BR112015017934B1

BR112015017934B1 - Uso de um extrato de lactobacillus delbrueckii, processo de elicitação de células vegetais e de preparação de uma composição, composições, composição cosmética e usos da composição cosmética

Info

Publication number: BR112015017934B1
Application number: BR112015017934-7A
Authority: BR
Inventors: Richard Martin; Pascal Hilaire
Original assignee: L'oreal
Priority date: 2013-01-29
Filing date: 2014-01-29
Publication date: 2020-09-29
Also published as: FR3001391B1; US10786539B2; WO2014118207A1; CN105142733B; ES2655035T3; BR112015017934A2; CN105142733A; EP2950887B1; FR3001391A1; EP2950887A1; BR112015017934B8; US20150366929A1

Abstract

uso de lactobacillus delbrueckii, processo de elicitação de células vegetais e de preparação de uma composição, composições, composição cosmética e uso da composição cosmética. a presente invenção concerne o uso de lactobacillus delbrueckii para elicitar uma célula vegetal de uma iridácea e o uso dessas células elicitadas no tratamento das peles sensíveis.

Description

[001] A presente invenção diz respeito ao tratamento cosmético ou farmacêutico das peles sensíveis e dos distúrbios associados a um excesso de síntese e/ou de liberação do peptídeo derivado da calcitonina (conhecida com o nome de Calcitonine Gene Related Peptide ou CGRP).

[002] O CGRP é um elemento químico polipeptídico elaborado e liberado por uma terminação nervosa. Como a localização do CGRP é específica das fibras nervosas sensitivas (fibras C), numerosos de órgãos ou tecidos recebem aferências de neurônios com CGRP, tais como as glândulas salivares, o estômago, o pâncreas, o intestino, o sistema cardiovascular, a glândula tireoide ou a pele.

[003] Devido a essas distribuição ubiquitária do CGRP, um número muito grande de distúrbios está associado a um excesso de síntese e/ou de liberação do CGRP. É o caso, em particular, de doenças respiratórias e inflamatórias, de doenças alérgicas e de distúrbios cutâneos tais como afecções dermatológicas que incluem o eczema, o prurido ou a rosácea.

[004] O uso de antagonistas do CGRP constitui um tratamento eficaz em todas as afecções citadas acima.

[005] Além disso, a Depositante demonstrou que uma das características essenciais das peles sensíveis estava ligada à liberação do CGRP. Consequentemente, o uso de antagonistas do CGRP pode igualmente permite obter um efeito preventivo e/ou curativo das peles sensíveis.

[006] Por "antagonista do CGRP", entende-se aqui qualquer composto suscetível e inibir parcial, e mesmo totalmente, o efeito biológico do CGRP.

[007] Entre os antagonistas do CGRP conhecidos, podem ser citados, por exemplo, o CGRP 8-37 (sequências dos aminoácidos 8 a 37 da parte N-terminal do CGRP), ou ainda os anticorpos anti-CGRP.

[008] Além disso, a Depositante mostrou no pedido FR 2 738 486 que um extrato de pelo menos uma Iridácea era capaz de diminuir a vasodilatação induzida pela capsaicina e/ou por uma estimulação elétrica antidrômica (aplicada sobre um nervo aferente) e/ou de provocar uma inibição da liberação de CGRP pelas fibras nervosas sensitivas e/ou de provocar uma inibição da contração do músculo liso do vas deferens induzida pelo CGRP, e podia, portanto, ser utilizado como antagonista do CGRP, em particular para tratar as afecções citadas acima e as peles sensíveis.

[009] Todavia, esse extrato só permitia inibir o CGRP parcialmente, da ordem de 70%.

[010] Existe, portanto, ainda, uma grande necessidade de composições que apresentem uma atividade antagonista do CGRP mais elevada.

[011] Além disso, o extrato descrito no pedido FR 2 738 486 podia conter compostos deletérios em relação à atividade antagonista do CGRP e as moléculas responsáveis por essa atividade antagonista não eram excretadas no meio de cultura, reduzindo, portanto, a produtividade da cultura.

[012] Existe, portanto, ainda uma necessidade significativa de composições que apresentem uma atividade antagonista do CGRP que possam ser obtidas com uma grande produtividade.

[013] A presente invenção resulta da descoberta inesperada, pelos inventores, que um extrato de Lactobacillus delbrueckii spp lactis atua como elecitador nas células vegetais de íris. De fato, quando ele é adicionado a uma cultura de células desdiferenciadas de íris, esse extrato permite uma superexpressão da atividade antagonista do CGRP ao mesmo tempo intracelular e extracelular das células de íris, induzindo uma inibição do CGRP maximizada, da ordem de 100%. Ademais, a excreção, no meio externo, das moléculas responsáveis por essa atividade antagonista, permite aumentar de modo significativo a produtividade da cultura.

[014] A presente invenção trata, portanto, do uso de Lactobacillus delbrueckii para elicitar uma célula vegetal de uma Iridácea.

[015] Ela trata igualmente do uso de Lactobacillus delbrueckii para induzir a produção de um antagonista do CGRP por uma célula vegetal de uma Iridácea.

[016] A presente invenção tem igualmente por objeto um processo de elicitação de células vegetais de uma Iridácea que compreende a colocação em contato de células vegetais de uma Iridácea com Lactobacillus delbrueckii em condições apropriadas para induzir a expressão de uma atividade antagonista do CGRP.

[017] Ela se refere igualmente a um processo de preparação de uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRP que compreende as etapas que consistem em: a) pôr em contato, em um meio de cultura, células vegetais de uma Iridácea com Lactobacillus delbrueckii em condições apropriadas para induzir a expressão de uma atividade antagonista do CGRP, b) eventualmente separar as células vegetais cultivadas na etapa a) do meio de cultura, e c) recolher uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRP.

[018] A presente invenção trata igualmente de uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRP suscetível de ser obtida por esse processo de preparação.

[019] Ela tem igualmente por objeto uma composição cosmética que compreende uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRP suscetível de ser obtida por esse processo de preparação, e um veículo cosmeticamente aceitável.

[020] Outro objeto da presente invenção trata do uso dessa composição cosmética para tratar as peles sensíveis ou no tratamento anticaspa.

[021] A presente invenção trata, finalmente, de uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRP suscetível de ser obtida pelo processo de preparação acima para seu uso no tratamento dos distúrbios associados a um excesso de síntese e/ou de liberação do CGRP.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO ATIVIDADE ANTAGONISTA DO CGRP

[022] No contexto da presente invenção, o da calcitonina" "Calcitonine Gene Related Peptide" ou "CGRP" faz referência a um peptídeo membro da família da calcitonina produzido nos neurônicos centrais e periféricos e que existe, no ser humano, em duas formas, o a-CGRP e o β-CGRP. O CGRP atua através de um receptor heterômero composto de um receptor acoplado a uma proteína G, denominado "calcitonin receptor-like receptor" ou CALCRL, e uma proteína que modifica a atividade do receptor ou RAMP.

