CN109069579A

CN109069579A - 环状三肽用于改善细胞能量代谢的用途

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Publication number: CN109069579A
Application number: CN201680067857.2A
Authority: CN
Inventors: J-P·沃尔夫; A·隆布; M·邦塞尔
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Paris 5 Rene Descartes
Current assignee: Western Dais Paris, University of; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite de Paris
Priority date: 2015-09-21
Filing date: 2016-09-21
Publication date: 2018-12-21
Anticipated expiration: 2036-09-21
Also published as: BR112018005457A8; IL258178A; RU2737116C2; IL258178B2; MA42928A; RU2018114660A3; AU2016325378B2; CN109069579B; MA42928B1; EP3352775A1; US20180264075A1; EP3352775B1; CA2998747A1; HK1258383A1; JP2018536013A; ES2969739T3; FR3041260A1; RU2018114660A; ZA201802132B; EP3352775C0

Abstract

本发明涉及包含再生致育蛋白β与卵母细胞整联蛋白的结合位点的三肽的环肽用于改善细胞能量代谢的用途。更具体地，本发明涉及包含三肽FEEc的环肽用于在医学辅助生育(MAP)方案的背景下刺激配子或胚胎细胞的能量代谢的用途，特别是促进卵母细胞的体外成熟、受精率和出生率。

Description

环状三肽用于改善细胞能量代谢的用途

本发明涉及医学辅助生育(MAP)的领域，且更具体地涉及在其中希望刺激细胞的线粒体活性或更一般地能量活性的所有医学、兽医学或其它应用，特别是在包括细胞培养或离体细胞维持的步骤的方案中。

超过15％的夫妇在他们的生殖寿命中具有对医学辅助生育的依赖。当精子受损时，为了得到受精经常求助于显微注射技术。该技术对于卵母细胞而言是非常侵袭性的。此外，在使用正常精子的体外受精(IVF)过程中，经常遇到3-5％的无法解释的受精失败。

在先前的专利申请(WO 2005/051799 A2)中，发明人的团队描述了具有在两个末端半胱氨酸之间的环化连接的式C-S-F-E-E-C(SEQ ID No.1)的环状三肽(Phe,Ac Glu,AcGlu)(FEEc)以及它的增加人配子的受精能力的作用。在不同的动物物种中存在所述分子的等同物，它们具有相同的性质，并且也被描述在所述文件中。

跟随他们的研究，发明人已经证实，FEEc分子对精子具有影响(下面的实施例1)。具体地，它会改善精子运动的参数，如通过CASA(Computer Aided Sperm Analysis，计算机辅助的精子分析)所分析的。因而，例如，头部的直线速度和侧向摆动(lateral tiring)的振幅分别增加了7％和8％(P<0.05和P<0.002)(实施例1)。这导致超活化的精子的百分比的接近30％的增加(P<0.009)。这些超活化的精子是授精精子，为了使所述精子增加它的前进速度，在逻辑上认为它会增加它的ATP消耗，或至少增强它的能量代谢，因为它的运动通过使动力蛋白臂结合至在鞭毛轴丝附近的小管而建立。动力蛋白是ATP酶。通过研究暴露于FEEc的精子的线粒体代谢，发明人已经提出以下假设：所述FEEc诱导线粒体膜电位的增加，从而证实线粒体的ATP合成的增加或减少的消耗。因而，FEEc会改善线粒体能量代谢，或更一般地改善精子的细胞能量代谢，无论通过改善ATP生产，还是通过定量配给细胞对它的使用。

因此，本发明一般地涉及包含三肽(其再生致育蛋白β与卵母细胞整联蛋白的结合位点)的环肽或式EEP(SEQ ID No.2)的三肽的用途，其作为用于改善线粒体活性或更一般地用于改善细胞能量代谢的药物的用途。在本文中举例说明了这样的肽在两种不同细胞类型(即精子和卵母细胞)上和在多细胞胚胎生物的发育上的应用。呈现在实验部分中的结果支持能够在其中希望改善细胞能量代谢的其它应用中使用该肽的事实。具体地，该肽可以用于改善细胞培养物、特别是淋巴细胞的收率。在一个特定实施方案中，将所述肽载体化，也就是说与试剂、分子、组合物或任意其它类型的促进它进入细胞中的载体组合施用。更一般而言，所述载体化通过将它与载体组合用于调节和控制活性成分向靶标的分布。

在前述内容中，“包含三肽(其再生致育蛋白β与卵母细胞整联蛋白的结合位点)的环肽”对应于在上述专利申请WO 2005/051799 A2中描述的肽。如在该在先申请中、特别是在表1中提及的，所述三肽随物种变化。通过本领域技术人员已知的任何方式，特别是借助于位于所述三肽的任一侧上的两个半胱氨酸残基，可以将它环化。通常，认为在申请WO2005/051799 A2中描述的所有变体对应于用于本发明的目的的“包含三肽(其形成致育蛋白β与卵母细胞整联蛋白的结合位点)的环肽”的定义。为了便利本文的阅读，该环肽以及含有它作为活性成分的药物将在本文中用式“FEEc”表示。本领域技术人员将完全理解，该表示法也涵盖可以用在除了人类以外的物种中的形式，例如，将用在牛科动物中的TDE环状三肽。

通过阅读下面的发明详述以及实施例将理解，本发明的范围不限于医学辅助生育应用，并且它在许多其它领域中开启了真实前景。因而，本发明更一般地涉及FEEc在其中希望刺激细胞能量代谢的医学或非医学应用中的用途。

