétë·'incubée âvëcdë////'/('''//· 7.FËE et l’autre avec un peptide « scramble » contenant les mêmes acidès/aminés mais dattsyM'.'·······';·'.:;:··:·· ordre aléatoire. Les inventeurs ont incubé pendant 3h à 37°C, des spermatozoïdes de l’espèce^ / humaine en présence de 100 μΜ du peptide FEEc ou du peptide scramble puis ont observé les paramètres du mouvement spermatique selon une analyse automatisée (Computed Assistée! :;:SperM:Ânàfysis, CASA). '/:'. EëS paramètres Spermatiques testés sont les suivants : la VAP lissée, la VSL, la VCL et /'i’ÀLHLIls correspondent respectivement à la vitesse selon la trajectoire moyenne, la vitesse en ligné droite (Straight Line Velocity), la vitesse curviligne et le déplacement latéral de la têtév. L’étude a montré une augmentation significative du pourcentage de spermatozoïdes hvperactivés (selon les;(critères de Mbifimer/ét7:'al^(;':Gela':''ésit de nature à expliquer l'augmentation des taux dé fécondation observé en présence du peptide. 'Mèsure::dùpotentielde.

Les inventeurs ont incubé pendam 3h â/37°C, des spermatozoïdes de l’espèce humaine en présence soit du peptide FEEc soit du peptide "scramble" qui comprend les mêmes acides aminés dans un ordre aléatoire et constitue ainsi le groupe témoin. Après lavage, les spermatozoïdes sont marqués grâce a üh colorant lîpophile fluorescent, le DIOC6.

Le potentiel de membrane mitochondrial gradient protonique au niveau de la membrane interne de la mitochondrie) a ensuite été mesuré par cytométrie en flux. Il se trouve augmenté dans les spërmâmzoïdes après expositiônnU FËE.

Mesure^e Pindexdejecondation

Des ovocytes humains dépellucidés ont été incubés avec des spermatozoïdes humains en Fafesehcë ou^en présence dé FËËc à IfiOpM, Les spermatozoïdes fusionnés ont été décomptés aprèsëXcitaticM ÜV, 1^ considérés fusionnés lorsque le noyau était rraoc^é au HOECHST 33342, De plus lés têtesdes spermatozoïdes ayant pénétré l’ovocyte en présence du pepfide FFE sont non seulement plus nombreuses mais présentent également un aspect fiôüté témoin de la décondensation de leur tête spermatique. Cette dëcondensation est une dès premières étapes deFâctiyatiôn ovocylaire après la pénétration du spermatozoïde.

Nous pouvons donc ëh eonelmé que le FEE hoU sëiüemënt améliore lafécondance du spermatozoïde mais qu’iFactivè egalement l’bvbcÿtë îédimdé. y:C0Uécte des ovocytes hünminseUVüe'de la MatmMonÆ^'Î^O:i(MII^^C::::::^

Des ovoèJ1és:''lrara'aîttS·''''immatures donnés à-18.-Cherche ont été colIeétéS'::'au'''Sein;;:'dnt/;'·' laboratoire: de fécondation: In Vitro (FIV)· du;'Centre d’ Assistance Médicale :à:3a:'Prücrëation.:·.':·' CÀÎ^^ÿ;-:'dë'·; ï’hôipîtiÈïï) OoChïib::.-(Paris9 France), Deux heures après la ponction; O'Vbcpàirei: lès : ovocytes; destinés â: etië; Mcidiiijectés ont été dëcoronisés par la hyaluronidasé; /(OMCjIO, : . Limonest, France). Après: : observation : :àu ;:m:icroscdpé: 'inversé (Hoffman)*;;; les· ; OVocytés : : ./immaturës/au.--stade vésiculë;germinMive::(VG)Ont;été;retenus pour la suite-des· expériences;;.--(:(:

Maturation In Pittv (MIV) des ovocytes humains immatures /'Lés; ovocytes humains immatures· au stade VG; ont; été randomisés, soit dans : lé·milieu:' dé'.' ./•'•.culture témoin (Global, JCD, La Muletière, F;ranee)7(n=2Û3) soit dans/..'le···même '.milieu; 7' "'Supplémenté avec 100 μΜ de FEEc (n=193). Les. ovocytes humains immatures;ontété: classés //7//7-en deux groupes : ceux appartenant aux femmes âgées dé moins de 37 ans et ceux appartenant / à celles âgées de 37 ans et plus. Le jour dé la ponction folliculairëçlès deux groupes d’ovocytes au stade VG ont été incubés dans des /gouttes de 20μ1 recouvertes d’huile, et 7/-/-/ maintenus à 37°C sous 5% de CO2 pour être observés: au microscope inversé (Hoffman) à J1 ./:-//// (24h d’incubation) et J2 (48h d'incubation). Lès-Ovocytes étaient classés en métaphase II (1er //://// globule polaire dans l’espace péri vi tel lin), vésicuié géribiflative (VG), métaphase I (rupture de "là:vésicule germinative sans expulsion du globule polaire) ou atrctiques.

Collecte des ovocytes murins en vue de la MatunUiûn ln fàro (MIV)

Des femelles B6CBAF1 (âgées entre 5 et 8 semaines) fournies: par lë laboratoire Charles/

River (L’Arbresie, France) ont été stimulées par injection de PMSG (Prégnant Mare Sérum Gonadotrophin) à 10UI (SIGMA-ALDRICH, Saint-Quentin Fallavier, France) sans déclenchement de Γ ovulation/: Les ovocytes immatures ont été recueillis dans les ovaires 48b après cette dernière injection, puis dénudés de leurs cumulus grâce à la hyaluronidasé et lavés à trois reprises dans du tniliéü de culture M2. Seuls les ovocytes classés ètt VG ont été retenus pour la suite des expériences, :/7./MtUüraiion Μ'ψ&ο (MIV) des ovocytes de souris immatures Lés ovocytës/de ;sbufis;;bnt.;été;fbCübéS''de manière randomisée entre le milieu standard d’une /part et le milieu;-supplémenté^en7QDËC/.100 μΜ d’autre part. Les boîtes de Culture ont été -.•préparées la veille et Incubées â'370C;:sous 5% de CC^-Les ovocytes ont été observés à JO (8h ';':pO'st-sacrifice);et;JL':(24h)v-7-7//-

Les ovocytes humains issus de MIV ont été fixés dans le paraformaldéhyde (PFA) 2% pendant lh à température ambiante puis lavés dans le PBS contenant 0,5% de BSA. La perméabilisation a été assurée par incubation des ovocytes dans une solution contenant':0,5% de BSA, 0.1% de Triton X-100, 0,05% de Twëên^lO et:5Và .ide sérum normal détehévtei'/Puis les ovocytes ont été lavés dans/lè: PB S-BSA· :Q,5%: avant d’être 'incubés toute la nuit dartsune dilution au 1/200 d’anticorps·" aiiti-a tubuline/humaine (SlGMA-ALDRlOH};dan$/;CÏu:.':PBS contenant 0,5% de BSA, Les ovocytes ont ensuite été incubés îh en présence·;''dë/P'àhtiCOrpS^//:/;/::···· secondaire de type IgG conjugué' à l'AleXa/FluOr (LIFE TECHNOLOGIES,:.AlfOrtVille,./////.:.:: France). Après une étape de lavage, les ovocÿtësdht été incubés 10 min dans;'dU'DAPX'(dilÜé'v.'.'·.'·':: au 1/1000) avant d’être montés sur lame et observés en microscopie/confbeâl'e/dans:./·/.;'/' l’obscurité. Pour l’analyse du fuseau, les ovo'cyte's.:'avec des fibres de microtu'b''ülêsÆ bien organisés associés à un alignement parfait des chromosomes au mvë^':d'ë''là/|piâqüè:·.'·: métaphasique sont identifiés comme normaux'.·