[023] Por "antagonista do CGRP", entende-se aqui qualquer composto suscetível de inibir parcial, e mesmo totalmente, o efeito biológico do CGRP. De preferência, um antagonista do CGRP ou um composto que possui uma atividade antagonista do CGRP de acordo com a presente invenção é capaz de produzir uma inibição da fixação receptorial do CGRP ou de produzir uma inibição de a síntese e/ou de a liberação de CGRP pelas fibras nervosas sensitivas. De modo particularmente preferido, um antagonista do CGRP ou um composto que possui uma atividade antagonista do CGRP de acordo com a presente invenção é capaz de produzir uma inibição da fixação receptorial do CGRP. De modo ainda mais preferido, um antagonista do CGRP ou um composto que possui uma atividade antagonista do CGRP de acordo com a presente invenção possui uma afinidade para os receptores com CGRP.

EXTRATO DE LACTOBACILLUS DELBRUECKII

[024] Por "Lactobacillus delbruecki, entende-se aqui um bacilo gram positivo do gênero Lactobacillus, não móvel, capaz de fermentar os substratos glucídicos de ácido láctico em condições anaeróbicas. Como é bem conhecido do técnico no assunto, a espécie Lactobacillus delbrueckii inclui 4 subespécies: Lactobacillus delbrueckii spp bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii spp lactis, Lactobacillus delbrueckii delbrueckii e Lactobacillus delbrueckii indicus.

[025] De preferência, a subespécie de Lactobacillus delbrueckii utilizada no âmbito da presente invenção é Lactobacillus delbrueckii spp lactis. Lactobacillus delbrueckii spp lactis inclui, em particular, as cepas ATCC 4797, DSM 20076, NCDO 299, NCIB 7854, DSM 7290 e NCC 88. De preferência, a cepa de Lactobacillus delbrueckii spp lactis utilizada no âmbito da presente invenção é a cepa ATCC 4797.

[026] A bactéria Lactobacillus delbrueckii utilizada no âmbito da presente invenção pode ser utilizada em uma forma viva, semiativa, inativada ou morte. De preferência, a bactéria Lactobacillus delbrueckii é utilizada em forma inativada ou morta.

[027] No sentido da presente invenção, um micro-organismo "inativado" é um micro-organismo que não é mais capaz, temporada ou definitivamente, de formar colônias em cultura.

[028] No sentido da presente invenção, um micro-organismo "morto" é um micro-organismo que não é mais capaz, definitivamente, de formar colônias em cultura. Os micro-organismos mortos ou inativados podem ter das membranas celulares intactas ou rompidas. Assim, o termo "inativado" designa igualmente os extratos e lisados de micro-organismos como detalhados a seguir. A obtenção de micro-organismos mortos ou inativados pode ser obtida por qualquer método conhecido do técnico no assunto.

[029] De acordo com um modo de realização vantajoso, as bactérias Lactobacillus delbrueckii utilizadas de acordo com a presente invenção estão, pelo menos, em parte inativadas ou mortas.

[030] Por "bactérias Lactobacillus delbrueckii pelo menos em parte inativadas", entende-se uma preparação de bactérias Lactobacillus delbrueckii de acordo com a presente invenção que compreende pelo menos 80%, em particular pelo menos 85%, mais particularmente pelo menos 90%, e mesmo pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de bactérias Lactobacillus delbrueckii inativadas expressas em unidade que formam uma colônia (ufc) em relação à totalidade das bactérias Lactobacillus delbrueckii vivas não inativadas contidas na preparação inicial antes de ser submetida a um processo de inativação. A taxa de inativação obtida depende das condições de aplicação do método de inativação que são ajustadas pelo técnico no assunto de acordo com a taxa de inativação a ser obtida. De acordo com um modo de realização, a presente invenção compreende a utilização de uma preparação que compreende 100% de bactérias Lactobacillus delbrueckii inativadas.

[031] Bactérias Lactobacillus delbrueckii inativadas que são apropriadas para a presente invenção podem ser preparadas por irradiação, inativação térmica ou liofilização de uma preparação de bactérias Lactobacillus delbrueckii. Esses métodos são conhecidos do técnico no assunto.

[032] As bactérias Lactobacillus delbrueckii de acordo com a presente invenção podem utilizadas em forma inteira, ou seja, principalmente em sua forma nativa, ou em forma de extratos ou de lisados que compreendem frações e/ou metabólitos dessas bactérias.

[033] No sentido da presente invenção, o termo "fração" designa um fragmento da referida bactéria dotada de uma eficácia de elicitação por analogia com a referida bactéria inteira.

[034] No sentido da presente invenção, o termo "metabólito" designa toda substância proveniente do metabolismo das bactérias e, em particular, secretada pelas bactérias consideradas de acordo com a presente invenção e dotada igualmente de uma eficácia de elicitação.

[035] Um extrato ou lisado que é apropriado para presente invenção pode ser preparado a partir de bactérias, no fim da fase de crescimento.

[036] De acordo com um modo preferido de realização, a bactéria Lactobacillus delbrueckii apropriado para a presente invenção pode ser preparada em forma de um extrato.

[037] Um extrato no sentido da presente invenção designa comumente um material obtido no fim da destruição ou dissolução de células biológicas por um fenômeno chamado de lise celular provocando assim a liberação dos constituintes biológicos intracelulares naturalmente contidos nas células do micro-organismo considerado. No sentido da presente invenção, o termo "extrato" é utilizado indiferentemente para designar a integralidade do lisado obtido por liso do micro-organismo envolvido ou somente uma fração dele. O extrato utilizado é, portanto, formado em totalidade ou em parte dos constituintes biológicos intracelulares e dos constituintes das paredes e membranas celulares da bactéria Lactobacillus delbrueckii. Vantajosamente, um extrato utilizado para a presente invenção pode ser a integralidade do extrato obtido por lise da bactéria Lactobacillus delbrueckii.

[038] Essa lise celular pode ser realizada por diferentes tecnologias, tais como, por exemplo, um choque osmótico, um choque térmico, por ultrassons, ou ainda sob tensão mecânica de tipo centrifugação ou pressão.

[039] Mais particularmente, esse extrato pode ser obtido de acordo com o seguinte protocolo: o extrato é obtido por passagem de um meio que compreende as bactérias Lactobacillus delbrueckii na prensa francesa, seguida, de preferência, por filtrações em cascata, e de preferência de uma liofilização.

[040] Um extrato pode ser utilizado em diferentes formas, tal como em forma de uma solução ou em uma forma pulverulenta.

[041] Os presentes inventores mostraram, em particular, que um extrato de Lactobacillus delbrueckii spp lactis, obtido pela técnica descrita acima, agia como elicitador sobre as células vegetais de íris, enquanto outras bactérias Gram positivo não tinham essa propriedade.

CÉLULA VEGETAL DE IRIDACEA

[042] A família das Iridáceas (ou Irídeas) conta com aproximadamente 750 espécies. As plantas dessa família são utilizadas principalmente por suas propriedades aromáticas e ornamentais.

[043] Entre os gêneros de iridáceas de que provêm as células vegetais utilizadas no âmbito da presente invenção, podem ser citados, a título de exemplo, os gêneros Romulea, Crocus, Iris, Gladiolus, Sisyrinchium e Hermodactylus. De preferência, as células vegetais utilizadas no âmbito da presente invenção são células vegetais de íris.

[044] As células vegetais utilizadas no âmbito da presente invenção podem mais particularmente provir de iris germanica, de iris florentina, de iris pallida, de Crocus versicolor, de Romulea bulbucodium ou ainda de Gladiolus communis. De preferência, as células vegetais utilizadas no âmbito da presente invenção provêm de iris pallida.