对在子宫内授精中的精子的作用

通过改善精子运动参数，FEEc也能够改善子宫内授精(IUI)中的妊娠率。根据本发明的第一个特定方面，使用FEEc来增加医学辅助生育(MAP)方案中的精子前进速率。仍然在MAP的背景下，可以使用FEEc来改善精子运动参数和增加超活化的精子的水平。因而，在人类中和在非人哺乳动物中，FEEc的应用在子宫内授精(IUI)方案中是特别有利的。在实现本发明的该方面的过程中，优选地将精子在有10-100μM肽存在下温育1分钟至3小时，然后在子宫内授精之前洗涤。

对体外卵母细胞成熟的作用

所述分子对卵母细胞也是有效的。在核泡中阻断的人卵母细胞的体外成熟在有FEEc存在下从37.71％达到59.30％(P<5.7x10^-5)(实施例2)。在37岁或更大的患者中，该比率从36.96％达到68.29％(P<0.003)，这表明，所述分子在该年龄范围是特别有效的。因为他们的线粒体活性的下降，37-40岁的女性的卵母细胞在至少50％和更一般地大约80％的情况下是非整倍体。所述分子因此能够改善卵母细胞的倍性，并且通过相同的分子，预示了胚胎的倍性，胚胎的发育潜力和植入能力也依赖于已经受精的卵母细胞的线粒体活性。在下述的“致育蛋白”临床研究的背景下，37岁以下的女性中的妊娠率的显著增加表明，该有益效果发生在任何卵母细胞上且特别是在其受精和早期胚胎发育过程中。根据这些结果的假设是，致育蛋白能够改善卵母细胞倍性。

因此，给培养介质和体外受精介质、以及胚胎温育介质补充所述分子使得通过常规IVF和也通过具有ICSI(细胞质内精子注射)的IVF改善卵母细胞和胚胎成熟(特别是对于30岁以下的女性和37岁或更大的女性)和受精率成为可能。

因此，在体外受精(具有或没有显微操作)过程中给培养介质补充FEEc分子使得在使用的实验条件下改善妊娠率和婴儿出生率成为可能，特别是在37岁以下的女性中。

在卵母细胞体外成熟(IVM)方案中的作用

FEEc分子也能够在用于保留能育性(IVM)的卵母细胞体外成熟方案中有效。

在体外受精方案中，卵母细胞的成熟通常在卵母细胞收集时结束。但是，有些卵母细胞有时仍然是未成熟的。另外，有些女性存在卵巢功能异常或造成难以刺激的临床病症。因此在体外成熟的未成熟阶段自动地进行穿刺。所述肽可以有效地辅助该成熟(用于能育性保持的体外成熟)。

完全未成熟的卵母细胞具有大细胞核，其被称作核泡(GV)。成熟卵母细胞的特征在于第1极体(PG)在卵周隙(在卵母细胞的表面和透明带之间)中的存在。仅成熟卵母细胞是可受精的。

发明人已经证实，FEEc使得改善体外卵母细胞的成熟成为可能。这通过所述三肽对线粒体活性或对卵母细胞的能量代谢的影响来解释。实际上，所述线粒体活性或更一般地所述能量代谢随年龄下降，并且卵母细胞的成熟包含几个高耗能步骤：

-核泡破裂

-染色体浓缩

-中期板形成

-纺锤体形成

-检查点蛋白合成

-分裂末期

-PG排出。

事实上，通过源自年轻细胞(来自年轻供体的卵母细胞或卵原干细胞)的线粒体的显微注射来纠正随着年龄恶化的这些卵母细胞成熟问题。这会增强FEEc实际上纠正与线粒体不足或更一般地能量不足有关的细胞缺陷的概率。

因此，根据它的方面中的另一个方面，本发明涉及FEEc用于改善卵母细胞的体外成熟的用途。减数分裂的质量的改善可能引起流产率的下降(这也在更年轻的女性中观察到)，所以本发明的该方面对于改善37岁以下或甚至30岁以下的女性的卵母细胞的体外成熟也是有利的。在本发明的该方面的实现中，将卵母细胞温育1小时至4天之间的时间段，特别是多达3天或24小时，并且在有10-100μM肽存在下。

对受精的卵母细胞的活化的作用

发明人还已经证实了受精以后精子头解凝的增加。这反映了在受精过程中卵母细胞活化的改善。此外，这与卵母细胞的线粒体活性有关。

对胚细胞形成的作用

发明人还已经(在小鼠中)证实，所述FEEc允许改善胚细胞形成。这也可以归因于所述三肽对线粒体活性或更一般地对细胞的代谢的作用。实际上，已知的是，在植入前胚胎发生过程中不存在线粒体DNA复制。在发育的第一周中，合子(或卵)通过连续有丝分裂进行分裂，从2个细胞开始，然后是4个细胞，并经过桑椹胚期直到达到胚泡期，优先使用最初存在于卵母细胞中的线粒体。线粒体缺乏(以数目或收率的方式)因此可以引起分裂球在减数分裂和有丝分裂过程中的染色体不稳定性，并可以导致合子、胚胎或甚至妊娠的演化的阻止。这是天然受精以后或在IVF过程中在胚胎转移以后的自发流产的常见原因。

因此，本发明也涉及FEEc用于在合子发育的第一周中改善分裂球的倍性的用途。所以，本发明涉及FEEc用于减少流产数目的用途。本发明也涉及FEEc用于减小非整倍性、特别是三体性的风险的用途。在本发明的该方面的实现中，将所述胚胎在有10-100μM肽存在下温育24小时至6或7天的时间段。

上述的用途在体外受精(IVF)方案中是特别有用的。在人类中，它们允许所有年龄的女性用她们自己的卵母细胞通过MAP获得儿童，无需求助于在文献中描述的线粒体注射(迄今为止最广泛地记录的主要效应)。