Stimulation et accouplements des souris

Des femelles B6CBAF1 "jeunes" âgées de 7 semaines et "âgées" de 7 mois ont été accouplées avec des mâles C57N après supèfôvulatidïL Cette dernière consistant à injecter la PMSG à 10UI (SIGMA-ALDRICH) suivi du déclenchement de l’ovulation par administration d’hCG (Humah Chorionic GonadotropMn) i 10 Üï (SÏGMA-ALDRICH), 46-48Î1 après. .. Lie-;Ieaidie'ïiïiaii^ dië ' lraicc0iïî>lëment, les souris présentant un bouchon vaginal ont ete sacrifiées. •'Lés/ovdcpëxdïit^ëté'rëêueillis dans les oviductes 15-16h après l’injection d’hCG et le taux de /fé<^üdàti'ôn.':a:été'ëv'Mué par la présence du second globule polaire dans l’espace périvitellin. des ovocÿtèsfécondés desouris '•/.Les:bVO'cÿtëS;de::S0üfis fécondés après:/accouplement et recueillis ont été randomises en 4 '..'.groupé au peptide QDE cyclique (QDEc), jeunes contrôles, âgées exposées au QUEc, âgées contrôles) et disposés dans des gouttes de milieu de culture :·:(RSOM)'.;de::20pL'pour. les:témoins ci supplémentés avec 100μΜ de QDEc pour les exposés. /'LtexpesitiôUaduré de Jl à.:74âj>rès l’accouplement in vivo (J0). Le QDEc est équivalent au •dFËËc(humain,L’inGubadon dés boites de culture ést réalisée à 37bC sous 5% de CO2 et elles './sdhfteeoüvërtës^’hüilëmmérâlëd':.: : /Les: ovocytes· ont·· été ^observésfbus’les jours à la loupebinoculaire pour apprécier les signes de : : développement/embryoïmai^ cinétique dé:'··développement normale correspond au '/mimffiüm,'^ à 2 celluleStet/à/JS: un embryon.:'au stade moral.â:o'u·:: /blastOcystë,

Etude prospective randomisée én-:ÉiŸ:'kumaine '//Un essai clinique a débuté au seiri:dü'iàteatoirè'''de\-FIV''.du Centreid^AMPide"CbcMn, le '.".'.Ό8/09/2014, sur 66 couples, la moyenne d’âge étMt'dë/MÿS^ //37^0+/- 5,2 pour leurs partenaires, 11; /s’agit d’iiiië étude ;|>ï^-g|^'eÎiVëi'··.'·.'i^ôiib'feiéntrique ÎMddinÎsée, des Fécondation In VitriD '.:(JFD^/.'rëalisé<^F ;ptëëëîïice l*'kbSëno&-..de FEEc. .'/'Liés:ovocytes, récupérés dans leurs cuthMüsybht été répartis en deux groupes alternativement dans l’un puis dans l’autre en fonction de leur ordre de récupération, lorsque tous les OvOCytes ont été récupérés, un technicien n’ayant pas participé au recueil des cumulus //d'ëtë'rtninait par randomisation lequel dés deux groupes était inséminé en présence de FEEc et lequel servait de témoin. Une partie des ovocytes est incubée dans le milieu de culture standard (Global, JCD), l’autre partie dans ce même-'.nuliêU-supplëmenté--ett-Ï^Ec3''OOpMïv.''c/'-:'.;\··:/'';/·'.··'/ La méthodologie de cette étude, schématisée à la figure 9, est présentée ci-dessous. Des pyocytèS humains provenant de femmes âgées de 18 à 43 ans ont été récupérés par ponction dés ovaires après stimulation hdrinonalépâï lès gynécologues. Ils ont été répartis de manière randomisée en 2 groupes : les ovocytes incubés en présence d’un milieu de culture standard supplémenté en FEEc à 100 μΜ ou d’un milieu de culture standard (Global, JCD) puis placés dans Utt incubateur à 37° sous une atmosphère de 5% de CO2. Les spermatozoïdes du conjoint ont été récupérés au laboratoire et les plus mobiles, sélectionnées selon une préparation standard des centres d’AMP, Là FIV consiste enla mise en présence des spermatozoïdes et des ovocytes dans le milieu d’insémination à raison d’une concentration de 105 spermatozoïdes sélectionnés /ml dans des gouttes de 20 microlitres sous huile. L’insémination a lieu dans un incubateur à 37°C sous 5% de CO2 pendant 18 heures. 18h après l’insémination (Jl), la décoronisation des ovocytes est effectuée. Les ovocytes fécondés sont lavés et /(transférés dans une aun e goutte de milieu et mis en culture pour 24h supplémentaires. Lors du transfert in utero, ils sont lavés trois fois, puis mis dans un milieu de transfert et placés dans la cavité utérine. Les embryons sont transférés selon leur qualité dd··//;/:/ groupe d’origine. Un, ou plusieurs embryons sont transférés en fonction/dé l’agé, de ^ l’indication de la FIV. du rang de la tentative et de la qualité des embryons obtenus, et avec /./F.accord des couples.