[045] De modo particularmente preferido, a célula vegetal utilizada no âmbito da presente invenção é uma célula desdiferenciada de uma Iridácea, tal como definida acima.

[046] Por "célula vegetal desdiferenciada", entende-se aqui toda célula vegetal que não apresenta nenhum dos caracteres de uma especialização particular e capaz de viver por si só e não em dependência com outras células. Essas células vegetais desdiferenciadas estão eventualmente aptas, sob o efeito de uma indução, a qualquer diferenciação de acordo com seu genoma.

[047] As células vegetais utilizadas no âmbito da presente invenção são de preferência células vegetais cultivadas in vitro.

[048] A pressão de seleção impostas pelas condições físico- químicas durante a cultura das células vegetais in vitro permite, de fato, obter um material vegetal estandardizado e disponível ao longo de todo o ano, ao contrário das plantas cultivadas in vivo.

PROCESSO DE ELICITAÇÃO

[049] A presente invenção trata do uso de Lactobacillus delbrueckii, mais particularmente de um extrato de Lactobacillus delbrueckii, tal como definido na seção "Lactobacillus delbrueckii'acima, para elicitar uma célula vegetal de uma Iridácea, tal como definida na seção "Célula vegetal de iridácea" acima.

[050] Ela trata igualmente de um processo de elicitação de células vegetais de uma Iridácea que compreende a colocação em contato de células vegetais de uma Iridácea, tal como definida na seção "Célula vegetal de iridácea" acima, com Lactobacillus delbrueckii, de preferência com um extrato de Lactobacillus delbrueckii spp lactis, tal como definido na seção "Lactobacillus delbruecki” acima, em condições apropriadas para induzir a expressão de uma atividade antagonista do CGRP, tal como definida na seção "Antagonista do CGRF” acima.

[051] Por "elicitação", entende-se aqui o fato de induzir, por um elicitador exógeno, em outro organismo ou célula, uma via metabólica pouco expressa ou de despertar, em outro organismo ou célula, vias metabólicas silenciosas.

[052] De preferência, por "elicitação", on entende-se aqui a estimulação, por um elicitador exógeno, da atividade antagonista do CGRP, tal como definida na seção "Antagonista do CGRF” acima, em outro organismo ou célula.

[053] Por "elicitadores", on entende-se aqui moléculas ou organismos capazes de induzir, em outro organismo, uma via metabólica pouco expressa ou de despertar, em outro organismo, vias metabólicas silenciosas. Um grande número de elicitadores são conhecidos do técnico no assunto e incluem elicitadores bióticos, tais como o jasmonato e seus derivados, e elicitadores abióticos tais como a temperatura, o pH ou um choque osmótico.

[054] Por "pôr em contato", on entende-se aqui incubar, em um mesmo meio de cultura as células vegetais e a bactéria Lactobacillus delbrueckii, em particular o extrato de Lactobacillus delbrueckii.

[055] Por "condições apropriadas para induzir a expressão de uma atividade antagonista do CGRP", entende-se aqui as condições de duração e de temperatura, e/ou uma concentração de bactéria Lactobacillus delbrueckii, que permitem induzir a expressão de uma atividade antagonista do CGRP tal como definida na seção "Antagonista do CGRP" acima, de preferência que permite induzir a expressão de uma atividade agonista do CGRP que provoca uma inibição de mais de 80%, de preferência de mais de 90%, de preferência de mais de 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, de modo preferido entre todos de 100% do receptor com CGRP. Tais condições podem ser determinadas pelo técnico no assunto por técnicas de rotina.

[056] De fato, as técnicas que permitem determinar a expressão de uma atividade antagonista do CGRP são bem conhecidas do técnico no assunto e estão descritas, por exemplo, em "Calcitonin gene-related peptide (CGRP) and its role in hypertension", Sarah-Jane Smillie, Susan D. Brain. BHF Centre of Cardiovascular Excellence and Centre for Integrative Biomedicine, Cardiovascular Division, Franklin-Wilkins Building, Waterloo Campus, King's Collège London, London SE1 9NH, UK.

[057] Tipicamente, a expressão de uma atividade antagonista do CGRP pode ser constatada da seguinte maneira: células HEK transfectadas estavelmente pelo receptor hCALCRL e a proteína associada hRAMPI e que expressam o gene relator da β-lactamase sob o controle do elemento de resposta ao AMP cíclico (CRE) são cultivadas, de preferência em meio DMEM + soro, a 37°C e 5% CO2. As células são depois tratadas pelo ligante de referência CGRP, por exemplo em seu EC80 (tipicamente 0,2 nM final) e diferentes doses das composições candidatas. Após incubação, de preferência entre 2 e 4 horas, por exemplo 3 horas, de incubação, a 37<C 5% CO2, o substrato da β-lactamase é adicionado. Após incubação, por exemplo durante 2 horas, tipicamente à temperatura ambiente, a degradação do substrato da β-lactamase é medida, por exemplo com um espectrofotômetro.

[058] De preferência, no processo de elicitação de acordo com a presente invenção, as células vegetais de uma Iridácea, tal como definida na seção "Célula vegetal de iridácea" acima, são postas em contato com Lactobacillus delbrueckii, de preferência com um extrato de Lactobacillus delbrueckii spp lactis, tal como definido na seção "Lactobacillus delbrueckii' acima, a uma concentração de 200 pg de extrato / litro de cultura durante 7 dias a uma temperatura de 26°C.

PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO QUE POSSUI UMA ATIVIDADE ANTAGONISTA DO CGRP

[059] A presente invenção concerne igualmente o uso de Lactobacillus delbrueckii, de preferência de um extrato de Lactobacillus delbrueckii, tal como definido na seção "Lactobacillus delbrueckii” acima, para induzir a produção de um antagonista do CGRP, tal como definido na seção "Antagonista do CGRP" acima, por uma célula vegetal de uma Iridácea, tal como definida na seção "Célula vegetal de iridácea" acima.

[060] A presente invenção trata igualmente de um processo de preparação de uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRP que compreende as etapas que consistem em: d) pôr em contato, em um meio de cultura, células vegetais de uma Iridácea, tal como definida na seção "Célula vegetal de iridácea" acima, com Lactobacillus delbrueckii, de preferência com um extrato de Lactobacillus delbrueckii, tal como definido na seção "Lactobacillus delbrueckii" acima, em condições apropriadas para induzir a expressão de uma atividade antagonista do CGRP, tais como definida na seção "Processo de elicitação" acima, e) eventualmente separar as células vegetais cultivadas na etapa a) do meio de cultura, e f) recolher uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRP.

[061] Por "pôr em contato", entende-se aqui incubar, em um mesmo meio de cultura as células vegetais e a bactéria Lactobacillus delbrueckii, em particular o extrato de Lactobacillus delbrueckii.

[062] Por "meio de cultura", entende-se aqui uma solução que compreende todos os nutrientes necessários às células vegetais para sua sobrevivência e seu crescimento. Tais meios de cultura são bem conhecidos do técnico no assunto e estão, por exemplo, descritos em "Plant Cultura Media: Formulation and Uses, Edwin F.George, David J.M.Puttock and Heather J.George". Exemplos de meios de cultura apropriados para a realização da presente invenção incluem o meio descrito em Murashige and Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473-497.

[063] Por "condições apropriadas para induzir a expressão de uma atividade antagonista do CGRP", entende-se aqui as mesmas condições que as descritas na seção "Processo de elicitação" acima.