流产风险的减小

本发明也涉及FEEc用于减小流产风险的用途，如在前面提及的和在下面实验部分中举例说明的。

三体性风险的减小

本发明也涉及FEEc用于在IVF过程中在所有女性中、特别是在35、36、37、38、39或40岁和更老的女性中减小三体性或更一般地非整倍性的风险的用途。

体外胚胎发育动力学的改善

本发明也涉及FEEc用于改善植入前体外胚胎发育的用途。在一个特定实施方案中，所述植入前发育在延长的培养条件下得到。胚胎发育的动力学的改善使得提高出生率成为可能。

在天然生殖中的作用

尽管发明人已经在IVF背景下证实了FEEc对卵母细胞和合子的影响，但是显然这些影响也可在天然受精过程中得到，例如通过在排卵时在阴道中施用FEEc，所述三肽偶联至适合用于将它运载至卵母细胞的装置。

在配子和胚胎冷冻保存过程中的作用

还已经证实，冷冻保存的卵母细胞的存活率尤其依赖于其线粒体活性。对于胚胎而言，这也可能如此。因此，FEEc肽能够改善冷冻保存的配子和胚胎在其融化过程中的存活率和/或质量。

对其它细胞类型的作用

生产了环状三肽以便结合卵母细胞上的α6β1整联蛋白。它能够结合多种其它细胞类型的细胞质膜，因为该整联蛋白是非常普遍存在的。因此该分子可能能够增加众多细胞类型的能量活性。因此它能够具有除了IVF以外的多种用途。

由于所述分子的作用模式可能借助于α6β1整联蛋白而发生，所述FEEc能够对许多其它细胞类型具有影响。该分子可以用于提高任何细胞培养物的收率。

如上所述，所述FEEc可能借助于在众多细胞类型上存在的α6β1整联蛋白或另一种受体起作用。它因此可以用于改善携带该整联蛋白或该其它受体的任何细胞的线粒体活性或能量代谢。该性质的直接应用是任何细胞培养物的收率的提高。因此，本发明也涉及一种用于改善体外细胞的线粒体活性或更一般地能量活性的方法，所述方法包括使目标细胞与FEEc接触的步骤。在细胞疗法的背景下从施用给患者的角度看，该方法可以有利地在离体培养的原代细胞上进行。作为能够受益于该方法的细胞培养物的非限制性例子，可以提及皮肤培养物(针对皮肤移植物)、淋巴细胞培养物(针对细胞免疫疗法)等。

本发明涉及FEEc肽在医学应用(诸如细胞疗法)或非医学应用(诸如在用于实验目的或用于蛋白生产的培养物中的细胞的维持)中用于促进所有表达FEEc受体的细胞类型的离体培养的目的的用途。

在哺乳动物世界中的作用

所述分子表现出物种特异性。它的异形体可以适合用在所有家养或非家养动物(包括耕作动物)中，其中的一些物种难以繁殖(赛马、Holstein奶牛)。

对线粒体病理学和抗老化的作用

所述FEEc作为用于刺激线粒体活性或更一般地能量代谢的分子的性质还可以在体内用在与线粒体活性缺陷有关的任何类型的病理学中。在这方面，通常可以提及老化病理学。例如，几个团队已经建立了线粒体功能障碍和神经变性疾病之间的关联。因而，所述FEEc可以用作用于治疗神经变性疾病诸如阿尔茨海默氏病或帕金森病的药物。还已经证实了细胞的染色体端粒长度和线粒体活性之间的关联。事实上，端粒缩短与老化过程有关。因此可能通过刺激细胞的线粒体或能量活性来延迟老化的效应。

线粒体疾病具有不同的表象，但是经常与色素性视网膜炎或眼肌麻痹类型的眼表现组合。对于后一种病理学，FEEc在眼睛中的局部施用(例如在眼洗剂中)可以改善与线粒体或能量不足有关的征状。因此，本发明的另一个主题是眼洗剂，其包含含有三肽的环肽，所述三肽能够形成致育蛋白β与卵母细胞整联蛋白的结合位点。除了FEEc以外，这样的眼洗剂还可以包含另外的试剂，诸如增稠剂、杀菌剂、抗生素或可以用于这类产物的任何其它化合物。在申请WO 2005/051799 A2中描述的介质当然被从用于本发明的目的的术语“眼洗剂”的定义中排除。

在化妆品中的作用

本发明也涉及FEEc在意图用于局部施用的化妆品或治疗组合物中的用途。作为示例，可以提及FEEc用于刺激成纤维细胞(用于胶原产生)或用于刺激毛囊(用于促进毛发生长，例如用于预防或减慢脱发)的用途。因此，本发明也涉及包含FEEc作为活性成分的化妆品或皮肤病学组合物。术语“化妆品或皮肤病学组合物”在本文中意图指这样的组合物：除了FEEc以外，其还包含在整容领域中常用的成分。根据本发明，所述化妆品或皮肤病学组合物可以呈本领域技术人员已知的任何形式。它可以是例如水包油、油包水或有机硅包水乳剂，多重乳剂，微乳剂，纳米乳液，固体乳剂，水凝胶或水-醇凝胶，乳膏剂，乳液，洗剂，软膏剂，油，香膏，油膏剂，面膜，粉末，经浸渍的支持物，例如透皮贴剂、水洗剂或水-醇洗剂和/或蜡、化妆品，例如粉底霜、洗发剂、调理剂、面膜、用于局部施用的血清或洗发剂。在申请WO2005/051799 A2中描述的介质当然被从用于本发明的目的的化妆品或皮肤病学组合物的定义中排除。

根据本发明，所述化妆品或皮肤病学组合物可以例如是面部、身体或头发护理组合物，例如面部和/或身体和/或头发组合物。

下述实施例举例说明了本发明，但是，不限制其范围。

附图说明

图1:在有FEEc存在下的线粒体膜电位(在右侧)相对于“混杂”对照肽(在左侧)的变化。应当注意在大多数患者中暴露的精子的膜电位的增加。

图2:在紫外激发以后，计数与除去了透明带的人卵母细胞融合的人精子，在没有(A)或有100μM的FEEc存在下(B)温育。应当注意融合的精子的数目的增加和它们的头部的更快解凝。