Le critère d’évaluation principal est le taux de grossesse clinique par transfert d’embryon frais ou congelé et le taux de fausse couche en tenant compte des 3 groupes : transferts homogènes / (témoins et traités) et mixtes (mélange des deux). /.'.'Les critères secondaires sont :

Les taux de fécondation, i.e., le rapport du nombre/de: zyg6tes ayant deux pfonucleus dans le cytoplasme. 18 heures après insémination rapporté au nombre d'ovocyte véii métaphase 2 dans la cohorte. -v.. Le pourcentage d’embryon de bonne qualité i.e., "dés/.'èttbfÿdîis dont la /séquence;dé clivage correspond à la séquence.idéale soit :.433 cellules à,J2 etS'.IF cellules à J3 et dont la fragmentation des hlastomères est de type A (lorsque le volume occupé: par lès y fragments est inférieur à 10% du volume embr>Onnaire) ou B (lorsque le volume occupé par : les fragments est compris:'èiitfe ÏOMvet 30% du volume total de F embryon),:; Ainsi:': ces'.·;'··, embryons dit « Top » correspondent au rapport du nombre d ’embryons de chaque: type rapporté au nombre d’embryons total pour ehâtpèg^oupe. Cë protocole a reçu l’avis favorable du Comité de Protection des Personnes (CPP) Ouest VI le 13/12(2012. ITémdé a obtenue l’autorisation de T Agence de la Biomédecine le 08/07/2013. Ta FIV est effictuée dans le strict respect dès Bonnes Pratiques Cliniques. Chaque couple aeeêpfânï de participer àTétude a signé un consentement libre et éclairé, y ; Les^vmiables quantitatives ont été étudiées par leurs effectifs, moyenne et écart-type. Les données entêté compâreës entre le groupe éxpoSé ëtnon exposé àTaldë d’un test approprié (testxïe Ôü test «Te Wilcoxon) pour les variables quantitatives. Les comparaisons de pourcentages ont été eHecmées grfce â un test de Chi-2 (χ2) ou un test exact de Fisher. Les différences entre les données comparées ont été considérées comme statistiquement significatives lorsquela valeur de pTseüîI de signifîcativité) était inférieure à 0,05.

Exemple 1 : Amélioration des paramètres du mouvement des spermatozoïdes et du pourcentage de snermatozdîfdesLvperactivés chez' l’Homme : Des:expériences préliminaires ont montré que dtétslui test de Süi*vie sur 18 heures de spermes '.V'incübësémtyéséhce du peptide: FEE, ;la:sürvié: est: signifîcativement améliorée dans le groupe ytfàitépaflëTEE àla concentration" de LOOpM'.'eômparé au témoin. Ëxeniple la : Analyse automatisée des paramètres du mouvement spermatique après incubation èn présence de FEEc et d’un peptide scramble pour témoin. "Lés: tésüitatsy présenté s dans le tableau L: ci-dessous montrent une augmentation-dë: la VAP lissée: (ρ=0;,008)ν de la VSL (p=0.048), delà VCL (p<0,0001), de l'ALH (p=0,002), résultant :en une: augmentation de 29% des spermatozoïdes hyperactives (p=0.009) par rapport au ; groupe tëffloiii. Cette amélioration du pourcentage des spermatozoïdes hyperactivés explique l’améliofation de leur capacité fusiogèné et l'augmentation des taux de fécondation énregiStrës ehëz la souris sur des complexestcümulo ovocytaire intacts.

/;;///\ÙTableau 1 : Analyse automatisée des paramètres du mouvement spermatique comparée entre les groupes témoin et après incubation en présence de FEE. Ëxëiiipli' 1b : Mesure du potentiel de membrane mitochondrial

Le potentiel de membrane mitochondrial s’avère être augmenté dé 21% en présence du peptÎde : FEEc par rapport au peptide « scramble: » (p<0. 001) (Figure 1 ).

Le 'FBËcdaïiiélidré'·.donc les paramètres du mouvement spermatique par augmentation du ; ν/3ρόϊ<3'ίτίΐΐ'έί1^©:;ιώ mitochondrial spermatique.