[064] Toda técnica de separação convencional pode ser utilizada para separar as células vegetais do meio de cultura na etapa opcional b). Tais técnicas incluem, por exemplo, a centrifugação, a filtração ou a decantação.

[065] Por "composição que possui uma atividade antagonista do CGRP", entende-se aqui uma mistura que compreende moléculas que possuem uma atividade antagonista do CGRP, tal como definida na seção "Antagonista do CGRP" acima, produzidas pelas células vegetais após sua colocação em contato com Lactobacillus delbrueckii na etapa a) do processo de acordo com a presente invenção. Tal composição pode, portanto, conter compostos diferentes dos que possuem uma atividade antagonista do CGRP, em particular outros compostos provenientes da célula vegetal e/ou de Lactobacillus delbrueckii e/ou do meio de cultura.

[066] A natureza das moléculas que possuem essa atividade antagonista do CGRP não foi ainda determinada. Todavia, foi demonstrado pela Depositante que essas moléculas que possuem uma atividade antagonista são unicamente expressas por as células vegetais cultivadas, e não por Lactobacillus delbrueckii.

[067] Em um modo de realização particular da presente invenção, a composição que possui uma atividade antagonista do CGRP recolhida na etapa c) é um extrato das células vegetais separadas na etapa b).

[068] Todo método de extração conhecido do técnico no assunto pode ser utilizado para obter um extrato das células vegetais separadas na etapa b). Podem ser citados, em particular, os extratos alcoólicos, em particular etanólicos, ou os extratos hidroalcoólicos. O extrato de células vegetais pode igualmente ser um extrato aquoso, tipicamente preparado por recolocação em suspensão das células vegetais separadas em água osmosada, de preferência em uma quantidade equivalente volume da cultura de partida, seguida de preferência de uma passagem em homogeneizador de alta pressão (HHP) tipicamente a 1250 Bar, centrifugação, de preferência a 6000 g, durante 20 min a 4°C, filtração, por exemplo em um filtro de espessura tal como o filtro GFD® e/ou em um filtro GFF ("Gravity flow fiber"), e congelamento, por exemplo a -20° C.

[069] A Depositante demonstrou que a colocação em contato de Lactobacillus delbrueckii permitia induzir a secreção no meio externo das moléculas responsáveis pela da atividade antagonista do CGRP produzida por as células vegetais.

[070] Em um modo de realização particular da presente invenção, a composição que possui uma atividade antagonista do CGRP recolhida na etapa c) é, portanto, proveniente do meio de cultura separado na etapa b). Esse meio de cultura pode ser liofilizado, atomizado ou concentrado tal qual ou ser submetido a um fracionamento sobre peneira molecular de tipo filtração tangencial e depois tratado de acordo com as técnicas descritas acima.

[071] Dans outro modo de realização particular da presente invenção, o processo de preparação de uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRP não compreende uma etapa de separação das células vegetais cultivadas na etapa a) do meio de cultura, e a composição que possui uma atividade antagonista do CGRP recolhida na etapa c) compreende, portanto, ao mesmo tempo o meio de cultura e as células vegetais cultivadas e elicitadas na etapa a).

[072] Por "composição que possui uma atividade antagonista do CGRP", entende-se aqui uma mistura que compreende moléculas que possuem uma atividade antagonista do CGRP, tal como definida na seção "Antagonista do CGRF” acima, produzidas pelas células vegetais após sua colocação em contato com Lactobacillus delbrueckii na etapa a) do processo de acordo com a presente invenção. Tal composição pode, portanto, conter compostos diferentes dos que possuem uma atividade antagonista do CGRP, em particular outros compostos provenientes da célula vegetal e/ou de Lactobacillus delbrueckii e/ou do meio de cultura.

[073] A presente invenção trata, portanto, igualmente de uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRP suscetível de ser obtida, de preferência obtida, pelo processo de preparação de acordo com a presente invenção descrito acima. De preferência, essa composição que possui uma atividade antagonista do CGRP compreende compostos provenientes de Lactobacillus delbrueckii.

[074] A natureza das moléculas que possuem essa atividade antagonista do CGRP não foi ainda determinada. Todavia, foi demonstrado pela Depositante que essas moléculas que possuem uma atividade antagonista são unicamente expressas pelas células vegetais cultivadas, e não por Lactobacillus delbrueckii.

COMPOSIÇÃO COSMÉTICA E FARMACÊUTICA

[075] A presente invenção trata igualmente de uma composição cosmética ou farmacêutica que compreende uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRP tal como definida na seção "Preparação de uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRP’ acima, e um veículo cosmética ou farmaceuticamente aceitável.

[076] Por "veículo cosmeticamente aceitável", entende-se aqui um meio sem cheiro ou aspecto desagradável, e que não provoca formigamento, repuxamento ou vermelhidão inaceitável pelo usuário, durante sua administração, em particular durante sua aplicação tópica sobre a pele ou seus fâneros.

[077] Por "veículo farmaceuticamente aceitável", entende-se aqui qualquer solvente, meio de dispersão, agente retardador da absorção, etc., que não produza uma reação secundária, por exemplo alérgica, no ser humano ou no animal. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos do técnico no assunto, e incluem os descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Company, Easton, USA, 1985).

[078] O veículo cosmética ou farmaceuticamente aceitável será adaptado à via de administração da composição cosmética ou farmacêutica, em particular à natureza do suporte sobre qual deve ser aplicada a composição cosmética ou farmacêutica, bem como à forma sob a qual a composição cosmética ou farmacêutica se destina a ser condicionada, em particular sólida ou fluida à temperatura ambiente e pressão atmosférica.

[079] De acordo com a presente invenção, a composição que possui uma atividade antagonista do CGRP, tal como definida na seção "Preparação de uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRP' acima, é utilizada em uma quantidade que representa de 0,001% a 20% do peso total da composição cosmética ou farmacêutica e preferencialmente em uma quantidade que representa de 0,1% a 10% do peso total da composição cosmética ou farmacêutica.

[080] A composição cosmética ou farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser ingerida, injetada ou aplicada sobre a pele sobre qualquer região cutânea do corpo), os cabelos, as unhas ou as mucosas (bucal, malar, gengival, genital, conjuntiva). De acordo com o modo de administração, a composição cosmética ou farmacêutica de acordo com a presente invenção pode se apresentar sob todas as formas galênicas normalmente utilizadas.

[081] Para uma aplicação tópica sobre a pele, a composição cosmética ou farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ter a forma, em particular, de solução aquosa ou oleosa ou de dispersão do tipo loção ou soro, de emulsões de consistência líquida ou semilíquida do tipo leite, obtidas por dispersão de uma fase graxa em uma fase aquosa (O/A) ou inversamente (A/O), ou de suspensões ou emulsões de consistência mole do tipo creme ou gel aquosos ou anidros, ou ainda de microcápsulas ou micropartículas, ou de dispersões vesiculares de tipo iônico e/ou não iônico. Essas composições cosméticas ou farmacêuticas são preparadas de acordo com os métodos usuais.

[082] Elas podem igualmente ser utilizadas para os cabelos em forma de soluções aquosas, alcoólicos ou hidroalcoólicas, ou em forma de cremes, de géis, de emulsões, de mousses ou ainda em forma de composições para aerossol que compreendem igualmente um agente propulsor sob pressão.