图3:在体外成熟(IVM)的D1的成熟卵母细胞的比例。在对照介质或补充了100μM的FEEc的介质中从IVM以后的GV阶段开始的分裂中期II(MII)中的人卵母细胞的比例的图示。*p＝0.02.**p＝0.003.D1＝IVM的24h。

图4:在体外成熟(IVM)的D1的闭锁卵母细胞的比例。闭锁人卵母细胞的比例的图示。在对照介质或补充了100μM的FEEc的介质中从体外成熟(IVM)以后的GV阶段开始在D1观察到的结果。D1＝IVM的24h。

图5:在标准介质中在IVM以后MII在人卵母细胞上得到的减数分裂纺锤体的标记(24h)。用抗-α-微管蛋白抗体标记纺锤体，并用DAPI标记染色体。在共焦显微镜上得到图像。A:完整卵母细胞.B:中期板的放大图。

图6:在有或没有致育蛋白(其对应于QDEc肽)存在下在年轻和老小鼠之间在D1的受精率的对比。

年轻:7-周龄B6CBAF1小鼠；老:7-月龄B6CBAF1小鼠。

图7:在有或没有QDEc肽存在下，在年轻和老小鼠之间在D2和在D4的分裂胚胎的平均百分比的对比。

年轻:7-周龄B6CBAF1小鼠(n＝108个卵母细胞,56个对照，52QDEc)；老的:7-月龄B6CBAF1小鼠(n＝128个卵母细胞，65个对照，63QDEc)；*p＝0.02,**p＝0.008,***p＝0.01。

图8:在有或没有QDEc肽存在下，在年轻和老小鼠之间在D2的闭锁(ATR)的平均百分比的对比。

年轻:7-周龄B6CBAF1小鼠(n＝108个卵母细胞，56个对照，52QDEc)；老的:7-月龄B6CBAF1小鼠(n＝128个卵母细胞，65个对照，63QDEc)。

图9:在实施例5中进行的临床研究的方法的图示。

图10:在临床研究的背景下主要和次要判断的标准的初步结果。每次转移的新鲜的或冷冻的胚胎的妊娠率(对照组，n＝17转移/FEEc组，n＝13转移)。“顶胚胎”百分比(对照组，n＝75分裂胚胎/FEEc组，n＝72)。受精率(对照组，n＝259MII/FEEc组，n＝246MII)

图11:在临床研究的背景下得到的妊娠率。

图12:在有FEEc存在下温育以后在GV中封闭的卵母细胞的成熟率的改善。通过考虑每个女性的1个卵母细胞和通过在有FEEc或对照肽存在下温育所述卵母细胞，进行该研究。

图13:按年龄范围FEEc对在GV中封闭的人卵母细胞的成熟的影响。

图14:用QDEc刺激在年轻小鼠中的植入前胚胎发育(*P<0.00532；**P<0.00374；***P<0.00913；****P<0.068；()胚胎的数目)。

材料和方法

使用下述材料和方法得到下面呈现的实验实施例：

精子运动参数的观察

将研究的精子各自分成2个等分试样，将其中的一个与FEEc一起温育，并将其中的另一个与“混杂”肽一起温育，所述“混杂”肽含有相同的氨基酸，但是以随机顺序。发明人将来自人类的精子在有100μM的FEEc肽或混杂肽存在下在37℃温育3h，并然后根据自动化分析(计算机辅助的精子分析,CASA)观察精子运动参数。

试验的精子参数如下：平滑的VAP、VSL、VCL和ALH。它们分别对应于平均路径速度、直线速度、曲线速度和侧向头部位移。研究表明超活化的精子的百分比的显著增加(根据Mortimer等人的标准)。这可以解释在有所述肽存在下观察到的受精率的增加。

线粒体膜电位的测量

发明人将来自人类的精子在有FEEc肽或“混杂”肽存在下在37℃温育3h，所述“混杂”肽包含呈随机次序的相同氨基酸且因而构成对照组。在洗涤以后，使用亲脂荧光染料DIOC6标记精子。

然后通过流式细胞计量术测量线粒体膜电位(在线粒体内膜水平的质子梯度)。发现在暴露于FEEc以后的精子中增加。

受精指数的测量

将除去了透明带的人卵母细胞在没有或有100μM的FEEc存在下与人精子一起温育。在紫外激发以后计数融合的精子。当细胞核被Hoechst 33342标记时，认为精子是融合的。此外，在有FEEc肽存在下已经穿透卵母细胞的精子的头部不仅在数目上更大，而且具有模糊的外观，从而证明它们的精子头部的解凝。该解凝是精子穿透以后卵母细胞活化的第一步之一。因此可以由此得出结论：FEEc不仅改善精子的授精能力，而且它也活化受精的卵母细胞。

针对体外成熟(IVM)的人卵母细胞的收集

从Cochin医院(巴黎,法国)的医学辅助生育(MAP)中心的体外受精(IVF)实验室收集用于研究的未成熟的人卵母细胞。在卵母细胞穿刺以后2小时，将意图用于显微注射的卵母细胞用透明质酸酶(Origio,Limonest,法国)除去它们的冠(corona)。在倒置显微镜(Hoffman)下观察以后，将在核泡(GV)阶段的未成熟的卵母细胞保留用于剩余的实验。

未成熟的人卵母细胞的体外成熟(IVM)