Exemple le : Etude de 'rindéxvdetfécondation

Les résultats présentés a la figuré 2 montrent que, non seulement un plus grand nombre de spermatozoïdes est fusionné avesfiés ovocytes dépellucidés en présence du peptide FEEc. mais ces derniers sont également décondensés contrairement â céux du groupe témoin.

Sur lés ovocytes témoins, on dénombre une moyenne de 19,0 +/-4,6 spermatozoïdes dans le .'.''cytoplasme alors qu'une augmentation avec 36,9 +/-11,7 spermatozoïdes fusionnés par oyocyÏeSj est rapportée après incubation avec le FEEc à 100 μΜ (pO.OOOl ). Ce phénomène suggéré une amélioration de la fécondance des spermatozoïdes et une activation ovocytaire /.méÉéépârle peptide FEEc. ËXétitnlé 2 : Amélioration des pourcentages de maturation in vitro des ovocytes humains immatures .....

Une augmentation significative de la maturation ovocytairë sous FËBC â été mise en évidence à Jl> pour l’ensemble des ovocytes humains testés. Les fésultàts ôbtênüs sont les suivants: v42,3%:(69/163)'d'ovocytes en métaphase Π (Mil) sous FEEc versus 30,0% (52/173) dans le groupe tëmoïùip=0,02 (Figure 3). Cette augmentation de maturation est encore plus marquée pour les ô'Vocÿtès issus de femmes âgées de 37 ans et plus dès J1. Les résultats obtenus sont lés suivants: 47,9% (23/48) d'ovocytes en Mil sous FEEc versus 20,4% (1.1/54) dans le './groupe témoinj/p-0,003.

Bien que faible pour les ovocytes issus de femmes';·'dont:'Tâgd est inférieur à":3.7'; ans» l’amélioration de la MIV ovocytaire chez l’humain est.très^significative pour les oyôéytes de: femmes plus âgées puisque le même taux de matmatiûh que "pour des ovocytes; des: femmes jeunes a été obtenu (47,9%;'de8''.ovocyt'es';en métaphase'll;:en;'prêsènee de FEEc versus :20,4% dans le groupe témoin,-.p—

Les résultats obtëims avec les 336 ovocytes humains àü stade VG, incubés dé hianière randomisée en présence ou en l’absence du peptide FEEc, montrent que la présence du FEEc améliore le taux de maturation des ovocytes humains.

Aucune différence significative entre les taux d’atrésie ovocytaire parmi lés 2 groupés n’a été détectée (16,5% en présence du peptide versus 16,8% pour le groupe témoin) (Figure 4). Dans l’échantillon de femmes âgées de 37 ans et plus, on note une tendance non significative à une diminution du taux d’atrésie en présence du peptide FEEc (16,7%, 8/4$) parrapport au milieu témoin (24,1%, 13/54) p>0,0$.

Exemple 3 : Organisation du fuseau méiotique de ovocytes humains matures in vitro

La figure 5 montre l’organisation incomplète et aberrante de l’alignement des chromosomes sur la plaque métaphasique avec des chromosomes non alignés. L’image est obtenue à partir d'an qvdcÿtë humain en Mil après 24h dé MIV en présence du milieu contrôle. '/Exempte 4 : AMéIiaratioP/du"taux;;dfe' fécondation et du développement embryonnaire .''..'précoce chez la souris· /A fl, le taux de fêcottdation.ïestedhchangé:chéz les souris·;) aunes, tandis qu’il passe dë;3:9%h//.v\ ;.'.5L% chez les souris'âgées (p<0)G3;)'· (figuréP')*·'. /Â;j2 parmi les souris jeunes, 50,Q$V;'(26/52)/des ovocytes "Sont clivés dans le groupe QDEc ; contre 32,4 % (18/56) dans le groüpë''téihôih'(P=Ü,02) (Figuré7). Concernant les souris âgées, il y a significativement plus d ’ embryons cfiVês à J2 ëhprêsëflce de QDEc (58,7%, 37/63) par .;"""//' .'.''"rapport au tém0:in"(35,4%,.: 23/65),^^),008^ A J4, là·.·proportion d'embryons clivés issues de //// ;:souris jeunes atteignant.le;itade/moralâvqu. blastocyste'.''est:de 34,6% (7/16) pour le groupe ;' /témoin contre 63,0%· (17/26) pourlë'MliëU supplémerité'.;en;:QDEc, p<0,03. Cette proportion ' "'atteint 86.3 % (63/73) pq'ur';les'.soM's.âgéëS;:ën présence du peptide contre 28,3% (15/53) dans :1e milieu témoin, p=0,001. ';; /'De manière intéressante, la· blastolbrrnation; chez la.:'souris'"est·;améliorée errprésence du /peptide QDEc. //;;";.