[083] Para a injeção, a composição cosmética ou farmacêutica de acordo com a presente invenção pode se apresentar em forma de loção aquosa, oleosa ou em forma de soro. Para os olhos, ela pode se apresentar em forma de gotas e para a ingestão, ela pode se apresentar em forma de cápsulas, de granulados, de xaropes ou de comprimidos.

[084] As quantidades dos diferentes constituintes das composições cosméticas ou farmacêuticas de acordo com a presente invenção são as convencionalmente utilizadas nos campos considerados.

[085] Essas composições constituem, em particular, cremes de limpeza, de proteção, de tratamento ou de cuidado para o rosto, para as mãos, para os pés, para as grandes dobras anatômicas ou para o corpo (por exemplo cremes para dia, cremes para a noite, cremes demaquilantes, cremes de base para o rosto, cremes antissolares), bases fluidas para o rosto, leites de demaquilagem, leites corporais de proteção ou de cuidado, leites antissolares, loções, géis ou mousses para o cuidado da pele, como loções de limpeza, loções antissolares, loções de bronzeamento artificial, composições para o banho, composições desodorantes que compreendem uma agente bactericida, géis ou loções pós-barba, cremes depilatórios, composições contra as picadas de insetos, composições contra a dor, composições para tratar certas doenças da pele como o eczema, as úlceras da perna, a rosácea, a psoríase, os líquens, os pruridos severos, as pústulas ou as estrias.

[086] As composições cosméticas ou farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem igualmente consistir de preparações sólidas que constituem sabões ou barras de limpeza.

[087] As composições cosméticas ou farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem também ser condicionadas em forma de composição para aerossol que compreende igualmente um agente propulsor sob pressão.

[088] A composição que possui uma atividade antagonista do CGRP utilizada de acordo com a presente invenção pode também ser incorporada em diversas composições para cuidados capilares e, em particular, xampus, loções de mise em plis, loções de tratamento, cremes ou géis para o penteado, composições de tinturas (em particular tinturas de oxidação) eventualmente em forma de xampus colorantes, loções estruturadoras para os cabelos, composições de permanente (em particular, composições para a primeira etapa de uma permanente), loções ou géis antiqueda, xampus antiparasitárias, etc.

[089] As composições cosméticas ou farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem também ser para uso buco-dentário, por exemplo uma pasta dentifrícia. Em certos casos, elas podem conter adjuvantes e aditivos usuais para as composições de uso bucal e, em particular, agentes tensoativos, agentes espessantes, agentes umectantes, agentes de polimento tais como a sílica, diversos ingredientes ativos como os fluoretos, em particular o fluoreto de sódio, e eventualmente agentes edulcorantes como o sacarinato de sódio.

[090] Quando a composição cosmética ou farmacêutica de acordo com a presente invenção for uma emulsão, a proporção da fase graxa pode variar de 5% a 80% em peso, e de preferência de 5% a 50% em peso em relação ao peso total da composição. Os óleos, as ceras, os emulsionantes e os co- emulsionantes utilizados na composição em forma de emulsão são escolhidos entre os convencionalmente utilizados no campo cosmético. O emulsionante e o co-emulsionantes estão presentes de preferência, na composição cosmética ou farmacêutica, em uma proporção que varia de 0,3% a 30% em peso, e mais preferencialmente ainda de 0,5 a 20% em peso em relação ao peso total da composição cosmética ou farmacêutica. A emulsão pode, ainda, conter vesículas lipídicas.

[091] Quando a composição cosmética ou farmacêutica de acordo com a presente invenção for uma solução ou um gel oleoso, a fase graxa pode representar mais de 90% do peso total da composição cosmética ou farmacêutica.

[092] De forma conhecida, a composição cosmética pode conter igualmente adjuvantes habituais no campo cosmético, tais como os gelificantes hidrófilos ou lipófilos, os aditivos hidrófilos ou lipófilos, os conservantes, os antioxidantes, os solventes, os perfumes, as cargas, os filtros, os absorvedores de odor e as matérias colorantes. As quantidades desses diferentes adjuvantes são as convencionalmente utilizadas no campo cosmético, e por exemplo de 0,01% a 10% do peso total da composição cosmética. Esses adjuvantes, de acordo com sua natureza, podem ser introduzidos na fase graxa, na fase aquosa e/ou nas esférulas lipídicas.

[093] Como óleos ou ceras utilizáveis na presente invenção, podem ser citados os óleos minerais (óleo de vaselina), os óleos vegetais (fração líquida da manteiga de karité, óleo de girassol), os óleos animais (peridroesqualeno), os óleos de síntese (óleo de Purcelin), os óleos ou ceras siliconadas (ciclometicona) e os óleos fluorados (perfluoropoliéteres), as ceras de abelhas, de carnaúba ou parafina. Podem ser adicionados a esses óleos dos álcoois graxos e dos ácidos graxos (ácido esteárico).

[094] Como emulsionantes utilizáveis na presente invenção, podem ser citados, por exemplo, o estearato de glicerol, o polissorbato 60 e a mistura de PEG-6/PEG-32/ Estearato de Glicol vendida com o nome de Tefose® 63 pela Gattefosse.

[095] Como solventes utilizáveis na presente invenção, podem ser citados os álcoois inferiores, em particular o etanol e o isopropanol, ou o propileno glicol.

[096] Como gelificantes hidrófilos utilizáveis na presente invenção, podem ser citados os polímeros carboxivinílicos (carbômero), os copolimeros acrílicos tais como os copolimeros de acrilatos/alquilacrilatos, as poliacrilamidas, os polissacarídeos tais como a hidroxipropilcelulose, as gomas naturais e as argilas, e, como gelificantes lipófilos, podem ser citados as argilas modificadas como as bentonas, os sais metálicos de ácidos graxos como os estearatos de alumínio e a sílica hidrófoba, etilcelulose, polietileno.

[097] A composição cosmética de acordo com a presente invenção pode conter outros ativos hidrófilos como as proteínas ou os hidrolisados de proteína, os aminoácidos, os polióis, a ureia, a alantoína, os açúcares e os derivados de açúcar, as vitaminas hidrossolúveis, os extratos vegetais e os hidroxiácidos.

[098] Como ativos lipófilos, podem ser citados o retinol (vitamina A) e seus derivados, o tocoferol (vitamina E) e seus derivados, os ácidos graxos essenciais, as ceramidas, os óleos essenciais, o ácido salicílico e seus derivados.