在对照培养介质(Global,JCD,La Mulatière,法国)中(n＝203)或在补充了100μM的FEEc的相同介质中(n＝193)，将在GV阶段的未成熟的人卵母细胞随机化。将未成熟的人卵母细胞分类成两组：属于37岁以下女性的那些，和属于37岁及以上女性的那些。在滤泡穿刺当天，将两组在GV阶段的卵母细胞在20μl被油覆盖的小滴中温育，并在5％CO₂下在37℃维持，从而在D1(温育24h)和D2(温育48h)在倒置显微镜(Hoffman)下观察到。将卵母细胞分类为分裂中期II(在卵周隙中的第1极体)、核泡(GV)、分裂中期I(没有排出极体的核泡的破裂)或闭锁。

针对体外成熟(IVM)的鼠卵母细胞的收集

通过在不触发排卵的情况下注射10IU的PMSG(孕马血清促性腺激素)(Sigma-Aldrich,Saint-Quentin Fallavier,法国)，刺激由Charles River实验室(L’Arbresle,法国)供给的B6CBAF1雌性(5-8周龄)。在后一次注射以后48h从卵巢收集未成熟的卵母细胞，然后将它们的丘(cumulus)借助于透明质酸酶除去，并在M2培养介质中洗涤3次。仅将分类为GV的卵母细胞保留用于剩余实验。

未成熟的小鼠卵母细胞的体外成熟(IVM)

将小鼠卵母细胞以在标准介质(一方面)和补充了100μM QDEc的介质(另一方面)之间随机化的方式温育。在前一天准备培养皿并在5％CO₂下在37℃温育。在D0(处死后8h)和D1(24h)观察卵母细胞。

免疫荧光

将来自IVM的人卵母细胞在2％低聚甲醛(PFA)中在环境温度固定1h，并然后在含有0.5％的BSA的PBS中洗涤。通过将所述卵母细胞在含有0.5％的BSA、0.1％的Triton X-100、0.05％的吐温-20和5％的正常山羊血清的溶液中温育进行透化。然后将卵母细胞在PBS-05％BSA中洗涤，然后在含有0.5％的BSA的PBS中与抗-人α-微管蛋白抗体(Sigma-Aldrich)以1/200的稀释比温育过夜。然后将卵母细胞在有Alexa Fluor-缀合的IgG第二抗体(Life Technologies,Alfortville,法国)存在下温育1h。洗涤步骤以后，将卵母细胞在DAPI中温育10min(稀释至1/1000)，然后固定在载玻片上并通过共焦显微术在暗处观察。对于纺锤体分析，将具有独特的和良好组织的微管纤维(其与在中期板水平的染色体完美对齐有关)的卵母细胞鉴别为正常的。

小鼠的刺激和交配

使7-周龄“年轻”和7-月龄“老的”B6CBAF1雌性超排卵以后与C57N雄性交配，后者由以下内容组成：注射10IU的PMSG(Sigma-Aldrich)，随后通过在此后46-48h施用10IU的hCG(人绒毛膜促性腺激素)(Sigma-Aldrich)触发排卵。

在交配次日，将表现出阴道塞的小鼠处死。在注射hCG以后15-16h从输卵管收集卵母细胞，并通过第二极体在卵周隙中的存在评价受精率。

受精的小鼠卵母细胞的温育

将交配后受精并收集的小鼠卵母细胞随机分成4组(暴露于环状QDE肽(QDEc)的年轻的，年轻的对照，暴露于QDEc的老的，老的对照)，并放在培养介质(KSOM)的滴中，对于对照而言为20μl，且对于暴露者补充100μM QDEc。所述暴露从体内交配(D0)以后D1持续至D4。所述QDEc等同于人FEEc。将培养皿在5％的CO₂下在37℃温育，并给它们覆盖矿物油。

每天用双目放大镜观察卵母细胞，以便评估胚胎发育的征象。正常的发育动力学最少在D2对应于分裂成2个细胞的胚胎，且在D5对应于处在桑椹胚或胚泡期的胚胎。

在人IVF中的随机化前瞻性研究

在09/08/2014在Cochin的MAP中心(MAP Center of Cochin)的IVF实验室中在66对夫妇上开始临床试验，女性的平均年龄为34.3±4.2岁，且她们的配偶的平均年龄为37.0±5.2。它是在有或没有FEEc存在下进行的体外受精(IVF)的随机化单中心前瞻性研究。将从它们的丘(cumulus)回收的卵母细胞分成两组，根据它们的回收次序交替地分在一个组中并然后分在另一个组中。当所有的卵母细胞都被回收时，没有参与丘(cumuli)回收的技师通过随机化确定两个组中的哪一个在有FEEc存在下被授精和哪一个充当对照。将一部分的卵母细胞在标准培养介质(Global,JCD)中温育，并将其它部分在补充了100μM的FEEc的该相同介质中温育。

在下面呈现了该研究的方法，将其图示在图9中。在妇科医生激素刺激以后通过卵巢穿刺回收源自18-43岁女性的人卵母细胞。将它们以随机化方式分成2组：将卵母细胞在有补充了100μM的FEEc的标准培养介质或标准培养介质(Global,JCD)存在下温育，然后放在培养箱中在37℃在5％的CO₂气氛下。在实验室中回收配偶的精子，并根据MAP中心的标准配方选择最活动的。IVF由以下内容组成：在油下的20微升滴中以10⁵个选择的精子/ml的浓度在授精介质中使所述精子与卵母细胞接触。在37℃在5％的CO₂下在培养箱中进行授精18小时。授精以后18h(D1)，从卵母细胞除去冠(corona)。将受精的卵母细胞洗涤并转移进另一滴介质中，并培养另外24h。在子宫内转移时，将它们洗涤3次，然后放在转移介质中并放在子宫腔中。根据它们的表观质量转移胚胎，而不对它们的起源组做出任何注意。根据年龄、IVF的指示、尝试排序和得到的胚胎的质量，并经夫妇同意，转移一个或多个胚胎。可以将一些胚胎立即或在D2胚胎转移以后置于在5天过程中的长期培养中(在胚泡期)。