Les pourcentages d’embryons atfétiques ne sont pas significativement différents; entre les 2 groupes parmi les souris jeunes ; 17*3% (9/52) en présence de QDEc et 30,4% (17/56) pour le contrôle (p=0, l). Par rapport aux (souris jeunes*; lé/pourcentage d'atrésie est plus important dans; je groupe·· dès souris âgées avec·; des faux : similaires entre les: /groupes QDEc y + (3#,f%,24/63);ët témoin (49.2%, 32/65)::(p-6j2)/@ &),;/ :-Exemple 5 : Augmentation des taux de grossesse clinique en Fécondation in vitro .'.-Dans un premier temps, 56 couples ont été inclus. La moyenne d’âge est de .33,9+/-4,1 ans parmi les femmes et 36,7+/-5,3 pour les partenaires. Aucune différence significative: tt’â· été relevée, ni entre les taux de fécondation ni entre le pourcentage d’embryon de top qualité; : y parmi les 2 groupes FEEc versus témoin. Une tendance non significative à l’augmentation des taux de grossesse par transfert est relevée en présence du peptide par rapport au contrôle étau y groupe mixte,; 46,1% (6/13) οοη^0/29>4%·;'(5:/1·7)·.'6ΐ:··4Ο%·:·'(2/5)ί respectivement (figure 10 ët ; - :/ tableau 2 ci-dessous). Une faussé couche mêlé 'rapportée après transfert d’un"embryon;issu du groupe témoim:.Aucun efiet indësirâblë;fl.’aëtë:.rapporié::à;'cègôüry-.· A ce jour 66 couples ont été inclus dans l’étude, 54 transferts ont été effectués, 26 avec des y ; embryons; témoins, 22 avec des-embryons du groupe FEËi 6 :avec des.; embryons; des deux groupes transferts mixtes). Lé taux de grossesse cumulée a ';ëte; respectivement de 34,6%, 45,5% et: ;33:,3% dans les 3 groupes. Le taux de faussés: -couclîës spontanées était respectivement de y 33,3 %, 10% et 0%. : Lé taux; de grossesses cliniques est donc y y -y respectivement de 23%, 41% et 33,3%. Fait essentiel quand le taux de grossesse clinique est rapporté à l'âge des patientes, on s’aperçoit que chez les patientes jeunes, le taux de grossesse clinique évolutive est significativement augmenté de 20% à 57,1% (P<0,03)

T ableau 2 : T aux de grossesse par transfert (pour 66 patients)

Les résultats montrent également une augmentation de 21% de grossesses cliniques après; v / transfert d’un embryon issu du groupe FEEc 40,0% (8/20) contre 33,3% (8/24) dans le groupé: ; \ témoin (p>0,05), Les taux de fécondation sont de 66,2% parmi les témoins contre 67i6%::;dans. le groupe exposé au FEEc (p>0,05). Le taux, de fausse couche spontanée précoce '.'.atteint:;//.'///. 37,5% (3/8) dans le groupe témoin contre 11,1%. (1/9) lorsque Γembryon a été exposé aü : : FE/Ee (p>Q,Û5) (Figure 11). 'Pour· les femmes·: âgées· de. moins rte/ST/ansyaprès exposition au FEEc, les taux de fécondation /'./ /sonfde 70.,9%:coùtre::'68:j3.%:dan$:le:.':groUpé:tëiTtOmi;Dans le cas où Γovocyte a été exposé au : .FEEc, lësrtâux déÿrOSsèsSë.atte^ dans le groupe témoin (Tableau 3 ////' / .ci-dessous);

Tableau 3 : Taux de fécondation et taux: de grossesse selon l’âge de la partenaire .(>37 ou<37 ans) * P<0,03·)/'·'.·.·;::·.·.:

Sur.'ίes/66 premiers/cbüplë's/mclüs dans l’étude jusqu’à eë jour, 51 transferts ont été effectués, : les autres étant différésyét:lës:.risulitàts montrent que sur ces .51 transferts : - 21 ont e/é réalisés à partir d'embryons du groupe lémoin ; O-· 18 à partir du: groupe en présence du FEEdT/.'/:/ - 12 avec des èmbrÿons des deux groupes. :r

Le taux de grossesse est: plus éleyé/et les fausses : couches sont moins nombreuses: pour: le groupe en présence du FËËC pâr comparaison avec les autres groupes (33% de fausses couchés versus 9% pour les ëmbrÿbns en présence de FEEc) (tableaux 4 et 5 ci-dessous). ./'Lésfaux de grossesses pourl.es femmes jeunes passenMe:/2Q% à 57,I%: (p<Û.03), en présence'/:/·.'. " de:FEEcparTapportautémom.'y'/:./·:''.·'/././.;/

Tableau 4 ; Taux de grossesse par transfert (pour 66 patients)

Tableau 5

Claims

REVENDICATIONS AMENDEES

1. Peptide cyclique comprenant le peptide de formule C-S-F-E-E-C (SEQ ID NO: 1) avec une liaison de cyclisation entre les deux cystéines terminales et reproduisant un site de liaison de la fertiline béta à l’intégrine de l’ovocyte, pour son utilisation comme médicament pour améliorer l’activité mitochondriale.
2. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le médicament augmente la vitesse de progression des spermatozoïdes et/ou leur fécondance dans un protocole de procréation médicalement assistée (PMA).
3. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le médicament augmente le taux de spermatozoïdes hyperactivés dans un protocole de PMA.
4. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans un protocole d’insémination intra utérine (IIU).
5. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que les spermatozoïdes sont incubés pendant 1 minute à 3h en présence de 1 à 100 μΜ de peptide avant l’insémination intra utérine.
6. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le médicament améliore la maturation in vitro des ovocytes.
7. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon la revendication 6, pour améliorer la maturation in vitro d’ovocytes humains.
8. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon la revendication 6 ou la revendication 7, pour améliorer la fécondation et l’activation ovocytaire.
9. Peptide selon la revendication I, pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisée en ce que les ovocytes sont incubés pendant une durée comprise entre 1 minute et 24 heures en présence de 1 à 100 μΜ de peptide,
10. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon la revendication selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le médicament améliore la ploïdie des blastomères pendant la première semaine de développement du zygote.
11. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes, pour améliorer la cryopréservation des gamètes et des embryons.
12. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans un protocole de fécondation in vitro (FIV).
13. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que le médicament augmente les Chances de grossesse.
14. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisée en ce que le médicament diminue les risques de fausse couche.
15. Peptide selon la revendication 1, pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisée en ce que le médicament diminue les risques de trisomie.
16. Procédé d’amélioration de l’activité mitochondriale de cellules in vitro, comportant une étape de mise en présence desdites cellules cultivées ex vivo avec le peptide cyclique tel que défini selon la revendication 1.
17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que les cellules sont des lymphocytes.
18. Composition cosmétique ou thérapeutique comprenant le peptide cyclique comprenant le peptide de formule C-S-F-E-E-C (SEQ ID NO: 1) avec une liaison de cyclisation entre les deux cystéines terminales et reproduisant un site de liaison de la fertiline béta à l’intégrine de l’ovocyte, tel que défini dans la revendication 1, pour améliorer l’activité mitochondriale, ladite composition étant destinée à une application topique.
19. Composition selon la revendication 18, ladite composition étant destinée à une application topique dans l’œil.
20. Composition cosmétique ou dermatologique comprenant un peptide cyclique Comprenant le peptide de formule C-S-F-E-E-C (SEQ ID NO: 1) avec une liaison de cyclisation entre les deux cystéines terminales et reproduisant un site de liaison de la fertiline béta à l’intégrine de l’ovocyte, tel que défini dans la revendication 1, pour améliorer l’activité mitochondriale.
21. Collyre comprenant un peptide cyclique comprenant le peptide de formule C-S-F-E-E-C (SEQ ID NO: 1) avec une liaison de cyclisation entre les deux cystéines terminales et reproduisant un site de liaison de la fertiline béta à l’intégrine de l’ovocyte, tel que défini dans la revendication 1, pour améliorer 1 ’ activité mitochondriale.