[099] De acordo com a presente invenção, é possível, entre outras, associar pelo menos uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRP tal como definida na seção "Preparação de uma composição que possuí uma atividade antagonista do CGRP" acima a outros agentes ativos destinados, em particular, à prevenção e/ou ao tratamento das afecções cutâneas. Entre esses agentes ativos, podem ser citados a título de exemplo: - os agentes que modulam a diferenciação e/ou a proliferação e/ou a pigmentação cutânea tais como o ácido retinoico e seus isômeros, o retinol e seus ésteres, a vitamina D e seus derivados, os estrógenos tais como o estradiol, o ácido cójico ou a hidroquinona; - os antibacterianos tais como o fosfato de clindamicina, a eritromicina ou os antibióticos da classe das tetraciclinas; - os antiparasitários, em particular o metronidazol, o crotamiton ou os piretrinoides; os antifúngicos, em particular os compostos que pertencem à classe dos imidazois tais como o econazol, o ketoconazol ou o miconazol ou seus sais, os compostos polienos, tais como a anfotericina B, os compostos da família das alilalaninas, tais como a terbinafina; - os agentes antivirais tais como o aciclovir; - os agentes anti-inflamatórios, em particular os agentes anti- inflamatórios esteroidianos, tais como a hidrocortisona, o valerato de betametasona ou o propionato de clobetasol, ou os agentes anti-inflamatórios não-esteroidianos tais como o ibuprofeno e seus sais, o diclofenac e seus sais, o ácido acetilsalicílico, o acetaminofeno ou o ácido glicirretínico; - os agentes anestésicos tais como o cloridrato de lidocaína e seus derivados; - os agentes antipruriginosos como a tenaldina, a trimeprazina ou a ciproheptadina; - os agentes queratolíticos tais como os ácidos alfa- e beta- hidroxicarboxílicos ou beta-cetocarboxílicos, seus sais, am idas ou ésteres e mais particularmente os hidroxiácidos tais como o ácido glicólico, o ácido láctico, o ácido salicílico, o ácido cítrico e, de modo geral, os ácidos de frutas, e o ácido n- octanoil-5-salicílico; - os agentes antirradicalares ou antirradicais livres, tais como o alfa- tocoferol ou seus ésteres, as superóxido dismutases, certos quelantes de metais ou o ácido ascórbico e seus ésteres; - os agentes calmantes tais como as bactérias filamentosas ou extratos de bactérias filamentosas como Vítreoscílla fílíformís tal como descrito na patente EP 761 204 e comercializado pela Chimex com o nome Mexoryl SBG®; - os agentes antisseborreicos tais como a progesterona; - os agentes anticaspa como o octopirox ou a piritiona de zinco; - os antiacneicos como o ácido retinoico ou o peróxido de benzoila; - as vitaminas e seus derivados ou precursores, sozinhos ou em misturas; - os agentes antioxidantes; - os filtros UV hidrófilos ou insolúveis na água e nos óleos; - os filtros UV inorgânicos; - os agentes autobronzantes; - os agentes antiglicação; - os inibidores de NO-sintase; - os agentes que estimulam a síntese de macromoléculas dérmicas ou epidérmicas e/ou que impedem sua degradação; - os agentes estimulam a proliferação dos fibroblastos; - os agentes que estimulam a proliferação dos queratinócitos; - os agentes dermorrelaxantes; - os agentes tensores; - os agentes matificantes; - os agentes descamantes; - os agentes hidratantes; - os agentes que agem sobre o metabolismo energético das células; - os agentes repelentes contra os insetos; - os antagonistas de substâncias P; - os agentes aπtirrugas; - os agentes antifotoenvelhecimento; - os agentes colorantes; - os agentes perolizantes; e - os pigmentos.

[0100]Assim, de acordo com um modo particular, a presente invenção concerne uma composição cosmética ou farmacêutica que compreende uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRP tal como definida na seção "Preparação de uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRF” acima, um veículo cosmética ou farmaceuticamente aceitável, e pelo menos um agente escolhido entre os agentes antibacterianos, antiparasitários, antifúngicos, antivirais, anti- inflamatórios, antipruriginosos, anestésicos, queratolíticos, antirradicais livres, calmantes, antisseborreicos, anticaspa, antiacneicos e/ou os agentes que modulam a diferenciação e/ou a proliferação e/ou a pigmentação cutânea.

Uso COSMÉTICO

[0101] A Depositante demonstrou que uma das características essenciais das peles sensíveis estava ligada à liberação de CGRP e, portanto, que o uso de composições que possuem uma atividade antagonista do CGRP podia permitir obter um efeito preventivo e/ou curativo das peles sensíveis.

[0102] A presente invenção trata, portanto, do uso de uma composição cosmética tal como definida na seção "Composição cosmética ou farmacêutica" acima para tratar as peles sensíveis.

[0103] Como lembra o pedido europeu EP 0 723 774, as peles sensíveis podem ser divididas em duas grandes formas clínicas, as peles irritáveis e/ou reativas, e as peles intolerantes.

[0104] Uma pele irritável e/ou reativa é uma pele que reage por um prurido, isto é, por coceiras ou por formigamentos, a diferentes fatores tais como o ambiente, as emoções, os alimentos, o vento, os atritos, o barbeador, o sabão, os tensoativos, a água dura com concentração elevada de calcário, as variações de temperatura ou a lã. Em geral, esses sinais estão associados a uma pele seca com ou sem descamações, ou a uma pele que apresenta um eritema.

[0105] Uma pele intolerante é uma pele que reage por sensações de calor, de repuxamentos, de formigamento e/ou de vermelhidões, a diferentes fatores tais como o ambiente, as emoções, os alimentos. Em geral, esses sinais estão associados a uma pele hiperseborreica ou acneica com ou sem descamações, e a um eritema.

[0106] Além disso, em certas regiões anatômicas como as grandes dobras anatômicas (regiões inguinais, genital, axilares, poplíteas, anal, submamárias, dobra do cotovelo) e os pés, a pele sensível se traduz por sensações pruriginosas e/ou sensações disestésicas (calor, formigamento) ligadas, em particular, ao suor, aos atritos, à lã, aos tensoativos, à água dura com concentração elevada de calcária e/ou às variações de temperatura.

[0107] A Depositante mostrou que uma composição cosmética que compreende uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRP tal como definida na seção "Antagonista do CGRF” acima permitia evitar a irritação e/ou as sensações disestésicas e/ou os pruridos da pele e/ou das mucosas e/ou o eritema.

[0108] Mais precisamente, a presente invenção permite tratar os sintomas de origem neurogênica, devidos a um agente exógeno suscetível de modificar as constantes biofísicas e bioquímicas do tecido envolvido (pele, mucosas).

[0109] Além disso, uma pele sensível é uma pele que reage mais facilmente que outras a fatores externos. Toda irritação de uma pele sensível começa por sinais subjetivos (formigamento, calor,...) antes de chegar à inflamação.

[0110] A presente invenção tem, portanto, ainda por objeto o uso, em particular cosmético, de uma composição cosmética tal como definida na seção "Composição cosmética ou farmacêutica" acima para prevenir e/ou combater as irritações cutâneas e/ou as descamações e/ou os eritemas e/ou as sensações de calor e/ou de disestesia e/ou os pruridos da pele e/ou das mucosas.

[0111] Os couros cabeludos "sensíveis" possuem uma semiologia clínica mais unívocas: as sensações de prurido e/ou de formigamentos e/ou de calores são desencadeadas essencialmente por fatores locais tais como atritos, sabão, tensoativos, água com concentração elevada de calcário, xampus ou loções. Essas sensações são também, às vezes, desencadeadas por fatores tais como o ambiente, as emoções e/ou os alimentos. Um eritema e uma hiperseborreia do couro cabeludo bem como a presença de caspa são frequentemente observados nos indivíduos que possuem tal couro cabeludo "sensível".

[0112] A presente invenção trata, portanto, igualmente do uso, em particular cosmético, de uma composição cosmética tal como definida na seção "Composição cosmética ou farmacêutica" acima no tratamento anticaspa.

[0113] A presente invenção trata igualmente um processo de tratamento cosmético não terapêutico das peles sensíveis, na qual é aplicada sobre a pele, sobre o couro cabeludo, e/ou sobre as mucosas, uma quantidade cosmeticamente eficaz de uma composição cosmética tal como definida na seção "Composição cosmética ou farmacêutica" acima.