主要评价标准是新鲜的或冷冻的胚胎的转移的临床妊娠率和考虑3组的流产率：均一转移(对照和经处理)和混合转移(二者的混合物)。

第二标准是：

-受精率，即在授精后18小时在细胞质中具有两个原核的合子的数目相对于组群中处于分裂中期2的卵母细胞的数目的比率。

-良好质量的胚胎的百分比，即其切割序列对应于理想序列的胚胎，也就是说：4-5个在D2的细胞和8-9个在D3的细胞，并且其中分裂球(blastomer)片段化属于类型A(当被所述片段占据的体积小于胚胎体积的10％时)或B(当被所述片段占据的体积是在胚胎总体积的10％至30％之间时)。因而，这些“顶”胚胎对应于每类胚胎的数目相对于每组的胚胎总数的比率。

该方案于12/13/2012被West VI伦理委员会(West VI Ethics Committee)批准。所述研究于07/08/2013得到了来自Agence de la Biomédecine[French BiomedicineAgency，法国生物医学部]的授权。严格按照良好临床试验规范进行IVF。每对同意参加研究的夫妇签署了自由的和知情的同意文件。

统计分析

借助于它们的数目、平均值和标准差研究了定量变量。使用定量变量的适当检验(Student氏检验或Wilcoxon检验)在暴露和非暴露组之间对比数据。使用卡方(χ²)检验或Fisher氏精确检验进行了百分比的对比。当p值(显著性阈值)小于0.05时，认为对比的数据之间的差异是统计上显著的。

实施例1：精子运动参数和男性中的超活化的精子的百分比的改善

初步实验表明，在FEE肽存在下温育的精子的18-小时存活试验中，与对照相比，在用100μM浓度的FEE处理过的组中存活显著地改善。

实施例1a:在有FEEc和对于对照组而言的混杂肽存在下在温育以后精子运动参数的自动化分析

在下面表1中呈现的结果表明平滑的VAP(p＝0.008)、VSL(p＝0.048)、VCL(p<0.0001)和ALH(p＝0.002)的增加，从而导致与对照组相比超活化的精子的29％增加(p＝0.009)。超活化的精子的百分比的这种改善解释了它们的致融合能力的改善和在具有完整卵母细胞丘(cumulus)复合物的小鼠中记录的受精率的增加。

表1:在对照组和有FEEc存在下温育以后的组之间对比的精子运动参数的自动化分析。

参数	对照	FEE	P
					VAP(μm/s)	81.0±16.8	86.3±13.7	0.008	7％
VSL(μm/s)	67.3±16.7	71.8±15.3	0.048	7％
					VCL(μm/s)	137.5±26.7	148.0±26.6	<0.0001	8％
ALH(μm)	6.1±1.3	6.6±1.3	0.002	8％
					BCF(Hz)	32.7±3.4	33.0±3.9	NS	-
STR(％)	85.8±11.4	84.9±10.0	NS	-
					LIN(％)	51.1±12.6	50.9±12.2	NS	-
超活化	12.3±9.7	15.9±11.6	0.009	29％

实施例1b：线粒体膜电位的测量

发现与“混杂”肽相比在有FEEc肽存在下线粒体膜电位增加了21％(p<0.001)(图1)。

因此，所述FEEc通过增加精子线粒体膜电位改善精子运动参数。

实施例1c:受精指数的研究

在图2中呈现的结果表明，不仅较大数目的精子在有FEEc肽存在下与除去了透明带的卵母细胞融合，而且所述精子也解凝，这不同于对照组的那些。

在对照卵母细胞上在细胞质中计数了19.0±4.6个精子的平均值，而在与100μM的FEEc一起温育以后报告了36.9±11.7个被卵母细胞融合的精子的增加(p<0.001)。该现象提示由FEEc肽介导的精子的受精能力和卵母细胞活化的增加。在有或没有FEEc存在下(温育3小时)分析了37位患者的精子运动参数。根据Mortimer标准存在超活化的精子的百分比的显著增加，这解释了它们的受精能力的增加(参见上面表1)。

实施例2:未成熟的人卵母细胞的体外成熟的百分比的改善

对于所有试验的人卵母细胞，FEEc对卵母细胞成熟的显著增加在D1表现出。得到的结果如下：对于FEEc而言42.3％(69/163)的在分裂中期II(MII)的卵母细胞，与此相比，在对照组中为30.0％(52/173)，p＝0.02(图3)。成熟的增加甚至早至D1对于来自37岁及以上女性的卵母细胞更显著。得到的结果如下：对于FEEc而言47.9％(23/48)的在MII的卵母细胞，与此相比，在对照组中为20.4％(11/54)(p＝0.003)。

尽管对于来自小于37岁的女性的卵母细胞而言较小，在人类中卵母细胞IVM的改善对于较老女性的卵母细胞而言是非常显著的，因为得到了与年轻女性的卵母细胞相同的成熟率(相对于对照组中的20.4％，在有FEEc存在下47.9％的在分裂中期II的卵母细胞，p＝0.003)。

用336个在GV阶段的人卵母细胞(在有或没有FEEc肽存在下以随机化方式温育)得到的结果表明，FEEc的存在会改善人卵母细胞的成熟率。

在2个组之间没有检测到卵母细胞闭锁率的显著差异(相对于对照组的16.8％，在有所述肽存在下的16.5％)(图4)。在37岁及以上女性的样品中，与对照介质(24.1％,13/54)相比(p>0.05)，在有FEEc肽存在下注意到朝向闭锁率降低的非显著趋势(16.7％,8/48)。

继续研究，并得到了补充性结果。这些结果确认了上述结果并证实了FEEc肽的其它作用，如下所述。

使共计600个卵母细胞在体外成熟。为了分析，在研究中包括每位女性的仅1个卵母细胞，以便使所有的事件都是独立的。在有致育蛋白(在介质中)存在下，成熟率从38.3％达到59.0％(P<1.6×10^-4)(图12)。当作为女性(在GV中的卵母细胞源自她)的年龄的函数进行分析时，看到成熟的改善对于37岁以下女性而言是相对不大的(42.6％至51.8％，P<0.2)，但是它在源自37岁及以上女性的卵母细胞中大得多(35.1％至65.9％,P<3.91×10^-5)。因此，致育蛋白能够刺激除去了冠(corona)的卵母细胞的体内成熟和第一极体的排出。显然，卵母细胞的年龄相关的能量缺乏越大，致育蛋白执行该刺激越好。该研究也使得证实成熟率(更具体地，37岁以上和30岁以下女性的GV卵母细胞的成熟率)的增加成为可能(图13)。

实施例3:在体外成熟的人卵母细胞的减数分裂纺锤体的组构

图5显示了具有未对齐的染色体的中期板上的染色体的对齐的不完全和异常组构。在有对照介质存在下在IVM的24h以后从MII的人卵母细胞得到图像。

实施例4：在小鼠中的受精率和早期胚胎发育的改善

在D1，受精率在年轻小鼠中保持不变，而它在老小鼠中从39％达到51％(p<0.03)(图6)。

在D2，在年轻小鼠中，与对照组中的32.4％(18/56)相比，在QDEc组中50.0％(26/52)的卵母细胞分裂(P＝0.02)(图7)。关于老小鼠，与对照(35.4％,23/65)相比，在有QDEc存在下在D2有显著更分裂的胚胎(58.7％,37/63)，p＝0.008。在D4，达到桑椹胚或胚泡期的来自年轻小鼠的分裂胚胎的比例对于对照组而言为34.6％(7/16)，与此相比，对于补充了QDEc的介质而言为63.0％(17/26)，p<0.03。对于老小鼠，与对照介质的28.3％(15/53)相比，在有所述肽存在下该比例达到86.3％(63/73)，p＝0.001。

有利地，在有QDEc肽存在下，小鼠中的胚细胞形成改善。

闭锁胚胎的百分比在年轻小鼠的2个组之间没有显著不同：在有QDEc存在下为17.3％(9/52)，且对于对照而言为30.4％(17/56)(p＝0.1)。与年轻小鼠相比，闭锁的百分比在老小鼠的组中更大，在QDEc(38.1％,24/63)和对照(49.2％,32/65)组之间具有类似的比率(p＝0.2)(图8)。

为了更精细地研究植入前胚胎发育，进行下述方案：在D0使小鼠交配。在D1，通过管球(tube bulb)的撕裂回收卵母细胞。然后将它们以随机化方式分配进两个组中，并放在具有或没有QDEc的培养物中，然后受精。

结果表明在D3的桑椹胚、在D4的胚泡的增加，和在这些中，当在有QDEc存在下温育卵母细胞时增大的胚泡的增加(31.1％相对于45.9％，P<0.009)(图14)。此外，在将这些胚泡转移进假妊娠的雌性中以后，通过转移的胚胎得到的后代的数目显著增加，特别是对于源自年轻小鼠的胚胎(下面表2)。

表2：在小鼠中转移对照胚胎和用QDEc处理过的胚胎以后的出生率

实施例5：通过体外受精对临床妊娠率的增加

在“致育蛋白”研究的背景下得到了下面呈现的结果。

在第一步中，包括56对夫妇。女性的平均年龄为33.9±4.1岁，且配偶为36.7±5.3。在2个组(FEEc相对于对照)之间没有观察到受精率或顶级质量胚胎的百分比的显著差异。在有所述肽存在下观察到与对照和混合组相比通过转移增加妊娠率的非显著趋势，分别是46.1％(6/13)相对于29.4％(5/17)和40％(2/5)(图10和下面表2)。从对照组转移一个胚胎以后报告了流产。迄今为止尚未报道不良作用。

迄今为止，已经在研究中包括了66对夫妇。进行了54次转移，26次使用对照胚胎，22次使用FEE组的胚胎，6次使用两组的胚胎(混合转移)。在3个组中的累积妊娠率分别是34.6％、45.5％和33.3％。自发流产率分别是33.3％、10％和0％。因此临床妊娠率分别是23％、41％和33.3％。当临床妊娠率是相对于患者年龄时，一个基本事实是，在年轻患者中看到，进化临床妊娠率(即妊娠到期)从20％显著地增加至57.1％(P<0.03)。

表3：通过转移的妊娠率(对于66位患者)

结果也表明转移来自FEEc组的胚胎以后临床妊娠的21％增加，为40.0％(8/20)，与此相比在对照组中为33.3％(8/24)(p>0.05)。受精率在对照中为66.2％，与此相比在暴露于FEEc的组中为67.6％(p>0.05)。过早自发流产率在对照组中达到37.5％(3/8)，与此相比，当已经将胚胎暴露于FEEc时为11.1％(1/9)(p>0.05)(图11)。

对于37岁以下女性，在暴露于FEEc以后，受精率为70.9％，与此相比在对照组中为68.3％。在其中将卵母细胞暴露于FEEc的情况下，妊娠率达到57.1％，与此相比，对照组中为20.0％(下面表4)。

表4：根据配偶年龄的受精率和妊娠率(≥37或<37岁)*P<0.03

在迄今研究所包括的前66对夫妇中，已经进行了51次转移，其它被推迟，且结果表明，在这51次转移中：

-21次使用对照组的胚胎进行；

-18次使用在有FEEc存在下的组；

-12次使用两组的胚胎。

与其它组相比，对于在有FEEc存在下的组而言，妊娠率更高并且存在更少流产(33％的流产相对于在有FEEc存在下的胚胎的9％)(下面表5和6)。

与对照相比，在有FEEc存在下年轻女性的妊娠率从20％达到57.1％(p<0.03)。

表5：转移妊娠率(对于66位患者)