[0114] A presente invenção tem igualmente por objeto um processo de tratamento anticaspa, na qual é aplicada o couro cabeludo uma quantidade cosmeticamente eficaz de uma composição cosmética tal como definida na seção "Composição cosmética ou farmacêutica" acima.

[0115] Por "quantidade cosmeticamente eficaz", entende-se aqui uma quantidade suficiente dos agentes utilizada no âmbito da presente invenção a fim de tratar e/ou prevenir o referido distúrbio cosmético, que não provoque efeitos secundários inaceitáveis para o usuário.

[0116] Os processos de tratamento cosmético da presente invenção podem ser utilizados em particular aplicando as composições cosméticas tais como definidas na seção "Composição cosmética ou farmacêutica" acima, de acordo com a técnica habitual dessas composições. Por exemplo: aplicação de cremes, de géis, de soros, de loções, leites demaquilantes ou de composições pós-solares sobre a pele ou sobre os cabelos secos, aplicação de uma loção para cabelos sobre cabelos molhados, de xampus, ou ainda aplicação de dentifrício sobre as gengivas.

Uso TERAPÊUTICO

[0117] Devido à distribuição ubiquitária do CGRP, um número muito grande de distúrbios está associado a um excesso de síntese e/ou de liberação do CGRP. Trata-se, em particular, de doenças respiratórias e inflamatórias, das doenças e distúrbios cutâneos, em particular de afecções dermatológicas tais como o eczema, o prurido ou a rosácea.

[0118] A presente invenção trata, portanto, de igualmente uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRP, tal como definida na seção "Preparação de uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRP" acima, para seu uso no tratamento dos distúrbios associados a um excesso de síntese e/ou de liberação do CGRP.

[0119] Ela trata também do uso de uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRP, tal como definida na seção "Preparação de uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRP’ acima, para a fabricação de uma composição farmacêutica destinada a tratar distúrbios associados a um excesso de síntese e/ou de liberação do CGRP.

[0120] Ela trata igualmente de um método de tratamento de distúrbios associados a um excesso de síntese e/ou de liberação do CGRP em um sujeito, no qual é administrada, em um sujeito que dela tem necessidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica tal como definida na seção "Composição cosmética ou farmacêutica" acima.

[0121] Por "quantidade terapeuticamente eficaz", entende-se aqui uma quantidade suficiente dos agentes utilizados no âmbito da presente invenção para tratar e/ou prevenir a referida doença, em uma relação benefício/risco razoável aceitável para qualquer tratamento médico. Deverá, porém, ficar claro que a dose específica terapeuticamente eficaz para um paciente particular vai depender de uma variedade de fatores que incluem a doença a ser tratada, a gravidade da doença, a atividade dos agentes específicos empregados, a composição específica empregada, a duração do tratamento, a idade, o peso e a condição do sujeito tratado, bem como os fatores análogos bem conhecidos do campo médico.

[0122] Os distúrbios associados a um excesso de síntese e/ou de liberação do CGRP são, em particular, escolhidos no grupo constituído das doenças respiratórias e inflamatórias, as doenças alérgicas e as doenças dermatológicas tais como o eczema, o prurido, a rosácea, os pruridos severos, a acne, as úlceras da perna, a psoríase, as pústulas e as estrias.

[0123] De preferência, o distúrbio associado a um excesso de síntese e/ou de liberação do CGRP tratado no âmbito da presente invenção é uma doença dermatológica tal como o eczema, o prurido, a rosácea, os pruridos severos, a acne, as úlceras da perna, a psoríase, as pústulas e as estrias. Mais preferencialmente, o distúrbio associado a um excesso de síntese e/ou de liberação do CGRP tratado no âmbito da presente invenção é escolhido no grupo constituído pelo eczema, pelo prurido e pela rosácea. De modo preferido entre todos, o distúrbio associado a um excesso de síntese e/ou de liberação do CGRP tratado no âmbito da presente invenção é a rosácea.

[0124] Na descrição e nos exemplos a seguir, a indicação contrária, as porcentagens são porcentagem em peso e as faixas de valores indicadas na forma "entre ... e ..." incluem os limites inferior e superior especificados.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 PREPARAÇÃO DO ELICITADOR

[0125] Este exemplo mostra um processo de preparação de um extrato de Lactobacillus delbrueckii spp lactis que pode ser utilizado para realizar a presente invenção.

[0126] O Lactobacillus delbrueckii spp lactis é cultivado em um meio tradicional denominado MRS.

[0127] No fim do crescimento, as células são submetidas a uma passagem na prensa francesa. Após filtração em cascata, o extrato é liofilizado.

EXEMPLO 2 PREPARAÇÃO DE EXTRATOS DE CÉLULAS VEGETAIS DESDIFERENCIADAS DE ÍRIS

[0128] Este exemplo mostra um processo de preparação de um extrato de células vegetais desdiferenciadas de íris que pode ser utilizado para realizar a presente invenção. A) CULTURA DAS CÉLULAS VEGETAIS DESDIFERENCIADAS DE ÍRIS - Meio de cultura: Murashige & Skoog Ácido Naftaleno Acético (ANA) 2 e Cinetina 0,6, sacarose 20 g/1. - Cultura em Erlenmeyer: Volume de cultura de 400 ml_. A cultura é realizada a 26°C, sob agitação de 100 rpm durante 15 dias. - Cultura em fermentador de 10 L: Fermentador de 10 litros eficientes, pH não regulado, pÜ2 15% regulada por ar. A cultura é realizada a 26°C sob agitação de 100 rpm (Rushton).

[0129] Em 14 dias de Batch, 120 g de peso fresco de células / litro, ou seja, 8 g de peso seco / litro são obtidos.

[0130] 7 dias após inoculação do fermentador com a pré-cultura de células de iris pallida, o elicitador em solução aquosa é introduzido esterilmente no fermentador. A cultura é mantida nas mesmas condições durante 7 dias.

B) EXTRAÇÃO DAS CÉLULAS VEGETAIS DESDIFERENCIADAS DE ÍRIS PRODUZIDAS EM A)

[0131] A cultura é filtrada em filtro Nylon com 50 pm de porosidade para recolher a biomassa e eliminar o meio de cultura condicionado.

[0132] A biomassa é colocada novamente em suspensão em água osmosada, a uma quantidade equivalente á cultura de partida.

[0133] A suspensão é passada em um Homogeneizador de Alta Pressão (HHP) sobre microfluidics a 1250 Bars, e depois centrifugada a 6000 g durante 20 min, a 4°C, e filtrada sobre GFD e GFF.

[0134] O produto final é então congelado a -20°C e liofilizado.

[0135] Entre 2,5 e 3,5 g de extrato / 100 g de células frescas são assim obtidos, ou seja, entre 3 e 4 g/L de cultura.

EXEMPLO 3 CONSTATAÇÃO DO EFEITO ELICITADOR DE LACTOBACILLUS DELBRUECKII

[0136] Este exemplo mostra que o uso de um extrato de Lactobacillus delbrueckii spp lactis permite de induzir a expressão e a secreção de uma atividade antagonista do CGRP por células vegetais desdiferenciadas de íris.