表6：随着女性年龄而变化的转移妊娠率

致育蛋白的继续研究使得得到另外的结果成为可能。在研究中包括了共计66位夫妇。结果报告在下表中。

所述尝试的总数据报告在表7中。总受精率是基本上未改变的。但是，在有FEEc存在下缺乏受精(小于20％受精率)的尝试的百分比从37.9％下降至27.3％，从而提示在有致育蛋白存在下所述配子的更好受精能力。同样地，在致育蛋白组中与在对照组中相同数量级的多精入卵(4.0％相对于5.2％)表明，阻断多精入卵的正常机制未被改变。

表7：在66位患者上的致育蛋白研究的总结果

已经转移胚胎的所有夫妇的结果报告在表8中。该表不包括在具有或没有致育蛋白的2组卵母细胞中具有未解释的受精失败的夫妇(n＝6)。

表8：在致育蛋白研究的66对夫妇中得到的结果

如在表8中所示，对于具有胚胎转移的患者，受精率从69.5％达到78.6％，这是13％的改善，但是其在本组群中没有达到显著性。直到胚泡期的胚胎发育未改变，胚胎在子宫中的植入率也未改变。另一方面，在致育蛋白组中的流产率下降了接近50％(15.4％相对于30.5％)。

具有胚胎转移且其中女性在37岁以下的夫妇的结果报告在表9中。

如果仅考虑其中女性在37岁以下(n＝47)且对应于超过70％的受治疗的患者的夫妇，看到受精率从70.9％显著地提高至83.3％(P<0.05)。对于已经接受致育蛋白组的胚胎的那些患者，流产率从已经接受对照组的胚胎的患者的36.3％达到9.1％，即降低4倍。实际上，产生婴儿的进化妊娠率从对照胚胎组的28.6％达到致育蛋白组的胚胎的41.6％。

表9：在致育蛋白研究的背景下在其中女性是在37岁以下的夫妇中得到的结果

Claims

1.一种包含再生致育蛋白β与卵母细胞整联蛋白的结合位点的三肽的环肽，其用在其中希望刺激细胞能量代谢的医学或非医学应用中。

2.在权利要求1中要求保护的肽，其用于用在权利要求1要求保护的用途中，其特征在于，所述药物在医学辅助生育(MAP)方案中增加精子前进速率及其受精能力。

3.在权利要求1中要求保护的肽，其用于用在权利要求1要求保护的用途中，其特征在于，所述药物在MAP方案中增加超活化的精子的量。

4.在权利要求1-3中的一项中要求保护的肽，其用于用在权利要求1-3中的任一项要求保护的用途中，用于在子宫内授精(IUI)方案中。

5.在权利要求2-4中的一项中要求保护的肽，其用于用在权利要求2-4中的任一项要求保护的用途中，其特征在于，将所述精子在子宫内授精前在有1-100μM肽存在下温育1分钟至3h。

6.在权利要求1中要求保护的肽，其用于用在权利要求1要求保护的用途中，其特征在于，所述药物改善卵母细胞的体外成熟。

7.在权利要求6中要求保护的肽，其用于用在权利要求6要求保护的用途中，用于改善人卵母细胞的体外成熟。

8.在权利要求6和7中的任一项中要求保护的肽，其用于用在权利要求6和7中的任一项要求保护的用途中，用于改善受精和卵母细胞活化。

9.在权利要求6-8中的一项中要求保护的肽，其用于用在权利要求6-8中的任一项要求保护的用途中，其特征在于，将所述卵母细胞在有1-100μM肽存在下温育1分钟至4天之间的时间段。

10.在权利要求6-9中的一项中要求保护的肽，其用于在权利要求6-9中要求保护的用途，其特征在于，所述药物改善在合子发育第一周的分裂球的倍性。

11.在权利要求1中要求保护的肽，其用于用在权利要求1要求保护的用途中，其特征在于，所述药物改善植入前胚胎发育。

12.在权利要求11中要求保护的肽，其用于用在权利要求11要求保护的用途中，其特征在于，所述药物在延长的培养条件下使用。

13.在权利要求1中要求保护的肽，其用于改善配子和胚胎的冷冻保存的用途。

14.在前述权利要求中的一项中要求保护的肽，其用于用在前述权利要求中的任一项中要求保护的用途中，用在体外受精(IVF)方案中。

15.在权利要求10中要求保护的肽，其用于用在权利要求10要求保护的用途中，其特征在于，所述药物增加妊娠的机会。

16.在权利要求10中要求保护的肽，其用于用在权利要求10要求保护的用途中，其特征在于，所述药物减小流产的风险。

17.在权利要求10中要求保护的肽，其用于用在权利要求10要求保护的用途中，其特征在于，所述药物减小非整倍性、特别是三体性的风险。

18.在权利要求1中要求保护的肽，其用于用在权利要求1要求保护的用途中，其特征在于，所述药物用于促进离体细胞培养。

19.在权利要求18中要求保护的肽，其用于用在权利要求18要求保护的用途中，其特征在于，所述细胞是淋巴细胞。

20.在权利要求1中要求保护的肽，其用于用在权利要求1要求保护的用途中，其特征在于，将所述药物施用在眼中。

21.在权利要求1中要求保护的肽，其用于用在权利要求1要求保护的用途中，其特征在于，将所述药物载体化。

22.在权利要求1中要求保护的肽，其用于用在意图局部施用的化妆品或治疗组合物中的用途中。

23.一种化妆品或皮肤病学组合物，其包含含有再生致育蛋白β与卵母细胞整联蛋白的结合位点的三肽的环肽。

24.一种眼洗剂，其包含含有再生致育蛋白β与卵母细胞整联蛋白的结合位点的三肽的环肽。