EQUIPAMENTO E MÉTODOS

[0137] Os extratos de íris, preparados de acordo com o Exemplo 2, postos em contato ou não com diferentes doses de extratos de Lactobacillus delbrueckii spp lactis preparados de acordo com o Exemplo 1, foram testados na linhagem celular HEK transfectada estavelmente pelo receptor hCALCRL e a proteína associada hRAMPI . Essa linhagem expressa o gene relator da β- lactamase sob o controle do elemento de resposta ao AMP cíclico (CRE).

[0138] Composição do meio de cultura: - 500 mL meio DMEM 4,5 g/L (Glicose) - 50 mL soro dialisado - 12,5 mL de Hepes (1 M) - 5 mL de peni/Strepto/fungizone (100X)

[0139] Os extratos foram diluídos extemporaneamente em 1 mL de meio de cultura completado a 1% de DMSO e 0,1% de ácido plurônico, ou seja, uma concentração de 20 mg/ml inicial.

[0140] Para certas amostras, a solubilização não foi completa, e foi, portanto, avaliada visualmente: “OK”: solubilização total. “Suspensão”: mistura homogênea de pequenas partículas de mesmo tamanho. “Particulada": mistura não homogênea de partículas de tamanhos diferentes. As células foram inoculadas na véspera em placas de 384 poços e incubadas a 37°C e 5% CO2.

[0141] Após 24 horas, as células foram tratadas pelo ligante de referência CGRP a seu EC80 (0,2 nM final) e as doses respostas dos extratos a ser testados. Os extratos foram previamente diluídos em dose-resposta em 10 pontos, a 2000 pg mL final para a primeira concentração, e diluições seriadas a %.

[0142] Após 3 horas de incubação a 37°C 5% CO2, o substrato da β-lactamase foi adicionado.

[0143]Após 2 horas de incubação à temperatura ambiente, as placas foram lidas com espectrofotômetro.

[0144] Os dados foram normalizados entre 0% e 100% de atividade, graças aos controles incluídos na placa. As curvas de dose-resposta foram traçadas por meio do software XLfit, os IC50 são expressos em pg/ml.

RESULTADOS

[0145] A tabela 1 a seguir apresenta os resultados obtidos.TABELA 1 ATIVIDADE ANTAGONISTA DO CGRP EXPRESSA PELAS CÉLULAS VEGETAIS DE ÍRIS POSTAS EM CONTATO COM L. DELBRUECKII

[0146]O meio condicionado é um meio que está em contato com as células vegetais.

[0147] O meio virgem é o meio antes da inoculação, que não esteve em contato com as células vegetais.

[0148] Esses resultados mostram, portanto, que a adição do elicitador L delbrueckii à concentração de 0,2% se traduz por um ganho de atividade em relação aos controles sem elicitador. Em compensação, o elicitador L delbrueckii sozinho não possui atividade.

[0149] Assim, a Depositante desenvolveu uma técnica de elicitação para células vegetais que permite ao mesmo a produção intracelular, mas igualmente a excreção do princípio ativo antagonista do CGRP de modo extracelular aumentando com isso os rendimentos de produção pelo menos de um fator 2.

EXEMPLO 4 COMPARAÇÃO DA EFICÁCIA DE LACTOBACILLUS DELBRUECKII EM RELAÇÃO A DE OUTROS ELICITADORES EQUIPAMENTO E MÉTODOS

[0150] Vários elicitadores "convencionais" de íris foram testados: o metil-jasmonato, a quitina e o alginato, bem como outros elicitadores "não convencionais": CaCh, Staphylococcus epidermidis, Lactobacillus delbrueckii, β- D-glucano, AICh e SrCh.

[0151] Todos os elicitadores foram testados 3 concentrações e com três medições nas células vegetais desdiferenciadas de íris preparadas de acordo com o Exemplo 2.

[0152] A atividade antagonista do CGRP foi medida do modo descrito no Exemplo 3.

RESULTADOS

[0153] A tabela 2 a seguir apresenta os resultados obtidos. TABELA 2 ATIVIDADE ANTAGONISTA DO CGRP EXPRESSA PELAS CÉLULAS VEGETAIS DE ÍRIS POSTAS EM CONTATO COM DIFERENTES ELICITADORES

[0154] Apenas o extrato de Lactobacillus delbrueckii spp lactis se comporta como elicitador: cerca de 100% de inibição é observado. É um dos raros elicitadores que toma o meio de cultura muito ativo (97% de inibição em matéria seca equivalente). Finalmente, esse elicitador é muito ativo na mais baixa concentração, ou seja, 0,2%.

[0155] Deve-se notar que S. epidermidis é igualmente uma bactéria Gram positiva e que ela é sem efeito sobre a cultura de íris.

Claims

1. USO DE UM EXTRATO DE LACTOBACILLUS DELBRUECKII, caracterizado por ser para elicitar uma célula vegetal de uma Iridácea do gênero Romulea, Crocus, Iris, Gladiolus, Sisyrinchium ou Hermodactylus por estimulação da atividade antagonista do CGRP.

2. USO DE UM EXTRATO DE LACTOBACILLUS DELBRUECKII, caracterizado por ser para induzir a produção de um antagonista de CGRP por uma célula vegetal de uma Iridácea do gênero Romulea, Crocus, Iris, Gladiolus, Sisyrinchium ou Hermodactylus.

3. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela célula vegetal ser uma célula desdiferenciada da Iridácea.

4. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela célula vegetal ser uma célula vegetal de Iris.

5. PROCESSO DE ELICITAÇÃO DE CÉLULAS VEGETAIS, de uma Iridácea do gênero Romulea, Crocus, Iris, Gladiolus, Sisyrinchium ou Hermodactylus, caracterizado por compreender colocar em contato células vegetais da Iridácea com um extrato de Lactobacillus delbrueckii em condições apropriadas para induzir a expressão de uma atividade antagonista de CGRP.

6. PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO, que possui uma atividade antagonista de CGRP, caracterizado por compreender as etapas que consistem em: (a) colocar em contato, em um meio de cultura, células vegetais de uma Iridácea do gênero Romulea, Crocus, Iris, Gladiolus, Sisyrinchium ou Hermodactylus com um extrato de Lactobacillus delbrueckii em condições apropriadas para induzir a expressão de uma atividade antagonista do CGRP, (b) separar as células vegetais cultivadas na etapa (a) do meio de cultura, e (c) recuperar uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRP.

7. COMPOSIÇÃO, caracterizada por possuir uma atividade antagonista do CGRP suscetível de ser obtida pelo processo de preparação, conforme definido na reivindicação 6.

8. COMPOSIÇÃO COSMÉTICA, caracterizada por compreender uma composição que possui uma atividade antagonista do CGRP, conforme definida na reivindicação 7, e um veículo cosmeticamente aceitável.

9. USO DA COMPOSIÇÃO COSMÉTICA, conforme definida na reivindicação 8, caracterizado por ser para tratar as peles sensíveis.

10. USO DA COMPOSIÇÃO COSMÉTICA, conforme definida na reivindicação 8, caracterizado por ser para o tratamento anticaspa.

11. COMPOSIÇÃO, possuindo uma atividade antagonista do CGRP, conforme definida na reivindicação 7, caracterizada por ser para uso no tratamento dos distúrbios associados a um excesso de síntese e/ou de liberação do CGRP.

12. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo referido distúrbio associado a um excesso de síntese e/ou de liberação do CGRP ser escolhido no grupo constituído pelo eczema, pelo prurido e pela rosácea.